KR20210137009A - 미생물에서 풀링 게놈 편집 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 1회 이상의 형질전환 라운드에서 미생물 숙주 세포의 게놈을 편집하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 적어도 한 라운드의 형질전환 후에 기능적 역선택의 사용을 필요로 하지 않는 풀링 및/또는 반복적인 방식으로 미생물 숙주 세포의 게놈에 유전적 편집을 도입할 수 있게 한다. 이 방법은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 유전자 편집을 빠르게 스태킹하는 데 사용될 수 있다. 이 방법을 수행하기 위한 조성물 및 키트가 또한 개시되어 있다.

Description

미생물에서 풀링 게놈 편집
본 발명은 부위 지정 게놈 편집 기술(예를 들어, CRISPR-Cas9)의 사용을 통한 미생물 숙주 세포의 풀링 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 풀링 편집 방법은 편집 라운드 중 적어도 하나가 활성 발현 및 역선택 가능한 마커의 활용 없이 수행되도록 연속 편집 라운드의 반복 과정에서 수행될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물은 원하는 숙주 세포 또는 유기체의 게놈에서 다수의 유전자좌에 걸쳐 다수의 유전자 편집을 스태킹(stacking)할 뿐만 아니라 다양한 유전적 편집을 생성하는 데 유용할 수 있다.
대사 공학은 에탄올, 고급 알코올, 지방산, 아미노산, 시키메이트 전구체, 테르페노이드, 폴리케타이드, 및 1,4-부테인다이올의 중합체성 전구체를 포함하는 산업적으로 관련된 바이오연료 또는 생화학물질을 생산하기 위해 대장균과 같은 미생물 숙주 세포를 변형시키는 데 널리 적용된다. 종종, 산업적으로 최적화된 균주는 산업적으로 관련된 제품을 생산하기 위해 삽입, 결실 및 조절 변형을 포함하는 수많은 게놈 변형을 필요로 한다. 이러한 많은 수의 게놈 편집 대상은 시간을 절약하는 순차적 조작 또는 다중 조작을 수행하기 위한 효율적인 도구를 필요로 한다.
대장균의 염색체 DNA를 조작하기 위해 Rac 프로파지 시스템 또는 3개의 박테리오파지 λ 레드(Red) 단백질 엑소(Exo), 베타(Beta) 및 감(Gam)을 사용하여 파지 재조합효소 매개 상동 재조합(재결합)을 이용하는 많은 접근법이 있지만, 이들은 접근 방식은 힘들고 시간이 많이 걸리고 종종 1% 미만의 돌연변이 유발 효율을 특징으로 한다는 점을 감안할 때 처리량이 많은 응용 프로그램에 이상적이지 않다. 최근에, 파지 재조합효소-매개 상동 재조합 및 CRISPR/Cas9 기술을 모두 활용하는 접근법이 지앙 더블유 등에 의해 도입되었다(Jiang et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol. 2013 Mar; 31(3):233-9 참조). 간단히 말해서, 지앙과 동료들의 방법에서, 변형될 균주는 먼저 Cas9 뉴클레아제와 λ Red 기계를 발현하도록 유전적으로 조작되고, 이어서 균주는 (i) 변형될 염색체 영역과 어닐링되고 Cas9에 의한 부위-특이적 DNA 절단을 촉진하는 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드(pCRISPR), 및 (ii) λ Red-매개 재조합을 통한 이중 가닥 파손의 복구를 촉진하여, 원하는 돌연변이를 도입하는 절단된 말단에 부분적으로 상동성인 공여자 DNA(PCR 유래 또는 화학적 합성)로 공동 변형된다. 지앙과 동료들의 전략은 65%의 높은 돌연변이 효율을 보고했지만, 이 방법은 여전히 시간이 많이 걸리고 절차 전반에 걸쳐 도입된 플라스미드의 숙주 세포를 효과적으로 치료하기 위해 역선택 가능한 마커의 존재와 사용을 필요로 한다.
따라서, 광범위한 미생물 숙주에서 이용될 수 있는 효율적이고 신속하며 비용 효율적인 방식으로 미생물 숙주 세포에 다양한 유전자 편집을 도입하고 반복적으로 스태킹하기 위한 새로운 방법이 당업계에 필요하다. 본 발명에 제공된 조성물 및 방법은 미생물 숙주 세포를 대사적으로 조작하기 위한 현재 방법에 내재된 전술한 단점을 다룬다.
한 양태에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: a.) 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; b.) 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및 c.) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상이한 편집 플라스미드는 개별 미생물 숙주 세포에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 상이한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 상이한 편집 플라스미드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 복구 단편을 포함하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포, 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포, 및 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함한다: d.) 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; e.) 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함한다; f.) 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및 g.) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 항생제, 화학물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 다중 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(c)에서 선택된 콜로니의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장한 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 1) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않으며; 또는 2) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 및 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 미생물 숙주 세포와 사전에 조합된 편집 플라스미드의 서로의 또는 추가의 풀에서 각각의 편집 플라스미드와 비교하여 동일한 복제 기점 또는 동일한 부류의 복제 기점을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 편집 플라스미드를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀에서 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대한 상이한 서열을 포함하고 사전 편집 라운드의 상이한 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌를 표적으로 하고 사전 편집 라운드의 상이한 항생제 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 최종 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일한 또는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하며, 여기서 최종 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 단계(a) 전에 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 상에서 미생물 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질의 세트는 미생물 숙주 세포의 게놈에 이종 재조합 시스템의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 구조성으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 선택적으로, 여기서 이종 재조합 시스템 유전자는 오페론에 내에 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 시약의 추가, 대사 산물 또는 시약의 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 일부 경우에, 시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 대장균(E. coli) 균주이다. 일부 경우에, 도입하는 단계는 미생물 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 경우에, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 사상균류이다. 일부 경우에, 사상균류는 아스퍼길루스 니거이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 경우에, 원핵 숙주 세포는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: a.) 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 추가로 포함하거나 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 편집 플라스미드의 제 1 풀과 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; b.) 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및 c.) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상이한 편집 플라스미드는 개별 미생물 숙주 세포에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 상이한 편집 구조체는 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 상이한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 상이한 편집 플라스미드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 복구 단편을 포함하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포, 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포, 및 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함한다: d.) 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; e.) 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의-부위 특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하는 편집 플라스미드의 추가 풀과 함께 도입되고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; f.) 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및 g.) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 항생제, 화학물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 다중 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(c)에서 선택된 콜로니의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장한 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 1) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않으며; 또는 2) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 및 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 미생물 숙주 세포와 사전에 조합된 편집 플라스미드의 서로의 또는 추가의 풀에서 각각의 편집 플라스미드와 비교하여 동일한 복제 기점 또는 동일한 부류의 복제 기점을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 편집 플라스미드를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀에서 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 일부 경우에, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에, 부위-특이적 제한 효소의 각각은 플라스미드 상에 암호화되거나, 게놈에 암호화되거나, RNA로부터 번역되거나, 단백질로서 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대한 상이한 서열을 포함하고 사전 편집 라운드의 상이한 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌를 표적으로 하고 사전 편집 라운드의 상이한 항생제 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 최종 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일한 또는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하며, 여기서 최종 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함하며, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하는 최종 플라스미드와 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 이 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 단계(a) 전에 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 상에서 미생물 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질의 세트는 미생물 숙주 세포의 게놈에 이종 재조합 시스템의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 구조성으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 선택적으로, 여기서 이종 재조합 시스템 유전자는 오페론에 내에 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 시약의 추가, 대사 산물 또는 시약의 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 일부 경우에, 시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 대장균(E. coli) 균주이다. 일부 경우에, 도입하는 단계는 미생물 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 경우에, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 사상균류이다. 일부 경우에, 사상균류는 아스퍼길루스 니거이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 경우에, 원핵 숙주 세포는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하거나 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 편집 구조체의 제 1 풀과 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 다음을 포함한다: i. 동일한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적으로 하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; ii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 동일한 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; 또는 iii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및 c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상이한 편집 플라스미드는 개별 미생물 숙주 세포에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 상이한 편집 구조체는 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 상이한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 편집 구조체의 제 1 풀은 1개 이상의 선형 단편을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 선형 단편을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드를 포함한다. 일부 경우에, gRNA는 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, gRNA와 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화하고 편집하기 위한 gRNA는 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화하고 편집하기 위한 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 상이한 유전자좌를 표적화하고 편집하기 위한 gRNA는 둘 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 상이한 유전자좌를 표적화하고 편집하기 위한 복구 단편은 둘 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 모든 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, gRNA는 1개 이상의 선형 단편에 존재한다. 일부 경우에, 복구 단편은 1개 이상의 선형 단편에 존재한다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 선형 단편에 암호화된다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 복구 단편을 포함한다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 선형 단편은 ssDNA 또는 dsDNA로 제공된다. 일부 경우에, 선형 단편은 말단 변형을 포함한다. 일부 경우에, 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용된다. 일부 경우에, 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 또는 여러 상이한 복구 단편을 포함한다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 gRNA 또는 여러 상이한 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 및 상이한 gRNA, 또는 여러 상이한 복구 단편 및 여러 상이한 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 상이한 편집 구조체는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포, 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포, 및 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함한다: d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; e. 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및 g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 항생제, 화학물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 다중 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단계(b) 또는 (f)에서 도입된 gRNA는 표적 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 상이한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단계(f)는 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 하나 이상의 상이한 편집 구조체를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에 도입된 gRNA 및/또는 복구 단편과 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단에서 하나 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 하나 이상의 상이한 편집 구조체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하는 상이한 gRNA를 포함하며, 여기서 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들은 임의의 사전에 표적화된 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이하다. 일부 경우에, 하나 이상의 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 상이한 복구 단편을 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(c)에서 선택된 콜로니의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장한 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 1) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않으며; 또는 2) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 및 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 미생물 숙주 세포와 사전에 조합된 편집 플라스미드의 서로의 또는 추가의 풀에서 각각의 편집 플라스미드와 비교하여 동일한 복제 기점 또는 동일한 부류의 복제 기점을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 편집 플라스미드를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀에서 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택된다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 플라스미드에 암호화되거나, 게놈에 암호화되거나, RNA에서 번역되거나, 단백질로서 세포에 도입된다. 일부 경우에, gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 일부 경우에, gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다. 일부 경우에, 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대한 상이한 서열을 포함하고 사전 편집 라운드의 상이한 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌를 표적으로 하고 사전 편집 라운드의 상이한 항생제 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 gRNA 및 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 미생물 숙주 세포 내로 사전에 도입된 gRNA에 의해 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일하거나 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에서 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 플라스미드, 최종 gRNA 및/또는 최종 복구 단편은 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열과 연관된다. 일부 경우에, 이 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 단계(a) 전에 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 상에서 미생물 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질의 세트는 미생물 숙주 세포의 게놈에 이종 재조합 시스템의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 구조성으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 선택적으로, 여기서 이종 재조합 시스템 유전자는 오페론에 내에 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 시약의 추가, 대사 산물 또는 시약의 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 일부 경우에, 시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 대장균(E. coli) 균주이다. 일부 경우에, 도입하는 단계는 미생물 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 경우에, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 사상균류이다. 일부 경우에, 사상균류는 아스퍼길루스 니거이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 경우에, 원핵 숙주 세포는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: a.) 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 다음을 포함한다: i. 동일한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적으로 하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; ii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 동일한 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; 또는 iii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; b.) 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 및 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및 c.) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상이한 편집 구조체는 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 상이한 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 편집 구조체의 제 1 풀은 1개 이상의 선형 단편을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 선형 단편을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드를 포함한다. 일부 경우에, gRNA는 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 편집 플라스미드에 암호화된다. 일부 경우에, gRNA와 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 각각의 편집을 생성하는 데 필요한 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, gRNA 및 복구 단편에 대한 서열은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA는 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 상이한 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA는 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 상이한 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 복구 단편은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, 모든 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재한다. 일부 경우에, gRNA는 1개 이상의 선형 단편에 존재한다. 일부 경우에, 복구 단편은 1개 이상의 선형 단편에 존재한다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 선형 단편에 암호화된다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 복구 단편을 포함한다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 선형 단편은 ssDNA 또는 dsDNA로 제공된다. 일부 경우에, 선형 단편은 말단 변형을 포함한다. 일부 경우에, 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용된다. 일부 경우에, 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 또는 여러 상이한 복구 단편을 포함한다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 gRNA 또는 여러 상이한 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 및 상이한 gRNA, 또는 여러 상이한 복구 단편 및 여러 상이한 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 상이한 편집 구조체는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 gRAN 및/또는 복구 단편을 포함하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포, 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포, 및 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함한다: d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; e. 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 및 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및 g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 항생제, 화학물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 다중 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단계(b) 또는 (f)에서 도입된 gRNA는 표적 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 상이한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단계(f)는 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 하나 이상의 상이한 편집 구조체를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에 도입된 gRNA 및/또는 복구 단편과 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단에서 하나 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 일부 경우에, 하나 이상의 상이한 편집 구조체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하는 상이한 gRNA를 포함하며, 여기서 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들은 임의의 사전에 표적화된 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이하다. 일부 경우에, 하나 이상의 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 상이한 복구 단편을 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(c)에서 선택된 콜로니의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장한 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 1) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않으며; 또는 2) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 및 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 미생물 숙주 세포와 사전에 조합된 편집 플라스미드의 서로의 또는 추가의 풀에서 각각의 편집 플라스미드와 비교하여 동일한 복제 기점 또는 동일한 부류의 복제 기점을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 편집 플라스미드를 포함한다. 일부 경우에, 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀에서 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자를 포함한다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택된다. 일부 경우에, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 플라스미드에 암호화되거나, 게놈에 암호화되거나, RNA에서 번역되거나, 단백질로서 세포에 도입된다. 일부 경우에, gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 일부 경우에, gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다. 일부 경우에, 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대한 상이한 서열을 포함하고 사전 편집 라운드의 상이한 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌를 표적으로 하고 사전 편집 라운드의 상이한 항생제 선택 마커 유전자와 연관된다. 일부 경우에, 이 방법은 단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 gRNA 및 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 미생물 숙주 세포 내로 사전에 도입된 gRNA에 의해 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일하거나 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에서 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 플라스미드, 최종 gRNA 및/또는 최종 복구 단편은 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열과 연관되어 있다. 일부 경우에, 이 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터의 단백질 세트를 포함한다. 일부 경우에, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 단계(a) 전에 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 상에서 미생물 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질의 세트는 미생물 숙주 세포의 게놈에 이종 재조합 시스템의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 구조성으로 발현된다. 일부 경우에, 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 선택적으로, 여기서 이종 재조합 시스템 유전자는 오페론에 내에 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 시약의 추가, 대사 산물 또는 시약의 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 일부 경우에, 시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 경우에, 도입하는 단계는 미생물 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 경우에, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 사상균류이다. 일부 경우에, 사상균류는 아스퍼길루스 니거이다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 경우에, 원핵 숙주 세포는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명에 제공되고 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같은 반복적 게놈 편집의 실시태양에 대한 흐름 개략도를 도시한다.
도 2는 형질전환의 함수로서 선택가능한 마커의 손실을 예시한다.
도 3은 반복적 편집 형질전환의 편집 효율성을 예시한다. 형질전환 1(즉, 1_cadA)은 W3110에서 18%의 편집 효율성을 가져왔다(46개의 복제물이 스크리닝됨). 형질전환 2(2_maeA)는 W3110에서 100% 편집 효율성을 가져왔다(6개의 복제물이 스크리닝됨). 형질전환 3(3_maeB)은 W3110에서 75%의 편집 효율성을 가져왔다(16개의 복제물이 스크리닝됨). *cadA 결실은 잠재적으로 독성이 있는 것으로 생각되어 편집 효율성을 낮췄다(이는 다양한 조건에서 여러 실험에서 관찰되었다).
도 4는 3차 반복적 스태킹 후 대장균 콜로니에 대한 콜로니 PCR 반응 스크리닝을 예시한다. 형질전환 편집 1 및 2에 대해 회색으로 중첩된 야생형 밴드 크기. 상단 패널 - cadA: WT = 1826bp, cadA 결실 = 933bp, 중간 패널 - maeA: WT = 2256bp, maeA 결실 = 881bp, 하단 패널 - maeB : WT = 2590bp, maeB 결실 = 1047bp.
도 5a-5d는 제 2 플라스미드에 대한 형질전환 및 선택을 통해 균주로부터 사전에 존재하는 플라스미드의 제거의 예를 예시한다. 도 5a는 항생제 내성 마커(abR1)를 갖는 플라스미드를 함유하는 세포가 동일한 복제 기점(원) 및 상이한 항생제 선택 마커(abR2)를 갖는 제 2 플라스미드로 형질전환됨을 나타낸다. 도 5b는 두 번째 플라스미드를 포함하는 형질전환체에 대한 선택이 두 번째 마커에 대한 항생제를 포함하는 배지에 플레이팅하여 수행되어 두 플라스미드를 모두 포함하는 세포를 생성한다는 것을 도시한다. 도 5c는 제 2 플라스미드에 대한 선택하에서의 성장이 제 1 플라스미드의 손실을 초래함을 도시한다. 도 5d는 선택적 최종 단계가 활성 역선택에 의한 또는 항생제 선택의 완화에 의한 제 2 플라스미드의 손실을 수반하여 플라스미드가 없는 최종 균주를 생성하는 것을 도시한다.
도 6은 풀링된 CRISPR 편집이 적용된 대장균(E. coli) 형질전환체의 콜로니 PCR 스크리닝 결과를 도시한다.
도 7은 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)에 도입된 sgRNA/복구 플라스미드 풀의 조성을 나타낸다.
도 8은 도 7에 예시된 sgRNA/복구 플라스미드 풀로 형질전환된 C. 글루타미쿰 형질전환체의 조성을 예시한다.
도 9는 본 발명에 제공되고 실시예 6에 상세히 설명된 바와 같은 반복 및 풀링된 반복 CRISPR 게놈 편집의 실시태양에 대한 흐름 개략도를 도시한다.
도 10a-10b는 CRISPR/Cas9 상동성 유도 복구를 사용하는 S. 세레비지애에서 풀링된 게놈 편집을 예시한다. 도 10a는 3가지 부류의 선형 DNA 분자를 도입함으로써 수행된 CRISPR/Cas9 매개 형질전환을 도시한다: Cas9 발현 유전자 및 항생제(즉, 누르세오트리신) 내성 마커 유전자를 암호화하는 플라스미드 백본, Cas9 발현 유전자 내로 통합을 위한 상동성을 갖는 sgRNA 발현 카세트 및 sgRNA가 표적으로 하는 게놈 유전자좌에 대한 다중 편집 페이로드. 도 10b는 에스, 세레비시애 게놈의 6개 유전자좌 중 하나를 표적으로 하는 sgRNA에 의해 표적화된 6개의 가능한 게놈 유전자좌(즉, ARI1 유전자, TRP1 유전자, ADH6 유전자, ECM13 유전자, MCH5 유전자 또는 PRB1 유전자) 각각에 삽입하기 위한 3개의 페이로드 풀을 도입하는 6개의 형질전환 실험으로부터의 유전형 데이터를 나타낸다. 각 실험에서, 여러 유전자형은 풀링된 게놈 편집 후 복구되었다.
도 11a 내지 도 11c는 CRISPR/Cas9 상동성 유도 복구를 사용하는 에스, 세레비시애에서의 반복적인 게놈 편집을 예시한다. 도 11a는 신속한 반복적 형질전환 과정을 도시한다: 표준 형질전환 과정에 따라, 형질전환체는 항생제 배지 상에서 선택된다. 콜로니를 풀로 배양한 다음 항생제 마커 2를 포함하는 대체 플라스미드 백본으로 두 번째 형질전환하고 항생제 2를 함유하는 고체 배지에서 형질전환체를 선택한다. 이 과정을 항생제 3으로 반복하여 3개의 편집이 있는 균주를 생성한다. 도 11b는 3개의 선형 DNA 분자를 사용하는 형질전환에 의해 수행된 CRISPR/Cas9 매개 형질전환을 도시한다: Cas9 발현 유전자 및 3개의 항생제 마커 중 하나를 암호화하는 플라스미드 백본, Cas9 발현 플라스미드로의 통합을 위한 상동성을 갖는 sgRNA 발현 카세트, 및 sgRNA가 표적으로 하는 게놈 유전자좌에 대한 복구 주형. 도 11c는 전통적인 형질전환에 이어 빠르게 반복되는 형질전환에 의해 도입된 2개의 게놈 편집물의 유전자형 분석 결과를 도시한다. 유전자형이 지정된 28개 콜로니 중 17.8%가 두 가지 반복된 편집을 모두 포함하였다.
도 12a는 풀링된 플라스미드 반복적 스태킹(PPIS)을 수행하기 위한 방법을 예시하는 반면, 도 12b-12c는 PPIS 방법에서 CRISPR 매개 상동성 지시된 복구를 사용하여 4 라운드 동안 4개의 고유한 편집/라운드를 적용한 후 대장균에서 에서 125개 중 11개 또는 가능한 유전자형의 ~9%가 캡처되었음을 도시한다(4 라운드 중 1에서 편집이 발생하지 않았고 가능한 유전자형 #에서 제외되었다).
도 13a는 풀링된 모 반복적 스태킹(PPAIS)을 수행하기 위한 방법을 예시하는 반면, 도 10b-10c는 PPAIS 방법에서 CRISPR 매개 상동성 유도 복구를 사용하여 4 라운드 동안 4개의 고유한 편집/라운드를 적용한 후 대장균에서 125개 중 26개 또는 가능한 유전자형의 ~21%가 캡처되었음을 도시한다(4 라운드 중 1에서 편집이 발생하지 않았고 가능한 유전자형 #에서 제외되었다).
도 14a는 수동 역선택을 통한 단일 반복적 스태킹을 위한 방법을 예시한다. 도 14b는 3차 형질전환 후 카나마이신에 대한 균주의 감수성을 나타낸다. 도 14c-14d는 CRISPR 매개 상동성 유도 복구를 사용하여 4 라운드 동안 4개의 고유한 편집/라운드를 적용한 후 대장균에서 32개 중 7개 또는 가능한 유전자형의 ~22%가 캡처되었음을 도시한다(4 라운드 중 1에서 편집이 발생하지 않았고 가능한 유전자형 #에서 제외되었다).
도 15는 실시예 7에 기술된 바와 같이 상동 재조합(HR)-매개 풀링된 균주 빌드를 받은 대장균의 PCR 스크리닝 및 차세대 시퀀싱(NGS)의 결과를 도시한다.
정의
다음의 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 생각되지만, 다음 정의는 본 발명에 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
본 발명에 사용된 용어 하나("a" 또는 "an")는 그 실체 중 하나 이상을 의미하며, 즉 복수의 지시대상을 의미할 수 있다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 부정관사에 의한 "한 요소"에 대한 언급은, 내용이 분명하게는 요소의 하나 및 단지 하나가 존재하는 것을 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구 범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는"(comprising)과 같은 이의 변형은 "포함하나 이에 제한되지 않는다"와 같은 개방적이고 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.
본 명세서 전체에서 "일 실시태양" 또는 "한 실시태양"에 대한 언급은 실시태양과 관련하여 기술된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시태양에 포함될 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 장소에서 "일 실시태양에서" 또는 "한 실시태양에서"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시태양을 지칭하는 것은 아니다. 명확성을 위해 별도의 실시태양의 맥락에서 기술된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 실시태양에서 조합되어 제공될 수 있다는 것이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해, 단일 실시태양의 맥락에서 기술된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "세포 생물", "미세유기체" 또는 "미생물"은 광범위하게 이해되어야 한다. 이 용어들은 상호 교환적으로 사용되나 두 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균 뿐만 아니라 진핵 균류와 원생 생물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 목록/표 및 도면의 "미세유기체" 또는 "세포유기체" 또는 "미생물"을 의미한다. 이런 특성화는 본 발명에 제공된 확인된 분류학적 속과 확인된 분류학적 종뿐만 아니라 본 발명에 제공된 임의의 유기체의 다양한 신규하고 새로운 확인된 또는 디자인된 균주를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "원핵 생물"은 당업계에 공지되어 있으며 핵 또는 다른 세포 기관을 함유하지 않는 세포를 의미한다. 원핵 생물은 일반적으로 두 영역, 박테리아와 고세균의 하나로 분류된다. 고세균과 박테리아 영역의 유기체 사이의 명확한 차이는 16S 리보솜 RNA에서 뉴클레오타이드 염기 서열의 근본적인 차이에 기초한다.
본 발명에 사용된 용어 "고세균"은 전형적으로 특이한 환경에서 발견되고 세포벽에서 리보솜 단백질의 수 및 뮤라민산의 부족을 포함하는 몇몇 기준에 의해 나머지 원핵 생물과 구별되는 멘도시쿠테스(Mendosicutes) 문의 유기체의 범주를 의미한다. ssrRNA 분석에 기초하여, 고세균은 두 계통발생학적으로 다른 그룹으로 구성된다: 크렌고세균(Crenarchaeota) 및 유리고세균(Euryarchaeota). 생리학을 기초로, 고세균은 세 가지 유형으로 구성될 수 있다: 메테인 생성균(methanogens)(메테인을 생성하는 원핵 생물); 고염성 세균(extreme halophiles)(매우 높은 농도의 염(NaCl)에서 사는 원핵 생물; 및 고온성(초고온성) 세균(extreme(hyper) thermophilus)(초고온에서 사는 원핵 생물). 박테리아와 구별되는 통일된 고세균의 특징(즉, 세포벽, 에스터-연결 막 지질 등에 뮤레인 없음) 이외에, 이런 원핵 생물은 이들의 특정한 서식 환경에 적응시키는 특이한 구조 또는 생화학적 특성을 나타낸다. 크렌고세균은 주로 초고온성 황 의존성 원핵 생물로 이루어지며 유리고세균은 메테인 생성균과 고염성 세균을 함유한다.
본 발명에 사용된 "박테리아" 또는 "진정세균(eubacteria)"는 원핵 생물의 영역을 의미할 수 있다. 박테리아는 다음과 같이 적어도 11개의 구별된 그룹을 포함한다: (1) 그람 양성 (그람+) 박테리아, 2개위 주요 세부구분이 존재한다: (1) 높은 G+C 그룹(액티노마이세테스, 마이코박테리아, 마이크로콕커스, 기타) (2) 낮은 G+C 그룹(바실러스, 클로스트리디아, 락토바실러스, 스타필로콕키, 스트렙토콕키, 마이코플라스마스); (2) 프로테오박테리아, 예를 들어, 보라색 광합성 + 비 광합성 그람 음성 박테리아 (대부분의 "일반적인" 그람 음성 박테리아 포함); (3) 사이아노박테리아, 예를 들면, 산소성 광영양생물; (4) 스피로체테스 및 관련 종; (5) 플랭크토마이세스; (6) 박테로이데스, 플라보박테리아; (7) 클라미디아; (8) 녹색 황 박테리아; (9) 녹색 비 황 박테리아(또한 혐기성 광영양식물); (10) 방사성 저항성 마이크로콕키 및 동족; (11) 써모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
본 발명에 사용된 "진핵 생물"은 세포가 막 내에 둘러싸인 핵 및 다른 세포 기관을 함유하는 임의의 유기체이다. 진핵 생물은 분류군(Eukarya 또는 Eukaryota)에 속한다. 진핵 생물 세포를 원핵 생물(상기 박테리아와 고세균)와 구분시키는 정의하는 특징은 막으로 둘러싸인 유전자 물질, 특히 유전자 물질을 함유하고 핵막에 의해 둘러싸인 핵을 가진다는 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자 변형된 숙주 세포", "재조합 숙주 세포" 및 "재조합 균주"는 본 발명에 제공된 반복적 유전자 편집 방법에 의해 유전자 변형된 숙주 세포를 의미할 수 있다. 따라서, 이 용어는 유전자 변경, 변형 또는 조작되어, 숙주 세포가 유도된 자연 발생 유기체와 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내는(예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 암호화에 영향을 미칠 때) 세포(예를 들어, 박테리아 등)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 이 용어는 문제의 특정 재조합 숙주 세포뿐만 아니라 이런 숙주 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 사용된 용어 "야생형 미생물" 또는 "아생형 숙조 세포"는 자연에서 발생하는 세포, 즉 유전자 변형되지 않은 세포를 기술할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자 조작된"은 (예를 들어, 핵산의 삽입, 결실, 돌연변이 또는 대체에 의한) 숙주 세포 게놈의 임의적 조작을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "대조군" 또는 "대조군 숙주 세포"는 유전자 변형 또는 실험적 처리의 효과를 측정하기 위한 적절한 비교기 숙주 세포를 의미한다. 일부 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 야생형 세포이다. 다른 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 처리 숙주 세포를 분화시키는 유전자 변형(들)을 제외하고, 유전자 변형된 숙주 세포와 유전적으로 동일하다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 대조군 숙주 세포로서 모 균주의 사용을 교시한다. 다른 실시태양에서, 숙주 세포는 치료 숙주 세포에서 테스트되는 특정 프로모터 또는 SNP가 결여된 유전적으로 동일한 세포일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "대립 유전자(들)"은 유전자의 하나 이상의 대안 형태의 임의의 것을 의미할 수 있고, 이의 모두 대립 유전자는 적어도 하나의 형질 또는 특성과 관련된다. 2배체 세포에서, 주어진 유전자의 2개의 대립 유전자는 한 쌍의 상동 염색체상의 상응하는 유전자좌를 차지한다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자좌(locus)"(복수형 loci)는 천연 게놈 서열에 대한 편집이 요구되는 임의의 위치를 의미할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 용어는 예를 들어 유전자 또는 유전자 마커가 발견되는 염색체 상의 특정 장소 또는 장소들 또는 위치를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "유전적으로 연결된"은 교차를 통해 분리하기가 어려워 번식 동안 높은 비율로 공동유전되는 2개 이상의 형질을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "재조합" 또는 "재조합 사건"은 염색체 교차 또는 독립된 분류를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "표현형"은 개체의 유전적 구성(즉, 유전자형)과 환경 사이의 상호작용으로부터 기인하는 개별 세포, 세포 배양, 유기체 또는 유기체의 그룹의 관찰 가능한 특성을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 핵산 서열 또는 단백질 서열을 기술할 때 용어 "키메릭" 또는 "재조합체"는 적어도 2개의 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 이종 폴리펩타이드를 단일 거대분자 속에 연결하거나 적어도 하나의 천연 핵산 또는 단백질 서열의 하나 이상의 요소를 배열하는 핵산 또는 단백질 서열을 의미할 수 있다. 예를 들어, 용어 "재조합체"는 예를 들어, 화학적 합성 또는 유전 공학 기술에 의한 핵산의 분리된 단편의 조작에 의해 서열의 두 개의 분리된 단편의 인공적 조합을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "합성 뉴클레오타이드 서열" 또는 "합성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 자연에서 발생하는 것으로 알려지지 않았거나 자연 발생적이지 않은 뉴클레오타이드 서열이다. 일반적으로, 이런 합성 뉴클레오타이드 서열은 임의의 다른 자연 발생 뉴클레오타이드 서열과 비교할 때 적어도 하나의 뉴클레오타이드 차이를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 의미할 수 있다. 이 용어는 분자의 1차 구조를 의미하고, 따라서 이중 나선 및 단일 가닥의 DNA뿐 아니라 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 또한, 메틸화 및/또는 캡핑된 핵산과 같은 변형된 핵산, 변형된 염기를 함유하는 핵산, 골격 변형 등과 같은 변형 핵산을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 단편을 의미할 수 있다. 따라서, 유전자는 암호화 서열 및/또는 그의 발현에 요구되는 조절 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유전자는 또한, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비 발현 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 원하는 파라미터를 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상동의" 또는 "상동체" 또는 "이종 상동체"(ortholog 또는 orthologue)는 당업계에 공지되어 있고 공통 조상 또는 가족 구성원을 공유하고 서열 동일성의 정도에 기초하여 결정되는 관련 서열을 의미할 수 있다.
용어 "상동성", "상동의", "실질적으로 유사" 및 "상응하게 실질적으로"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 유전자 발현을 중재하거나 특정 표현형을 생성시키는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미할 수 있다. 이런 용어는 또한 초기의 변형되지 않은 단편에 비해 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미할 수 있다. 따라서, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 특정 예시적인 서열 이상을 포함하는 것으로 이해된다. 이런 용어는 한 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 발견된 유전자 및 다른 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 상응하는 또는 동등한 유전자 사이의 관계를 기술한다. 본 발명을 위해서, 상동성 서열이 비교될 수 있다.
"상동 서열" 또는 "상동체" 또는 "이종 상동체"는 기능적으로 관련이 있다고 생각되고, 믿거나 알려져 있다. 기능적 관계는 (a) 서열 동일성 및/또는 (b) 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 방식 중 임의의 하나로 표시될 수 있다. 바람직하게는, (a) 및 (b) 모두가 표시된다. 아미노산 또는 핵산 서열 간의 서열 상동성은 공유 조상으로 정의할 수 있다. 핵산의 두 세그먼트는 종 분화 이벤트(이종 상동체) 또는 중복 이벤트(동종 상동체)로 인해 공유된 조상을 가질 수 있다. 아미노산 또는 핵산 서열 간의 상동성은 서열 유사성으로부터 추론될 수 있어서 아미노산 또는 핵산 서열은 상기 아미노산 또는 핵산 서열이 상당한 유사성을 공유하는 경우 상동성이라고 불린다. 현저한 유사성은 두 서열이 공통 조상으로부터 다른 진화에 의해 관련되어 있다는 강력한 증거가 될 수 있다. 여러 서열의 정렬을 사용하여 상동 영역을 발견할 수 있다. 상동성은 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, 섹션 7.718, 표 7.71에서 논의된 바와 같은 당해분야에서 용이하게 이용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 정렬 프로그램은 BLAST(NCBI), 맥벡터(MacVector)(Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.), ALIGN 플러스(Plus)(Scientific and Educational Software, Pennsylvania) 및 AlignX(Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하는 시퀀처(Sequencher)(Gene Codes, Ann Arbor, Michigan)이다.
