CN103160544A - 一种使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种利用微生物发酵糖类的方法。本发明藉由基因工程的方式，针对目标细菌的糖类代谢相关路径进行改良，使得目标细菌具备可以同时快速代谢五碳糖与六碳糖的能力，并且达到利用单一菌株即可同时发酵五碳糖与六碳糖的功能，不仅简化发酵的流程，更可以降低发酵成本、提升糖类发酵的效能。
Description
技术领域
本发明是关于一种利用微生物发酵糖类的方法，尤其是关于一种使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法。
背景技术
由再生资源来生产替代性能源和取代石油衍生性的化学品是目前国际市场的主流，也是必然的趋势。再生资源中，尤以植物生质(即木质纤维素)的蕴藏量最丰，而木质纤维素包含纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素和半纤维素经酵素水解后，主要可生成葡萄糖(glucose)和木糖(xylose)，本发明可以将细菌(如：大肠杆菌)改质，经改质后的菌株即具有同时且快速代谢葡萄糖和木糖的能力，并能发酵转化生成能源(如：酒精)和其他大宗化学品(如：乳酸)。
习知技术中，常见利用大肠杆菌对糖类进行发酵的技术，然而此一方法存在着若干尚待解决的问题。大肠杆菌的优势在于生长快速、培养基成分简单且易于调配、发酵过程易于操作、并且可以代谢多种不同的糖类，然而在同时具有多种糖类的生长环境之下，大肠杆菌会优先代谢葡萄糖，待生长环境中的葡萄糖消耗完毕后，才会开始依序代谢其他糖类，因此无法同时代谢不同的糖类，使得整体糖类的代谢速率无法提升，甚至造成非葡萄糖的其他糖类代谢不完全，导致糖类代谢的效率低落。
先前技术利用紫外光、伽玛射线、亚硝基胍(nitrosoguanidine)等致突变剂使得菌种产生突变，接着透过筛选的方式找出可以同时发酵五碳糖与六碳糖的菌株，然而此一方法步骤繁琐，亦非在了解菌种糖类代谢机制的情况下将菌种改良而得到可同时代谢五碳糖与六碳糖的菌株，而是藉由重复筛选的方式摸索寻找可能适合的变种菌株，因此效果较差。
由于大肠杆菌在代谢葡萄糖时所产生的降解产物会抑制其他糖类的代谢路径，因此有习知技术让大肠杆菌的磷酸转移酵素系统产生缺陷，以期降低大肠杆菌代谢葡萄糖时所造成的降解产物抑制效应，希望藉此提高其他糖类的代谢速率。然而，具有缺陷的大肠杆菌虽然可以因此同时代谢葡萄糖与木糖，但是 其对于葡萄糖的代谢速率却明显降低，反而不利于整体的代谢流程及产物生成效率。
若干先前技术会在糖类发酵过程中同时采用两种分别代谢葡萄糖和木糖的菌株，希望能藉由两种菌株分工的方式达到同时代谢五碳糖与六碳糖的目的。但是这样的发酵过程操作不易，必须多次尝试与调整才能达到最佳的发酵成效，并且必须事先培养两种菌株，因此也会导致整体发酵成本的增加，并不利于工业生产的应用。
由于必须克服前述习知技术的缺点，例如发酵成本过高、发酵速率与效率不佳、发酵操作程序困难繁复等，因此有必要找到能够利用易于制备的单一菌株同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，以便改善与简化糖类发酵的程序并提升糖类发酵的效能，藉此提升相关产业界的技术，尤其在生质能源的领域更有其必要性。
发明内容
人类第四次工业革命的产业实系于绿色的制程，其中生物产业被视为绿色工业的代表，生物产业有赖于生物技术为基础，相对于以化石能源为基础的化学工业，生物技术可有效降低能源的消耗和污染的排放，尤其生物技术可利用再生资源，达到永续发展和改善环境的目的。再生资源是指以生物质(biomass)为原料，范围主要包括作物、农林渔牧加工后的废弃物和工业及都市排放的有机废弃物，透过生物精炼制程(biorefinery process)可将这些生物质转化生产替代性能源、取代石油衍生性的产品和新产品，这类新兴产业的市场以每年约15％的速率成长，预计2012年的全球总产值可达到1215亿美元(Gobina E，2007，report code EGY054A，BCC Research publications)。
再生资源中，尤以木质纤维素(lignocellulose)的蕴藏量最丰，木质纤维素的来源广泛，但目前被研究可做为发酵料源的，包括(1)农业残留物如甘蔗渣、稻秆、榖壳、玉米秆等，(2)非粮食作物，如芒草等，(3)木本生物质，如麻疯树等，(4)生物质废弃物，如蔬菜和水果废弃物、纸浆废弃物和都市排放固态废弃物等(Dietmar P，2006，Biotechnol J.1：806-814)。一般而言，木质纤维素的组成 包含30-60％纤维素(cellulose)、20-40％半纤维素(hemicellulose)和10-30％木质素(lignin)。而纤维素是一种由葡萄糖以β-1，4糖键结(glycosidic linkage)的聚合糖，由于其本身分子和分子间的氢键键结，以致造成结晶区和非结晶区的结构；半纤维素则是一种由六碳糖和五碳糖所构成的具有复杂分支结构的聚合糖，软木的半纤维素组成分主要是六碳糖如葡萄糖，而硬木的半纤维素组成分主要是五碳糖如木糖(Ganapathy S.et al.2010，Eng.Life Sci.10：8-18)。纤维素和半纤维素经水解后，主要可生成葡萄糖和木糖，绝大部分的微生物皆可有效代谢葡萄糖，然仅有少数的微生物可以发酵木糖，不过代谢效能不彰，以致影响了以木质纤维素为基础的微生物发酵精炼制程的工业发展。
相较于其他细菌，大肠杆菌是一株工业实用友善性极高的菌种，它的优势在于生长快速、培养基质配方简单、发酵易操作，尤其大肠杆菌具有代谢多种类糖(包括木糖)的能力，不过当有多种糖类同时存在的环境下，大肠杆菌将优先使用葡萄糖，其他糖类(如木糖)的代谢则受到抑制，待葡萄糖消耗完后，其他糖类再依次代谢，因此迟缓了糖的代谢速率，甚至造成其他糖类代谢的不完全，以致效率不佳。
基于此，本发明技术就是运用代谢工程的技术来改质大肠杆菌，根据大肠杆菌的葡萄糖和木糖代谢路径，剔除大肠杆菌的ptsG基因，以缓和葡萄糖降解物抑制的现象，再引介运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促进基因(glucose facilitator gene)glf，以增进大肠杆菌的葡萄糖代谢速率，且加强五碳糖磷酸代谢路径的rpiA、tktA、rpe、talB基因表现，以增加大肠杆菌木糖代谢的速率，最后移除生产其他有机酸的ldhA、frdA、pta、poxB基因，以便移除生成的有机酸对于五碳糖磷酸的回馈抑制作用。整合以上的代谢工程技术，经改质后的单一菌株即能同时代谢葡萄糖和木糖，且葡萄糖和木糖的消耗速率可几乎达到同步，操作简易方便，亦可简化发酵程序，以生产能源(如酒精)和其他大宗化学品(如乳酸)为最佳实施例，可有效提升发酵产品的生产效能，极具发展前瞻性和潜力。
图3.大肠杆菌的葡萄糖和木糖代谢路径。
本发明是利用基因工程的方式改良大肠杆菌的代谢路径，使大肠杆菌得以 同时且快速地代谢五碳糖与六碳糖，包含以下步骤：剔除大肠杆菌的ptsG基因，以缓和葡萄糖降解物抑制的现象；引介运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促进基因(glucose facilitator gene)glf，以增进大肠杆菌的葡萄糖代谢速率；引入一起动子以加强五碳糖磷酸代谢路径的rpiA、tktA、rpe、talB基因表现，藉此增加大肠杆菌木糖代谢的速率；剔除生产其他有机酸的ldhA、frdA、pta、poxB基因，以便移除代谢过程中生成的有机酸对于五碳糖磷酸的回馈抑制作用。
因此，本发明的一种利用微生物发酵糖类的方法不但可以增进菌株发酵植物生质水解产物的速率，亦可简化发酵程序，并且有效提升发酵产品的生成效能，具有国内外市场需求的潜力。
附图说明
图1为本发明的一种实施方式的流程图。
图2为本发明的另一实施方式的流程图。
图3.大肠杆菌的葡萄糖和木糖代谢路径。
图4.DNA电泳图。
图5.质体pND-glf图谱。
图6.质体pHK-glf图谱。
图7.DNA电泳图。
图8.质体pPhi80-rTA图谱。
图9.DNA电泳图。
图10.质体pLam-rTB图谱。
图11.DNA电泳图。
图12.质体pMC-poxKm图谱。
图13.DNA电泳图。
图14.质体pMC-ptaKm图谱。
图15.DNA电泳图。
图16.质体pND-pet图谱。
图17.重组菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet的混合糖消耗曲线。
图18.重组菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet发酵混合糖生产酒精曲线。
图19.重组菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet的混合糖消耗曲线。
图20.重组菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet发酵混合糖生产酒精曲线。
图21.重组菌株BL-A4/pND-pet的混合糖消耗曲线。
图22.重组菌株BL-A4/pND-pet发酵混合糖生产酒精曲线。
