KR102345899B1 - 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents

박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 관심 생체 분자를 생산하는 이종 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현하는 미생물 균주를 생성시키는 방법을 기술한다. 양태에서, 본 발명은 발현이 천연 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 또는 이로부터 유래된 돌연변이 프로모터에 의해 조절되는 이종 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현하는 신규한 박테리아 균주를 제공한다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 래더를 사용하여 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리를 제조하는 방법이 본 발명에 제공된다.

Description

박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
본 발명은 미생물 게놈 공학에 관한 것이다. 개시된 게놈 공학적 방법은 산소가 적거나 실질적으로 혐기성 조건에서 성장하면서 관심 생성물을 생산할 수 있는 균주를 생산하기 위해 원핵 생물 헤모글로빈 유전자 라이브러리를 생성하고 상기 라이브러리를 미생물 숙주에 도입하는 것을 수반한다.
다양한 바람직한 대사 산물 및 중요한 약제의 상업적 생산은 산소 요구 박테리아, 곰팡이 및 포유류 세포의 과발현 능력을 이용할 수 있다. 또한, 통풍성 장관 또는 산소를 필요로 하는 생성물 경로를 포함하는 상용 생성물을 생산하기 위한 공정(예를 들어, 발효)을 최적화하는 동안, 미생물에 대한 산소 전달은 종종 속도 제한이 된다. 이는 크게 산업 규모 공정(예를 들어, 발효)의 표면적/부피 비율이 매우 낮기 때문일 수 있다. 산소는 물에 대한 용해도가 매우 낮으며 다양한 미생물 및 배양된 세포 유형은 특히 대규모 및 고 세포 밀도 생산 공정 동안 산소에 대한 높은 영양 요구를 가진다. 산소에 대한 높은 수요는 공정 파라미터 및 생물 반응기 구성, 예를 들어, 생산 배지에서 산소 분압을 증가시키는데 모두 기여할 수 있는 개선된 혼합 속도, 고효율 분산 시스템 및 배지의 변형을 개선함으로써 부분적으로 충족될 수 있다. 그러나, 이러한 개선은 종종 생산 프로세스를 운영하는 자본 및 운영 비용에 직접적으로 기여합니다. 또한, 이런 개선은 배양 용기에서 난류 및/또는 전단 속도와 같은 바람직하지 않은 유변학적 특성을 생산할 뿐만 아니라 원하는 숙주 미생물에 대해 최적 이하의 성장률을 만들 수 있는 배양 배지를 이용하는 방법을 종종 사용한다.
따라서, 다양한 발효 미생물에 광범위하게 적용될 수 있고, 물리적인 생물 반응기 구성요소 또는 발효 배지의 최적화에 의존하지 않는 산업적 발효에서의 산소 제한 문제에 대한 창조적인 해결책에 대한 절실한 필요가 당업계에 존재한다.
본 발명은 산업 발효에서 미생물에 대한 산소 제한의 악영향을 경감시키기 위한 유전자 공학적 접근법을 취함으로써 상기 제한를 극복한다. 구체적으로, 본 발명은 산업 발효에서 제한된 산소 환경의 문제점을 해결하기 위한 라이브러리 접근법을 제공한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명은 산업적 미생물에서 이종 세균 헤모글로빈 및/또는 플라헤모글로빈 유전자를 테스트하고, 산업적 미생물에서 특히 산소의 부분 압력, 성장 및/또는 생산성을 증가시키는 것에 대한 도입 효과를 평가한다.
한 양태에서, 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 이종 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 숙주 세포가 본 발명에 제공되며, 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자이다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 34로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터 유래된다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자는 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자이다. 일부 경우에, 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터 유래된다. 일부 경우에, 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 생체 분자를 생산하기에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생체 분자를 생산하는 방법에 사용된다. 일부 경우에, 생체 분자는 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올이다. 일부 경우에, 아미노산은 라이신, 글루탐산, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루이신 또는 메티오닌이다. 일부 경우에, 유기산은 숙산산염, 락트산염 또는 피루브산염이다. 일부 경우에, 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올이다.
다른 양태에서, 생체 분자의 생산을 증가시킬 수 있는 미생물을 생성하는 방법으로서, a) 숙주 미생물을 유전자 변형시키는 단계로서, 변형시키는 단계는 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터의 박테리아 헤모글로빈 유전자의 숙주 미생물의 게놈 속으로 도입을 포함하며, 여기서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터의 각각의 박테리아 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터에 기능적으로 연결되며 변형은 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현하는 숙주 미생물의 균주를 생성하는 단계; b) 숙주 미생물의 복수의 균주가 생성될 때까지 복수 회 동안 단계 a)를 반복하는 단계로서, 숙주 미생물의 복수의 균주 각각의 균주는 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터 별도의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현시키는 단계; c) 숙주 미생물의 복수의 균주의 각각의 균주를 발효 조건하에서 탄소원과 접촉시키는 단계; 및 d) 대조군 미생물로부터 생산된 생체 분자의 양과 비교하여 생체 분자의 증가된 양을 생산하는 숙주 미생물의 각 균주를 선택하는 단계로서, 대조군 미생물은 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현하지 않는 단계를 포함하는 방법이 본 발명에 제공된다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가진 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자는 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자이다. 일부 경우에, 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 헤모글로빈의 라이브러리에서 박테리아 헤모글로빈의 적어도 하나는 박테리아 플라보헤모글로빈이다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자 및 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 숙주 미생물은 코리네박테리움 속에 속한다. 일부의 경우, 숙주 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 일부 경우에, 도입은 형질 전환, 형질 주입 또는 전기 천공에 의해 수행된다. 일부 경우에, 생체 분자는 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올이다. 일부 경우에, 아미노산은 라이신, 글루탐산, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루이신 또는 메티오닌이다. 일부 경우에, 유기산은 숙산산염, 락트산염 또는 피루브산염이다. 일부 경우에, 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올이다.
또 다른 양태에서, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리가 본 발명에 제공되며, 여기서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리에서 각각의 박테리아 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터에 기능적으로 연결된다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리에서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 각각은 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자이다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리에서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 적어도 하나는 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자이다. 일부 경우에, 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자 및 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 라이브러리로부터 박테리아 헤모글로빈 유전자를 숙주 세포 내로 도입시키는 단계 및 생체 분자를 생산하기에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생체 분자를 생산하는 방법에 사용된다. 일부 경우에, 생체 분자는 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올이다. 일부 경우에, 아미노산은 라이신, 글루탐산, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루이신 또는 메티오닌이다. 일부 경우에, 유기산은 숙산산염, 락트산염 또는 피루브산염이다. 일부 경우에, 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 코리네박테리움 속에 속한다. 일부의 경우, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 일부의 경우, 도입은 형질 전환, 형질 주입 또는 전기 천공에 의해 수행된다.
추가 양태에서, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로부터 선택된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 갖는 단리된 합성 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 제공되며, 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 경우에, 숙주 세포는 대장균 및/또는 C. 글루타미쿰이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 형질 전환 플라스미드의 조립 및 숙주 유기체로의 이의 통합을 예시한다. 삽입 서열 삽입체 DNA는 하나 이상의 합성 올리고 뉴클레오타이드를 조합 반응에서 결함으로써 생성된다. DNA 삽입체는 후속 단계에서 DNA를 루핑 아웃(looping out)하기 위해 디자인된 직접 반복 영역(즉, 상동성 암)이 측면에 위치하는 원하는 프로모터 서열을 함유한다. 조립된 플라스미드는 삽입체 DNA (본 발명에 제공된 프로모터에 기능적으로 연결된 박테리아 헤모글로빈 유전자), 및 선택적으로 하나 이상의 선택 마커를 함유한다.
도 2는 숙주 균주로부터 DNA의 선택된 영역을 루핑 아웃하기 위한 절차를 도시한다. 삽입된 DNA의 직접 반복(DR) 영역은 숙주 균주의 게놈에서 상응하는 서열을 갖는 루프를 형성한다. 선택 마커로 선택된 세포 카운터는 루프 DNA의 DNA 결실를 나타낸다.
도 3a-3b는 실시예 1에서 기술된 바와 같은 평가 방법에서 이종 박테리아 헤모글로빈 유전자의 성능을 예시한다. 도 3a는 각 상황(배경)에서 테스트된 각 헤모글로빈 유전자에 대한 예측 생산성의 변화를 예시한다. 도 3b는 각 상황(배경)에서 테스트된 각 헤모글로빈 유전자에 대한 예측 수율의 변화를 예시한다.
도 4는 실시예 1에서 기술된 바와 같이 원하는 발효 조건에서 이종 박테리아 헤모글로빈 유전자의 성능을 예시한다.
다음의 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 생각되지만, 다음 정의는 본 발명에 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
용어 하나("a" 또는 "an")는 그 실체 중 하나 이상을 의미하며, 즉 복수의 지시대상을 의미할 수 있다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 부정관사에 의한 "한 요소"에 대한 언급은, 내용이 분명하게는 요소의 하나 및 단지 하나가 존재하는 것을 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.
그 내용이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전체에서, 단어 "포함하다" 및 이의 변형, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형의 포함 의미로, 즉 "포함하지만, 이들로 제한되지 않는"것으로서 해석되어야 한다.
본 명세서 전체에서 "한 실시태양" 또는 "실시태양"에 대한 언급은 그 실시태양과 관련하여 기술된 특정 특징부, 구조 또는 특징이 본 발명의 내용의 적어도 하나의 실시태양에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에서 다양한 곳에서 구 "한 실시태양에서" 또는 "실시태양에서"의 출현은 동일한 실시형태를 반드시 지칭하는 것은 아니다. 명확성을 위해서, 별도의 실시태양의 내용에 기술된, 본 발명의 특정 특징부는 또한 단일 실시태양에서 조합으로 제공될 수 있다는 것이 인지된다. 이에 반해서, 간결성을 위해서, 단일 실시태양의 내용에 기술된, 본 발명의 다양한 특징부는 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "세포 생물", "미세유기체" 또는 "미생물"은 광범위하게 이해되어야 한다. 이 용어들은 상호 교환적으로 사용될 수 있으나 두 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 균류 및 원생 생물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 목록/표 및 도면의 "미세유기체" 또는 "세포유기체" 또는 "미생물"을 의미한다. 이런 특성화는 표와 도면의 확인된 분류학적 속과 확인된 분류학적 종뿐만 아니라 상기 표 또는 도면의 임의의 유기체의 다양한 신규하고 새로운 확인된 또는 디자인된 균주를 의미할 수 있다. 동일한 특성화는 실시예에서와 같이, 명세서의 다른 부분에서 이런 용어의 인용에 대해서도 마찬가지이다.
용어 "원핵 생물"은 당업계에 공지되어 있으며 핵 또는 다른 세포 기관을 함유하지 않는 세포를 의미한다. 원핵생물은 일반적으로 두 영역, 박테리아와 고세균의 하나로 분류된다. 고세균과 박테리아 영역의 유기체 사이의 명확한 차이는 16S 리보솜 RNA에서 뉴클레오타이드 염기 서열의 근본적인 차이에 기초한다.
용어 "고세균"은 전형적으로 특이한 환경에서 발견되고 세포벽에서 리보솜 단백질의 수 및 뮤라민산의 부족을 포함하는 몇몇 기준에 의해 나머지 원핵 생물과 구별되는 멘도시쿠테스(Mendosicutes) 문의 유기체의 범주를 의미한다. ssrRNA 분석에 기초하여, 고세균은 두 계통발생학적으로 다른 그룹으로 구성된다: 크렌고세균(Crenarchaeota) 및 유리고세균(Euryarchaeota). 생리학을 기초로, 고세균은 세 가지 유형으로 구성될 수 있다: 메테인 생성균(methanogens)(메테인을 생성하는 원핵 생물); 고염성 세균(extreme halophiles)(매우 높은 농도의 염(NaCl)에서 사는 원핵 생물; 및 고온성(초고온성) 세균(extreme(hyper) thermophilus)(초고온에서 사는 원핵 생물). 박테리아와 구별되는 통일된 고세균의 특징(즉, 세포벽, 에스터-연결 막 지질 등에 뮤레인 없음)이외에, 이런 원핵 생물은 이들의 특정한 서식 환경에 적응시키는 특이한 구조 또는 생화학적 특성을 나타낸다. 크렌고세균은 주로 초고온성 황 의존성 원핵 생물로 이루어지며 유리고세균은 메테인 생성균과 고염성 세균을 함유한다.
"박테리아" 또는 "진정세균(eubacteria)"는 원핵 생물의 영역을 의미한다. 박테리아는 다음과 같이 적어도 11개의 구별된 그룹을 포함한다: (1) 그람 양성 (그람+) 박테리아, 2개위 주요 세부구분이 존재한다: (1) 높은 G+C 그룹(액티노마이세테스, 마이코박테리아, 마이르코콕커스, 기타) (2) 낮은 G+C 그룹(바실러스, 클로스트리디아, 락토바실러스, 스타필로콕키, 스트렙토콕키, 마이코플라스마스); (2) 프로테오박테리아, 예를 들어, 보라색 광합성 + 비 광합성 그람 음성 박테리아 (대부분의 "일반적인" 그람 음성 박테리아 포함); (3) 사이아노박테리아, 예를 들면, 산소성 광영양생물; (4) 스피로체테스 및 관련 종; (5) 플랭크토마이세스; (6) 박테로이데스, 플라보박테리아; (7) 클라마이디아; (8) 녹색 황 박테리아; (9) 녹색 비 황 박테리아(또한 혐기성 광영양식물); (10) 방사성 저항성 마이크로콕키 및 동족; (11) 써모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
"진핵 생물"은 세포가 막 내에 둘러싸인 핵 및 다른 소기관을 함유하는 임의의 유기체이다. 진핵 생물은 분류군(Eukarya 또는 Eukaryota)에 속한다. 진핵 생물 세포를 원핵 생물(박테리아와 고세균)와 구분시키는 정의하는 특징은 막으로 둘러싸인 유전자 물질, 특히 유전자 물질을 함유하고 핵막에 의해 둘러싸인 핵을 가진다는 것이다.
용어 "유전자 변형된 미생물", "재조합 미생물", "재조합 숙주 세포" 및 "재조합 균주"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있고 유전자 변형된 미생물을 의미할 수 있다. 따라서, 이 용어는 유전자 변경, 변형 또는 조작되어, 숙주 세포가 유도된 자연 발생 미생물과 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내는(예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 암호화에 영향을 미칠 때) 미생물(예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 곰팡이 세포 등)을 포함한다. 이 용어는 문제의 특정 재조합 미생물뿐만 아니라 이런 미생물의 자손 또는 잠재적 자손을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 "야생형 미생물"은 자연에서 발생하는 세포, 즉 유전자 변형되지 않은 세포를 기술할 수 있다.
용어 "유전자 조작된"은 (예를 들어, 핵산의 삽입 또는 결실에 의한) 미생물의 게놈의 임의적 조작을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "대립 유전자(들)"은 유전자의 하나 이상의 대안 형태의 임의의 것을 의미할 수 있고, 이의 모두 대립 유전자는 적어도 하나의 형질 또는 특성과 관련된다. 2배체 세포에서, 주어진 유전자의 2개의 대립 유전자는 한 쌍의 상동 염색체상의 상응하는 유전자좌를 점 할 수 있다. 본 발명은, 실시태양에서, QTL, 즉 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열을 포함할 수 있는 게놈 영역에 관한 것이기 때문에, 어떤 경우에는 "대립 유전자" 대신에 "일배체형"(즉, 염색체 단편의 대립 유전자)을 언급하는 것이 더 정확하나, 이런 경우에, "대립 유전자"라는 용어는 "일배체형"을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자좌"(복수 유전자좌)는 예를 들어 유전자 또는 유전자 마커가 발견되는 염색체 상의 특정 장소 또는 장소들 또는 위치를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "유전적으로 연결된"은 교차를 통해 분리하기가 어려워 번식 동안 높은 비율로 공동유전되는 2개 이상의 형질을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "재조합"또는 "재조합 사건"은 염색체 교차 또는 독립된 분류를 의미할 수 있다. 용어 "재조합"은 재조합 사건의 결과로서 발생하는 새로운 유전체 구성을 갖는 유기체를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "표현형"은 개체의 유전적 구성(즉, 유전자형)과 환경 사이의 상호작용으로부터 기인하는 개별 세포, 세포 배양, 유기체 또는 유기체의 그룹의 관찰 가능한 특성을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 핵산 서열 또는 단백질 서열을 기술할 때 용어 "키메라" 또는 "재조합체"는 적어도 2개의 이종 폴리 뉴클레오타이드 또는 2개의 이종 폴리펩타이드를 단일 거대분자 속에 연결하거나 적어도 하나의 천연 핵산 또는 단백질 서열의 하나 이상의 요소를 재배열하는 핵산 또는 단백질 서열을 의미할 수 있다. 예를 들어, 용어 "재조합체"는 예를 들어, 화학적 합성 또는 유전 공학 기술에 의한 핵산의 분리된 단편의 조작에 의해 서열의 두 개의 분리된 단편의 인공적 조합을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "합성 뉴클레오타이드 서열"또는 "합성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 자연에서 발생하는 것으로 알려지지 않았거나 자연 발생적이지 않은 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일반적으로, 이런 합성 뉴클레오타이드 서열은 임의의 다른 자연 발생 뉴클레오타이드 서열과 비교할 때 적어도 하나의 뉴클레오타이드 차이를 포함할 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 의미할 수 있다. 이 용어는 분자의 1 차 구조를 의미할 수 있고, 따라서 이중 나선 및 단일 가닥의 DNA뿐 아니라 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 또한, 메틸화 및/또는 캡핑된 핵산과 같은 변형된 핵산, 변형된 염기를 함유하는 핵산, 골격 변형 등과 같은 변형 핵산을 포함할 수 있다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상화 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 단편을 의미할 수 있다. 따라서, 유전자는 암호화 서열 및/또는 그의 발현에 요구되는 조절 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유전자는 또한, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비 발현 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 원하는 파라미터를 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상동 기관(homologous)"또는 "동족체 (homologue)"또는 "오르쏘로그(ortholog)"는 당업계에 공지되어 있고 공통 조상 또는 가족 구성원을 공유하고 서열 동일성의 정도에 기초하여 결정되는 관련 서열을 의미할 수 있다. 용어 "상동성", "상동 기관", "실질적으로 유사" 및 "상응하게 실질적으로"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 유전자 발현을 중재하거나 특정 표현형을 생성시키는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미할 수 있다. 이런 용어는 또한 초기의 변형되지 않은 단편에 비해 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미한다. 따라서, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 특정 예시적인 서열 이상을 포함하는 것으로 이해된다. 이런 용어는 한 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 발견된 유전자 및 다른 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 상응하는 또는 동등한 유전자 사이의 관계를 기술한다. 본 발명을 위해서, 상동성 서열이 비교될 수 있다. "상동 서열"또는 "상동체"또는 "오르쏘로그"는 기능적으로 관련이 있다고 생각되고, 믿거나 알려질 수 있다. 기능적 관계는 (a) 서열 동일성 및/또는 (b) 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 방식 중 임의의 하나로 표시될 수 있다. 바람직하게는, (a) 및 (b) 모두가 표시된다. 상동성은 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, 섹션 7.718, 표 7.71에서 논의된 바와 같은 당해분야에서 용이하게 이용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수있다. 일부 정렬 프로그램은 맥벡터(MacVector)(Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.), ALIGN 플러스(Plus)(Scientific and Educational Software, Pennsylvania) 및 AlignX(Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하여 시퀀처(Sequencher)(Gene Codes, Ann Arbor, Michigan)이다.
