CN106414735B - 优化增殖的戊糖发酵菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及获得能够在低营养潜力培养基内有效增殖，能够代谢戊糖和耐受发酵抑制剂的菌株的方法，包括以下步骤：a)重组酵母菌株与缺乏任何损伤的野生酵母菌株的生长，重组酵母菌株包括至少一拷贝的木糖异构酶的外源性基因和至少一额外拷贝的D‑木酮糖激酶的基因，包括在基因组中并连接于菌株的单性特性，b)通过孢子形成和/或随机杂交进行至少两个周期的基因组重排；c)根据菌株代谢木糖的适合性标准选择步骤b)获得的群体；d)根据菌株在优选型培养基，低营养价值培养基内生长的适应度标准选择步骤c)获得的群体。本发明还涉及细胞，酵母或根据本方法获得的重组酵母菌株，以及涉及该细胞在生产生物乙醇中的应用。

Description

优化增殖的戊糖发酵菌株
本发明涉及改进的酵母菌株的领域，特别是为了生产醇，例如生物乙醇。本发明方法联用遗传学和分子生物学技术产生重组微生物。
鉴于化石能源成本、潜在的供应问题和环境影响，为产生生物燃料而提出的白色生物技术替代方案是重大挑战。植物生物质是可持续发展框架内生产生物燃料的首选可再生原料。
背景
植物生物质是指任何生物质，其可以对应农业和农工业作物，如玉米，甘蔗，小麦，高粱，木工业和家具用树木的剩余或副产物，或对应特定培养物，如芒(Miscanthusgigantheus)，柳枝稷(Panicum virgatum(switchgrass))以及短和很短轮伐期矮林。植物生物质是富含己糖的纤维素，富含戊糖的半纤维素和木质素(疏水性酚类化合物的聚合物)的混合物。通常来讲，利用三个步骤说明将植物生物质转化成生物乙醇：
实施机械，化学和/或加热过程预处理以优化生物质或生物质组分随后的水解；
在适当的温度和pH值条件下，生物质或生物质组分在试剂、溶剂或酶的作用下水解。水解的目的是释放主要的可发酵的单糖。使用的酶必须是稳定且表现出可以接受的水解反应动力学；
发酵可发酵的糖必须是强健，快速且使用所有可用的糖，即C6糖(己糖)和C5糖(戊糖)。
第一和第二步骤或第二步骤和第三步骤可以组合或分开进行。
具体地，实际发酵步骤之前先进行实施发酵的微生物增殖，随后蒸馏。增殖通常在酶促糖化所得液相中进行，例如在两个罐内连续进行，第二罐明显大于第一罐。这些参数取决于不同的工业过程，技能和习惯。
可通过组合各步骤和/或单独改善它们以改进整个过程，例如，优化用于水解的酶或负责发酵的微生物。在后一种情况下，例如，特别地，通过允许转化己糖和戊糖二者，和/或限制它们对存在于木质纤维素水解产物或发酵溶液中的抑制剂的敏感性，如酸性或温度，对于改善转化糖类的适宜性是有用的。例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是生物乙醇生产中通常使用的酵母，其不能够代谢D-木糖，但可以通过非特异性转运蛋白吸收它。它可以通过相比D-葡萄糖对D-木糖具有较低亲和性的己糖转运蛋白来运输。因此，不仅在遗传学上修饰细胞来赋予它代谢D-木糖的能力，而且转化它以便它更有效吸收所述糖都是有吸引力的。
有关这些主题的综述，参见，如la Grange等,2010,Appl.Microbiol.Biotechnol.,87:1195-1208或Jordan等,2012,Biochem.J.,442:241-252。
本发明涉及细胞转化从而解决代谢缺陷，还给予它转化D-木糖的能力，以及，有利地，增强吸收此类糖的特性。
现有技术
在酵母转化领域，专利申请WO2010000464A1公开了用于发酵C5糖特别是木糖的酵母，通过引入外源基因编码功能性木糖异构酶转化所述酵母。在这种情况下，木糖异构酶源自梭菌(Clostridium phytofermentans)。
申请人的专利申请WO2012072793A1寻求优化通过酵母转化木糖的过程，使之与工业应用兼容。为了这个目的，该申请公开了只在一个步骤中引入用于基因编码能够将任何碳水化合物(包括D-木糖)转化为木酮糖(D-木酮糖)的酶的以及基因编码能将所有五醇(包括木糖醇)转化为木酮糖的酶的表达盒。这使得由此修饰的任何菌株对木糖发酵和/或生长特别有效。该文件描述了2011年10月5日保藏在CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号为I-4538的酵母菌株作为例子。
专利申请WO2013178915A1也由申请人提交，其通过转化酵母以使它们既能够发酵戊糖和也能耐受至少一种发酵抑制剂而进一步改进了工艺。所述申请描述了通过组合靶向功能方面(戊糖转化)和筛选中间分离子的乙酸抗性的过程获得杂交酵母。在这种情况下，由“乙酸抗性”标准选择的细胞差异很小。