图23.质体pTrc-H/D-ldh图谱。
图24.BL-A4/pTrc-H/D-Ldh的混合糖发酵生产乳酸曲线。
具体实施方式
本发明于实施例中所提及的实验操作方法，优先说明如下：
一般实验方法与材料
本发明技术中采用的一般实验方法和DNA选殖（DNA cloning）主要可参考本技艺中所详知的教科书：Sambrook J,Russell DW,2001,Molecular Cloning：a Laboratory Manual.3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，其中例如限制酶剪切DNA片段反应(cleavage reaction by restricting enzyme)、使用T4DNA黏接酶（ligase）黏接DNA片段反应(DNA ligation with T4DNA ligase)、聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction,PCR）、琼脂凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）、硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）和质体转形（transform）等，这些技术都是熟悉此项技术的人士可根据本身的专业素养来实施。此外、细菌培养液密度是使用分光亮度计(V530,Jasco)测量，测定波长为550nm，所得到的吸光值记录为OD550。蛋白质浓度分析则是使用蛋白质分析试剂(Protein assay Reagent,BioRad Co.)，进行总蛋白质的定量，个别标的的蛋白质则是以影像分析仪(AlphaImagerEP,AlphaInnotech)来分析经凝胶电泳分离的蛋白质加以定量。
细菌及噬菌体染色体(chromosome)、质体(plasmid)和DNA片段的纯化则分别使用 Genomic DNA Purification kit(Promega Co.)、High-Speed Plasmid Mini kit(Geneaid Co.)和Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit(Geneaid Co.)等商业纯化药品组。DNA核苷酸定点突变则使用 Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene Co.)、限制酶(Restriction enzyme)购自 New England Biolabs以及Fermentas Life Science，T4 DNA黏接酶和Pfu DNA聚合酶(polymerase)购自Promega Co.，聚合酶连锁反应中所须的引子(primers)委由明欣生物科技公司(台北)及源资生物科技公司(台北)合成。
DNA选殖过程中所使用的中介细胞为大肠杆菌DH5α(Stratagene Co.)、BW25142(Haldimann and Wanner，2001，J.Bacteriol.，183：6384-93)与BL21(DE3)(Invitrogen Co.)，细菌以LB营养基(Miller JH，1972，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)培养，而经转形的菌种则在培养基中添加抗生素培养，抗生素用量如安培西林(ampicillin)为50μg/mL，康纳霉素(kanamicin)为50μg/mL。
实施例一：
1.剔除大肠杆菌染色体的ptsG基因：
根据前人的研究，移除ptsG基因产物的功能后，可减缓大肠杆菌中葡萄糖降解物抑制的效应，使得大肠杆菌可以同时利用木糖和葡萄糖。因此，首先剔除大肠杆菌染色体的ptsG基因，其进行步骤如下所述。根据EcoCyc基因体数据库中ptsG基因周遭的核苷酸序列来合成以下两个引子：
顺向引子1：
(5’-TGGGTGAAACCGGGCTGG)
反向引子2：
(5’-AGCCGTCTGACCACCACG)
使用Wizard Genomic DNA purification kit(Promega Co.)来纯化菌株CGSC 9031(E.coli Genetic Stock Center，USA)的染色体，以纯化后的染色体为DNA模版(template)，使用上述两个引子进行PCR反应，增幅出一段DNA(2.8kb)，其两端包含ptsG基因N端及ptsG基因C端的同源区域，而其中间部分则包含一个两端被FRT位置(sites)镶夹的抗康纳霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化。接着，依照前述的“化学转形法”，将协助型质体pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，2000，Proc.Natl.Aca.Sci.USA，97：6640-6645)转形入大肠杆菌亚型B BL21中，得到菌株BL21/pKD46。依 照前述的“电穿孔法”，准备菌株BL21/pKD46的胜任细胞，再利用电穿孔法将上述所得的线性DNA送入菌株BL21/pKD46中，随后以SOC培养基于30℃下培养，同时加入1mM阿拉伯糖进行诱导生产质体pKD46上的λ-Red基因，以帮助此增幅出来的线性DNA与染色体ptsG基因进行同源重组(homologous recombination)，诱导二小时后，将培养温度提升到42℃，经二小时后以离心机将细胞离心下来，移除上清液，将细胞涂洒在含有抗康纳霉素的LB固态培养基上。随意挑选生长于固态培养基的菌落，以顺向引子3和反向引子4(如下)，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体基因ptsG中所镶嵌的抗康纳霉素基因，如图4中所示，挑选出的菌株可增幅出抗康纳霉素基因的DNA片段，然而原生型菌株BL21则无法增幅出抗康纳霉素基因的DNA片段。最后选择其中一株菌株，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，重新命名为BL-G。
图4.DNA电泳图。径1：原生型菌株BL21；径2：DNA标准物；径3：染色体镶嵌抗康纳霉素基因的菌株。
顺向引子3：
(5’-GATTGAACAAGATGGATTGC)
反向引子4：
(5’-GAAGAACTCGTCAAGAAGGC)
2.建构含有glf基因的重组大肠杆菌菌株：
根据前人的研究报导，ptsG基因缺陷大肠杆菌的葡萄糖消耗速率将大幅降低，另一方面，过去的研究显示来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促进基因(glucose facilitator gene)glf产物可提供大肠杆菌运输葡萄糖到胞内的功能(Parker C et al.，1995，Mol Microbiol.15：795-802)，为了设法提升此缺陷菌BL-G的葡萄糖消耗速率，因此将glf基因引介入ptsG基因缺陷大肠杆菌中。建构过程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库glf的核苷酸序列(GenBank：M60615.1)来合成glf基因引子：
顺向引子5：
(5’-TGTCTCTAGAAGCATGCAGGAGGAATCG)
反向引子6：
(5’-AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)
上述顺向引子被设计含有限制酶XbaI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有XhoI的切割位置(如底线所标示者)。以Z.mobilis的染色体做为DNA模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有glf的片段(1.4kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，使用限制酵素XbaI以及XhoI切割此基因片段；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化质体pND707(Love CA et al.，1996，Gene，176：49-53)，以限制酵素XbaI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收。接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述两个片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pND-glf，如下图5所示。
图5.质体pND-glf图谱。符号简写说明：bla，抗安培西林基因；CI857，抑制子；lambda PR，λPR启动子；lambda PL，λPL启动子。
接着，构筑镶嵌式质体(integration plasmid)pHK-glf，根据质体pND-glf的DNA序列，设计以下的引子：
顺向引子7：
(5’-AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG)