본 발명에 사용된 용어 "내인성" 또는 "내인성 유전자"는 숙주 세포 게놈 내에서 발견되는 위치에서 자연적으로 발생하는 유전자를 의미할 수 있다. 본 발명의 내용에서, 이종 프로모터를 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결시키는 것은 그 유전자가 자연적으로 존재하는 위치에서, 현존하는 유전자 앞에 이종 프로모터 서열을 유전적으로 삽입하는 것을 의미한다. 본 발명에 기술된 내인성 유전자는 본 발명의 임의의 방법에 따라 돌연변이된 자연 발생 유전자의 대립 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어, "외인성"은 "이종성"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 천연 출처 이외의 일부 출처로부터 유래하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 용어 "외인성 단백질" 또는 "외인성 유전자"는 비천연 출처 또는 위치로부터이며 인위적으로 생물학적 시스템에 공급된 단백질 또는 유전자를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변화"는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 삽입을 의미한다. 예를 들어 돌연변이는 침묵 치환, 추가 또는 결실을 생성하나 암호화된 단백질의 특성 또는 활성 또는 단백질이 어떻게 만들어지는지를 변형하지 않는 변경을 함유한다. 대안적으로, 돌연변이는 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 비동의적 치환 또는 변화일 수 있고 단백질의 특성 또는 활성의 변경을 초래할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질 변형"은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 변형, 결실 및 또는 삽입을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 핵산 또는 폴리펩타이드의 "적어도 일부" 또는 "단편"은 전장 분자를 포함하는 전장 분자의 이런 서열 또는 임의의 더 큰 단편의 최소 크기 특성을 갖는 부분을 의미할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 단편은 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분을 암호화할 수 있다. 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분은 유전자 조절 요소를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 일부를 분리하고 본 발명에 기재된 바와 같은 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 폴리펩타이드의 일부는 전장 폴리펩타이드까지 이르는 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산 등일 수 있다. 사용될 부분의 길이는 특정 용도에 따라 다를 것이다. 하이브리드화 프로브로서 유용한 핵산의 일부는 12개 뉴클레오타이드 정도로 짧을 수 있으며; 일부 실시태양에서, 이것은 20개 뉴클레오타이드이다. 에피토프로서 유용한 폴리펩타이드의 일부는 4개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. 전장 폴리펩타이드의 기능을 수행하는 폴리펩타이드의 일부는 일반적으로 4개 이상의 아미노산보다 길 수 있다.
변이체 폴리뉴클레오타이드는 또한 DNA 셔플링과 같은 돌연변이 및 재조합 절차로부터 유도될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 그러한 DNA 셔플링을 위한 전략은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Stemmer(1994) PNAS 91:10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al.(1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al.(1997) PNAS 94:4504-4509; Crameri et al.(1998) Nature 391:288-291; 및 미국 특허 제5,605,793호 및 제5,837,458호 참조.
본 발명에 개시된 PCR 증폭을 위해, 임의의 관심 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터의 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에 사용하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 디자인하기 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)에 개시된다. PCR의 공지된 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 네스티드 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴성 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적 불일치 프라이머, 하나 이상의 DNA 세그먼트를 동시에 증폭하기 위해 여러 쌍의 프라이머 세트를 사용하는 다중 방법 등을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이머"는 DNA 중합효소를 부착시키는 증폭 표적에 대한 어닐링을 행할 수 있어, 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓일 때, 즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 중합화제의 존재하에서 및 적절한 온도 및 pH에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. (증폭) 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 단일 가닥일 수 있다. 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다. 프라이머는 중합화제의 존재 하에서 증량 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 조성(A/T 대 G/C 함량)을 포함하는 많은 요소에 따라 달라질 것이다. 한 쌍의 양방향성 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 하나의 순방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터"는 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로모터 서열은 근위 및 더 원위 상류 요소로 구성되고, 후자의 요소는 종종 인핸서로 불린다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며, 프로모터의 선천적인 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 요소일 수 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 완전히 유도되거나 자연계에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유도된 상이한 요소로 구성되거나 심지어 합성 DNA 단편을 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해한다. 예를 들어, 프로모터는 구성적이거나 내인성 또는 외인성 자극에 반응하는 방식으로 유전자의 발현 수준을 변경하는 데 사용될 수 있다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 일부 변이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 구조체", "발현 구조체", "키메라 구조체", "구조체" 및 "재조합 DNA 구조체"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 재조합 구조체는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열과 같은 핵산 단편의 인위적인 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구조체는 상이한 공급원으로부터 유도된 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유도되지만 자연계에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구조체는 그 자체로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우 벡터의 선택은 당업자에게 주지된 바와 같이 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용될 방법에 의존한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 분리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선별 및 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전자 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 상이한 독립적인 형질전환 사건이 발현의 상이한 수준 및 패턴을 유도한다는 것을 인식할 것이며(Jones et al., (1985) EMBO J. 4 : 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen Genetics 218 : 78-86), 따라서 다수의 사건은 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 라인을 수득하기 위해 선별돼야 한다. 이러한 선별은 다른 것들 중에서, 직접 서열화, DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 면역 블로팅 분석 또는 표현형 분석에 의해 실행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등일 수 있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제하지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오타이드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오타이드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 모두로 구성된 폴리뉴클레오타이드, 폴리-라이신-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 펩타이드-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이드된 DNA 등일 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "발현"은 기능적 최종 산물, 예를 들어 mRNA 또는 단백질(전구체 또는 성숙)의 생산을 의미한다.
"작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 본 발명에 따른 임의의 기능적 유전자 요소(예를 들어, 프로모터, 터미네이터, 데그론, 용해도 태그 등)의 추가 올리고-또는 폴리뉴클레오타이드와의 순차적 배열을 의미할 수 있다. 일부 경우에, 순차적 배열은 상기 추가 폴리뉴클레오타이드의 전사를 초래할 수 있다. 일부 경우에, 순차적 배열은 상기 추가 폴리뉴클레오타이드의 번역을 초래할 수 있다. 기능적 유전자 요소는 추가 올리고 또는 폴리뉴클레오타이드의 상류 또는 하류에 존재할 수 있다. 한 예에서, "작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 프로모터가 상기 프로모터에 인접하거나 하류 또는 3' 유전자의 전사를 제어함을 의미할 수 있다. 또 다른 예에서, "작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 터미네이터가 상기 터미네이터에 인접하거나 상류 또는 5' 유전자의 전사 종결을 제어함을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "관심 생성물" 또는 "생체 분자"는 원료로부터 미생물에 의해 생성된 임의의 생성물을 의미할 수 있다. 일부 경우에, 관심 생성물은 작은 분자, 효소, 펩타이드, 아미노산, 유기산, 합성 화합물, 연료, 알코올 등일 수 있다. 예를 들어, 관심 생성물 또는 생체 분자는 임의의 1차 또는 2차 세포외 대사산물일 수 있다. 1차 대사산물은 특히 에탄올, 시트르산, 락트산, 글루탐산, 글루탐산염, 라이신, 트레오닌, 트립토판 및 다른 아미노산, 비타민, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 2차 대사산물은 특히 페니실린과 같은 항생물질 또는 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제, 지베렐린과 같은 식물 호르몬, 로바스타틴과 같은 스타틴 약물, 그리세오풀빈과 같은 살균제 등일 수 있다. 관심 생성물 또는 생체 분자는 또한 카탈라아제, 아밀라아제, 펙티나아제, 글루코오스 아이소머라제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 리파아제, 락타아제, 스트렙토키나아제 및 여러 다른 것을 포함하는 미생물 효소와 같은 미생물에 의해 생성된 임의의 세포내 성분일 수 있다. 세포내 성분은 또한 인슐린, B형 간염 백신, 인터페론, 과립구 콜로니-자극 인자, 스트렙토키나아제 및 기타와 같은 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "HTP 유전 디자인 라이브러리" 또는 "라이브러리"는 본 발명에 따른 유전자 교란의 집합을 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 라이브러리는 i) 데이터베이스 또는 다른 컴퓨터 파일에서 서열 정보의 집합, ii) 상기한 일련의 유전자 요소를 포함하는 유전자 구조체의 집합, 또는 iii) 상기 유전자 요소를 포함하는 숙주 세포 균주로서 입증될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 라이브러리는 개별 요소의 집합(예를 들어, PRO 스왑 라이브러리를 위한 프로모터 집합 또는 STOP 스왑 라이브러리를 위한 터미네이터 집합, SOLUBILITY TAG 스왑 라이브러리용 단백질 용해도 태그 모음 또는 DEGRADATION TAG 스왑 라이브러리용 단백질 분해 태그 모음)을 의미할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 라이브러리는 프로모터:유전자, 유전자:터미네이터, 또는 심지어 프로모터:유전자:터미네이터의 조합과 같은 유전자 요소의 조합을 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 라이브러리는 또한 프로모터, 터미네이터, 단백질 용해도 태그 및/ 또는 단백질 분해 태그의 조합을 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 라이브러리는 숙주 유기체에서 라이브러리의 각 구성원을 적용하는 효과와 관련된 메타 데이터를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 라이브러리는 특정 종에서 하나 이상의 표현형에 대한 이들 조합의 얻어진 효과와 함께 프로모터::유전자 서열 조합의 집합을 포함할 수 있으며, 따라서 미래 프로모터 스왑에 상기 조합을 사용하는 미래 예측 가치를 개량시킨다.
본 발명에서 사용된 용어 "SNP"는 작은 핵 다형성(들)을 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 SNP는 광범위하게 해석되어야하며, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 서열 삽입, 결실, 역전 및 다른 서열 치환을 포함한다. 본 발명에서 사용된 용어 "비 동의" 또는 비 동의 SNP "는 숙주 세포 단백질에서 암호화 변화를 유도하는 돌연변이를 의미할 수 있다
게놈 공학의 "고 처리량(HTP)" 방법은 상기 방법의 적어도 하나의 단계를 수행하기 위한 자동화 장비(예를 들어, 액체 핸들러 또는 플레이트 핸들러 머신), 예를 들어, 많은 실험이나 조건을 평가할 수 있는 장비의 적어도 하나의 부품의 이용을 필요로 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있고 임의의 길이의 핵산을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 달리 명시되지 않는 한 단일 가닥(ss) 또는 이중 가닥(ds)일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성, 예를 들어 DNA 합성기에서 합성되거나, 자연 발생, 예를 들어 천연 공급원에서 추출되거나, 복제 또는 증폭된 물질에서 파생될 수 있다. 본 발명에서 언급된 폴리뉴클레오타이드는 변형된 염기 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "풀"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드의 집합을 의미할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 풀은 복수의 상이한 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 풀에 있는 폴리뉴클레오티드 세트는 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 12개 또는 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 또는 적어도 1000개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "어셈블링"은 2개 이상, 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 또는 15개 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 4개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 다른 폴리뉴클레오타이드에 결합되어 더 긴 폴리뉴클레오타이드를 만든다.
본 발명에 사용된 용어 "적절한 반응 조건 하에서 배양"은 원하는 결과, 즉 폴리뉴클레오타이드 어셈블리를 달성하기 위해 반응을 적합한 온도 및 시간으로 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 방법에서 사용되는 효소 및 시약에 적합한 반응 조건은 공지되어 있으며(예를 들어, 본 발명의 실시예에 기술된 바와 같음), 따라서 본 방법에 적합한 반응 조건을 쉽게 결정할 수 있다. 이러한 반응 조건은 사용되는 효소에 따라 (예를 들어, 최적 온도 등에 따라) 달라질 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "결합"은 두 서열 사이의 공유 결합의 생성을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "조성물"은 나열된 것들에 더하여 다른 시약, 예를 들어, 글리세롤, 염, dNTP 등을 함유할 수 있는 시약의 조합을 의미할 수 있다. 조성물은 임의의 형태, 예를 들어 수성 또는 동결 건조일 수 있고, 임의의 상태(예를 들어, 동결 또는 액체 형태)일 수 있다.
본 발명에 사용된 "벡터"는 이 속에 단편 또는 DNA 어셈블리가 통합되어 조작된 벡터가 숙주 세포에서 복제될 수 있는 적합한 DNA이다. 선형화된 벡터는 원형 벡터의 제한 엔도뉴클레아제 분해 또는 PCR에 의해 생성될 수 있다. 단편 및/또는 선형화된 벡터의 농도는 겔 전기 영동 또는 기타 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "인테그론"은 Gillings, Michael R, "Integrons: Past, Present, and Future" Microbiology and Molecular에 기술된 바와 같이 외인성 유전자, 인테그론 인테그라제(Intl)를 암호화하는 유전자, 인테그론 관련 재조합 부위(attl) 및 인테그론 관련 프로모터(Pc)를 포함하는 유전자 카세트를 포함하거나 함유하는 이동성 유전자 요소 또는 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)에 통합된 유전자 요소를 의미할 수 있으며, 이의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다.
개요
하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 데 사용하기 위한 조성물 및 키트가 본 발명에 제공된다. 또한, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하기 위해 미생물 숙주 세포의 게놈을 편집하는 방법이 본 발명에 제공된다. 이 방법은 미생물 숙주 세포의 게놈에 복수의 유전자 편집물을 풀링 방식으로 도입 및/또는 스태킹하는 데 유용할 수 있다. 게놈 내에서 복수의 유전자 편집의 도입 및/또는 스태킹을 용이하게 하기 위해, 미생물 숙주 세포는 부위-특이적 제한 효소 및/또는 하나 이상의 재조합 시스템을 포함할 수 있고 복수의 유전자 편집으로부터의 각각의 유전자 편집은 미생물 숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등) 내에 존재하는 유전자좌에 상동성인 이의 5' 및 3' 말단 모두 상의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 제공된 방법은 복구 또는 공여자 핵산, 예를 들어 선형 핵산 단편(단일 또는 이중 가닥)에 대한 유전자 편집을 미생물 숙주 세포에 도입하는 단계를 수반할 수 있다. 본 발명에 기술된 편집 방법은 본질적으로 풀링될 수 있으며, 이는 미생물 집단에서 여러 상이한 편집을 생성하기 위한 구성요소가 편집 라운드당 혼합되거나 풀링됨을 의미한다. 하나 이상의 라운드의 편집(예를 들어, 형질전환 및 선택)은 라운드 중 적어도 하나가 기능적 역선택(예를 들어, 항생제, 화학적 또는 온도 역선택)의 사용을 수반하지 않도록 본 발명에 기술된 편집 방법에서 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 복구 또는 공여자 핵산은 동일한 또는 개별 플라스미드 상에 존재하며, 이는 각 라운드의 편집에서 도입되고 형질전환 및 선택의 선행 및 후행 라운드에서 도입된 플라스미드 상에 존재하는 선택 가능한 마커 유전자와 상이한 선택 가능한 마커 유전자를 포함한다. 추가로, 형질전환 및 선택의 각 라운드에서 도입된 플라스미드는 이 방법 전반에 걸쳐 도입된 플라스미드에 대해 서로 동일한 복제 기점을 포함할 수 있다. 형질전환의 라운드에서 도입된 미생물 숙주 세포로부터 플라스미드의 경화 또는 제거는 현재 라운드의 역선택 가능한 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적 압력을 가하는 시약을 포함하는 배지 상에서의 성장을 통해 촉진될 수 있다. 또한, 미생물 숙주 세포의 게놈을 반복적 또는 비 반복적 방식으로 편집하기 위해 본 발명에 제공된 방법에서 사용하기 위한 조성물 및 키트가 본 발명에 제공된다. 유전자 편집은 삽입(예를 들어, 하나 또는 몇 개의 뉴클레오타이드의 작은 삽입에서 다중 유전자의 경로 삽입에 이르는 범위), 결실(예를 들어, 하나 또는 몇 개의 작은 결실에서 다중 유전자의 경로 결실에 이르는 범위), 단일 뉴클레오타이드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에서 형질전환의 각 라운드는 미생물 숙주 세포의 유전자 요소(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드) 내의 단일 유전자좌 내로 단일 유전자 편집을 도입하거나 미생물 숙주 세포의 유전자 요소(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드)을 갖는 복수의 유전자좌 내로 복수의 유전자 편집을 도입할 수 있다. 본 발명에 제공된 방법, 조성물 및 키트에 사용하기 위한 미생물 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.
한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포 게놈을 편집하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 제 1 복구 단편 및 선택 마커 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 미생물 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 제 1 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌 내에 또는 이에 인접하게 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함하고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상보성 또는 상동성인 서열을 포함한다; (b) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(a)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계. 한 실시태양에서, 편집 방법은 미생물 숙주 세포에 유전자 편집을 도입하는 단일 라운드를 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 반복적이고 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포에서 하나 이상의 추가 라운드에서 단계(a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 추가 라운드의 각각은 추가 복구 단편을 포함하는 추가 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 추가 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 유전자좌 내에 또는 이에 인접하게 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함하고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상보성 또는 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 추가 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하여, 미생물 숙주 세포 게놈을 반복적으로 편집한다. 하나 이상의 추가 라운드는 미생물 숙주 세포에 유전자 편집을 도입하는 것의 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000회 라운드일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자, 예를 들어, 본 발명에 제공된 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌는 제 1 유전자좌 또는 제 1 유전자좌의 다른 또는 제 1 유전자좌와 상이한 유전자좌일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌는 반복 방법의 다른 라운드로부터의 유전자좌와 동일한 유전자좌일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적으로 하는 유전자좌는 반복 방법의 다른 라운드로부터의 유전자좌의 다른 또는 상이한 유전자좌일 수 있다.
한 실시태양에서, 각각의 복구 단편(즉, 제 1 및/또는 추가 복구 단편(들))은 사전 복구 단편으로부터의 하나 이상의 유전자 편집과 동일한 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 동일한 유전자 편집에 대한 서열은 방법의 각 라운드(제 1 및/또는 추가 라운드)의 각 유전자좌에 도입될 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편(즉, 제 1 및/또는 추가 복구 단편(들))은 사전 복구 단편으로부터의 하나 이상의 유전자 편집으로서 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 상이한 유전자 편집에 대한 서열은 방법의 각 라운드(제 1 및/또는 추가 라운드)의 각 유전자좌에 도입될 수 있다. 한 실시태양에서, 복수의 상이한 제 1 복구 단편이 도입된다. 복수의 상이한 제 1 복구 단편은 상이한 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 복수의 상이한 추가 복구 단편이 도입된다. 복수의 추가 복구 단편의 복구 단편의 각각은 상이한 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법의 각 라운드에서 각각의 상이한 유전자좌에 도입된 유전자 편집은 동일한 유전자 편집이다. 한 실시태양에서, 이 방법의 각 라운드에서 각각의 상이한 유전자좌에 도입된 유전자 편집은 상이한 유전자 편집이다. 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 단계(a)-(c)를 반복하는 최종 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하는 단계(e)를 추가로 포함한다. 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 내에 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함할 수 있어 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈의 최종 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상보성 또는 상동성인 서열을 포함한다. 최종 유전자좌는 사전에 편집된 유전자좌와 상이한 유전자좌일 수 있다. 최종 플라스미드는 사전 라운드의 선택에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 말단 라운드 다음에 수행된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 관련된 서열에 상보성 또는 상동성인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 단계를 추가로 포함한다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 그러한 엔도뉴클레아제일 수 있다. gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)를 포함한다.
한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포 게놈을 편집하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 제 1 복구 단편 및 선택 마커 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 미생물 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 미생물 숙주 세포는 부위-특이적 제한 효소를 포함하고 또는 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 서열은 제 1 플라스미드와 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포 게놈의 제 1 유전자좌를 표적화하고(예를 들어, 결합한다), 여기서 제 1 복구 단편은 제 1 유전자좌 내에 또는 이에 인접하게 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함하고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상보성 또는 상동성인 서열을 포함한다; (b) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(a)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계. 한 실시태양에서, 편집 방법은 미생물 숙주 세포에 유전자 편집에 대한 서열을 도입하는 단일 라운드를 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 반복적이고 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포에서 하나 이상의 추가 라운드에서 단계(a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 추가 라운드의 각각은 추가 복구 단편을 포함하는 추가 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 추가 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 유전자좌 내에 또는 이에 인접하게 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함하고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상보성 또는 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 추가 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 부위-특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌 또는 상이한 유전자좌를 표적으로 하는 추가 플라스미드와 함께 미생물 숙주 세포에 도입되어, 미생물 숙주 세포 게놈을 반복적으로 편집한다. 하나 이상의 추가 라운드는 미생물 숙주 세포에 유전자 편집을 도입하는 것의 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000회 라운드일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자, 예를 들어, 본 발명에 제공된 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다. 한 실시태양에서, 단계(a)의 부위-특이적 효소는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌에서 서열을 절단한다. 한 실시태양에서, 단계(d)의 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌에서 서열을 절단한다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌는 제 1 유전자좌 또는 제 1 유전자좌의 다른 또는 제 1 유전자좌와 상이한 유전자좌일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌는 반복 방법의 다른 라운드로부터의 유전자좌와 동일한 유전자좌일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적으로 하는 유전자좌는 반복 방법의 다른 라운드로부터의 유전자좌의 다른 또는 상이한 유전자좌일 수 있다. 편집 방법의 각 라운드(예를 들어, 제 1 및/또는 추가 라운드)에 도입된 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포에서 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 편집 방법의 각 라운드(예를 들어, 제 1 및/또는 추가 라운드)에 도입된 복구 단편에 존재하는 각각의 유전자 편집은 미생물 숙주 세포의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 유전자좌에 상동성인 서열이 측면에 위치될 수 있다. 미생물 숙주 세포의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 각각의 복구 단편 또는 유전자 편집의 5' 및 3' 말단 모두에 존재할 수 있으며 상동성 암으로 지칭될 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편(즉, 제 1 및/또는 추가 복구 단편(들))은 사전 복구 단편 상에 존재하는 하나 이상의 유전자 편집으로서 동일한 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 동일한 유전자 편집에 대한 서열은 상기 방법의 각 라운드(제 1 및/또는 추가 라운드)의 각 유전자좌에 도입될 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편(즉, 제 1 및/또는 추가 복구 단편(들))은 사전 복구 단편 상에 존재하는 하나 이상의 유전자 편집으로서 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 상이한 유전자 편집에 대한 서열은 상기 방법의 각 라운드(제 1 및/또는 추가 라운드)의 각 유전자좌에 도입될 수 있다. 한 실시태양에서, 복수의 상이한 제 1 복구 단편이 도입된다. 복수의 상이한 제 1 복구 단편은 상이한 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 복수의 상이한 추가 복구 단편이 도입된다. 복수의 추가 복구 단편은 상이한 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법의 각 라운드에서 각각의 상이한 유전자좌에 도입된 유전자 편집은 동일한 유전자 편집이다. 한 실시태양에서, 이 방법의 각 라운드에서 각각의 상이한 유전자좌에 도입된 유전자 편집은 상이한 유전자 편집이다. 이 실시태양에 더하여, 미생물 숙주 세포에서 부위-특이적 제한 효소는 하나 이상의 반복 라운드에서 각각의 상이한 유전자좌에서 서열을 절단할 수 있다. 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 단계(a)-(c)를 반복하는 최종 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하는 단계(e)를 추가로 포함한다. 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 내에 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 최종 유전자좌는 사전에 편집된 유전자좌와 상이한 유전자좌일 수 있다. 최종 플라스미드는 사전 라운드의 선택에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 말단 라운드 다음에 수행된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 관련된 서열에 상보성 또는 상동성인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 단계를 추가로 포함한다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 그러한 엔도뉴클레아제일 수 있다. gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)를 포함한다.
한 실시태양에서, 상기 반복적 편집 방법은 본질적으로 풀링되며, 이는 미생물 집단에서 다중 편집을 생성하기 위한 구성요소가 편집 라운드당 혼합되거나 풀링됨을 의미한다. 이 실시태양에 더하여, 각각의 라운드 또는 형질전환은 2개 이상의 복구 단편을 포함하는 풀을 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 복구 단편은 2개 이상의 복구 단편의 서로 다른 복구 단편과 상이한 유전자좌를 표적으로 할 수 있다. 각각의 복구 단편은 2개 이상의 복구 단편의 서로 다른 수선 단편과 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 상기 반복적 편집 방법의 각 라운드 또는 형질전환은 라운드 또는 형질전환당 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 복구 단편을 포함하는 풀을 추가할 수 있다. 본 발명에 제공된 바와 같이, 2개 이상의 복구 단편의 각각은 편집 플라스미드로 지칭될 수 있는 플라스미드에 존재할 수 있다. 2개 이상의 복구 단편의 각각은 동일한 플라스미드에 존재할 수 있다. 2개 이상의 복구 단편의 각각은 상이한 플라스미드에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 각 라운드 또는 형질전환에 첨가된 2개 이상의 복구 단편의 각각은 본 발명에 제공된 바와 같은 2개 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 상이한 gRNA/복구 단편 쌍은 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 1000개의 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함할 수 있어서 미생물 숙주 세포의 편집된 집단에 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 1000개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성할 수 있다. 복구 단편 상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 본 발명에 제공된 바와 같이 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집 또는 다중 편집으로 이루어진 그룹로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 상동성 재조합을 독점적으로 이용하는 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법이 본 발명에 제공된다. 상동성 재조합은 상기 하나 이상의 유전적으로 변형된 미생물 균주를 생성하기 위해 사용된 미생물 숙주 세포에 대해 고유하거나 이종일 수 있다. 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; (b) 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드를 도입하는 단계; 및 (c) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계. 한 실시태양에서, 단계(b)는 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 상이한 편집 플라스미드를 도입함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것을 수반한다. 상이한 편집 플라스미드는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 1000개의 상이한 복구 단편을 포함할 수 있어서 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 1000개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성할 수 있다. 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드에 존재할 수 있다. 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 상이한 플라스미드에 존재할 수 있다. 하나 이상의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집 및 다중 편집 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹로부터 선택될 수 있다. 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다.
한 실시태양에서, 상동성 재조합을 독점적으로 이용하는 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 상기 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 단계(d)는 단계(b)에서 도입된 편집 플라스미드의 풀로부터 플라스미드의 제거를 용이하게 할 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법은 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계(e)를 추가로 포함하며, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하는 상동성 암을 포함하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있다. 한 실시태양에서, 이 방법은 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드를 도입하는 것을 포함하는 단계(f)를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계(g)를 추가로 포함한다.
하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하기 위한 상기 방법은 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 단계(d)-(g)를 반복하여 편집 플라스미드의 추가 풀 내의 각각의 편집 플라스미드가 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀에 존재하는 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하는 반복적 과정일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드는 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000회 라운드일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대해 상이한 서열을 포함할 수 있고 사전 편집 라운드로부터 상이한 선택 마커 유전자와 연관될 수 있다. 하나 이상의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하기 위한 방법은 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하는 단계(h)를 추가로 포함한다. 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드)에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있으며, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함한다. 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일하거나 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함할 수 있다. 최종 플라스미드는 사전 선별 라운드에서 도입된 선별 마커 유전자와 상이한 선별 마커 유전자에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연련된 서열에 상보적이거나 상동성인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 수복 단편의 제거를 용이하게 하는 단계를 추가로 포함한다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 이런 엔도뉴클레아제일 수 있다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 추가로 포함하거나 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 편집 플라스미드의 제 1 풀과 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다; (b) 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드를 도입하는 단계; 및 (c) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
한 실시태양에서, 단계(b)는 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 상이한 편집 플라스미드를 도입함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것을 수반한다. 상이한 편집 플라스미드는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 1000개의 상이한 복구 단편을 포함할 수 있어서 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 1000개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성할 수 있다. 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드 또는 상이한 플라스미드에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편은 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 편집 또는 각각의 복구 단편에 대한 각각의 서열은 미생물 숙주 세포에 존재하거나 미생물 숙주 세포 내로 도입된 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함한다. 미생물 숙주 세포에 존재하거나 도입된 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동인 서열은 복구 단편의 각각의 5' 및 3' 말단 둘 다 또는 하나 이상의 유전자 편집의 각각의 각각의 말단에 존재할 수 있고 상동성 암으로 지칭될 수 있어서 5' 말단의 상동성 암은 좌측 상동성 암으로 지칭될 수 있는 반면, 3' 말단의 상동성 암은 우측 상동성 암으로 지칭될 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포에 존재하거나 미생물 숙주 세포 내로 도입된 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 하나 이상의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 선택 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있고/있거나 본 발명에 제공된 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법은 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 단계(d)는 단계(b)에서 도입된 편집 플라스미드의 풀로부터 플라스미드의 제거를 용이하게 할 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법은 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계(e)를 추가로 포함하며, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하는 편집 플라스미드의 추가 풀과 함께 도입되고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드를 도입하는 것을 포함하는 단계(f)를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계(g)를 추가로 포함한다.
부위-특이적 제한 효소를 사용하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하기 위한 상기 방법은 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 단계(d)-(g)를 반복하여 편집 플라스미드의 추가 풀 내의 각각의 편집 플라스미드가 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀에 존재하는 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하는 반복적 과정일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드는 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000회 라운드일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포에 존재하거나 미생물 숙주 세포 내로 도입된 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대해 상이한 서열을 포함할 수 있고 사전 편집 라운드로부터 상이한 선택 마커 유전자와 연관될 수 있다. 하나 이상의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하기 위한 방법은 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하는 단계(h)를 추가로 포함한다. 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드)에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있으며, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함한다. 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일하거나 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함할 수 있다. 최종 플라스미드는 사전 선별 라운드에서 도입된 선별 마커 유전자와 상이한 선별 마커 유전자에 대한 서열과 연관될 수 있다. 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 포함하거나 부위 특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌를 표적으로 하는 최종 플라스미드와 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입된다. 한 실시태양에서, 이 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연련된 서열에 상보적이거나 상동성인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 수복 단편의 제거를 용이하게 하는 단계를 추가로 포함한다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 이런 엔도뉴클레아제일 수 있다.
본 발명에 제공된 임의의 방법 중 임의의 단계에 사용하기 위한 부위-특이적 제한 효소는 당업계에 공지된 임의의 부위-특이적 제한 효소일 수 있다. 부위-특이적 제한 효소는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 부위-특이적 제한 효소는 플라스미드 상에 암호화된다. 한 실시태양에서, 부위-특이적 제한 효소는 인테그론 상에 암호화된다. 한 실시태양에서, 부위-특이적 제한 효소는 게놈에 암호화된다. 한 실시태양에서, 부위-특이적 제한 효소는 RNA로부터 번역된다. 한 실시태양에서, 부위-특이적 제한 효소는 단백질로서 세포 내로 도입된다. 한 실시태양에서, 부위-특이적 제한 효소는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제일 수 있다. 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 유형 II, 유형 V 또는 유형 VI RNA 가이드 엔도뉴클레아제이다. 한 실시태양에서, CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 및 MAD7, 또는 이의 상동체, 이종 상동체, 돌연변이체, 변이체 또는 변형 버전으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 본질적으로 다중화이며, 이는 다중 유전자 편집이 라운드당 단일 미생물의 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)으로 도입될 수 있음을 의미한다. 이 실시태양에 추가로, 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포에서 핵산(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드) 내의 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 다중 유전자 편집을 위한 서열을 포함한다. 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 복구 단편의 각 유전자 편집에 대한 서열은 본 발명에 제공된 바와 같이 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집 또는 다중 편집으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 본 발명에 제공된 바와 같이, 각각의 복구 단편은 플라스미드에 존재할 수 있다. 하나 이상의 복구 단편을 포함하는 플라스미드는 편집 플라스미드로 지칭될 수 있다.
다른 실시태양에서, 미생물 숙주 세포 게놈을 편집하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 제 1 플라스미드, 제 1 가이드 RNA(gRNA) 및 제 1 복구 단편을 미생물 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하며, 여기서 제 1 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌 내에 또는 이에 인접하게 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함하고, 여기서 제 1 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 gRNA 및 복구 단편의 적어도 하나 또는 둘 다를 포함하며, 여기서 미생물 숙주 세포는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하고 또는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 제 1 플라스미드와 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입된다; (b) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(a)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; (c) 단계(b)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계. 한 실시태양에서, 편집 방법은 미생물 숙주 세포에 유전자 편집을 도입하는 단일 라운드를 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 반복적이고 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포에서 하나 이상의 추가 라운드에서 단계(a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하거나 수반하며, 여기서 하나 이상의 추가 라운드 각각은 추가 플라스미드, 추가 gRNA 및 추가 복구 단편을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 추가 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 추가 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 유전자좌 내에 또는 이에 인접하게 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함하고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 추가 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하고, 여기서 추가 플라스미드는 추가 gRNA 및 추가 복구 단편의 적어도 하나 또는 둘 다를 포함하여, 미생물 숙주 세포 게놈을 반복적으로 편집한다. 하나 이상의 추가 라운드는 미생물 숙주 세포에 유전자 편집을 도입하는 것의 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000회 라운드일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 가능한 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자, 예를 들어, 본 발명에 제공된 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다. 한 실시태양에서, 단계(a)의 RAN-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌에서 서열을 절단한다. 단계(d)의 RAN-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌에서 서열을 절단한다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌는 제 1 유전자좌 또는 제 1 유전자좌의 다른 또는 제 1 유전자좌와 상이한 유전자좌일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적화된 유전자좌는 반복 방법의 다른 라운드로부터의 유전자좌와 동일한 유전자좌일 수 있다. 하나 이상의 추가 라운드 각각에서 표적으로 하는 유전자좌는 반복 방법의 다른 라운드로부터의 유전자좌의 다른 또는 상이한 유전자좌일 수 있다.
한 실시태양에서, 제 1 플라스미드는 제 1 gRNA 및 제 1 복구 단편을 포함하고, 추가 플라스미드 각각은 추가 gRNA 및 추가 복구 단편을 포함한다. 한 실시태양에서, 제 1 gRNA는 선형 단편으로 제공된다. 한 실시태양에서, 각각의 추가 gRNA는 선형 단편으로서 제공된다. 한 실시태양에서, 제 1 gRNA 및 각각의 추가 gRNA는 선형 단편으로서 제공된다. 한 실시태양에서, 제 1 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 한 실시태양에서, 각각의 추가 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 한 실시태양에서, 제 1 gRNA 및 각각의 추가 gRNA 둘 모두는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 한 실시태양에서, 제 1 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)이다. 한 실시태양에서, 각각의 추가 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)이다. 한 실시태양에서, 제 1 gRNA 및 각각의 추가 gRNA 둘 모두는 단일 gRNA(sgRNA)이다. 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 이전 편집 라운드로부터의 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화할 수 있다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 상기 편집 방법의 각 라운드에서 gRNA에 의해 표적화된 각 유전자좌에서 미생물 숙주 세포 게놈의 서열을 절단할 수 있다.
