JP6653659B2 - 最適化された繁殖力を有するペントース発酵菌株 - Google Patents
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Description
・その後のバイオマスまたはバイオマスの断片の加水分解を最適化するための機械的、化学的および/または加熱プロセスの実施による前処理;
・適切な温度およびpH条件での、試薬、溶媒もしくは酵素の作用によるバイオマスまたはバイオマスの断片の加水分解。この加水分解の目的は、主な発酵性単糖類の放出である。使用される酵素は、安定で、かつ許容可能な加水分解速度で存在しなければならない。
・強く、高速で、かつ利用可能な全ての糖、すなわちC6(ヘキソース)糖およびC5(ペントース)糖の両方を使用しなければならない、発酵性糖の発酵。
酵母の形質転換の分野では、国際公開第2010/000464A1号パンフレットは、機能性キシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子の導入による前記酵母の形質転換を介したC5糖、特にキシロースの発酵のための酵母について説明する。この場合、キシロースイソメラーゼは、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスに由来する。
a)欠陥のない野生酵母菌株との組換え酵母菌株の交配ステップであって、ゲノムに組み込まれ、菌株の接合形質の1つのみに連鎖する外来キシロースイソメラーゼ遺伝子の少なくとも1つのコピーと、D−キシルロキナーゼ遺伝子の少なくとも1つの付加的コピーとを組換え酵母菌株が含んでいるステップ、
b)ランダム胞子形成および/または交配による、少なくとも2サイクルのゲノムシャッフリングステップ、
c)ステップb)で得られた集団の、キシロースを代謝する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、ならびに
d)ステップc)で得られた集団の、窒素塩基が少ない培地、低栄養価の培地で増殖する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、
を含み、2つの選択段階を逆にしてもよいことが留意される。
・30μg/LまでのRNase Aの添加により加水分解されたカンジダ・ユチリスのRNAの加水分解物3g/Lを補足したPref.培地、残りの本文および図面においてPref+窒素塩基と呼ぶ;
・酵母エキス10g/kg、バクトペプトン10g/kg、グルコース55g/L、キシロース45g/L、酢酸塩4g/Lを含み、pH4.4に調整されているYFI2培地;
・酵母エキス10g/L、グルコース20g/L、およびアガロース20g/Lを含むYEG培地。
いくつかの段階における、最初は半嫌気的、その後は嫌気的な酵母菌株の増殖ステップ、
約12〜25%の乾燥物質を含有する液体酵母クリームを得るための、または、酵母クリームをオスモライト製品と混合する場合、より多量の乾燥材料を得るための、その培養培地から生産された酵母の遠心分離による分離ステップ、
得られた液体酵母クリームのろ過ステップであって、一般的には回転式真空フィルター上で、26〜35%の乾燥物質を含む生の脱水酵母を取得するステップ、
均質な塊を得るための、前記の生の脱水酵母の混合ステップ、
このように得られた酵母の、以下を得るための押し出しステップ:
・約30%の乾燥物質を含む生の固形酵母もしくは砕いた生の酵母の形態の圧搾酵母、または
・酵母が乾燥されることが意図されている場合、粒子、一般に顆粒の形態の酵母
可能ならば、熱気流において、例えば、流動化により、押出成形で得られた酵母の粒子を、乾燥酵母を得るために制御乾燥させるステップ。
CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15)において、番号I-4538で寄託されている組換え菌株を、野生菌株、この場合出願人のEGAc1の菌株(I-4839)と交配させた。このステップを、Chapter 7, "Sporulation and Hybridization of Yeast" by R.R. Fowell, in the reference work "The Yeasts", Volume 1, published by A.H. Rose and J. S. Harrison, 1969-Academic Pressに教示されているような、従来技術に従って実施した。
分離個体100%を得ることが可能ではなかった限りにおいて、減数分裂を完了していなかった二倍体を排除する必要があった。
酵母エキス5g/L、グルコース20g/L、寒天30g/L、水適量1L。増殖48時間後、コロニーを使用して、国際公開第2013/178918A1号パンフレットに記載されているような、Mat1、Mat2およびMat3プライマーにそれぞれ対応する配列番号1、配列番号2および配列番号3のプライマーを使用することにより、「コロニーのPCR」を作製する。このPCR分析は、一倍体菌株を二倍体菌株から区別することを目標としている。