본 발명에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변화"는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 삽입을 의미할 수 있다. 예를 들어 돌연변이는 침묵 치환, 추가 또는 결실을 생성하나 암호화된 단백질의 특성 또는 활성 또는 단백질이 어떻게 만들어지는지를 변형하지 않는 변경을 함유한다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질 변형"은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 변형, 결실 및 또는 삽입을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 핵산 또는 폴리펩타이드의 "적어도 일부" 또는 "단편"은 전장 분자를 포함하는 전장 분자의 이런 서열 또는 임의의 더 큰 단편의 최소 크기 특성을 갖는 부분을 의미할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 단편은 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분을 암호화할 수있다. 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분은 유전자 조절 요소를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 일부를 분리하고 본 발명에 기재된 바와 같은 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 폴리펩타이드의 일부는 전장 폴리펩타이드까지 이르는 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산 등일 수 있다. 사용될 부분의 길이는 특정 용도에 따라 다를 것이다. 하이브리드화 프로브로서 유용한 핵산의 일부는 12개 뉴클레오타이드 정도로 짧을 수 있으며; 일부 실시태양에서, 이것은 20개 뉴클레오타이드이다. 에피토프로서 유용한 폴리펩타이드의 일부는 4개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. 전장 폴리펩타이드의 기능을 수행하는 폴리펩타이드의 일부는 일반적으로 4개 이상의 아미노산보다 길 수 있다.
변이체 폴리뉴클레오타이드는 또한 DNA 셔플링과 같은 돌연변이 및 재조합 절차로부터 유도될 수 있는 서열을 포함한다. 그러한 DNA 셔플링을 위한 전략은 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, Stemmer(1994) PNAS 91:10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al.(1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al.(1997) PNAS 94:4504-4509; Crameri et al.(1998) Nature 391:288-291; 및 미국 특허 제5,605,793호 및 제5,837,458호 참조.
본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 증폭을 위해, 임의의 관심 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터의 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에 사용하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 디자인하기 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)에 개시된다. PCR의 공지된 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 네스타이드 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴성 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적 불일치 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이머"는 DNA 중합효소를 부착시키는 증폭 표적에 대한 어닐링을 행할 수 있어, 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓일 때, 즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 중합화제의 존재하에서 및 적절한 온도 및 pH에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. (증폭) 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 바람직하게는 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 중합화제의 존재 하에서 증량 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 조성(A/T 대 G/C 함량)을 포함하는 많은 요소에 따라 달라질 것이다. 한 쌍의 양방향성 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 하나의 순방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
"엄격성" 또는 "엄격한 혼성화 조건"이란 용어는 하이브리드의 안정성에 영향을 주는 혼성화 조건, 예를 들어 온도, 염 농도, pH, 포름아마이드 농도 등을 의미할 수 있다. 이러한 조건은 특이적 결합을 최대화하고 표적 핵산 서열에 대한 프라이머 또는 프로브의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 경험적으로 최적화될 수 있다. 사용된 용어는 프로브 또는 프라이머가 다른 서열보다 검출 가능하게 더 큰 정도로 (예를 들어, 배경보다 적어도 2배) 이의 표적 서열에 혼성화될 조건에 대한 언급을 포함할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존성일 수 있으며 다른 상황에서 상이할 것이다. 긴 서열은 고온에서 특이적으로 혼성화될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택될 수 있다. Tm은 상보적 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브 또는 프라이머에 하이브리드화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH 하에서)일 수 있다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M Na+ 이온 미만, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M Na+ 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도는 짧은 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 30℃이고 긴 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 50개 초과 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화 제의 첨가로 성취될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건 또는 "감소된 엄격한 조건"은 37℃에서 30% 포름아마이드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충액에 의한 하이브리드화 및 40℃에서 2 x SSC의 세척을 포함할 수 있다. 예시적인 높은 엄격 조건은 37℃에서 50% 포름아마이드, 1M NaCl, 1% SDS에서 하이브리드화 및 60℃에서 0.1 x SSC 세척을 포함한다. 하이브리드화 절차는 당업계에 주지되어 있으며 예를 들어, Ausubel et al., 1998 and Sambrook et al., 2001에 의해 기술된다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건은 1 mM Na2EDTA, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%와 같은 45℃의 0.5-20% 황산 도데실 나트륨을 함유하는 0.25 M Na2HPO4 완충액(pH 7.2)에서의 하이브리드화, 및 뒤이은 55℃ 내지 65℃에서 0.1%(w/v) 황산 도데실 나트륨을 함유하는 5 x SSC 세척이다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터" 또는 "프로모터 폴리뉴클레오타이드"는 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 프로모터 서열은 근위 및 더 원위 상류 요소로 구성되고, 후자의 요소는 종종 인핸서로 불릴 수 있다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열일 수 있으며, 프로모터의 선천적인 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 요소일 수 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 완전히 유도되거나 자연계에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유도된 상이한 요소로 구성되거나 심지어 합성 DNA 단편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형, 또는 상이한 발달 단계 또는 상이한 환경 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 지시할 수 있음은 당업자에게 이해된다. 또한, 대부분의 경우에, 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 일부 변이체의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 추가로 인식된다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 구조체", "발현 구조체", "키메라 구조체", "구조체" 및 "재조합 DNA 구조체"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 재조합 구조체는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열과 같은 핵산 단편의 인위적인 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구조체는 상이한 공급원으로부터 유도된 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유도되지만 자연계에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키메릭 구조체는 조절성(예를 들어, 프로모터) 및 코딩 서열(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)를 포함하는 재조합 구조체일 수 있다. 복수의 코딩 서열을 포함하는 키메릭 구조체 내의 각각의 코딩 서열은 별도의 조절 서열에 의해 제어될 수 있거나 기능적으로 연결될 수 있다. 본 발명에 기술된 이러한 구조체는 그 자체로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우 벡터의 선택은 당업자에게 주지된 바와 같이 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용될 방법에 의존할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 분리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선별 및 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전자 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 상이한 독립적인 형질전환 사건이 발현의 상이한 수준 및 패턴을 유도한다는 것을 인식할 것이며(Jones et al., (1985) EMBO J. 4 : 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen Genetics 218 : 78-86), 따라서 다수의 사건은 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 라인을 수득하기 위해 선별돼야한다. 이러한 선별은 다른 것들 중에서, DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 면역 블로팅 분석 또는 표현형 분석에 의해 실행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등일 수있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제하지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오타이드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오타이드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 모두로 구성된 폴리뉴클레오타이드, 폴리-라이신-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 펩타이드-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이드된 DNA 등일 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "발현"은 기능적 최종 산물, 예를 들어 mRNA 또는 단백질(전구체 또는 성숙)의 생산을 의미한다.
"작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 이 내용에서 추가 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)의 전사를 초래하는 추가의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)에 의한 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 순차적 배열을 의미할 수 있다. 다시 말하면, "작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 프로모터가 상기 유전자에 인접 또는 하류 또는 3'인 유전자(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)의 전사를 제어하는 것을 의미할 수 있다.
용어 "탄소원"은 일반적으로 세포 성장을 위한 탄소원으로 사용되기에 적합한 물질을 의미한다. 탄소원은 바이오매스 가수분해물, 전분, 수크로오스, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 자일로오스 및 리그닌뿐만 아니라 이들 기질의 단량체 성분을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 탄소원은 폴리머, 탄수화물, 산, 알코올, 알데하이드, 케톤, 아미노산, 펩타이드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 다양한 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 글루코오스, 자일로오스, 덱스트로스(D-글루코오스), 말토오스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 포화 또는 불포화 지방산, 숙시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올 등, 또는 이의 혼합물과 같은 다양한 모노사카라이드를 포함한다. 광합성 유기체는 광합성의 산물로서 탄소원을 추가로 생산할 수 있다. 일부 실시태양에서, 탄소원은 바이오매스 가수분해물 및 글루코오스로부터 선택될 수 있다.
용어 "공급원료"는 미생물 또는 발효 공정에 공급되는 원료 또는 원료의 혼합물로서 다른 생성물이 제조될 수 있는 것으로 정의된다. 예를 들어, 바이오매스 또는 바이오매스에서 유도된 탄소 화합물과 같은 탄소 공급원은 발효 공정에서 관심 생성물(예를 들어, 작은 분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)을 생산하는 미생물의 공급원료이다. 그러나, 공급원료는 탄소원 이외의 영양분을 함 유할 수 있다.
용어 "체적 생산성" 또는 "생산 속도"는 단위 시간당 매질의 부피당 형성된 생성물의 양으로 정의된다. 체적 생산성은 시간당 리터 당 그램(g/L/h)으로 보고될 수 있다.
용어 "비 생산성"은 생성물의 형성 속도로 정의된다. 비 생산성은 본 발명에서 시간당 세포 건조 중량의 그래당 그램 생성물(g/g CDW/h)의 비 생산성으로서 더 정의된다. 소정의 미생물에 대한 OD600에 대한 CDW의 관계를 사용하여, 비 생산성은 시간당 600nm(OD)(g/L/h/OD)에서 배양액의 광학 밀도당 배양 배지당 그램 생성물로 표현될 수 있다.
용어 "수율"은 원료의 단위 중량당 수득된 생성물의 양으로 정의되며 g 기질 당 g 생성물(g/g)로 표현될 수 있다. 수율은 이론적 수율의 백분율로 표현될 수있다. "이론적 수율"은 생성물을 제조하는데 사용된 신진대사 경로의 화학양론에 따라 결정된 소정량의 기질당 생성될 수 있는 최대 생성물로 정의된다.
용어 "역가(titre 또는 titer)"는 용액의 강도 또는 용액 속의 물질의 농도로 정의된다. 예를 들어, 발효액에서 관심 생성물(예를 들어, 작은 분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)의 역가는 발효액 1 리터당 용액 속 관심 제품의 g(g/L)로 기술된다.
용어 "총 적가"는 용액 속의 관심 생성물, 적용 가능한 경우 기체상의 관심 생성물, 공정으로부터 제거되고 공정에서 최초 부피 또는 공정에서 작동 부피에 따라 회수된 임의의 관심 생성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 공정에서 생산된 모든 관심 생성물의 합으로 정의될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "원핵 생물 헤모글로빈"은 하나 이상의 글로빈 도메인을 함유하는 헤메 함유 산소 결합 및/또는 수송 단백질인 원핵 생물 세포(즉, 박테리아 또는 고세균)로부터 유래된 임의의 단백질을 의미할 수 있다. 원핵 생물 헤모글로빈은 본 발명에 기술된 바와 같은 헤모글로빈 단백질 또는 예를 들어, 플라보헤모글로빈과 같은 관련 단백질을 의미할 수 있다. 원핵 생물 헤모글로빈 단백질은 당업계에 공지된 임의의 속 및/또는 종의 박테리아 또는 고세균으로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "박테리아 헤모글로빈"은 박테리아로부터 유래된 본 발명에 기술된 바와 같은 헤모글로빈 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "원핵 생물 헤모글로빈 유전자"는 전사 및/또는 번역될 때 본 발명에 기술된 바와 같은 원핵 생물 헤모글로빈 단백질을 암호화하는 임의의 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA 및/또는 mRNA)을 의미할 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "박테리아 헤모글로빈 유전자"는 박테리아로부터 유래된 본 발명에 기술된 박테리아 헤모글로빈 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "관심 생성물" 또는 "생체 분자"는 원료로부터 미생물에 의해 생성된 임의의 생성물을 의미한다. 일부 경우에, 관심 생성물은 작은 분자, 효소, 펩타이드, 아미노산, 유기산, 합성 화합물, 연료, 알코올 등일 수 있다. 예를 들어, 관심 생성물 또는 생체 분자는 임의의 1차 또는 2차 세포외 대사산물일 수 있다. 1차 대사산물은 특히 에탄올, 시트르산, 락트산, 글루탐산, 글루탐산염, 라이신, 트레오닌, 트립토판 및 다른 아미노산, 비타민, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 2차 대사산물은 특히 페니실린과 같은 항생물질 또는 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제, 지베렐린과 같은 식물 호르몬, 로바스타틴과 같은 스타틴 약물, 그리세오풀빈과 같은 살균제 등일 수 있다. 관심 생성물 또는 생체 분자는 또한 카탈라아제, 아밀라아제, 펙티나아제, 글루코오스 아이소머라제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 리파아제, 락타아제, 스트렙토 키나아제 및 여러 다른 것을 포함하는 미생물 효소와 같은 미생물에 의해 생성된 임의의 세포내 성분일 수 있다. 세포내 성분은 또한 인슐린, B형 간염 백신, 인터페론, 과립구 콜로니-자극 인자, 스트렙토키나아제 및 기타와 같은 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
개관
현대의 산업 미생물에서 대사 과정으로부터 유래된 엄청난 양의 생성물을 감안할 때, 소정의 미생물이 표적 생성물을 생산할 수 있는 속도 및 효율을 향상시키는데 엔지니어가 엄청난 압력을 받고 있는 것은 놀랄 일이 아니다. 따라서, 대사 공학적 접근법은 미생물에 대한 산소 제한의 악영향을 완화하기 위한 것과 같은 유전 전략을 추구한다. 한 접근법에서, 비트레오스실라(Vitreoscilla) 헤모글로빈 유전자(vhb)는 대장균으로 성공적으로 옮겨졌고 VHb의 발현시, 대장균의 성장 및 단백질 생산은 미세혐기 조건하에서 강화되었다(Khosla　C.,　Bailey　J.E.(1988)　Heterologous expression of a bacterial haemoglobin improves the growth properties of recombinant　E.coli.　Nature　331,　633-635 and Khosla　C.,　Curtis　J.E.,　DeModena　J.,　Rinas　U.,　Bailey　J.E. (1990)　Expression of intracellular hemoglobin improves protein synthesis in oxygen-limited　E.coli.　Bio-Technology　8,　849-853 참조). 또한,이 접근법은 Frey AD et al. (2003) Bacterial hemoglobins and flavohemoglobins: versatile proteins and their impact on microbiology and biotechnology FEMS Microbiol Rev.Oct 27(4), 525-545에 나타낸 바와 같이 여러 미생물에서 1차 및 2차 대사 산물의 산소 제한 성장 및/또는 생산의 효율을 촉진시키는 것과 같은 긍정적 효과를 가져왔다. 그러나, Vhb의 생화학적 성질은 모든 외래 숙주 세포에 대해 최적화되지 않을 수 있으며, 전통적인 미생물 게놈 공학적 방법을 사용하여 특정한 숙주 미생물에서 어떤 헤모글로빈 유전자가 긍정적 효과를 나타낼지 를 결정하는 것은 힘들고 및/또는 비용이 많이들 수 있다.
본 발명은 전통적인 미생물 균주 개선 프로그램과 관련된 무수한 문제점을 겪지 않는 미생물 게놈 공학 방법을 제공한다.
본 발명에 제공된 한 양태는 관심 생체 분자 또는 생성물의 생산을 증가시킬 수 있는 미생물(예를 들어, 박테리아)을 생산시키는 방법이다. 일반적으로, 본 발명에서 제공되는 임의의 생체 분자를 생산하는데 사용하기 위한 미생물을 생성시키는 방법은 표적 유전자의 라이브러리의 구성원을 상기 숙주 미생물에 도입하여 상기 미생물의 게놈 조작된 균주를 생성시킴으로서 숙주 미생물을 유전적으로 변형시키는 단계, 관심 생체 분자 또는 생성물을 생산하기에 적합한 조건하에서 상기 조작된 균주를 배양하는 단계 및 상기 조작된 균주가 관심 생체 분자 또는 생성물의 증가된 양을 생산하는 경우 상기 조작된 균주를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 증가된 양은 숙주 미생물의 야생형 균주와 비교될 수 있다. 증가된 양은 표적 유전자의 라이브러리 구성원을 함유하지 않는 숙주 미생물 균주와 비교될 수 있다. 표적 유전자의 라이브러리는 복수의 벡터를 포함할 수 있으며, 라이브러리 내의 각 벡터는 표적 유전자에 기능적으로 연결되거나 결합된 적어도 하나의 프로모터 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 키메릭 구조체를 포함한다.
본 발명의 실시태양 중 하나의 예시적인 워크 플로우는 표적 유전자의 선택, 표적 유전자에 대한 핵산(예를 들어, DNA)의 획득 또는 합성, 및 상기 획득되거나 합성된 표적 유전자의 적절한 벡터로의 클로닝을 수반한다. 당해 분야에 공지된 및/또는 본 발명에서 제공된 임의의 방법은 표적 유전자 또는 표적 유전자를 적절한 벡터 속에 조립 또는 복제하는데 사용될 수 있다. 벡터는 활용하고자 하는 숙주 미생물과 양립할 수 있는 당해 기술 분야에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 벡터일 수 있다. 일단 표적 유전자(들)을 포함하는 벡터가 조립되면, 숙주 미생물에 도입될 수 있다. 벡터의 도입은 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 숙주 미생물은 본 발명에 제공된 임의의 숙주 미생물일 수 있다. 일단 숙주 미생물에 도입되면, 유전자 변형된 숙주가 선택될 수 있고 표적 유전자(들)의 삽입이 평가될 수 있다. 표적 유전자(들)은 숙주 미생물의 게놈의 특정 위치에 삽입되도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 표적 유전자(들)은 숙주 미생물 내에서 의도하지 않은 경로/과정을 교란시키지 않고 표적 유전자(들)의 발현을 촉진시키는 게놈의 중성 부위에 삽입된다. 일부 경우에, 표적 유전자(들)는 숙주 미생물 내의 특정 유전자를 대체한다. 특정 유전자는 숙주 미생물에 통상 존재하는 상동성 표적 유전자일 수 있다. 예를 들어 중성 통합 부위와 같은 통합 부위는 경험적으로 결정될 수 있어서 다양한 부위가 테스트되고 숙주 세포에 해를 끼치 지 않고 통합된 표적 유전자(들)의 발현을 허용하는 부위가 선택될 수 있다. 표적 유전자(들)을 원하는 통합 부위에 상동성인 서열의 부분(즉, 상동성 암)을 포함하는 벡터 속에 복제하고 이어서 숙주 세포에서 재조합 이벤트를 수행하여 원하는 부위(예를 들어, 중성 부위)로의 통합이 촉진될 수 있다. 표적 유전자(들)은 상동성 서열의 부분 사이에 삽입될 수 있다. 한 실시태양에서, 벡터는 원하는 통합 부위에 상동인 약 2kb의 서열을 포함한다. 원하는 부위와 상동성인 서열은 원핵 생물 헤모글로빈 유전자 삽입체의 측면에 위치하여 서열의 제 1 부분이 유전자 삽입체의 상류(즉, 5')이고 서열의 제 2 부분이 유전자 삽입체의 하류(즉, 3')이다. 다른 실시태양에서, 벡터는 원하는 통합 부위에 상동성인 약 4kb의 서열을 포함한다. 이 실시태양에서, 벡터는 원핵 생물 헤모글로빈 유전자 삽입체에 대한 원하는 통합 부위 상류(즉, 5')에 상동성인 약 2kb의 서열 및 원핵 생물 헤모글로빈 유전자 삽입체에 대한 원하는 통합 부위 하류(즉, 3')에 상동성인 약 2kb의 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 벡터 백본에 존재하는 마커상의 역 선택(counter-selection)에 의해 촉진된 플라스미드 백본의 단일 크로스 오버 통합 및 후속 루프 아웃에 의해 통합이 수행된다. 한 실시태양에서, 표적 유전자는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자이다.