反向引子8：
(5’-AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)
上述顺向引子被设计含有限制酶BamHI的切割位置(如底线所标示者)。以质体pND-glf做为DNA模板，并以上述两个引子进行菌落PCR反应，增幅出一段含有受λPRPL启动子调控glf的DNA片段(1.8kb)，以Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，使用限制酵素BamHI以及SmaI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化的镶嵌式质体pHK-Km(Chiang CJ et al.，2008，Biotechnol.Bioeng.101：985-995)，以限制酵素 BamHI以及SmaI切割；接着使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将上述被酵素切割过的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述两个片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α(pir)中，而得到镶嵌式质体pHK-glf，质体图谱如下图6所示。
图6.质体pHK-glf图谱。符号简写说明：Km，康纳霉素抗性基因；R6K origin，大肠杆菌R6K复制源点；HK attP，前嗜菌体(prophage)HK镶嵌位置；lambda PR，PR启动子；lambda PL，PL启动子。
其次，将受λPRPL启动子调控glf基因镶嵌至ptsG基因缺陷菌株BL-G的染色体上，因此将协助型质体pAH69(Haldimann A and Wanner BL.，2001，J Bacteriol.，183：6384-6393)依照前述的“化学转形法”转形进入大肠杆菌菌株BL-G中，得到菌株BL-G/pAH69；接着根据前述的“质体镶嵌细菌染色体法”，将镶嵌式质体pHK-glf再转形入菌株BL-G/pAH69中，进行基因镶嵌入菌株染色体，以含有康纳霉素的LB固态培养基来筛选菌株。挑选单一菌落，利用顺向引子7和反向引子8，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体镶嵌一个glf基因，经挑选出的菌株可增幅出一个受λPRPL启动子调控glf基因片段(径3)，如下图7所示。
图7.DNA电泳图。径1：DNA标准物；径2：质体pHK-glf；径3：染色体镶嵌glf基因菌株。
最后，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，重新命名为BL-Gf。
3.强化大肠杆菌的rpe和tktA基因：
为了增进菌株代谢木糖的速率，因此将强化菌株的五碳糖磷酸代谢路径中的rpe和tktA基因。其执行流程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库rpe的核苷酸序列来合成引子：
顺向引子9：
(5’-TATACATATGAAACAGTATTTGATTGC)
反向引子10：
(5’-CCTGAATTCAAACTTATTCATGACTTACC)
上述顺向引子被设计含有限制酶NdeI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有EcoRI的切割位置(如底线所标示者)。以大肠杆菌BL21的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有rpe基因的片段(0.7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素NdeI以及EcoRI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；另一方面，根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库tktA的核苷酸序列来合成引子：
顺向引子11：
(5’-ACGGGAATTCAGGAGGAGTCAAAATG)
反向引子12：
(5’-GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)
上述顺向引子被设计含有限制酶EcoRI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有XhoI的切割位置(如底线所标示者)。以大肠杆菌BL21的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有tktA基因的片段(2.01kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素EcoRI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；同时利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化质体pND707(Love CA et al.，1996，Gene，176：49-53)，以限制酵素NdeI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收。接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述三个DNA片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pND-rTA。最后依据质体pND-rTA的DNA序列，设计以下的引子：
顺向引子13：
(5’AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG 3’)
反向引子14：
(5’-GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)
上述顺向引子被设计含有限制酶BamHI的切割位置(如底线所标示者)。以质体pND-rTA做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有受λPRPL启动子调控rpe-tktA基因的片段(2.7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素BamHI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化的镶嵌式质体pPhi80-Km (Chiang CJ et al.，2008，Biotechnol.Bioeng.101：985-995)，以限制酵素BamHI以及SmaI切割；接着使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将上述被酵素切割过的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述两个片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α(pir)中，而得到镶嵌式质pPhi80-rTA。
图8.质体pPhi80-rTA图谱。符号简写说明：Km，康纳霉素抗性基因；R6Korigin，大肠杆菌R6K复制源点；Phi80 attP，前嗜菌体(prophage)80镶嵌位置；lambda PR，PR启动子；lambda PL，PL启动子。
其次，将受λPRPL启动子调控rpe-tktA基因镶嵌至步骤2建构的菌株BL-Gf的染色体上，因此将协助型质体pAH123(Haldimann A and Wanner BL.，2001，J Bacteriol.，183：6384-6393)依照前述的“化学转形法”转形进入大肠杆菌菌株BL-Gf中，得到菌株BL-Gf/pAH123；接着根据前述的“质体镶嵌细菌染色体法”，将镶嵌式质体pPhi80-rTA再转形入菌株BL-Gf/pAH123中，进行基因镶嵌入菌株染色体，以含有康纳霉素的LB固态培养基来筛选菌株。挑选单一菌落，利用顺向引子13和反向引子14，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体镶嵌一个rpe-tktA基因，经挑选出的菌株可增幅出一个受λPRPL启动子调控rpe-tktA基因片段(径3)。
图9.DNA电泳图。径1：DNA标准物；径2：质体pPhi80-rTA；径3：染色体镶嵌rpe-tktA基因菌株。
最后，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，重新命名为BL21e。
4.强化大肠杆菌的rpiA和talB基因：
为了增进菌株代谢木糖的速率，因此将强化菌株的五碳糖磷酸代谢路径中的rpiA和talB基因。其执行流程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库rpiA的核苷酸序列来合成引子：
顺向引子15：