最后，专利申请WO2013178918A1也源自申请人的工作，其旨在确保该方法获得改进的酵母菌株，该方法通过在遗传学连接于接合型表达基因座的区域整合至少一种感兴趣基因，然后与感兴趣的MATa分离子杂交，意味着该方法能够提供所需的一种或多种感兴趣表型性状，并与连接杂交基因座的遗传修饰相结合。因此，经遗传修饰的酵母菌株的孢子形成后，一种或多种遗传改变一起分离且都在相应的接合型分离子(MATα)内。具体而言，使用所述过程构建杂交种为该杂交种提供的给定性状的确定性，例如，能够“代谢戊糖”的特性。这种原始的方法更令人感兴趣，因为它适用于任何基因，用于任何类型可能的改进和用于具有单倍孢子体周期的任何酵母菌株。单倍孢子体周期是在单倍体和二倍体相之间交替的生殖周期，且在此期间，所述的微生物无论在单倍体状态还是在二倍体状态能够通过有丝分裂增殖。
按照类似的方法，Demeke等，2013年，用于生物燃料的生物技术(Biotechnologyfor Biofuels)，6：89稳定地将能够利用D-木糖和L-阿拉伯糖的基因的表达盒整合入酵母基因组。获得的杂交体还经受诱变，单一基因组改组周期，然后通过它们使用富含抑制剂的培养基中的D-木糖的能力进行选择。作者提出增殖问题，报告他们已经获得的菌株具有普通的增殖速度。他们提出导致较慢增殖速度的遗传改变在诱变和基因组改组期间出现。这不鼓励采用诱变和/或基因组改组来提高菌株对增殖的适应性。
虽然旨在改进工业酵母菌株，现有技术的工作一直没有关注用于生物燃料工业制造过程中的关键步骤：增殖。也被称为繁殖，增生或生物质生产，增殖先于实际的发酵阶段。目的是系统地获得最佳量的生物质以供发酵。它是由制造商完成，制造商将发酵生产中产生的汁液，通常是在要进行发酵的复合培养基上。因此增殖汁液可以是富含戊糖的汁液，己糖汁，或戊糖和己糖的混合物。发酵培养基可能会略被稀释，富含营养成分，充气以允许快速和充分的生长，从而系统地允许满意的发酵。矿物养分如氮和磷源以及诸如矿物质也通常被提供并且比发酵中的比例更大。避免供给化合物如维生素和例如氨基酸或嘌呤或嘧啶酸的有机化合物，因为它太昂贵。制造商通常依赖由培养基本身或通过回收发酵培养基的供给。可以考虑仅供给维生素，以使来自工业培养基的供给可靠，因为它们可以是可变的，并导致变异生长的发生。
除了增殖期间获得的增长量，酵母生长速度也是成功增殖的关键点。实际上，酵母的生长速度将限制增殖长度，并通过环境污染物如乳酸杆菌(Lactobacilli)或野生酵母限制培养基的相对富集。过度的增殖污染将导致发酵生产乙醇的产率降低。即使细胞抑制剂如
Figure GDA0001184738370000031
或啤酒花的酸提取物可被用来限制细菌的生长，具有快速和显著增长的酵母仍是增殖和增殖转入的发酵成功的关键。
所以具有在增殖时快速和显著增长的营养需求尽可能低的酵母是确保整个工业过程并使它最终有利可图的关键点。
根据他们的菌株之一增殖能力差的反馈，申请人寻求显著改善酵母菌株增殖的能力，同时保持遗传稳定并保持使用D-木糖且抵抗通常存在于木素纤维素“汁液”中的抑制剂的良好能力。换言之，他们已经试图修复菌株的代谢缺陷。
在这方面，本发明为获得酵母菌株的方法，该菌株适合于在低营养潜力的培养基上有效增殖且抵抗发酵抑制剂，同时保持其代谢戊糖的能力。“有效”应理解为在至少两个菌株之间作比较，以认为在给定时间不产生与工业方法兼容的足够的生物质的作参比。该方法包括以下步骤：
a)用没有缺陷的野生酵母菌株和重组酵母菌株杂交，其中所述重组酵母菌株包括至少一个拷贝的外源性木糖异构酶基因和至少一个额外拷贝的D-木酮糖激酶基因，掺入基因组并连接于菌株的配对特性之一；
b)通过随机孢子形成和/或杂交进行至少两个周期的基因组重排；
c)根据菌株代谢木糖的能力的标准选择步骤b)获得的群体；
d)根据菌株在低含氮碱基(nitrogenous base)的培养基，低营养价值培养基内生长的能力的标准选择步骤c)获得的群体，
注意，两个选择阶段可以颠倒。
如现有技术所建议的，不选择孢子形成后得到的中间分离子的，例如抑制剂耐受能力，但它们直接经历基因组重组的几个阶段，而不在混合间选择。值得一提的是必要的代谢戊糖的能力通过由申请WO2013/178918A1所述方法插入感兴趣基因而得到实质性保留。本发明的最终选择是在差增殖性能的起源解除营养缺乏。
本发明还涉及本方法获得菌株，于2013年5月16日保藏在CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号为I-4749。
有利的是，本发明的另一个菌株也呈现GAL2基因过表达，允许木糖更好地进入细胞。通过加入额外拷贝的该基因可能进行过表达，这还取决于组成型pADH1启动子。后者通常控制ADH1基因的表达。由此获得的'子'菌株于2013年12月12日保藏在CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号为I-4829。
本发明还涉及本发明的菌株的应用，将糖特别是己糖和戊糖转化成乙醇。
为了确保根据本发明方法得到的菌株的有效增殖，发明人限定各种“基本”培养基。
基本培养基是包括碳(CxHyOz)源，矿物氮源，钾源，磷源，硫源，镁源，钙源，铁源，微量元素及水源的培养基。它是低营养值的培养基。
下表I汇集发明人使用的各种培养基：低营养潜力，低含氮碱基，本发明方法中使用的“优选(Pref)培养基”。该培养基可以是用于本发明菌株的基本培养基，但证实是不符合本发明的菌株的亚基本培养基。
