CN105062938A - 一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产d-乳酸的工程菌及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产高光学纯D-乳酸工程菌的构建及其应用,属于遗传发酵工程领域。本发明提供的工程菌，以能利用五碳糖发酵产乙醇的大肠杆菌RM10为出发菌株，通过同源重组，以D-乳酸脱氢酶基因（<i>ldhA</i>）替换乙醇脱氢酶基因（<i>adhE</i>），同时敲除葡萄糖转运入胞的酶ⅡCB？^Glc的编码基因（<i>ptsG</i>），得到可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产高光学纯D-乳酸工程菌。用本发明的工程菌以混合碳源进行乳酸的发酵生产，不仅可降低葡萄糖效应，达到五碳糖和六碳糖的同步利用，提高单位时间内碳源的利用效率；同时，由于碳代谢流的重新分配，促进了目的产物D-乳酸的大量积累，基本无乙酸等其它副产物的生成，D-乳酸光学纯度高，达到99.8%？以上。

Description

一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌及其构建和应用

技术领域

本发明涉及一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌的构建，属于基因工程领域。本发明还涉及一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌的应用，特别是发酵生产D-乳酸，属于发酵工程领域。

背景技术

D-乳酸是一种重要的手性中间体，其聚合物具有很高的热稳定性，可制成生物可降解材料，因此其生产和应用受到广泛关注，成为目前研究的热点。微生物发酵法由于原料来源广泛、生产成本低、光学纯度高、安全性高等优点已成为国内外生产D-乳酸的主要方法。目前D-乳酸的生产主要以葡萄糖做为底物。自然界中生物质种类繁多，分布广泛，且数量巨大，价格低廉。木质纤维素的水解产物富含大量糖类，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯通和半乳糖等。这些混合糖可以作为碳源用以微生物发酵生产。如果能以木质纤维素水解后的混合糖替代葡萄糖作为碳源用于微生物发酵就能够节省生产成本，同时将如秸秆的农业废弃物加以利用，变废为宝，有益于保护环境。但是利用混合糖进行发酵目前面临着两个难题：一，混合糖中的六碳糖较容易被微生物利用，但木糖等五碳糖很少有微生物能够利用；二，利用混合糖发酵时大肠杆菌优先利用六碳糖，待六碳糖消耗完才利用五碳糖，而利用五碳糖特别是木糖前有一段很长的停滞期，相比于纯木糖它的利用速度比较慢，而且通常木糖没能利用完。上述现象的出现主要是由于葡萄糖效应：在两种混合碳源环境中大肠杆菌通常优先利用其中容易代谢的一种(通常是葡萄糖)，待前一种耗尽和一段停滞期后再开始利用另一种碳源。大量研究表明，CCR的产生与糖类磷酸转移酶系统(PTS转运系统)有关。PTS系统负责特异性地将葡萄糖从细胞外跨膜主动运输进入细胞，并在此过程中，将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解途径。

虽然目前D-乳酸工程菌和生产菌已有不少，但普遍存在上述两方面问题；有少量报道的改造工程菌虽然可以利用混合糖进行发酵，但不是发本酵产量低，转化效率不高，就是副产物大量生成，产物纯度不高。因此，如何提高五碳糖的利用率，特别是以混合碳源发酵时，降低葡萄糖效应，实现五碳糖和六碳糖的同步利用，提高碳源利用率及发酵效率，得到光学纯度高的D-乳酸产品，是目前在乳酸发酵生产工艺中研究热点之一。

发明内容：

为了克服现有乳酸发酵生产过程中的缺点与不足，本发明旨在提供一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产高光学纯D-乳酸工程菌。

所述工程菌Escherichi.coliDX03的保藏号为CCTCCM2015414，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，保藏日期2015年6月29日。Escherichi.coliDX03以能利用木糖发酵生产乙醇的大肠杆菌工程菌RM10为出发菌株，以D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)替换其乙醇脱氢酶基因(adhE)，得到能利用木糖发酵产D-乳酸的重组菌；敲除葡萄糖转运入胞的酶ⅡCB^Glc的编码基因(ptsG)，降低葡萄糖效应，最终得到能同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌。该工程菌具体是由以下步骤构建得到的：