(5’-AATGCCATATGAATTTCATACCACAGGCGAAAC)
反向引子16：
(5’-TGGAGGAATTCCCGTCAGATCATTTCACAATG)
上述顺向引子被设计含有限制酶NdeI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有EcoRI的切割位置(如底线所标示者)。以大肠杆菌BL21的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有rpiA基因的片段(0.7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素NdeI以及EcoRI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；另一方面，根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库talB的核苷酸序列来合成引子：
顺向引子17：
(5’-TTTGAATTCAGGAGGATACTATCATGACG)
反向引子18：
(5’-CTAACTCGAGGTCGACGTTACAGCAGATCGCCGATC 3’)
上述顺向引子被设计含有限制酶EcoRI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有XhoI的切割位置(如底线所标示者)。以大肠杆菌BL21的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有talB基因的片段(1.0kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素EcoRI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；同时利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化质体pND707(Love CA et al.，1996，Gene，176：49-53)，以限制酵素NdeI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收。接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述三个DNA片段黏合后， 依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pND-rTB。最后依据质体pND-rTB的DNA序列，设计以下的引子：
顺向引子19：
(5’AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG 3’)
反向引子20：
(5’-CTAACTCGAGGTCGACGTTACAGCAGATCGCCGATC 3’)
上述反向引子被设计含有限制酶SalI的切割位置(如底线所标示者)。以质体pND-rTB做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有受λPRPL启动子调控rpiA-talB基因的片段(1.7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素SalI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化的镶嵌式质体pLamda-Km(Chiang CJ et al.，2008，Biotechnol.Bioeng.101：985-995)，以限制酵素SalI以及SmaI切割；接着使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将上述被酵素切割过的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述两个片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α(pir)中，而得到镶嵌式质pLam-rTB，质体图谱如图10所示。
图10.质体pLam-rTB图谱。符号简写说明：Km，康纳霉素抗性基因；R6K origin，大肠杆菌R6K复制源点；Lambda attP，前嗜菌体(prophage)镶嵌位置；lambda PR，PR启动子；lambda PL，PL启动子。
其次，将受λPRPL启动子调控rpiA-talB基因镶嵌至步骤3建构的菌株BL21e的染色体上，因此将协助型质体pAH121(Haldimann A and Wanner BL.，2001，J Bacteriol.，183：6384-6393)依照前述的“化学转形法”转形进入大肠杆菌菌株BL-Gf中，得到菌株BL21e/pAH121；接着根据前述的“质体镶嵌细菌染色体法”，将镶嵌式质体pLam-rTB再转形入菌株BL21e/pAH121中，进行基因镶嵌入菌株染色体，以含有康纳霉素的LB固态培养基来筛选菌株。挑选单一菌落，利用顺向引子19和反向引子20，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体镶嵌一个rpiA-talB基因，经挑选出的菌株可增幅出一个受λPRPL启动子调控rpiA-talB基因片段(径3)。
图11.DNA电泳图。径1：DNA标准物；径2：质体pLam-rTB；径3：染色体镶嵌rpiA-talB基因菌株。
最后，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，重新命名为BL21e-RB。
5.剔除大肠杆菌染色体的ldhA、poxB、pta、frdA基因：
大肠杆菌主要进行混合酸发酵，所生产的混合酸或混合酸相关代谢路径中生产的中间代谢物，可能产生回馈抑制五碳糖磷酸代谢的作用，为了免除这个抑制机制，因此将混合酸生成代谢路径中的ldhA、poxB、pta、frdA基因逐一剔除。进行步骤如下：
5.1根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库poxB的核苷酸序列来合成以下引子：
顺向引子21：
(5’-ATTAGAAGCTTGCAGGGGTGAAACGCATCTG)
反向引子22：
(5’-ATTAGACTAGTGGCTGGGTTGATATCAATC)
上述顺向引子被设计含有限制酶HindIII的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有SpeI的切割位置(如底线所标示者)。以大肠杆菌BL21的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有poxB基因的片段(0.84kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素HindIII以及SpeI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；同时利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化质体pMCS-5(Mo Bi Tec，Germany)，以限制酵素HindIII以及SpeI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收。接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述二个DNA片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pMC-pox。再依据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库poxB的 核苷酸序列来合成以下引子：
顺向引子23：
(5’-ATTAGGAATTCGTGATTGCGGTGGCAATC)
反向引子24：
(5’-ATTAGGTCGACGGTACCAAACTGGCGCAACTGCTG)
上述顺向引子被设计含有限制酶EcoRI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有SalI的切割位置(如底线所标示者)。以质体pMC-pox做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一段DNA片段(3.5kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；同时依据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库中质体pKD13(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，2000，Proc.Natl.Aca.Sci.USA，97：6640-6645)的核苷酸序列来合成以下引子：
顺向引子25：
(5’-TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)
反向引子26：