본 발명에 제공된 방법의 연속적인 라운드에서 도입된 내부에 존재하는 복구 단편 또는 유전적 편집의 각각은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단된 표적화된 유전자좌 내에, 에서 또는 인접하여 서열에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 각각의 복구 단편의 5' 및 3' 말단 둘 다에 존재할 수 있거나 유전자 편집(들)에 대한 서열은 그 안에 존재할 수 있으며 상동성 암으로 지칭될 수 있다. 한 실시태양에서, 제 1 복구 단편은 선형 단편으로서 제공된다. 한 실시태양에서, 각각의 추가 복구 단편은 선형 단편으로서 제공된다. 한 실시태양에서, 제 1 복구 단편 및 각각의 추가 복구 단편 모두는 선형 단편으로서 제공된다. 한 실시태양에서, 제 1 복구 단편은 ssDNA 또는 dsDNA로서 제공된다. 한 실시태양에서, 각각의 추가 복구 단편은 ssDNA 또는 dsDNA로서 제공된다. 한 실시태양에서, 제 1 복구 단편 및 각각의 추가 복구 단편 모두는 ssDNA 또는 dsDNA로서 제공된다. 선형 단편은 하나 이상의 말단 변형을 포함할 수 있다. 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용될 수 있다. 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 각각의 복구 단편(즉, 제 1 및/또는 추가 복구 단편(들))은 사전 복구 단편으로부터의 하나 이상의 유전자 편집과 동일한 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 각각의 복구 단편(즉, 제 1 및/또는 추가 복구 단편(들))은 사전 복구 단편으로부터의 하나 이상의 유전자 편집으로서 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 복수의 상이한 제 1 복구 단편이 도입된다. 복수의 상이한 제 1 복구 단편의 상이한 제 1 복구 단편의 각각은 상이한 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 복수의 상이한 추가 복구 단편이 도입된다. 복수의 추가 복구 단편의 각각의 복구 단편은 상이한 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법의 각 라운드에서 각각의 상이한 유전자좌에 도입된 유전자 편집은 동일한 유전자 편집이다. 한 실시태양에서, 이 방법의 각 라운드에서 각각의 상이한 유전자좌에 도입된 유전자 편집은 상이한 유전자 편집이다. 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 단계(a)-(c)를 반복하는 최종 라운드에서 최종 플라스미드, 최종 gRNA 및 최종 복구 단편을 도입하는 것을 포함하는 단계(e)를 추가로 포함한다. 최종 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 최종 유전자좌는 미생물 숙주 세포에 사전에 도입된 gRNA에 의해 표적화된 임의의 유전자좌와 상이한 유전자좌일 수 있다. 최종 복구 단편은 최종 유전자좌에서 유전자 편집에 대한 서열에 의해 분리된 상동성 암을 포함할 수 있다. 상동성 암은 최종 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 최종 gRNA 및/또는 최종 복구 단편은 사전 선별 라운드에서 도입된 선별 마커 유전자와 상이한 선별 마커 유전자에 대한 서열과 연관될 수 있다. 최종 플라스미드는 최종 gRNA 및 최종 복구 단편 중 적어도 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 최종 gRNA는 선형 단편으로 제공된다. 한 실시태양에서, 최종 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 한 실시태양에서, 최종 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)이다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적이거나 상동성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하여 CRISPR을 통한 말단 라운드에 따른 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 것을 포함하는 단계(f)를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적이거나 상동성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 선형 단편으로서 제공된다. 한 실시태양에서, 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적이거나 상동성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 한 실시태양에서, 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적이거나 상동성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)이다.
한 실시태양에서, 상기 반복적 편집 방법은 본질적으로 풀링되며, 이는 미생물 집단에서 다중 편집을 생성하기 위한 구성요소가 편집 라운드당 혼합되거나 풀링됨을 의미한다. 이 실시태양에 더하여, 각각의 라운드 또는 형질전환은 2개 이상의 gRNA/복구 단편 쌍을 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 gRNA/복구 단편은 2개 이상의 gRNA/복구 단편의 서로의 gRNA/복구 단편과 상이한 유전자좌를 표적으로 할 수 있다. 다른 경우에, 각각의 gRNA/복구 단편 쌍은 2개 이상의 gRNA/복구 단편 쌍의 서로의 gRNA/복구 단편 쌍과 상이한 유전자 편집을 생성할 수 있다. 상기 반복적 편집 방법의 각 라운드 또는 형질전환은 라운드 또는 형질전환당 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 복구 단편을 포함하는 풀을 추가할 수 있다. 본 발명에 제공된 바와 같이, 2개 이상의 gRNA/복구 단편 쌍 각각은 플라스미드에 존재할 수 있다. 각 gRNA/복구 단편 쌍에서 gRNA 또는 복구 단편 중 하나 또는 둘 모두는 선형 단편일 수 있다. 선형 단편은 하나 이상의 말단 변형을 포함할 수 있다. 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용될 수 있다. 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 각 gRNA/복구 단편 쌍에서 gRNA 또는 복구 단편 중 하나 또는 둘 모두가 플라스미드에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 각 라운드 또는 형질전환에 추가된 2개 이상의 gRNA/복구 단편 쌍의 각각의 복구 단편은 2개 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있어서 2개 이상의 유전자 편집의 각각이 본 발명에 제공된 바와 같은 gRNA와 쌍을 이룬다. 상이한 gRNA/복구 단편 쌍은 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함할 수 있어서 미생물 숙주 세포의 편집된 집단에 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성할 수 있다. 복구 단편에 존재하는 각각의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 또는 다중 편집으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 각각의 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 다음을 포함한다: (i) 동일한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적으로 하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다; (ii) 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 동일한 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다; 또는 (iii) 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다; (b) 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체를 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체는 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및 (c) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계. 한 실시태양에서, 상이한 편집 구조체는 단계(b)에서 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전적으로 변형된 미생물 균주를 생성한다. 상이한 편집 구조체는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함할 수 있어서 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성할 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포의 기본 집단은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 기본 집단 내로 도입된다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 편집 플라스미드 상에서 암호화될 수 있고, 이에 의해 1개 이상의 편집 플라스미드의 도입 시에 미생물 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 편집을 생성하는 데 필요한 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제에 대한 서열, gRNA, 및 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 미생물 숙주 세포의 기본 집단에 존재하거나 도입된 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단할 수 있다. 적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드 또는 상이한 플라스미드에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 기본 집단에 존재하거나 도입된 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편의 하나 이상의 유전적 편집에 대한 각각의 서열은 미생물 숙주 세포의 기본 집단에 존재하거나 도입된 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함한다. 미생물 숙주 세포의 기본 집단에 존재하거나 도입된 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 유전자좌에 상보적이거나 상동인 서열은 복구 단편의 각각의 5' 및 3' 말단 둘 다 또는 하나 이상의 유전자 편집의 각각의 각각의 말단에 존재할 수 있고 상동성 암으로 지칭될 수 있어서 5' 말단의 상동성 암은 좌측 상동성 암으로 지칭될 수 있는 반면, 3' 말단의 상동성 암은 우측 상동성 암으로 지칭될 수 있다. 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포의 기본 집단에 존재하거나 도입된 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 하나 이상의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 편집 구조체의 제 1 풀은 하나 이상의 선형 단편을 추가로 포함한다. 가이드 RNA(gRNA)는 하나 이상의 선형 단편의 각각에 존재할 수 있다. 가이드 RNA(gRNA)는 하나 이상의 선형 단편 중 적어도 하나에 존재할 수 있다. 복구 단편은 하나 이상의 선형 단편의 각각에 존재할 수 있다. 복구 단편은 하나 이상의 선형 단편 중 적어도 하나에 존재할 수 있다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 선형 단편의 각각에 암호화될 수 있다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 선형 단편 중 적어도 하나에 암호화될 수 있다. 선형 단편은 상이한 선형 구조체일 수 있다. 한 실시태양에서, 편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 선형 단편을 추가로 포함한다. 2개 이상의 상이한 선형 단편의 각각은 상이한 복구 단편을 포함할 수 있다. 2개 이상의 상이한 선형 단편 중 적어도 하나는 상이한 복구 단편을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 gRNA를 포함한다. 2개 이상의 상이한 선형 단편의 각각은 상이한 gRNA를 포함할 수 있다. 2개 이상의 상이한 선형 단편 중 적어도 하나는 상이한 gRNA를 포함할 수 있다. 선형 단편은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA)일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 선형 단편은 하나 이상의 말단 변형을 포함할 수 있다. 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용될 수 있다. 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용될 수 있다. 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 각각의 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다.
한 실시태양에서, gRNA는 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 한 실시태양에서, 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 한 실시태양에서, gRNA 및 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재한다. 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화하고 편집하기 위한 gRNA는 동일한 편집 플라스미드에 존재할 수 있다. 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화하고 편집하기 위한 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재할 수 있다. 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재할 수 있다. 모든 유전자좌를 표적화하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재할 수 있다. 각각의 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다.
한 실시태양에서, 편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드를 포함한다. 한 실시태양에서, 상이한 유전자좌를 표적화하고 편집하기 위한 gRNA는 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재한다. 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 gRNA 또는 여러 상이한 gRNA를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 상이한 유전자좌를 표적화하고 편집하기 위한 복구 단편은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재한다. 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 또는 여러 상이한 복구 단편을 포함할 수 있다. 각각의 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다. 한 실시태양에서, 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 및 상이한 gRNA, 또는 여러 상이한 수선 단편 및 여러 상이한 gRNA를 포함한다.
한 실시태양에서, gRNA를 이용하는 하나 이상의 유전자 변형된 미생물 균주를 생성하기 위한 상기 방법은 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 것을 포함하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 단계 (d)는 단계(b)에서 도입된 편집 플라스미드(들)의 제거를 용이하게 할 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법은 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 것을 포함하는 단계(e)를 추가로 포함한다. 편집 구조체의 추가 풀 내의 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있고, 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 하나 이상의 편집 구조체를 도입하는 것을 포함하는 단계(f)를 추가로 포함하며, 여기서 편집 구조체는 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것을 포함하는 단계(g)를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 편집 플라스미드의 추가 풀 내의 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀 상에 존재하는 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다. 단계(f)에서 도입된 gRNA는 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있고, 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다.
gRNA를 사용하는 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하기 위한 상기 방법은 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 단계(d)-(g)를 반복하여 각 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드가 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 결합된 풀에 존재하는 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다. 하나 이상의 추가 라운드는 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000회 라운드일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포에 존재하거나 도입된 RNA-의존성 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대해 상이한 서열을 포함할 수 있고 사전 편집 라운드로부터 상이한 선택 마커 유전자와 연관될 수 있다. 하나 이상의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있고, 각각의 복구 단편은 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 동일한 유전자좌 또는 유전자좌에 상보적이거나 상동인 서열을 포함할 수 있고, 각각의 복구 단편은 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 상이한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 단계(f)는 단계(e)로부터 개별 미생물 숙주 세포 내로 하나 이상의 상이한 편집 구조체를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에서 도입된 gRNA 및/또는 복구 단편과 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단에서 하나 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성한다. 한 실시태양에서, 편집의 하나 이상의 추가 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화하고 사전 편집 라운드로부터의 상이한 항생제 선택 마커 유전자와 연관된다. 하나 이상의 상이한 편집 구조체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하는 상이한 gRNA를 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들은 임의의 사전에 표적화된 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이하다. 하나 이상의 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 상이한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 상이한 복구 단편을 포함할 수 있다. 편집 플라스미드의 제 1 및 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 미생물 숙주 세포와 사전에 조합된 편집 플라스미드의 서로의 또는 추가의 풀에서 각각의 편집 플라스미드와 비교하여 동일한 복제 기점 또는 동일한 부류의 복제 기점을 포함한다. 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가 풀의 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 선택 마커 유전자는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 선택 마커 유전자일 수 있다. 한 실시태양에서, 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자를 포함한다. 각각의 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다. 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대해 상이한 서열을 포함할 수 있고 사전 편집 라운드로부터 상이한 선택 마커 유전자와 연관될 수 있다. 하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 할 수 있고 사전 편집 라운드의 다른 항생제 선택 마커 유전자와 연관된다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법은 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 플라스미드, 최종 gRNA 및 최종 복구 단편을 도입하는 것을 포함하는 단계(h)를 추가로 포함한다. 최종 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 미생물 숙주 세포 내로 사전에 도입된 gRNA에 의해 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일하거나 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함할 수 있다. 최종 복구 단편은 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에서 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있을 수 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함한다. 최종 플라스미드, 최종 gRNA 및/또는 최종 복구 단편은 사전 선별 라운드에서 도입된 선별 마커 유전자와 상이한 선별 마커 유전자에 대한 서열과 연관될 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법은 최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연련된 서열에 상보적이거나 상동성인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 수복 단편의 제거를 용이하게 하는 단계를 추가로 포함한다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 이런 엔도뉴클레아제일 수 있다. 최종 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 최종 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다.
한 실시태양에서, gRNA를 이용하는 상기 방법은 본질적으로 다중화이며, 이는 다중 유전자 편집이 편집 라운드당 단일 미생물의 게놈에 도입될 수 있음을 의미한다. 이 실시태양에 더하여, 각 라운드 또는 형질전환에서 도입된 복구 단편은 여러 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고 여러 유전자 편집의 각각은 gRNA와 쌍을 이룬다. 또 다른 실시태양에서, 적어도 2개 이상의 상이한 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA가 도입되어, 각각의 gRNA가 동일하거나 상이한 복구 단편과 쌍을 이룬다. 한 실시태양에서, 다중 편집을 위한 복구 단편 및/또는 쌍을 이루는 gRNA는 선형 단편으로 존재한다. 선형 단편은 하나 이상의 말단 변형을 포함할 수 있다. 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용될 수 있다. 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 다중 편집을 위한 복구 단편 및/또는 쌍을 이루는 gRNA는 플라스미드 상에 존재한다. 한 실시태양에서, 다중 편집을 위한 복구 단편(들) 및 쌍을 이루는 gRNA(s)는 각각 동일한 플라스미드 상에 존재한다. 한 실시태양에서, 다중 편집을 위한 복구 단편 및 쌍을 이루는 gRNA는 쌍을 이루는 gRNA의 쌍을 이루는 각각의 gRNA가 쌍을 이루는 gRNA의 서로 쌍을 이룬 gRNA와 동일하거나 상이한 플라스미드에 존재하도록 상이한 플라스미드에 각각 존재한다. 각 라운드 또는 형질전환에 도입된 복구 단편은 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있고 각 유전자 편집은 gRNA와 쌍을 이룰 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 반복적 편집 방법의 각 라운드 또는 형질전환에서 도입된 gRNA는 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 유전자좌를 표적으로 할 수 있고 각각의 gRNA는 복구 단편과 쌍을 이룰 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에서 도입된 gRNA는 표적 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하고, 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내의 또는 이에 인접하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에서 도입된 gRNA는 사전 라운드의 편집에서 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하고 각각의 복구 단편은 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들 내의 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 유전자 편집을 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에서 도입된 gRNA는 사전 라운드의 편집에서 표적화된 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하고, 각각의 복구 단편은 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 상이한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 다른 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 상기 반복적 편집 방법의 각 라운드 또는 형질전환에서 도입된 상이한 gRNA는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 유전자좌를 표적화할 수 있고 각각의 gRNA는 복구 단편과 쌍을 이룰 수 있다. 복구 단편에 존재하는 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 또는 다중 편집으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 각각의 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하기 위해 본 발명에 제공된 임의의 방법에 사용하기 위한 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가 풀은 복수의 상이한 편집 플라스미드를 포함할 수 있다. 복수의 상이한 편집 플라스미드는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 편집 플라스미드일 수 있다. 편집 플라스미드의 제 1 또는 추가 풀의 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 제공된 바와 같은 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법은 0, 1 또는 복수의 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 미생물 숙주 세포의 제 1, 제 2 또는 추가 편집 집단을 생성할 수 있다. 복수의 게놈 편집은 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집일 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 다중 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포의 제 2 편집된 집단은 다중 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포의 각각의 추가의 편집된 집단은 다중 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에 사용하기 위한 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 플라스미드 상에 암호화된다. 플라스미드는 본 발명에 제공된 임의의 방법에 사용하기 위한 편집 플라스미드일 수 있다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 인테그론 상에 암호화된다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 게놈에 암호화된다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 RNA로부터 번역된다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 단백질로서 세포 내로 도입된다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제일 수 있다. 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 유형 II, 유형 V 또는 유형 VI RNA 가이드 엔도뉴클레아제이다. 한 실시태양에서, CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 및 MAD7, 또는 이의 상동체, 이종 상동체, 돌연변이체, 변이체 또는 변형 버전으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에서 사용하기 위한 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 시스템은 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, Red/ET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택된될 수 있다. 한 실시태양에서, 단백질 세트는 람다 레드 재조합 시스템으로부터의 것이며 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함한다. 한 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 본 발명에 제공된 방법 중 하나에서 단계(a) 이전에 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는, 예를 들어 하나 이상의 플라스미드 또는 인테그론을 통해 핵산으로서 미생물 숙주 세포에 도입된다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 미생물 숙주 세포의 게놈 내로의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 미생물 숙주 세포의 게놈 내로의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 한 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 오페론에 존재한다. 유도성 프로모터는 시약 또는 대사 산물의 추가 또는 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 본 발명에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 유도성 프로모터의 예는 IPTG-유도성 lac 프로모터 및 아라비노스-유도성 pBAD 프로모터를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 억제성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 오페론에 존재한다. 억제성 프로모터는 시약의 제거에 의해 유도될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 프로모터일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 억제성 프로모터의 예는 trp 프로모터를 포함할 수 있고 시약은 트립토판일 수 있다. 하나 이상의 재조합 시스템은 미생물 숙주 세포에 대해 이종성일 수 있다.
한 실시태양에서, (예를 들어, 단일, 다중 또는 풀링 방식으로) 미생물 숙주 세포 게놈을 편집하기 위한 본 발명에 제공된 임의의 방법은 특이적 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 미생물 숙주 세포의 성장 후에 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. (예를 들어, 단일, 다중 또는 풀링 방식으로) 미생물 숙주 세포 게놈을 편집하기 위해 본 발명에 제공된 방법은 다중 선택 단계를 사용하는 방법에서 선택 단계 사이에 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포 게놈을 반복적으로 편집하기 위해 본 발명에 제공된 방법은 편집의 모든 라운드 사이에 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법은 미생물 숙주 세포 내로 도입된 특정 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 미생물 숙주 세포의 성장 후 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 최종 단계, 예를 들어, 편집의 최종 단계 후에 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포 게놈을 반복적으로 편집하기 위해 본 발명에 제공된 방법은 편집의 최종 라운드 이후에만 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 30 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000회의 편집 라운드에 따라 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 유전자형 결정은 원하는 변형의 존재를 확인하기 위해 수행할 수 있다. 유전자형 결정은 콜로니 PCR, 제한 소화(Restriction digest), 생거 시퀀싱(Sanger sequencing), NGS(next-generation sequencing), 리포터 유전자 또는 항생제의 유무 검출, 또는 현장의 다른 표준 방법으로 수행될 수 있다. 유전적 편집은 또한 당업계에 공지된 임의의 차세대 시퀀싱 방법과 같은 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
다른 실시태양에서, 미생물 숙주 세포로부터 사전에 존재하는 플라스미드를 제거하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 미생물 숙주 세포에 제 1 선택 마커 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 도입하는 단계; 및 (b) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(a)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계, 여기서 사전에 존재하고 도입된 제 1 플라스미드는 동일한 복제 기원을 포함하여, 미생물 숙주 세포로부터 사전에 존재하는 플라스미드를 제거하고, 여기서 역선택은 사전에 존재하는 플라스미드의 제거를 용이하게 하기 위해 수행되지 않는다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 이 방법은 단계(b)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(c)를 추가로 포함한다. 또 다른 추가 실시태양에서, 이 방법은 하나 이상의 라운드에서 단계(a)-(c)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 라운드의 각각은 이전 라운드의 선택에 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하는 추가 플라스미드를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 사전에 존재하고 추가로 도입된 플라스미드는 동일한 복제 기점을 포함한다. 사전에 존재하는 플라스미드는 천연 플라스미드 또는 이종 플라스미드이다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시예에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 선택 마커 유전자는 본 발명에 제공된 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자와 같은 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다.
미생물 숙주 세포로부터 사전에 도입된 플라스미드를 반복적으로 제거하는 방법이 본 발명에 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 제 1 선택 마커 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 미생물 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (b) 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(a)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; (c) 단계(b)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계; 및 (d) 하나 이상의 라운드에서 단계(a)-(c)를 반복하는 단계, 여기서 하나 이상의 라운드의 각각은 이전 라운드의 선택에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하는 추가 플라스미드를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 제 1 및 추가 플라스미드는 미생물 숙주 세포 내로 사전에 도입된 제 1 또는 추가 플라스미드 서로에 대한 동일한 복제 기점을 포함하여, 미생물 숙주 세포로부터 사전에 도입된 제 1 또는 추가 플라스미드를 반복적으로 제거하고; 여기서 역선택은 사전에 존재하는 플라스미드의 제거를 용이하게 하기 위해 수행되지 않는다. 역선택은 미생물 숙주 세포에 의한 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 역선택 마커 유전자의 발현을 통한 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않는다. 다른 실시예에서, 역선택은 편집 라운드마다 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 역선택은 임의의 편집 라운드 후에 수행되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 교대하는 편집 라운드 후에만 수행된다. 또 다른 실시태양에서, 역선택은 편집의 최종 라운드 후에만 수행된다. 선택 마커 유전자는 본 발명에 제공된 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자와 같은 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다.
한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포로부터 플라스미드를 제거하기 위해 본 발명에 제공된 방법은 각 단계 사이에 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포 게놈으로부터 플라스미드를 제거하기 위해 본 발명에 제공된 방법은 선택 단계 사이에 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포 게놈으로부터 플라스미드를 제거하기 위해 본 발명에 제공된 방법은 최종 단계 후에 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 원하는 변형의 존재를 확인하기 위해 유전자형 분석을 수행할 수 있다. 유전자형 결정은 콜로니 PCR, 제한 소화(Restriction digest), 생거 시퀀싱(Sanger sequencing), NGS(next-generation sequencing), 리포터 유전자 또는 항생제의 유무 검출, 또는 현장의 다른 표준 방법으로 수행될 수 있다. 유전적 편집은 또한 당해 분야에 공지된 임의의 차세대 시퀀싱 방법과 같은 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법의 도입하는 단계는 미생물 숙주를 형질전환시키는 것을 포함한다. 미생물 숙주 세포의 형질전환은 예를 들어, 플라스미드와 같은 핵산을 미생물 숙주 세포로 형질전환 또는 도입하기 위해 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우에, 미생물 숙주 세포 내로 도입되는 핵산의 일부 또는 전부는 하나 이상의 플라스미드의 일부로서 도입될 수 있다. 다른 경우에, 미생물 숙주 세포 내로 도입되는 핵산의 일부 또는 전부는, 예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 선형 단편으로서 도입될 수 있다. 선형 단편으로 존재하는 임의의 핵산은 선형 단편이 단일 가닥이든 이중 가닥이든 본 발명에 제공된 임의의 방법, 조성물 또는 키트에 사용하기 위해 하나 이상의 말단 변형을 함유할 수 있다. 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용될 수 있다. 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에 사용되는 미생물 숙주 세포는 진핵 세포이다. 진핵 미생물 숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 진핵 미생물 숙주 세포일 수 있다. 한 실시태양에서, 진핵 미생물 숙주 세포는 효모 세포 또는 사상균류 세포이다. 효모 세포는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 효모 세포일 수 있다. 사상균류 세포는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 사상균류 세포일 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에 사용되는 미생물 숙주 세포는 원핵 세포이다. 원핵 미생물 숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 원핵 미생물 숙주 세포일 수 있다. 한 실시태양에서, 원핵 미생물 숙주 세포는 대장균(E. coli)의 균주이다. 대장균의 균주는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 균주일 수 있다. 예를 들어, 대장균 균주는 장독소성 대장균(ETEC), 장병원성 대장균 (EPEC), 장침입성 대장균(EIEC), 장출혈성 대장균(EHEC), 요로병원성 대장균(UPEC), 베로톡신 생성 대장균, 대장균 O157:H7, 대장균 O104:H4, 대장균 O121, 대장균 O104:H21, 대장균 K1, 대장균 NC101으로부터 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 원핵 미생물 숙주 세포는 바실러스 종 또는 이의 균주이다. 바실러스 종은 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 종일 수 있다. 바실러스 균주는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 균주일 수 있다. 한 실시태양에서, 원핵 미생물 숙주 세포는 코리네박테리움 종 또는 이의 균주이다. 코리네박테리움의 종은 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 종일 수 있다. 코리네박테리움의 균주는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 균주일 수 있다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 기술된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에 사용된 플라스미드는 선택 가능한 또는 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 선택 가능한 마커 유전자는 영양요구성 마커, 원영양 마커, 우성 마커, 열성 마커, 항생제 내성 마커, 이화작용 마커, 효소 마커, 형광성 마커, 발광성 마커 또는 이들의 조합일 수 있다. 한 실시태양에서, 선택 가능한 또는 선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자이다. 항생제 선택 마커 유전자는 당업계에 공지된 임의의 항생제 선택 마커 유전자일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에 사용되는 임의의 플라스미드에 사용되는 항생제 선택 마커 유전자는 미생물 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 원핵 숙주 세포의 경우, 항생제 선택 마커 유전자는 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 제오신, 스펙티노마이신/스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 당업계에 공지된 임의의 유전자일 수 있다. 진핵 숙주 세포의 경우, 항생제 선택 마커 유전자는 벨로마이신, 플레오마이신 제네티신, 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스티시딘, 제오신에 대한 내성을 부여하는 당업계에 공지된 임의의 유전자일 수 있다. 영양요구성 선택 마커 유전자는 특정 미생물 숙주 세포에 대해 당업계에 공지된 임의의 영양요구성 선택 마커 유전자일 수 있다. 원핵 세포에 대해 본 발명에 제공된 방법에 사용된 임의의 플라스미드에 사용되는 영양요구성 선택 마커 유전자는 공지된 아미노산 영양요구성 마커로부터 선택될 수 있다. 진핵 세포에 대해 본 발명에 제공된 방법에 사용되는 임의의 플라스미드에 사용되는 영양요구성 선택 마커 유전자는 효모 URA3, LYS2, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 및 ADE2 또는 이의 상동체 또는 이종 상동체로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 기술된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에 사용되는 플라스미드는 역선택 가능한 또는 역선택 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 역선택 가능한 마커 유전자는 종종 생산자 세포를 죽이는 독성 유전자 산물을 발현하는 "사망 유전자"라고도 하는 유전자일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 역선택 가능한 마커 유전자는 당업계에 공지된 임의의 '사망 유전자'일 수 있다. 한 실시태양에서, 역선택 가능한 또는 역선택 마커 유전자는 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 마커 유전자이다. 본 발명에 제공된 방법에 사용되는 임의의 플라스미드에 사용되는 역선택 가능한 마커 유전자는 미생물 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 원핵 숙주 세포(예를 들어, 대장균 또는 C. 글루타미쿰)의 경우, 역선택 가능한 마커 유전자는 sacB, rpsL(strA), tetAR, pheS, thyA, gata-1 또는 ccdB로부터 선택될 수 있으며, 이의 기능은 (Reyrat et al. 1998 "Counterselectable Markers: Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis." Infect Immun. 66(9): 4011-4017)에 기술된다. 진핵 숙주 세포의 경우, 역선택 가능한 마커 유전자는 효모 LYS2, TRP1, MET15, URA3, URA4+ 및 티미딘 키나제 또는 이의 상동체 또는 이종 상동체로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 기술된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에서 형질전환 및 선택의 임의의 라운드(들)에 사용되는 플라스미드는 각각 동일한 복제 기점을 포함할 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에서 유전자 편집을 도입하는 임의의 라운드(들)에서 사용되는 각각의 플라스미드에 의해 공유되는 복제 기점은 당업계에 공지된 임의의 복제 기점일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에 사용되는 임의의 플라스미드에 사용된 복제 기점은 미생물 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이고 임의의 편집 라운드(들) 동안 도입된 플라스미드 사이에서 공유되는 복제 기점은 특정 원핵 숙주 세포 유기체에 대해 당업계에 공지된 임의의 복제 기점이다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포는 대장균의 균주이고 임의의 편집 라운드(들) 동안 도입된 플라스미드 사이에서 공유되는 복제 기점은 oriR, colE1, p15A, pUC, pSC101 또는 R6K이다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포는 바실러스의 균주이고 연속적인 편집 라운드 동안 도입된 플라스미드 사이에서 공유되는 복제 기점은 pE194, pBAA1 또는 pUB110이다. 일부 실시태양에서, R6K 복제 기점은 pir 단백질의 존재에 조건부이다. 즉, 일부 실시태양에서, R6K 복제 기점을 포함하는 현재 개시된 벡터는 pir 유전자를 포함하는 숙주 세포에서만 증폭될 것이다. 한 실시태양에서, 미생물 숙주 세포는 코리네박테리움의 균주이고 임의의 편집 라운드 동안 도입된 플라스미드 사이에서 공유되는 복제 기점은 oriR, CASE1 또는 CG1이다.
또한 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 조성물이 본 발명에 제공된다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 조성물은 복구 단편의 풀을 포함한다. 한 실시태양에서, 풀은 복수의 단일 복구 단편을 포함한다. 한 실시태양에서, 풀은 복수의 복구 단편을 포함하여 풀에 있는 적어도 하나의 복구 단편이 복수의 복구 단편의 서로 상이한 복구 단편에 존재하는 서로 상이한 유전자 편집을 포함한다. 풀 내에 존재하는 복수의 복구 단편은 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 상이한 복구 단편일 수 있다. 한 실시태양에서, 복수의 복구 단편 중 적어도 하나의 복구 단편은 풀 내에서 서로 상이한 복구 단편에 의해 표적화된 유전자좌와 상이한 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드)의 유전자좌를 표적화할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편은 풀 내에서 서로 상이한 복구 단편에 의해 표적화된 유전자좌와 상이한 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드)의 유전자좌를 표적화할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 조성물에 존재하는 풀에 있는 각각의 복구 단편은 하나의 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 조성물에 존재하는 풀에 있는 각각의 복구 단편은 다중 유전자 편집에 대한 서열을 포함한다. 각각의 복구 단편은 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 복구 단편에 존재하는 각각의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 또는 다중 편집으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 유전자 편집은 프로모터, 데그론, 터미네이터, 단백질 용해도 태그 또는 분해 태그일 수 있다.
본 발명에 제공된 조성물에 존재하는 풀에 있는 각 복구 단편은 핵산의 선형 단편으로 존재할 수 있다. 핵산의 선형 단편은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 선형 단편은 하나 이상의 말단 변형을 포함할 수 있다. 말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용될 수 있다. 말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 조성물에 존재하는 풀에 있는 각각의 복구 단편은 플라스미드 또는 인테그론 내에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 조성물에 존재하는 풀에 있는 각각의 복구 단편은 풀에 있는 서로 상이한 복구 단편과 상이한 플라스미드 또는 인테그론 내에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 복구 단편은 플라스미드에 제공된다. 한 실시태양에서, 복구 단편을 포함하는 각각의 플라스미드는 하나 이상의 복제 기점을 추가로 포함한다. 각 플라스미드의 하나 이상의 복제 기점은 동일할 수 있다. 한 실시태양에서, 플라스미드는 플라스미드의 복제 동안 사용되는 미생물 숙주 세포(예를 들어, 대장균)에서 플라스미드의 유지를 촉진하는 제 1 복제 기점 및 본 발명에 제공된 유전자 편집 방법 중 하나에 사용되는 미생물 숙주 세포(예를 들어, C. 글루타미쿰)에서 플라스미드의 유지를 촉진하는 제 2 복제 기점을 포함한다..
한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 또는 복구 단편을 포함하는 핵산(예를 들어, 플라스미드)은 선택 마커 및/또는 역선택 마커를 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 선택 마커 유전자 및/또는 역선택 마커 유전자는 원영양 마커, 우성 마커, 열성 마커, 항생제 내성 마커, 이화작용 마커, 효소 마커, 형광성 마커, 발광성 마커 또는 이들의 조합일 수 있다. 한 실시태양에서, 선택 마커 유전자 및/또는 역선택 마커 유전자는 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 마커 유전자이다. 항생제 선택 마커 유전자는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 항생제 선택 마커 유전자일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에 사용되는 임의의 플라스미드에 사용되는 항생제 선택 마커 유전자는 미생물 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 바와 같은 조성물 내의 각각의 복구 단편 또는 복구 단편을 포함하는 핵산(예를 들어, 플라스미드)은 서로의 복구 단편 또는 복구 단편을 포함하는 서로의 핵산(예를 들어, 플라스미드)과 동일한 선택 마커 유전자를 포함한다.
각각의 복구 단편 또는 복구 단편 내에 존재하는 하나 이상의 유전적 편집은 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 복구 단편 또는 유전자 편집의 상류 또는 5' 및/또는 복구 단편 또는 유전자 편집의 하류 또는 3'에 위치할 수 있다. 복구 단편 또는 유전자 편집의 상류 또는 5'에 위치한 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 좌측 상동성 암으로 지칭될 수 있는 반면, 복구 단편 또는 유전자 편집의 하류 또는 3'인 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 우측 상동성 암으로 지칭될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 조성물은 편집 플라스미드의 풀을 포함한다. 편집 플라스미드의 풀은 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 상이한 편집 플라스미드를 포함할 수 있다. 풀에 있는 편집 플라스미드의 각각은 하나 이상의 복구 단편을 포함할 수 있다. 각각의 편집 플라스미드에 존재하는 하나 이상의 복구 단편은 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함할 수 있다. 복구 단편에 존재하는 각각의 유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 또는 다중 편집으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 유전자 편집은 프로모터, 데그론, 터미네이터, 단백질 용해도 태그 또는 분해 태그일 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 바와 같은 조성물 내의 편집 플라스미드 풀에 있는 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 바와 같은 조성물 내의 편집 플라스미드 풀 내의 각각의 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 바와 같은 조성물 내의 편집 플라스미드 풀 내의 각각의 편집 플라스미드는 역선택 마커 유전자를 포함한다. 편집 플라스미드 내의 선택 마커 유전자 및/또는 역선택 마커 유전자는 원영양 마커, 우성 마커, 열성 마커, 항생제 내성 마커, 이화작용 마커, 효소 마커, 형광성 마커, 발광성 마커 또는 이들의 조합일 수 있다. 한 실시태양에서, 선택 마커 유전자 및/또는 역선택 마커 유전자는 항생제, 화학 물질 또는 온도-민감성 마커 유전자이다. 항생제 선택 마커 유전자는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 항생제 선택 마커 유전자일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에 사용되는 임의의 플라스미드에 사용되는 항생제 선택 마커 유전자는 미생물 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 풀에 있는 각각의 편집 플라스미드는 하나 이상의 복제 기점을 추가로 포함한다. 각 편집 플라스미드 내의 하나 이상의 복제 기점은 동일할 수 있다. 한 실시태양에서, 플라스미드는 플라스미드의 복제 동안 사용되는 미생물 숙주 세포(예를 들어, 대장균)에서 플라스미드의 유지를 촉진하는 제 1 복제 기점 및 본 발명에 제공된 유전자 편집 방법 중 하나에 사용되는 미생물 숙주 세포(예를 들어, C. 글루타미쿰)에서 플라스미드의 유지를 촉진하는 제 2 복제 기점을 포함한다..