(1)敲除菌株E.coliRM10的乙醇脱氢酶基因adhE，得到工程菌E.coliDX01；

①以pKD4质粒为模板，用引物adhE-P1、adhE-P2进行adhE同源重组片段的PCR扩增；

②纯化带有卡那霉素基因kan的同源重组片段；

③通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliRM10细胞；

④通过电转法将纯化后的同源重组片段转化入带有pKD46质粒的E.coliRM10感受态细胞中，经过复苏后，将菌液涂布于卡那抗性LB平板，筛选阳性转化子(带有kan基因的重组片段替换adhE基因，以将其从基因组上敲除)，PCR验证阳性转化子，得到E.coliDX01；

⑤消除E.coliDX01的卡那抗性。

(2)在E.coliDX01基因组上插入乳酸脱氢酶基因ldhA，得到能发酵产D-乳酸工程菌E.coliDX02；

①以野生型E.coliW的基因组为模板，以ldhA-P1和ldhA-P2为引物，PCR扩增带自身启动子的ldhA基因全长；

②纯化扩增的ldhA基因片段；

③通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliDX01细胞；

④通过电转法将纯化后的ldhA基因片段转化入带有pKD46质粒的E.coliDX01感受态细胞，后将涂布于LB平板；

⑤挑选LB平板上的单菌落，进行无氧管筛选和PCR验证，得到E.coliDX02。

(3)敲除E.coliDX02葡萄糖转运入胞的酶ⅡCBGlc的编码基因ptsG，得到可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌E.coliDX03。

①以pKD4质粒为模板，用引物ptsG-P1、ptsG-P2进行ptsG同源重组片段的PCR扩增；

②纯化带有卡那霉素基因kan的同源重组片段；

③通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliDX02细胞；

④通过电转法将纯化后的同源重组片段转化入带有pKD46质粒的E.coliDX02感受态细胞中，经过复苏后，将菌液涂布于卡那抗性LB平板，筛选阳性转化子(带有kan基因的重组片段替换ptsG基因，以将其从基因组上敲除)PCR验证阳性转化子，得到E.coliDX03；

⑤消除E.coliDX03的卡那抗性。

本发明的另一目的在于提供上述可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌在乳酸生产中的用途，其发酵生产乳酸的工艺为：

(1)种子培养：37℃下150r/min摇瓶培养工程菌至对数生长中期；

(2)发酵罐培养：以10％的接种量将菌液接种至发酵罐，发酵培养28-120h，发酵参数为：pH7.0,37℃下150r/min，所述10％为经步骤(1)培养所得的菌液与发酵罐中培养基的体积比。

本发明提供的工程菌E.coliDX03乳酸生产工艺以及发酵培养基成分简单，能同时利用五碳糖和六碳糖产高光学纯D-乳酸。目前还未知有相同的菌株报道，本发明的产乳酸发酵菌相对现有技术具有如下优点：1、工程菌E.coliDX03能同时利用五碳糖和六碳糖，是极具有潜力的可做为能利用木质纤维原料的乳酸发酵生产菌。其原理是因为ptsG基因的敲除，降低了葡萄糖效应，使得木糖，阿拉伯糖等在葡萄糖存在的情况下，能同时被消耗，从而加快发酵速度，缩短发酵时间。如：在5％葡萄糖和5％木糖为碳源的发酵过程中能提高木糖消耗速率，有效缩短发酵时间，同时糖酸转化率达到0.84g/g；在10％的混合糖(6％葡萄糖，3％木糖，1％L-阿拉伯糖)为碳源进行发酵时，糖酸转化率达到0.81g/g，D-乳酸光学纯度达到99.8％以上。2、其出发菌株RM10通过基因敲除技术阻断了其它代谢副产物(如乳酸，乙酸，甲酸，琥珀酸等)的合成途径，使得碳代谢流都流向乙醇代谢途径，不仅乙醇产量高，而且产物纯度高；而E.coliDX03正是在此基础上将乙醇脱氢酶基因敲除掉，置换上D-乳酸脱氢酶基因，相当于将原来的乙醇代谢途径阻断，重新开启D-乳酸代谢途径，因而终产物D-乳酸产量高，基本无其它副产物产生，D-乳酸光学纯度能达到99.8％以上。在达到产物高产量的同时，达到高光学纯度，也是现在同型发酵产乳酸的重要指标。结合上述两个优点，本发明的工程菌E.coliDX03极具利用木质纤维素原料同型发酵生产D-乳酸的生产潜力。