表I：培养基
Figure GDA0001184738370000051
Figure GDA0001184738370000061
YE＝酵母提取物
还提及：
·优选(Pref)培养基补充有3g/L假丝酵母(Candida utilis)的RNA的水解产物，通过添加RNA酶A至30μg/L来水解，在以下文本和附图中称为“优选+含氮碱基”；
·YFI2培养基含有：酵母提取物10g/kg，细菌用蛋白胨为10g/kg，葡萄糖55克/升，木糖45克/升，醋酸4g/L，调节至pH 4.4；
·YEG培养基包含：酵母提取物10g/L，葡萄糖为20g/L和琼脂糖20g/L。
然后，假设是得到的菌株在将使用它来生产生物乙醇的生产者的复杂培养基中将具有有效增殖能力。
为了更好地理解本发明给出以下定义。
术语“酵母菌株”指的是相对均匀的酵母细胞群体。分离克隆获得酵母菌株。克隆产生从单一酵母细胞获得的细胞的群体。
分离对应于这样的情形，在其间，减数分裂结束时，倍性水平降低。通过扩增，分离子是来自倍性水平大于1的细胞的减数分裂的活细胞。
术语“衍生的酵母菌株”是指通过一次或多次杂交和/或通过突变和/或通过基因转化得到的酵母菌株。
通过杂交衍生的酵母菌株可以通过本发明的酵母菌株与相同的酵母菌株、与本发明的另一酵母菌株、或与任何其他的酵母菌株(前提是它可以被杂交，本领域技术人员理解，它对于MAT基因座是纯合的，并且在STE基因没有突变)杂交育种来获得。
通过突变衍生的酵母菌株可以是这样一种酵母菌株，在其基因组中有至少一种自发突变或诱变引起的至少一个突变。衍生菌株的突变可以是沉默或没有。
表述“诱变”是指突变的出现过程。通常，两种方法是可能的：随机诱变，和插入或定向诱变。第一种方法包括应用物理处理(如UV辐射)或化学诱变剂处理，其将在所研究生物体的基因组中随机诱发突变。第二种方法将使用分子生物学方法在基因组区域或特定基因座产生特定的修饰(即启动子，基因，终止子等)。基因座用于表示染色体上特定和恒定的物理位置。
遗传转化衍生的酵母菌株是在其中引入DNA序列的酵母菌株，优选通过质粒提供或直接掺入基因组中。
己糖用来指作为碳源的含6个碳原子的糖，也被称为C6糖或更简单C6。单体形式的己糖的主要代表是葡萄糖，果糖和半乳糖。通过类比，戊糖是具有5个碳原子的糖，也被称为C5糖或C5糖。戊糖的主要单体代表是D-木糖和L-阿拉伯糖。
增殖是指繁殖，增生或生物质产生，将有助于接种发酵培养基。它可以在天然培养基上，例如从植物生物质转化，或在富或贫合成培养基上实现。通常，增殖在富培养基上较快，在贫培养基上不太有效，要求细胞具有强代谢能力从而克服培养基的低营养价值(或不足)。来自植物生物质转化的木质纤维素水解产物是复杂的环境，它可以是主要包含戊糖的汁液，主要包含己糖的汁液或包含戊糖和己糖混合物的汁液。从工业的角度来看，“富”合成培养基当然为增殖最有效的选择，但它在经济上不可行。基本培养基(即包括最低限度)将会更有效，但限定它的成分并不简单。出于这些原因以及工业过程连续的原因，增殖是在前一步骤得到的组合物上，换句话说，在木质纤维素汁液上最常进行的。综述可参见Bellissimi E,Richards C:酵母增殖(Yeast propagation)。醇教科书(The alcoholtextbook)，饮料，燃料和工业酒精工业的参考。第5版。Ingledew WM,Kelsall DR,AustinGD,Kluhspies C编辑。诺丁汉：大学出版社；2009：145-159。
菌株的代谢不足被理解为一个或多个代谢途径失效，导致酵母的生长或发酵缺陷。营养缺陷型被理解为在给定的培养基上无法产生代谢中间体和酵母发育的必要物质，即代谢缺陷，意味着如果没有外源提供于此必不可少的所有营养，该菌株不会增长。
原养型酵母菌株是能够在基本培养基上生长的菌株。尤其是，根据本发明的原养型酵母菌株是能够合成其生长所必需的所有含氮碱基。
抑制剂被理解为在木质纤维素水解产物中从头存在的或在酒精发酵期间形成的抑制剂，其包括酚醛树脂，糠醛和其衍生物，羟基-甲基糠醛和它的衍生物，或甚至弱酸如乙酸，甲酸或乳酸。还已知的是，这些抑制剂对酵母的性能或甚至存活是有害的。此外，渗透压，pH值(特别是高酸性)，温度(大于35℃)，或生产的乙醇也可以抑制或至少限制菌株的发酵能力。
能代谢木糖的酵母菌株是能够转化木糖为乙醇，即能够发酵木糖的酵母菌株。
木糖转化成乙醇是木糖到木酮糖的直接或间接异构化的结果，随后在戊糖磷酸通路上的非氧化部分使用这样获得的木酮糖。
在本发明的意义内，能代谢木糖的酵母菌株是指在厌氧条件下，在发酵培养基(每千克培养基包括55克葡萄糖和45克木糖)中在60小时内将至少70％，优选至少80％，更优选至少90％的木糖转化为乙醇的酵母菌株。
用于测量木糖转化成乙醇百分比的酵母菌株的接种量优选为0.25克干物/千克发酵培养基。
从酵母菌株接种到发酵培养基开始计算60小时持续时间。
用于测量木糖转化为乙醇百分比的发酵培养基应优选是合成培养基。
合成培养基是其确切的化学组成已知的培养基。
发酵优选在32℃，在培养基搅拌下进行，例如90rpm。