한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 또는 편집 플라스미드의 각각의 복구 단편 내에 존재하는 하나 이상의 유전자 편집은 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 복구 단편 또는 유전자 편집의 상류 또는 5' 및/또는 복구 단편 또는 유전자 편집의 하류 또는 3'에 위치할 수 있다. 복구 단편 또는 유전자 편집의 상류 또는 5'에 위치한 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 좌측 상동성 암으로 지칭될 수 있는 반면, 복구 단편 또는 유전자 편집의 하류 또는 3'인 핵산(예를 들어, 게놈 및/또는 플라스미드)에 존재하는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열은 우측 상동성 암으로 지칭될 수 있다.
한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 또는 편집 플라스미드의 각각의 복구 단편 내에 존재하는 하나 이상의 유전적 편집은 서로의 복구 단편 또는 풀에 있는 서로의 편집 플라스미드 내의 서로의 복구 단편 내에 존재하는 하나 이상의 유전적 편집에 의해 표적화된 유전자좌와 상이한 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드)의 유전자좌를 표적으로 하는 좌측 및 우측 상동성 암을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 또는 편집 플라스미드의 각각의 복구 단편 내에 존재하는 하나 이상의 유전적 편집은 서로의 또는 적어도 하나의 복구 단편 또는 풀에 있는 서로의 편집 플라스미드 내의 서로의 복구 단편 내에 존재하는 하나 이상의 유전적 편집에 의해 표적화된 유전자좌와 동일한 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)의 유전자좌를 표적으로 하는 좌측 및 우측 상동성 암을 포함할 수 있다.
본 발명에 제공된 임의의 조성물은 복구 단편에 존재하는 각각의 유전자 편집과 쌍을 이루는 가이드 RNA(gRNA)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 제공된 임의의 조성물에 존재하는 각각의 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 조성물에 존재하는 각각의 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성된다. 본 발명에 제공된 바와 같은 복구 단편에 존재하는 유전적 편집과 쌍을 이루는 gRNA는 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)의 유전자좌를 표적화할 수 있으며 이를 위해 유전자 편집 또는 상기 유전자 편집을 포함하는 복구 단편은 이에 대한 상보적 또는 상동성 서열을 포함하며 상기 유전자좌의 절단을 용이하게 할 수 있다. 본 발명에 제공된 바와 같이 복구 단편에 존재하는 유전적 편집과 쌍을 이루는 gRNA는 상기 유전자 편집과 동일한 플라스미드(예를 들어, 편집 플라스미드) 또는 상이한 플라스미드(예를 들어, 편집 플라스미드)에 존재할 수 있다. 상이하거나 별도의 플라스미드에 존재하는 경우, gRNA를 포함하는 플라스미드는 쌍을 이루는 유전자 편집을 포함하는 플라스미드 또는 쌍을 이루는 유전자 편집을 포함하는 복구 단편과 동일한 선택 마커 유전자 및/또는 역선택 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상이하거나 별도의 플라스미드에 존재하는 경우, gRNA를 포함하는 플라스미드는 쌍을 이루는 유전자 편집을 포함하는 플라스미드 또는 쌍을 이루는 유전자 편집을 포함하는 복구 단편과 동일한 복제 기점(들)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 제공된 바와 같이 복구 단편에 존재하는 유전자 편집과 쌍을 이루는 gRNA는 상기 유전자 편집과 동일한 선형 단편(단일 가닥 또는 이중 가닥) 또는 상이한 선형 단편(단일 가닥 또는 이중 가닥)에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 조성물 중 플라스미드(예를 들어, 편집 플라스미드) 또는 편집 구조체는 하나의 gRNA 또는 복수의 상이한 gRNA를 포함하여, 각각의 gRNA가 조성물에도 존재하는 복구 단편 상에 존재하는 유전자 편집과 쌍을 이루도록 한다. 복수의 상이한 gRNA는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 상이한 gRNA일 수 있다. 상기 플라스미드(예를 들어, 편집 플라스미드) 또는 편집 구조체 상의 각각의 gRNA와 쌍을 이루는 유전자 편집은 또한 상기 플라스미드(예를 들어, 편집 플라스미드) 또는 편집 구조체 상에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 조성물에 존재하는 선형 단편(단일 가닥 또는 이중 가닥)은 하나의 gRNA 또는 복수의 상이한 gRNA를 포함하여, 각각의 gRNA가 조성물에도 존재하는 복구 단편 상에 존재하는 유전자 편집과 쌍을 이루도록 한다. 복수의 상이한 gRNA는 적어도, 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 상이한 gRNA일 수 있다. 상기 선형 단편(단일 가닥 또는 이중 가닥) 상의 각 gRNA와 쌍을 이루는 유전자 편집은 또한 상기 선형 단편(단일 가닥 또는 이중 가닥)에 존재할 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 바와 같은 조성물은 하나 이상의 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 포함하는 미생물 숙주 세포를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 당업계에 공지된 임의의 부위-특이적 제한 효소일 수 있다. 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 핵산(예를 들어, 플라스미드 또는 인테그론) 상의 미생물 숙주 세포 또는 이의 기본 균주 내로 도입된다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 플라스미드 상에 암호화되고 미생물 숙주 세포 또는 이의 기본 균주 내로 도입된다. 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 본 발명에 제공된 바와 같이 1개 이상의 편집 플라스미드 상에서 암호화될 수 있다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각, 하나 이상의 gRNA, 및 하나 이상의 복구 단편에 대한 서열은 본 발명에 제공된 바와 같은 1개 이상의 편집 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 인테그론 상에서 암호화되고 미생물 숙주 세포 또는 이의 기본 균주 내로 도입된다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 게놈에 암호화된다. 한 실시태양에서, 부위-특이적 제한 효소는 RNA로부터 번역된다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 단백질로서 세포 내로 도입된다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제일 수 있다. 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 유형 II, 유형 V 또는 유형 VI RNA 가이드 엔도뉴클레아제이다. 한 실시태양에서, CRISPR-Cas 시스템 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 및 MAD7, 또는 이의 상동체, 이종 상동체, 돌연변이체, 변이체 또는 변형 버전으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 핵산(예를 들어, 플라스미드 또는 인테그론) 상의 미생물 숙주 세포 또는 이의 기본 균주 내로 도입된다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 인테그론 상에서 암호화되고 미생물 숙주 세포 또는 이의 기본 균주 내로 도입된다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 플라스미드 상에 암호화되고 미생물 숙주 세포 또는 이의 기본 균주 내로 도입된다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 본 발명에 제공된 바와 같이 1개 이상의 편집 플라스미드 상에서 암호화될 수 있다. 한 실시태양에서, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 하나 이상의 gRNA, 및 하나 이상의 복구 단편에 대한 서열은 본 발명에 제공된 바와 같은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재할 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법에서 사용하기 위한 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 시스템은 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, Red/ET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택된될 수 있다. 한 실시태양에서, 단백질 세트는 람다 레드 재조합 시스템으로부터의 것이며 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함한다. 한 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 본 발명에 제공된 반복적 편집 방법 중 하나에서 단계(a) 이전에 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는, 예를 들어 하나 이상의 플라스미드 또는 인테그론을 통해 핵산으로서 미생물 숙주 세포에 도입된다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 미생물 숙주 세포의 게놈 내로의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 미생물 숙주 세포의 게놈 내로의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 한 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 오페론에 존재한다. 유도성 프로모터는 시약 또는 대사 산물의 추가 또는 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 본 발명에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 유도성 프로모터의 예는 IPTG-유도성 lac 프로모터 및 아라비노스-유도성 pBAD 프로모터를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 억제성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 오페론에 존재한다. 억제성 프로모터는 시약의 제거에 의해 유도될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 프로모터일 수 있다. 본 발명에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 억제성 프로모터의 예는 trp 프로모터를 포함할 수 있고 시약은 트립토판일 수 있다. 하나 이상의 재조합 시스템은 미생물 숙주 세포에 대해 이종성일 수 있다.
응용분야
본 발명에 제공된 조성물 및 방법은, 예를 들어, 원하는 관심 생성물의 합성을 위한 미생물 숙주 세포 내의 경로의 디자인 또는 유전자 산물이 원하는 산물의 합성 또는 발현에서 역할을 하는 하나 이상의 서열의 최적화를 허용하는 매우 다양한 응용분야를 가질 수 있다. 본 발명에 제공된 조성물 및 편집 방법은 또한 유전자 또는 이의 발현의 최적화된 서열을 생성하거나 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 기능적 도메인 또는 모티프를 결합하는 데 사용될 수 있다. 유전자는 생화학 적 또는 대사 경로의 일부일 수 있다. 생화학적 또는 대사 경로는 원하는 관심 생성물을 생성할 수 있다.
원하는 관심 생성물은 세포 배양, 진핵 또는 원핵 발현 시스템 또는 트랜스 제닉 동물 또는 식물에서 어셈블될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 본 발명에 제공된 편집 방법 및 이에 사용하기 위한 조성물을 사용하여 변경된 유전자 및/또는 대사 경로를 갖는 미생물 숙주 세포 또는 이의 라이브러리를 생성할 수 있다. 본 발명에 제공된 편집 방법 및 이에 사용하기 위한 조성물은 관심 생성물을 생성하고/하거나 관심 생성물과 관련하여 원하는 특성을 갖는 미생물 숙주 세포 또는 이의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다. 원하는 특성은 원하는 관심 생성물의 높은 생산 수준, 관심 제품의 향상된 기능 또는 감소된 기능(이것이 유리한 경우)일 수 있다. 본 발명에서 제공되는 임의의 방법에서 추가 단계는 원하는 특성 또는 관심 생성물(들)의 존재에 대해 생성된 미생물 숙주 세포 또는 이의 라이브러리를 스크리닝하는 것을 수반할 수 있다. 이러한 스크리닝은 본 발명에 제공된 바와 같이 로봇/자동화될 수 있는 고처리량 방법에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명에 제공된 편집 방법은 원하는 관심 생성물을 생산하는 미생물 숙주 세포를 생산하거나 조작하기 위해 다양한 맥락에서 사용될 수 있다. 일부 경우에 관심 생성물은 소분자, 효소, 펩타이드, 아미노산, 유기산, 합성 화합물, 연료, 알코올 등일 수 있다. 예를 들어, 관심 생성물 또는 생체 분자는 1차 또는 2차 세포 외 대사 산물일 수 있다. 1차 대사 산물은 특히 에탄올, 시트르산, 젖산, 글루탐산, 글루타메이트, 라이신, 트레오닌, 트립토판 및 기타 아미노산, 비타민, 다당류 등일 수 있다. 2차 대사 산물은 특히 페니실린, 또는 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제, 지베렐린과 같은 식물 호르몬, 로바스타틴과 같은 스타틴 약물, 그리 세오 풀빈과 같은 살진균제 등과 같은 항생제 화합물일 수 있다. 관심 생성물 또는 생체 분자는 또한 카탈라아제, 아밀라아제, 프로테아제, 펙티나아제, 글루코스 이성화효소, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 리파아제, 락타아제, 스트렙토키나아제 등을 포함한 미생물 효소와 같은 숙주 세포에 의해 생성된 다음과 같은 세포 내 성분일 수 있다. 세포 내 성분은 또한 인슐린, B 형 간염 백신, 인터페론, 과립구 콜로니 자극 인자, 스트렙토키나아제 등과 같은 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 관심 생성물은 관심 단백질을 지칭할 수도 있다.
재조합 시스템
본 발명에 제공된 한 양태에서, 미생물 숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈, 코스미드, 또는 플라스미드)를 편집하거나 이로부터 균주를 생성하기 위한 본 발명에 제공된 방법은 미생물 숙주 세포에서 상동성 재조합 시스템의 사용을 수반할 수 있다. 상동성 재조합 시스템은 숙주 세포에 고유하거나 세포 숙주에 도입될 수 있다. 상동성 재조합 시스템에 대한 유전자는 플라스미드에 도입되거나, 선형 DNA 단편에 도입되거나, RNA 또는 RNA 세트로 도입 및 번역되거나, 단백질 또는 단백질 세트로 도입될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에서 상동성 재조합(예를 들어, 천연 상동성 재조합)의 사용은 다중 라운드 방법의 각 라운드에서 플라스미드의 풀을 사용할 수 있다. 풀에 있는 각 플라스미드는 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)의 영역에 상동성인 서열(예를 들어, 좌측 및 우측 상동성 암)을 포함할 수 있어 좌측 및 우측 상동성 암이 디자인된 유전자 편집(예를 들어 프로모터 또는 다른 서열 삽입, 치환, SNP, 터미네이터, 데그론, 태그에 대한 서열, 분해 신호 또는 결실에 대한 서열)에 의해 분리된다. 풀에 있는 각각의 플라스미드의 다른 특징은 선택 가능한 마커 유전자(예를 들어, 본 발명에 제공된 바와 같은 영양요구성 또는 항생제 선택 마커 유전자), 역선택 가능한 마커 유전자(예를 들어, 각각 수크로오스 및 4-클로로-페닐알라닌의 존재하에 독성을 부여하는 SacB 또는 PheS) 및 복제 기점(예를 들어, R6K)을 포함할 수 있다. 반복적 편집 방법의 각 라운드에서 사용되는 플라스미드 풀의 각 플라스미드는 동일한 복제 기점을 가질 수 있다. 반복적 편집 방법의 한 라운드에서 사용되는 플라스미드 풀의 각 플라스미드는 편집 방법의 서로 다른 라운드에서 사용되는 플라스미드 풀의 각 플라스미드와 동일한 복제 기점을 가질 수 있다.
유전자 편집을 위한 상동성 암 및 서열을 포함하는 각각의 플라스미드가 생성되면, 이들은 정의된 비율(예를 들어, 등몰)로 혼합되거나 풀링될 수 있고 본 발명에 제공된 임의의 방법(예를 들어, 전기천공, 접합 등을 통한 형질전환)을 사용하여 미생물 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법의 각 라운드는 2개 이상의 플라스미드의 풀을 포함한다. 각 라운드가 플라스미드의 2개 이상의 풀을 포함하는 실시태양에서, 풀은 정의된 비율(예를 들어, 등몰) 비율로 혼합될 수 있다.
형질전환 후, 생성된 형질전환체는 회수될 수 있다. 회수 조건(예를 들어, 시간 및 온도)은 풀링된 라이브러리에서 바이어스(bias)를 생성할 가능성을 최소화하거나 줄이기 위해 선택될 수 있다(예를 들어, 일부 편집된 균주는 편집 방법을 사용할 수 있으며 다른 편집되거나 편집되지 않은 균주보다 더 많거나 덜 빈번할 수 있고/또는 더 빠르거나 느리게 성장할 수 있다).
회수 후, 본 발명에 제공된 방법의 각 라운드에서 생성된 형질전환체는 배지에 플레이팅되어 특정 라운드에서 사용되는 선택 가능한 마커 유전자를 발현하는 형질전환체를 선택할 수 있다. 상동성 암을 포함하는 플라스미드와 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)의 표적 유전자좌가 있는 플라스미드의 재조합은 플라스미드에 존재하고 디자인된 유전자 편집의 측면에 있는 상동성 암에 의해 표적화된 2개의 상동성 부위 중 하나에서 발생할 수 있다.
선택 배지에서 콜로니로 성장한 생성된 형질전환체는 선택 배지에서 긁어내고 희석하고 제 2 유형의 선택 배지(예를 들어, 역선택 배지)에 플레이팅될 수 있다. 이 단계는 표적 유전자좌를 소유하는 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)이 좌측 또는 우측 상동성 암에서 제 2 재조합 이벤트를 거친 세포(및 콜로니)의 유도 및 선택을 허용할 수 있다. 제 2 재조합 이벤트가 제 1 재조합 이벤트와 동일한 상동성 암에서 발생한 경우, 시작 균주가 다시 만들어질 수 있다. 제 2 재조합 이벤트가 두 번째 재조합 부위에서 발생한 경우, 생성된 형질전환체는 원하는 유전자 편집을 포함할 수 있다. 따라서, 역선택 배지에서 성장하는 콜로니 집단은 편집되지 않은 균주와 편집된 균주의 혼합물을 모두 포함하며, 각각은 특정 편집 라운드에서 도입된 플라스미드 풀에 포함된 편집 중 하나를 포함한다.
본 발명에 제공된 바와 같이, 다중 라운드 반복적 편집 방법의 특정 라운드에 도입된 플라스미드 풀의 제거는 특정 라운드에서 형질전환체에 의해 발현되는 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 형질전환체를 성장시킴으로써 촉진될 수 있다.
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 바와 같은 상동 재조합을 이용하는 방법에 의해 생성된 형질전환체 또는 균주에서 원하는 유전자 편집(들)의 확인 및/또는 동정은 선택 및/또는 역선택 후 상기 형질전환체 또는 균주의 유전자형을 결정함으로써 달성될 수 있다. 유전자형 결정은 PCR 및/또는 본 발명에 제공된 차세대 시퀀싱을 사용하여 수행될 수 있다.
루프-인/루프-아웃
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체로부터 선택된 DNA 영역을 루핑 아웃하는 방법을 교시한다. 루핑 아웃 방법은 Nakashima et al. 2014 "Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing." Int. J. Mol. Sci. 15(2), 2773-2793에 기술된 것일 수 있다. 루핑 아웃 결실 방법은 당업계에 공지되어 있고 (Tear et al. 2014 "Excision of Unstable Artificial Gene-Specific inverted Repeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli." Appl. Biochem. Biotech. 175:1858-1867)에 기술되어 있다. 본 발명에 제공된 방법에 사용된 루핑 아웃 방법은 단일 교차 상동성 재조합을 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시태양에서, 선택된 영역의 루핑 아웃은 단일 교차 상동성 재조합을 사용하는 것을 수반할 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 조성물, 방법 또는 키트는 상동성 암(예를 들어, 좌측/우측 상동성 암) 및 그 사이에 위치한 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 복구 단편을 포함하거나 사용하여 상기 복구 단편이 루프 아웃 벡터 역할을 할 수 있는 플라스미드에 각각 위치한다. 한 실시태양에서, 단일-교차 상동성 재조합은 상기 벡터를 루프 인하기 위해 상동성 암 및 그 사이에 위치한 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 복구 단편을 포함하는 루프 아웃 벡터와 숙주 세포 게놈 사이에 사용된다. 루프 아웃 벡터 내의 유전적 편집의 서열은 기존 또는 도입된 근처 숙주 서열의 직접 반복인 서열로 디자인될 수 있어, 직접 반복이 루핑 및 결실을 위해 예정된 DNA 영역의 측면에 위치한다. 삽입되면, 루프 아웃 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 세포는 선택 영역의 결실을 위해 카운터 선택될 수 있다.
본 발명에 제공된 한 양태에서, 미생물 숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈, 코스미드, 또는 플라스미드)를 편집하기 위한 본 발명에 제공된 방법은 하나 이상의 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트의 사용을 수반할 수 있다. 상기 재조합 시스템은 미생물 숙주 세포에 내인성일 수 있거나 이종적으로 도입될 수 있다. 하나 이상의 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 핵산(예를 들어, 플라스미드, 선형 DNA 또는 RNA 또는 인테그론)으로 도입되어 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 염색체 외 요소에서 안정적으로 발현될 수 있다. 하나 이상의 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 RNA로 도입되어 숙주 세포에 의해 번역될 수 있다. 하나 이상의 이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 숙주 세포에 단백질로 도입될 수 있다. 하나 이상의 재조합 시스템의 단백질 세트는 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, Red/ET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 오쏠로그 또는 동종 상동체, RecET 재조합 시스템, 또는 Red/ET 재조합 시스템 또는 이들의 조합에서 유래될 수 있다. RecET 재조합 시스템의 재조합 방법 및/또는 단백질 세트는 Zhang Y., Buchholz F., Muyrers J.P.P. and Stewart A.F. "A new logic for DNA engineering using recombination in E. coli." Nature Genetics 20 (1998) 123-128; Muyrers, J.P.P., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A.F. "Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination." Nucleic Acids Res. 27 (1999) 1555-1557; Zhang Y., Muyrers J.P.P., Testa G. and Stewart A.F. "DNA cloning by homologous recombination in E. coli." Nature Biotechnology 18 (2000) 1314-1317 and Muyrers JP et al., "Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA" Trends Biochem Sci. 2001 May;26(5):325-31에 기술된 것 중 임의의 것일 수 있으며, 이는 본 발명에 참조로 포함된다. Red/ET 재조합 시스템의 단백질의 세트는 Rivero-Muller, Adolfo et al. "Assisted large fragment insertion by Red/ET-recombination (ALFIRE)--an alternative and enhanced method for large fragment recombineering" Nucleic acids research vol. 35,10 (2007): e78에 기술된 것 중 임의의 것일 수 있으며, 이는 본 발명에 참조로 포함된다.
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법을 사용하여 단독으로 도입되거나 풀링될 수 있는 유전자 편집은 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 터미네이터, 용해도 태그, 분해 태그 또는 디그론), 변형된 형태의 유전자(예를 들어, 원하는 SNP(s)를 갖는 유전자), 안티센스 핵산, 및/또는 대사 또는 생화학적 경로의 일부인 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 변형은 예를 들어 단일 유전자 또는 복수의 유전자를 불활성화시키기 위한 하나 이상의 결실을 수반한다. 한 실시태양에서, 변형은 숙주 세포의 유전자 편집을 수반한다. 유전자 편집은 숙주 세포의 게놈 및/또는 예를 들어 플라스미드 또는 코스미드와 같은 숙주 세포에 존재하는 별도의 유전 요소를 편집하는 것을 수반할 수 있다.
람다 레드 매개 유전자 편집
본 발명에 제공된 한 양태에서, 미생물 숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈, 코스미드 또는 플라스미드)을 편집하기 위해 본 발명에 제공된 방법은 람다 레드 매개 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트의 사용을 수반할 수 있다. 본 발명에 제공된 임의의 방법에서 람다 레드-매개 상동 재조합의 사용은 Datsenko and Wanner, PNAS USA 97:6640-6645 (2000)에 기술된 바와 같을 수 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다. 람다 레드 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 엑소, 베타 또는 감마 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. Gam은 내인성 RecBCD 및 SbcCD 뉴클레아제가 미생물 숙주 세포에 도입된 선형 DNA를 분해하는 것을 방지할 수 있는 반면, exo는 5' 말단에서 시작하여 선형 dsDNA를 분해할 수 있고 2개의 가능한 산물(즉, 단일 가닥 3' 오버행이 있는 부분 dsDNA 듀플렉스 또는 전체 상보적 가닥이 분해된 ssDNA)을 생성할 수 있는 5' → 3' dsDNA 의존성 엑소뉴클레아제이며 베타는 Exo에서 생성된 ssDNA를 보호하고 세포에서 상보적 ssDNA 표적에 대한 어닐링을 촉진할 수 있다. 베타 발현은 blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering에 기술된 대로 ssDNA 올리고 기질과의 람다 레드 기반 재조합에 필요할 수 있으며, 이는 참조로 본 발명에 포함된다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 편집 방법은 blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering에 기술된 DY380 균주와 같은 람다 적색 재조합 유전자를 이미 안정적으로 발현하는 미생물 숙주 세포에서 구현되며, 이는 참조로 본 발명에 포함된다. 람다 레드 재조합 시스템의 성분을 포함하고 본 발명에 제공된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 다른 박테리아 균주는 Thomason et al (Recombineering: Genetic Engineering in Bacteria Using Homologous Recombination. Current Protocols in Molecular Biology. 106:V:1.16:1.16.1-1.16.39) 및 Sharan et al (Recombineering: A Homologous Recombination-Based Method of Genetic Engineering. Nature protocols. 2009;4(2):206-223)에서 발견될 수 있고, 이의 각각의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다.
본 발명에 제공된 바와 같이, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 본 발명에 제공된 임의의 편집 방법의 구현 전에 미생물 숙주 세포로 도입될 수 있다. 람다 레드 재조합 시스템의 각 단백질에 대한 유전자는 핵산(예를 들어, 플라스미드, 선형 DNA 또는 RNA, 미니-λ, 람다 레드 프로파지 또는 인테그론)에 도입되어 숙주의 게놈에 통합되거나 세포 또는 염색체 외 요소에서 발현될 수 있다. 일부 경우에, 람다 레드 재조합 시스템의 각 성분(즉, exo, beta, gam 또는 이들의 조합)은 RNA로 도입되어 숙주 세포에 의해 번역될 수 있다. 일부 경우에, 람다 레드 재조합 시스템의 각 성분(즉, exo, beta, gam 또는 이들의 조합)은 숙주 세포에 단백질로 도입될 수 있다.
한 실시태양에서, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트에 대한 유전자는 플라스미드 상에 도입된다. 플라스미드 상의 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는, 예를 들어, 내인성 파지 pL 프로모터와 같은 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 한 실시태양에서, 플라스미드 상의 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 유도성 프로모터는 시약의 첨가 또는 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 한 실시태양에서, 플라스미드 상의 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 IPTG-유도성 lac 프로모터 또는 아라비 노스-유도성 pBAD 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트에 대한 유전자를 발현하는 플라스미드는 또한 각각, 예를 들어, IPTG-유도성 lac 프로모터, 아리비노스-유도성 pBAD 프로모터 및 내인성 파지 pL 프로모터와 관련된 lacI, araC 또는 cI857 억제자와 같은 특정 프로모터와 관련된 억제자를 발현할 수 있다.
한 실시태양에서, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트에 대한 유전자는 미니-λ 상에 도입되며, 이는 미생물 숙주 세포에 도입될 때 blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering에 기술된 바와 같이 게놈 속에 통합되는 결함이 있는 복제되지 않는 원형 파지 DNA 조각이며, 이의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다.
한 실시태양에서, 람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트에 대한 유전자는 람다 레드 프로 파지에 도입되며, 이는 blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering에 기술된 바와 같이 람다 레드 재조합 시스템을 미생물 숙주 세포로 안정적으로 통합할 수 있게 하며, 이의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다.
한 실시태양에서, 람다 적색 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 포함하는 미생물 숙주 게놈을 편집하기 위해 본 발명에 제공된 임의의 방법은 복구 단편을 단독으로 또는 gRNA와 쌍으로 사용하여 각각의 복구 단편 및/또는 쌍을 이루는 gRNA가 DNA의 선형 단편으로 존재한다. DNA의 선형 단편은 ssDNA 또는 dsDNA일 수 있다. 복구 단편 및/또는 gRNA를 포함하는 선형 단편은 선택성 마커 유전자 및/또는 역선택성 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다. dsDNA 또는 ssDNA 선형 단편의 사용은 복구 단편 또는 gRNA의 크기 또는 길이에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, dsDNA 선형 단편은 복구 단편이 약 20개 뉴클레오타이드보다 큰 유전자 편집(예를 들어, 삽입 또는 결실)을 포함할 때 사용될 수 있는 반면, ssDNA 선형 단편은 복구 단편이 약 20개 미만의 뉴클레오타이드인 유전자 편집(예를 들어, 삽입 또는 결실)을 포함할 때 사용될 수 있다.
본 발명에 제공된 바와 같이, 복구 단편 또는 복구 단편 상에 존재하는 유전자 편집은 미생물 숙주 세포 내에 존재하는 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)의 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하는 상동성 암을 포함할 수 있다. 복구 단편 상에 존재하거나 유전자 편집에 인접하는 상동성 암은 종점을 포함하여 각각 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 125, 125 내지 150, 150 내지 175 또는 175 내지 200개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 복구 단편에 존재하거나 유전자 편집에 인접하는 상동성 암은 각각 적어도, 최대 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
CRISPR 매개 유전자 편집
본 발명에 제공된 한 양태에서, 미생물 숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈, 코스미드 또는 플라스미드)을 반복적으로 편집하기 위한 본 발명에 제공된 방법은 CRISPR의 사용을 수반할 수 있다. 본 발명에 제공된 바와 같이, CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 방법의 실행 전에 미생물 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 핵산(예를 들어, 플라스미드, 선형 DNA 또는 RNA, 또는 인테그론)으로 도입될 수 있고 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 염색체외 요소로부터 발현될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 RNA로 도입되어 숙주 세포에 의해 번역될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 단백질로 숙주 세포에 도입될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드 및 파지 내에 존재하는 것과 같은 외래 유전자 요소에 대한 내성을 부여하고 획득된 면역의 형태를 제공하는 원핵 면역 시스템이다. CRISPR은 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat을 나타내며, cas는 CRISPR-관련 시스템(CRISPR-associated system)을 나타내며, CRISPR 복합체와 관련된 작은 cas 유전자를 지칭한다.
CRISPR-Cas 시스템은 클래스 1 또는 클래스 2 시스템으로 가장 광범위하게 특징지어진다. 이 두 시스템의 주요 특징은 Cas-효과기 모듈의 특성이다. 클래스 1 시스템은 간섭을 중재하기 위해 복합체("캐스케이드 복합체"로 지칭됨)에 다수의 Cas 단백질의 조립을 필요로하는 반면, 클래스 2 시스템은 간섭을 중재하기 위해 큰 단일 Cas 효소를 사용한다. 클래스 1 및 클래스 2 시스템 각각은 특정 Cas 단백질의 존재에 기초하여 다수의 CRISPR-Cas 유형으로 추가로 분할된다. 예를 들어, 클래스 1 시스템은 다음 세 가지 유형으로 나뉜다: Cas3 단백질을 포함하는 타입 I 시스템; Cas 10 단백질을 함유하는 타입 III 시스템; 및 Cas8-유사 단백질인 Csf1 단백질을 함유하는 추정 타입 IV 시스템. 클래스 2 시스템은 일반적으로 클래스 1 시스템보다 덜 일반적이며 다음 세 가지 유형으로 더 나뉜다: Cas9 단백질을 포함하는 타입 II 시스템; Cas 12a 단백질(사전에 Cpf1로 알려짐, 본 발명에서 Cpf1이라고 함), Cas 12b(사전에 C2c1로 알려짐), Cas 12c(사전에 C2c3로 알려짐), Cas 12d(사전에 CasY로 알려짐) 및 Casl2e(사전에 CasX로 알려짐)를 함유하는 타입 V 시스템; 및 Casl3a(사전에 C2c2로 알려짐), Casl3b 및 Casl3c를 함유하는 타입 VI 시스템. Pyzocha et al., ACS Chemical Biology, Vol. 13 (2), pgs. 347-356. 일 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 CRISPR-Cas 시스템은 클래스 2 시스템이다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 CRISPR-Cas 시스템은 타입 II, 타입 V 또는 타입 VI 클래스 2 시스템이다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 CRISPR-Cas 시스템은 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c 및 MAD7 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택된 구성요소를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 CRISPR-Cas 시스템은 Cpf1, 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 CRISPR-Cas 시스템은 MAD7, 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체를 포함한다.
본 발명에 개시된 방법에 사용된 CRISPR 시스템은 본 발명에서 Cas 효과기 단백질로 지칭되는 하나 이상의 핵산(예를 들어, RNA) 가이드 CRISPR-관련(Cas) 뉴클레아제를 포함하는 Cas 효과기 모듈을 포함한다. 일부 실시태양에서, Cas 단백질은 하나 또는 다수의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. Cas 효과기 단백질은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 핵산)를 표적으로 할 수 있고 이중 가닥 또는 단일 가닥 브레이크를 생성할 수 있다. 일부 실시태양에서, Cas 효과기 단백질은 야생형 또는 자연 발생 Cas 단백질이다. 일부 실시태양에서, Cas 효과기 단백질은 돌연변이체 Cas 단백질이며, 여기서 하나 이상의 돌연변이, 삽입 또는 결실은 WT 또는 자연 발생 Cas 단백질(예를 들어, 부모 Cas 단백질)에서 만들어져 부모 Cas 단백질과 비교하여 하나 이상의 변경된 특성을 갖는 Cas 단백질을 생성한다.
일부 경우에, Cas 단백질은 야생형(WT) 뉴클레아제이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 Cas 단백질의 비-제한적인 예는 C2cl, C2c2, C2c3, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Cpfl, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx100, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, MAD1-20, SmCsm1, 이의 상동체, 이의 이종 상동체, 이의 변이체, 이의 돌연변이체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 적합한 핵산 유도 뉴클레아제(예를 들어, Cas 9)는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 속으로부터의 유기체로부터 유래될 수 있다: 티오미크로스피라(Thiomicrospira), 숙시니비브리오(Succinivibrio), 칸디다투스(Candidatus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 애시도모노코쿠스(Acidomonococcus), 프레보텔라(Prevotella), 스미텔라(Smithella), 모락셀라(Moraxella), 시너지스테스(Synergistes), 프란시셀라(Francisella), 렙토스피라(Leptospira), 카테니박테리움(Catenibacterium), 칸드레리아(Kandleria), 클로스트리디움(Clostridium), 도레아(Dorea), 코프로코쿠스(Coprococcus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 프룩토바실러스(Fructobacillus), 웨이셀라(Weissella), 페디오코쿠스(Pediococcus), 코리네박터(Corynebacter), 슈터렐라(Sutterella), 레기오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 로세뷰리아(Roseburia), 필리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 박테로이데스(Bacteroides), 플라비볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 아조스피릴룸(Azospirillum), 클루코나세토박터(Gluconacetobacter), 네이세리아(Neisseria), 로제뷰리아(Roseburia), 파비바큘럼(Parvibaculum), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 알리시클로바실러스(Alicyclobacillus), 브레비바실러스(Brevibacilus), 바실러스(Bacillus), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 브레비바실러스(Brevibacilus), 카르노박테리움(Carnobacterium), 클로스트리디아리디움(Clostridiaridium), 클로스트리디움(Clostridium), 데술포나트로늄(Desulfonatronum), 데술포비브리오(Desulfovibrio), 헬코쿠스(Helcococcus), 렙토트리키아(Leptotrichia), 리스테리아(Listeria), 메타노메티오필루스(Methanomethyophilus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 오피튜타세애(Opitutaceae), 팔루디박터(Paludibacter), 로도박터(Rhodobacter), 스파애로카에타(Sphaerochaeta), 튜베리바실러스(Tuberibacillus), 및 캄필로박터(Campylobacter). 이러한 속의 유기체 종은 본 발명에서 달리 논의된 바와 같을 수 있다.