附图说明：

图1为实施例1工程菌E.coliDX01adhE基因敲除PCR验证图；M：marker；1：带卡那抗性E.coliDX01PCR扩增片段；2：E.coliRM10PCR扩增片段。

图2为实施例1工程菌E.coliDX02ldhA基因插入PCR验证图；M：marker；1：E.coliDX02PCR扩增片段；2:E.coliRM10PCR扩增片段；3：E.coliWPCR扩增片段。

图3为实施例2工程菌E.coliDX03ptsG基因敲除的PCR验证图；M：DNAmarker；1：E.coliDX02PCR扩增片段；2：卡那抗性基因PCR扩增片段；3：带卡那抗性E.coliDX03PCR扩增片段。

图4为实施例3工程菌E.coliDX02和E.coliDX03在5％葡萄糖+5％木糖为碳源发酵的菌体生长曲线图；■：E.coliDX02；▲：E.coliDX03。

图5为实施例3工程菌E.coliDX02和E.coliDX03在5％葡萄糖+5％木糖为碳源发酵的消耗曲线图；■：E.coliDX02，葡萄糖；□：E.coliDX03，葡萄糖；▲：E.coliDX02，木糖；△：E.coliDX03，木糖。

图6为实施例3工程菌E.coliDX03在混合糖(6％葡萄糖+3％木糖+1％L-阿拉伯糖)为碳源发酵的糖耗和乳酸产量曲线图；■：葡萄糖；●：木糖；▲：L-阿拉伯糖；□：乳酸。

图7为实施例3工程菌E.coliDX03发酵液HPLC图谱分析图；A：D-乳酸和L-乳酸的混合酸标准样品图谱；B：E.coliDX03发酵液样图谱。

具体实施方式：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中工程菌株RM10记载于：RyanManow,JinhuaWang,YongzeWang,JinfangZhao,ErinGarza,AndrewIverson,ChrisFinan,ScottGrayburn,ShengdeZhou*.Partialdeletionofrng(RNaseG)-enhancedhomoethanolfermentationofxylosebythenon-transgenicEscherichiacoliRM10.SocietyforIndustrialMicrobiologyandBiotechnology.2012,977–985。

下述实施例中所用的质粒和菌株见表1，所设计的PCR引物序列见表2。

实施例1利用木糖产D-乳酸大肠杆菌工程菌E.coliDX02的构建

利用木糖产D-乳酸大肠杆菌工程菌E.coliDX02是以能利用木糖发酵生产乙醇的大肠杆菌工程菌RM10为出发菌株，通过同源重组技术，以D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)替换其乙醇脱氢酶基因(adhE)，得到工程菌E.coliDX02。

E.coliRM10来源于野生菌株E.coliB(ATCC11303)，该菌通过基因工程手段敲除了丙酮酸甲酸裂解酶(focA-pflB)、延胡索酸还原酶(frdBC)、乙酸激酶(ackA)、D-乳酸脱氢酶(ldhA)等竞争性代谢途径关键酶的基因以及部分核酸酶基因(rngHSR2)，并厌氧表达丙酮酸脱氢酶(pflBp6-aceEF-lpd)，能够在厌氧条件下高效利用木糖同型发酵产乙醇。

具体操作步骤如下：

(1)乙醇脱氢酶基因adhE的敲除

第一步，扩增adhE同源重组片段:以pKD4质粒为模板，用引物adhE-P1、adhE-P2(敲除引物)进行PCR扩增，该PCR产物包括pKD4质粒上FRT-kan-FRT序列以及adhE基因开放阅框(ORF)首尾各45bp同源序列。