삽입의 평가는, 예를 들어, 유전자 변형된 미생물의 게놈 또는 그의 부분의 증폭 및/또는 서열화과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명에 제공된 방법은 또한 본 발명에 기술된 카운터 선택을 통한 선택 마커의 제거 또는 루핑 아웃(looping out)을 수반한다. 루핑 아웃은 본 발명에 제공된 방법 중 하나를 사용하여 수행될 수 있다.
표적 유전자의 삽입 및 선택적인 선택 마커의 제거의 평가에 이어서, 유전자 변형된 균주는 관심 생체 분자 또는 생성물을 생산하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 평가하기 전에 선택적 단계는 균주를 확장하는 단계일 수 있다. 확장은 확장에 적합한 성장 배지에서 다중-웰 플레이트의 플레이트 상에 또는 웰에 유전자 변형된 균주를 배양하는 단계를 수반할 수 있다. 평가 단계는 관심 생체 분자 또는 생성물을 생산하기 위한 실제 조건을 모방하도록 고안된 성장 배지/조건을 포함하는 다중 웰 플레이트에서 플레이트 상에 또는 웰에 유전자 변형된 균주를 배양하는 단계를 수반할 수 있다. 일부 경우에, 이 단계에서 성장 배지는 글루코오스의 대사 과정으로부터 유래된 관심 생체 분자 또는 생성물의 생산에 적합할 수 있다. 유전자 변형된 균주는 평가 단계에서 결정된 바와 같이 관심 생체 분자 또는 생성물의 원하는 또는 임계 생산 속도 또는 수율의 원하는 비율 또는 한계 비율을 갖거나 생산하도록 예측되는 경우, 균주는 선택될 수 있고 냉장 보관에 놓일 수 있다. 예측은 균주 배양 동안 다양한 시점에서 형성된 관심 생성물 및 바이오매스의 양을 측정하고 어떻게 상기 균주가 확장되거나 더 큰 규모의 조건(예를 들어, 발효 조건)을 실행할지를 예측하는데 상기 측정을 사용하는 것에 기초할 수 있다. 한 실시태양에서, 예측은 평가 방법 동안 균주의 성능의 선형 회귀 분석에 기초한다.
일부 경우에, 관심 생체 분자 또는 생성물의 원하는 또는 임계 생산 속도 또는 수율을 갖거나 또는 예측할 수 있는 유전자 변형된 균주는 관심 생체 분자 또는 생성물을 생산하기 위한 조건하에서 더 큰 배양액에 전달되거나 성장된다(예를 들어, 발효 조건). 이 단계는 선택된 균주가 관심 생체 분자 또는 생성물의 생산을 위한 실제 조건하에서 예측된 바와 같이 수행할 수 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부의 경우에, 본 발명에 제공되는 것과 같은 표적 유전자의 라이브러리로부터 각각의 표적 유전자의 도입 및 평가를 위해 본 발명에 제공된 단계는 라이브러리로부터 각각의 표적 유전자에 대해 반복되어 관심 생체 분자 또는 생성물의 원하는 또는 임계 수율 및/또는 생산 속도를 생산하는 유전자 변형 미생물의 하나 이상의 균주를 선택한다.
한 실시태양에서, 관심 생체 분자 또는 생성물은 산소가 부족한 환경에서 성장된 미생물로부터 유래되어 본 발명에 제공된 방법은 미생물 내의 산소의 증가된 부분압을 갖는 미생물의 균주 또는 균주들의 생성을 수반하여 미생물이 상기 산소가 부족한 환경에서 성장될 때 증가된 양의 관심 생체 분자 또는 생성물을 생산하게 한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 산소 결합 및/또는 수송에 관여하는 하나 이상의 표적 유전자의 도입을 수반한다. 한 실시태양에서, 표적 유전자는 원핵 생물 헤모글로빈 유전자이어서 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 본 발명에 제공된 방법으로 숙주 미생물에 도입된다. 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 숙주 미생물에서 이종 유전자일 수 있다. 한 실시태양에서, 숙주 미생물 내로 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 도입은 숙주 미생물 내의 산소의 수준 또는 부분압을 증가시키기 위한 시스템을 생산한다. 증가된 수준 또는 부분압은 상기 미생물 또는 상기 이종 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 발현하지 않는 미생물의 야생형 균주와 대비될 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에 의해 생산된 관심 생체 분자 또는 생성물은 미생물로부터 생산된 임의의 상용 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 관심 생체 분자 또는 생성물은 발효에 의해 생산된다. 일부 경우에, 관심 생체 분자 또는 생성물은 의약, 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 글루탐산, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신일 수 있다. 유기산은 숙신산염, 락트산염 또는 피루브산염일 수 있다. 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다.
한 실시태양에서, 개시된 미생물 게놈 조작 방법은 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리를 이용한다. 박테리아 헤모글로빈 유전자는 세포 내로의 산소의 결합 및/또는 수송에 대한 헤모글로빈 친화력을 기초로 선택될 수 있다. 조작 이후, 미생물은 최종 결과, 예를 들어, 본 발명에 제공된 바와 같이 생성물의 성장 속도 및/또는 생산에 대해 효율적으로 스크리닝되거나 평가될 수 있다. 특정 게놈 변경을 정의하기 위해 본 발명에 제공된 라이브러리를 이용하고 변경을 포함하는 숙주 미생물 게놈을 테스트/스크리닝하는 이런 공정은 효율적이고 반복적인 방식으로 구현될 수 있으며 숙주 세포에서 발현이 관심 생체 분자 또는 생성물의 성장 또는 생산의 원하는 또는 임계 수준을 생산하는 특정 박테리아 헤모글로빈 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에서 사용하기 위해 본 발명에 제공된 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)는 천연 프로모터 또는 본 발명에 제공된 임의의 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조절하에 있거나 또는 이에 기능적으로 연결되어 있다. "프로모터 폴리뉴클레오타이드" 또는 "프로모터" 또는 "프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드"는 전사될 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결될 때 암호화 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 또는 박테리아 헤모글로빈 유전자)의 전사의 개시 시점 및 빈도를 결정하여, 제어된 폴리뉴클레오타이드의 발현 강도에 영향을 미칠 수 있게 하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 디옥시리보폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 바람직하게는 디옥시리보핵산(DNA)을 의미할 수 있다. 한 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)를 포함하는 라이브러리 내의 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)는 같은 또는 동일한 프로모터의 제어하에 있다. 한 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)를 포함하는 라이브러리 내의 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)는 별도의 또는 상이한 프로모터의 제어하에 있다.
한 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)의 라이브러리를 생성하는데 사용하기 위한 프로모터 래더가 본 발명에 제공된다. 본 발명에서 사용된 용어 "프로모터 래더"는 점증적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 의미한다. 본 발명에 사용된 용어 "프로모터 활성"은 폴리뉴클레오타이드 서열의 mRNA로의 전사를 개시하는 프로모터의 능력을 의미한다. 프로모터 활성을 평가하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 2015년 12월7 일자로 출원된 US62/264,232의 실시예 2 및 PCT/US16/65464(PCT 공개 번호 WO2017/100376)에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본 발명에 포함된다. 본 발명에서 사용된 용어 "구조성 프로모터"는 내부 또는 외부 세포 조건에 관계없이 일정한 속도로 이의 관련 유전자의 전사를 지시하는 프로모터를 의미할 수 있다.
프로모터
일부 실시태양에서, 본 발명은 RNA 분해 기능을 조절하고 전체 숙주 균주 생산성에 유익한 효과를 나타내기 위해 최적 발현 특성을 갖는 프로모터를 선별하는 방법을 교시한다.
프로모터는 유전자가 전사되는 속도를 조절하고 다양한 방식으로 전사에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 구조성 프로모터는 내부 또는 외부 세포 조건에 관계없이 일정한 비율로 관련 유전자의 전사를 지시하지만, 조절 가능한 프로모터는 내부 및/또는 외부 세포, 예를 들어, 성장 속도, 온도, 특정 환경 화학물질에 대한 반응 등에 따라 유전자가 전사되는 속도를 증가 또는 감소시킨다. 프로모터는 정상적인 세포 컨텍스트로부터 격리될 수 있으며 사실상 모든 유전자의 발현을 조절하도록 조작되어 세포 성장, 생산 수율 및/또는 기타 관심 표현형의 효과적인 변형을 가능하게 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다양한 발현 강도(예를 들어, 아래에서 논의된 프로모터 래더) 또는 뛰어난 조절 특성(즉, 선택된 유전자에 대한 엄격한 조절 제어)을 나타내는 하나 이상의 프로모터를 확인 및/또는 숙주 세포 내에서 하나 이상의 프로모터의 변이체를 생성시키는 방법을 교시한다. 이들 확인된 및/또는 생성된 프로모터의 특정 조합은 보다 상세히 이하에서 설명된 RNA 분해 교란 실험에 사용하기 위한 프로모터 래더로서 함께 그룹화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 프로모터 래더는 다양한 발현 강도를 갖는 관심 표적 유전자와 관련된 천연, 고유 또는 야생형 프로모터를 동정함으로써 생성된다. 이런 동정된 프로모터는 프로모터 래더로서 함께 그룹화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 프로모터 래더는 관심 표적 유전자와 관련된 천연, 고유 또는 야생형 프로모터를 동정한 다음 상기 프로모터를 돌연변이시켜 다수의 돌연변이 프로모터 서열을 유도함으로써 생성된다. 이들 돌연변이된 프로모터의 각각은 표적 유전자 발현에 대한 효과에 대해 테스트된다. 일부 실시태양에서, 편집된 프로모터는 다양한 조건에 걸쳐 발현 활성에 대해 테스트되어 각 프로모터 변이체의 활성이 문서화/특징화/주석처리되고 데이터베이스에 저장된다. 생성된 편집된 프로모터 변이체는 뒤이어 그 발현의 강도에 기초하여 배열된 프로모터 래더로 조직화된다(예를 들어, 상부 근처의 고도로 발현된 변이체 및 하부 근처의 약화된 발현에 의해, 따라서 "래더"라는 용어를 유도한다).
일부 실시태양에서, 본 발명은 확인된 자연 발생 프로모터 및 돌연변이된 변이체 프로모터의 조합인 프로모터 래더를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 기준을 모두 만족하는: 1) 구조성 프로모터의 래더를 나타내며; 2) 이상적으로 100개 염기쌍 미만의 짧은 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있는 자연, 고유 또는 야생형 프로모터를 확인하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 구조성 프로모터는 두 개의 선택된 성장 조건 (전형적으로, 산업용 재배 동안 경험된 조건들 간에 비교됨)에 걸쳐 일정한 유전자 발현을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 ~60 염기쌍 코어 프로모터 및 26-40 염기쌍 길이의 5' UTR로 구성될 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 확인된 자연 발생 프로모터 서열 중 하나 이상이 유전자 편집을 위해 선택된다. 일부 실시태양에서, 자연 프로모터는 임의의 공지된 유전자 돌연변이 방법을 통해 편집된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 원하는 서열을 갖는 새로운 프로모터 변이체를 합성함으로써 편집된다.
2015년 12월7일 출원된 미국 특허 출원 제62/264,232호 및 2016년 12월7일자로 출원된 PCT/US16/65464(PCT 공개 번호 WO2017/100376)의 전체 개시 내용은 모든 목적을 위해 각각 본 발명에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 프로모터의 비 제한적인 목록이 하기 표 1에 제공된다. 표 1의 프로모터 서열의 각각은 이종 프로모터 또는 이종 프로모터 폴리뉴클레오타이드로 지칭될 수 있다.
본 발명의 선택된 프로모터 서열
SEQ ID No. 프로모터 단축 명칭
1 P1
2 P2
3 P3
4 P4
5 P5
6 P6
7 P7
8 P8
일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 표 1로부터의 프로모터 서열과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
원핵 생물 헤모글로빈 유전자
본 발명에 제공된 방법에서 사용하기 위한 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 라이브러리가 본 발명에 제공된다. 원핵 생물 헤모글로빈의 라이브러리는 하나 이상의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 포함할 수 있다. 라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 천연 형태 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이 형태는 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형체(SNP) 또는 전좌로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 박테리아 헤모글로빈 유전자일 수 있다. 박테리아 헤모글로빈 유전자는 당업계에 공지된 임의의 박테리아 헤모글로빈 유전자일 수 있다. 박테리아 헤모글로빈 유전자는, 예를 들어, WO1992003546 및 US6759218과 같은 문헌에 보고된 바와 같은 그들의 특성에 기초하여 박테리아 헤모글로빈 라이브러리의 생성을 위해 선택될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 발명에 참조로 포함된다. 숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 한 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 에어로모나스(Aeromonas), 아퀴펙스(Aquifex), 칸디다투스(Candidatus), 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리듐(Clostridium), 노보스핀고비움(Novosphingobium), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 바트레오실라(Vitreoscilla), 바실러스(Bacillus), 코리네박테리움(Corynebacterium glutamicum), 아조토박터(Azotobacter), 고르도니아(Gordonia), 하살리아(Hassallia), 허크홀데리아(Hurkholderia), 데이노콕쿠스(Deinococcus), 에르위니아(Erwinia), 에스체르치아(Escherchia), 피스체렐라(Fischerella), 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum), 노스톡(Nostoc), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 파에오박터(Phaeobacter), 수도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 살모넬라(Salmonella), 산다라시누스(Sandaracinus), 쉬와넬라(Shewanella), 시겔라(Shigella), 시노르히조비움(Sinorhizobium), 스피로소마(Spirosoma), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 설푸리모나스(Sulfurimonas), 터모비피다(Thermobifida), 비브리오(Vibrio), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 또는 이의 조합의 임의의 균주/종/아종으로부터의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 한 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 유기체 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 포함한다. 본 발명에 제공된 바와 같이 헤모글로빈 유전자의 라이브러리에 포함시키기 위해 표 2에 열거된 유기체로부터의 헤모글로빈 유전자는 본 발명에 제공된 바와 같은 숙주 세포에서의 발현을 위해 본 발명에 기술된 바와 같이 코돈 최적화될 수 있다.
박테리아 헤모글로빈(Hb) 및 플라보헤모글로빈(flavoHB) 유전자를 함유하는 유기체.
