CN112300971B - 高通量基因合成法提高食气梭菌一氧化碳利用率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高通量基因合成法提高食气梭菌一氧化碳利用率的方法。具体地，本发明提供了一种工程化的食气梭菌，所述的工程化的食气梭菌的一氧化碳利用率为≥30.0％，较佳地为≥37.5％，更佳地为≥40.0％。并且，本发明提供了所述的工程化的食气梭菌的制备方法和用途，以及一种高效利用一氧化碳的生物固碳方法。本发明所提供的技术方案成功提高了食气梭菌的生长和发酵表型以及碳利用率，为后续食气梭菌的代谢工程设计和改造提供了新思路。

Description

高通量基因合成法提高食气梭菌一氧化碳利用率的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量基因合成法提高食气梭菌一氧化碳利用率的方法。
背景技术
在微生物发酵工业中糖基原料一直是重要的底物来源，随着可持续发展的需求，更新、更为廉价的生物质原料作为重组微生物的工业发酵原料具有更为广阔的前景。
近年来，碳一气体已引起广泛关注。碳一气体是一种来源广泛、价格低廉的重要碳资源，包括CO、CO2和CH4等，主要来源于包括大型石化、冶炼企业的废气、由含碳物质如煤、石油、天然气以及生物质等气化制备的合成气。因此，碳一气体的资源化和能源化利用，对工业可持续发展有重要意义。
利用微生物发酵，生物转化碳一气体，相对于传统化学催化法有诸多优势，如：产物具有高度特异性，对气体组分的成分和配比要求较低，耗能低更安全等等。近年来，美国Coskata公司，INEOS Bio及新西兰朗泽公司都在攻关碳一气体(CO2/CO)微生物发酵产乙醇的技术。我国作为碳排大国，发展碳一气体的高效利用技术，对缓解环境压力和满足资源能源需求有重大意义。
化能固碳微生物是一类能很好利用碳一气体的微生物，其能够利用CO或CO2作为碳源、CO和H2作为能源合成生物质，并发酵生产各种化学品。食气梭菌是这类微生物中的重要成员，能利用CO/CO2/H2混合气体生产乙酸、乙醇和丁醇，是理想的CO/CO2生物转化微生物。其中，扬氏梭菌遗传操作技术建立成熟，是适于人工设计改造的底盘细胞。
目前，扬氏梭菌除天然能发酵生产乙醇和乙酸外，研究者通过合成生物学技术改造，使其能生产丁醇、丁酸、异丙醇和3-羟基丁酸等化合物，拓展了碳一气体微生物转化的产物谱，具有极大应用前景。在钢厂尾气、合成气等碳一气体中，CO是重要的组成成分，它作为食气梭菌重要的能源和碳源，对其生长和发酵产量起决定性作用。
然而，CO在水中可溶性低(仅为氧气的77％)，那么CO的气-液传质速率便是决定合成气微生物发酵的细胞密度和产物产量的重要限制性因素。所以，如何有效地提高CO的气-液传质速率，是食气梭菌微发酵中的亟待解决的问题。
因此，本领域迫切需要开发一种提高固碳微生物的一氧化碳利用率的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种提高固碳微生物的一氧化碳利用率的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种工程化的食气梭菌，所述的工程化的食气梭菌的一氧化碳利用率为≥30.0％，较佳地为≥37.5％，更佳地为≥40.0％。
在另一优选例中，所述的利用率是指发酵全程所消耗的一氧化碳的物质的量比发酵全程所提供的一氧化碳的物质的量的总量所得的比率。
在另一优选例中，所述食气梭菌选自下组：扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)。
在另一优选例中，所述工程化的食气梭菌是工程化的食气扬氏梭菌。
在另一优选例中，所述工程化的食气梭菌中，含有一载体，所述载体中含有用于表达外源血红蛋白的表达盒。
在另一优选例中，所述载体是pMTL83151载体。
在另一优选例中，所述用于表达外源血红蛋白的表达盒中，包括编码外源血红蛋白的基因序列。
在另一优选例中，所述血红蛋白的来源选自下组：智人(Homo sapiens)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、分枝结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC 6803)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、空肠弯杆菌(Campylobacter jejuni)，或透明颤菌(Vitreoscilla sp.)C1。
在另一优选例中，所述血红蛋白的来源为：空肠弯杆菌或透明颤菌。