적합한 핵산 유도된 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 문(phylum)으로부터의 유기체로부터 유래될 수 있으며, 이는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 피르미큐트, 악티노박테리아, 박테로이데테스, 프로테오박테리아, 스피로카테스 및 테네리쿠테스. 적합한 핵산 유도된 뉴클레아제는 에리시펠로트리키아, 클로스트리디아, 바실리, 악티노박테리아, 박테로이데테스, 플라보박테리아, 알파프로테오박테리아, 베타프로테오박테리아, 감마프로테오박테리아, 델타프로테오박테리아, 입실론프로테오박테리아, 스피로케카에테스 및 몰리큐테스. 적합한 핵산 유도된 뉴클레아제는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 클로스트리디알레스, 락토바실 라레스, 악티노마이세탈레스, 박테로이달레스, 플라보박테리알레스, 리조비알레스,로도스피릴랄레스, 버크홀데리알레스, 니세리알레스, 레지오넬랄레스, 노틸리알레스, 캄피로박테랄레스, 스피로카에탈레스, 마이코플라스마탈레스 및 티오트리칼레스. 적합한 핵산 유도된 뉴클레아제는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 패밀리 내의 유기체로부터 유래될 수 있다: 라크노스피라세애, 엔테로코카세애, 류코노스토카세애, 락토바실라세애, 스트렙토코카세애, 펩토스트렙토코카세애, 스타필로코카세애, 유박테리아세애, 코리네박테리네애, 박테로이다세애, 플라보박테리움, 크리오무어파세애, 로도비아세애, 로도스피릴라세애, 아세토박테라세애, 슈터렐라세애, 네이세리아세애, 레기오넬라세애, 노틸리아세애, 캄필로박테라세애, 스피로카에타세애, 마이코플라스마타세애 및 프란시셀라세애.
본 발명의 방법, 시스템 및 조성물에 사용하기에 적합한 다른 핵산 유도 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 다음과 같은 유기체로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: Thiomicrospira sp. XS5, Eubacterium rectale, Succinivibrio dextrinosolvens, Candidatus Methanoplasma termitum, Candidatus Methanomethylophilus alvus, Porphyromonas crevioricanis, Flavobacterium branchiophilum, Acidomonococcus sp., Lachnospiraceae bacterium COE1, Prevotella brevis ATCC 19188, Smithella sp. SCADC, Moraxella bovoculi, Synergistes jonesii, Bacteroidetes oral taxon 274, Francisella tularensis, Leptospira inadai serovar Lyme str. 10, Acidomonococcus sp. crystal structure (5B43) S. mutans, S. agalactiae, S. equisimilis, S. sanguinis, S. pneumonia; C. jejuni, C. coli; N. salsuginis, N. tergarcus; S. auricularis, S. carnosus; N. meningitides, N. gonorrhoeae; L. monocytogenes, L. ivanovii; C. botulinum, C. difficile, C. tetani, C. sordellii; Francisella tularensis l, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_ 44_17, Smithella sp. SCADC, Microgenomates, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens, Porphyromonas macacae, Catenibacterium sp. CAG:290, Kandleria vitulina, Clostridiales bacterium KA00274, Lachnospiraceae bacterium 3-2, Dorea longicatena, Coprococcus catus GD/7, Enterococcus columbae DSM 7374, Fructobacillus sp. EFB­N1, Weissella halotolerans, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus curvatus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus versmoldensis, 및 Filifactor alocis ATCC 35896. U.S. Pat. Nos. 8,697,359; 8,771,945; 8,795,965; 8,865,406; 8,871,445; 8,889,356; 8,895,308; 8,906,616; 8,932,814; 8,945,839; 8,993,233; 8,999,641; 9,822,372; 9,840,713; U.S. Pat. App. No. 13/842,859 (US 2014/0068797 A1); 9,260,723; 9,023,649; 9,834,791; 9,637,739; U.S. Pat. App. No. 14/683,443 (US 2015/0240261 A1); U.S. Pat. App. No. 14/743,764 (US 2015/0291961 A1); 9,790,490; 9,688,972; 9,580,701; 9,745,562; 9,816,081; 9,677,090; 9,738,687; U.S. App. No. 15/632,222 (US 2017/0369879 A1); U.S. App. No. 15/631,989; U.S. App. No. 15/632,001; 및 U.S. Pat. No. 9,896,696 참조, 이들 각각은 본 발명에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에서, Cas 효과기 단백질은 다음 활성 중 하나 이상을 포함한다:
닉카제 활성, 즉 핵산 분자의 단일 가닥을 절단하는 능력;
이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 두 가닥을 절단하고 이중 가닥 브레이크를 생성하는 능력;
엔도뉴클레아제 활성;
엑소뉴클레아제 활성; 및/또는
헬리카제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 풀 수 있는 능력.
본 발명의 양태에서, 용어 "가이드 핵산"은 1) 표적 서열(본 발명에서 "표적 세그먼트"로 지칭됨)에 혼성화할 수 있는 가이드 서열 및 2) 본 발명에 기재된 바와 같은 핵산 유도 뉴클레아제(본 발명에서 "스캐폴드 세그먼트"로 지칭됨)와 (단독으로 또는 tracrRNA 분자와의 조합으로) 상호작용 가능한 스캐폴드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 가이드 핵산은 DNA일 수 있다. 가이드 핵산은 RNA일 수 있다. 가이드 핵산은 DNA 및 RNA 모두를 포함할 수 있다. 가이드 핵산은 변형된 비-천연 발생 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산이 RNA를 포함하는 경우, RNA 가이드 핵산은 본 발명에 제공된 방법과 조성물을 사용하여 생성된 플라스미드, 선형 구조체 또는 편집 카세트와 같은 폴리뉴클레오타이드 분자상의 DNA 서열에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 가이드 핵산은 RNA 가이드 핵산("가이드 RNA" 또는 "gRNA")이고 표적 세그먼트 및 스캐폴드 세그먼트를 포함한다. 일부 실시태양에서, gRNA의 스캐폴드 세그먼트는 하나의 RNA 분자에 포함되고 표적 세그먼트는 다른 별도의 RNA 분자에 포함된다. 이러한 실시태양은 본 발명에서 "이중 분자 gRNA" 또는 "2분자 gRNA" 또는 "이중 gRNA"로 지칭된다. 일부 실시태양에서, gRNA는 단일 RNA 분자이고 본 발명에서는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로 지칭된다. 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 2분자 가이드 RNA 및 sgRNA를 모두 지칭한다.
gRNA의 DNA-표적 세그먼트는 표적 핵산 서열의 서열에 상보적이거나 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 표적 핵산 서열은 게놈 또는 플라스미드와 같은 유전자 요소 내의 유전자좌일 수 있다. 이와 같이, gRNA의 표적 세그먼트는 하이브리드화(즉, 염기쌍)를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 핵산과 상호 작용하고, 표적 세그먼트의 뉴클레오타이드 서열은 gRNA가 결합할 표적 DNA 내의 위치를 결정한다. 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이거나 그 보다 크다. 서열 정렬을 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 최적 정렬이 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 가이드 서열은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 이상 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 75개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이이거나 그 보다 크다. 일부 실시태양에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20개 미만의 뉴클레오타이드이다. 양태들에서, 가이드 서열은 10-30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 가이드 서열은 15-20개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 가이드 서열은 15개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 가이드 서열은 16개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 가이드 서열은 17개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 가이드 서열은 18개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 가이드 서열은 19개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 가이드 서열은 20개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
가이드 RNA의 스캐폴드 세그먼트는 적어도 하나의 Cas 효과기 단백질과 상호 작용하여 리보핵산단백질 복합체(본 발명에서 CRISPR-RNP 또는 RNP-복합체로 지칭됨)를 형성한다. 가이드 RNA는 상기 기재된 표적 세그먼트를 통해 결합된 폴리펩타이드를 표적 핵산 서열 내의 특정 뉴클레오타이드 서열로 유도한다. 가이드 RNA의 스캐폴드 세그먼트는 서로 상보적이고 이중 가닥 RNA 이중체를 형성하는 2개의 스트레치 뉴클레오타이드를 포함한다. 표적화 뉴클레아제 복합체의 형성을 촉진하기 위해 스캐폴드 서열 내에서 충분한 서열은 스캐폴드 서열 내에서 2개의 서열 영역의 길이를 따라 상보성 정도, 예를 들어 2차 구조를 형성하는 데 관여하는 1개 또는 2개의 서열 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 1개 또는 2개의 서열 영역은 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 포함되거나 존재한다. 일부 경우에, 1개 또는 2개의 서열 영역은 별도의 폴리뉴클레오타이드 상에 포함되거나 존재한다. 최적의 정렬은 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있고, 1개 또는 2개의 서열 영역 내에서의 자기 상보성과 같은 2차 구조를 추가로 설명할 수 있다. 일부 실시태양에서, 최적으로 정렬될 때 2개 중 짧은 길이를 따라 1개 또는 2개의 서열 영역 사이의 상보성의 정도는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이거나 그 보다 높다. 일부 실시태양에서, 2개의 서열 영역 중 적어도 하나는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이이다.
본 발명의 gRNA의 스캐폴드 서열은 2차 구조를 포함할 수 있다. 2차 구조는 유사매듭(pseudoknot) 영역 또는 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 가이드 핵산 및 핵산 유도된 뉴클레아제의 상용성은 가이드 RNA의 2차 구조 영역 내에서 또는 가이드 RNA의 인접 서열에 의해 적어도 부분적으로 결정된다. 일부 경우에, 가이드 핵산의 핵산 가이드된 뉴클레아제에 대한 결합 동역학은 스캐폴드 서열 내의 2차 구조에 의해 부분적으로 결정된다. 일부 경우에, 가이드 핵산의 핵산 유도 뉴클레아제에 대한 결합 동역학은 스캐폴드 서열을 갖는 핵산 서열에 의해 부분적으로 결정된다.
gRNA-Cas 효과기 단백질 조합에 대한 적합한 스캐폴드 서열은 천연 Cas 뉴클레아제 유전자좌에 인접한 서열을 스캐닝함으로써 발견될 수 있다. 다시 말해, 천연 Cas 뉴클레아제는 상응하는 호환 가능한 가이드 핵산 또는 스캐폴드 서열에 근접한 게놈에서 코딩될 수 있다.
핵산 가이드 뉴클레아제는 뉴클레아제 내인성 숙주 내에서 발견되지 않은 가이드 핵산과 상용성일 수 있다. 이러한 직교 가이드 핵산은 경험적 테스트에 의해 결정될 수 있다. 직교 가이드 핵산은 상이한 박테리아 종으로부터 유래되거나 비-천연적으로 발생하도록 합성되거나 아니면 조작될 수 있다. 공통 핵산 안내 뉴클레아제와 양립할 수 있는 직교 가이드 핵산은 하나 이상의 공통 특징을 포함할 수 있다. 일반적인 특징은 유사매듭 영역 외부의 서열을 포함할 수 있다. 일반적인 특징은 유사매듭 영역을 포함할 수 있다. 일반적인 특징은 1차 서열 또는 2차 구조를 포함할 수 있다.
가이드 서열이 표적 서열에 상보적이거나 상동성이도록 가이드 서열을 변경함으로써 원하는 표적 서열을 표적화하도록 가이드 핵산을 조작하여, 가이드 서열과 표적 서열 사이의 혼성화를 가능하게 한다. 조작된 가이드 서열을 갖는 가이드 핵산은 조작된 가이드 핵산으로 지칭될 수 있다. 조작된 가이드 핵산은 종종 자연적으로 발생하지 않으며 자연에서 발견되지 않는다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 임의의 방법의 각 라운드에 도입된 본 발명에 제공된 바와 같은 하나 이상의 유전자 편집을 포함하는 복구 단편은 공여자 DNA로서 작용하고, 각 복구 단편의 각각의 유전자 편집은 gRNA와 쌍을 이룬다. 각각의 gRNA는 숙주 세포 내의 유전자 요소(예를 들어, 염색체 또는 플라스미드)의 유전자좌에서 특정 서열을 표적화하는 서열을 포함할 수 있다. 공여자 DNA 서열은 상동성 지정 복구(HDR)를 사용하는 유전자 편집의 CRISPR 방법에서 이의 쌍을 이룬 가이드 RNA(gRNA)와 조합하여 사용될 수 있다. CRISPR 복합체는 상동성 지정 복구(HDR)를 사용하여 복구할 수 있는 표적 유전자(들) 내에서 가닥 파손을 초래할 수 있다. HDR 매개 복구는 본 발명에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여 생성된 공여자 DNA 서열로 숙주 세포를 공동 형질 전환함으로써 촉진될 수 있다. 공여자 DNA 서열은 원하는 유전자 교란(예를 들어, 결실, 삽입(예를 들어, 프로모터, 터미네이터, 용해도 또는 분해 태그), 및/또는 단일 뉴클레오타이드 다형성) 뿐만 아니라 gRNA에 의해 표적화된 서열 또는 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함하는 표적화 서열 또는 상동성 암을 포함할 수 있다. 이 실시태양에서, CRISPR 복합체는 하나 이상의 gRNA에 의해 지정된 표적 유전자를 절단한다. 공여자 DNA 서열은 원하는 유전자 섭동을 숙주 세포에 통합하기 위해 상동성 재조합 기구에 대한 주형으로 사용될 수 있다. 공여자 DNA는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이중 가닥 플라스미드일 수 있다. 공여자 DNA는 재절단을 방지하기 위해 PAM 서열이 없거나 스크램블, 변경 또는 비 기능적 PAM을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 공여자 DNA는 기능적이거나 변경되지 않은 PAM 부위를 포함할 수 있다. 공여자 DNA의 돌연변이 또는 편집된 서열(또한 상동성 영역에 플랭킹)은 돌연변이(들)가 게놈에 통합된 후 CRISPR-복합체에 의한 재절단을 방지한다. 일부 실시태양에서, 상동성 재조합은 숙주 세포에 내인성이거나 이종성으로 도입된 하나 이상의 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트의 사용 또는 발현을 통해 촉진된다.
숙주 세포
숙주 세포의 핵산(예를 들어, 게놈 또는 플라스미드)를 반복적으로 편집하여 원하는 형질 또는 표현형(예를 들어, 본 발명에 제공된 바와 같은 관심 생성물의 생산)을 생성하거나 생성하기 위한 본 발명에 제공된 키트, 조성물 및 방법은 원하는 형질 또는 표현형이 유전자 돌연변이 집단에서 확인될 수 있는 임의의 유기체에 적용될 수 있다. 유기체는 미생물 또는 고등 진핵 유기체일 수 있다.
따라서, 본 발명에 사용된 용어 "미생물"은 광범위하게 해석되어야 한다. 미생물은 두 가지 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 균류와 원생 생물을 포함한다. 그러나, 특정 양태에서, 곤충, 식물 및 동물과 같은 "보다 높은" 진핵생물이 본 발명에 교시된 방법에서 이용될 수 있다.
적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 조류 세포, 식물 세포, 균류 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 예시적인 실시태양에서, 적합한 숙주 세포는 대장균(E. coli) 균주 또는 바실러스(Bacillus) 균주를 포함한다.
본 발명의 다른 적합한 숙주 유기체는 코리네박테리움 속의 미생물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 바람직한 코리네박테리움 균주/종은 기탁된 유형 균주가 DSM44549인 C. 에피센스(C. efficiens), 기탁된 유형 균주가 ATCC13032인 C. 글루타미쿰(C. glutamicum) 및 기탁된 유형 균주가 ATCC6871인 C. 암모니아게네스(C. ammoniagenes)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 바람직한 숙주는 C. 글루타미쿰이다.
특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 코리네박테리움 속의 적합한 숙주 균주는 특히 공지된 야생형 균주이다: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필럼 ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노게 네스 FERM BP- 1539, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869 및 브레비박테리움 다이바리카툼 ATCC14020; 및 예를 들어, L-리신 생산 균주로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주: 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM P-1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464, 코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1, 코리네박테리움 글루타미쿰 DG52-5, 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5714 및 코리네박테리움 글루타미 쿰 DSM12866.
용어 "마이크로콕쿠스 글루타미쿠스"는 C. 글루타미쿰에도 사용되어 왔다. C. 에피시엔스 종의 일부 대표는 또한 예를 들어, 균주 FERM BP-1539와 같은 종래 기술에서 C. 써모아미노게네스로 불려왔다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 미생물 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 적합한 진핵생물 숙주 세포는 곰팡이 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 동물 세포 및 식물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 균류 숙주 세포는 아스코코타(Ascomycota), 바시디오마이코타(Basidiomycota), 데우티로마이코다(Deuteromycota), 자이고마이코타(Zygomycota), 펑기 임퍼펙티(Fungi imperfecti)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 바람직한 숙주 세포는 효모 세포 및 사상 균류 세포를 포함한다. 적합한 사상 균류 숙주 세포는 예를 들어 유마이코티나(Eumycotina) 및 오마이코타(Oomycota) 세분의 임의의 섬유상 형태를 포함한다. (예를 들어, 참조로 본 발명에 포함된 Hawksworth et al., In Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th　edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 참조). 사상 균류는 키틴, 셀룰로오스 및 다른 복합 다당류로 구성된 세포벽을 갖는 식물성 균사체를 특징으로 한다. 사상 균류 숙주 세포는 효모와 형태학적으로 구별된다.
특정 예시적이고 비 제한적인 실시태양에서, 사상균류 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 볼바리엘라(Volvariella), 또는 텔레오모르프(teleomorphs), 또는 아나모르프(anamorphs), 이의 동의어 또는 분류학적 동등물의 종의 세포일 수 있다. 한 실시태양에서, 사상균류는 A. niger 그룹의 A. nidulans, A. oryzae, A. sojae, 및 Aspergilli로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 사상균류는 아스페르길루스 니거이다.
한 실시태양에서, 사상균류는 Aspergillus foetidus ACM 3996(=FRR 3558), Magnaporthe grisea Guy-11 또는 Phanerochaete chrysosporium RP78로부터 선택된 생산 균주이다. 별도의 실시태양에서, 사상균류는 당업계에 공지된 A. niger 생산 균주이다. 본 발명에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 A. niger 생산 균주의 예는 A. niger ATCC 11414, ATCC 1015, ACM 4992(=ATCC 9142), ACM 4993(=ATCC 10577), ACM 4994(=ATCC 12846), 0 ATCC 12846, ATCC 11414, N402, CBS 513.88 또는 NRRL3(ATCC 9029, CBS 120.49)을 포함할 수 있다.
적합한 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세누라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces,), 피키아(Pichia), 클루베로마이세스(Kluyveromyces) 및 야로비아(Yarrowia)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 효모 세포는 한세누라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르젠시스(Saccaromyces carlsbergensis), 사카로마이세스 다이아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코다매(Pichia kodamae), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오프니티애(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 쿠에르쿰(Pichia quercuum), 피치아 피제페리(Pichia pijperi), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 일비칸스(Candida albicans), 또는 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 미생물 숙주 세포는 클라미도모나스(Chlamydomonas)(예를 들어, C. 레인하르티(C. Reinhardtii)) 및 포름디움(Phormidium)과 같은 조류(P. sp. ATCC29409)이다.
다른 실시태양에서, 미생물 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 적합한 원핵생물 세포는 그람 양성, 그람 음성 및 그람 가변 박테리아 세포를 포함한다. 상기 미생물 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)의 종 또는 균주일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 미생물 숙주 균주는 박테리아 산업용 균주이다. 수많은 박테리아 산업용 균주가 알려져 있고 본 발명에 기술된 방법 및 조성물에 적합하다.
일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 세포는 아그로박테리움 종(예를 들어, A. radiobacter, A. rhizogenes, A. rubi), 아테로박터 종(예를 들어, A. aurescens, A. citreus, A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparaffinus, A. sulfureus, A. ureafaciens), 바실루스 종(예를 들어, B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulars, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans 및　B. amyloliquefaciens)이다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 B. 서브틸리스, B. 푸밀루스, B. 리체니포르미스, B. 메가테륨, B. 클라우실, B. 스테아로써모필루스, 및B. 아밀로리퀴에파시엔스를 포함하나 이에 제한되지 않는 산업용 바실루스일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 클로스트리디움 종(예를 들어, C. acetobutylicum, C. tetani　E88,　C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, C. beijerinckii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 코리네박테리움 종(예를 들어, C. glutamicum, C. acetoacidophilum)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에스체리아치아 종(예를 들어, E. coli)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에르위니아 종(예를 들어, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata, E. terreus)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 판토에아 종(예를 들어, P. citrea, P. agglomerans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 수도모나스 종(예를 들어, P. putida, P. aeruginosa, P. mevalonii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토콕쿠스 종(예를 들어,　S. equisimiles, S. pyogenes, S. uberis)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토마이세스 종(예를 들어, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus, S. lividans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 자이모모나스 종(예를 들어, Z. mobilis, Z. lipolytica) 등일 것이다.
일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 세포는 대장균 종이며 장독소성 대장균(ETEC), 장병원성 대장균 (EPEC), 장침입성 대장균(EIEC), 장출혈성 대장균(EHEC), 요로병원성 대장균(UPEC), 베로톡신 생성 대장균, 대장균 O157:H7, 대장균 O104:H4, 대장균 O121, 대장균 O104:H21, 대장균 K1 및 대장균 NC101를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 대장균 K12, 대장균 B 및 대장균 C로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 대장균 균주 NCTC 12757, NCTC 12779, NCTC 12790, NCTC 12796, NCTC 12811, ATCC 11229, ATCC 25922, ATCC 8739, DSM 30083, BC 5849, BC 8265 , BC 8231, BC 8319, BC 8320, BC 8321, BC 8322, BC 8321, BC 8231, BC 8319, BC 8231, BC 8231, 8326, BC 8327, BC 8331, BC 8335, BC 8338, BC 8341, BC 8344, BC 8345, BC 8346, BC 8347, BC 8348, BC 8863 및 BC 8864일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 균주 BC 4734 (O26:H11), BC 4735 (O157:H-), BC 4736, BC 4737 (n.d.), BC 4738 (O157:H7), BC 4945 (O26:H-), BC 4946 (O157:H7), BC 4947 (O111:H-), BC 4948 (O157:H), BC 4949 (O5), BC 5579 (O157:H7), BC 5580 (O157:H7), BC 5582 (O3:H), BC 5643 (O2:H5), BC 5644 (O128), BC 5645 (O55:H-), BC 5646 (O69:H-), BC 5647 (O101:H9), BC 5648 (O103:H2), BC 5850 (O22:H8), BC 5851 (O55:H-), BC 5852 (O48:H21), BC 5853 (O26:H11), BC 5854 (O157:H7), BC 5855 (O157:H-), BC 5856 (O26:H-), BC 5857 (O103:H2), BC 5858 (O26:H11), BC 7832, BC 7833 (O 미가공 형태:H-), BC 7834 (ONT:H-), BC 7835 (O103:H2), BC 7836 (O57:H-), BC 7837 (ONT:H-), BC 7838, BC 7839 (O128:H2), BC 7840 (O157:H-), BC 7841 (O23:H-), BC 7842 (O157:H-), BC 7843, BC 7844 (O157:H-), BC 7845 (O103:H2), BC 7846 (O26:H11), BC 7847 (O145:H-), BC 7848 (O157:H-), BC 7849 (O156:H47), BC 7850, BC 7851 (O157:H-), BC 7852 (O157:H-), BC 7853 (O5:H-), BC 7854 (O157:H7), BC 7855 (O157:H7), BC 7856 (O26:H-), BC 7857, BC 7858, BC 7859 (ONT:H-), BC 7860 (O129:H-), BC 7861, BC 7862 (O103:H2), BC 7863, BC 7864 (O 미가공 형태:H-), BC 7865, BC 7866 (O26:H-), BC 7867 (O 미가공 형태:H-), BC 7868, BC 7869 (ONT:H-), BC 7870 (O113:H-), BC 7871 (ONT:H-), BC 7872 (ONT:H-), BC 7873, BC 7874 (O raw form:H-), BC 7875 (O157:H-), BC 7876 (O111:H-), BC 7877 (O146:H21), BC 7878 (O145:H-), BC 7879 (O22:H8), BC 7880 (O 미가공 형태:H-), BC 7881 (O145:H-), BC 8275 (O157:H7), BC 8318 (O55:K-:H-), BC 8325 (O157:H7), 및 BC 8332 (ONT), BC 8333와 같은 베로세포독성 대장균(VTEC)이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 균주 BC 8246 (O152 : K- : H-), BC 8247 (O124 : K (72) : H3), BC 8248 O124), BC 8225 (O112), BC 8250 (O136 : K (78) : H-), BC 8251 (O124 : H-), BC 8252 (O144 : K- : H-), BC 8253 BC 8256 (O112), BC 8256 (O28a.e), BC 8257 (O124 : H-), BC 8258 (O143), BC 8259 (O167 : K- : H5), BC 8262 (O128a.c.:H35), BC 8261 (O164), BC 8262 (O164 : K- : H-), BC 8263 (O164) 및 BC 8264 (O124)과 같은 장침입성 대장균(EIEC)이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 균주 BC 5581 (O78 : H11), BC 5583 (O2 : K1), BC 8221 (O118), BC 8222 (O148 : H), BC 8229 (O111), BC 8224 (O110 : H-), BC 8225 (O148), BC 8226 (O 118), BC 8227 (O25 : H42), BC 8229 (O6), BC 8231 (O153 : H45) BC 8238 (O148), BC 8234 (O128), BC 8235 (O118), BC 8237 (O111), BC 8238 (O 110 : H17), BC 8240 (O148), BC 8241 (O 6H 16) BC 8313 (O6 : H6), BC 8315 (O153 : H-), BC 8243 (O153), BC 8244 (O15 : H-), BC 8245 (O20) , BC 8329, BC 8334 (O118 : H12) 및 BC 8339와 같은 장독성 대장균(ETEC)이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 균주 BC 7567 (O86), BC 7568 (O128), BC 7571 (O114), BC 7572 (O119), BC 7573 (O125) BC 7575 (O126), BC 7576 (O126), BC 7578 (O142), BC 7579 (O26), BC 7580 (OK26), BC 7581 (O142), BC 7582 (O55) BC 8535 (O-), BC 7585 (O-), BC 7586 (O-), BC 8330, BC 8550 (O26), BC 8551 (O55), BC 8552 (O158), BC 8553 (O26), BC 8554 (O158), BC 8555 (O86), BC 8556 (O128), BC 8557 (OK26), BC 8558 (O55), BC 8560 (O158), BC 8561 (O158), BC 8562 BC 8565 (O158), BC 8565 (O158), BC 8565 (O158), BC 8568 (O111), BC 8569 (O128), BC 8570 (O114) BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158), BC 8575 (O158) (O158), BC 8583 (O128), BC 8584 (O158), BC 8585 (O128), BC 8586 (O158), BC 8588 (O26), BC 8589 (O 86), BC 8590 (O 127), BC 8591 ), BC 8592 (O114), BC 8593 (O114), BC 8594 (O114), BC 8595 (O125), BC 8596 (O158), BC 8597 (O26), BC 8598 (O26), BC 8599 (O158), BC 8605 (O158), BC 8606 (O158), BC 8607 O86), BC 8618 (O86), BC 8616 (BC 8616), BC 8616 , BC 8621, BC 8622, BC 8623, BC 8624 (O158) 및 BC 8625 (O158)과 같은 장병원성 대장균(EPEC)이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella boydii 및 Shigella sonnei를 포함하는 Shigella 유기체이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 박테리아 숙주 세포는 당업계에 공지된 및/또는 B. subtilis, B. wakoensis, B. amylolyticus, B. hemicellulosilyticus, B. cellulosilyticus, B. akibai, B. mannanilyticus, B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis, B. megaterium, B. pumilus, B. licheniformis, B. circulans, B. coagulans, B. alvei, B. brevis, B. macerans, B. amyloliquefaciens 및 B. sphaericus로부터 선택된 바실루스 종의 임의의 균주 또는 하위 종이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 게놈 조작 방법을 위한 미생물 숙주 세포는 균주 O-4(=JCM 9137=DSM 2514), N-1(=JCM 9140=DSM 2521), 17-1(=JCM 9142=DSM 2524), 27-1(=JCM 9144=DSM 2520), 13(=JCM 9145=DSM 2523), K-12-5(=JCM 9149), 202-1( =JCM 9151), C-11(=JCM 9152=DSM 16731), D-6(=JCM 9154), 2b-2(=JCM 9155), N-4T(=JCM 9156=DSM 2522), 1139T(= JCM 9157=ATCC 43226), IC(=JCM 9158), KX-6(=JCM 9159), H-167(=JCM 9160), 199(=JCM 9163), C-3(=JCM 9164), S- 2(=JCM 9166), AM-001(=JCM 10596=DSM 16130) 및 8-1(=JCM 10598)와 같은 알칼리성 바실러스 균주이다.
다양한 실시태양에서, 원핵 및 진핵 균주 둘 다를 포함하는 본 발명의 실행에 사용될 수 있는 균주는 American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 및 Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), 농업 연구 서비스 특허 문화 컬렉션, Northern Regional Research Center (NRRL)과 같은 다수의 배양 컬렉션으로부터 대중이 쉽게 접근할 수 있다.
숙주 세포의 형질전환
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용되는 구조체는 형질 전환, 형질 감염, 형질 도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti 매개 유전자 전달을 포함하는 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 미생물 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 방법은 인산 칼슘 형질 감염, DEAE-덱스트란 매개 형질 감염, 형질 주입 또는 전기 천공을 포함한다(Davis, L., Dibner, M., Battey, I. 1986 "Basic Methods in Molecular Biology"). 형질 전환의 다른 방법은 예를 들어, 아세트산 리튬 형질 전환 및 전기 천공을 포함한다. 예를 들어, Gietz et al.,　Nucleic Acids Res.　27:69-74 (1992); Ito et al.,　J. Bacterol.　153:163-168 (1983); and Becker and Guarente,　Methods in Enzymology　194:182-187(1991) 참조. 일부 실시태양에서, 형질 전환된 숙주 세포는 재조합 숙주 균주로 불린다.
자동화
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트, 조성물 및 방법은 미생물 숙주 세포의 유전 공학을 위한 고 처리량(HTP) 방법에 통합된다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 PCT/US18/36360, PCT/US18/36333 또는 WO 2017/100377에 기술된 HTP 분자 도구 세트의 일부인 하나 이상의 분자 도구를 사용하여 구현될 수 있으며, 이들 각각은 목적하는 형질 또는 표현형을 갖는 유전적으로 조작된 미생물 숙주 세포를 생성하기 위해 모든 목적을 위해 본 발명에 참조로 포함된다. 미생물 숙주 세포의 게놈을 반복적으로 편집하기 위해 본 발명에 제공된 방법을 사용하여 생성될 수 있는 라이브러리의 예는 프로모터 래더, 터미네이터 래더, 용해도 태그 래더 또는 분해 태그 래더를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 제공된 방법을 적용할 수 있는 고 처리량 게놈 조작 방법의 예는 PCT/US18/36360, PCT/US18/36333 또는 WO 2017/100377에 기술된 바와 같은 프로모터 스와핑, 터미네이터(중지) 스와핑, 용해도 태그 스와핑, 분해 태그 스와핑 또는 SNP 스와핑을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 고 처리량 방법은 자동화될 수 있고/있거나 로봇 공학 및 액체 취급 플랫폼(예를 들어, 당업계에 공지된 플레이트 로봇 플랫폼 및 액체 취급 기계)를 이용할 수 있다. 고 처리량 방법은, 예를 들어, 미세적정 플레이트와 같은 다중 웰 플레이트를 이용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 자동화된 방법은 로봇 시스템을 포함한다. 본 발명에 개괄된 시스템은 일반적으로 96-또는 384-웰 미세적정 플레이트의 사용에 관한 것이지만, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 수의 상이한 플레이트 또는 구성이 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 개괄된 단계 중 일부 또는 전부는 자동화될 수 있다. 따라서, 예를 들어 시스템은 완전히 또는 부분적으로 자동화될 수 있다. 본 발명에 제공된 방법 및 조성물과 호환되는 로봇 시스템은 PCT/US18/36360, PCT/US18/36333 또는 WO 2017/100377에 기술된 것일 수 있다.
키트
또한, 상기 기재된 바와 같이 미생물 숙주 세포로부터 플라스미드의 반복적 편집 또는 제거 또는 이로부터 유래된 라이브러리를 생성하기 위한 방법을 실행하기 위한 키트가 본 발명에 제공된다. 키트는 상기 방법을 수행하는 데 필요한 모든 시약(예를 들어, 복구 단편 및/또는 gRNA를 포함하는 플라스미드; 기본 미생물 숙주 세포)을 함유하는 혼합물을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 대상 키트는 (i) 하나 이상의 유전자 편집 및 선택 마커 유전자를 포함하는 제 1 복구 단편을 포함하는 제 1 플라스미드의 풀, (ii) 플라스미드의 각각의 추가 풀이 하나 이상의 추가 유전자 편집을 위한 서열 및 사전 플라스미드에 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하는 추가 복구 단편을 포함하도록 하는 하나 이상의 추가 플라스미드의 풀, 및 (iii) 임의적으로, 미생물 숙주 세포를 포함할 수 있다. 제 1 복구 단편 및/또는 각각의 추가 단편은 하나 이상의 유전자 편집을 플랭킹하는 상동성 암을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 각각의 추가 복구 단편) 상의 상동성 암은 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)의 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 추가 복구 단편)에 존재하는 상동성 암은 서로의 복구 단편 상의 상동성 암과 동일한 유전자좌를 표적화할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 추가 복구 단편)에 존재하는 상동성 암은 서로의 복구 단편 상의 상동성 암으로서 상이한 유전자좌를 표적화할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 추가 복구 단편)에 존재하는 상동성 암은 서로의 복구 단편 상의 상동성 암 중 하나 이상과 동일한 유전자좌를 표적화할 수 있다.