搅拌适度以便不充氧。
培养基的pH值应是可控制的，例如通过酸/碱对的缓冲能力，例如YFGX培养基中乙酸/乙酸盐缓冲能力。
由本领域技术人员公知的任何合适的手段测定发酵培养基中存在的乙醇的量。
可以直接测量所产生的乙醇，或通过相关的乙醇生产参数，如质量损失间接测量。
例如，可以通过色谱法，包括HPLC(高效液相色谱法)，酶促试剂盒(例如勃林格试剂盒检测乙醇)，或由重铬酸钾测定测量乙醇产量。
发酵培养基中木糖的量由本领域技术人员公知的任何适当的方法测定，优选通过色谱法，特别是HPLC。
通过使用同时含有葡萄糖和木糖的发酵培养基，可评估各种酵母菌株从可比较量的生物质将木糖向乙醇的转化情况。实际上，酵母菌株首先从葡萄糖和木糖的混合物发酵葡萄糖，然后是葡萄糖和木糖，然后是木糖。
在有至少一种发酵抑制剂存在下代谢木糖的能力被称为耐受所述发酵抑制剂。
附图简述
图1示出菌株I-4538(重组亲株，2011年10月5日保藏在CNCM)，EGAc1，2014年3月13日保藏在CNCM，编号I-4839(野生亲株)和I-4749(根据本发明的菌株，2013年5月16日保藏在CNCM)在具有低营养价值的优选+含氮碱基和优选的培养基上的各自增殖。
图2示出在模拟工业增殖培养基的合成培养基上，本发明的菌株I-4749的增殖和亲本株I-4538的增殖之间的比较。
图3示出由野生株EGAc1(I-4839)，重组亲本株Ⅰ-4538和本发明的I-4749的菌株的乙醇产量。
发明详述
首先，菌株I-4538看来有代谢缺陷，其不利地影响其在复杂培养基上的增殖效率。所述菌株I-4538是根据专利WO 2012072793A1所得菌株之一，包含至少一拷贝的编码木糖异构酶的外源性基因，和一拷贝的编码木糖醇脱氢酶的外源性基因。它还包含用于戊糖磷酸通路的基因和XKS1基因的至少一拷贝。在实际应用中，该菌株具有良好的能力以代谢木糖和耐受生物质水解得到的抑制剂，如酚醛产品，糠醛及乙酸。因此，分析在另外含有木糖的贫含氮碱基的培养基上的增殖阶段以进行后续的改善。看来水解的RNA，或者称为含氮碱基，非常有利于菌株I-4538的生长。有趣的是，含有葡萄糖的培养基上不存在此营养缺陷，这表明生物合成途径是功能性的，但在含木糖的培养基内调节不良。由于酵母天然不能够代谢这种糖，有可能是含氮碱基合成所需的基因的表达不充分。此外，导致获得该菌株的UV辐射和遗传转化的各个阶段都可能导致这些缺陷。
作为第一步，菌株I-4538与没有缺陷的野生株(实施例和附图中的参比菌株EGAc1，2014年3月13日保藏在CNCM，编号I-4839)杂交。野生型菌株是指未作遗传学修饰的菌株。此步骤获得杂交种，它的代谢缺陷被部分修复，但其丢失快速发酵木糖的实质性能力。
杂交步骤是根据常规技术进行，例如在第7章教导的那些，R.R.Fowell的“产孢和酵母的杂交”，参考工作“酵母菌”，第1卷，A.H.Rose和J.S.Harrison出版，1969年，学术出版社。
第二步骤是随机基因组重组，更具体地，通过基因组重排的四个周期。这些周期在两个步骤之间进行，不作选择。此步骤是根据改编自Hou,2009,Biotechnol.Lett.,31:671-677的方法完成。
根据代谢木糖的适宜性标准，然后根据在低营养价值培养基上的增殖能力，特别是在含氮碱基的增殖培养基上的扩增能力的标准，选择得到的群体。
两个选择标准可以颠倒。即，有可能首先选择在缺陷型培养基上繁殖的能力，然后选择发酵木糖的能力，或首先选择发酵木糖的能力，然后选择在缺陷型培养基上繁殖的能力。
得到的菌株保藏在CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号I-4749。
有趣的是，在含有木糖作为唯一碳源的培养基上对含氮碱基的营养缺陷型的去除可以传到菌株I-4749的直线遗传菌株。以这种方式，各种菌株，包括保藏的菌株I-4829，获自菌株I-4749。事实上，观察到蛋白Gal2p是己糖的转运蛋白，其也能转运木糖(Hamacher等.2002,Microbiology,148:2783-2788)。因此，改善已经能够发酵木糖的酵母菌株，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)捕获木糖的能力是有吸引力的。出于这个原因，将一拷贝的基因GAL2，取决于强的组成型启动子(pADH1)，引入菌株的基因组中。它编码促进木糖进入细胞的通道。该菌株是本发明的酵母菌株。通过这种额外遗传修饰获得的菌株已经保藏于CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号为I-4829。
通过培养本发明的酵母菌株或本发明衍生的酵母菌株获得酵母，特别如以下参考书籍：“酵母技术”，第2版，1991，G.Reed和T.W.Nagodawithana,Van Nostrand Reinhold出版,ISBN 0-442-31892-8。
在工业规模上，酵母的增殖通常包括下组步骤中的前两个步骤：
-在几个阶段，首先在半厌氧阶段，然后在好氧阶段增殖酵母菌株，