扩增体系为：ThermoScientificPCRMasterMix2X缓冲25μL、DNA模板20ng、引物(100μM)各1μL、无菌水25μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃预变性3min；95℃预变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸2min(30个循环)；72℃延伸5min。

第二步，将上述PCR产物进行纯化：与灭菌的NaAc(浓度为3mol/L)、95％乙醇，按1:1/10:3的比例依次转入灭菌的EP管中，放置于冰上30min；4℃条件下，13000r/min，离心30min，去掉上清液；向EP管中加1mL95％乙醇，4℃，13000r/min，离心1min，弃上清液；将EP管盖打开放置在无菌操作台中，等EP管中乙醇挥发完后加30μL无菌水，电泳检测后备用。

第三步，pKD46质粒的转化：取200μL以CaCl₂法制备的E.coliRM10感受态细胞于预冷的、无菌的1.5mLEP管中，加入1μLpKD46质粒，用移液枪轻柔的吹打混匀，置于冰上30min；37℃水浴锅中热冲击2min，快速放到冰上5min；向EP管中加入1mLLB(2％木糖)液体培养基，摇床中30℃，150r/min，复苏培养1～2h；取200μL复苏后菌液均匀的涂布于含有氨苄霉素的LB固体平板上，将平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养16h；从平板上筛选出E.coliRM10/pKD46的单克隆，于氨苄固体平板上转接1～2代。

第四步，adhE基因的敲除：取40mL灭菌的无氯化钠的LB培养基加入灭菌的250mL空摇瓶中，加0.8mL灭菌的L-阿拉伯糖溶液(浓度为1mol/L)，加40μL氨苄霉素溶液(50mg/mL)；挑取E.coliRM10/pKD46的单菌落接种到摇瓶中，30℃，200r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.5～0.8；将长好的菌液转移到预冷的50mL的离心管中，置于冰上30min；4℃条件下，5000r/min，离心10min，弃去上清液，并用灭无菌的超纯水反复洗涤细胞4次；最后一次洗完后加1mL无菌水重悬，并将菌液全部转入1.5mEP管中，4℃，5000r/min，离心10min，小心去除上清，再加100μL无菌水重悬；取10μL准备好的PCR产物与菌液混合，置于冰上30min；然后转入预冷的电击杯中，将点击杯连接到电转仪上，在Ec2、2.5kV条件下，电击4ms～5ms；电击后迅速向点击杯中加入1mL无氯化钠的LB培养基，然后把所有的液体转移到1.5mLEP管中，30℃，150r/min复苏培养1～2h，使细胞恢复正常生长状态；将上述复苏菌液混匀，取100μL菌液均匀涂布于加有卡那霉素(50mg/L)LB平板上，于37℃恒温培养箱培养16h，筛选阳性转化子E.coliDX01。提取阳性转化子基因组DNA进行PCR验证，PCR反应体系同第一步中所述，扩增引物为adhE-P3，adhE-P4(验证引物)，通过PCR产物片段大小判断同源重组成功，结果如图1所示。

第五步，消除E.coliDX01的卡那抗性：通过CaCl₂化转法将pFT-A质粒转化到重组大肠杆菌E.coliDX01内，通过氨苄固体平板筛选出阳性转化子E.coliDX01/pFT-A，然后在固体平板上纯化1～2代；从长有E.coliDX01/pFT-A的固体平板上挑单克隆接种接种到27mLLB液体培养基(含有1％L-阿拉伯糖和50mg/L氨苄青霉素)的摇瓶中，30℃，200r/min培养5h；向摇瓶中添加3mL灭活的氯四环素溶液(浓度为2mg/10mL),30℃，200r/min培养5h以上；取1mL菌液梯度稀释1～10^-7，每个梯度取100μL涂布于LB固体平板上，39℃恒温培养箱中培养12～16h；挑100个以上的单克隆分别在LB平板和含有卡那霉素的LB平板上划线，筛选出在LB平板上生长而在卡那平板上不长的菌，即为不带卡那抗性的E.coliDX01。