(5’-ATTCCGGGGATCCGTCGACC)
上述顺向引子被设计含有限制酶EcoRI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有SalI的切割位置(如底线所标示者)。以质体pKD13做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一段包含一个两端被FRT位置(sites)镶夹的抗康纳霉素基因片段(1.3kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述二个DNA片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pMC-poxKm，质体图谱如图12所示。
图12.质体pMC-poxKm图谱。符号简写说明：Ap，安培西林抗性基因；ColE1 origin，大肠杆菌ColE1复制源点；poxB-1，poxB基因的N端；poxB-2， poxB基因的C端；Km，康纳霉素抗性基因；FRT，FRT位置。
以质体pMC-poxKm做为模板，使用顺向引子21和反向引子22进行PCR反应，增幅出一段DNA(1.9kb)，其两端包含poxB基因N端及poxB基因C端的同源区域，而其中间部分则包含一个两端被FRT位置(sites)镶夹的抗康纳霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化。接着，依照前述的“化学转形法”，将协助型质体pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，2000，Proc.Natl.Aca.Sci.USA，97：6640-6645)转形入步骤4建构的菌株BL21e-RB中，得到菌株BL21e-RB/pKD46。依照前述的“电穿孔法”，准备菌株BL21e-RB/pKD46的胜任细胞，再利用电穿孔法将上述所得的线性DNA送入菌株BL21e-RB/pKD46中，随后以SOC培养基于30℃下培养，同时加入1mM阿拉伯糖进行诱导生产质体pKD46上的λ-Red基因，以帮助此增幅出来的线性DNA与染色体poxB基因进行同源重组(homologous recombination)，诱导二小时后，将培养温度提升到42℃，经二小时后以离心机将细胞离心下来，移除上清液，将细胞涂洒在含有抗康纳霉素的LB固态培养基上。随意挑选生长于固态培养基的菌落，以顺向引子21和反向引子22，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体基因poxB中所镶嵌的抗康纳霉素基因，挑选出的菌株可增幅出截断的poxB基因内镶嵌抗康纳霉素基因的DNA片段。最后选择其中一株菌株，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，同时以顺向引子21和反向引子22，使用前述的“原位PCR反应”来确认抗康纳霉素基因移除后所残留的poxB基因片段(图13，径3)，获得的菌株重新命名为BL-A1。
图13.DNA电泳图。径1：DNA标准物；径2：截断的poxB基因内镶嵌一个康纳霉素抗性基因；径3：康纳霉素抗性基因移除后残留的poxB基因片段。
5.2根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库pta的核苷酸序列来合成以下引子：
顺向引子27：
(5’-TGTCCAAGCTTATTATGCTGATCCCTACC)
反向引子28：
(5’-GTTCGACTAGTTTAGAAATGCGCGCGTC)
上述顺向引子被设计含有限制酶HindIII的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有SpeI的切割位置(如底线所标示者)。以大肠杆菌BL21的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有pta基因的片段(0.95kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素HindIII以及SpeI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；同时利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化质体pMCS-5(Mo Bi Tec，Germany)，以限制酵素HindIII以及SpeI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收。接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述二个DNA片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pMC-pta。再依据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库pta的核苷酸序列来合成以下引子：
顺向引子29：
(5’-ACGATGAATTCCATCAGCACATCTTTCTG)
反向引子30：
(5’-ACCGTGTCGACGGTACCTGATCGCGACTCGTGC)
上述顺向引子被设计含有限制酶EcoRI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有SalI的切割位置(如底线所标示者)。以质体pMC-pta做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一段DNA片段(3.5kb)，以Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；同时依据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库中质体pKD13(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，2000，Proc.Natl.Aca.Sci.USA，97：6640-6645)的核苷酸序列来合成以下引子：
顺向引子25：
(5’-TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)
反向引子26：
(5’-ATTCCGGGGATCCGTCGACC)
上述顺向引子被设计含有限制酶EcoRI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有SalI的切割位置(如底线所标示者)。以质体pKD13做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一段包含一个两端被FRT位置(sites)镶夹的抗康纳霉素基因片段(1.3kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述二个DNA片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pMC-ptaKm，质体图谱如图14所示。
图14.质体pMC-ptaKm图谱。符号简写说明：符号简写说明：Ap，安培西林抗性基因；ColE1 origin，大肠杆菌ColE1复制源点；pta-1，pta基因的N端；pta-2，pta基因的C端；Km，康纳霉素抗性基因；FRT，FRT位置。
以质体pMC-ptaKm做为模板，使用顺向引子29和反向引子30进行PCR反应，增幅出一段DNA(1.9kb)，其两端包含pta基因N端及C端的同源区域，而其中间部分则包含一个两端被FRT位置(sites)镶夹的抗康纳霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化。接着，依照前述的“化学转形法”，将协助型质体pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，2000，Proc.Natl.Aca.Sci.USA，97：6640-6645)转形入上述建构的菌株BL-A1中，得到菌株BL-A1/pKD46。依照前述的“电穿孔法”，准备菌株BL-A1/pKD46的胜任细胞，再利用电穿孔法将上述所得的线性DNA送入菌株BL-A1/pKD46中，随后以SOC培养基于30℃下培养，同时加入1mM阿拉伯糖进行诱导生产质体pKD46上的λ-Red基因，以帮助此增幅出来的线性DNA与染色体pta基因进行同源重组(homologous recombination)，诱导二小时后，将培养温度提升到42℃，经二小时后以离心机将细胞离心下来，移除上清液，将细胞涂洒在含有抗康纳霉素的LB固态培养基上。随意挑选生长于固态培养基的菌落，以顺向 引子29和反向引子30，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体基因pta中所镶嵌的抗康纳霉素基因，挑选出的菌株可增幅出截断的poxB基因内镶嵌抗康纳霉素基因的DNA片段。最后选择其中一株菌株，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，同时以顺向引子21和反向引子22，使用前述的“原位PCR反应”来确认抗康纳霉素基因移除后所残留的poxB基因片段(图15径3)，获得的菌株重新命名为BL-A2。