유기체 유전자 형태
Aeromonas molluscorum 헤모글로빈
Aquifex aeolicus 헤모글로빈
Campylobacter jejuni HCTC11168 헤모글로빈
Clostridium perfringens hyp27 헤모글로빈
Corynebacterium glutamicum　 헤모글로빈
Novosphingobium aromaticivorans 헤모글로빈
Rhodopseudomonas palustris 헤모글로빈
Gordonia terrae C-6 헤모글로빈
Vitreoscilla stercoraria 헤모글로빈
Spirosoma radiotolerans 헤모글로빈
Shewanella loihica (strain ATCC BAA-1088 / PV-4) 헤모글로빈
Sulfurimonas gotlandica (strain DSM 19862 / JCM 16533 / GD1) 헤모글로빈
Sandaracinus amylolyticus 헤모글로빈
Fischerella sp. JSC-11 헤모글로빈
Candidatus Entotheonella sp. TSY1 헤모글로빈
Hassallia byssoidea VB512170 헤모글로빈
Phaeobacter gallaeciensis DSM 26640 헤모글로빈
Azotobacter vinelandii 플라보헤모글로빈
Bacillus anthracis　A2012 플라보헤모글로빈
Bacillus halodurans　C-125 플라보헤모글로빈
Bacillus subtilis　168trpC2 플라보헤모글로빈
Burkholderia fungorum 플라보헤모글로빈
Burkholderia　sp. TH2 플라보헤모글로빈
Corynebacterium glutamicum　ATCC 13032 플라보헤모글로빈
Deinococcus radiodurans 플라보헤모글로빈
Erwinia chrysanthemi 플라보헤모글로빈
Escherichia coli　MG1655 플라보헤모글로빈
Magnetospirillum magnetotacticum 플라보헤모글로빈
Nostoc punctiforme 플라보헤모글로빈
Oceanobacillus iheyensis 플라보헤모글로빈
Pseudomonas fluorescens 플라보헤모글로빈
Pseudomonas aeruginosa　PAO1 플라보헤모글로빈
Ralstonia eutropha 플라보헤모글로빈
Ralstonia metallidurans 플라보헤모글로빈
Ralstonia solanacearum 플라보헤모글로빈
Salmonella enterica　serovar Typhi 플라보헤모글로빈
Salmonella enterica　serovar Typhimurium 플라보헤모글로빈
Shigella flexneri 2a　str. 301 플라보헤모글로빈
Sinorhizobium meliloti 플라보헤모글로빈
Staphylococcus aureus　N315 플라보헤모글로빈
Staphylococcus aureus　subsp. aureus MW2 플라보헤모글로빈
Staphylococcus. aureus　MU50 플라보헤모글로빈
Streptomyces coelicolor　A3 플라보헤모글로빈
Streptomyces coelicolor　A3 플라보헤모글로빈
Streptomyces coelicolor　A3 cosmid J11 플라보헤모글로빈
Thermobifida fusca 플라보헤모글로빈
Vibrio cholerae 플라보헤모글로빈
Vibrio parahamolyticus 플라보헤모글로빈
Xylella fastidiosa　9a5c 플라보헤모글로빈
Yersinia pestis　OC92 플라보헤모글로빈
한 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 헤모글로빈 유전자는 본 발명에 제공된 헤모글로빈 유전자와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
한 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 또는 이의 조합으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 헤모글로빈 유전자에 의해 암호화된 헤모글로빈 폴리펩타이드는 본 발명에 제공된 헤모글로빈 폴리펩타이드와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 기능적으로 연결될 수 있거나 또는 천연 프로모터 또는 천연 프로모터의 돌연변이 형태의 제어하에 있을 수 있다. 라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 본 발명에 제공된 임의의 프로모터에 기능적으로 연결되거나 제어될 수 있다. 라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 서열을 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 제어될 수 있다. 라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 서열을 함유하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 제어될 수 있다. 한 실시태양에서, 라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 한 세트로 존재하며, 각 세트는 SEQ ID NO. 1에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자, SEQ ID NO. 2에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자, SEQ ID NO. 3에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자, SEQ ID NO. 4에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자, SEQ ID NO. 5에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자, SEQ ID NO. 6에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자, SEQ ID NO. 7에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자 및 SEQ ID NO. 8에 기능적으로 연결된 하나의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자 또는 이의 조합을 가진다. 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 라이브러리에서 각 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 키메릭 구조체에 존재할 수 있어서 유전자가 하나 이상의 조절 서열 및/또는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 서열과 상동성인 서열에 의해 측면에 위치될 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 서열과 상동성인 서열은 상보적 서열을 포함하는 숙주 세포 게놈의 부위 또는 좌위 속에 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 통합을 용이하게 할 수 있다. 통합은 재조합 이벤트를 통해 이루어질 수 있다. 조절 서열은 숙주 세포의 유전자 기계에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 조절 서열일 수 있다. 종결 서열은 SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 22로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서 후보 원핵 생물 헤모글로빈은 당업계에 공지된 하나 이상의 원핵 생물 헤모글로빈과의 유사성에 기초하여 본 발명에 제공된 라이브러리 또는 방법에 포함시키기 위해 선택된다. 유사성은 예를 들어 BLAST 알고리즘과 같은 핵산 또는 단백질 서열 간의 서열 정렬을 수행하는 당업계에 공지된 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 비트레오실라 스테르코카리아로부터의 헤모글로빈의 아미노산 서열은 BLAST 알고리즘을 사용하여 TREMBL 단백질 데이터베이스 검색을 씨드하기 위해 사용될 수 있다. 씨드된 헤모글로빈(예를 들어, 비트레오실라 스테르코카리아로부터의 헤모글로빈의 아미노산 서열)과 특정 유사성을 갖는 모든 후보 헤모글로빈이 선택될 수 있다. 특정 유사성은 일반적으로 씨드(예컨대, 비트레오실라 스테르코카리아로부터의 헤모글로빈의 아미노산 서열)로서 사용된 헤모글로빈과 정렬되는 후보 헤모글로빈이 선택되는 임계치일 수 있다. 일부 경우에, BLAST 알고리즘이 사용되며, 씨드 헤모글로빈(예를 들어, 비트레오실라 스테르코카리아로부터의 헤모글로빈의 아미노산 서열)과 일반적으로 일치하는 후보 헤모글로빈은 5의 BLAST E-값을 가진 헤모글로빈이다. 뒤이어, 세트 내의 각각의 선택된 후보 서열 사이의 쌍 정렬은 세트 내의 임의의 다른 서열과 각 서열을 연관시키는 유사성 스코어를 생성하도록 수행될 수 있다. 쌍 정렬은 예를 들어, http://efi.igb.illinois.edu/efi-est/에서 이용 가능한 온라인 도구와 같은 당업계에 공지된 임의의 쌍 정렬 도구를 사용하여 수행될 수 있다. 선택된 후보는 다소 유사한 후보 서열의 세트로 하위 그룹화될 수 있다. 하위 그룹화는, 예를 들어, 소프트웨어 도구 사이토스케이프(cytoscape.org)와 같은 클러스터링 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 그런 다음 각 하위 그룹으로부터의 대표 후보는 라이브러리에 존재할 수 있는 서열의 다양성을 극대화하도록 선택될 수 있다. 각각의 선택된 후보 헤모글로빈은 본 발명에 제공된 바와 같이 헤모글로빈 유전자의 라이브러리에 후속 포함을 위해 본 발명에 기술된 바와 같이 최적화된 상응하는 핵산 서열 코돈을 가질 수 있다.
원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 돌연변이 형태 생성
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에서 사용하기 위한 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 이것이 유래되는 유전자의 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 유전자는 당업계에 공지되어 있거나 본 발명에 제공된 임의의 방법으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 게놈 DNA의 선택된 부분을 도입, 결실 또는 치환함으로써 세포 집단을 돌연변이시키는 것을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 돌연변이를 특정 좌위(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)에 표적화하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA 영역을 선택적으로 편집하기 위해 ZFN, TALENS 또는 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술의 사용을 교시한다. 세포 집단의 돌연변이에 이어서, 표적화된 돌연변이는 세포로부터 단리될 수 있고 이어서 본 발명에 기술된 바와 같이 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 외부에서 선택된 DNA 영역(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)을 돌연변이시키는 것을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 돌연변이시키는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, DNA의 선택된 영역은 천연 변이체의 유전자 셔플링 (shuffling) 또는 합성 올리고(oligos), 플라스미드-플라스미드 재조합, 바이러스 플라스미드 재조합 또는 바이러스-바이러스 재조합과의 셔플링을 통해 시험관 내에서 생산된다. 다른 실시태양에서, 게놈 영역은 에러가 발생하기 쉬운 PCR 또는 부위-지정 돌연변이 유발을 통해 생산된다.
일부 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 함유하는 선택된 유전 영역에서 돌연변이를 생성하는 것은 "재조합 PCR"에 의해 달성된다. 간략히, 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligos)는 관심 핵산 서열(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)의 단편의 PCR 증폭을 위해 합성되어, 올리고뉴클레오타이드의 서열은 두 개의 단편의 접합부와 중첩된다. 중첩 영역은 전형적으로 약 10 내지 100 뉴클레오타이드 길이이다. 각 단편은 이러한 프라이머 세트로 증폭된다. 그런 다음 PCR 생성물은 조립 프로토콜에 따라 "재조립"된다. 요약하면, 조립 프로토콜에서, PCR 생성물은 먼저, 예를 들어, 겔 전기 영동 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 프라이머로부터 정제된다. 정제된 생성물을 함께 혼합하고 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오시드 삼인산염(dNTP's) 및 추가 프라이머의 부존재("셀프 프라이밍(self-priming)")시 적절한 버퍼 염의 존재하에서 약 1-10 사이클의 변성, 재어닐링 및 연장을 실시한다. 유전자에 인접한 프라이머를 이용한 후속 PCR은 완전 재조합 및 셔플 유전자의 수율을 증가시키는데 사용된다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 위에서 논의된 것과 같은 돌연변이 원핵 생물 헤모글로빈 DNA 영역은 다중 돌연변이 스펙트럼, 즉 돌연변이의 가능한 조합이 보다 효율적으로 표본 추출되도록 돌연변이체 서열에 대해 농축된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 서열은 조립 반응 이전에 시험관 내에서 친화도-정제 물질을 증폭하는 바람직한 단계로 mutS 단백질 친화성 매트릭스를 통해 동정된다(Wagner et al., Nucleic Acids Res. 23(19):3944-3948 (1995); Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 83:5057-5061(1986)). 이 증폭된 물질은 조립 또는 재조립 PCR 반응에 투입된다.
원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 포함하는 라이브러리의 생성
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입 및/또는 교체 및/또는 결실하는 것을 교시한다. 일부 양태에서, 본 발명에서 교시된 방법은 숙주 유기체의 게놈에 혼입될 수 있는 관심 올리고뉴클레오타이드(즉, 원핵 생물 헤모글로빈 단편)를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 원핵 생물 헤모글로빈 DNA 절편은 공지된 주형으로부터의 복제 또는 절단, 돌연변이 또는 DNA 합성을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 수득될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열(예를 들어, GeneArtTM, GeneMakerTM, GenScriptTM, AnagenTM, Blue HeronTM, EntelechonTM, GeNOsys, Inc., 또는 QiagenTM)을 생산하기 위한 상용 유전자 합성 생성물과 양립 가능성이 있다.
일부 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 DNA 단편은 원핵 생물 헤모글로빈 유전자 DNA 단편을 숙주 유기체의 선택된 DNA 영역에 혼입시키도록 디자인된다. 선택된 DNA 영역은 중립적인 통합 부위가 될 수 있다. 다른 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 DNA 단편은 숙주 유기체의 DNA로부터 천연 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 제거하도록 디자인된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용된 원핵 생물 헤모글로빈 유전자는 당업계에 공지된 임의의 효소적 또는 화학적 합성 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로서 단계적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 제어된 공극 유리(CPG), 폴리스티렌 비드 또는 CPG를 함유할 수 있는 열가소성 폴리머로 구성된 막과 같은 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 어레이 상에서, 마이크로 유체(Tian et al., Mol. BioSyst., 5, 714-722 (2009))를 사용하는 병렬 마이크로스케일 상에서, 또는 모두의 조합을 제공하는 공지된 기술(제이콥슨 등. 미국 특허 출원 제2011/0172127호 참조)을 사용하여 합성될 수 있다.
어레이 상의 또는 마이크로 유체를 통한 합성은 보다 낮은 시약 사용을 통해 비용을 감소시킴으로써 종래의 고체 지지체 합성에 비해 이점을 제공한다. 유전자 합성에 필요한 규모가 작으므로 어레이 또는 마이크로 유체를 통해 합성된 올리고 뉴클레오타이드 생성물의 규모가 허용할만하다. 그러나, 합성된 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체 합성을 사용할 때보다 품질이 떨어진다(이하에서 티안 참조; 또한 스태힐러 등, 미국 특허 출원 제2010/0216648호 참조).
1980년대에 처음으로 기술되었기 때문에, 종래의 4 단계 포스포아미다이트 화학에서 큰 진전이 성취되었다(예를 들어, Sierzchala, et al.　J. Am. Chem. Soc., 　125, 13427-13441 (2003) using peroxy anion deprotection; Hayakawa et al., U.S. Pat. No. 6,040,439 for alternative protecting groups; Azhayev et al,　Tetrahedron 　57, 4977-4986 (2001) for universal supports; Kozlov et al.,　Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 　24 (5-7), 1037-1041 (2005) for improved synthesis of longer oligonucleotides through the use of large-pore CPG; and Damha et al.,　NAR, 　18, 3813-3821 (1990) for improved derivatization 참조).
합성 유형에 관계 없이, 생성된 올리고뉴클레오타이드는 더 긴 폴리뉴클레오타이드(즉, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자)에 대한 보다 작은 빌딩 블록을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 보다 작은 올리고뉴클레오타이드는 중합 효소 연쇄 조립(PCA), 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 열역학적으로 균형 잡힌 내측 합성(TBIO)과 같은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 함께 결합될 수 있다(Czar et al. Trends in Biotechnology, 27, 63-71 (2009) 참조). PCA에서, 원하는 긴 생성물의 전체 길이에 걸쳐 있는 올리고뉴클레오타이드는 어닐링되고 여러 사이클(일반적으로 약 55 사이클)에서 연장되어 결국 최종 전장 생성물을 얻는다. LCR은 리가아제 효소를 사용하여 세 번째 올리고 뉴클레오타이드에 모두 어닐링되는 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 연결한다. TBIO 합성은 원하는 생성물의 중심에서 시작하여 유전자의 5'말단에서 순방향 가닥과 상동성이 있고 유전자의 3' 말단에서 역방향 가닥과 대항하는 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 점진적으로 양방향으로 연장된다.
더 큰 이중 가닥 DNA 단편을 합성하는 다른 방법은 상부-가닥 PCR(TSP)을 통해 더 작은 올리고뉴클레오타이드를 결합하는 것이다. 이 방법에서, 복수의 올리고뉴클레오타이드는 원하는 생성물의 전체 길이에 걸쳐 있고 인접한 올리고뉴클레오타이드(들)에 중첩 영역을 함유한다. 증폭은 범용 순방향 및 역방향 프라이머로 수행될 수 있으며, 증폭의 다중 사이클을 통해 전장 이중 가닥 DNA 생성물이 형성된다. 그런 다음 이 생산은 선택적 오류 수정 및 추가 증폭을 수행하여 원하는 이중 가닥 DNA 단편 최종 생성물을 생성할 수 있다.
TSP의 한 방법에서, 전장 길이의 원하는 생성물을 형성하도록 결합될 더 작은 올리고뉴클레오타이드의 세트는 40-200 염기 길이이고 적어도 약 15-20 염기만큼 서로 중첩된다. 실제적인 목적을 위해, 중첩 영역은 올리고뉴클레오타이드의 특정 어닐링을 보장할 수 있을 만큼 길어야 하고, 사용된 반응 온도에서 어닐링하기에 충분히 높은 용융 온도(Tm)를 가져야 한다. 중첩은 소정의 올리고뉴클레오타이드가 인접한 올리고뉴클레오타이드에 의해 완전히 중첩되는 지점까지 연장될 수 있다. 중첩의 양은 최종 생성물의 품질에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 조립의 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드 빌딩 블록은 순방향 및 역방향 증폭 프라이머에 대한 결합 부위를 함유해야 한다. 한 실시태양에서, 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드의 말단 서열은 보편적 프라이머의 사용을 허용하기 위해 상보성의 동일한 서열을 함유한다.
플라스미드의 조립/복제
일부 실시태양에서, 본 발명은 원하는 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 숙주 유기체의 게놈에 삽입할 수 있는 벡터를 제조하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 삽입 DNA(예를 들어, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자), 상동성 암 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 벡터를 복제하는 방법을 교시한다. (도 1 참조).
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체로의 형질 전환에 적합한 임의의 벡터와 양립 가능하다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포와 양립 가능한 셔틀 벡터의 사용을 교시한다. 한 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 셔틀 벡터는 대장균 및/또는 코리네박테리움 숙주 세포와 양립 가능한 셔틀 벡터이다. 본 발명에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 셔틀 벡터는 본 발명에 기술된 바와 같은 선택 및/또는 카운터-선택을 위한 마커를 포함할 수 있다. 표지는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에서 제공된 임의의 표지일 수 있다. 셔틀 벡터는 당업계에 공지된 바와 같은 상기 셔틀 벡터의 조립에 유용한 임의의 조절 서열 및/또는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 셔틀 벡터는 예를 들어 대장균 또는 C. 글루타미쿰과 같은 본 발명에 제공된 바와 같은 숙주 세포에서 증식에 필요할 수 있는 임의의 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 조절 서열은 숙주 세포의 유전 공학에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 조절 서열일 수 있다. 종결 서열은 SEQ ID NO: 20 또는 21일 수 있다. 특정 예에서, 표적 DNA는 상용 벡터(예를 들어, DNA2.0 custom 또는 GATEWAY® 벡터)와 같은 임의의 저장소 또는 카탈로그 생성물로부터 수득 가능한 벡터, 구조체 또는 플라스미드에 삽입될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조립/복제 방법은 다음 조립 전략 중 적어도 하나를 사용할 수 있다: i) II형 통상적인 복제, ii) II형 S-매개 또는 "골든 게이트" 복제(예를 들어, Engler, C., R. Kandzia, and S. Marillonnet. 2008 "A one pot, one step, precision　cloning method with high throughput capability". PLos One 3:e3647; Kotera, I., and T. Nagai. 2008 "A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS　restriction enzyme." J Biotechnol 137:1-7; Weber, E., R. Gruetzner, S. Werner, C. Engler, and S. Marillonnet. 2011 Assembly of Designer TAL Effectors by　Golden Gate　Cloning. PloS One 6:e19722 참조), iii) GATEWAY® 재조합, iv) TOPO®　복제, 엑소누클레아제-매개 조립(Aslanidis and de Jong 1990. "Ligation-independent　cloning　of PCR products (LIC-PCR)." Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 20 6069), v) 상동성 재조합, vi) 비 상동성 말단 결합, 또는 이의 조합. 모듈형 IIS 기반 어셈블리 전략은 PCT 공개 공보 WO 2011/154147에 개시되어 있으며, 이의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 선택 마커를 갖는 벡터의 복제를 교시한다. 다양한 선별 마커 유전자는 선택적 압력하에서 원핵 세포(예컨대, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 제오신, 스펙티노마이신/스트렙토마이신) 또는 진핵 세포(예컨대, 제네티신, 네오마이신, 하이그로마이신, 푸로마이신, 블라 스티신, 제오신)에서 선택을 위한 항생제 내성 기능을 주로 암호화하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 다른 마커 시스템은 성공적으로 형질도입된 숙주 세포에서 발현된 X-gal 또는 녹색 또는 적색 형광 단백질과 같은 형광 리포터의 존재하에서 양성 클론을 선택하기 위해 박테리아에서 사용되는 주지된 청색/백색 스크리닝 시스템과 같은 원하거나 원하지 않는 세포의 선별 및 동정을 허용한다. 대다수가 원핵 생물 시스템에서만 기능하는 선별 마커의 또 다른 부류는 생산자 세포를 죽이는 독성 유전자 생성물을 발현하는 "사멸 유전자"라고도하는 선택 가능한 마커 유전자에 관한 것이다. 이러한 유전자의 예는 sacB, rpsL (strA), tetAR, pheS, thyA, gata-1 또는 ccdB를 포함하며, 이의 기능은 (Reyrat et al. 1998 "Counterselectable Markers: Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis." Infect Immun. 66(9): 4011-4017)에 기술된다.
한 실시태양에서, 표적 DNA 절편이 복제되는 벡터는 본원에서 제공되는 프로모터 래더 또는 라이브러리로부터의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 서열을 포함하거나 함유하는 프로모터가 본 발명에 제공된다. 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 숙주 미생물에서 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 과다 발현 또는 과소 발현하기 위해 각각의 경우에 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 이종 원핵 생물 헤모글로빈을 포함하는 각각의 생성된 균주는 본 발명의 하나 이상의 기준(예를 들어, 관심 생체 분자 또는 생성물의 성장 및/또는생산성)하에서 배양되고 분석된다. 각각의 분석된 숙주 균주로부터의 데이터는 특정 원핵 생물 헤모글로빈과 관련/상호 연관되어 미래의 사용을 위해 기록된다. 따라서, 본 발명은 관심 미생물 유전적 또는 표현형 특질의 임의의 수에 대한 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 효과를 확인하는 크고 고도로 주석된 유전적 다양성 라이브러리/저장소의 생성을 가능하게 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 개시 및/또는 정지 코돈 변형체에 의한 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 복제하기 위한 벡터의 사용을 교시하여 복제된 유전자는 개시 및/또는 정지 코돈 변형체를 사용한다. 예를 들어, S. 세레비시애 및 포유 동물에 대한 전형적인 정지 코돈은 각각 UAA 및 UGA이다. 단엽 식물에 대한 전형적인 정지 코돈은 UGA인 반면, 곤충과 대장균은 일반적으로 정지 코돈으로서 UAA를 사용한다(Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218).