(2)乳酸脱氢酶ldhA基因的插入

第一步，以野生型E.coliW的基因组为模板，以ldhA-P1和ldhA-P2为引物，扩增带自身启动子的ldhA基因全长。扩增体系为：ThermoScientificPCRMasterMix2X缓冲25μL、DNA模板20ng、引物(100μM)各1μL、无菌水25μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃预变性3min；95℃预变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸2min(30个循环)；72℃延伸5min。

第二步，将上述PCR产物纯化：与灭菌的NaAc(浓度为3mol/L)、95％乙醇，按1:1/10:3的比例依次转入灭菌的EP管中，放置于冰上30min；4℃条件下，13000r/min，离心30min，去掉上清液；向EP管中加1mL95％乙醇，4℃，13000r/min，离心1min，弃上清液；将EP管盖打开放置在无菌操作台中，等EP管中乙醇挥发完后加30μL无菌水，电泳检测后备用。

第三步，pkD46质粒的转化：取200μL以CaCl₂法制备的E.coliDX01感受态细胞于预冷的、无菌的1.5mLEP管中，加入1μLpKD46质粒，用移液枪轻柔的吹打混匀，置于冰上30min；37℃水浴锅中热冲击2min，快速放到冰上5min；向EP管中加入1mLLB(2％木糖)液体培养基，摇床中30℃，150r/min，复苏培养1～2h；取200μL复苏后菌液均匀的涂布于含有氨苄霉素的LB固体平板上，将平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养16h；从平板上筛选出E.coliDX01/pKD46的单克隆，于氨苄固体平板上转接1～2代。

第四步，ldhA基因的插入。取40mL灭菌的无氯化钠的LB培养基加入灭菌的250mL空摇瓶中，加0.8mL灭菌的L-阿拉伯糖溶液(浓度为1mol/L)，加40μL氨苄霉素溶液(50mg/mL)；挑取E.coliRM10/pKD46的单菌落接种到摇瓶中，30℃，200r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.5～0.8；将长好的菌液转移到预冷的50mL的离心管中，置于冰上30min；4℃条件下，5000r/min，离心10min，弃去上清液，并用灭无菌的超纯水反复洗涤细胞4次；最后一次洗完后加1mL无菌水重悬，并将菌液全部转入1.5mEP管中，4℃，5000r/min，离心10min，小心去除上清，再加100μL无菌水重悬；取10μL准备好的PCR产物与菌液混合，置于冰上30min；然后转入预冷的电击杯中，将点击杯连接到电转仪上，在Ec2、2.5kV条件下，电击4ms～5ms；电击后迅速向点击杯中加入1mL无氯化钠的LB培养基，然后把所有的液体转移到1.5mLEP管中，30℃，150r/min复苏培养1～2h，使细胞恢复正常生长状态。

第五步，将第四步得到的菌液接种于装有LB液体培养基的无氧管中，37℃恒温培养箱中静置培养24h，取菌液稀释后在LB固体平板上均匀涂布，挑单菌落用无氧管进行反复筛选，最后分离出能够在无氧管中生长的单菌落进行PCR验证，设计引物为ldhA-P3和ldhA-P4(验证引物)，通过PCR产物片段大小判断基因插入成功，结果如图2所示。得到工程菌E.coliDX02。

实施例2可同步利用五碳糖和六碳糖发酵高产光学纯D-乳酸工程菌E.coliDX03的构建

在能利用木糖的D-乳酸工程菌E.coliDX02的基础上，利用RED同源重组技术，敲除ptsG基因，构建可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌E.coliDX03。

第一步，扩增ptsG同源重组片段:以pKD4质粒为模板，用引物ptsG-P1和ptsG-P2(敲除引物)进行PCR扩增，该PCR产物包括pKD4质粒上FRT-kan-FRT序列以及ptsG基因开放阅框(ORF)首尾各45bp同源序列。扩增体系为：ThermoScientificPCRMasterMix2X缓冲25μL、DNA模板20ng、引物(100μM)各1μL、无菌水25μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃预变性3min；95℃预变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸2min(30个循环)；72℃延伸5min。