新しい交配種を、分離個体に富む懸濁液から、バルク相交配を行うことにより生成した。これを行うために、分離体の懸濁液1mLを、酵母エキス10g/L、バクトペプトン20g/L、グルコース20g/Lおよび蒸留水適量1Lを含むYPG培地50mLに植菌した。16時間後この培地において、顕微鏡観察では、接合体の形成を確認した。これらの交配種の増殖を促進するために、24時間ごとに、培養液200μLを生のYEG培地50mLに植菌した。継代培養の5日後、新しい交配種を、大きな胞子形成サイクルに再導入することができる。
出発交配種の遺伝子型の分析
ゲノムシャッフリングの質を検証する方法の1つは、遺伝子GRE3に連鎖する2つの遺伝子座からの対立遺伝子の分布を研究することから構成されている。実際、「gre3ヌル」遺伝子型に対応する遺伝子GRE3の両コピーの欠失が、菌株I-4538につながるC5菌株で行われた。この乱れは、EGAc1(I-4839)におけるGRE3の非欠失のために、ヘテロ接合で菌株EGAc2(I-4840)に伝えられた。
GRE3遺伝子型に関連して、EGAc2(I-4840)のような交配種は、したがって、4つの型の分離個体を与えることができる。これらの分離個体は、以下の表2に記載されている。遺伝子型gre3Δ; -およびGRE3; GRE3を持つ分離個体は、全ての対立遺伝子が単一の親に由来しているため、いわゆる親遺伝子型である。対照的に、分離個体GRE3; -およびgre3Δ; GRE3は、組換えと呼ばれている。それぞれの場合について、MATa型およびMATアルファ型がある。
このゲノムシャッフリングの終わりに生じ得る交配種を、表3に示す。各交配種型の遺伝子型は、対応するボックスに参照されている。これらの遺伝子型を、pGRE3(配列番号4)およびtGRE3(配列番号5)プライマーのPCRプロファイルについて、3つの群に分類した:
群1:200BPサイズの単一バンド(表中の白いセル)
群2:200BPおよび1200BPの2つのバンド(表中の薄灰色のセル)
群3:1200BPの単一バンド(表中の暗灰色のセル)
ここで、
集団の多様性の質の測定に関する重要な点は、全処理を耐え抜いて最終的な集団に留まっている出発交配種の数の決定である。GRE3遺伝子型の決定の結果に基づいて、その数を推定することが可能である。実際、そのPCRプロファイルが2つのバンド(200BPおよび1200BP)を提示する細胞は、ゲノムシャッフリングにより得られた交配種、またはエーテルでの濃縮の間に殺されなかった出発細胞のいずれかである。
要約すると:単一の出発交配種からの菌株の集団を構築することが可能であった。バルク交配および胞子形成の4つの段階の後に生成されたこの新たな集団が、広範なゲノムシャッフリングの生成物であることが示された。
ゲノムシャッフリングの質を検証した後、得られた酵母を、阻害物質に抵抗しながらキシロースを発酵する能力について選択した。
これを行うために、それらを48時間、培地YFI1で培養し、その後YFX培地に移して72時間培養した(注:培地の組成は、表1(前出)または表に続く本文に示されている)。この第二集団の試料を、YEG培地(前出)に広げた。この最後のステップは、とりわけ、CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15)に、番号I-4749で寄託された菌株の単離につながった。
最初に、菌株の繁殖をPref.培地、およびPref.+窒素塩基培地で試験した。これは、図1に示されている。これらの結果は、以下を示す:
菌株I-4538は、本発明で使用された組換え菌株であり、Pref.+窒素塩基培地では効率的に繁殖するが、Pref.培地では非常に乏しく繁殖する;
菌株EGAc1(I-4839)は、本発明により菌株I-4538と交配された野生菌株であり、Pref.またはPref.+窒素塩基培地で効率的に繁殖しない;
本発明による菌株I-4749は、効率的にPref.培地で繁殖する。
YFC培地(上記表1に示される)は、ヘキソース(例えばグルコース、ガラクトースなど)およびペントース(例えばキシロース、アラビノースなど)の産業培地型混合の条件を模倣すると定義されてきた。菌株I-4538(親菌株)およびI-4749(本発明の菌株)のそれぞれの繁殖を、この培地で検証した。図2はこれらの結果を示しており、本発明の菌株での2倍以上の繁殖効率を実証している。
本発明の菌株は、実際の培地に近い培地で、発酵に使用されてきた。この目的のために使用されたYFI2培地は、グルコースおよびキシロース、つまりC6およびC5糖の両方を含む。発酵中の質量損失を監視した結果を、図3に示す。実施される全ての菌株の場合で、発酵は二相性である。
Claims (15)
- 低栄養価の培地で効率的に繁殖するのに適しており、ペントースを代謝するのに適しており、そして発酵阻害物質抵抗性を有する酵母菌株を得るプロセスであって、