在另一优选例中，所述外源血红蛋白是CGb或VHb。
在另一优选例中，编码所述血红蛋白的基因的Locus tag为Cj1586或ADP71_11980。
在另一优选例中，所述用于表达外源血红蛋白的表达盒中，还包括启动子、终止子，和/或rbs区域。
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：Pthl9、P1339、P1440，或其组合。
在另一优选例中，所述的启动子为Pthl9启动子。
在本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的工程化的食气梭菌的制备方法，包括步骤：将用于表达外源血红蛋白的表达盒可操作地插入一食气梭菌中，从而获得如本发明第一方面所述的工程化的食气梭菌。
在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的工程化的食气梭菌的用途，用于制备一发酵种子液，所述发酵种子液用于在利用钢厂尾气生产乙酸和乙醇的发酵过程中提高一氧化碳的利用率。
在另一优选例中，所述一氧化碳的利用率可被提高35％，较佳地37.5％，更佳地40％。
在另一优选例中，所述发酵种子液中的工程化的食气梭菌的浓度为OD600＝0.8至OD600＝1.2，较佳地OD600＝0.8至OD600＝1.2，更佳地OD600＝0.8至OD600＝1.2。
在另一优选例中，所述发酵种子液中还包括美国模式培养物保藏所(AmericanType Culture Collection，ATCC)培养基1754。
在另一优选例中，所述发酵过程中，发酵液中的工程化的食气梭菌的浓度为OD600＝2.3至OD600＝2.4，较佳地OD600＝2.3至OD600＝2.4，更佳地OD600＝2.3至OD600＝2.4。
在本发明的第四方面，提供了一种高效利用一氧化碳的生物固碳方法，包括步骤：
(i)在生物固碳的发酵液中添加发酵种子液，所述发酵种子液中包括如本发明第一方面所述的工程化的食气梭菌；和
(ii)在适合生物固碳的条件下，对发酵液进行发酵。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的适合生物固碳的条件包括具有富含一氧化碳的合成气的发酵气体。
在另一优选例中，所述的发酵气体为富含一氧化碳的合成气，所述合成气包括CO、CO2、H2和N2。
在另一优选例中，所述合成气中，CO所占体积为54％至58％，较佳地56％。
在另一优选例中，所述合成气中，CO2所占体积为18％至22％，较佳地20％。
在另一优选例中，所述合成气中，H2所占体积为7％至11％，较佳地9％。
在另一优选例中，所述合成气中，N2所占体积为13％至17％，较佳地15％。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的适合生物固碳的条件包括：发酵温度为35至37℃，较佳地35至37℃，更佳地37℃。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的适合生物固碳的条件包括：发酵时间为80至120小时，较佳地90至100小时。
在本发明的第五方面，提供了一种发酵种子液，所述发酵种子液中包括如本发明第一方面所述的工程化的食气梭菌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了过量表达不同血红蛋白的扬氏梭菌的生长和发酵表型。
其中，图1A显示了不同血红蛋白对重组菌株生长表型，即菌体浓度(OD600)的影响。图2B显示了过量表达不同血红蛋白的重组菌株发酵终点(96h)的乙醇和乙酸的总浓度。图中显示为3次生物学重复的结果。
发酵条件：1754培养基(20ml)、CO-CO2-H2-N2(56％/20％/9％/15％；0.2MPa)、5％的接种量(v/v)。
图2显示了过量表达CGb和VHb的扬氏梭菌的生长和发酵表型以及一氧化碳利用情况。
其中，图2A显示了过量表达CGb和VHb的重组菌株生长表型，即菌体浓度(OD600)的影响。图2B显示了过量表达CGb和VHb的重组菌株发酵过程中的乙醇和乙酸的总浓度。图2C显示了过量表达CGb和VHb的重组菌株发酵过程中的一氧化碳利用情况。图中显示为3次生物学重复的结果。