第二步，将上述PCR产物进行纯化：与灭菌的NaAc(浓度为3mol/L)、95％乙醇，按1:1/10:3的比例依次转入灭菌的EP管中，放置于冰上30min；4℃条件下，13000r/min，离心30min，去掉上清液；向EP管中加1mL95％乙醇，4℃，13000r/min，离心1min，弃上清液；将EP管盖打开放置在无菌操作台中，等EP管中乙醇挥发完后加30μL无菌水，电泳检测后备用。

第三步，pKD46质粒的转化：取200μL以CaCl₂法制备的E.coliDX02感受态细胞于预冷的、无菌的1.5mLEP管中，加入1μLpKD46质粒，用移液枪轻柔的吹打混匀，置于冰上30min；37℃水浴锅中热冲击2min，快速放到冰上5min；向EP管中加入1mLLB(2％木糖)液体培养基，摇床中30℃，150r/min，复苏培养1～2h；取200μL复苏后菌液均匀的涂布于含有氨苄霉素的LB固体平板上，将平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养16h；从平板上筛选出E.coliDX02/pKD46的单克隆，于氨苄固体平板上转接1～2代。

第四步，ptsG基因的敲除：取40mL灭菌的无氯化钠的LB培养基加入灭菌的250mL空摇瓶中，加0.8mL灭菌的L-阿拉伯糖溶液(浓度为1mol/L)，加40μL氨苄霉素溶液(50mg/mL)；挑取E.coliRM10/pKD46的单菌落接种到摇瓶中，30℃，200r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.5～0.8；将长好的菌液转移到预冷的50mL的离心管中，置于冰上30min；4℃条件下，5000r/min，离心10min，弃去上清液，并用灭无菌的超纯水反复洗涤细胞4次；最后一次洗完后加1mL无菌水重悬，并将菌液全部转入1.5mEP管中，4℃，5000r/min，离心10min，小心去除上清，再加100μL无菌水重悬；取10μL准备好的PCR产物与菌液混合，置于冰上30min；然后转入预冷的电击杯中，将点击杯连接到电转仪上，在Ec2、2.5kV条件下，电击4ms～5ms；电击后迅速向点击杯中加入1mL无氯化钠的LB培养基，然后把所有的液体转移到1.5mLEP管中，30℃，150r/min复苏培养1～2h，使细胞恢复正常生长状态；将上述复苏菌液混匀，取100μL菌液均匀涂布于加有卡那霉素(50mg/L)LB平板上，于37℃恒温培养箱培养16h，筛选阳性转化子E.coliDX03。提取阳性转化子E.coliDX03基因组DNA进行PCR验证，PCR反应体系同第一步中所述，扩增引物更换为ptsG-P3，ptsG-P4(验证引物)，通过PCR产物片段大小判断同源重组成功，结果如图3所示。

第五步，消除E.coliDX03的卡那抗性：通过CaCl₂化转法将pFT-A质粒转化到重组大肠杆菌E.coliDX03内，通过氨苄固体平板筛选出阳性转化子E.coliDX03/pFT-A，然后在固体平板上纯化1～2代；从长有E.coliDX03/pFT-A的固体平板上挑单克隆接种接种到27mLLB液体培养基(含有1％L-阿拉伯糖和50mg/L氨苄青霉素)的摇瓶中，30℃，200r/min培养5h；向摇瓶中添加3mL灭活的氯四环素溶液(浓度为2mg/10mL),30℃，200r/min培养5h以上；取1mL菌液梯度稀释1～10^-7，每个梯度取100μL涂布于LB固体平板上，39℃恒温培养箱中培养12～16h；挑100个以上的单克隆分别在LB平板和含有氨苄青霉素的LB平板上划线，筛选出在LB平板上生长而在氨苄平板上不长的菌，即为不带卡那抗性的E.coliDX03。