-如果酵母膏与渗透产物混合，为获得包含约12至25％干物质或甚至更高量的干燥材料的液体酵母膏，通过离心分离从酵母培养基中产生的酵母，
-通常采用旋转真空过滤器过滤获得的液体酵母膏，从而获得包含26-35％干物质的新鲜脱水酵母，
-混合所述新鲜脱水酵母以获得均匀的团块，
-挤压由此得到的酵母，以便获得：
○压榨酵母，新鲜块状酵母形式或弄碎的鲜酵母形式，含有约30％的干物质，或
○颗粒形式的酵母，通常是粒状，如果要干燥酵母的话，
-在热空气流中，例如通过流体化，可控干燥通过挤出获得的酵母颗粒，以得到干酵母。
优选地，干燥步骤是在乳化剂存在下的快速可控干燥。
在可以在干燥阶段中使用的乳化剂中，可能选择山梨醇单硬脂酸酯，例如，在约1.0％(以重量计，干酵母的重量)的浓度使用。
本发明的酵母可以以任何可能的形式使用。
例如，本发明的主题是如上述所定义的酵母，其特征在于它是酵母膏，压榨酵母，干酵母或冷冻酵母的形式。
本发明的主题还是产生至少一种发酵产品的方法，包括在厌氧或半厌氧条件下，在发酵培养基中发酵酵母，例如以上定义的酵母的步骤。
发酵产物特别选自乙醇，乙醇获得的代谢产物或次级代谢物。
本发明的一种优选的发酵产物是乙醇。
乙醇产品获自酒精发酵。
本领域技术人员知道如何确定酒精发酵的合适条件。
例如，可以参考以下参考书中描述的酒精发酵条件：“酵母技术”，第2版，1991，G.Reed和T.W.Nagodawithana,Van Nostrand Reinhold出版,ISBN 0-442-31892-8。
发酵培养基包括下列元素：至少一可发酵碳源，至少一氮源，至少一硫源，至少一磷源，至少一维生素源和/或至少一矿物质源。
例如，碳源以立即可用于酵母的糖，戊糖如木糖，甘油，乙醇或它们的组合的形式提供。
立即可用于酵母的糖是，例如葡萄糖，果糖或半乳糖型的单糖，蔗糖型二糖或这些糖的混合物。
碳源可以葡萄糖糖浆，果糖糖浆，蔗糖糖浆，糖蜜，废糖蜜(第2次糖结晶废母液)，全部或植物材料的水解产物或它们的混合物的形式提供。
氮源是，例如以硫酸铵，氢氧化铵，磷酸氢二铵，氨，尿素，或它们的组合的形式提供。
硫源是，例如以硫酸铵，硫酸镁，硫酸，和/或它们的组合的形式提供。
磷源是，例如以磷酸，磷酸钾，磷酸二氢铵，磷酸一铵和/或它们的组合的形式提供。
维生素源是，例如以糖蜜，酵母水解物，纯的维生素溶液或纯维生素的混合物和/或它们的组合的形式提供。
维生素源向酵母供应的所有维生素的量至少等同于参考书所推荐的量。几个来源的维生素可以组合。
矿物质源是，例如以糖蜜，矿物盐的混合物和/或它们的组合物的形式提供。
矿物质源向酵母供应常量营养元素和微量矿物质的量至少等同于参考书所推荐的量。几个矿物质源可以组合。
同一物质可以提供多种不同的元素。
本发明的主题是如上限定的方法，用于生产至少一种发酵产品，优选乙醇，包括在厌氧或半厌氧条件下，通过例如以上定义的酵母在包括木糖和/或至少一种发酵抑制剂的发酵培养基中发酵的步骤。优选地，发酵培养基包括所有或部分植物材料的至少一种水解产物。
所有或部分植物材料的水解产物可通过预处理植物材料步骤获得，例如，在高温并在酸或有机溶剂的存在下，随后通过酶和/或化学和/或热途径全部或部分水解糖聚合物。
因此，所有或部分植物材料的水解产物包括糖聚合物，如纤维素，半纤维素和淀粉的水解得到的糖的混合物。
发酵抑制剂例如选自有机酸，糠醛，HMF(羟基-甲基-糠醛)，一种或多种酚类化合物和渗透压。
有机酸例如选自乙酸，乳酸，甲酸和乙酰丙酸。
本发明的主题还涉及如上述所定义的酵母的应用，用于生产至少一种发酵产物，优选在含有木糖和至少一种发酵剂的发酵培养基内。即，利用本发明的酵母能够转化和代谢含有木糖的植物来源的材料。
发酵产物如上所定义。
优选地，发酵产物应是乙醇。
发酵培养基如上所定义。
下面的实施例旨在更好地理解本发明，但不以任何方式进行限制。
实施例
重组菌株与野生菌株杂交，然后产孢
保藏在CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号为I-4538的重组菌株与野生菌株杂交，在这种情况下，是申请人的菌株EGAc1(I-4839)。这一步骤是根据常规技术进行，例如由以下内容教导：R.R.Fowell的"酵母的孢子形成和杂交(Sporulation and Hybridization of Yeast)"第7章，参考"酵母(The Yeasts)",第1卷,A.H.Rose和J.S.Harrison编辑,1969-学术出版社。
如此获得2014年3月13日保藏在CNCM编号为I-4840的EGAc2菌株。该菌株表现出良好的代谢木糖性能，只有部分修复的缺陷。实际上，在基本包括木糖和蛋白质水解产物的低营养价值培养基上，增殖质量仍然很差。
孢子形成在液体介质中进行，无氮源，含有不可发酵的碳源，优选乙酸盐，理想地是乙酸钾。
分离子富集的快速方法的建立
因为似乎没有可能获得100％的分离子，排除没有完成减数分裂的二倍体是必要的。