发酵条件：1754培养基(20ml)、CO-CO2-H2-N2(56％/20％/9％/15％；0.2MPa)、5％的接种量(v/v)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种提高固碳微生物的一氧化碳利用率的方法。具体地，本发明人对过量表达不同血红蛋白基因的扬氏梭菌重组菌株进行发酵筛选，发现不同来源的血红蛋白对菌株的生长状态有不同程度的提升。借助高效气相色谱进一步对发酵产物进行检测，发现产物浓度与菌株的生长表型呈正相关。并且，本发明人对筛选实验中表型最优的重组菌株(过量表达CGb和VHb的扬氏梭菌)进行发酵验证，确定血红蛋白CGb和VHb对菌株的生长状态有促进作用，菌体浓度能够提升约25％，乙醇和乙酸的产量能提升20％左右，一氧化碳的利用量也相较野生型提升约30％左右。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“本发明工程菌株”、“重组菌株”、“扬氏梭菌重组菌株”和“工程化的食气梭菌”可互换使用，是指本发明中在生物固碳的过程中用于提高一氧化碳利用率的菌株，即本发明第一方面所述的菌株。
血红蛋白
血红蛋白英文缩写为HGB或Hb。血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是使血液呈红色的蛋白，由珠蛋白和血红素组成，其珠蛋白部分是由两对不同的珠蛋白链(α链和β链)组成的四聚体。
血红蛋白是生物体中运载氧气的重要蛋白。在部分好氧菌中，在微氧条件下会合成血红蛋白，提高氧气的摄取和利用，以保障菌体的生长。随着研究的不断深入，越来越多的细菌(如透明颤菌(Vitreoscilla sp.)、真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)和空肠弯杆菌(Campylobacter jejuni)等)的血红蛋白被鉴定并应用到菌株的代谢改造中，以提高工程菌株在缺氧或者高密度发酵下的生长和底物利用。血红蛋白在酶工程改造中可以作为重要的“伴侣蛋白”以增强酶活性。例如，将人源的血红蛋白与超氧化物歧化酶融合增强了大肠杆菌的抗氧化特性，将透明颤菌来源的血红蛋白与D-氨基酸氧化酶融合，增强了头孢菌素C的生物转化等。
同时，血红蛋白不仅能与氧气结合，还能与一氧化碳可逆性的结合，且具有极强的结合能力。
在本发明中，所筛选出的用于本发明方法的效果较佳的血红蛋白包括来源于透明颤菌或空肠弯杆菌的血红蛋白，即CGb或VHb，其在NCBI中的locus tag编号分别为Cj1586和ADP71_11980。
本发明方法
在本发明中，利用血红蛋白与一氧化碳的结合特性，提供了一种高效利用一氧化碳的生物固碳的方法。
本发明的方法中，提供了一种利用血红蛋白的提升食气梭菌性能的技术手段。即通过在菌株中优化表达血红蛋白后，使得菌株的生长速率和一氧化碳利用率得到显著提升，进而高效合成有机溶剂产物。
具体地，本发明人在重要工业产溶剂梭菌—食气扬氏梭菌中异源表达不同物种的血红蛋白，使用钢厂尾气发酵筛选验证，获得了一种通过过量表达血红蛋白CGb或VHb，提高扬氏梭菌一氧化碳利用率和发酵表型的方法。
因此，本发明的方法克服了一氧化碳在食气菌气体发酵培养基中溶解度低和传质速率低的问题，以提高一氧化碳的利用效率和菌体的生长浓度。并且，本发明公开了提高一氧化碳利用率表型最优的血红蛋白名称及其序列。
本发明的主要优点包括：
1)本发明提出了一种在重要工业产溶剂梭菌—食气扬氏梭菌中提高一氧化碳利用率和生长表现的方法。
2)本发明的方法在菌株中异源表达不同物种的血红蛋白，提高了菌株在一氧化碳气体发酵时的菌体浓度，产物浓度和一氧化碳利用率。
3)本发明筛选出了提高一氧化碳利用率效果最佳的血红蛋白名称及其序列。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：在扬氏梭菌中对不同来源的血红蛋白进行筛查
实验方法：
利用梭菌通用性强人工启动子分别对9种不同来源的血红蛋白基因进行过量表达，鉴定血红蛋白对菌株发酵表型的影响。
实验步骤：
1)选取在微生物中曾经用于工程改造的血红蛋白，或者已报道的对一氧化碳有极强结合力的血红蛋白，选定9种血红蛋白作为初步筛查的靶点蛋白，见表1。
2)将上述9种血红蛋白的合成基因构建在pMTL83151载体上，并用强人工启动子Pthl9对基因进行表达。
3)将上述含血红蛋白表达基因的载体转入扬氏梭菌中。获得的工程菌以富含一氧化碳的合成气(CO-CO2-H2-N2，体积比56％/20％/9％/15％)进行发酵。
实验结果：
通过对过量表达不同血红蛋白基因的扬氏梭菌重组菌株进行发酵筛选，发现不同来源的血红蛋白大部分对菌株的生长有促进，见图1A。借助高效气相色谱进一步对发酵终点的产物浓度进行检测，发现产物浓度与菌株的生长表型类似，即乙醇和乙酸的产量有不同程度的提升(图1B)。
表1：用于初步筛选的不同血红蛋白的来源和基因编号
Figure BDA0002145701380000071
Figure BDA0002145701380000081
实施例2：筛选出发酵表型贡献最大的血红蛋白