한 실시태양에서, 대상 키트는 (i) 하나 이상의 유전자 편집 및 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함하는 제 1 복구 단편의 풀, (ii) 제1 복구 단편 상에 존재하는 하나 이상의 유전자 편집의 각각과 쌍을 이루는 가이드 RNA(gRNA), (iii) 각각의 추가 복구 단편이 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열 및 사전 복구 단편에 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함하도록 하는 하나 이상의 추가 복구 단편, (iv) 각각의 추가 복구 단편 상에 발견된 각각의 추가 유전자 편집(들)에 대한 추가 gRNA, 및 (v) 임의적으로, 미생물 숙주 세포를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 및 이의 쌍을 이루는 gRNA는 동일한 플라스미드 상에 존재한다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 및 이의 쌍을 이루는 gRNA는 별도의 플라스미드에 존재한다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 및 이의 쌍을 이루는 gRNA는 핵산의 동일한 선형 단편 상에 존재한다. 한 실시태양에서, 각각의 복구 단편 및 이의 쌍을 이루는 gRNA는 핵산의 개별 선형 단편 상에 존재한다. 각각의 제 1 복구 단편 및/또는 각각의 추가 단편은 하나 이상의 유전자 편집을 플랭킹하는 상동성 암을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 각각의 추가 복구 단편) 상의 상동성 암은 미생물 숙주 세포 내의 핵산(예를 들어, 게놈, 플라스미드 등)의 유전자좌에 상보적이거나 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 추가 복구 단편)에 존재하는 상동성 암은 서로의 복구 단편 상의 상동성 암과 동일한 유전자좌를 표적화할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 추가 복구 단편)에 존재하는 상동성 암은 서로의 복구 단편 상의 상동성 암으로서 상이한 유전자좌를 표적화할 수 있다. 각각의 복구 단편(제 1 및/또는 추가 복구 단편)에 존재하는 상동성 암은 서로의 복구 단편 상의 상동성 암 중 하나 이상과 동일한 유전자좌를 표적화할 수 있다.
일부 경우에, 키트는 유전자형 결정을 위한 시약(예를 들어, 콜로니 PCR 및/또는 제한 단편 분석을 위한 시약) 및/또는 편집된 미생물 숙주 세포의 표현형 테스트를 추가로 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 이종 재조합 시스템을 미생물 숙주 세포에 도입하기 위한 이종 재조합 시스템을 위한 단백질 세트를 암호화하는 핵산(예를 들어, 플라스미드, 선형 DNA 또는 RNA, 또는 인테그론으로서)을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 이종 재조합 시스템을 미생물 숙주 세포에 도입하기 위한 이종 재조합 시스템용 단백질 세트를 추가로 포함한다. 이종 재조합 시스템은 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, Red/ET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템, Red/ET 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 조합으로부터 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택될 수 있다.
별도의 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 부위-특이적 제한 효소를 미생물 숙주 세포 내로 도입하기 위한 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 핵산(예를 들어, 플라스미드, 선형 DNA 또는 RNA, 또는 인테그론으로서)을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 미생물 숙주 세포 내로 도입하기 위한 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 추가로 포함한다. 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 부위-특이적 제한 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 제 1 유전자좌 및/또는 다른 유전자좌에서 서열을 절단하는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제이다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 및 MAD7 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 유사체로부터 선택될 수 있다.
키트의 구성 요소는 하나의 용기에 결합되거나 각 구성 요소가 자체 용기에있을 수 있다. 예를 들어, 키트의 구성 요소는 단일 반응 튜브 또는 하나 이상의 다른 반응 튜브에서 결합될 수 있다.
상기 언급된 성분에 추가하여, 대상 키트는 대상 방법을 실행하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 주제 방법을 실행하기 위한 지침은 일반적으로 적절한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재에 인쇄될 수 있다. 이와 같이 설명서는 키트의 용기 또는 그 구성 요소의 라벨링에 패키지 삽입물로서 키트에 존재할 수 있다(즉, 패키징 또는 서브 패키징과 결함됨). 다른 실시태양에서, 실제 지침은 키트에 존재하지 않지만 원격 소스로부터 지침을 얻기 위한 수단, 예를 들어 인터넷을 통해 제공된다. 이 실시태양의 예는 지침을 볼 수 있고/있거나 지침을 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 예시된다. 그러나, 전술한 실시 예와 같이 이들 실시예는 예시적인 것이며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 점에 유의해야 한다.
실시예 1 - 편집 라운드마다 역선택 마커를 사용할 필요가 없는 CRISPR을 통한 미생물 숙주 세포 게놈의 반복 편집 방법의 원리 증명.
목적
이 실시예는 편집의 각 라운드에서 역선택 가능한 마커의 사용을 요구하지 않고 미생물 숙주 세포의 게놈에서 여러 게놈 편집을 스태킹하기 위한 CRISPR 매개 방법의 사용을 기술한다. 이 실시예에서 사용된 방법의 일반적인 워크플로우는 도 4에 도시되어 있다. 도 1은 CRISPR/Cas9 및 람다 레드 재조합 기구를 포함하는 미생물 숙주 균주(즉, 대장균 균주)에서 게놈 편집의 3회의 연속 라운드 각각에서 3개의 개별 게놈 유전자좌 중 하나에 유전자 편집을 도입하는 것을 수반하였다. 3개의 개별 게놈 유전자좌 각각에 대한 유전자 편집은 선택 가능한 마커 유전자(즉, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(KanR), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(ChlorR) 또는 테트라사이클린 유출 수송체(TetR))를 포함하는 별도의 구조체에 각각 존재하였고 각각의 구조체는 미생물 숙주 균주에 단독으로 도입되었다. 제 1 라운드에서, KanR 플라스미드는 미생물 숙주 세포로 형질전환되었고 형질전환체는 카나마이신 함유 배지(Kan)에서의 성장을 통해 선택되었다. 그런 다음, 항생제 내성 형질전환체를 플레이트로부터 개별적으로 선택하고(서브셋은 유전자형이 결정됨), KanR 플라스미드에 대해 선택하지 않은 배지에서 밤새 배양하고 제 2 라운드의 형질전환을 위해 준비하였다. 제 2 형질전환 라운드에서, ChlorR 플라스미드는 제 1 라운드에서 선택되고 클로람페니콜 함유 배지(CMP)에서 성장을 통해 선택되는 형질전환체로 형질전환되었다. 제 2 라운드에서 선택된 형질전환체에서 TetR 플라스미드의 제 3 라운드에 대해 동일한 주기가 발생하였다. TetR 플라스미드의 형질전환 후, 한 라운드의 역선택을 선택적으로 적용하여 세포 집단에 남아 있는 임의의 플라스미드를 적극적으로 제거할 수 있다(예를 들어, 도 1 및 9에서 "2"). 도 1 및 9에 도시된 바와 같이, 역선택은 수동적이거나 능동적이었다. 라운드 1 및 2 및 라운드 2 및 3 사이의 수동 역선택(도 1 및 9의 '1')은 항생제 선택(즉, 비선택적 배지에서의 성장)으로부터 형질전환체를 방출함으로써 매개되었다. 항생제 선택 압력이 없는 경우, 플라스미드는 복제 기계(즉, 단백질)를 놓고 경쟁하여 세포에서 손실을 초래한ㄷ다라운드 3 후 활성 역선택(도 1 및 9의 '2')은 sgRNA/복구 단편 플라스미드에 존재하는 sacB 또는 pheS와 같은 마커의 사용을 통해 매개될 수 있다.
재료 및 방법
천연 Cas9 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas9 유전자 및 아라비노스 유도성 물질에 작동 가능하게 연결된 오페론에서 람다 적색 재조합 시스템(즉, 베타, 감 및 엑소)의 단백질 세트를 포함하는 Cas9/람다-적색 플라스미드 프로모터는 당업계에 공지된 클로닝 방법을 사용하여 구축하였다. 그런 다음 Cas9/람다-레드 플라스미드를 E. coli W3110 균주로 형질전환시켰다.
도 1에 도시된 반복적 CRISPR 편집 워크플로우의 효능을 수행하고 테스트하기 위해, 3세트의 sgRNA/복구 단편 플라스미드를 구축하였다. sgRNA/복구 단편 플라스미드의 제 1 세트(즉, KanR 플라스미드)는 대장균 균주에서 cadA 유전자를 표적으로 하는 pR 프로모터의 제어하에서 sgRNA 카세트, cadA 유전자에 893bp 결실을 도입하기 위한 결실 카세트, 성공적으로 형질전환된 대장균 숙주 세포에 카나마이신 내성을 부여하기 위한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 유전자 및 대장균 숙주 세포에서 유지를 위한 복제 기점을 가졌다. 제 2 세트의 sgRNA/복구 단편 플라스미드(즉, ChlorR 플라스미드)는 대장균 균주에서 maeA 유전자를 표적으로 하는 pR 프로모터의 제어하에서 sgRNA 카세트, maeA 유전자에 1375bp 결실을 도입하기 위한 결실 카세트, 성공적으로 형질전환된 대장균 숙주 세포에 클로람페니콜 내성을 부여하기 위한 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 및 sgRNA/복구 단편 플라스미드의 제 1 세트와 같은 대장균 숙주 세포에서의 유지를 위한 동일한 복제 기원을 가졌다. 제 3 세트의 sgRNA/복구 단편 플라스미드(즉, tetR 플라스미드)는 대장균 균주에서 maeB 유전자를 표적으로 하는 pR 프로모터의 제어하에서 sgRNA 카세트, maeB 유전자에 1543 bp 결실을 도입하기 위한 결실 카세트, 성공적으로 형질전환된 대장균 숙주 세포에 테트라사이클린 내성을 부여하고 대장균 숙주 세포에서 sgRNA/복구 단편 플라스미드의 제 1 및 제 2 세트와 동일한 복제 기점을 유지하기 위한 테트라사이클린 유출 수송체 유전자를 가졌다. sgRNA/복구 단편 플라스미드의 모든 세트는 또한 성장 배지를 함유하는 수크로스 상에서 역선택을 가능하게 하는 sacB 유전자를 가졌다.
sgRNA/복구 단편 플라스미드의 3개 세트 각각을 제조한 후, KanR 플라스미드를 카베니실린에 대한 내성을 부여하기 위한 베타-락타마제 유전자를 갖는 Cas9/람다 레드 플라스미드를 함유하는 기본 대장균 W3110 균주로 형질전환시켰고 생성된 라운드 1 형질전환체는 성장판을 함유하는 카나마이신 및 카르베니실린 상에서의 성장을 통해 선택되었다. 각각의 선택 배지 플레이트에서 성장은 개별 콜로니가 선택 가능해질 때까지의 기간(일반적으로 하룻밤) 동안이었다. 그런 다음 여러 Kan 및 Clin 내성 콜로니를 원하는 편집의 유전자형 결정을 위해 선택하고 KanR, ClinR 또는 TetR 플라스미드의 존재를 결정하기 위해 선택적 배지에 패치를 적용하고 카베니실린을 함유한 배지에서 밤새 성장시켜 Cas9/람다 레드 플라스미드에 대해서만 선택하였다(도 2 참조). 적격 세포(Compentent cell)는 라운드 1 형질전환체로부터 유래된 밤새 배양물로부터 제조되었고, Cas9/람다 레드 플라스미드 및 KanR 플라스미드를 함유하는 생성된 적격 라운드 1 형질전환체는 ChlorR 플라스미드로 형질전환되었고 라운드 2 형질전환체는 클로람페니콜 및 카르베니실린 함유 플레이트에서의 성장을 통해 선택되었다. 그런 다음 여러 Chlor 및 Clin 내성 콜로니를 원하는 편집의 유전자형 결정을 위해 선택하고, KanR, ClinR 또는 TetR 플라스미드의 존재를 결정하기 위해 선택적 배지에 패치를 적용하고 카베니실린을 함유한 배지에서 밤새 성장시켜 Cas9/람다 레드 플라스미드에 대해서만 선택하였다(도 2 참조). 적격 세포는 라운드 2 형질전환체로부터 유래된 밤새 배양물로부터 제조되었고, Cas9/람다 레드 플라스미드 및 ChlorR 플라스미드를 함유하는 생성된 적격 라운드 2 형질전환체(서브세트는 또한 KanR 플라스미드를 함유할 수 있음)를 TetR 플라스미드로 형질전환시켰다. 테트라사이클린 및 카르베니실린 함유 플레이트 상에서의 성장을 통해 라운드 3 형질전환체를 선택하였다. 여러 TetR 및 Clin 내성 콜로니를 선택하고 라운드 1, 2 및 3의 편집에 대해 유전자형을 결정하고(도 4 참조) KanR, ClinR 또는 TetR 플라스미드의 존재를 결정하기 위해 선택적 배지에 패치를 적용하였다(도 2 참조). 변형된 대장균 균주가 프로토콜 동안 도입된 각각의 유전자 편집을 포함하고 이전에 도입된 모든 sgRNA/복구 단편 플라스미드가 결여된 경우, 콜로니는 적절한 양의 역선택제를 함유하는 배지에서 밤새 성장할 수 있다는 점에 유의해야 한다. (예를 들어, 5% 수크로스; 도 1 및 9 참조).
결과
이 실시예의 목적 중 하나는 플라스미드를 함유하는 제 1 선택 가능한 마커가 플라스미드를 포함하는 제 2 선택 가능한 마커의 도입 및 선택에 의해 플라스미드를 포함하는 상기 제 1 선택 가능한 마커를 보유하는 미생물 숙주 세포로부터 제거 또는 삭제되는지를 데스트하는 것이었다. 이런 소위 '수동' 연선택 과정에서 플라스미드를 포함하는 제 1 선택 가능한 마커에 대한 도입 및 선택에 의한 제 1 선택 가능한 마커의 손실은 플라스미드를 포함하는 제 1 선택 가능한 마커에 대한 선택의 부족 뿐만 아니라 DNA 복제 기계에 대한 경쟁으로 인해 발생하는 것으로 가정되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 숙주 세포로부터 플라스미드를 함유하는 사전에 도입된 선별 마커의 손실이 실제로 발생하였다. 특히, 도 2는 동일한 복제 기원을 갖는 상이한 항생제 선택 마커를 함유하는 새로운 플라스미드로 형질전환을 통한 플라스미드 제거의 예를 도시하였다. 이는 특히 도 2의 우측 하단 행에 있는 페트리 접시의 사진에 도시되며, 여기서 세포는 tetR 플라스미드를 강력하게 발현하지만, 이전 형질전환에서 도입된 ChlorR 플라스미드 및 KanR 플라스미드 둘 모두를 분명히 상실하였다.
미생물 숙주 균주에 도입된 플라스미드는 각각의 새로운 형질전환 및 선택과 함께 점진적으로 손실되었지만(도 2 참조), 각 플라스미드의 숙주 세포 내에 도입된 유전자 편집(cadA, maeA 및 maeB 유전자의 결실)은 도 4에서 3 라운드의 형질전환 후 대장균 콜로니로부터 콜로니 PCR 반응에 대해 실행된 겔의 이미지에서 알 수 있는 바와 같이 명백히 효능이 있었다. 특히, 도 4는 본 발명에 기술된 sgRNA 복구 단편 플라스미드 세트를 사용한 3회의 연속적인 라운드의 형질전환 후에 개별 콜로니에서 adA, maeA 및 maeB 결실의 존재를 도시하였다. 편집 효율은 도 3에 도시된 바와 같이 변환의 연속적인 라운드 사이에서 변하였다는 점에 유의해야 한다; 그러나 가변 편집 효율은 표적화된 유전자좌 및/또는 이에 도입된 유전자 편집의 기능일 수 있다. 예를 들어, cadA 결실은 독성이 있을 수 있으며, 이는 이 형질전환 라운드의 낮은 편집 효율성을 설명할 수 있다.
전반적으로, 본 발명에 제공된 결과는 미생물 숙주 세포에서 유전자 편집의 반복적 스태킹이 본 발명 전체에 걸쳐 제공된 바와 같이 편집의 각 라운드에서 역선택가능 마커의 활성 발현 및 이용을 필요로 하지 않고 수행될 수 있음을 명확하게 입증하였다.
실시예 2 - 미생물 숙주 균주에 사전에 도입된 플라스미드를 제거하는 방법의 원리 증명.
목적
본 실시예는 상기 제 1 플라스미드가 더 이상 존재하지 않는 최종 균주를 수득함으로써 상기 제 1 플라스미드의 상기 미생물 균주를 효과적으로 경화시키는 것을 목적으로 미생물 균주 내에 존재하는 제 1 플라스미드의 제거를 설명한다.
재료 및 방법
도 5a-5d에 도시된 바와 같이, 제 1 플라스미드가 미생물 균주에 더 이상 존재하지 않는 최종 균주를 얻기 위해, 제 1 플라스미드와 동일한 복제 기점, 항생제 선택 마커 및 선택적 역선택 마커를 포함하는 제 2 플라스미드가 균주 내로 형질전환된다(도 5a). 제 2 플라스미드를 흡수한 형질전환체는 선택 배지에 플레이팅하여 선택된다(도 5b). 제 2 플라스미드를 유지하기 위한 선택하에 생성된 균주의 성장은 사전에 존재하는 제 1 플라스미드의 손실을 초래한다(도 5c). 이 제 2 플라스미드는 항생제 선택 및/또는 플라스미드 상의 선택적인 역선택 가능한 마커의 활성 역선택에 의해 소실되어 제 1, 제 2 또는 임의의 추가 플라스미드가 없는 최종 균주를 생성할 수 있다(도 5d). 제 1 플라스미드는 예를 들어, 본 발명에 제공된 및/또는 당업계에 공지된 유전자 편집 방법 동안과 같이 미생물 균주 내로 사전에 도입된 플라스미드일 수 있거나, 미생물 균주에 고유한 플라스미드일 수 있음을 주목해야 한다.
실시예 3 - 다중 방식의 반복적 편집 방법 원리 증명
목적
이 실시예는 실시예 1에 기술된 반복적인 편집 방법을 확장하기 위한 CRISPR 매개 방법의 사용을 설명하여, 1개 이상의 편집이 유전자 편집의 각 라운드에서 역선택 가능한 마커를 사용하지 않고도 미생물 숙주 세포의 게놈에 여러 게놈 편집을 쌓는 것을 목표로 하는 유전자 편집의 일련의 연속적인 라운드의 각 라운드에서 미생물 숙주 세포 또는 이로부터 유래된 형질전환체에 부여되도록 한다. 이 실시예에서, 접근 방식은 도입된 각각의 플라스미드가 >1 가이드 RNA(gRNA)/복구 단편 쌍을 포함한다는 점을 제외하고, 실시예 1 및 본 발명의 다른 곳에서 설명된 것과 유사하다.
재료 및 방법
이 실시예에서 사용된 미생물 세포는 실시예 1에서 생성되고 사용된 동일한 대장균 W3110 균주이다.
대장균에서 반복적 다중 편집을 위해 편집 플라스미드의 세 가지 다른 세트가 준비된다. 세트당 동일한 플라스미드 백본이 사용된다. 편집은 각 편집 라운드마다 숙주 세포의 게놈에 두 가지 다른 편집을 도입하는 것을 목표로 세 라운드를 통해 수행되며, 각 라운드마다 도입된 편집은 이전 편집 라운드에서 도입된 편집과 상이하다. 각 편집 플라스미드는 2개의 상이한 sgRNA/복구 단편 쌍을 포함한다. 모든 편집 플라스미드는 동일한 복제 ori를 포함하고 편집 플라스미드의 각각 다른 세트는 다른 항생제 마커를 포함한다(이 예에서, 플라스미드 세트 1 = KanR, 플라스미드, 세트 2 = ChlorR, 플라스미드, 세트 3 = TetR). 따라서 KanR, ChlorR 및 TetR 플라스미드의 각각은 상이한 다중 sgRNA/복구 단편 쌍을 포함한다.
편집의 제 1 라운드를 위해, KanR 플라스미드(세트 1)는 실시예 1에서 상기한 바와 같이 ClinR Cas9/람다 레드 플라스미드를 함유하는 대장균 W3110 기본 균주로 형질전환된다. 형질전환체는 카나마이신과 카르베니실린에 대해 선택적인 배지에 플레이팅함으로써 선택된다. 여러 Kan 및 Clin 내성 콜로니를 유전자형 결정을 위해 선택하고 카르베니실린을 함유한 배지에서 밤새 성장시켜 Cas9/람다 레드 플라스미드에 대해서만 선택한다. 적격 세포는 라운드 1 형질전환체로부터 유래된 밤새 배양물로부터 제조되고, Cas9/람다 레드 플라스미드 및 KanR 플라스미드를 함유하는 생성된 적격 라운드 1 형질전환체는 ChlorR 플라스미드(세트 2)로 형질전환된다. 라운드 2 형질전환체는 클로람페니콜 및 카르베니실린 함유 플레이트에서 성장을 통해 선택된다. 여러 ChlorR 및 Clin 내성 콜로니를 유전형 분석(ChloR 편집 및 KanR 편집 모두의 유전자형 결정)을 위해 선택하고 카베니실린을 함유한 배지에서 밤새 성장시켜 Cas9/람다 레드 플라스미드에 대해서만 선택한다. 적격 세포는 라운드 2 형질전환체로부터 유래된 밤새 배양물로부터 제조되고, Cas9/람다 레드 플라스미드 및 ChlorR 플라스미드를 함유하는 생성된 적격 라운드 2 형질전환체(하위 집합은 KanR 플라스미드도 함유할 수 있음)는 TetR 플라스미드(세트 3)로 형질전환된다. 라운드 3 형질전환체는 테트라사이클린 및 카르베니실린 함유 플레이트 상에서의 성장을 통해 선택된다. 여러 테트라사이클린 내성 콜로니를 유전자형 결정(TetR, ChloR 및 KanR 편집의 유전자형 결정)을 위해 선택하고 카베니실린을 함유한 배지에서 밤새 성장시켜 Cas9/람다 레드 플라스미드에 대해서만 선택한다. 한 라운드의 역선택을 선택적으로 적용하여 세포 집단에 남아 있는 임의의 플라스미드를 적극적으로 제거할 수 있다(예를 들어, 도 1 및 9에서 "2"). 예를 들어, 일부 경우에, 마지막 편집 라운드 후에 카르베니실린만 포함하는 배지에서 세포를 성장시키는 대신, 적절한 양의 역선택제(예를 들어, 5% 수크로스)를 포함하는 배지에서 세포를 밤새 성장시켜 sgRNA/복구 단편 쌍을 포함하는 도입된 모든 플라스미드가 결여되어 있는 균주를 생성한다. 생성된 세포 집단은 일반적으로 이 실시예에서 세포당 6개의 상이한 편집인 다수의 상이한 유전자 편집을 갖는 개별 세포를 포함하고; 상이한 편집은 편집의 각 라운드마다 플라스미드 세트마다 존재하는 다른 sgRNA/복구 단편 쌍의 일부 또는 전부에 해당한다.
실시예 4 - 대장균에서 풀링된 CRISPR 매개 편집의 원리 증명 .
목적
이 실시예는 편집(즉, 생물다양성)의 조합을 포함하는 혼합된 대장균 집단을 생성하기 위해 대장균 숙주 균주의 게놈을 편집하기 위한 풀링된 CRISPR 매개 방법의 사용을 기술한다. 이 실시예에서, CRISPR 매개 편집이 여러 게놈 유전자좌에 걸쳐 유전자 편집의 다양한 조합을 포함하는 대장균 세포의 집단을 생성하는 데 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 여러 게놈 유전자좌 중 하나에 여러 가능한 유전자 편집 중 하나를 각각 포함하는 복구 단편의 혼합물을 함유하는 풀을 대장균 기본 균주에 도입하였다.
재료 및 방법
이 실시예에서 사용된 미생물 세포는 실시예 1에서 생성되고 사용된 동일한 대장균 W3110 균주이었다.
추가로, 상기 생성된 대장균 염기 균주에 풀로서 도입될 sgRNA/복구 단편 플라스미드의 집합을 준비하였다. 각각의 플라스미드는 (1) 카세트에 암호화된 sgRNA의 구성적 발현을 촉진하는 pR 프로모터에 작동 가능하게 연결된 3개의 게놈 유전자좌(즉, cadA, maeA 또는 maeB) 중 하나를 표적화하는 sgRNA를 포함하는 sgRNA 카세트; (2) 해당 유전자좌에 대한 적절한 sgRNA에 상응하는 3개의 유전자좌 중 하나에 대한 원하는 유전자 편집을 포함하는 복구 단편(9개의 복구 단편 중 하나(즉, cadA에서 3개의 상이한 결실: 500bp 결실, 890bp 결실 및 1500bp 결실; maeA에서 3개의 상이한 결실: 1000 bp 결실, 1300 bp 결실 및 1500 bp 결실); (3) sgRNA/복구 단편 플라스미드를 상기 생성된 기본 균주에 도입한 후 대장균 형질전환체를 선택하고 필요한 클로닝 단계 동안 사용하기 위해 카나마이신에 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 유전자; (4) 대장균에서 플라스미드 유지를 위한 colE1 복제 기점; 및 (5) 대장균에 대한 sacB 역선택 마커를 포함하였다. 제조 후, 9개의 sgRNA/복구 단편 플라스미드를 동일한 비율로 함께 혼합하여 상기 생성된 대장균 염기 균주에 도입하기 위한 풀을 생성하였다.
상기 시약의 제조 후, CRISPR/Cas9 및 람다 레드 재조합 기구를 함유하는 대장균 기본 균주를 서로 동일한 비율로 각각 9개의 sgRNA/복구 플라스미드의 풀로 형질전환시켰다. 위에서 언급한 바와 같이, 9개의 sgRNA/복구 플라스미드 각각은 3개의 sgRNA 중 하나(즉, 이 실험에서 3개의 유전자좌가 표적화되었다: cadA, maeA 또는 maeB)와 9개의 복구 단편 중 하나(즉, cadA에서 3개의 상이한 결실: 500bp 결실, 890bp 결실 및 1500bp 결실, maeA에서 3개의 상이한 결실: 1000bp 결실, 1300bp 결실 및 1500bp 결실)를 포함하였다. 형질전환 반응을 180℃ 또는 300℃에서 배양하고 1시간(180℃ 및 300℃ 모두에서 배양) 또는 3시간(300℃에서 배양) 후에 회수하고 카나마이신을 함유하는 배지에 플레이팅하였다. 콜로니 PCR에 의한 성공적인 편집을 위해 콜로니를 선택하고 스크리닝하거나 유전자형을 결정하였다.
결과
도 6은 테스트된 3개의 상이한 조건(성장 온도/회복 시간)에 대해 선별된 콜로니에서 관찰된 편집을 도시한다. 조건 중 2개(30℃-1시간 회수 및 30℃-3시간 회복)에서, 9개의 의도된 편집 중 4개가 확인되었다. 마지막 조건(180℃-1시간 회수)에서 9개의 의도된 편집 중 5개가 확인되었다. 전반적으로, 도 6에 도시된 결과는 풀링된 CRISPR-매개 편집을 사용하여 다중 게놈 유전자좌에 걸친 유전자 편집의 특정 조합을 포함하는 대장균 숙주 세포의 집단을 생성할 수 있음을 입증한다.
실시예 5 - C. 글루타미쿰에서 풀링된 CRISPR 매개 편집의 원리 증명.
목적
이 실시예는 편집(즉, 생물다양성)의 조합을 포함하는 C. 글루타미쿰의 혼합 집단을 생성하기 위해 C. 글루타미쿰 숙주 균주의 게놈을 편집하기 위한 풀링된 CRISPR 매개 방법의 사용을 기술한다. 이 실시예에서, CRISPR 매개 편집이 여러 게놈 유전자좌에 걸쳐 유전자 편집의 다양한 조합을 포함하는 C. 글루타미쿰 세포의 집단을 생성하는 데 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 여러 게놈 유전자좌 중 하나에 여러 가능한 유전자 편집 중 하나를 각각 포함하는 복구 단편의 혼합물을 함유하는 풀을 C. 글루타미쿰 기본 균주에 도입하였다.
재료 및 방법
이 실시예에서 실험을 수행하기 위해, CRISPR/Cas9를 함유하는 C. 글루타미쿰 기본 균주는 C. 글루타미쿰 숙주 세포의 게놈 내에서 구성적 발현을 촉진하는 프로모터(예를 들어, Ptrc)에 작동 가능하게 연결된 Cas9 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 통합함으로써 생성되었다. 이종 재조합 시스템을 암호화하는 단백질 또는 유전자 세트는 또한 C. 글루타미쿰 기본 균주에 도입될 수 있다. 이종 재조합 단백질 세트를 암호화하는 유전자는 오페론에서 발현될 수 있고 유도성 프로모터에 의해 유도될 수 있으며, 이는 플라스미드 내에 포함되거나 게놈에 통합될 수 있다.
추가로, 상기 생성된 C. 글루타미쿰 염기 균주에 풀로서 도입될 sgRNA/복구 단편 플라스미드의 집합을 준비하였다. 각각의 플라스미드는 (1) 카세트에 암호화된 sgRNA의 구성적 발현을 촉진하는 프로모터(예를 들어, Pcg2613)에 작동 가능하게 연결된 여러 게놈 유전자좌 중 하나를 표적화하는 sgRNA를 포함하는 sgRNA 카세트; (2) 여러 유전자좌(PROSWAPS 또는 데그론에 대한 프로모터) 중 하나에 대한 원하는 유전자 편집을 포함하는 복구 단편 (3) sgRNA/복구 단편 플라스미드를 준비하는 동안 대장균의 클로닝 단계에 사용하고 sgRNA/복구 단편 플라스미드 도입 후 C. 글루타미쿰 형질전환체를 선택하기 위한 적절한 선택 마커 유전자(예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제); (4) 대장균(예를 들어, colE1 또는 p15A)에서 플라스미드 유지를 위한 적절한 복제 기점; 및 (5) C. 글루타미쿰(예를 들어, CASE1 또는 CG1)에서 플라스미드 유지를 위한 적절한 복제 기점을 포함하였다. C. 글루타미쿰(예를 들어, sacB, pheS 등)에 대한 적절한 역선택 마커도 sgRNA/복구 단편 플라스미드에 포함될 수 있다. 제조 후, sgRNA/복구 단편 플라스미드를 동일한 비율로 함께 혼합하여 상기 생성된 C. 글루타미쿰 기본 균주에 도입하기 위한 풀을 생성하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 17개의 상이한 sgRNA/복구 플라스미드 풀을 제조하였다. 각 풀은 3 내지 17개의 플라스미드를 포함하였다; 주어진 풀 내의 모든 플라스미드는 PROSWAP용 프로모터 또는 데그론에 대한 프로모터, 동일한 유형의 편집을 포함하였다. 주어진 풀 내의 모든 플라스미드는 다른 유전자좌를 표적화하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 17개의 풀은 300ng(도면의 오른쪽)과 900ng(도면의 왼쪽)를 포함하였다. C. 글루타미쿰으로 형질전환하기 전에, 모든 플라스미드 풀로부터 차세대 시퀀싱(NGS) 라이브러리를 제조하고, 생성된 서열 판독을 사용하여 도 7에 도시된 바와 같이 각 풀에 존재하는 편집 플라스미드의 비율을 확인하였다. 도 7 내에서, 각 파이 차트는 풀을 나타내고, 각 색상은 주어진 풀 내에서 고유한 sgRNA/수리 플라스미드를 나타내고 "파이 조각"의 크기는 주어진 풀 내에서 판독(즉, 플라스미드) 수에 비례한다.
상기 시약의 제조 후, CRISPR/Cas9를 함유하는 C. 글루타미쿰 기본 균주는 도 7에 도시된 17개의 풀 중 하나의 300ng(도면의 우측) 또는 900ng(도면의 좌측)으로 형질전환되었다. 형질전환은 30℃에서 3시간 후에 회복되었고 카나마이신을 함유하는 배지에 플레이팅되었다. 형질전환체의 콜로니를 선택하고 NGS(Next Generation Sequencing)로 편집을 평가하였다. NGS 스크리닝 절차에는 PCR 증폭 및 의도된 표적 유전자좌를 식별하기 위해 선택된 콜로니 내에 포함된 sgRNA/복구 플라스미드의 후속 NGS 시퀀싱이 수반되었다. 다음으로, 이 식별 정보를 사용하여 대상 유전자좌 프라이머를 선택된 각 콜로니와 일치시켰다. 표적 유전자좌 프라이머는 sgRNA/복구 플라스미드에 존재하는 상동성 암 외부를 어닐링하도록 설계되었다. 다음으로, 각 콜로니의 표적 유전자좌를 증폭하고, 각 앰플리콘의 태그화 라이브러리를 구축하고, 각 앰플리콘에 대한 태그화 라이브러리의 서열을 분석하여 의도한 편집이 각 유전자좌에 성공적으로 통합되었는지 확인하였다.
결과
도 8에 도시된 바와 같이, 단일 풀로부터 복구된 개별 편집의 최대 수는 8이었다. 도 8에서, 각 색상은 다른 성공적인 편집을 나타내고, 검은색과 흰색 줄무늬는 결정적이지 않은 시퀀싱 데이터를 나타내고, 흰색은 야생형을 나타내고, 검은색은 프로세스 실패를 나타낸다. 전반적으로, 도 8에 도시된 결과는 풀링된 CRISPR-매개 편집을 사용하여 다중 게놈 유전자좌에 걸쳐 유전자 편집의 특정 조합을 함유하는 C. 글루타미쿰 숙주 세포의 집단을 생성할 수 있음을 입증한다. 또한, 실시예 4 및 5의 결합된 결과는 풀링된 CRISPR 편집이 일반적으로 원핵생물에서 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 6 - 풀링된 방식으로 반복적 편집 방법 원리 증명
목적
이 실시예는 편집(즉, 생물다양성)의 조합 모음을 생성하기 위해 실시예 1 및 3에 기술된 반복적 편집 방법을 확장하기 위한 CRISPR 매개 방법의 사용을 기술한다. 이를 달성하기 위해, 실시예 1 및 3에 기술된 반복적 편집 방법 및 실시예 3-5에 기술된 풀링 편집 방법은 각각의 형질전환 또는 형질전환 라운드가 1개 초과 또는 1개 초과 편집 플라스미드의 도입으로 구성되는 방식으로 확장될 수 있다.