한 실시태양에서, 제공된 본 발명의 방법은 숙주 유기체에 의해 발현된 하나 이상의 유전자를 최적화하는 코돈을 포함한다. 다양한 숙주에서 발현을 향상시키기 위해 코돈을 최적화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌에 기술된다(그 전체가 본 발명에 참조로 포함된 미국 특허출원 공개공보 제2007/0292918호 참조). 특정 원핵 또는 진핵 숙주(Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res.17 : 477-508 참조)에 의해 선호되는 코돈을 함유하는 최적화된 암호화 서열은, 예를 들어, 번역 속도를 증가시키거나 또는 최적화되지 않은 서열로부터 생산된 전사체와 비교할 때, 더 긴 반감기와 같은 바람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생성하도록 제조된다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 헤모글로빈 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 대장균 및/또는 C. 글루타미쿰과 같은 본 발명에 제공된 숙주 세포에서 번역에 최적화된 분자 코돈을 포함한다. 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 단리된, 합성된 또는 재조합 핵산일 수 있다. 코돈 최적화된 헤모글로빈 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 2에 열거된 유기체로부터 선택될 수 있다. 코돈 최적화된 헤모글로빈 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 표 2에 열거된 유기체로부터 선택된 헤모글로빈 폴리펩타이드에 대해 폴리펩타이드 서열을 암호화하는데 코돈 최적화된 헤모글로빈 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 제공된다. 일부 경우에, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 34로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 암호화하는데 코돈 최적화된 헤모글로빈 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 제공된다. 본 발명에 제공된 코돈 최적화된 헤모글로빈 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 GenScript's OptimumGeneTM 유전자 설계 시스템 또는 DNA2.0 GeneGPS® 발현 최적화 기술과 같은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
단백질 발현은 전사, mRNA 프로세싱 및 안정성 및 번역 개시에 영향을 미치는 인자를 포함하는 다수의 인자에 의해 지배된다. 따라서 최적화는 임의의 특정 유전자의 많은 서열 특징의 임의의 것을 처리할 수 있다. 특정 예로서, 드문 코돈 유도 번역 일시 중지는 감소된 단백질 발현을 초래할 수 있다. 드문 코돈 유도 번역 일시 중지는 숙주 유기체에서 거의 사용되지 않는 관심 폴리뉴클레오타이드에서 코돈의 존재를 포함하며 이용가능한 tRNA 풀에서의 희소성 때문에 단백질 번역에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
대안적인 번역 개시는 또한 감소된 이종 단백질 발현을 초래할 수 있다. 대안적인 번역 개시는 의도하지 않게 리보솜 결합 부위(RBS)로서 기능할 수 있는 모티프를 함유하는 합성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이런 위치는 유전자 내부 위치로부터 잘린 단백질의 번역을 시작할 수 있다. 정제 과정에서 제거하기 어려울 수 있는 절단된 단백질을 생산할 가능성을 줄이는 한 가지 방법은 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 내부 RBS 서열을 제거하는 것을 포함한다.
반복체-유도된 폴리머라제의 슬리파지(slippage)는 감소된 이종 단백질 발현을 초래할 수 있다. 반복체-유도된 폴리머라제의 슬리파지는 프레임변이 돌연변이를 초래할 수 있는 DNA 폴리머라제의 슬리파지 또는 스터터링(stuttering)을 유발하는 것으로 밝혀진 뉴클레오타이드 서열 반복체를 필요로 한다. 이러한 반복체는 또한 RNA 폴리머라제의 슬리파지를 유발할 수 있다. 높은 G+C 함량 편향을 갖는 유기체에서, G 또는 C 뉴클레오타이드 반복체로 구성된 더 높은 등급의 반복체가 존재할 수 있다. 따라서, RNA 폴리머라제의 슬리파지를 유도하는 가능성을 줄이는 한 가지 방법은 G 또는 C 뉴클레오타이드의 연장된 반복체를 변경하는 것을 포함한다.
2차 구조를 간섭하면 또한 감소된 이종 단백질 발현을 초래할 수 있다. 2차 구조는 RBS 서열 또는 개시 코돈을 격리할 수 있고 단백질 발현의 감소와 상관관계가 있다. 스템루프 구조는 또한 전사 일시 중지 및 약화에 관여할 수 있다. 최적화 된 폴리뉴클레오타이드 서열은 RBS 내에 최소 2차 구조 및 뉴클레오타이드 서열의 유전자 암호화 영역을 함유하여 개량된 전사 및 번역을 가능하게 한다.
예를 들어, 최적화 공정은 숙주에 의해 발현되는 원하는 아미노산 서열을 확인함으로써 시작될 수있다. 아미노산 서열로부터 후보 폴리뉴클레오타이드 또는 DNA 서열이 디자인될 수 있다. 합성 DNA 서열의 디자인 동안, 코돈 사용의 빈도는 숙주 발현 유기체의 코돈 사용과 비교될 수 있고 드문 숙주 코돈은 합성 서열로부터 제거될 수있다. 또한, 합성 후보 DNA 서열은 바람직하지 않은 효소 제한 부위를 제거하고 원하는 신호 서열, 링커 또는 비번역 영역을 추가 또는 제거하기 위해 변형될 수 있다. 합성 DNA 서열은 G/C 반복체 및 스템-루프 구조와 같이 번역 과정을 방해할 수 있는 2차 구조의 존재에 대해 분석될 수 있다.
숙주 세포의 형질 전환
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 형질 전환, 형질 감염, 형질 도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti 매개 유전자 전달을 포함하는 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 방법은 인산 칼슘 형질 감염, DEAE-덱스트란 매개 형질 감염, 형질 주입 또는 전기 천공을 포함한다(Davis, L., Dibner, M., Battey, I. 1986 "Basic Methods in Molecular Biology"). 형질 전환의 다른 방법은 예를 들어, 아세트산 리튬 형질 전환 및 전기 천공을 포함한다. 예를 들어, Gietz et al.,　Nucleic Acids Res.　27:69-74 (1992); Ito et al.,　J. Bacterol.　153:163-168 (1983); and Becker and Guarente,　Methods in Enzymology　194:182-187 (1991) 참조. 일부 실시태양에서, 형질 전환된 숙주 세포는 재조합 숙주 균주로 불린다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 96-웰 플레이트 로봇 플랫폼 및 액체 처리 기계를 사용하는 세포의 고 처리량 형질전환을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 하나 이상의 선택 마커로 형질전환된 세포를 선별하는 것을 교시한다. 이런 한 실시태양에서, 카나마이신 내성 마커(KanR)를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포는 유효량의 카나마이신 항생제를 함유하는 배지 상에 덮인다. 카나마이신-레이스(kanamycin-laced) 배지에서 볼 수 있는 콜로니 형성 단위는 벡터 카세트를 게놈에 통합시킨 것으로 추정된다. 원하는 서열의 삽입은 PCR, 제한 효소 분석 및/또는 관련 삽입 위치의 서열화를 통해 확인될 수 있다.
선택된 서열의 루핑 아웃
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체로부터 DNA의 선택된 영역을 루핑 아웃하는 방법을 교시한다. 루핑 아웃 방법은 Nakashima et al. 2014 "Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing." Int. J. Mol. Sci. 15(2), 2773-2793에 기술될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 양성 형질전환 체로부터 선택 마커를 루핑 아웃하는 것을 교시한다. 루핑 아웃 결실 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며 (Tear et al. 2014 "Excision of Unstable Artificial Gene-Specific inverted Repeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli." Appl. Biochem. Biotech. 175:1858-1867)에 기술된다. 본 발명에서 제공된 방법에 사용된 루핑 아웃 방법은 단일-교차 상동성 재조합 또는 이중-교차 상동성 재조합을 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명에 기술된 바와 같이 선택된 영역을 루핑하는 것은 본 발명에 기술된 바와 같이 단일-교차 상동성 재조합을 사용하는 것을 수반할 수 있다.
먼저, 루프 아웃 벡터가 (예를 들어 상동성 재조합, CRISPR 또는 다른 유전자 편집 기술을 통해) 숙주 유기체의 게놈 내의 선택된 표적 영역 내로 삽입된다. 한 실시태양에서, 단일-교차 상동성 재조합이 도 1에 도시된 바와 같은 원형 플라스미드 또는 벡터를 루프-인(loop-in)시키기 위해 원형 플라스미드 또는 벡터와 숙주 세포 게놈 사이에 사용된다. 삽입된 벡터는 현존하는 또는 숙주 서열 근처에 도입된 직접 반복체인 서열을 갖도록 디자인되어, 직접 반복체가 루핑 및 결실이 예정된 DNA의 영역에 인접하게 된다. 일단 삽입되면, 루프 아웃 플라스미드 또는 벡터는 선택 영역의 결실을 위해 역 선택될 수 있다(예를 들어, 도 2 참조; 선택 유전자에 대한 내성의 결핍).
숙주 미생물
본 발명에서 제공된 게놈 공학적 방법은 산업적 미생물 세포 배양으로 예시되지만, 원하는 형질이 유전적 돌연변이 집단에서 동정될 수 있는 임의의 유기체에 적용 가능할 수 있다.
따라서, 본 발명에 사용된 용어 "미생물"은 광범위하게 해석되어야 한다. 미생물은 두 가지 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 균류와 원생 생물을 포함한다. 그러나, 특정 양태에서, 곤충, 식물 및 동물과 같은 "보다 높은" 진핵생물이 본 발명에 교시된 방법에서 이용될 수 있다.
적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 조류 세포, 식물 세포, 균류 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 예시적인 실시태양에서, 적합한 숙주 세포는 대장균(예를 들어, 매사추세츠주, 입스위치의 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)로부터 구입가능한 SHuffle™ competent E. coli)을 포함한다.
본 발명의 다른 적합한 숙주 유기체는 코리네박테리움 속의 미생물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 바람직한 코리네박테리움 균주/종은 기탁된 유형 균주가 DSM44549인 C. 에피센스(C. efficiens), 기탁된 유형 균주가 ATCC13032인 C. 글루타미쿰(C. glutamicum) 및 기탁된 유형 균주가 ATCC6871인 C. 암모니아게네스(C. ammoniagenes)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 바람직한 숙주는 C. 글루타미쿰이다.
특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 코리네박테리움 속의 적합한 숙주 균주는 특히 공지된 야생형 균주이다: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필럼 ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노게 네스 FERM BP- 1539, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869 및 브레비박테리움 다이바리카툼 ATCC14020; 및 예를 들어, L-리신 생산 균주로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주: 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM P-1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464, 코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1, 코리네박테리움 글루타미쿰 DG52-5, 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5714 및 코리네박테리움 글루타미 쿰 DSM12866.
용어 "마이크로콕쿠스 글루타미쿠스"는 C. 글루타미쿰에도 사용되어 왔다. C. 에피시엔스 종의 일부 대표는 또한 예를 들어, 균주 FERM BP-1539와 같은 종래 기술에서 C. 써모아미노게네스로 불려왔다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 적합한 진핵생물 숙주 세포는 곰팡이 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 동물 세포 및 식물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 균류 숙주 세포는 아세코코타 (Ascomycota), 담자균(Basidiomycota), 신생 균주(Deuteromycota), 접합체 진균 (Zygomycota), 진균 무균(Fungi imperfecti)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 바람직한 숙주 세포는 효모 세포 및 사상 균류 세포를 포함한다. 적합한 사상 균류 숙주 세포는 예를 들어 유마이코티나(Eumycotina) 및 오마이코타(Oomycota) 세분의 임의의 섬유상 형태를 포함한다. (예를 들어, 참조로 본 발명에 포함된 Hawksworth et al., In Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th　edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 참조). 사상 균류는 키틴, 셀룰로오스 및 다른 복합 다당류로 구성된 세포벽을 갖는 식물성 균사체를 특징으로 한다. 사상 균류 숙주 세포는 효모와 형태학적으로 구별된다.
특정 예시적이고 비 제한적인 실시태양에서, 사상 균류 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 볼바리엘라(Volvariella), 또는 텔레오모르프(teleomorphs), 또는 아나모르프(anamorphs), 이의 동의어 또는 분류학적 동등물의 종의 세포일 수 있다.
적합한 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세누라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces,), 피키아(Pichia), 클루베로마이세스(Kluyveromyces) 및 야로비아(Yarrowia)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 효모 세포는 한세누라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르젠시스(Saccaromyces carlsbergensis), 사카로마이세스 다이아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코다매(Pichia kodamae), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오프니티애(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 쿠에르쿰(Pichia quercuum), 피치아 피제페리(Pichia pijperi), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 일비칸스(Candida albicans), 또는 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포는 클라미도모나스(Chlamydomonas)(예를 들어, C. 레인하르티(C. Reinhardtii)) 및 포름디움(Phormidium)과 같은 조류(P. sp. ATCC29409)이다.
다른 실시태양에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 적합한 원핵생물 세포는 그람 양성, 그람 음성 및 그람 가변 박테리아 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)의 종일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 균주는 산업용 균주이다. 수많은 박테리아 산업용 균주가 알려져 있고 본 발명에 기술된 방법 및 조성물에 적합하다.
일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 세포는 아그로박테리움 종(예를 들어, A. radiobacter, A. rhizogenes, A. rubi), 아테로박터 종(예를 들어, A. aurescens, A. citreus, A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparaffinus, A. sulfureus, A. ureafaciens), 바실루스 종(예를 들어, B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulars, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans 및　B. amyloliquefaciens)이다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 B. 서브틸리스, B. 푸밀루스, B. 리체니포르미스, B. 메가테륨, B. 클라우실, B. 스테아로써모필루스, 및B. 아밀로리퀴에파시엔스를 포함하나 이에 제한되지 않는 산업용 바실루스일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 클로스트리디움 종(예를 들어, C. acetobutylicum, C. tetani　E88,　C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, C. beijerinckii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 코리네박테리움 종(예를 들어, C. glutamicum, C. acetoacidophilum)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에스체리아치아 종(예를 들어, E. coli)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에르위니아 종(예를 들어, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata, E. terreus)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 판토에아 종(예를 들어, P. citrea, P. agglomerans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 수도모나스 종(예를 들어, P. putida, P. aeruginosa, P. mevalonii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토콕쿠스 종(예를 들어,　S. equisimiles, S. pyogenes, S. uberis)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토마이세스 종(예를 들어, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus, S. lividans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 자이모모나스 종(예를 들어, Z. mobilis, Z. lipolytica) 등일 것이다.
다양한 실시태양에서, 원핵생물 및 진핵생물 균주 모두를 포함하는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 균주는 American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS), 및 Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center(NRRL)와 같은 여러 배양 컬렉션으로부터 대중에게 쉽게 접근될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 다세포 유기체에도 적용 가능하다. 예를 들어, 플랫폼은 작물의 성능을 개량시키는데 사용될 수 있다. 유기체는 그라미니애(Gramineae), 페투코이데애(Fetucoideae), 포아코이데애(Poacoideae), 아그로스티스(Agrostis), 필레움(Phleum), 닥틸리스(Dactylis), 소르검(Sorgum), 세타리아(Setaria), 제아(Zea), 오리자(Oryza), 트라이티쿰(Triticum), 세칼레(Secale), 아베나(Avena), 호르데움(Hordeum), 삭카룸(Saccharum), 포아(Poa), 페스투카(Festuca), 스테노타프룸(Stenotaphrum), 사이노돈(Cynodon), 코익스(Coix), 올리레애(Olyreae), 파레애(Phareae), 콤포시태(Compositae) 또는 레구미노새(Leguminosae)와 같은 복수의 식물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물은 옥수수, 쌀, 콩, 면화, 밀, 호밀, 귀리, 보리, 완두콩, 콩, 렌즈콩, 땅콩, 참마콩, 동부, 벨벳콩, 클로버, 알팔파, 자주개자리, 루핀, 살갈퀴, 등나무, 완두콩, 사탕수수, 수수, 해바라기, 카놀라 등일 수 있다. 마찬가지로, 유기체는 비-인간 포유류, 어류, 곤충 등과 같은 복수의 동물을 포함할 수 있다.
세포 발효 및 배양
본 발명에 기술된 바와 같이 유전자 조작된 것들을 포함하는 본 발명의 미생물은 임의의 바람직한 생합성 반응 또는 선택을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 프로모터를 활성화시키기 위해 배지를 유도하는 배양을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 형질전환체(예를 들어, 항생제)의 선택 제제 또는 억제 조건(예를 들어, 높은 에탄올 조건)하에 성장하기에 적합한 유기체의 선택 제제를 포함하는 선택 제제를 갖는 배지를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 성장을 위해 최적화된 배지에서 세포 배양물을 성장시키는 것을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은, 예를 들어, 관심 생성물 또는 생체 분자와 같이 생산 수율에 최적화된 배지에서 세포 배양물을 성장시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 성장을 유도할 수 있는 배지에서 배양 물을 배양하는 것을 교시하며 최종 생성물 생산을 위한 필수 전구체(예를 들어, 에탄올 생산을 위한 높은 수준의 당)를 포함한다. 본 발명에 제공된 방법에 의해 제조된 생체 분자 또는 관심 생성물은 미생물로부터 제조된 임의의 상용 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 관심 생체 분자 또는 생성물은 의약, 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 글루탐산, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루이신, 메티오닌 또는 라이신일 수 있다. 유기산은 숙신산염, 락트산염 또는 피루브산염일 수 있다. 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다.
온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용하기에 적합한 것들이며, 당업자에게 명백할 것이다. 언급한 바와 같이, 박테리아, 식물, 동물(포유류 포함) 및 고세균 기원 세포를 포함하는 많은 세포의 배양 및 생산에 대한 많은 참고 자료가 이용될 수 있다. 예를 들어, Sambrook, Ausubel (all supra), as well as Berger, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology　volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; and　 Freshney (1994)　Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and the references cited therein; Doyle and Griffiths (1997)　Mammalian Cell Culture: Essential Techniques　John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition W.H. Freeman and Company; and Ricciardelle et al., (1989)　In Vitro Cell Dev. Biol.　25:1016-1024, all of which are incorporated herein by reference. For plant cell culture and regeneration, Payne et al. (1992)　Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems　John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips (eds) (1995)　Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg N.Y.); Jones, ed. (1984)　Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, N.J. and　Plant Molecular Biology　(1993) R. R. D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6 참조하고, 이의 전문은 참조로 본 발명에 포함된다. 일반적으로 세포 배양 배지는 Atlas and Parks (eds.)　The Handbook of Microbiological Media　(1993) CRC Press, Boca Raton, Fla에서 설명되며, 이는 참조로 본 발명에 포함된다. 세포 배양에 대한 추가 정보는 Life Science Research Cell Culture Catalogue　from Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) ("Sigma-LSRCCC") 및, 예를 들어,　The Plant Culture Catalogue　and supplement also from Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) ("Sigma-PCCS")와 같은 구입가능한 상업용 논문에서 발견되며, 이의 전부는 참조로 본 발명에 포함된다.