实验方法：
将步骤1中表现最优的两株重组菌株挑选出来进行进一步气体发酵验证，并测定气体中一氧化碳的利用。
实验步骤：
1)、对不同重组菌株发酵终点(96h)产乙酸和乙醇的总量进行编序，选取溶剂总量最高的过量表达CGb和VHb的两株菌进一步确认。
2)、将1)中的选定的重组菌株在YTF平板上活化，进行气体发酵，监测生长表型。
3)、在2)的发酵历程中取不同时间点的发酵样液，通过高效气相色谱测定乙酸和乙醇的产量。取不同时间点的剩余气体样品，通过高效气相色谱测定一氧化碳的余量。
实验结果：
通过对过量表达CGb和VHb的扬氏梭菌重组菌株进行发酵验证，发现血红蛋白CGb和VHb对菌株的生长状态有促进作用，菌体浓度最高提升约25％，见图2A。借助高效气相色谱进一步对发酵产物进行检测，发现产物浓度与菌株的生长表型类似，即乙醇和乙酸的产量最高能提升20％左右(图2B)。重组菌株的一氧化碳的利用量也相较野生型有明显提升，约30％左右(图2C)。
讨论
为了便于理解，本发明人提供以下原理供参考。
应理解，本发明的保护并不受所述原理的限制。此外，所述原理也可能仅反映了本发明的食气梭菌能够高效利用一氧化碳的部分原因。
本发明的实施例的筛选过程中，实际筛选出的效果较佳的血红蛋白同源物应当具备如下特征：在生物固碳的发酵过程中，与一氧化碳具有较佳的结合能力；并且，在工程菌株的细胞内代谢过程中，能够适时具有较佳的释放一氧化碳的能力。
然而，上述的特征涉及较为复杂的微生物细胞代谢的过程，无法通过理论预测得到。
因此，本发明的筛选意在通过实验直接得出较好的血红蛋白同源物的优选例，并构建重组菌株，成功提高了食气梭菌的生长和发酵表型以及碳利用率，为后续食气梭菌的代谢工程设计和改造提供了新思路。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (38)

1.一种工程化的食气梭菌，其特征在于，所述工程化的食气梭菌中，含有一载体，所述载体中含有用于表达外源血红蛋白的表达盒。
2.如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述工程化的食气梭菌其一氧化碳利用率≥30.0%。
3.如权利要求2所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述工程化的食气梭菌其一氧化碳利用率≥37.5%。
4.如权利要求2所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述工程化的食气梭菌其一氧化碳利用率≥40%。
5.如权利要求2-4中任一所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述的利用率是指发酵全程所消耗的一氧化碳的物质的量比发酵全程所提供的一氧化碳的物质的量的总量所得的比率。
6.如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述工程化的食气梭菌是工程化的食气扬氏梭菌。
7.如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述载体是pMTL83151载体。
8.如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述用于表达外源血红蛋白的表达盒中，包括编码外源血红蛋白的基因序列。
9. 如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述血红蛋白的来源选自下组：智人(Homo sapiens)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、分枝结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、空肠弯杆菌(Campylobacter jejuni)，或透明颤菌(Vitreoscilla sp.)C1。
10.如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述血红蛋白的来源为：空肠弯杆菌或透明颤菌。
11.如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述外源血红蛋白是来源于空肠弯杆菌的CGb或来源于透明颤菌的VHb。
12.如权利要求1所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述用于表达外源血红蛋白的表达盒中，还包括启动子、终止子，和/或rbs区域。