재료 및 방법
이 실시예에 기술된 풀링된 반복적 편집 방법은 또한 실시예 1에서 생성되고 사용된 동일한 대장균 W3110 균주에서 수행될 수 있다.
이 실시예의 풀링된 반복적 편집 방법을 구현하기 위해, 편집 라운드 동안 편집 플라스미드의 풀이 각 세트에 사용되어 세트당 각 편집 플라스미드가 동일한 유전자좌를 표적화하는 하나의 sgRNA/복구 단편 쌍을 포함하거나(실시예 1에 기술된 바와 같은 기본 반복 편집) 다수의 유전자좌를 표적화하는 2개 이상의 상이한 sgRNA/복구 단편 쌍(실시예 3에 기술된 바와 같은 다중 반복 편집)을 포함한다. 이 실시예의 실시태양이 본 발명에 기술된 풀링되지 않은 실시예("단일 돌연변이 스태킹")와 비교하여 도 9("조합 돌연변이 스태킹")에 도시된다. 각 형질전환 후, 콜로니를 플레이트에서 수집하고 결합한다 - 그런 다음 이 콜로니 콜렉션에서 적격 세포가 준비된다. 제 2 편집 라운드에서, 편집 플라스미드의 별도 풀이 형질전환되고(라운드 1과 상이한 선택 마커 포함) 형질전환체가 선택된다. 라운드 2의 형질전환체를 플레이트에서 수집하고 결합한 다음 적격 세포를 준비하여 제 3 편집 풀의 형질전환에 사용한다. n 라운드의 풀링 형질전환 완료 후, 개별 콜로니는 유전자형이 결정되고 관심 표현형에 대해 테스트될 수 있다. 형질전환을 완료한 후, 역선택 라운드를 선택적으로 적용하여 세포 집단에 남아 있는 임의의 플라스미드를 적극적으로 제거할 수 있다(예를 들어, 도 1 및 9에서 "2"). 생성된 세포 집단은 세포당 상이한 단일 또는 다수의 상이한 유전자 편집을 갖는 하위-집단을 포함할 것이고, 상이한 편집은 임의의 편집 라운드마다 플라스미드 세트당 존재하는 상이한 sgRNA/복구 단편 쌍의 일부에 상응한다.
실시예 7 - 대장균에서 상동 재조합(HR) 매개 풀링된 균주 구축 방법의 원리 증명
목적
이 실시예는 편집된 미생물의 집합체를 생성하기 위한 고유 상동성 재조합의 사용을 자세히 기술한다. 이 실시예에서 각 플라스미드는 게놈의 영역(예를 들어, 좌측 및 우측 상동성 암)에 대한 서열 상동성을 포함한다. 좌측 및 우측 상동성 암은 디자인된 편집(예를 들어, 프로모터 또는 기타 서열 삽입, 치환 또는 결실)에 의해 분리된다. 플라스미드의 다른 특징은 양성 선택 마커(예를 들어, 카나마이신 내성 카세트), 역선택 마커(예: SacB 또는 PheS, 각각 수크로스 및 4-클로로-페닐알라닌 존재시 독성 부여) 및 R6K 복제 기원을 포함한다.
재료 및 방법
풀링된 균주 빌드를 사용한 균주의 구성은 일반적으로 두 부분으로 구성된다. 첫째, 가능한 많은 편집 중 하나를 만들 수 있는 플라스미드 풀을 만들고 이를 한 번에 수용 미생물로 형질전환하여 편집된 균주 라이브러리를 생성한다. 둘째, 있는 경우, 어느 유전자좌 또는 유전자좌들이 편집되는지를 동정한다.
편집된 균주 라이브러리 생성
각각의 플라스미드가 등몰량으로 존재하도록 10개의 플라스미드/풀의 6개의 상이한 풀을 제조하였다. 각 플라스미드는 1kb 상동성 암이 측면에 있는 추가할 프로모터 서열을 포함하였다. 이러한 플라스미드의 풀을 대장균 균주에 전기천공하고, 37℃에서 1-3시간 동안 풍부한 성장 배지에서 회수하고, 표준 대장균 배양 방법을 사용하여 단일 재조합 이벤트를 포함하는 단일 콜로니를 선택하였다. 형질전환 후 회수 시간(즉, 37C에서 1-3시간)은 풀링된 라이브러리에서 바이어스를 생성할 가능성을 최소화하면서 전기천공에서 형질전환체의 복구를 보장하는 데 사용되었다(예를 들어, 일부 편집된 균주는 더 많거나 적은 빈도 및/또는 다른 편집되거나 편집되지 않은 균주보다 더 빠르거나 느리게 성장할 수 있다). 추가로, 생성된 형질전환체를 배지에 플레이팅하여 염색체와 플라스미드의 재조합이 플라스미드에 존재하고 디자인된 편집의 측면에 있는 2개의 상동성 부위 중 하나에서 발생하는 형질전환체를 선택하였다.
단일 재조합 이벤트를 함유하는 콜로니는 한천 배지를 긁어내고 액체 배지에서 조합된 콜로니 바이오매스를 재현탁시킴으로써 함께 풀링하였다. 10개 플라스미드의 각 풀에서 생성된 콜로니의 다양성을 유지하기 위해 약 100개의 콜로니를 스크래핑하는 동안 함께 풀링하였다. 이들 콜로니를 25% 글리세롤 및 50ug/mL 카나마이신을 함유하는 리소제니 브로스 배지에 재현탁시키고, -80℃에서 60분 동안 동결시키고, 실온에서 해동하고, 30분 동안 교반하면서 37℃에서 배양하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 희석하고 다중 희석액을 수크로스 및 4-클로로페닐알라닌을 함유하는 배지(역선택 가능한 배지)에 플레이팅하여 역선택 유전자 sacB 및 pheS에 의해 매개되는 제 2 재조합 이벤트의 발생을 유도하고 선택하였다. 플레이트를 30℃에서 24-36시간 동안 배양하였다. 이것은 염색체가 좌측 또는 우측 상동성 암에서 제 2 재조합 이벤트를 거친 세포(및 콜로니)의 유도 및 선택을 허용하였다. 제 2 재조합 이벤트가 제 1 재조합 이벤트와 동일한 상동성 암에서 발생한 경우, 시작 균주가 다시 생성된다. 제 2 재조합 이벤트가 제 2 재조합 위치에서 발생한 경우, 생성된 균주는 의도된 편집을 포함하였다. 따라서, 역선택 배지에서 성장하는 콜로니 집단은 편집되지 않은 균주와 편집된 균주의 혼합물을 모두 포함하며, 각각은 초기 플라스미드의 풀에 포함된 편집 중 하나를 포함한다.
편집된 유전자좌의 동정
게놈에서 디자인된 편집 또는 원래의 모 유전자형을 포함하는 제 2 재조합 이벤트에서 생성된 콜로니를 선택하고 37℃에서 밤새 액체 배지에서 성장시켰다. 편집된 유전자좌는 당업계에 공지된 PCR 및/또는 차세대 시퀀싱(NGS) 기술에 의해 동정하였다.
세포에 도입된 원래의 10개 플라스미드 중에서, 10개의 플라스미드를 통해 구축된 고유 편집의 평균 40%-50%는 수크로스 및 4-클로로페닐알라닌 배지에서 성장한 콜로니 중 96개를 스크리닝한 후 풀링된 플라스미드 형질전환당 회수될 수 있다(도 15 참조).
실시예 8 - CRISPR/Cas9 매개된 상동성 유도 복구를 사용한 S. 세레비시애에서 풀링된 게놈 편집의 사용
목적
이 실시예는 편집된 S. 세레비시애 균주의 집합을 생성하기 위한 고유 상동성 재조합의 사용을 자세히 기술한다. 이 실시예에서, S. 세레비시애 숙주 세포에 삽입될 각 페이로드는 게놈의 영역(예를 들어, 좌측 및 우측 상동성 암)에 상동성인 서열을 포함한다. 좌측 및 우측 상동성 암은 디자이된 편집(예를 들어, 결실)에 의해 분리된다.
재료 및 방법
풀링된 S. 세레비지애 균주 빌드를 사용한 균주 구축은 일반적으로 두 부분으로 구성되었다. 첫째, 게놈 유전자좌에서 3가지 가능한 편집 중 하나를 만들 수 있는 플라스미드 풀을 만들고 이를 한 번에 수용자 S. 세레비시애 숙주 세포로 변환하여 편집된 균주 라이브러리를 생성한다. 둘째, 특정 위치에서 어떤 편집이 발생했는지 동정한다. 전반적으로, 과정은 3개의 별개의 페이로드 중 하나가 표적화된 각 유전자좌에 삽입된 과정에서 Cas9 매개 상동 재조합을 사용하여 숙주 S. 세레비지애 균주를 형질전환시키는 것을 수반하였다(도 10a 참조).
Cas9는 숙주 S. 세레비지애 균주에 존재하는 항생제(즉, 누르세오트리신) 내성 마커 유전자를 암호화하는 항생제-선택 가능한 CEN.ARS 플라스미드로부터 발현되었다. 6개의 게놈 유전자좌(즉, ARI1 유전자, TRP1 유전자, ADH6 유전자, ECM13 유전자, MCH5 유전자 또는 PRB1 유전자) 중 하나를 표적으로 하는 스페이서를 함유하는 sgRNA 발현 구조체가 숙주 세포에 존재하는 Cas9 발현 플라스미드로의 상동성 재조합을 통한 통합을 위한 상동성 암을 갖는 선형 DNA 분자로서 6개의 개별 형질전환(즉, 유전자좌당 하나의 형질전환)의 각각에 제공되었다. 원하는 유전자좌에 페이로드를 표적으로 하는 45bp 상동성 암을 첨가하고 해당 sgRNA가 표적으로 하는 서열을 삭제하고 특정 편집 페이로드로 대체하기 위해 PCR을 사용하여 각 유전자좌에 대한 DNA의 선형 단편으로 3개의 편집 페이로드를 생성하였다. 3개의 편집 페이로드는 (1) 5'에서 3' 방향으로 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적색 형광 단백질(RFP)(RFP_F로 지정), (2) 3'에서 5' 방향으로 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 RFP(RFP_R로 지정), 또는 (3) 5'에서 3' 방향으로 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 RFP 및 5'에서 3' 방향으로 상이한 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 녹색 형광 단백질(GFP)(RFP_GFP로 지정)이었다. 6개의 표적화된 게놈 유전자좌 각각에 대해, 선형화된 Cas9 발현 플라스미드, 선형 sgRNA 발현 카세트 및 3개의 페이로드 앰플리콘의 등몰 풀은 화학적 형질전환 과정을 통해 S. 세레비시애로 형질전환되었고 형질전환체는 누르세오트리신을 함유하는 배지에서 선택되었다. 화학적 형질전환 과정은 Gietz,et al., Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology, 350(2001), 87-96에 기술된 대로 리튬 아세테이트/단일 가닥 운반체 DNA/폴리에틸렌 글리콜 방법을 사용하는 것을 수반하였다.
각각의 형질전환 후, 당업계에 공지된 바와 같이 PCR 및/또는 차세대 시퀀싱(NGS) 기술을 사용하여 콜로니를 배양하고 유전자형을 결정하였다.
결과 및 결론
도 10b에 도시된 바와 같이, 각 형질전환 후 테스트된 콜로니 중에서 3개의 페이로드가 모두 검출되었다. 이 과정은 페이로드 풀이 S. 세레비시애에서 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집에 사용되어 새로운 S. 세레비시애 균주를 효율적이고 저렴하게 생성할 수 있음을 입증하였다.
실시예 9 - CRISPR/Cas9 매개된 상동성 유도 복구를 사용하는 S. 세레비시애에서 반복적 게놈 편집의 사용
목적
이 실시예는 편집된 S. 세레비시애 균주의 집합을 생성하기 위해 S. 세레비시애 숙주 세포의 게놈을 반복적으로 편집하기 위한 고유 상동성 재조합의 사용을 상세히 기술하나다. 이 실시예에서, 새로운 편집 페이로드를 도입하는 각 연속적인 변환 라운드에서 S. 세레비시애 숙주 세포에 삽입될 각 편집 페이로드는 게놈의 영역(예를 들어, 좌측 및 우측 상동성 암)에 대한 서열 상동성을 포함한다. 좌측 및 우측 상동성 암은 디자인된 편집(예를 들어, 결실)에 의해 분리된다.
재료 및 방법
풀링된 S. 세레비지애 균주 빌드를 사용한 균주의 구축은 일반적으로 두 부분으로 구성되었다. 첫째, 게놈 유전자좌에서 3가지 가능한 편집 중 하나를 만들 수 있는 플라스미드 풀을 만들고 이를 한 번에 수용자 S. 세레비시애 숙주 세포로 변환한 다음 2회의 추가 편집 라운드를 위한 이 과정을 반복하여 편집된 균주 라이브러리를 생성하고, 각 추가 라운드는 특정 추가 라운드에서 표적화된 게놈 유전자좌에 대한 3가지 가능한 유전자 편집 중 하나를 사용하여 상이한 유전자좌를 표적화한다. 둘째, 특정 위치에서 어떤 편집이 발생했는지 동정한다. 전반적으로, 과정은 도 10a에 도시된 바와 같이 표적화된 각각의 유전자좌에 3개의 별개 페이로드 중 하나를 삽입하는 과정에서 Cas9 매개 상동 재조합을 사용하여 숙주 S. 세레비지애 균주를 형질전환시키나, 도 11a에 도시된 바와 같이 2개의 추가 라운드에 대해 과정을 반복하는 것을 수반하였다.
3회 라운드의 형질전환의 각 라운드에 대해, Cas9는 숙주 S. 세레비시애 균주에 존재하는 3개의 항생제-선택 가능한 CEN.ARS 플라스미드 중 하나로부터 발현되었다. 형질전환의 각 라운드는 3개의 상이한 항생제 선택가능 마커 유전자 중 하나를 암호화하는 CEN.ARS 플라스미드를 사용하여 각 라운드는 형질전환의 각 서로의 라운드로부터의 상이한 항생제 선택가능 마커(즉, 누르세오트리신(항생제 1), 제네티신(G418)(항생제 2) 또는 하이그로마이신(도 11a의 항생제 3)을 형질전환시켰다. 각각의 형질전환 라운드에서, sgRNA 발현 구조체는 숙주 세포에 존재하는 Cas9 발현 플라스미드로의 상동성 재조합을 통한 통합을 위한 상동성 암을 갖는 선형 DNA 분자로서 제공되는 형질전환 라운드의 서로 표적화된 게놈 유전자좌와 상이한 게놈 유전자좌를 표적화하는 스페이서를 함유한다. 3개의 가능한 편집 중 1개의 편집 페이로드는 특정 변환 라운드에 대한 원하는 유전자좌에 페이로드를 표적으로 하는 45bp 상동성 암을 추가하기 위해 PCR을 사용하고 해당 sgRNA가 표적으로 하는 서열을 삭제하고 특정 편집 페이로드로 교체하여 특정 변환 라운드에서 표적화된 유전자좌에 대한 선형 단편으로 생성되었다. 각 변환 라운드에서는 3개의 가능한 페이로드 중 1개를 별도로 도입하였다. 3개의 가능한 편집 페이로드는 (1) 5'에서 3' 방향으로 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적색 형광 단백질(RFP)(RFP_F로 지정), (2) 3'에서 5' 방향으로 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 RFP(RFP_R로 지정), 또는 (3) 5'에서 3' 방향으로 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 RFP 및 5'에서 3' 방향으로 상이한 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 녹색 형광 단백질(GFP)(RFP_GFP로 지정)이었다.
도 11b에 도시된 바와 같이, 형질전환의 각 라운드에 대해, 선형화된 Cas9 발현 플라스미드, 선형 sgRNA 발현 카세트 및 특이적 편집 페이로드는 실시예 6에서 사용된 화학적 형질전환 과정을 통해 S. 세레비지에로 형질전환되었고 형질전환체는 특이적 형질전환 라운드에 대한 관련 항생제(즉, 항생제 1, 2 또는 3)를 함유하는 배지에서 선택되었다. 제 1 형질전환은 누르세오트리신 설페이트(항생제 1) 선택을 사용하고, 제 2 형질전환은 제네티신 G418(항생제 2) 선택을 사용하고, 제 3 형질전환은 하이그로마이신(항생제 3) 선택을 사용하여 수행되었다. 제 1 항생제(항생제 1)를 사용한 형질전환 및 선택의 초기 라운드 후, 콜로니를 2시간 동안 액체에서 배양하고, 적격하게 만들고, 두 번째 세트의 sgRNA 카세트/편집 페이로드를 사용하여 두 번째 편집 라운드로 형질전환하였다. 제 2 편집 라운드의 형질전환체는 제 2 항생제(항생제 2)를 사용하여 고체 배지에서 선택한 다음 액체에서 배양하고, 적격하게 만들고 제 3 세트의 sgRNA/edit 페이로드로 3회 형질전환하고 제 3 항생제(항생제 3)를 사용하여 선택하였다. 제 3 편집 라운드 후, 콜로니를 배양하고 당업계에 공지된 PCR 및/또는 차세대 시퀀싱(NGS) 기술을 사용하여 유전자형을 결정하였다.
결과 및 결론
도 11c에 도시된 바와 같이, 전통적인 형질전환에 이어 빠르게 반복된 형질전환에 의해 도입된 2개의 게놈 편집물의 유전자형 분석은 유전자형이 지정된 28개 콜로니 중 17.8%가 두 반복된 편집물을 모두 포함한다는 것을 보여주었다. 이 과정은 반복 과정에서 도입된 페이로드가 새로운 S. 세레비시애 균주를 효율적이고 저렴하게 생성하기 위해 S. 세레비시애에서 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집에 사용될 수 있음을 입증하였다.
실시예 10 - 풀링된 플라스미드 반복적 스태킹(PPIS)의 원리 증명
목적
이 실시예는 편집 라운드당 단일 풀링된 형질전환으로부터 많은 유전자형을 생성하기 위한 풀링된 플라스미드 반복적 스태킹(PPIS)의 사용을 상세히 기술한다. 플라스미드를 개별적으로 형질전환하기 보다는, 이 실시예에서 4개의 플라스미드 풀을 숙주 세포로 형질전환시키고, 플라스미드를 제거한 다음 풀링하여 주 배양물을 접종하는 데 사용하였다. 이어서, 주 배양물은 4개의 플라스미드 풀을 사용하여 과정을 반복하였다(도 12a 참조).
재료 및 방법
전반적으로, 풀링된 플라스미드 반복적 스태킹(PPIS)의 경우, 편집 페이로드(pEDIT 플라스미드)를 함유하는 다중 플라스미드를 혼합하고 여러 라운드의 편집에서 대장균 숙주 세포를 포함하는 배양물을 형질전환하는 데 사용하였다(도 12a 참조). 대장균 숙주 세포의 형질전환 전에, pCUT2.2 플라스미드를 상기 숙주 세포에 도입하였다. pCUT2.2 플라스미드는 Cas9, 재조합 기계, 카르베니실린 내성 카세트 및 온도에 민감한 복제 기점을 포함하는 복제 플라스미드이다. pCUT 2.2 플라스미드를 대장균 숙주 세포에 도입한 후, 각각 편집 페이로드를 함유하는 4개의 플라스미드 풀을 혼합하고 4개의 개별적인 연속적인 형질전환 라운드의 각각에 pCUT2.2 플라스미드를 함유하는 대장균 숙주 세포에 도입하였다. 각각의 연속적인 형질전환 라운드에 도입된 4개의 플라스미드 풀은 상동성 암이 있는 편집 페이로드 및 대장균 숙주 세포의 특정 유전자좌를 표적으로 하는 상응하는 sgRNA를 포함하는 각 pEDIT 플라스미드를 포함하는 4개의 pEDIT 플라스미드를 함유하였다. 각 라운드의 형질전환 후, 특정 라운드의 형질전환에 도입된 pEDIT 플라스미드를 해당 라운드의 형질전환체로부터 제거하였고(즉, 능동 역선택 또는 대안적으로 수동 역선택(즉, 비선택적 배지에서의 성장), 제거된 형질전환체를 풀링 후 주 배양을 위한 접종원으로 사용하여 다음 연속 편집 라운드를 수행하였다. 마지막 편집 라운드 후, pCUT2.2는 온도에 민감한 ori를 사용하여 제거되었다.
보다 구체적으로, PPIS 과정은 다음 방법을 사용하여 수행되었다:
(1) 적격 세포 준비를 위한 배양:
종자: 5mL의 LBClin100에 염기 편집 균주를 접종하였다. 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
주: 종자 배양물의 OD600을 측정하고 ~0.04의 시작 OD600에서 100mL LBClin100을 접종하였다(염기 편집 균주 배가 시간에 따라 다름). ~16시간 동안 18℃, 160rpm에서 흔들었다. (목표는 재조합 기구를 도입하기 전에 배양물이 다음날 아침 ~0.3의 OD600이 되도록 하는 것이었다).
다음날 아침, OD600이 ~0.3일 때, 0.2% 아라비노스로 주 배양물을 유도하였다(재조합 기구의 발현은 pBAD에 의해 구동됨). OD600이 0.4-0.6(1-2시간)에 도달할 때까지 30℃, 160rpm에서 배양액을 흔든다.
(2) 적격 세포 준비:
15분 동안 얼음 위에서 배양물을 냉각시켰다. 전체 적격 세포 준비 동안 얼음(또는 4℃)에 세포를 보관하였다.
4℃, 4000xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포를 50mL 차가운 10% 글리세롤에 재현탁하고 50mL 원뿔형으로 옮기고 4℃, 3500xg에서 10분 동안 회전하였다. 따라내고 2회 더 세척하여 총 3회 세척하였다. 최종 세척 후 액체를 따라내고 50mL 원뿔형의 바닥에 남아 있는 소량의 10% 글리세롤에 세포 펠릿을 재현탁하였다.
적격 세포를 1:50으로 희석(980uL 10% 글리세롤 + 20uL 세포)하고 OD600을 측정하였다. 차가운 10% 글리세롤로 적격 세포의 OD600을 ~50-75의 최종 OD600으로 조정하였다.
(3) 형질전환
50uL의 적격 세포와 100ng 플라스미드를 혼합하고(풀링된 플라스미드의 경우 - 총 100ng, 즉 플라스미드당 100ng/플라스미드 수 = ng 추가), 1 mM 큐벳으로 옮기고 대장균 세팅을 사용하여 전기천공하였다. 이 실시예에서, 4개의 유전자 편집 중 하나가 별도의 플라스미드에 존재하도록 4개의 고유한 유전자 편집이 사용되었고, 따라서 각 편집 라운드에서 4개의 플라스미드가 혼합되고 형질전환되었다.
NEB 회수 배지(750uL)에 즉시 재현탁하였다.
30℃, 1000rpm에서 3시간 동안 진탕하여 회수하였다.
분할되지 않은 LBClin100Kan50 Qtray에 900uL(1:500 희석)를 플레이팅하였다. WhisperFlow 캐비닛에서 1시간 동안 건조하였다. Qtray를 30℃에서 1-2일 동안 배양하였다(콜로니를 선택할 수 있을 때까지).
(4) pEDIT 제거
300uL LBClin100Kan50 96MWP 또는 120uL LBClin100Kan50 384DWP로 n개의 콜로니(n = 4x 가능한 유전자형)를 선택하였다. 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
LBClin100Kan50 배양물이 포화되었을 때, (동일한 부피의 배양물 및 50% 글리세롤 혼합) 뱅크하고 3uL를 300uL LBClin100 + 10% 수크로스 96MWP에 또는 2uL을 120uL LBClin100 384DWP에 대한 투명 카운터 활성에 스탬핑하여 pEDIT를 제거하였다(sacB에 의한 능동 역선택). 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
LBClin100Suc10 배양물이 포화되었을 때, 동일한 편집으로 배양물을 풀링하고 10-5로 희석하였다.
900uL의 희석된 배양물을 분할되지 않은 LBClin100 Qtray에 플레이팅하였다. WhisperFlow 캐비닛에서 1시간 동안 건조하였다. Qtray를 30℃에서 1-2일 동안 배양하였다(콜로니를 선택할 수 있을 때까지).
Qtray 웰당 1개의 콜로니를 30uL의 멸균수에 선택하였다. 콜로니를 재현탁하고 3uL를 300uL LBClin100 및 300uL LBClin100Kan50 96MWP에 또는 21uL를 120uL LBClin100 및 120uL LBClin100Kan50 384DWP에 스탬핑하였다. 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
LBClin100 배양물이 포화되었을 때, LBClin100 및 LBClin100Kan50 플레이트 둘 다의 OD600을 측정하여 pEDIT를 제거하지 않은 배양물을 확인하였다. LBClin100Kan50에서 성장한 배양물은 pEDIT를 제거하지 않았으며 후속 편집 라운드에서 앞으로 전달 않았다.
pEDIT를 제거한, 즉 LBClin100에서는 성장했지만 LBClin100Kan50에서는 성장하지 않은 보관된 배양물(동일한 부피의 배양물 및 50% 글리세롤 혼합)을 뱅크하였다.
pEDIT(종자)를 제거한 배양물을 풀링하였다. 풀링된 종자 배양물의 OD600을 측정하고 ~0.04의 시작 OD600에서 100mL LBClin100을 접종하였다(기본 편집 균주 배가 시간에 따라 다름).
(5) 균주 QC
1-4단계를 반복하여 n회 편집을 수행하였다. 이 실시예에서, 4회의 편집이 수행되었다.
편집의 최종 라운드(즉, 라운드 4) 후, 5uL 배양물을 20uL TE에 스탬핑하고 98℃에서 10분 동안 배양함으로써 pEDIT 제거 배양물의 보일 프렙(boil preps)을 만들었다(웰을 풀링하지 않음).
7uL 멸균수를 384-웰 PCR 프레임스타 플레이트에 스탬핑하고 앰플리콘 NGS 프라이머(i5/i7 어댑터 포함)를 첨가하였다.
3uL의 보일 프렙 및 10uL의 NEB OneTaq 핫 스타트 마스터 믹스와 GC 완충액을 프라이머를 포함하는 384-웰 PCR 프레임스타 플레이트에 스탬핑하였다. 총 반응 부피는 20uL이었다.
표준 NEB OneTaq 핫 스타트 마스터 믹스와 GC 버퍼 조건으로 PCR을 실행하였다.
매핑된 앰플리콘 플레이트를 앰플리콘 NGS에 대한 게놈 및 시퀀싱 코어로 전달하였다.
편집이 발생했는지 여부를 평가하기 위해 샘플에 대해 kmer 검색을 수행하였다.
(6) pCUT2.2 제거
3uL의 LBClin 배양물(pEDIT 제거 후)을 1mL LB 96DWP에 스탬핑하였다. 42℃, 1000rpm에서 17-20시간 동안 흔든다.
OD600을 측정하고, LB에서 10-4 내지 10-7 희석을 만들고, LB 및 LBClin 분할 Qtray에 150uL를 플레이팅하였다.
20-22시간 동안 30℃에서 LB 및 LBClin Qtray를 배양하였다.
pCUT2.2 제거에 대해 스크리닝하였다(고체 배지): LB 상에서 성장하지만 LBClin이 아닌 Qtray 웰은 pCUT2.2 제거를 나타내었다.
300uL 물 속 LB에서는 성장하지만 LBClin이 아닌 Qtray 웰에서 n개의 콜로니를 선택하였다. 콜로니를 재현탁하고 5uL을 300uL LB 및 LBClin 96MWP에 스탬핑하였다.
pCUT2.2 제거를 확인하였다(액체 배지): LB에서 성장하지만 LBClin이 아닌 웰은 pCUT2.2의 성공적인 제거를 나타내었다.
pCUT2.2를 제거한 보관된 배양물(75uL의 배양물을 75uL의 50% 글리세롤에 혼합)을 뱅크하였다.
결과 및 결론
이론상, CRISPR를 사용한 4회의 PPIS에 대한 4회의 고유 편집/라운드는 대장균에서 625개의 가능한 유전자형을 생성할 수 있다. 도 12b-12c에 도시된 바와 같이, 대장균에서 125개 중 11개 또는 가능한 유전자형의 ~9%가 캡처되었으며(4개 라운드 중 1개에서 편집이 발생하지 않았으며 가능한 유전자형의 수에서 제외됨), CRISPR을 사용하는 PPIS가 여러 게놈 유전자좌에 걸쳐 여러 유전자 편집을 도입하기 위한 효과적인 방법일 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 11 - 풀링된 모 반복적 스태킹(PPAIS)의 원리 증명
목적
이 실시예는 많은 유전자형을 생성하고 플라스미드를 개별적으로 분리된 대장균 숙주 세포 배양물로 형질전환함으로써 형질전환/편집 편향을 최소화하기 위한 풀링된 모 반복적 스태킹(PPAIS)의 사용을 상세히 기술한다.
재료 및 방법
전반적으로, 풀링된 모 반복 스태킹(PPAIS)의 경우, 풀링된 플라스미드 반복 스태킹(PPIS)과 같은 플라스미드 풀을 숙주 세포의 배양물로 형질전환시키는 것보다, pEDIT 플라스미드의 4개 풀을 개별 배양물로 개별적으로 형질전환시켰다. 숙주 세포의 pEDIT 플라스미드를 각각의 개별 배양물에서 제거하고, 제거된 모든 균주를 풀링(종자)하고 주 배양물을 접종하는 데 사용하여 별도의 배양으로 나누었다. 다음 편집 라운드에서, 플라스미드의 4개 풀을 이전 편집 라운드의 주 배양물을 분할하여 생성된 별도의 배양물로 개별적으로 형질전환함으로써 과정을 반복하였다(도 13a 참조). 실시예 8에서 사용된 대장균 숙주 세포와 유사하게, 대장균 숙주 세포는 편집 라운드를 시작하기 전에 상기 숙주 세포에 도입된 pCUT2.2 플라스미드를 포함하였다. 실시예 8의 pEDIT 플라스미드와 같이, 각각의 pEDIT 플라스미드는 상동성 암 및 대장균 숙주 세포의 특정 유전자좌를 표적으로 하는 상응하는 sgRNA를 갖는 편집 페이로드를 포함하였다. 또한 실시예 8과 유시하게, 각 라운드의 형질전환 후, 특정 라운드의 형질전환에 도입된 pEDIT 플라스미드를 해당 라운드의 형질전환체로부터 제거하였고(즉, 능동 역선택 또는 대안적으로 수동 역선택(즉, 비선택적 배지에서의 성장) 마지막 편집 라운드 후, pCUT2.2는 온도에 민감한 ori를 사용하여 제거되었다.
보다 구체적으로, PPAIS 과정은 다음 방법을 사용하여 수행되었다:
(1) 적격 세포 준비를 위한 배양:
종자: 5mL의 LBClin100에 염기 편집 균주를 접종하였다. 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
주: 종자 배양물의 OD600을 측정하고 ~0.04의 시작 OD600에서 100mL LBClin100을 접종하였다(염기 편집 균주 배가 시간에 따라 다름). ~16시간 동안 18℃, 160rpm에서 흔들었다. (목표는 재조합 기구를 도입하기 전에 배양물이 다음날 아침 ~0.3의 OD600이 되도록 하는 것이었다).
다음날 아침, OD600이 ~0.3일 때, 0.2% 아라비노스로 주 배양물을 유도하였다(재조합 기구의 발현은 pBAD에 의해 구동됨). OD600이 0.4-0.6(1-2시간)에 도달할 때까지 30℃, 160rpm에서 배양액을 흔든다.
(2) 적격 세포 준비:
15분 동안 얼음 위에서 배양물을 냉각시켰다. 전체 적격 세포 준비 동안 얼음(또는 4℃)에 세포를 보관하였다.
4℃, 4000xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포를 50mL 차가운 10% 글리세롤에 재현탁하고 50mL 원뿔형으로 옮기고 4℃, 3500xg에서 10분 동안 회전하였다. 따라내고 2회 더 세척하여 총 3회 세척하였다. 최종 세척 후 액체를 따라내고 50mL 원뿔형의 바닥에 남아 있는 소량의 10% 글리세롤에 세포 펠릿을 재현탁하였다.
적격 세포를 1:50으로 희석(980uL 10% 글리세롤 + 20uL 세포)하고 OD600을 측정하였다. 차가운 10% 글리세롤로 적격 세포의 OD600을 ~50-75의 최종 OD600으로 조정하였다.
(3) 형질전환
50uL의 적격 세포와 100ng 플라스미드를 혼합하고, 1 mM 큐벳으로 옮기고 대장균 세팅을 사용하여 전기천공하였다. 이 실시예에서, 4개의 유전자 편집 중 하나가 별도의 플라스미드에 존재하도록 4개의 고유한 유전자 편집이 사용되었고, 따라서 각 편집 라운드에서 4개의 플라스미드가 혼합되고 형질전환되었다.
NEB 회수 배지(750uL)에 즉시 재현탁하였다.
30℃, 1000rpm에서 3시간 동안 진탕하여 회수하였다.
분할되지 않은 LBClin100Kan50 Qtray에 900uL(1:500 희석)를 플레이팅하였다. WhisperFlow 캐비닛에서 1시간 동안 건조하였다. Qtray를 30℃에서 1-2일 동안 배양하였다(콜로니를 선택할 수 있을 때까지).
(4) pEDIT 제거
300uL LBClin100Kan50 96MWP 또는 120uL LBClin100Kan50 384DWP로 n개의 콜로니(n = 4x 가능한 유전자형)를 선택하였다. 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
LBClin100Kan50 배양물이 포화되었을 때, (동일한 부피의 배양물 및 50% 글리세롤 혼합) 뱅크하고 3uL를 300uL LBClin100 + 10% 수크로스 96MWP에 또는 2uL을 120uL LBClin100 384DWP에 대한 투명 카운터 활성에 스탬핑하여 pEDIT를 제거하였다(sacB에 의한 능동 역선택). 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
LBClin100Suc10 배양물이 포화되었을 때, 동일한 편집으로 배양물을 풀링하고 10-5로 희석하였다.
900uL의 희석된 배양물을 분할되지 않은 LBClin100 Qtray에 플레이팅하였다. WhisperFlow 캐비닛에서 1시간 동안 건조하였다. Qtray를 30℃에서 1-2일 동안 배양하였다(콜로니를 선택할 수 있을 때까지).