表1本发明中所用的菌株和质粒

表2本发明中的PCR引物序列

实施例3工程菌E.coliDX02和E.coliDX03发酵生产D-乳酸

从平板上挑一个单菌落，接种于含有10mL种子培养液的无氧管中，37℃过夜培养。取2mL菌液接种于300mL种子液中，37℃下150r/min培养至对数生长中期。以10％(v/v)的接种量将菌液接种至3L发酵培养基中，置于带自动调节系统的7L发酵罐SartoriusBB-8846880(德国SartoriusStedimBiotech公司)中，37℃下150r/min培养发酵，流加3mol/LCa(OH)₂控制pH为7.0。分别以不同碳源组合：10％葡萄糖，10％木糖，5％葡萄糖+5％木糖，6％葡萄糖+3％木糖+1％L-阿拉伯糖为底物培养至发酵结束。定时取样，测定菌体浓度、葡萄糖、木糖、乳酸及其它代谢产物的浓度。

种子培养基：NBS培养基，2％葡萄糖。

发酵培养基：NBS培养基，10％葡萄糖，10％木糖，5％葡萄糖+5％木糖，6％葡萄糖+3％木糖+1％L-阿拉伯糖。

NBS培养基：KH₂PO₄3.5g/L，K₂HPO₄5g/L，(NH₄)₂HPO₄3.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，CaCl₂·2H₂O15mg/LThiamine·HCl0.5mg/L，FeCl₃·6H₂O1.6mg/L，CoCl₂·6H₂O0.2mg/L，CuCl₂·2H₂O0.1mg/L，ZnCl₂0.2mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2mg/L，H₃BO₃0.05mg/L。

菌体浓度测定时先用3mol/LHCl溶液酸解，再在可见光分光光度计测定波长600nm下OD值。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和有机酸采用高效液相色谱仪Waterse2695(美国Waters公司)分析，色谱柱为Bio-RadHPX87H，流动相为4mmol/LH₂SO4，流速0.5mL/min，柱温40℃，检测器为PDA、ELS检测器。乳酸光学纯度采用高效液相色谱仪Waterse2695(美国Waters公司)分析，色谱柱为手性柱EC250/4NUCLEOSILCHIRAL-1，流动相为2mmol/LCuSO₄，流速0.5mL/min，柱温40℃，检测器为PDA检测器。

结果表明：构建的工程菌E.coliDX02和E.coliDX03都能利用10％葡萄糖，或10％木糖发酵高产乳酸(表3),以10％葡萄糖为碳源发酵时，发酵周期短(28h-36h)，乳酸产量达到90g/L以上；以10％木糖发酵为碳源发酵时，乳酸产量也可达到85g/L以上，但发酵周期过长(120h)，生产强度不高，不利于实际生产。

而在以5％葡萄糖和5％木糖为碳源进行发酵时(表4)，菌株E.coliDX03乳酸产量达到85.14g/L；相比于菌株E.coliDX02，菌株E.coliDX03木糖消耗速度提高了29.41％，乳酸产量提高了34.97％。同时，从菌体生长情况(图4)和糖耗情况(图5)来看，菌株E.coliDX03的最大细胞浓度是菌株E.coliDX02的1.15倍；E.coliDX03在混合糖发酵过程中葡萄糖和木糖同时消耗，而出发菌E.coliDX02优先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗完才开始利用木糖。E.coliDX03发酵至100h小时，糖源基本消耗完毕；而E.coliDX02发酵至120h时，仍到部分木糖没有消耗。E.coliDX03相对于E.coliDX02在发酵过程中，单位时间内糖利用效率提高，乳酸产量提高，发酵周期缩短，生产强度增强。

表3菌株E.coliDX02和E.coliDX03在单糖(10％葡萄糖或10％木糖)发酵中的比较

表4菌株E.coliDX02和E.coliDX03在5％葡萄糖和5％木糖发酵中的比较

而在以五碳糖和六碳糖为混合碳源(6％葡萄糖+3％木糖+1％L-阿拉伯糖)进行发酵时(表5和图6)，E.coliDX03能同步利用三种五碳糖和六碳糖，乳酸产量达到80.94g/L,糖酸转化率达到0.81g/g。