사용될 배양 배지 또는 발효 배지는 적절한 방식으로 각각의 균주의 요구를 충족시켜야한다. 다양한 유기체에 대한 배양 배지에 대한 설명은 American Bacteriology Society (Washington D.C., USA, 1981)의 "General Bacteriology Methods for Manual"에 제공된다. 용어 배양 배지 및 발효 배지는 상호교환가능하다. 일부 경우에, 본 발명에 제공된 방법에 의해 생산된 유전자 변형된 균주를 성장시키기 위한 배양 배지 또는 발효 배지에 제공된 산소 수준은 야생형 균주 또는 본 발명에서 제공되는 이종 헤모글로빈 유전자를 발현하지 않는 균주에 비해 작을 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생산된 미생물이 원하는 관심 생체 분자 또는 생성물을 생산하기 위한, 예를 들어 WO 05/021772에 기술된 바와 같이 연속적으로 또는 배치 공정(배치 배양) 또는 페드 배치(fed-batch) 또는 반복된 페드 배치에서 불연속적으로 배양될 수 있음을 교시한다. 알려진 배양 방법에 관한 일반적인 내용은 Chmiel(Bioprozeβtechnik. 1: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))에 의한 교과서 또는 Storhas(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 의한 교과서에서 이용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 세포는 배치 또는 연속 발효 조건하에 성장된다. 고전적인 배치 발효는 폐쇄된 시스템이며, 배지의 조성물은 발효의 시작시에 설정되고 발효 동안 인공적인 변형을 겪지 않는다. 배치 시스템의 변형은 본 발명에서 사용되는 페드 배치 발효이다. 이 변형에서, 기질은 발효가 진행됨에 따라 증분으로 첨가된다. 페드 배치 시스템은 이화생성물 억제가 세포의 신진대사를 억제 할 가능성이 있고 배지에 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 배치 및 페드 배치 발효는 일반적이고 당업계에 일반적으로 주지되어 있다. 연속 발효는 정의된 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고 동일한 양의 조건 배지가 원하는 단백질의 가공 및 수확을 위해 동시에 제거되는 시스템이다. 일부 실시태양에서, 연속 발효는 일반적으로 세포가 주로 대수기 성장하는 일정한 고밀도로 배양물을 유지시킨다. 일부 실시태양에서, 연속 발효는 일반적으로 정지기 또는 늦은 대수기/정지기 성장시에 배양물을 유지시킨다. 연속 발효 시스템은 정지기 성장 조건을 유지하기 위해 노력한다.
연속 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라 생성물 형성의 속도를 최대화하기 위한 기술은 산업용 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 본 발명의 배양물에 대한 탄소원의 비 제한적인 목록은 당 및 수화물, 예를 들어 글루코오스, 자일로오스, 수크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 말토오스, 당밀, 사탕무 또는 사탕수수 가공에 의한 수크로오스-함유 용액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로오스; 오일 및 지방, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방; 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산; 알코올, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 및 에탄올; 및 유기산, 예를 들어 아세트산 또는 젖산을 포함한다.
본 발명의 배양물을 위한 질소 공급원의 비 제한적인 목록은 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 콩가루 및 우레아와 같은 유기 질소 함유 화합물; 또는 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄, 탄산 암모늄 및 질산 암모늄과 같은 무기 화합물을 포함한다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 배양물을 위한 가능한 인 공급원의 비 제한적인 목록은 인산, 인산 이수소 칼륨 또는 인산 수소 이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 포함한다. 배양 배지는 추가로 성장에 필수적인, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 염화물 또는 황산염 형태의 염을 포함한다. 마지막으로, 아미노산, 예를 들어 호모세린 및 비타민, 예를 들어 티아민, 바이오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 인자가 상기 언급된 물질에 추가로 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양물의 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아; 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 산 또는 염기, 또는 완충 염에 의해 적절한 방식으로 조절될 수 있다. 일부 실시태양에서, pH는 일반적으로 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조절된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 배양물은 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스터를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양물은 예를 들어 항생제와 같은 적합한 선택 물질을 첨가함으로써 배양물의 플라스미드를 안정화시키도록 변형된다.
일부 실시태양에서, 배양은 호기성 조건하에 수행된다. 이러한 조건을 유지하기 위해, 예를 들어 공기와 같은 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물이 배양물 내로 도입된다. 과산화수소가 풍부한 액체를 사용하는 것도 가능하다. 발효는, 적절한 경우에, 상승된 압력, 예를 들어 0.03 내지 0.2 MPa의 상승된 압력에서 수행된다. 배양의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 배치 또는 페드 배치 공정에서, 배양은 바람직하게는 회수되는데 충분한 양의 목적하는 유기-화학적 화합물이 형성될 때까지 계속된다.
생성물 회수 및 정량화
관심 생성물의 생산을 위한 선별 방법은 당업자에게 공지되어 있으며 본 명세서 전반에 걸쳐 논의된다. 이러한 방법은 본 발명의 균주를 선별할 때 사용될 수있다. 본 발명에 제공된 방법에 의해 생산된 관심 생체 분자 또는 생성물은 글루코오스 또는 임의의 원료 또는 에너지원으로부터 생산된 임의의 상용 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 관심 생체 분자 또는 생성물은 의약, 작은 분자, 아미노산, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 글루탐산, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루신, 메티오닌 또는 라이신일 수 있다. 유기산은 숙신산염, 락트산염 또는 피루브산염일 수 있다. 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 비 분비된 세포내 생성물을 생산하도록 디자인된 균주를 개량시키는 방법을 교시한다. 예를 들어, 본 발명은 세포내 효소, 오일, 약제 또는 다른 가치있는 작은 분자 또는 펩타이드를 생성하는 세포 배양물의 견고성, 수율, 효율 또는 전반적인 바람직함을 개선시키는 방법을 교시한다. 비 분비된 세포내 생성물의 회수 또는 분리는 용해 및 본 발명에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 주지된 회수 기술에 의해 달성될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포는 원심 분리, 여과, 침전 또는 다른 방법에 의해 수확될 수 있다. 이어서, 수확된 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파쇄 또는 세포 용해제의 사용, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 포함하는 임의의 편리한 방법으로 파괴된다.
관심의 생성된 생성물, 예를 들면, 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 회수/분리될 수 있으며 임의로 정제될 수 있다. 예를 들어, 생성물 폴리펩타이드는 원심 분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성 상호작용, 크로마토포커싱 및 크기 배제) 또는 침전을 포함하나 이에 제한되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계에서 사용될 수 있다. (예를 들어, Purification of intracellular protein as described in Parry et al., 2001, Biochem. J.353:117, and Hong et al., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol.　73:1331, 참조, 모두는 참조로 본 발명에 포함된다).
상기한 참조문헌 이외에, 다양한 정제 방법은, 예를 들어, Sandana (1997)　Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996)　Protein Methods,　2nd　Edition, Wiley-Liss, NY; Walker (1996)　The Protein Protocols HandbookHumana Press, NJ; Harris and Angal (1990)　Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal　Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993)　Protein Purification: Principles and Practice　3rd　Edition, Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998)　Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition, Wiley-VCH, NY; and Walker (1998)　Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJ에 개시된 것들을 포함하여 당업계에 주지되어 있으며, 이의 전부는 본 발명에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 분비된 생성물을 생산하도록 디자인된 균주를 개량시키는 방법을 교시한다. 예를 들어, 본 발명은 귀중한 작은 분자 또는 펩타이드를 생산하는 세포 배양물의 견고성, 수율, 효율 또는 전반적인 바람직함을 개선시키는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 면역학적 방법을 사용하여 본 발명의 세포에 의해 생산된 분비된 또는 분비되지 않은 생성물을 검출 및/또는 정제하는데 사용될 수 있다. 한 예시적 접근법에서, 통상적인 방법을 사용하여 생성물 분자(예를 들어, 인슐린 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편에 대해)에 대해 생성된 항체는 비드 상에 고정화되고, 엔도글루카나아제가 결합되고 침전되는 조건하에 세포 배양 배지와 혼합된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)의 사용을 교시한다.
다른 관련 실시태양에서, 면역크로마토그래피가 미국 특허 제5,591,645호, 미국 특허 제4,855,240호, 미국 특허 제4,435,504호, 미국 특허 제4,980,298호 및 Se-Hwan Paek, et al., "Development of rapid One-Step Immunochromatographic assay, Methods", 22, 53-60, 2000에 개시된 바와 같이 사용되며, 이의 각각은 참조로 본 발명에 포함된다. 일반적인 면역크로마토그래피는 2개의 항체를 사용하여 표본을 검출한다. 제 1 항체는 시험 용액 중에 또는 시험 용액을 떨어뜨린 다공성 막으로 제조된 대략 직사각형 형태의 시험편의 말단 부분에 존재한다. 이 항체는 라텍스 입자 또는 금 콜로이드 입자(이 항체는 이하에서 표지 항체로 불릴 것이다)로 표지한다. 떨어뜨린 시험 용액이 검출될 표본을 포함하는 경우, 표지된 항체는 표본을 인식하여 표본과 결합한다. 표본과 표지된 항체의 복합체는 모세관 현상에 의해 여과지로 만들어지고 표지된 항체를 포함하는 말단의 반대편 말단에 부착된 흡수체를 향하여 흐른다. 이 흐름 동안, 표본과 표지 항체의 복합체가 다공질 막의 중간에 존재하는 제 2 항체(이하에서 태핑 항체로 불릴 것이다)에 의해 인식되어 포획되고, 그 결과, 복합체는 가시광 신호로서 다공성 막 상의 검출부 상에 나타내고 검출된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 선별 방법은 측광 검출 기술(흡수, 형광)에 기초한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 검출은 항체에 결합된 GFP와 같은 형광 단 검출기의 존재에 기초할 수 있다. 다른 실시태양에서, 측광 검출은 세포 배양 물로부터의 원하는 생성물 상의 축적에 기초할 수 있다. 일부 실시태양에서, 생성물은 배양물의 UV 또는 상기 배양물로부터의 추출물을 통해 검출될 수 있다.
일부 실시태양에서, 생성물 회수 방법은 각각의 후보 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 성능에 대한 효과의 정량적 결정을 가능하게 한다. 일부 실시태양에서, 생성물 회수 방법은 각 후보 원핵 생물 헤모글로빈 유전자의 성능 및 원하는 관심 생체 분자 또는 생성물의 최적 성장 및/또는 생산성 비율을 촉진시키는 후보 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 발현하는 미생물에 대한 선택에 대한 효과의 정량적 결정을 가능하게 한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 방법은 0 초과 및 125 미만 nmoles/g의 세포 습식 중량의 세포내 헤모글로빈 농도를 생성하는 후보 이종 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)를 발현하는 미생물 또는 균주의 선택을 허용한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 0 초과 및 100 미만 nmoles/g의 세포 습식 중량의 세포내 헤모글로빈 농도를 생성하는 후보 이종 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)를 발현하는 미생물 또는 균주의 선별을 허용한다. 일부 실시 태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 0 초과 및 75 미만 nmoles/g의 세포 습식 중량의 세포내 헤모글로빈 농도를 생성하는 후보 이종 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)를 발현하는 미생물 또는 균주의 선별을 허용한다.
선택 기준 및 목표
이종 원핵 생물 헤모글로빈 유전자(예를 들어, 박테리아 헤모글로빈 유전자)를 발현하는 숙주 세포의 특정 균주의 선별은 특정 목표에 기초할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 즉각적인 시간 제한없이 반응의 단일 배치 수율을 최대화하는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 폴리머의 탄소 사슬을 길게하는 것과 같이 생성물의 화학적 구조를 변형시키는 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 수율, 역가, 생산성, 부산물 제거, 공정 이상현상에 대한 내성, 최적 성장 온도 및 성장율과 같은 성능 특성을 개선하는 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 미생물에 의해 생성된 관심 생성물의 부피 생산성, 비 생산성, 수율 또는 역가에 의해 측정된 바와 같이 개량된 숙주 성능이다.
일부 실시태양에서, 프로그램의 목표는 0 초과 및 125 미만 nmoles/g의 세포 습식 중량의 세포내 헤모글로빈 농도를 생성하는 미생물 또는 미생물 균주를 제공하는 것이다. 일부 실시태양에서, 프로그램의 목표는 0 초과 및 100 미만 nmoles/g의 세포 습식 중량의 세포내 헤모글로빈 농도를 생성하는 미생물 또는 미생물 균주를 제공하는 것이다. 일부 실시태양에서, 프로그램의 목표는 0 초과 및 75 미만 nmoles/g의 세포 습식 중량의 세포내 헤모글로빈 농도를 생성하는 미생물 또는 미생물 균주를 제공하는 것이다.
일부 실시태양에서, 프로그램의 목표는 낮은 수준의 산소(산소 제한)하에서 성장하는 유전자 변형된 숙주 미생물 또는 숙주 미생물의 균주를 제공하는 것이다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 산화 또는 질산화 스트레스 조건하에서 성장하는 유전자 변형된 숙주 미생물 또는 숙주 미생물의 균주를 제공하는 것이다. 성장은 숙주 미생물의 야생형 균주에 비해 증가될 수 있다. 성장은 이종 원핵 헤모글로빈 유전자를 발현하도록 유전자 변형되지 않은 숙주 미생물의 균주에 비해 증가될 수 있다. 일부 실시태양에서, 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 발현하도록 유전자 변형된 본 발명의 숙주 미생물 또는 숙주 미생물의 균주는 산화 스트레스, 질산화 스트레스 또는 산소 제한 조건하에서 대조군 또는 참조보다 적어도 또는 약 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 초과 성장을 나타낸다. 대조군 또는 참조는 숙주 미생물의 야생형 균주 또는 이종 원핵 생물 헤모글로빈 유전자를 발현하도록 유전자 변형되지 않은 숙주 미생물일 수 있다.
다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 투입량 당 최종 생성물 수율(예를 들어, 수크로오스의 파운드당 생산된 총 에탄올의 양)의 관점에서 상업적 균주의 합성 효율을 최적화하는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 예를 들어 배치 완료율 또는 연속 배양 시스템에서의 수율로 측정된 합성 속도를 최적화하는 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 프로그램 목표는 관심 생체 분자 또는 생성물의 최종 생성물 수율 및/또는 생산 속도를 최적화하는 것이다. 본 발명에 제공된 방법에 의해 제조된 생체 분자 또는 관심 대상 생성물은 글루코오스 또는 미생물 또는 미세유기체로부터 제조된 임의의 상용 생성물일 수 있다. 일부 경우, 관심 생체 분자 또는 생산물은 의약, 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 글루탐산, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소루이신, 메티오닌 또는 라이신일 수 있다. 유기산은 숙신산염, 락트산염 또는 피루브산염일 수 있다. 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다.
당업자는 특정 프로젝트 목표를 달성하기 위해 어떻게 균주 선택 기준을 맞춤하는지를 인식할 것이다. 예를 들어, 반응 포화시 균주의 단일 배치 최대 수율의 선택은 높은 단일 배치 수율을 가진 균주를 확인하는데 적절할 수 있다. 다양한 온도 및 조건에서 수율의 일관성에 기반한 선택은 견고성 및 신뢰성이 증가된 균주를 확인하는데 적절할 수 있다.
일부 실시태양에서, 초기 단계 및 탱크-기반 검증에 대한 선택 기준은 동일할 것이다. 다른 실시태양에서, 탱크-기반 선택은 추가 및/또는 상이한 선택 기준하에서 작동할 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조로 추가로 설명된다. 그러나, 전술한 실시태양과 마찬가지로, 이들 실시예는 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 어떤식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 사용한 코리네박테리움의 형질 전환
박테리아 헤모글로빈 라이브러리의 생성
여러 박테리아 헤모글로빈을 특정 박테리아 헤모글로빈 및 후보 박테리아 헤모글로빈 사이의 서열 유사성을 탐색하도록 설계된 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 기반 방법을 사용하여 박테리아 헤모글로빈 라이브러리의 생성을 위해 선택하였다. 보다 구체적으로, 비트레오실라 스테르코카리아로부터의 헤모글로빈의 아미노산 서열을 사용하여 BLAST 알고리즘을 사용하는 TREMBL 단백질 데이터베이스 검색을 씨드하였다. 씨드된 헤모글로빈과 특정 유사성(즉, 5의 BLAST E-값) 내에서 일치된 모든 서열은 데이터베이스로부터 추출하였다. 세트 내의 각각의 선택된 후보 서열 사이의 쌍 정렬은 세트 내의 임의의 다른 서열과 각 서열을 연관시키는 유사성 스코어를 생성하도록 수행하였다. 쌍 정렬은 http://efi.igb.illinois.edu/efi-est/에서 이용 가능한 온라인 도구를 사용하여 수행하였다. 그런 후에 유기 클러스터링 알고리즘을 알맞게 사용하여 소프트웨어 도구 사이토스케이프(cytoscape.org)를 사용하여 세트의 구성원을 다소 유사한 그룹으로 하위 그룹화하였다. 각 하위 그룹의 대표 후보자는 서열 다양성이 기능적 다양성과 일치하기를 희망하면서 라이브러리에 존재하는 서열의 다양성을 최대화하도록 선택하였다.
라이브러리에 포함시키기 위해 선택된 박테리아 헤모글로빈을 암호화하는 박테리아 헤모글로빈 유전자는 DNA2.0 GeneGPS® 발현 최적화 기술을 사용하여 코돈 최적화되었다. 따라서, 라이브러리에 포함시키기 위해 선택된 박테리아 헤모글로빈 유전자는 세균 헤모글로빈 유전자이었다: Vhb01(Vitreoscilla stercoraria; SEQ ID NO: 9), Vhb02(Gordonia terrae C-6, SEQ ID NO: 10), Vhb03(Sandaracinus amylolyticus; SEQ ID NO: 11), Vhb04(Fischerella sp. JSC-11, SEQ ID NO: 12), Vhb05(Candidatus Entotheonella sp. TSY1, SEQ ID NO: 13), Vhb06(Hassallia byssoidea VB512170, SEQ ID NO: 14), Vhb07(mine drainage metagenome; SEQ ID NO: 15), Vhb08(Aeromonas molluscorum 848, SEQ ID NO: 16), Vhb09(Phaeobacter gallaeciensis DSM 26640, SEQ ID NO: 17), Vhb10(Spirosoma radiotolerans, SEQ ID NO: 18), Vhb11(Shewanella loihica(균주 ATCC BAA-1088/PV-4); SEQ ID NO: 19) 및 Vhb12(Sulfurimonas gotlandica(균주 DSM 19862/JCM 16533/GD1); SEQ ID NO: 20).
헤모글로빈 라이브러리의 생성을 위해, 상기 각각의 코돈 최적화된 헤모글로빈 유전자를 서열 확인하여 서열 완전성을 보장하고 이어서 유형 IIs 제한 및 결찰 복제 기술을 사용하여 C. 글루타미쿰/대장균 양립 가능성 발현 벡터 속으로 복제하였다. 또한, 각 헤모글로빈 구조체 내에서 P1 프로모터(SEQ ID NO: 1)가 각각의 헤모글로빈 유전자 앞에 복제되었다. 마지막으로, 구조체 내의 각 헤모글로빈 유전자는 종결 서열(SEQ ID NO: 21)로 종료되었다.