Qtray 웰당 1개의 콜로니를 30uL의 멸균수에 선택하였다. 콜로니를 재현탁하고 3uL를 300uL LBClin100 및 300uL LBClin100Kan50 96MWP에 또는 21uL를 120uL LBClin100 및 120uL LBClin100Kan50 384DWP에 스탬핑하였다. 30℃, 160rpm에서 밤새 흔든다.
LBClin100 배양물이 포화되었을 때, LBClin100 및 LBClin100Kan50 플레이트 둘 다의 OD600을 측정하여 pEDIT를 제거하지 않은 배양물을 확인하였다. LBClin100Kan50에서 성장한 배양물은 pEDIT를 제거하지 않았으며 후속 편집 라운드에서 앞으로 전달 않았다.
pEDIT를 제거한, 즉 LBClin100에서는 성장했지만 LBClin100Kan50에서는 성장하지 않은 보관된 배양물(동일한 부피의 배양물 및 50% 글리세롤 혼합)을 뱅크하였다.
pEDIT(종자)를 제거한 배양물을 풀링하였다. 풀링된 종자 배양물의 OD600을 측정하고 ~0.04의 시작 OD600에서 100mL LBClin100을 접종하였다(기본 편집 균주 배가 시간에 따라 다름).
(5) 균주 QC
1-4단계를 반복하여 n회 편집을 수행하였다. 이 실시예에서, 4회의 편집이 수행되었다.
편집의 최종 라운드(즉, 라운드 4) 후, 5uL 배양물을 20uL TE에 스탬핑하고 98℃에서 10분 동안 배양함으로써 pEDIT 제거 배양물의 보일 프렙(boil preps)을 만들었다(웰을 풀링하지 않음).
7uL 멸균수를 384-웰 PCR 프레임스타 플레이트에 스탬핑하고 앰플리콘 NGS 프라이머(i5/i7 어댑터 포함)를 첨가하였다.
3uL의 보일 프렙 및 10uL의 NEB OneTaq 핫 스타트 마스터 믹스와 GC 완충액을 프라이머를 포함하는 384-웰 PCR 프레임스타 플레이트에 스탬핑하였다. 총 반응 부피는 20uL이었다.
표준 NEB OneTaq 핫 스타트 마스터 믹스와 GC 버퍼 조건으로 PCR을 실행하였다.
매핑된 앰플리콘 플레이트를 앰플리콘 NGS에 대한 게놈 및 시퀀싱 코어로 전달하였다.
편집이 발생했는지 여부를 평가하기 위해 샘플에 대해 kmer 검색을 수행하였다.
(6) pCUT2.2 제거
3uL의 LBClin 배양물(pEDIT 제거 후)을 1mL LB 96DWP에 스탬핑하였다. 42℃, 1000rpm에서 17-20시간 동안 흔든다.
OD600을 측정하고, LB에서 10-4 내지 10-7 희석을 만들고, LB 및 LBClin 분할 Qtray에 150uL를 플레이팅하였다.
20-22시간 동안 30℃에서 LB 및 LBClin Qtray를 배양하였다.
pCUT2.2 제거에 대해 스크리닝하였다(고체 배지): LB 상에서 성장하지만 LBClin이 아닌 Qtray 웰은 pCUT2.2 제거를 나타내었다.
300uL 물 속 LB에서는 성장하지만 LBClin이 아닌 Qtray 웰에서 n개의 콜로니를 선택하였다. 콜로니를 재현탁하고 5uL을 300uL LB 및 LBClin 96MWP에 스탬핑하였다.
pCUT2.2 제거를 확인하였다(액체 배지): LB에서 성장하지만 LBClin이 아닌 웰은 pCUT2.2의 성공적인 제거를 나타내었다.
pCUT2.2를 제거한 보관된 배양물(75uL의 배양물을 75uL의 50% 글리세롤에 혼합)을 뱅크하였다.
결과 및 결론
이론상, CRISPR를 사용한 4회의 PPAIS에 대한 4회의 고유 편집/라운드는 대장균에서 625개의 가능한 유전자형을 생성할 수 있다. 도 13b-13c에 도시된 바와 같이, 대장균에서 125개 중 26개 또는 가능한 유전자형의 ~21%가 캡처되었으며(4개 라운드 중 1개에서 편집이 발생하지 않았으며 가능한 유전자형의 수에서 제외됨), CRISPR을 사용하는 PPAIS가 여러 게놈 유전자좌에 걸쳐 여러 유전자 편집을 도입하기 위한 효과적인 방법일 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 12 - 수동 역선택을 사용한 단일 반복적 편집 방법의 원리 증명
목적
이 실시예는 실시예 1에 기재된 반복적 편집 방법을 사용하기 위한 CRISPR 매개 방법의 사용을 설명하지만, 4차 형질전환이 제 1 형질전환의 라운드에서 사용된 것과 동일한 선택가능 마커를 갖는 편집 플라스미드를 사용하는 4회 형질전환을 포함한다. 목적은 동일한 선택 가능한 마커가 이후의 게놈 편집 라운드에서 재활용될 수 있도록 이전에 도입된 편집 플라스미드를 제거하는 데 수동 역선택이 효과적임을 확인하는 것이었다. 전반적으로, 능동 역선택과 비교하여 수동 역선택을 사용하여 편집 주기 시간을 줄일 수 있다.
재료 및 방법
이 실시예에 기술된 반복적인 편집 방법은 본질적으로 도 2 및 14a에 도시된 바와 같이 대장균 숙주 세포에서 수행되었다. 동일한 유전자좌를 표적으로 하는 하나의 sgRNA/복구 단편 쌍 및 카나마이신(kan) 선택성 마커 유전자를 포함하는 4개의 편집 플라스미드 세트가 제 1 라운드의 형질전환에서 대장균 숙주 세포 내로 개별적으로 형질전환되었다. 형질전환체를 카나마이신 함유 배지에서 성장시켰다; 개별 콜로니를 선택하고 밤새 비선택적 배지에서 성장시키고, 풀링(종자)하고, 본질적으로 실시예 9에 기재된 바와 같이 주요 배양물을 접종하는 데 사용하였다(각 배양물의 풀은 단일 pEDIT 플라스미드로부터 유래되었다). 라운드 2에서, 주 배양물은 동일한 유전자좌(제 1 형질전환 라운드의 편집 플라스미드와 상이한 유전자좌임) 및 클로람페니콜(chlor) 선택 가능한 마커 유전자를 표적으로 하는 하나의 sgRNA/복구 단편 쌍을 포함하는 4개의 편집 플라스미드 세트로 형질전환되었다. 형질전환체는 클로르 함유 배지에서 성장시켰다; 개별 콜로니를 선택하고 밤새 비선택적 배지에서 성장시키고 풀링(종자)시키고 제 3 형질전환 라운드에 적용할 새로운 주 배양물을 접종하는 데 사용하였다. 라운드 3에서, 라운드 2의 주 배양물은 동일한 유전자좌(제 1 및 제 2 형질전환 라운드의 편집 플라스미드와 상이한 유전자좌임) 및 테트라사이클린(tet) 선택 가능한 마커 유전자를 표적으로 하는 하나의 sgRNA/복구 단편 쌍을 포함하는 4개의 편집 플라스미드 세트로 형질전환되었다. 형질전환체는 Tet 함유 배지에서 성장시켰다; 개별 콜로니를 선택하여 밤새 비선택적 배지에서 성장시키고 풀링(종자)시키고 4차 형질전환에 적용할 새로운 주 배양물을 접종하는 데 사용하였다. 라운드 4에서, 라운드 3의 주 배양물은 동일한 유전자좌(제 1 , 제 2 및 제 3 형질전환 라운드의 편집 플라스미드와 상이한 유전자좌임)및 Kan 선택성 마커 유전자를 표적으로 하는 하나의 sgRNA/복구 단편 쌍을 포함하는 4개의 편집 플라스미드 세트로 형질전환되었다. 형질전환체는 Kan 함유 배지에서 성장시켰다; 개별 콜로니를 비선택적 배지에서 밤새 성장시키고, pEDIT를 제거하기 위해 수크로스-함유 배지로 옮기고, pEDIT를 제거한 균주를 당업계에 공지된 차세대 시퀀싱(NGS) 기술을 사용하여 유전자형을 결정하였다.
결과 및 결론
도 14b에 도시된 바와 같이, 라운드 3 형질전환 이후에 생산된 균주는 카나마이신에 민감하였고, 이는 1차로부터의 플라스미드를 함유하는 카나마이신 내성 유전자가 제거되었음을 나타낸다. 더욱이, 도 14c-14d는 이 실시예의 반복적 편집 방법에 의해 생산된 균주가 실제로 원하는 유전자 편집의 일부 또는 전부를 보유한다는 것을 보여주었다. 도 14c-14d는 이 실시예에 기술된 4회의 형질전환 라운드에 대한 4회의 고유한 편집/라운드가 캡처되었다. 따라서, 적어도 2회 이전에 사용된 선별 마커 유전자의 사용을 적용하기 위해 2회의 수동 역선택으로 충분하였다. 이 과정은 반복적 과정에서 도입된 페이로드가 새로운 대장균 균주를 효율적이고 저렴하게 생성하기 위해 대장균에서 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집에 사용될 수 있음을 입증하였다.
본 발명의 번호가 매겨진 실시태양
본 발명에 의해 고려되는 다른 주제는 다음의 번호가 매겨진 실시태양에서 설명된다:
1) 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
2) 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 추가로 포함하거나 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 편집 플라스미드의 제 1 풀과 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
3) 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하거나 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 편집 구조체의 제 1 풀과 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 다음을 포함한다:
i. 동일한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적으로 하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
ii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 동일한 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; 또는
iii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
4) 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 다음을 포함한다:
i. 동일한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적으로 하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
ii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 동일한 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; 또는
iii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 및 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
5) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함하는 것인 방법.
6) 제 1(b) 실시태양 또는 제 2(b) 실시태양에 있어서,
상이한 편집 플라스미드는 개별 미생물 숙주 세포에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
7) 제 3(b) 실시태양 또는 제 4(b) 실시태양에 있어서,
상이한 편집 구조체는 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
8) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
9) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
적어도 2개의 상이한 복구 단편은 상이한 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
10) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
편집 구조체의 제 1 풀은 1개 이상의 선형 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
11) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 선형 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
12) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드를 추가로 포함하는 것인 방법.
13) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
gRNA는 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
14) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
15) 제 4 실시태양에 있어서,
RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 편집 플라스미드에 암호화되는 것인 방법.
16) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
gRNA와 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
17) 제 4 실시태양에 있어서,
각각의 편집을 생성하는 데 필요한 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, gRNA 및 복구 단편에 대한 서열은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
18) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA는 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
19) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
20) 제 12 실시태양에 있어서,
상이한 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA는 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
21) 제 12 실시태양에 있어서,
상이한 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 복구 단편은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
22) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
23) 제 3 실시태양 또는 제 4 실시태양에 있어서,
모든 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
24) 제 10 실시태양에 있어서,
gRNA는 1개 이상의 선형 단편에 존재하는 것인 방법.
25) 제 10 실시태양에 있어서,
복구 단편은 1개 이상의 선형 단편에 존재하는 것인 방법.
26) 제 10 실시태양에 있어서,
RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 선형 단편에 암호화되는 것인 방법.
27) 제 11 실시태양에 있어서,
2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 복구 단편을 포함하는 것인 방법.
28) 제 11 실시태양에 있어서,
2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 gRNA를 포함하는 것인 방법.
29) 제 10 실시태양, 제 11 실시태양 및 제 24 실시태양 내지 제 28 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
선형 단편은 ssDNA 또는 dsDNA로 제공되는 것인 방법.
30) 제 29 실시태양에 있어서,
선형 단편은 말단 변형을 포함하는 것인 방법.
31) 제 30 실시태양에 있어서,
말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용되는 것인 방법.
32) 제 31 실시태양에 있어서,
말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택되나 이에 제한되지 않는 것인 방법.
33) 제 12 실시태양에 있어서,
2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 또는 여러 상이한 복구 단편을 포함하는 것인 방법.
34) 제 12 실시태양에 있어서,
2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 gRNA 또는 여러 상이한 gRNA를 포함하는 것인 방법.
35) 제 12 실시태양에 있어서,
2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 및 상이한 gRNA, 또는 여러 상이한 복구 단편 및 여러 상이한 gRNA를 포함하는 것인 방법.
36) 제 6 실시태양에 있어서,
상이한 편집 플라스미드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 복구 단편을 포함하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
37) 제 7 실시태양에 있어서,
상이한 편집 구조체는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
38) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양, 제 6 실시태양, 제 7 실시태양, 제 36 실시태양 및 제 37 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
39) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양, 제 6 실시태양, 제 7 실시태양, 제 36 실시태양 및 제 37 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
40) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양, 제 6 실시태양, 제 7 실시태양, 제 36 실시태양 및 제 37 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
41) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양, 제 6 실시태양, 제 7 실시태양, 제 36 실시태양 및 제 37 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포, 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포, 및 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
42) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양, 제 6 실시태양, 제 7 실시태양, 제 36 실시태양 및 제 37 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
43) 제 1 실시태양에 있어서,
하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
e. 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함한다;
f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
44) 제 2 실시태양에 있어서,
하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
e. 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의-부위 특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하는 편집 플라스미드의 추가 풀과 함께 도입되고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
45) 제 3 실시태양에 있어서,
하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
e. 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다;
f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
46) 제 4 실시태양에 있어서,
하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
e. 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다;
f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 및 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계; 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
47) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는 것인 방법.
48) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
항생제, 화학물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는 것인 방법.
49) 제 1 실시태양 내지 제 48 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 다중 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
50) 제 1 실시태양 내지 제 49 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
51) 제 3 실시태양, 제 4 실시태양, 제 45 실시태양 및 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
단계(b) 또는 (f)에서 도입된 gRNA는 표적 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
52) 제 45 실시태양 또는 제 46 실시태양에 있어서,
단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
53) 제 45 실시태양 또는 제 46 실시태양에 있어서,
단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 상이한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
54) 제 45 실시태양 또는 제 46 실시태양에 있어서,
단계(f)는 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 하나 이상의 상이한 편집 구조체를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에 도입된 gRNA 및/또는 복구 단편과 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단에서 하나 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
55) 제 54 실시태양에 있어서,
하나 이상의 상이한 편집 구조체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하는 상이한 gRNA를 포함하며, 여기서 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들은 임의의 사전에 표적화된 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 것인 방법.
56) 제 54 실시태양에 있어서,
하나 이상의 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 상이한 복구 단편을 포함하는 것인 방법.
57) 제 1 실시태양 내지 제 56 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
단계(c)에서 선택된 콜로니의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
58) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장한 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
59) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
1) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않으며; 또는 2) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는 것인 방법.
60) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
편집 플라스미드의 제 1 및 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 미생물 숙주 세포와 사전에 조합된 편집 플라스미드의 서로의 또는 추가의 풀에서 각각의 편집 플라스미드와 비교하여 동일한 복제 기점 또는 동일한 부류의 복제 기점을 포함하는 것인 방법.
61) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
62) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
63) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양 및 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 편집 플라스미드를 포함하는 것인 방법.
64) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양 및 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀에서 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함하는 것인 방법.
65) 제 1 실시태양 내지 제 4 실시태양 및 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자를 포함하는 것인 방법.
66) 제 2 실시태양 또는 제 44 실시태양에 있어서,
하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단하는 것인 방법.
67) 제 2 실시태양 또는 제 44 실시태양에 있어서,
하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
68) 제 2 실시태양 또는 제 44 실시태양에 있어서,
부위-특이적 제한 효소의 각각은 플라스미드 상에 암호화되거나, 게놈에 암호화되거나, RNA로부터 번역되거나, 단백질로서 세포 내로 도입되는 것인 방법.
69) 제 3 실시태양, 제 4 실시태양, 제 45 실시태양 및 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단하는 것인 방법.
70) 제 3 실시태양, 제 4 실시태양, 제 45 실시태양 및 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택되는 것인 방법.
71) 제 3 실시태양, 제 4 실시태양, 제 45 실시태양 및 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 플라스미드에 암호화되거나, 게놈에 암호화되거나, RNA에서 번역되거나, 단백질로서 세포에 도입되는 것인 방법.
72) 제 3 실시태양 내지 제 5 실시태양, 제 7 실시태양 내지 제 42 실시태양, 제 45 실시태양 및 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함하는 것인 방법.
73) 제 3 실시태양 내지 제 5 실시태양, 제 7 실시태양 내지 제 42 실시태양, 제 45 실시태양 및 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성되는 것인 방법.
74) 제 1 실시태양 내지 제 73 실시태양 항 중 어느 하나에 있어서,
유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
75) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대한 상이한 서열을 포함하고 사전 편집 라운드의 상이한 선택 마커 유전자와 연관되는 것인 방법.
76) 제 43 실시태양 내지 제 46 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌를 표적으로 하고 사전 편집 라운드의 상이한 항생제 선택 마커 유전자와 연관되는 것인 방법.
77) 제 43 실시태양에 있어서,
단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 최종 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일한 또는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하며, 여기서 최종 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
78) 제 44 실시태양에 있어서,
단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 최종 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일한 또는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하며, 여기서 최종 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함하며, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하는 최종 플라스미드와 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되는 것인 방법.
79) 제 45 실시태양 또는 제 46 실시태양에 있어서,
단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 gRNA 및 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 미생물 숙주 세포 내로 사전에 도입된 gRNA에 의해 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일하거나 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에서 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 플라스미드, 최종 gRNA 및/또는 최종 복구 단편은 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열과 연관되는 것인 방법.
80) 제 77 실시태양 내지 제 79 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 것을 포함하는 것인 방법.
81) 제 1 실시태양 내지 제 80 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포는 하나 이상의 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 포함하는 것인 방법.
82) 제 1 실시태양 내지 제 81 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포는 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터의 단백질 세트를 포함하는 것인 방법.
83) 제 82 실시태양에 있어서,
람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함하는 것인 방법.
84) 제 81 실시태양 내지 제 83 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 단계(a) 전에 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 상에서 미생물 숙주 세포 내로 도입되는 것인 방법.
85) 제 81 실시태양 내지 제 84 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
이종 재조합 시스템의 단백질의 세트는 미생물 숙주 세포의 게놈에 이종 재조합 시스템의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되는 것인 방법.
86) 제 81 실시태양 내지 제 85 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 구조성으로 발현되는 것인 방법.
87) 제 81 실시태양 내지 제 86 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 선택적으로, 여기서 이종 재조합 시스템 유전자는 오페론에 내에 있는 것인 방법.
88) 제 87 실시태양에 있어서,
유도성 프로모터는 시약의 추가, 대사 산물 또는 시약의 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있는 것인 방법.
89) 제 88 실시태양에 있어서,
시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인 방법.
90) 제 1 실시태양 내지 제 89 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
도입하는 단계는 미생물 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
91) 제 1 실시태양 내지 제 90 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포는 진핵 세포인 방법.
92) 제 91 실시태양에 있어서,
미생물 숙주 세포는 효모 세포인 방법.
93) 제 92 실시태양에 있어서,
효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
94) 제 91 실시태양에 있어서,
미생물 숙주 세포는 사상균류인 방법.
95) 제 94 실시태양에 있어서,
사상균류는 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger)인 방법.
96) 제 1 실시태양 내지 제 90 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
미생물 숙주 세포는 원핵 세포인 방법.
97) 제 96 실시태양에 있어서,
원핵 숙주 세포는 대장균(E. coli)인 방법.
98) 제 96 실시태양에 있어서,
원핵 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)인 방법.
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위에서 기술한 다양한 실시태양은 결합되어여 추가 실시예를 제공할 수 있다. 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 간행물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물이 본 발명에서 언급되고/되거나 응용 데이터 시트에 나열되어 있으며 그 전체가 참고로 본 발명에 포함된다. 실시태양의 양태는 추가 실시태양을 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용하기 위해 필요한 경우 변형될 수 있다.
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Claims (98)

  1. 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
    a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 각각의 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
    b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
    c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
  2. 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
    a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 편집 플라스미드의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 적어도 하나의 복구 단편을 포함하고, 여기서 편집 플라스미드의 제 1 풀은 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 추가로 포함하거나 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 편집 플라스미드의 제 1 풀과 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
    b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 제 1 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
    c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
  3. 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
    a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하거나 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 편집 구조체의 제 1 풀과 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 다음을 포함한다:
    i. 동일한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적으로 하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
    ii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 동일한 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; 또는
    iii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
    b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
    c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
  4. 다음 단계를 포함하여 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 방법:
    a. 미생물 숙주 세포의 기본 집단을 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀과 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 다음을 포함한다:
    i. 동일한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적으로 하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
    ii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 동일한 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다; 또는
    iii. 적어도 2개의 상이한 표적 유전자좌, 및 적어도 2개의 상이한 복구 단편을 표적화하는 gRNA, 여기서 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하고, 여기서 각각의 유전자 편집에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈에서 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
    b. 단계(a)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 및 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 제 1 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 제 1 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
    c. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(b)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단계(d)를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상이한 편집 플라스미드는 개별 미생물 숙주 세포에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
  7. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상이한 편집 구조체는 개별 미생물 숙주 세포의 하위 집단에 도입되어, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집 집단에서 2개 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2개의 상이한 복구 단편은 동일한 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2개의 상이한 복구 단편은 상이한 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  10. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    편집 구조체의 제 1 풀은 1개 이상의 선형 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 선형 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    편집 구조체의 제 1 풀은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    gRNA는 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  14. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  15. 제 4 항에 있어서,
    RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 편집 플라스미드에 암호화되는 것인 방법.
  16. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    gRNA와 복구 단편은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  17. 제 4 항에 있어서,
    각각의 편집을 생성하는 데 필요한 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, gRNA 및 복구 단편에 대한 서열은 1개 이상의 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  18. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA는 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  19. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  20. 제 12 항에 있어서,
    상이한 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA는 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  21. 제 12 항에 있어서,
    상이한 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 복구 단편은 2개 이상의 상이한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  22. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    동일한 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  23. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    모든 유전자좌를 표적으로 하고 편집하기 위한 gRNA 및 복구 단편은 동일한 편집 플라스미드에 존재하는 것인 방법.
  24. 제 10 항에 있어서,
    gRNA는 1개 이상의 선형 단편에 존재하는 것인 방법.
  25. 제 10 항에 있어서,
    복구 단편은 1개 이상의 선형 단편에 존재하는 것인 방법.
  26. 제 10 항에 있어서,
    RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 선형 단편에 암호화되는 것인 방법.
  27. 제 11 항에 있어서,
    2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 복구 단편을 포함하는 것인 방법.
  28. 제 11 항에 있어서,
    2개 이상의 상이한 선형 단편은 상이한 gRNA를 포함하는 것인 방법.
  29. 제 10 항, 제 11 항 및 제 24 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선형 단편은 ssDNA 또는 dsDNA로 제공되는 것인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    선형 단편은 말단 변형을 포함하는 것인 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    말단 변형은 선형 단편의 5' 및/또는 3' 말단에 적용되는 것인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    말단 변형은 인산화 말단, 포스포로티오에이트 연결 염기, 헤어핀, 역염기, 염기 변형, 2' O-메틸 염기, 잠금 핵산 염기, 포스포로티오레이트 2' O-메틸 염기 및 포스포로티오레이트 잠금 핵산 염기로 이루어진 그룹에서 선택되나 이에 제한되지 않는 것인 방법.
  33. 제 12 항에 있어서,
    2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 또는 여러 상이한 복구 단편을 포함하는 것인 방법.
  34. 제 12 항에 있어서,
    2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 gRNA 또는 여러 상이한 gRNA를 포함하는 것인 방법.
  35. 제 12 항에 있어서,
    2개 이상의 상이한 편집 플라스미드는 상이한 복구 단편 및 상이한 gRNA, 또는 여러 상이한 복구 단편 및 여러 상이한 gRNA를 포함하는 것인 방법.
  36. 제 6 항에 있어서,
    상이한 편집 플라스미드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 복구 단편을 포함하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
  37. 제 7 항에 있어서,
    상이한 편집 구조체는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 게놈 편집이 없는 개별 세포, 하나의 게놈 편집을 갖는 개별 세포, 및 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포의 제 1 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
  43. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
    d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
    e. 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함한다;
    f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
    g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계;
    여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
  44. 제 2 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
    d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
    e. 편집 플라스미드의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 플라스미드의 추가 풀은 적어도 하나 또는 2개의 상이한 복구 단편을 포함하고, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의-부위 특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌를 표적으로 하는 편집 플라스미드의 추가 풀과 함께 도입되고, 여기서 각각의 복구 단편은 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소에 의해 표적화된 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 하나 이상의 표적 유전자좌로부터의 표적 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함한다;
    f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 편집 플라스미드의 추가 풀로부터의 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 단계; 및
    g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계;
    여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
  45. 제 3 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
    d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
    e. 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다;
    f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
    g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계;
    여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
  46. 제 4 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 라운드의 편집을 추가로 포함하고, 각각의 추가 라운드는 다음을 단계를 포함하는 것인 방법:
    d. 단계(c)에서 분리된 미생물 숙주 세포를 항생제 선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리하는 단계;
    e. 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 단계(d)에서 분리된 미생물 숙주 세포와 조합하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 선택 마커 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 및 복구 단편 중 하나 또는 둘다를 포함하고, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다;
    f. 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 및 1개 이상의 편집 플라스미드를 포함하는 편집 구조체의 추가 풀을 도입하는 단계, 여기서 편집 구조체의 추가 풀은 단계(a)(i)-(iii) 중 어느 하나에 따른 gRNA 및 복구 단편을 포함한다; 및
    g. 선택 마커 유전자를 발현하는 미생물 숙주 세포에 대해 선택적인 배지에서 단계(f)로부터의 미생물 숙주 세포를 성장시키고 이로부터 유래된 배양물로부터 미생물 숙주 세포를 분리함으로써, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가 편집된 집단에서 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 단계;
    여기서 편집 플라스미드의 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 편집 플라스미드의 제 1 또는 사전에 조합된 풀로부터의 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자를 포함한다.
  47. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는 것인 방법.
  48. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항생제, 화학물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에, 매 라운드의 편집 후에 또는 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는 것인 방법.
  49. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 복구 단편은 하나 이상의 표적 유전자좌 내 또는 이에 인접하는 다중 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
  51. 제 3 항, 제 4 항, 제 45 항 및 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(b) 또는 (f)에서 도입된 gRNA는 표적 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며 각각의 복구 단편은 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
  52. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서,
    단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
  53. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서,
    단계(f)에서 도입된 gRNA는 사전 편집 라운드에서 표적화된 동일한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하며, 각각의 복구 단편은 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 상이한 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
  54. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서,
    단계(f)는 단계(e)로부터의 개별 미생물 숙주 세포 내로 하나 이상의 상이한 편집 구조체를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에 도입된 gRNA 및/또는 복구 단편과 상이한 gRNA 및/또는 복구 단편을 포함하여, 미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단에서 하나 이상의 상이한 유전자 변형 미생물 균주를 생성하는 것인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    하나 이상의 상이한 편집 구조체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하는 상이한 gRNA를 포함하며, 여기서 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들은 임의의 사전에 표적화된 유전자좌 또는 유전자좌들과 상이한 것인 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    하나 이상의 상이한 편집 구조체는 사전 편집 라운드에서 도입된 유전자 편집과 표적 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 상이한 유전자 편집에 대한 서열을 포함하는 상이한 복구 단편을 포함하는 것인 방법.
  57. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(c)에서 선택된 콜로니의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  58. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택 마커 유전자에 대해 선택적이지 않은 배지에서 성장한 미생물 숙주 세포의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  59. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 적어도 한 라운드의 편집 후에 수행되지 않으며; 또는 2) 항생제, 화학 물질 또는 온도 기반 역선택은 임의의 라운드의 편집 후에 수행되지 않는 것인 방법.
  60. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    편집 플라스미드의 제 1 및 추가 풀에서 각각의 편집 플라스미드는 미생물 숙주 세포와 사전에 조합된 편집 플라스미드의 서로의 또는 추가의 풀에서 각각의 편집 플라스미드와 비교하여 동일한 복제 기점 또는 동일한 부류의 복제 기점을 포함하는 것인 방법.
  61. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 여러 게놈 편집을 갖는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
  62. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포의 제 2 또는 추가의 편집된 집단은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 게놈 편집을 포함하는 개별 세포를 포함하는 것인 방법.
  63. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 상이한 편집 플라스미드를 포함하는 것인 방법.
  64. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    편집 플라스미드의 제 1 또는 추가의 풀에서 각 편집 플라스미드는 동일한 선택 마커 유전자를 포함하는 것인 방법.
  65. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택 마커 유전자는 항생제 또는 영양요구성 선택 마커 유전자를 포함하는 것인 방법.
  66. 제 2 항 또는 제 44 항에 있어서,
    하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단하는 것인 방법.
  67. 제 2 항 또는 제 44 항에 있어서,
    하나 이상의 부위-특이적 제한 효소의 각각은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  68. 제 2 항 또는 제 44 항에 있어서,
    부위-특이적 제한 효소의 각각은 플라스미드 상에 암호화되거나, 게놈에 암호화되거나, RNA로부터 번역되거나, 단백질로서 세포 내로 도입되는 것인 방법.
  69. 제 3 항, 제 4 항, 제 45 항 및 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 미생물 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 표적 유전자좌에서 서열을 절단하는 것인 방법.
  70. 제 3 항, 제 4 항, 제 45 항 및 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cpf1, 또는 이의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터 선택되는 것인 방법.
  71. 제 3 항, 제 4 항, 제 45 항 및 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제는 플라스미드에 암호화되거나, 게놈에 암호화되거나, RNA에서 번역되거나, 단백질로서 세포에 도입되는 것인 방법.
  72. 제 3 항, 제 4 항, 제 45 항 및 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함하는 것인 방법.
  73. 제 3 항, 제 4 항, 제 45 항 및 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 구성되는 것인 방법.
  74. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 편집은 삽입, 결실, 단일 뉴클레오티드 다형성, 게놈 셔플링, 대규모 결실, 게놈 편집, 플라스미드 편집, 및 다중 편집, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 복구 단편은 하나 이상의 유전자 편집에 대한 상이한 서열을 포함하고 사전 편집 라운드의 상이한 선택 마커 유전자와 연관되는 것인 방법.
  76. 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 편집 라운드에서 도입된 gRNA는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌를 표적으로 하고 사전 편집 라운드의 상이한 항생제 선택 마커 유전자와 연관되는 것인 방법.
  77. 제 43 항에 있어서,
    단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 최종 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일한 또는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하며, 여기서 최종 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함하는 것인 방법.
  78. 제 44 항에 있어서,
    단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들 내 또는 이에 인접하는 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 최종 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 사전에 편집된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일한 또는 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하며, 여기서 최종 플라스미드는 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열을 포함하며, 여기서 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 부위-특이적 제한 효소를 포함하거나 부위-특이적 제한 효소를 암호화하는 하나 이상의 서열은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하는 최종 플라스미드와 함께 미생물 숙주 세포 내로 도입되는 것인 방법.
  79. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서,
    단계(h)를 추가로 포함하고, 여기서 단계(h)는 반복 단계(d)-(g)의 말단 라운드에서 최종 gRNA 및 최종 복구 단편을 포함하는 최종 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 최종 gRNA는 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들은 미생물 숙주 세포 내로 사전에 도입된 gRNA에 의해 표적화된 임의의 유전자좌 또는 유전자좌들과 동일하거나 상이한 유전자좌 또는 유전자좌들을 포함하고, 여기서 최종 복구 단편은 최종 유전자좌 또는 유전자좌들에서 하나 이상의 유전자 편집에 대한 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자 편집의 각각에 대한 서열은 상동성 암 사이에 있고, 여기서 상동성 암은 미생물 숙주 세포의 게놈에서 최종 유전자좌 또는 유전자좌들로부터의 유전자좌의 측면에 있는 서열에 상동성인 서열을 포함하고, 여기서 최종 플라스미드, 최종 gRNA 및/또는 최종 복구 단편은 사전 선택 라운드에서 도입된 선택 마커 유전자와 상이한 선택 마커 유전자에 대한 서열과 연관되는 것인 방법.
  80. 제 79 항에 있어서,
    최종 복구 단편 상에 존재하거나 이와 연관된 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하여 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 통한 말단 라운드 후 최종 복구 단편의 제거를 용이하게 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  81. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포는 하나 이상의 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 포함하는 것인 방법.
  82. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포는 람다 레드 재조합 시스템, RecET 재조합 시스템, 람다 레드 재조합 시스템 또는 RecET 재조합 시스템 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 단백질의 임의의 상동체, 이종 상동체 또는 동종 상동체로부터의 단백질 세트를 포함하는 것인 방법.
  83. 제 82 항에 있어서,
    람다 레드 재조합 시스템의 단백질 세트는 베타 단백질, 감 단백질 및 엑소 단백질을 포함하는 것인 방법.
  84. 제 81 항에 있어서,
    이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트는 단계(a) 전에 이종 재조합 시스템으로부터의 단백질 세트를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 상에서 미생물 숙주 세포 내로 도입되는 것인 방법.
  85. 제 81 항에 있어서,
    이종 재조합 시스템의 단백질의 세트는 미생물 숙주 세포의 게놈에 이종 재조합 시스템의 단백질 세트를 암호화하는 유전자의 통합으로 인해 미생물 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되는 것인 방법.
  86. 제 81 항에 있어서,
    이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 구조성으로 발현되는 것인 방법.
  87. 제 81 항에 있어서,
    이종 재조합 시스템의 단백질 세트는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 선택적으로, 여기서 이종 재조합 시스템 유전자는 오페론에 내에 있는 것인 방법.
  88. 제 87 항에 있어서,
    유도성 프로모터는 시약의 추가, 대사 산물 또는 시약의 고갈 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있는 것인 방법.
  89. 제 88 항에 있어서,
    시약은 아라비노스, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 및 테트라사이클린으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인 방법.
  90. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도입하는 단계는 미생물 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  91. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포는 진핵 세포인 방법.
  92. 제 91 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포는 효모 세포인 방법.
  93. 제 92 항에 있어서,
    효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
  94. 제 91 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포는 사상균류인 방법.
  95. 제 94 항에 있어서,
    사상균류는 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger)인 방법.
  96. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 숙주 세포는 원핵 세포인 방법.
  97. 제 96 항에 있어서,
    원핵 숙주 세포는 대장균(E. coli)인 방법.
  98. 제 96 항에 있어서,
    원핵 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)인 방법.
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