图15.DNA电泳图。径1：DNA标准物；径2：截断的pta基因内镶嵌一个抗康纳霉素抗性基因；径3：康纳霉素抗性基因移除后残留的pta基因片段。
5.3根据EcoCyc基因体数据库中ldhA基因周遭的核苷酸序列来合成以下两个引子：
顺向引子31：
(5’-TCTTATGAAACTCGCCGTTTATAG)
反向引子32：
(5’-TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)
使用Wizard Genomic DNA purification kit(Promega Co.)来纯化菌株CGSC 9216(E.coli Genetic Stock Center，USA)的染色体，以纯化后的染色体为DNA模版(template)，使用上述两个引子进行PCR反应，增幅出一段DNA(2.8kb)，其两端包含ldhA基因N端及C端的同源区域，而其中间部分则包含一个两端被FRT位置(sites)镶夹的抗康纳霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化。接着，依照前述的“化学转形法”，将协助型质体pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，2000，Proc.Natl.Aca.Sci.USA，97：6640-6645)转形入上述建构的菌株BL-A2中，得到菌株BL-A2/pKD46。依照前述的“电穿孔法”，准备菌株BL-A2/pKD46的胜任细胞，再利用电穿孔法将上述所得的线性DNA送入菌株BL-A2/pKD46中，随后以SOC培养基于30℃下培养，同时加入1mM阿拉伯糖进行诱导生产质体pKD46上的λ-Red基因，以 帮助此增幅出来的线性DNA与染色体ldhA基因进行同源重组(homologous recombination)，诱导二小时后，将培养温度提升到42℃，经二小时后以离心机将细胞离心下来，移除上清液，将细胞涂洒在含有抗康纳霉素的LB固态培养基上。随意挑选生长于固态培养基的菌落，完全依照步骤1的做法，以顺向引子3和反向引子4，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体基因ldhA中所镶嵌的抗康纳霉素基因。最后选择其中一株菌株，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，重新命名为BL-A3。
5.4根据EcoCyc基因体数据库中frdA基因周遭的核苷酸序列来合成以下两个引子：
顺向引子33：
(5’-GAAAGTCGACGAATCCCGCCCAGG)
反向引子34：
(5’-CAAGAAAGCTTGTTGATAAGAAAGG)
使用Wizard Genomic DNA purification kit(Promega Co.)来纯化菌株CGSC 10964(E.coli Genetic Stock Center，USA)的染色体，以纯化后的染色体为DNA模版(template)，使用上述两个引子进行PCR反应，增幅出一段DNA(3.0kb)，其两端包含frdA基因N端及C端的同源区域，而其中间部分则包含一个两端被FRT位置(sites)镶夹的抗康纳霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化。接着，依照前述的“化学转形法”，将协助型质体pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，2000，Proc.Natl.Aca.Sci.USA，97：6640-6645)转形入上述建构的菌株BL-A3中，得到菌株BL-A3/pKD46。依照前述的“电穿孔法”，准备菌株BL-A3/pKD46的胜任细胞，再利用电穿孔法将上述所得的线性DNA送入菌株BL-A3/pKD46中，随后以SOC培养基于30℃下培养，同时加入1mM阿拉伯糖进行诱导生产质体pKD46上的λ-Red基因，以帮助此增幅出来的线性DNA与染色体frdA基因进行同源重组(homologous recombination)，诱导二小时后，将培养温度提升到42℃，经二小时后以离心机将细胞离心下来，移除上清液，将细胞涂洒在含有抗康纳霉素的LB固态培养基上。随意挑选生长于固态培养基的菌落，完全依照步骤1的做法，以顺向引子3和反向引子4，使用前述的“原位PCR反应”来确认染色体基因ldhA中所镶嵌的抗康纳霉素基因。最后选择其中一株菌株，根据前述的“抗抗生素基因移除法”来移除该菌株染色体上镶嵌的抗康纳霉素基因，经温度诱导协助型质体pCP20产生FLP蛋白质，经作用于两个FRT位置后，将抗康纳霉素基因由菌株染色体上移除，选择其中一株无法在含有抗康纳霉素的LB固态培养基生长的菌株，重新命名为BL-A4。
实施例二：同时发酵葡萄糖和木糖生产酒精
为了验证本发明技术所建构的菌株相对于葡萄糖和木糖同时发酵的效能，在此以生产酒精为例，但本发明技术的运用范围不以此例为限。根据前人研究(Ingram LO et al.，1987，Appl.Environ.Microbiol.53：2420-2425)，将运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶(Zymomonas mobilis pdc)基因、乙醇脱氢酶基因II(adhII)基因引介至大肠杆菌中，可使得大肠杆菌具有生产酒精的能力。
(一)建构质体pND-pet
根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶(Zymomonas mobilis pdc)基因的核苷酸序列来合成引子：
顺向引子35：
(5’-TATACATATGAGTTATACTGTCGGTAC)
反向引子36：
(5’-CCATGGATCCTTATCCTCCTCCGAGGAGCTTG)
上述顺向引子被设计含有限制酶NdeI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有BamHI的切割位置(如底线所标示者)。以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有pdc基因的片段(1.7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素NdeI以及BamHI切割，再使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；另一方面，根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II(Zymomonas mobilis adhII)基因的核苷酸序列来合成引子：
顺向引子37：
(5’-ATgTGGATCCAggATATAgCTATGGCTTCTTCAACTTTTTATATTC)
反向引子38：
(5’-AGGACTCGAGTTAGAAAGCGCTCAGGAAGAG)
上述顺向引子被设计含有限制酶BamHI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有XhoI的切割位置(如底线所标示者)。以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有乙醇脱氢酶基因II(adhII基因)的片段(1.15kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素BamHI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；同时利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化质体pND707(Love CA et al.，1996，Gene，176：49-53)，以限制酵素NdeI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收。接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述三个DNA片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pND-pet，质体图谱如图16所示。
图16.质体pND-pet图谱。符号简写说明：bla，安培西林抗性基因；CI857，抑制子；lambda PR，PR启动子；lambda PL，PL启动子。
依照前述的“化学转形法”，将质体pND-pet逐一转形入原生型菌株BL21、实施例一中步骤1建构的菌株BL-G、实施例一中步骤2建构的菌株BL-Gf、实施例一中步骤4建构的菌株BL21e-RB、及实施例一中步骤5.4建构的菌株BL-A4中，而依序获得重组菌株BL21/pND-pet、BL-G/pND-pet、BL-Gf/ND-pet、BL21e-RB/pND-pet、BL-A4/pND-pet。