要做到这一点，通常执行子囊解剖方法，但非常耗时。因而，本申请人利用了孢子的不同特征，即它们对温度(Williams,1936,J.Bacteriol.,32(6):589-597)，某些营养素的缺乏(Ho和Miller,1978,Can.J.Microbiol.,24(3):312-320)或一些有机溶剂(Dawes和Hardie,1974,Mol.Gen.Genet.,131(4):281-289)的耐受能力更强而知名。
在这种情况下，使用基于由Dawes和Hardie(同上)描述的醚富集的方法。实际上，这种方法简单而有效。
事实上，由于分离子在二倍体的膜内形成，它们不是由一个磷脂双层，而是两个包围。另一方面，二倍体只有一个。当在最佳的接触时间(不同菌株之间有所不同)使用时，醚破坏二倍体膜。因此，醚由于两个原因而有吸引力。首先，如果接触时间不会太长，它杀死二倍体而不影响分离子。另一方面，它降解维持四联体形式的分离子的子囊的磷脂双层，其结果是释放它们，并允许它们出芽。
这种方法适用于本申请人的工业菌株。酵母悬浮液和醚之间的接触时间必须被密切监视。为做到这一点，2毫升乙醚与含大约2×107孢子形成结构的2毫升酵母悬浮液接触。在孢子形成条件下5天后获得孢子形成。然后在30秒至2分钟的总接触时间作整体涡旋搅拌。
含有每毫升1000个细胞的等份试样以100μL/皿的水平立即散布到培养基上，该培养基含有：
酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，琼脂30g/L，水补充至1升。48小时增长后，通过使用如申请WO2013/178918A1中描述的分别对应Mat1、Mat2和Mat3引物的SEQ ID no.1、SEQID no.2和SEQ ID no.3引物将菌落用于做“菌落PCR”。该PCR分析的目的是区分二倍体菌株与单倍体菌株。
不同接触时间的试验表明，在菌株EGAc2(Ⅰ-4840)的情况下，暴露1分钟足以富集超过98％的单倍体菌株。
批量杂交方法的建立
通过执行批量相杂交从分离子富集的悬浮液产生新的杂交体。为做到这一点，1mL分离子悬浮液接种入50毫升YPG培养基，含酵母提取物10g/L，细菌用蛋白胨为20g/L，葡萄糖20g/L和蒸馏水补充至1升。在该培养基内培养16小时后，显微镜观察确认接合子形成。为了促进这些杂交体的发育，每24小时，将200微升培养物接种到50毫升新鲜YEG培养基。次培养5天后，在大孢子形成周期，新的杂交体可以被再引入。
为了确保这批量杂交步骤的效率，每个含有YEG的培养皿分布100个细胞。然后在DNAg上通过PCR分析构成139形成菌落的细胞的再生特性。这些菌落被随机地选择。使用引物SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3(同上)实施PCR，显示测试的139个菌落中仅2菌落是单倍体。
在所产生的杂交群体内确认基因组重排
起始杂交种的基因型的分析
验证基因组重排质量的方法之一包括研究连接到基因GRE3的两个基因座的等位基因的分布。实际上，在C5菌株内进行对应于“gre 3空(gre3null)”基因型的基因GRE3的两个拷贝的缺失，导致获得菌株I-4538。这种破坏传递给菌株EGAc2(Ⅰ-4840)，因为EGAc1(I-4839)内没缺失GRE3，因此它是杂合的。
已经查找这一特点在菌株EGAc2(I-4840)的衍生分离子内可能的传递。采用GRE3的pGRE3TAGTTGTCAGTGCAATCCTTC启动子特异性引物(SEQ ID NO：4)和tGRE3TATACACATATACAGCATCGGA终止子特异性引物(SEQ ID NO：5)完成PCR。结果表明，有可能区分获得1200BP(碱基对)片段的基因GRE3的野生拷贝和获得200BP片段的缺失形式。
因此菌株EGAc2(I-4840)的一些分离子仅呈现缺失版本，而其他仅呈现GRE3野生拷贝。更令人惊讶地，第三类分离子有2拷贝的基因GRE3，一个野生型，而另一个缺失。这一结果由以下事实说明，菌株EGAc1(I-4839)内没有两个，但有四拷贝的GRE3基因。在这种情况下，在EGAc1分离子(I-4839)内有两拷贝的GRE3基因，其产生EGAc2(I-4840)。因此菌株EGAc2(I-4840)的基因型如下：
Figure GDA0001184738370000151
这样的基因型是由于在菌株EGAc1(I-4839)中在两个不同基因座存在GRE3，在菌株I-4538仅一个基因座。此外在菌株I-4538内，GRE3基因已缺失。因此，在菌株EGAc2(I-4840)的第一轮基因组重排结束时获得的137二倍体菌株中，GRE3基因和杂交体中等位基因的分布已被研究。
期望分离子的测定
相对于GRE3基因型，像EGAc2(I-4840)的杂交种因此可以获得4种分离子。这些分离子列于下表II。具有基因型gre3Δ；；-和GRE3；GRE3的分离子称为亲本基因型，因为全部它们的等位基因源自单亲。与此相反，分离子GRE3；-和gre3Δ；GRE3称为重组体。对于每一种情况，有MATa形和MATα形。
表II：各种可获得分离子的基因型
Figure GDA0001184738370000161