a)野生酵母菌株とのペントースを代謝するのに適しており、そして発酵阻害物質抵抗性を有する組換え酵母菌株の交配ステップであって、ゲノムに組み込まれ、該菌株の接合形質の1つに連鎖する外来キシロースイソメラーゼ遺伝子の少なくとも1つのコピーと、D−キシルロキナーゼ遺伝子の少なくとも1つの付加的コピーとを該組換え酵母菌株が含んでいるステップであって、前記組換え酵母菌株が、CNCM(National Collection of Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15)において、寄託番号CNCM I-4538で寄託されている酵母菌株であり、前記野生酵母菌株が寄託番号CNCM I-4839で寄託されている酵母菌株であり、
b)ランダム胞子形成および/または交配による、少なくとも2サイクルのゲノムシャッフリングステップ、
c)ステップb)で得られた集団の、キシロースを代謝する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、ならびに
d)ステップc)で得られた集団の、唯一の炭素源としてキシロース、ミネラル窒素源、カリウム源、リン源、硫黄源、マグネシウム源、カルシウム源、鉄源、微量元素源および水を含む窒素塩基が少ない培地である低栄養価の培地で増殖する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、
を含み、2つの選択段階を逆にしてもよいことが留意される、プロセス。 - ステップc)が、蒸留水 1000 g/L、キシロース 70 g/L、YE J型 5 g/L、(NH4) PO4 4.7 g/L、クエン酸 11.4 g/L、クエン酸三ナトリウム 13.5 g/L、ZnSO4 0.021 g/L、MgSO4 7H2O 1 g/L、チアミン0.018 g/L、ピリドキシン0.0053 g/L、ビオチンKOH0.0018 g/L、パントテン酸塩 0.0038 g/L、ニコチン酸 0.016 g/L、メソイノシトール 0.05 g/L、リボフラビン 0.001 g/L、パラアミノ安息香酸 0.0012 g/L、およびモノ‐ソルベートオレエート 1 g/Lを含むYFX培地での選択ステップを含む、請求項1に記載のプロセス。
- ステップc)が、発酵培地中において、グルコース55gおよびキシロース45gを前記培地1kg当たりに含む中で、少なくとも1つの交配種により、嫌気条件下で60時間かけてエタノールに変換されるキシロースの割合の測定ステップ、ならびに、60時間後に少なくとも70%のキシロースをエタノールへ変換する少なくとも1つの交配種の選択ステップを含む、請求項1または2に記載のプロセス。
- ステップd)が、タンパク質加水分解物を含有し、窒素塩基のない低栄養価の培地での菌株の繁殖を測定することからなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプロセス。
- 該低栄養価の培地が、蒸留水 1000 g/L、キシロース 20 g/L、(NH4)2SO45 g/L、タンパク質加水分解物 3 g/L、ZnSO4 0.04 g/L、 MgSO4 7H2O 0.5 g/L、KH2PO41 g/L、 NaCl 0.1 g/L、CaCl20.1 g/L、H3BO3 0.005 g/L、CuSO4 5 H2O 0.06 g/L、KI 0.001 g/L、MnSO4 H2O 0.004 g/L、Na2MoO4 2H2O 0.002 g/L、FeCl3 0.0002 g/L、チアミン 0.07 g/L、ピリドキシン 0.002 g/L、ビオチンKOH 0.002 g/L、パントテン酸塩 0.002 g/L、ニコチン酸 0.05 g/L、メソイノシトール 0.2 g/L、リボフラビン 0.002 g/L、およびパラアミノ安息香酸 0.002 g/Lを含むPref.培地である、請求項4に記載のプロセス。
- GAL2遺伝子の少なくとも1つのコピーの付加による遺伝的形質転換の追加ステップを含む、請求項1に記載のプロセス。
- ゲノムに組み込まれ、該菌株の接合形質の1つに連鎖する外来キシロースイソメラーゼ遺伝子の少なくとも1つのコピーと、少なくとも1つの付加的D−キシルロキナーゼ遺伝子とを含み、タンパク質加水分解物を含有し、窒素塩基のない低栄養価の培地で増殖することができる、請求項1〜6に記載のプロセスにより得ることができる、酵母であって、
寄託番号CNCM I-4749で寄託されている菌株を含む、酵母。 - GAL2遺伝子の少なくとも1つの付加的コピーをさらに含む、請求項7に記載の酵母。
- 前記酵母が寄託番号CNCM I-4829で寄託されている菌株である、請求項8に記載の酵母。
- 発酵阻害物質に抵抗しながらペントースを代謝するのに適していることを特徴とする、請求項7〜9のいずれか一項に記載の酵母に由来する酵母菌株。
- 請求項10に記載の酵母菌株の培養から得られる、酵母。
- a)1つのキシロース源を含む培地の嫌気性または半嫌気性条件下での、請求項7に記載の酵母による発酵ステップ、
b)エタノールを得るステップ、
を含む、少なくとも1つの発酵産物を生産する方法。 - 請求項7〜11のいずれか一項に記載の酵母により発酵が行われる、請求項12に記載の方法。
- キシロースを含む植物由来の材料の変換および代謝のための、請求項7〜11のいずれか一項に記載の酵母の利用。
- エタノールを生産するための、請求項14に記載の利用。
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