表5菌株E.coliDX03在混合碳源(6％葡萄糖+3％木糖+1％L-阿拉伯糖)中的发酵

通过对E.coliDX03发酵产物分析，基本没有发现乙酸等其它副产物的生成；通过光学纯度检测分析，发现乳酸产物为D-乳酸，纯度达99.8％以上(图7)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌，其特征在于：该工程菌为Escherichia.coliDX03，其保藏号为CCTCCNO：M2015414。

2.根据权利要求1所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌的构建，其特征在于包括以下步骤：

(1)菌株E.coliRM10乙醇脱氢酶基因adhE的敲除,得工程菌E.coliDX01；

(2)乳酸脱氢酶ldhA基因插入，替换受体菌E.coliRM10的adhE基因得到可发酵产乳酸的工程菌E.coliDX02；

（3）敲除E.coliDX02葡萄糖转运入胞的酶ⅡCB^Glc的编码基因ptsG，得到可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌E.coliDX03。

3.根据权利要求2所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌的构建，其特征在于步骤（1）包括如下步骤：

（1）以pKD4质粒为模板，用引物adhE-P1、adhE-P2进行adhE同源重组片段的PCR扩增；

（2）纯化带有卡那霉素基因kan的同源重组片段；

（3）通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliRM10细胞；

（4）通过电转法将纯化后的同源重组片段转化入带有pKD46质粒的E.coliRM10感受态细胞中，经过复苏后，将菌液涂布于卡那抗性LB平板，筛选阳性转化子，PCR验证阳性转化子，得到E.coliDX01；

（5）消除E.coliDX01的卡那抗性。

4.根据权利要求2所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌的构建，其特征在于步骤（2）包括如下步骤：

（1）以野生型E.coliW的基因组为模板，以ldhA-P1和ldhA-P2为引物，PCR扩增带自身启动子的ldhA基因全长；

（2）纯化扩增的ldhA基因片段；

（3）通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliDX01细胞；

（4）通过电转法将纯化后的ldhA基因片段转化入带有pKD46质粒的E.coliDX01感受态细胞，后将涂布于LB平板；

挑选LB平板上的单菌落，进行无氧管筛选和PCR验证，得到E.coliDX02。

5.根据权利要求2所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌的构建，其特征在于步骤（3）包括如下步骤：

（1）以pKD4质粒为模板，用引物ptsG-P1、ptsG-P2进行ptsG同源重组片段的PCR扩增；

（2）纯化带有卡那霉素基因kan的同源重组片段；

（3）通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliDX02细胞；

（4）通过电转法将纯化后的同源重组片段转化入带有pKD46质粒的E.coliDX02感受态细胞中，经过复苏后，将菌液涂布于卡那抗性LB平板，筛选阳性转化子，PCR验证阳性转化子,得到E.coliDX03；

（5）消除E.coliDX03的卡那抗性。

6.根据权利要求2所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌的构建，其特征在于：步骤（1）所述的E.coliRM10来源于野生菌株E.coliB，通过基因工程手段敲除丙酮酸甲酸裂解酶、延胡索酸还原酶、乙酸激酶、D-乳酸脱氢酶等竞争性代谢途径关键酶的基因以及部分核酸酶基因，并厌氧表达丙酮酸脱氢酶基因，具有能利用木糖同型发酵产乙醇的能力。

7.根据权利要求1所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌在制备高光学纯D-乳酸中的应用。

8.根据权利7中所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌的应用，其特征在于该工程菌的发酵生产工艺为：

种子培养：37℃下150r/min摇瓶培养工程菌至对数生长中期；

发酵罐培养：以10%的接种量将菌液接种至发酵罐，发酵培养28-120h，发酵参数为：pH7.0,37℃下150r/min，所述10%为经步骤（1）培养所得的菌液与发酵罐中培养基的体积比。

9.根据权利要求7中所述的一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌的应用，其特征在于：E.coliDX03可作为能利用混合糖的乳酸发酵生产菌，在发酵时，能同时消耗五碳糖、六碳糖，加快发酵速度，缩短发酵时间，发酵所得的D-乳酸产量高、没有其它副产物、光学纯度高，能达到99.8%以上。