(二)葡萄糖和木糖发酵生产酒精
从固态培养基中分别选取重组菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet单一菌落，各培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(5mL)的摇瓶中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB外加3％葡萄糖与3％木糖培养液(25mL)中，使得摇瓶中的初始细胞密度达到OD550＝2.0，接着于37℃、150rpm下进行继代培养，随着发酵时间取样分析，其中葡萄糖、木糖和酒精浓度则依据“一般实验方法”来测量。发酵结果如图9(A)所示，菌株BL21/pND-pet可快速代谢葡萄糖，却完全无法消耗木糖，当发酵时间结束后，生产的酒精达1.7％(图9(B))；相对的是，当大肠杆菌的ptsG基因被剔除时(即重组菌株BL-G/pND-pet)，菌株BL-G/pND-pet可以同时消耗葡萄糖及木糖，不过木糖和葡萄糖的消耗速率皆缓慢(图17)，当发酵时间结束后，则可生产2.2％酒精(图18)。
图17.重组菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet的混合糖消耗曲线。符号：(●)菌株BL21/pND-pet的葡萄糖消耗；(○)菌株BL21/pND-pet的木糖消耗；(■)菌株BL-G/pND-pet的葡萄糖消耗；(□)菌株BL-G/pND-pet的木糖消耗。
图18.重组菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet发酵混合糖生产酒精曲线。符号：符号：(●)菌株BL21/pND-pet；(■)菌株BL-G/pND-pet。
依照上述的摇瓶培养方法，以含有3％葡萄糖与3％木糖的LB培养液培养重组菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet，并随着发酵时间取样分析，其中葡萄糖、木糖和酒精浓度则依据“一般实验方法”来测量。发酵结果如图19所示：
图19.重组菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet的混合糖消耗曲线。符号：(●)菌株BL-Gf/pND-pet的葡萄糖消耗；(○)菌株BL-Gf/pND-pet的木糖消耗；(■)菌株BL21e-RB/pND-pet的葡萄糖消耗；(□)菌株BL21e-RB/pND-pet的木糖消耗。
当运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促进基因(glucose facilitator gene)glf引介到大肠杆菌中(即菌株BL-Gf/pND-pet)，即可弭补菌株缺乏ptsG基因而导致葡萄糖代谢缓慢的问题，可于14小时内将3％葡萄糖消耗完 毕，而于发酵时间结束后，则只能消耗掉1.8％的木糖，生产的酒精达2.3％(图20)。此外，进一步加强菌株五碳糖磷酸代谢路径中的rpiA、tktA、rpe和talB(即菌株BL21e-RB/pND-pet)，其葡萄糖的消耗速率大致与菌株BL-Gf/pND-pet相同，然其木糖消耗速率则增快，当发酵时间结束后，可以消耗2.3％的木糖，并能生产2.7％酒精(图20)。
图20.重组菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet发酵混合糖生产酒精曲线。符号：符号：(●)菌株BL21/pND-pet；(■)菌株BL-G/pND-pet。
最后，依照上述的摇瓶培养方法，以含有3％葡萄糖与3％木糖的LB培养液培养重组菌株BL-A4/pND-pet，并随着发酵时间取样分析，其中葡萄糖、木糖和酒精浓度则依据“一般实验方法”来测量。发酵结果如图21所示，进一步将大肠杆菌中产生其他有机酸的基因如ldhA、poxB、pta、frdA基因剃除(即菌株BL-A4/pND-pet)后，重组菌株可以十分快速的同时代谢葡萄糖和木糖，并在12小时内将3％葡萄糖消耗完毕，在17小时内将3％木糖消耗完毕；另如图22所示，当发酵时间结束后，生产的酒精达2.9％，转化率高达98％以上。以生产酒精为例，这个结果显示，基于本发明技术来基因改质的菌株(即菌株BL-A4)，具有同时且快速代谢葡萄糖与木糖的能力。
图21重组菌株BL-A4/pND-pet的混合糖消耗曲线。符号：(●)葡萄糖消耗；(○)木糖消耗。
图22.重组菌株BL-A4/pND-pet发酵混合糖生产酒精曲线。
实施例三：同时发酵葡萄糖和木糖生产乳酸
为了验证本发明技术所建构的菌株的于葡萄糖和木糖同时发酵的效能，在此另以生产乳酸为例，但本发明技术的运用范围不局限于此例。
(一)建构质体pTrc-H/D-Ldh
根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库大肠杆菌ldhA基因的核苷酸序列来合成引子：
顺向引子39：
(5’-AGCTCCATGGAACTCGCCGTTTATAGCAC)
反向引子40：
(5’-AGCGAAGCTTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)
上述顺向引子被设计含有限制酶NcoI的切割位置(如底线所标示者)，而反向引子设计含有HindIII的切割位置(如底线所标示者)。以大肠杆菌BL21的染色体做为模板，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有ldhA基因的片段(1kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素NcoI以及HindIII切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit纯化质体pTrc99A(National Institute of Genetics，Japan)，以限制酵素NcoI以及HindIII切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收。接着利用T4黏合酶(T4 ligase)将上述二个DNA片段黏合后，依照前述“一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pTrc-H/D-Ldh，质体图谱如图23所示。接着依照前述的“化学转形法”，将质体pTrc-H/D-Ldh转形入实施例一中步骤5.4建构的菌株BL-A4中，而得到菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh。
图23.质体pTrc-H/D-ldh图谱。符号简写说明：bla，安培西林抗性基因；pMB1 ori，大肠杆菌pMB1复制源点；lacIQ，抑制子lacI；trc promoter，trc启动子。
(二)葡萄糖和木糖发酵生产乳酸
从固态培养基中分别选取重组菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh单一菌落，培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(5mL)的摇瓶中，以37℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB外加1％葡萄糖与1％木糖培养液(25mL)中，使得摇瓶中的初始细胞密度达到OD550＝0.1，接着于37℃、150rpm下进行继代培养，待细胞密度达到OD550＝0.3时，加入300μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导质体pTrc-H/D-Ldh的ldhA基因生产，随着发酵时间取样分析，其中葡萄糖、木糖、乳酸和有机酸浓度则依据“一般实验方法”来测量。发酵结果如图24所示，菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh可同时代谢葡萄糖和木糖，而生产的乳酸亦随发酵时间逐渐累积增加，当发酵48小时 后，可生产约160mM乳酸，几乎无其他有机酸的生成。以生产乳酸为例，这个结果显示，基于本发明技术来基因改质的菌株(即菌株BL-A4)，具有同时且快速代谢葡萄糖与木糖的能力。
图24.BL-A4/pTrc-H/D-Ldh的混合糖发酵生产乳酸曲线。符号：(●)葡萄糖消耗；( 
)木糖消耗；(■)乳酸。
Claims (28)
1.一种使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，包含下列步骤：
A.剔除一目标微生物中的一葡萄糖输送酶基因序列；
B.引入一葡萄糖促进基因序列至该目标微生物中；
C.在该目标微生物的至少一五碳糖代谢基因序列上游引入至少一启动子；以及
D.剔除该目标微生物中的至少一有机酸代谢基因序列。
2.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤A所述的该目标微生物可以是一大肠杆菌(Escherichia coli)。