分析基因组重排质量的方法包括在分离子内找寻亲本杂交种的等位基因分布。因此，假设该基因座是独立的，获得亲本分离子的概率等于获得重组分离子的概率。
然而，该方法试图不选择分离子而工作。实际上，目的是检测已实际参与杂交种的形成的孢子。因此从杂交种进行基因分析。
分析得到的杂交种
可能在基因组重排结束时得到的杂交种示于表III。各类杂交种的基因型引用于相应的框中。这些基因型根据利用pGRE3(SEQ ID NO：4)和tGRE3(SEQ ID NO：5)引物的PCR情况被分成3组：
组1：200BP大小(表中的白格)单一条带
组2：200BP和1200的BP(在中浅灰格)的两个条带
组3：1200BP(表中深灰色格)单一条带
表III：可以得到的各种杂交种的基因型。行2和列2，这些都是分离子，其他框是杂交种。
Figure GDA0001184738370000162
可以容易地识别组1杂交种，因为当使用pGRE3和tGRE3引物时，它们呈现出与I-4538菌株相当的PCR图。值得注意的是，具有这种基因型的全部杂交种是MATa；gre3Δ；-和MATα；gre3Δ；-分离子。假设遗传独立，这些杂交种应占群体的1/16或6.25％。为了检验这一假设，通过PCR分析前面提到的137个杂交种的基因型。结果示于下表IV。
表IV：所得杂交种的基因型的PCR分析结果
Figure GDA0001184738370000171
组1杂交种比例过高(11.6％而非6.25％)表明GRE3的两基因座不是独立的。换句话说，这意味着在减数分裂中，具有亲本型分离子的概率大于具有重组型分离子的概率。此外这导致可以检测遗传距离cM。通过下式获得该遗传距离：
Figure GDA0001184738370000172
在该分析中，分离子的总数是杂交种的数量乘以2(为274)。
通过从分离子的总数中减去亲本分离子的数目得到重组分离子的数目。如上所示，组1杂交种仅由亲本分离子构成。这意味着具有gre3Δ；-亲本分离子的概率等于具有组1的杂交种的概率的平方根。此外，减数分裂期间亲本分离子是等概率的。因此重组分离子的数目可以由下面的等式确定：
重组分离子的数目＝分离子的总数-亲本分离子的数目
以及：
Figure GDA0001184738370000181
因此，亲本分离子数为186，且因此重组分离子数为88。这个结果表明两基因座之间的遗传距离为32cM。这个遗传距离计算用于检测具有各类分离子的概率。
最终群体内发现的起始细胞数量的估算
测量群体多样化的质量的相关重点是测定在整个处理过程存活下并留在最终群体内的起始杂交种的数量。有可能基于GRE3基因型的检测结果估算它们的数量。事实上，PCR图存在两个条带(200BP和1200BP)的细胞为基因组重排获得的杂交种，或为在乙醚富集过程中没有被杀死的起始细胞。
组2的菌株＝组2的真实杂交种+存活起始细胞
前段得到的结果允许测定组2的真实杂交种的数量和组2的菌株的数量。
为检测组2的真实杂交种的数量，必须将构成该组的各类杂交种的比例加到一起。下表V列出各种杂交种，以及获得它们的概率。获得某类杂交种的概率是基于获得进入该类的两分离子的概率的乘积。在前面的子章节表明亲本分离子代表68％的分离子(或34％的各亲本分离子)。因此，重组分离子示为32％的全部分离子(即16％各个重组分离子)。
表V：获得各类杂交种的概率。对于组1，组2和3的杂交种的颜色代码分别与表III和IV中相同。
Figure GDA0001184738370000182
表V中的结果表明组2杂交种的比例(浅灰)是63.4％。同时，组2的菌株的比例示为群体的64.5％。因此，看来在测试的群体中，约1％的杂交种是乙醚富集过程中没有被杀死的起始菌株。
群体构建总结
总之，有可能从单一的起始杂交种构建菌株群体。结果表明，批量杂交和孢子形成的4阶段后产生的这种新群体是广泛基因组改组的产物。
所得群体内所需个体的选择
验证基因组重排质量后，基于它们发酵木糖的同时抵抗抑制剂的能力选择得到的酵母。
为做到这一点，在培养基YFI1上培养它们48小时，然后转移到YFX培养基培养72小时。(注意，培养基的组成示于表I(同上)或在表格后的文本中)。第二群体的样本分散在YEG培养基(同上)上。这最后一步导致，除其他外，以编号I-4749保藏在CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)的菌株的分离。
优化增殖的验证
最初，在优选培养基和优选+含氮碱基培养基上测试菌株的增殖。示于图1中。这些结果表明：
-菌株Ⅰ-4538，用于本发明的重组菌株，在优选+含氮碱基培养基上有效增殖，但在优选培养基上增殖非常差；
-菌株EGAc1(I-4839)，根据本发明野生型与菌株I-4538杂交，在优选培养基或优选+含氮碱基培养基上不能有效增殖；
-本发明的菌株I-4749在优选培养基有效增殖。
工业型培养基上增殖的验证
YFC培养基(示于表I，同上)已被定义为模拟己糖(例如葡萄糖，半乳糖等)和戊糖(例如木糖，阿拉伯糖等)的工业培养基型混合物的条件。菌株I-4538(亲本菌株)和I-4749(本发明的菌株)在该培养基上各自的增殖已经被验证。图2示出这些结果，并表明本发明的菌株增殖效率大于2。