조립된 클론의 대장균으로의 형질 전환
코돈 최적화 헤모글로빈 유전자를 함유하는 벡터를 서열화에 의해 확인하고 이어서 정확하게 조립된 클론을 확인하고 코리네박테리움 형질 전환을 위한 벡터 DNA를 증폭시키기 위해 각각 개별적으로 대장균으로 형질 전환시켰다. 증폭된 DNA는 PCR/서열화를 통해 확인하였다. 양성 클론은 추후 사용을 위해 -20℃에서 냉장고에 저장하였다.
조립된 클론의 코리네박테리움으로의 형질 전환
확인된 클론을 전기 천공을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 숙주 세포로 개별적으로 형질 전환시켰다. 구조체 성능에 대한 균주 배경 효과를 테스트하기 위해, C. 글루타미쿰의 3 가지 상이한 균주 배경(즉, 도 3a-3b의 상황 1, 상황 2 및 상황 3)을 사용하여 각 구조체는 각 배경으로 형질 전환되었다. 각각의 벡터는 이종 헤모글로빈 유전자의 발현을 허용하지만 숙주 세포에 유해하지 않은 것으로 경험적으로 결정된 C. 글루타미쿰 게놈 내의 중성 통합 부위에 통합되도록 디자인되었다. 통합을 용이하게 하기 위해, 발현 벡터는 원하는 통합 부위에 약 4kb의 서열 상동성(즉, 상동성 암)을 추가로 포함하고 이에 의해 상기 각각의 헤모글로빈 유전자 카세트가 각 측면 상의 원하는 통합 부위에 상동성인 2kb의 서열 사이에 삽입되었다. 게놈 내로의 통합은 단일-크로스오버 통합에 의해 일어났고 플라스미드 백본의 루프-아웃은 플라스미드 백본에 포함된 두 번째 마커 상의 카운터-선택에 의해 촉진되었다.
형질 전환된 박테리아를 조립 성공(게놈 내로의 정확한 통합)에 대해 테스트하였다. 각 코리네박테리움 형질 전환 플레이트의 콜로니를 배양하고 PCR을 통한 정확한 통합에 대해 테스트하였다. 이 과정은 각 박테리아 헤모글로빈 구조체에 대해 수행된 각각의 형질 전환에 대해 반복되었다. 각 형질 전환의 게놈 통합은 또한 각 플라스미드에 대한 표적 게놈 위치와 관련하여 분석되었다.
코리네박테리움에서의 개별 박테리아 헤모글로빈 구조체 평가
이어서, 각각의 형질 전환체의 표현형을 각각의 숙주 세포 배경에서 각 구조체의 발현이 원하는 표현형에 대해 갖는 효과(즉, 발효 최종 생성물을 생산하기 위한 개선된 능력)를 측정하기 위해 원하는 발효 최종 생성물을 생산하기 위한 특정 발효 공정을 모방 또는 가장하도록 디자인된 평가 방법에서 테스트하였다. 간단히 말해, 평가 방법은 발효 조건을 모방하려는 조건하에서 형질 전환체를 96웰 플레이트 형식으로 배양한 실험이었다. 다양한 시점에서 형성된 생성물 및 바이오매스의 양을 측정하고 발효 조건하에서 각 균주가 어떻게 수행될 지 예측하는데 사용되었다. 이 예측은 평가 방법에서 다양한 발효 성능을 가진 균주를 테스트하고 성능과 측정치의 상관 관계를 결정함으로써 생성된 선형 회귀 분석이었다.
원하는 발효 최종 생성물의 예측된 생산 속도 및 수율을 각각의 헤모글로빈 형질 전환체에 대해 측정하였고, 측정하였으며, 이의 일부 예는 도 3a-3b에 도시된다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 특정 헤모글로빈 삽입체의 경우, 발효 공정에서 생산성은 도시된 각각의 헤모글로빈 삽입체 vs. 한 쌍의 특정 헤모글로빈/배경 조합(즉, 상황 1 및 2와 조합된 Vhb05; 상황 1과 조합된 Vhb10 및 Vhb11)을 제외한 부모 균주에 대해 각 상황(즉, 숙주 배경)에서 일반적으로 증가하는 것으로 예측되었다. Vhb04를 발현하는 균주는 테스트된 각 상황에서 부모 균주의 %로서 예측된 생산성의 증가를 나타내었다. 대조적으로, 도 3b에 도시된 바와 같이, 예측된 수율은 상황과 조합된 헤모글로빈 삽입체 vs. 부모 균주에 대해 훨씬 더 가변적이었다. 요약하면, 일반적으로 헤모글로빈 유전자는 생산성에 영향을 주었지만 수율에 미치는 영향은 훨씬 적었다. Vhb04를 발현하는 균주는 테스트된 각 상황에서 부모 균주의%와 동일한 예측된 수율을 나타내었다.
발효 조건하에서 개별 박테리아 헤모글로빈 구조체의 평가
전술한 바와 같이 평가한 후에, 예측된 증가된 성능(즉, 증가된 예측 생산성 및/또는 예측된 수율)을 갖는 이종 헤모글로빈 유전자를 갖는 형질 전환체를 선택하고 이어서 발효 및 원하는 발효 최종 생성물의 생산을 촉진시키도록 디자인된 조건하에서 배지에서 성장시켰다. 원하는 최종 생성물을 생산하도록 디자인된 발효 조건하에서 소정의 기간 동안 각 형질 전환체의 성장 이후, 각 형질 전환체에 대한 최종 생성물의 수율 및 용적 생산성을 결정하였다. 간략하게, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 공급 된 일정량의 기질에 대해 생산된 생성물의 양(즉, 평균 수율)을 결정하였다. 생산성(즉, 평균 생산성)은 시간 및 부피 데이터의 추가로 유사하게 결정하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, Vhb04 구조체는 부모 균주 대 부모 균주 단독의 생산성을 증가시켰지만 수율은 감소하였다. 따라서,이 실시예는 본 발명에서 제공된 방법이 발효 최종 생성물을 생산하는 관점에서 미생물 균주의 성능을 증가시키는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 2: 이종 박테리아 헤모글로빈 구조체를 사용한 코리네박테리움의 형질 전환: 제 2 발효 최종 생성물을 생산하는 발효 조건하에서 성장한 Vhbo1 발현 코리네박테리아 형질 전환체의 평가
실시예 1의 후속으로서, 상기한 바와 같이 평가한 후, 예측된 증가된 성능 (즉, 증가된 예측 생산성 및/또는 예측된 수율)을 갖는 Vhb01을 이종성으로 발현하는 형질 전환체를 선택하고 이어서 실시예 1에서 검사된 최종 생성물과 분리되고 구별된 제 2 원하는 발효 최종 생성물의 발효 및 생산을 촉진하도록 디자인된 조건하에서 배지에서 성장시켰다. 원하는 제 2 최종 생성물을 생산하도록 디자인된 발효 조건하에서 소정의 기간 동안 각 형질 전환체의 성장 후, 각 형질 전환체에 대한 최종 생성물의 수율 및 체적 생산성을 측정하였다. 간략하게, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 공급된 일정량의 기질에 대해 생성된 생성물(즉, 평균 수율)의 양을 측정하였다. 생산성(즉, 평균 생산성)은 시간 및 부피 데이터의 추가로 유사하게 결정되었다.
Vhb01 구조체는 이종 Vhb01 구조체를 함유하지 않은 코리네박테리아와 비교하여 제 2 발효 생성물의 생산성에서 20%의 개선을 나타내었다. 따라서, 본 실시 예는 본 발명에 제공된 방법이 다수의 발효 최종 생성물을 생산하는 관점에서 미생물 균주의 성능을 증가시키는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
참조에 의한 통합
다음의 출원들은 모든 목적을 위한 모든 설명, 참조, 도면 및 청구 범위를 포함하여 그 전체가 본 발명에 참조로 포함된다: 2016년 12월 30일 출원된 미국 특허 출원 제15/396,230호; 2016년 12월7일 출원된 국제 출원 제PCT/US2016/065465호; 2016년 4월 27일 출원된 미국 특허 출원 제15/140,296호; 2016년 7월 29일 출원된 미국 가출원 제62/368,786호; 및 2015년 12월7일 출원된 미국 가출원 제62/264,232호.
본 발명에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다.
그러나 본 발명에 언급된 모든 참고문헌, 기사, 출판물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 세계 어느 나라에서든 유효한 선행 기술을 구성하거나 보통의 일반 지식의 일부를 구성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안으로 간주되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zymergen, Inc. Manchester, Shawn Neckelmann, Alexander <120> METHODS FOR GENERATING A BACTERIAL HEMOGLOBIN LIBRARY AND USES THEREOF <130> ZYMR-006/01WO 327574-2025 <140> US 62/356,934 <141> 2016-06-30 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 97 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(97) <223> Pcg0007_39 <400> 1 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtat tatggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 2 <211> 97 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(97) <223> Pcg0007 <400> 2 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtaa gatggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 3 <211> 93 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(93) <223> Pcg1860 <400> 3 cttagctttg acctgcacaa atagttgcaa attgtcccac atacacataa agtagcttgc 60 gtatttaaaa ttatgaacct aaggggttta gca 93 <210> 4 <211> 98 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(98) <223> Pcg0755 <400> 4 aataaattta taccacacag tctattgcaa tagaccaagc tgttcagtag ggtgcatggg 60 agaagaattt cctaataaaa actcttaagg acctccaa 98 <210> 5 <211> 97 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(97) <223> Pcg0007_265 <400> 5 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtac gctggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 6 <211> 86 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(86) <223> Pcg3381 <400> 6 cgccggataa atgaattgat tattttaggc tcccagggat taagtctagg gtggaatgca 60 gaaatatttc ctacggaagg tccgtt 86 <210> 7 <211> 97 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(97) <223> Pcg0007_119 <400> 7 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgttg catggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 8 <211> 87 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(87) <223> Pcg3121 <400> 8 gtggctaaaa cttttggaaa cttaagttac ctttaatcgg aaacttattg aattcgggtg 60 aggcaactgc aactctggac ttaaagc 87 <210> 9 <211> 441 <212> DNA <213> Vitreoscilla stercoraria <220> <221> misc_feature <222> (1)..(441) <223> Vhb01 <400> 9 atgctagatc aacagacaat taacattatc aaagctacgg taccggttct taaagaacat 60 ggtgtgacta ttactactac tttctataag aatttgtttg cgaagcatcc agaagtccgc 120 ccactttttg atatgggtcg tcaggaatct ctggagcagc ctaaagctct tgcgatgacg 180 gttcttgcgg cagcgcagaa tattgagaat ctgccagcga ttcttcctgc ggtgaagaaa 240 attgcggtca aacattgtca ggctggagta gcagcagcac attatccgat cgtaggacaa 300 gaacttttgg gggctatcaa agaagtgctc ggcgacgctg ctaccgatga tattcttgac 360 gcgtggggaa aagcttacgg tgttatcgct gatgtattca ttcaagttga ggctgatttg 420 tatgcgcaag ctgttgaata g 441 <210> 10 <211> 411 <212> DNA <213> Gordonia terrae C-6 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(411) <223> Vhb02 <400> 10 atgcttaatc gtgaagttct ccaagattct ctatcccttg ttatcgacga tgaacagaaa 60 cttatgctta gtttctatga tcgcctgttc gaggaacatc cagaagtccg cccgatgttt 120 ggtgcggact tgcgtcctca ggctacgatg cttcaacagg ctattgcggc tgttctagat 180 catttggatg atacggaatg gcttggacga actttgggag cgcttggtcg gcgccatgca 240 gacctgggag tgactccaga gatgtacggt tgggtagctg gcgcgcttat tactacgatg 300 gctgagcgtg gtggcgggga ttggactgat gaaatgacag cggcttggac cgaagctctt 360 ggtgcagtgg cgggacttat gttggacgct tatccggcag tagcggatta g 411 <210> 11 <211> 423 <212> DNA <213> Sandaracinus amylolyticus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(423) <223> Vhb03 <400> 11 atgtcccttg atgttccttt gcttagatct tcattcgaat tggtacttga acgtgagcct 60 gcacttaccg cgcgttttta cgaaatccta ttcgagcgct atccgcaagc tcgcccgctt 120 tttgctcgga atgctcgtaa acagcaagaa gaaatgctgg cgcgagcgct ggctgctgta 180 gtggaccgcc ttgaagatgc accatggctt gtggagactt tgggagcgat gggagcgaaa 240 catgtcgatt atggcgtcac tgaagaaatg tatggttggg ttggggacgc acttcttcgt 300 acgctagctg aagttgctgg tgatgcttgg acgccagagt tggaagcggc ttgggcggca 360 gcttacggtg cgattcgcga tcttatgctc gctggagcga gtcgtgcgca ggcagctgaa 420 tag 423 <210> 12 <211> 498 <212> DNA <213> Fischerella sp. 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TSY1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(513) <223> Vhb05 <400> 13 atgaatttta tgtctaaact ttatggattt ctcacgttgg gccgtactgc gttgcttccg 60 atgccttctg cggagtctaa agttgatggt tcaatttccg ctcgccaggc atggcttgta 120 cagtctagtt ggaaacatgt tcggccaatt gctgatcagg ctgctacgct tttctatgat 180 aagcttttcg aattggaccc aagtatcaaa ccgcttttcg cacatactga gatgaaagaa 240 caacagaaaa agctaatgca aactatgaca gtagtcgtaa acggtcttaa tcgcctagat 300 aaaatggttc cagcggtgca agctttgggc aagcgtcata ttgattatgg tgtccaagct 360 gaccattact caaccgtggg ggcagcgctt ctgtggactc ttcaacaggg acttggagag 420 gcatttaccc ctgaagtcga agaagcgtgg tccgttacgt acactgtact ggcgggtacg 480 atgcagggtg ctgcggctga agtgactgtt tag 513 <210> 14 <211> 429 <212> DNA <213> Hassallia byssoidea VB512170 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(429) <223> Vhb06 <400> 14 atgtccctta atgttgagct tcttgaacaa tcatttgaac agattaaacc acgcgcgaat 60 gacttcgttg caagttttta cgaaaacttg ttcgcaacac atccagaagt aaaaccgctt 120 tttgcgcata ccaatatggt agagcagcgt aagcatctca ttgcggcgct tgtattggtt 180 attcagaatc tacgtaagcc tgaagtcctt ggatctgctc ttaaaacgtt gggagcgaaa 240 catgtcggat atggtacgat cccggaacat tatccagctg tgggcgaagc tctgctaact 300 actttcgagc agtatctgca tcaagattgg acgcctgaag tgaaacaagc ttgggttgat 360 gctcttactg caatcaccgc tcttatgctt aagggtgcgg gtgaggatta cgctttgctt 420 actgtgtag 429 <210> 15 <211> 462 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mine drainage metagenome <220> <221> misc_feature <222> (1)..(462) <223> Vhb07 <400> 15 atggctatta atattcaact aattcagagt tccggagcgg cagtcaaaga ccttggtgta 60 ccagtcgctg agcatttcta taactatatg ttcacgcatt tcccagaagt gcgtaaaatg 120 tttcctggtg atatgacaga gcagcgtgtt cgcttgttta actcagttat cttgattgcg 180 actaatatcg atactatgga agtacttgtg ccgtatttga aagaactcgg cattggacat 240 atcaaatatg atactcgccc cgaacattac ccgattgttg gtaagtctct tcttaatact 300 cttaagcatt ttctgggaga agcgtggacc caagaaatgg ctgagtcttg gatcgaagcg 360 tataatcttg ctagtacggt ttgtattgaa gcggcttacg aagctatggc accttctcgg 420 ttcgtaccgg ttacgattga cgatgtacct ccagcagtgt ag 462 <210> 16 <211> 450 <212> DNA <213> Aeromonas molluscorum 848 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(450) <223> Vhb08 <400> 16 atgaccttcg atgaaattga cctagtacag cgcgcttgga gtcgtatctc tcttttctcc 60 aatgcatttg ttagagagat ttatcaagaa ctttttcgct tggatgaacg tttggaaact 120 atgttcagtc taacagatga tcgccttatc gataaagttg cgcagacttt gaatacggtc 180 cttacgtctt tggagcaact ggattcactt cgattcatta ttcgccatct tggagaacgg 240 catcgtcagt atggtgttct tccggcgcat tttgaccttg tgaaggaagc gatgactcgt 300 gtaatggctt gtcgtcttgg agaatacttt acgcctgctc ttgcactcgc gtggtccggt 360 gcttatgatg aaattgctgc gattatgatc gaaggcctgc aggctgagga accatgtact 420 gagggtgcag atatggacat ttctcaatag 450 <210> 17 <211> 411 <212> DNA <213> Phaeobacter gallaeciensis DSM 26640 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(411) <223> Vhb09 <400> 17 atggtgtctg aagatggtcg tactcttatt cataaatctg tcgaatctga acgtatggaa 60 ttggatcatt ttgttcgcct cttttatgcg aagtttttcg agatttgtcc agacgtacgc 120 gcgcttttcc ctaatgatat ggcaagtcaa catgaaaagc tacttacttc attgacgcat 180 atcatcgaag cgcttgacca 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atgccgctta ccgatgagca aaaacaactt attcagaagt ccttcgctga gatcaatcgc 60 cagaattcaa actttgcgtc ccatttctac gattgtcttt ttgctatggc gcctttgatt 120 cgaccaatgt ttcagagtga gcgtccggta tttgagtatc atttcaatga actaattact 180 acggcagtgg caaaagttca tcagttcaat gaagttaaac caaaacttga agaattggga 240 cgcaagcatc ttgattatgg tgtcaatatc tctcaattcg aagttgtacg ggctgctttg 300 ctgctttcta ttcaggattg tctccgtgac gcttcatctc ctgcgattga acaggcttgg 360 tcttgttatt acgacgaaat tgcaaaagtg atgatcgcgg ctatgcaaga agcggcgagt 420 tag 423 <210> 20 <211> 429 <212> DNA <213> Sulfurimonas gotlandica (strain DSM 19862 / JCM 16533 / GD1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(429) <223> Vhb12 <400> 20 atggaactgt ctgctaaaac tatcgaaatt gtgaaggcta ctgcaccaat tgttgctgcg 60 aatgctgaag ctattacgtc cactatgtac aagattatgt ttacgaacca tccggaaatc 120 aaagaacttt tcaaagatgc gaagcctgat cagcataaga aattggctgc agcggtcgga 180 gcgtatgcag ctaatatcga caatctgatt gtccttgaaa aagcgattga gaaaatggta 240 tcaacacata tccttaaaaa tgtgcagcca gagcattatc cgattgttgg cattagtatt 300 cttgaggcta tcaaaaaagt gttgggtgac gctgttaccc tcgaagtact tgatgcgtgg 360 aaagaagcat atttcttttt ggcgcatgta ctaattgagc aagaaaagct tgcgtacgct 420 gatgtttag 429 <210> 21 <211> 77 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> T1 termination sequence <400> 21 gcatttttag tacgtgcaat aaccactctg gtttttccag ggtggttttt tgatgccctt 60 tttggagtct tcaactg 77 <210> 22 <211> 74 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> T2 termination sequence <400> 22 acaatagtaa aaggaaccct cacgaactgt gagggttcct tttttgggtt tcgccggagg 60 agacgtcgaa aagc 74 <210> 23 <211> 146 <212> PRT <213> Vitreoscilla stercoraria <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(146) <223> Vhb01 <400> 23 Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val 1 5 10 15 Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu 20 25 30 Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln 35 40 45 Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys 65 70 75 80 Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro 85 90 95 Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp 100 105 110 Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val 115 120 125 Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala 130 135 140 Val Glu 145 <210> 24 <211> 136 <212> PRT <213> Gordonia terrae C-6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(136) <223> Vhb02 <400> 24 Met Leu Asn Arg Glu Val Leu Gln Asp Ser Leu Ser Leu Val Ile Asp 1 5 10 15 Asp Glu Gln Lys Leu Met Leu Ser Phe Tyr Asp Arg Leu Phe Glu Glu 20 25 30 His Pro Glu Val Arg Pro Met Phe Gly Ala Asp Leu Arg Pro Gln Ala 35 40 45 Thr Met Leu Gln Gln Ala Ile Ala Ala Val Leu Asp His Leu Asp Asp 50 55 60 Thr Glu Trp Leu Gly Arg Thr Leu Gly Ala Leu Gly Arg Arg His Ala 65 70 75 80 Asp Leu Gly Val Thr Pro Glu Met Tyr Gly Trp Val Ala Gly Ala Leu 85 90 95 Ile Thr Thr Met Ala Glu Arg Gly Gly Gly Asp Trp Thr Asp Glu Met 100 105 110 Thr Ala Ala Trp Thr Glu Ala Leu Gly Ala Val Ala Gly Leu Met Leu 115 120 125 Asp Ala Tyr Pro Ala Val Ala Asp 130 135 <210> 25 <211> 140 <212> PRT <213> Sandaracinus amylolyticus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(140) <223> Vhb03 <400> 25 Met Ser Leu Asp Val Pro Leu Leu Arg Ser Ser Phe Glu Leu Val Leu 1 5 10 15 Glu Arg Glu Pro Ala Leu Thr Ala Arg Phe Tyr Glu Ile Leu Phe Glu 20 25 30 Arg Tyr Pro Gln Ala Arg Pro Leu Phe Ala Arg Asn Ala Arg Lys Gln 35 40 45 Gln Glu Glu Met Leu Ala Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Asp Arg Leu 50 55 60 Glu Asp Ala Pro Trp Leu Val Glu Thr Leu Gly Ala Met Gly Ala Lys 65 70 75 80 His Val Asp Tyr Gly Val Thr Glu Glu Met Tyr Gly Trp Val Gly Asp 85 90 95 Ala Leu Leu Arg Thr Leu Ala Glu Val Ala Gly Asp Ala Trp Thr Pro 100 105 110 Glu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Ala Ala Tyr Gly Ala Ile Arg Asp Leu 115 120 125 Met Leu Ala Gly Ala Ser Arg Ala Gln Ala Ala Glu 130 135 140 <210> 26 <211> 165 <212> PRT <213> Fischerella sp. JSC-11 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(165) <223> Vhb04 <400> 26 Met Val Ser Gln Lys Thr Ile Glu Ile Val Lys Ala Thr Ala Pro Ile 1 5 10 15 Ile Arg Glu Lys Gly Glu Glu Ile Thr Arg Arg Met Tyr Glu Ile Thr 20 25 30 Phe Ala Glu Arg Pro Asp Tyr Lys Arg Gly Phe Glu Thr Thr Trp Met 35 40 45 Gln His Leu Asp Gly Gly Glu Gln Ala His Lys Leu Ala Ala Ala Val 50 55 60 Tyr Ala Tyr Ala Thr His Ile Asp Arg Leu Asp Glu Leu Ala Met Ala 65 70 75 80 Val Lys Thr Ile Ala His Arg His Val Gln Thr Arg Thr Leu Pro Glu 85 90 95 Gln Tyr Pro Leu Ile Gly Glu Lys Leu Leu Gln Ala Met Lys Asp Val 100 105 110 Leu Gln Asp Ala Ala Thr Asp Glu Val Ile Ser Ala Trp Ala Glu Ala 115 120 125 Tyr Thr Ala Leu Ala Asp Ile Phe Ile Gln Lys Glu Lys Ala Ile Tyr 130 135 140 Gln Gln Glu Asp Arg Glu Leu Thr Glu Gln Leu Ala Lys Ala Asn Lys 145 150 155 160 Pro Glu Thr Ser Gly 165 <210> 27 <211> 170 <212> PRT <213> Candidatus Entotheonella sp. TSY1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(170) <223> Vhb05 <400> 27 Met Asn Phe Met Ser Lys Leu Tyr Gly Phe Leu Thr Leu Gly Arg Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Met Pro Ser Ala Glu Ser Lys Val Asp Gly Ser Ile 20 25 30 Ser Ala Arg Gln Ala Trp Leu Val Gln Ser Ser Trp Lys His Val Arg 35 40 45 Pro Ile Ala Asp Gln Ala Ala Thr Leu Phe Tyr Asp Lys Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Asp Pro Ser Ile Lys Pro Leu Phe Ala His Thr Glu Met Lys Glu 65 70 75 80 Gln Gln Lys Lys Leu Met Gln Thr Met Thr Val Val Val Asn Gly Leu 85 90 95 Asn Arg Leu Asp Lys Met Val Pro Ala Val Gln Ala Leu Gly Lys Arg 100 105 110 His Ile Asp Tyr Gly Val Gln Ala Asp His Tyr Ser Thr Val Gly Ala 115 120 125 Ala Leu Leu Trp Thr Leu Gln Gln Gly Leu Gly Glu Ala Phe Thr Pro 130 135 140 Glu Val Glu Glu Ala Trp Ser Val Thr Tyr Thr Val Leu Ala Gly Thr 145 150 155 160 Met Gln Gly Ala Ala Ala Glu Val Thr Val 165 170 <210> 28 <211> 142 <212> PRT <213> Hassallia byssoidea VB512170 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(142) <223> Vhb06 <400> 28 Met Ser Leu Asn Val Glu Leu Leu Glu Gln Ser Phe Glu Gln Ile Lys 1 5 10 15 Pro Arg Ala Asn Asp Phe Val Ala Ser Phe Tyr Glu Asn Leu Phe Ala 20 25 30 Thr His Pro Glu Val Lys Pro Leu Phe Ala His Thr Asn Met Val Glu 35 40 45 Gln Arg Lys His Leu Ile Ala Ala Leu Val Leu Val Ile Gln Asn Leu 50 55 60 Arg Lys Pro Glu Val Leu Gly Ser Ala Leu Lys Thr Leu Gly Ala Lys 65 70 75 80 His Val Gly Tyr Gly Thr Ile Pro Glu His Tyr Pro Ala Val Gly Glu 85 90 95 Ala Leu Leu Thr Thr Phe Glu Gln Tyr Leu His Gln Asp Trp Thr Pro 100 105 110 Glu Val Lys Gln Ala Trp Val Asp Ala Leu Thr Ala Ile Thr Ala Leu 115 120 125 Met Leu Lys Gly Ala Gly Glu Asp Tyr Ala Leu Leu Thr Val 130 135 140 <210> 29 <211> 153 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mine drainage metagenome <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(153) <223> Vhb07 <400> 29 Met Ala Ile Asn Ile Gln Leu Ile Gln Ser Ser Gly Ala Ala Val Lys 1 5 10 15 Asp Leu Gly Val Pro Val Ala Glu His Phe Tyr Asn Tyr Met Phe Thr 20 25 30 His Phe Pro Glu Val Arg Lys Met Phe Pro Gly Asp Met Thr Glu Gln 35 40 45 Arg Val Arg Leu Phe Asn Ser Val Ile Leu Ile Ala Thr Asn Ile Asp 50 55 60 Thr Met Glu Val Leu Val Pro Tyr Leu Lys Glu Leu Gly Ile Gly His 65 70 75 80 Ile Lys Tyr Asp Thr Arg Pro Glu His Tyr Pro Ile Val Gly Lys Ser 85 90 95 Leu Leu Asn Thr Leu Lys His Phe Leu Gly Glu Ala Trp Thr Gln Glu 100 105 110 Met Ala Glu Ser Trp Ile Glu Ala Tyr Asn Leu Ala Ser Thr Val Cys 115 120 125 Ile Glu Ala Ala Tyr Glu Ala Met Ala Pro Ser Arg Phe Val Pro Val 130 135 140 Thr Ile Asp Asp Val Pro Pro Ala Val 145 150 <210> 30 <211> 149 <212> PRT <213> Aeromonas molluscorum 848 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(149) <223> Vhb08 <400> 30 Met Thr Phe Asp Glu Ile Asp Leu Val Gln Arg Ala Trp Ser Arg Ile 1 5 10 15 Ser Leu Phe Ser Asn Ala Phe Val Arg Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Phe 20 25 30 Arg Leu Asp Glu Arg Leu Glu Thr Met Phe Ser Leu Thr Asp Asp Arg 35 40 45 Leu Ile Asp Lys Val Ala Gln Thr Leu Asn Thr Val Leu Thr Ser Leu 50 55 60 Glu Gln Leu Asp Ser Leu Arg Phe Ile Ile Arg His Leu Gly Glu Arg 65 70 75 80 His Arg Gln Tyr Gly Val Leu Pro Ala His Phe Asp Leu Val Lys Glu 85 90 95 Ala Met Thr Arg Val Met Ala Cys Arg Leu Gly Glu Tyr Phe Thr Pro 100 105 110 Ala Leu Ala Leu Ala Trp Ser Gly Ala Tyr Asp Glu Ile Ala Ala Ile 115 120 125 Met Ile Glu Gly Leu Gln Ala Glu Glu Pro Cys Thr Glu Gly Ala Asp 130 135 140 Met Asp Ile Ser Gln 145 <210> 31 <211> 136 <212> PRT <213> Phaeobacter gallaeciensis DSM 26640 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(136) <223> Vhb09 <400> 31 Met Val Ser Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ile His Lys Ser Val Glu Ser 1 5 10 15 Glu Arg Met Glu Leu Asp His Phe Val Arg Leu Phe Tyr Ala Lys Phe 20 25 30 Phe Glu Ile Cys Pro Asp Val Arg Ala Leu Phe Pro Asn Asp Met Ala 35 40 45 Ser Gln His Glu Lys Leu Leu Thr Ser Leu Thr His Ile Ile Glu Ala 50 55 60 Leu Asp His Pro Glu Lys Leu Ser Ala Ile Leu Lys His Gln Gly Glu 65 70 75 80 Arg His Arg Ala Ile Gln Ile Thr Asp Ala His Phe Asp Gly Phe Ile 85 90 95 His Ser Phe Thr Gly Ala Leu Ala Asp Ile Leu Gly Pro Glu Trp Ser 100 105 110 Glu Asp Thr His Ser Ala Trp Arg Ser Phe Leu Thr Asp Val Ala Leu 115 120 125 Asn Met Asn Phe Leu Arg Thr Ala 130 135 <210> 32 <211> 137 <212> PRT <213> Spirosoma radiotolerans <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(137) <223> Vhb10 <400> 32 Met Thr Asn Gln Gln Leu Thr Leu Val Lys Gln Ser Trp Thr Leu Leu 1 5 10 15 Arg Glu Val Asp Pro Ala Ile Leu Gly Asp Val Phe Tyr Gly Arg Leu 20 25 30 Phe Phe Asn Tyr Pro Asn Leu Arg Pro Leu Phe Lys Gly Pro Met Asp 35 40 45 Arg Gln Tyr Gln Lys Phe Ile Asp Met Leu Ser Ile Leu Val Ala Arg 50 55 60 Leu Asp Arg Pro Tyr Ala Val Glu Gln Glu Ile Ser Gln Leu Gly Gln 65 70 75 80 Ser His Ala Gln Tyr Gly Ile Lys Pro Glu His Tyr Glu Pro Val Lys 85 90 95 Asp Ala Leu Leu Trp Thr Leu Glu Arg Gly Leu Gly Asn Asp Trp Asn 100 105 110 Asp Asp Val Arg Gln Gly Trp Ile Ala Cys Tyr Asp Arg Leu Thr Arg 115 120 125 Ala Met Leu Gly Arg Glu Asn Asn Leu 130 135 <210> 33 <211> 140 <212> PRT <213> Shewanella loihica (strain ATCC BAA-1088 / PV-4) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(140) <223> Vhb11 <400> 33 Met Pro Leu Thr Asp Glu Gln Lys Gln Leu Ile Gln Lys Ser Phe Ala 1 5 10 15 Glu Ile Asn Arg Gln Asn Ser Asn Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Cys 20 25 30 Leu Phe Ala Met Ala Pro Leu Ile Arg Pro Met Phe Gln Ser Glu Arg 35 40 45 Pro Val Phe Glu Tyr His Phe Asn Glu Leu Ile Thr Thr Ala Val Ala 50 55 60 Lys Val His Gln Phe Asn Glu Val Lys Pro Lys Leu Glu Glu Leu Gly 65 70 75 80 Arg Lys His Leu Asp Tyr Gly Val Asn Ile Ser Gln Phe Glu Val Val 85 90 95 Arg Ala Ala Leu Leu Leu Ser Ile Gln Asp Cys Leu Arg Asp Ala Ser 100 105 110 Ser Pro Ala Ile Glu Gln Ala Trp Ser Cys Tyr Tyr Asp Glu Ile Ala 115 120 125 Lys Val Met Ile Ala Ala Met Gln Glu Ala Ala Ser 130 135 140 <210> 34 <211> 142 <212> PRT <213> Sulfurimonas gotlandica (strain DSM 19862 / JCM 16533 / GD1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(142) <223> Vhb12 <400> 34 Met Glu Leu Ser Ala Lys Thr Ile Glu Ile Val Lys Ala Thr Ala Pro 1 5 10 15 Ile Val Ala Ala Asn Ala Glu Ala Ile Thr Ser Thr Met Tyr Lys Ile 20 25 30 Met Phe Thr Asn His Pro Glu Ile Lys Glu Leu Phe Lys Asp Ala Lys 35 40 45 Pro Asp Gln His Lys Lys Leu Ala Ala Ala Val Gly Ala Tyr Ala Ala 50 55 60 Asn Ile Asp Asn Leu Ile Val Leu Glu Lys Ala Ile Glu Lys Met Val 65 70 75 80 Ser Thr His Ile Leu Lys Asn Val Gln Pro Glu His Tyr Pro Ile Val 85 90 95 Gly Ile Ser Ile Leu Glu Ala Ile Lys Lys Val Leu Gly Asp Ala Val 100 105 110 Thr Leu Glu Val Leu Asp Ala Trp Lys Glu Ala Tyr Phe Phe Leu Ala 115 120 125 His Val Leu Ile Glu Gln Glu Lys Leu Ala Tyr Ala Asp Val 130 135 140

Claims (46)

  1. 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연결된 이종 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 숙주 세포로서, 여기서 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래되고, 길이가 100 염기쌍 미만이고, 상이한 성장 조건에 걸쳐 유전자를 구성적으로 발현시키고, 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터의 래더를 형성하도록 협력할 수 있으며, 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가진 유전자인 숙주 세포.
  3. 제 1 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 것인 숙주 세포.
  4. 제 1 항에 있어서,
    숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 숙주 세포.
  5. 생체 분자를 생산하기에 적합한 조건하에서 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생체 분자를 생산하는 방법으로서, 생체 분자는 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 생체 분자의 생산을 증가시킬 수 있는 미생물을 생성하는 방법으로서,
    a) 숙주 미생물을 유전자 변형시키는 단계로서, 변형시키는 단계는 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터의 박테리아 헤모글로빈 유전자의 숙주 미생물의 게놈 속으로 도입을 포함하며, 여기서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터의 각각의 박테리아 헤모글로빈 유전자는 프로모터에 기능적으로 연결되며, 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래되고, 길이가 100 염기쌍 미만이고, 상이한 성장 조건에 걸쳐 유전자를 구성적으로 발현시키고, 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터의 래더를 형성하도록 협력할 수 있으며, 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 서열을 포함하고, 변형은 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현하는 숙주 미생물의 균주를 생성하는 단계;
    b) 숙주 미생물의 복수의 균주가 생성 될 때까지 복수 회 동안 단계 a)를 반복하는 단계로서, 숙주 미생물의 복수의 균주 각각의 균주는 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터 별도의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현시키는 단계;
    c) 숙주 미생물의 복수의 균주의 각각의 균주를 발효 조건하에서 탄소원과 접촉시키는 단계; 및
    d) 대조군 미생물로부터 생산된 생체 분자의 양과 비교하여 생체 분자의 증가된 양을 생산하는 숙주 미생물의 각 균주를 선택하는 단계로서, 여기서 생체 분자는 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 대조군 미생물은 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로부터 박테리아 헤모글로빈 유전자를 발현하지 않는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자는 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자이며, 여기서 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 방법.
  11. 제 6 항에 있어서,
    헤모글로빈의 라이브러리에서 박테리아 헤모글로빈의 적어도 하나는 박테리아 플라보헤모글로빈이며, 여기서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자 및 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 방법.
  12. 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리로서, 여기서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리에서 각각의 박테리아 헤모글로빈 유전자는 프로모터에 기능적으로 연결되며, 여기서 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래되고, 길이가 100 염기쌍 미만이고, 상이한 성장 조건에 걸쳐 유전자를 구성적으로 발현시키고, 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터의 래더를 형성하도록 협력할 수 있으며, 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리.
  13. 제 12 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 라이브러리.
  14. 제 12 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 라이브러리.
  15. 제 12 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 라이브러리.
  16. 제 12 항에 있어서,
    라이브러리에서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 각각은 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자이며, 여기서 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 라이브러리.
  17. 제 12 항에 있어서,
    박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리에서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 적어도 하나는 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자이며, 여기서 박테리아 헤모글로빈 유전자의 라이브러리는 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 헤모글로빈 유전자 및 표 2에 열거된 미생물의 균주, 종 또는 아종으로부터의 하나 이상의 박테리아 플라보헤모글로빈 유전자를 포함하는 것인 라이브러리.
  18. 숙주 세포 속에 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 라이브러리로부터의 박테리아 헤모글로빈 유전자를 도입시키는 단계 및 생체 분자를 생산하는데 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생체 분자를 생산하는 방법으로서, 여기서 생체 분자는 작은 분자, 아미노산, 뉴클레오타이드, 유기산 또는 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
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