3.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤A所述的该葡萄糖输送酶基因序列可以是一ptsG基因序列。
4.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤B所述的该葡萄糖促进基因序列可以是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的glf(glucosefacilitator gene)基因序列。
5.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤C所述的该至少一五碳糖代谢基因可以是一rpiA、一tktA、一rpe、一talB、或其组合的基因序列。
6.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤D所述的该至少一有机酸代谢基因可以是一ldhA、一pta、一poxB、一frdA、或其组合的基因序列。
7.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤B可以是将该葡萄糖促进基因序列镶嵌入该目标微生物的染色体上。
8.根据权利要求7所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，是该葡萄糖促进基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第一重组型质体，再将该第一重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
9.根据权利要求5所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，是将该大肠杆菌的该rpiA基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第二重组型质体，再将该第二重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
10.根据权利要求5所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，是将该大肠杆菌的该tktA基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第三重组型质体，再将该第三重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
11.根据权利要求5所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，是将该大肠杆菌的该rpe基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第四重组型质体，再将该第四重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
12.根据权利要求5所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，是将该大肠杆菌的该talB基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第五重组型质体，再将该第五重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
13.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，进一步包含以下步骤：
E.引入可产生一目标产物的基因序列至该目标微生物中，使该目标微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖以产生该目标产物。
14.根据权利要求13所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，该目标产物可以是醇类、有机酸、双糖、氢气、酮类、烷类、或其组合。
15.根据权利要求1所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤C所述的该至少一启动子可以是一λPRPL启动子。
16.一种使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，包含下列步骤：
A.剔除一目标微生物中的一ptsG基因序列；
B.引入一glf基因序列至该目标微生物中；
C.在该目标微生物的一rpe与一tktA基因序列上游引入一第一启动子；
D.在该目标微生物的一rpiA与一talB基因序列上游引入一第二启动子；
E.剔除该目标微生物中的一ldhA基因序列；
F.剔除该目标微生物中的一pta基因序列；
G.剔除该目标微生物中的一poxB基因序列；以及
H.剔除该目标微生物中的一frdA基因序列。
17.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，该目标微生物可以是一大肠杆菌(Escherichia coli)。
18.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，所述的五碳糖可以是木糖，所述的六碳糖可以是葡萄糖。
19.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤C与步骤D所述的该第一启动子与该第二启动子可以为一λPRPL启动子。
20.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤B中该glf基因序列可以是运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的glf基因序列。
21.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，可以是将运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的该glf基因序列镶嵌入该目标微生物的染色体上。
22.根据权利要求16或21所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，是将运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的该glf基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第一重组型质体，再将该第一重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
23.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤D是将该大肠杆菌的该rpiA基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第二重组型质体，再将该第二重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
24.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤C是将该大肠杆菌的该tktA基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第三重组型质体，再将该第三重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
25.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤C是将该大肠杆菌的该rpe基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第四重组型质体，再将该第四重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
26.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤D是将该大肠杆菌的该talB基因序列植入(incorporate)一个质体中，形成一第五重组型质体，再将该第五重组型质体转形(transform)至该目标微生物中表现。
27.根据权利要求16所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，进一步包含以下步骤：
I.引入可产生一目标产物的基因序列至该目标微生物中，使该目标微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖以产生该目标产物。
28.根据权利要求27所述的使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法，其特征在于，步骤I的该目标产物可以是醇类、有机酸、双糖、氢气、酮类、烷类、或其组合。
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