13.如权利要求12所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述的启动子选自下组：Pthl9、P1339、P1440，或其组合。
14.如权利要求12所述的工程化的食气梭菌，其特征在于，所述的启动子为Pthl9启动子。
15.一种如权利要求1所述的工程化的食气梭菌的制备方法，其特征在于，包括步骤：将用于表达外源血红蛋白的表达盒可操作地插入一食气梭菌中，从而获得如权利要求1所述的工程化的食气梭菌。
16.一种如权利要求1所述的工程化的食气梭菌的用途，其特征在于，用于制备一发酵种子液，所述发酵种子液用于在利用钢厂尾气生产乙酸和乙醇的发酵过程中提高一氧化碳的利用率。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述一氧化碳的利用率可被提高35%。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述一氧化碳的利用率可被提高37.5%。
19.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述一氧化碳的利用率可被提高40%。
20.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述发酵种子液中的工程化的食气梭菌的浓度为OD600=0.8至OD600=1.2。
21. 如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述发酵种子液中还包括美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)培养基1754。
22.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述发酵过程中，发酵液中的工程化的食气梭菌的浓度为OD600=2.3至OD600=2.4。
23. 一种利用一氧化碳的生物固碳方法，其特征在于，包括步骤：
(i) 在生物固碳的发酵液中添加发酵种子液，所述发酵种子液中包括如权利要求1所述的工程化的食气梭菌；和
(ii) 在适合生物固碳的条件下，对发酵液进行发酵。
24.如权利要求23所述的生物固碳方法，其特征在于，在步骤(ii)中，所述的适合生物固碳的条件包括具有富含一氧化碳的合成气的发酵气体。
25.如权利要求24所述的生物固碳方法，其特征在于，所述的发酵气体为富含一氧化碳的合成气，所述合成气包括CO、CO2、H2和N2。
26.如权利要求25所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，CO所占体积为54%至58%。
27.如权利要求26所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，CO所占体积为56%。
28.如权利要求25所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，CO2所占体积为18%至22%。
29.如权利要求28所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，CO2所占体积为20%。
30.如权利要求25所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，H2所占体积为7%至11%。
31.如权利要求30所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，H2所占体积为9%。
32.如权利要求25所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，N2所占体积为13%至17%。
33.如权利要求32所述的生物固碳方法，其特征在于，所述合成气中，N2所占体积为15%。
34.如权利要求23所述的生物固碳方法，其特征在于，在步骤(ii)中，所述的适合生物固碳的条件包括：发酵温度为35至37℃。
35.如权利要求23所述的生物固碳方法，其特征在于，在步骤(ii)中，所述的适合生物固碳的条件包括：发酵时间为80至120小时。
36.如权利要求35所述的生物固碳方法，其特征在于，在步骤(ii)中，所述的适合生物固碳的条件包括：发酵时间为90至100小时。
37.一种发酵种子液，其特征在于，所述发酵种子液中包括如权利要求1所述的工程化的食气梭菌。
38.一种如权利要求1所述的工程化的食气梭菌的用途，其特征在于，用于提升乙醇和乙酸的产量。
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