发酵适用性验证
本发明的菌株已用于在接近实际培养基的培养基内发酵。用于该目的的YF I2培养基包括葡萄糖和木糖，即，C6和C5糖。监测发酵期间质量损失的结果示于图3。在实施的所有菌株的情况下，发酵是两阶段的。
在第一阶段中，菌株EGAc1(Ⅰ-4839)和EGAc2(Ⅰ-4840)表现出相同的方式。这相同适用于本发明的菌株I-4749。然而，菌株I-4538在该第一阶段较慢。考虑由葡萄糖降解物阻遏的原理，很可能是发酵的该第一部分对应于葡萄糖的消耗。
在发酵的第二阶段，值得注意的是所有菌株显著放缓。然而，最有效的菌株是菌株I-4538和I-4749。该第二阶段可能对应木糖的消耗，由菌株EGAc1(I-4839)([木糖-]表型的)不发酵的事实暗示。
记录表明，所有实施菌株之间的最佳平衡是本发明获得的I-4749。
Figure IDA0001072706030000011
Figure IDA0001072706030000021

Claims (16)

1.一种获得酵母菌株的方法，该酵母菌株适合于在具有低营养潜力的培养基上有效增殖，适合于代谢戊糖且具有发酵抑制剂抗性，所述方法包括以下步骤：
a)重组酵母菌株与缺乏缺陷的野生酵母菌株杂交，其中所述重组酵母菌株包括至少一拷贝的外源性木糖异构酶基因和至少一额外拷贝的D-木酮糖激酶基因，掺入基因组中并连接于菌株的配对特性之一；
b)通过随机孢子形成和杂交进行至少两个周期的基因组重排；
c)根据菌株代谢木糖能力的标准来选择步骤b)获得的群体；和
d)根据菌株在优选型(Pref type)培养基的生长能力的标准来选择步骤c)获得的群体，其中所述优选型培养基为低营养价值培养基，为低含氮碱基并包含木糖作为唯一碳源的培养基，
其中，两个选择阶段可以颠倒；
所述酵母为酿酒酵母属(Saccharomyces)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)实施的所述重组酵母菌株是保藏在CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)的酵母菌株，编号为I-4538。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c)包括在YFX培养基上选择的步骤。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c)包括以下步骤：
测量在厌氧条件下，在发酵培养基内，至少一杂交种在60小时期间将木糖转化为乙醇的比例，每千克所述发酵培养基含有55克葡萄糖和45克木糖，和
选择至少一杂交种，其在60小时内将至少70％木糖转化为乙醇。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤d)包括检测在包含蛋白水解产物且无含氮碱基的低营养价值培养基上菌株的增殖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述低营养价值的培养基是表I限定的优选培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过加入至少一拷贝的GAL2基因进行的遗传转化的额外步骤。
8.一种适合代谢戊糖，同时耐受发酵抑制剂的酵母，包括至少一拷贝的外源性木糖异构酶基因和至少一额外的D-木酮糖激酶基因，掺入基因组中并连接于菌株的配对特性之一，能够在包含蛋白水解产物且无含氮碱基的低营养价值培养基上生长，通过权利要求1-6所述的方法获得所述酵母，所述酵母为酿酒酵母属。
9.根据权利要求8所述的酵母，所述酵母为酿酒酵母种(Saccharomyces cerevisiae)，其中菌株保藏于CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号为I-4749。
10.根据权利要求8所述的酵母，所述酵母还包括至少一额外拷贝的GAL2基因。
11.根据权利要求10所述的酵母，所述酵母为酿酒酵母种，其中菌株保藏于CNCM(微生物培养物国家保藏中心，法国巴斯德研究所，博士鲁街25号，巴黎75724邮箱15)，编号为I-4829。
12.一种酵母菌株，源自权利要求8-11之一所述的酵母，其特征在于，它适合代谢戊糖，同时耐受发酵抑制剂。
13.一种酵母，由培养权利要求12所述的酵母菌株获得。
14.一种用于生产至少一发酵产物的方法，包括以下步骤：
a)在厌氧或半厌氧条件下，在包括一木糖源的培养基中发酵权利要求8-11、13任一项所述的酵母或权利要求12所述的酵母菌株，
b)获得乙醇。
15.权利要求8至11、13之一所述的酵母或权利要求12所述的酵母菌株的用途，用于转化和代谢包括木糖的植物来源材料。
16.根据权利要求15所述的用途，用于生产乙醇。
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