MX2013004121A - Celula de levadura fermentadora de pentosas y glucosa. - Google Patents

Celula de levadura fermentadora de pentosas y glucosa.

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Abstract

Célula de levadura que comprende uno o más genes exógenos de una o más vías metabólicas de pentosas no nativas para la célula de levadura, en donde la célula de levadura tiene una interrupción de los genes nativos hxk1, hxk2 glk1 y gai11 en la célula de levadura. La invención se relaciona además con una célula de levadura fermentadora de pentosas y glucosa que tiene la capacidad de consumir simultáneamente pentosas y glucosa.

Description

CÉLULA DE LEVADURA FERMENTADORA DE PENTOSAS Y GLUCOSA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una célula de levadura fermentadora de pentosas y glucosa, adecuada para la fermentación de una composición de azúcares que comprende uno o más azúcares de C5 y C6 (dicha composición también se denomina composición de azúcares mixtos en la presente) . La composición de azúcares mixtos puede provenir de un material lignocelulósico . La invención también se relaciona con un proceso para la producción de un producto de fermentación a partir de la composición de azúcares mixtos usando la célula de levadura fermentadora de pentosas y glucosa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La mayor parte del etanol producido como una alternativa de los combustibles fósiles actualmente proviene de la fermentación del almidón de maíz y de la sacarosa basada en caña de azúcar. Con el fin de alcanzar las metas ambiciosas para producir combustibles renovables, se están desarrollando nuevas tecnologías para convertir una biomasa no alimenticia en productos de fermentación, tal como el etanol. Saccharomyces cerevisiae es el organismo de elección en la industria del etanol, pero no puede utilizar los azúcares de cinco carbonos contenidos en el componente de hemicelulosa de alimentaciones de biomasa. La hemicelulosa puede constituir hasta un 20-30% de la biomasa, siendo la xilosa y la arabinosa los azúcares de C5 más abundantes. La expresión heteróloga de una xilosa isomerasa (XI) es una opción para permitir que las células de levadura metabolicen y fermenten xilosa. Asimismo, la expresión de los genes bacterianos araA, araB y araD en cepas de S. cerevisiae da como resultado la utilización y una fermentación alcohólica eficiente de la arabinosa.
La fermentación de pentosa en etanol por las especies de levadura fermentadoras de pentosas conocidas es lenta y da como resultado bajo rendimientos con relación a los índices de fermentación y rendimientos de etanol que se obtienen con las levaduras convencionales en fermentaciones de glucosa.
Para mejorar la eficacia en cuanto al costo de la fermentación de pentosas, es necesario incrementar el índice de fermentación y los rendimientos del etanol obtenido.
S. cerevisiae tiene una preferencia inherente por la glucosa. Como consecuencia de ello, todas las cepas fermentadoras de pentosas actuales demuestran una utilización sucesiva de mezclas de glucosa y pentosas o en el mejor de los casos la fermentación de pentosas comienza a concentraciones bajas de glucosa.
En WO2008041840 se describe una célula eucariota que expresa secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas ara A, ara B y ara D, por lo cual la expresión de estas secuencias de nucleótidos le confiere a la célula la capacidad para usar L-arabinosa y/o convertir L-arabinosa en L-ribulosa, y/o xilulosa 5-fosfato y/o en el producto de fermentación deseado, tal como etanol. Opcionalmente, la célula eucariota también puede convertir xilosa en etanol. La cepa IMS0003 (página 46) puede consumir por completo glucosa, xilosa y arabinosa en el transcurso de 70 horas, según se muestra en la Figura 7. La Figura 7 muestra que el consumo sustancial de xilosa y arabinosa recién comienza después de 20 horas, es decir cuando ya hubo una conversión completa de glucosa. El consumo de glucosa y pentosas es sucesivo.
Raamsdonk LM et al., Yeast, 2001; 18; 1023-1003, describen el co-consumo de azúcares o etanol y glucosa en una cepa de Saccharomyces cerevisiae en la cual se ha suprimido el gen HXK2. Sin embargo, la cepa prácticamente no produjo etanol y crece casi exclusivamente de modo oxidativo en la presencia de abundante glucosa.
Seria deseable proporcionar una cepa de levadura que pueda fermenar an-aeróbicamente pentosas, ya sea de manera simultánea con la glucosa (co-fermentación de pentosas y glucosa) y/o más rápidamente que las conocidas actualmente.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un objeto de la invención comprende proveer una cepa de levadura que pueda co-fermentar pentosas y glucosa de manera anaeróbica .
Un objeto de la presente invención comprende proveer un método efectivo en cuanto al costo para producir etanol por fermentación de pentosas.
Otro objeto de la presente invención comprende proveer una célula de levadura que tiene la capacidad para fermentar pentosas con un mayor índice que el obtenido usando las cepas conocidas actualmente en el arte.
Otro objeto comprende reducir el tiempo de fermentación de una fermentación de C5/C6.
Otros objetos, características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de una revisión de la descripción y de las reivindicaciones.
Uno o más de estos objetos se pueden obtener de acuerdo con la invención. Una forma de realización de la invención es una célula de levadura que comprende uno o más genes exógenos de una o más vías metabólicas de pentosas no nativas para la célula de levadura, en donde la célula de levadura tiene una interrupción de los genes nativos hxkl, hxk2 glkl y gall en la célula de levadura.
En la presente, una célula tal con una o más interrupciones se denomina célula de levadura interrumpida. En la presente, la célula con interrupción de los genes hxkl, hxk2, glkl y gall también se denomina célula interrumpida cuádruple.
La invención se relaciona además con un proceso para la preparación de una célula de levadura termentadora de pentosas, en donde una célula de levadura que comprende uno o más genes exógenos de una via de pentosas es sometida a interrupción del gen hxk2 nativo en la célula de levadura, en donde la célula de levadura interrumpida resultante es sometida a ingeniería evolutiva para mejorar el consumo de pentosas, hasta que la célula de levadura tenga una velocidad de crecimiento de 0,05 h"1 o más con pentosas como única fuente de carbono y finalmente aislamiento de la célula de levadura termentadora de pentosas resultante. En una forma de realización, la célula de levadura termentadora de pentosas puede tiene capacidad para consumir glucosa. La célula que es el producto de la ingeniería evolutiva se denomina célula de levadura termentadora de pentosas en la presente .
En una forma de realización preferida de este proceso, la célula interrumpida es una célula de levadura que comprende uno o más genes exógenos que permiten que las células fermenten pentosas, en donde la célula contiene una interrupción de los genes hxkl, hxk2 glkl y gall nativos en la célula de levadura, es decir es una célula interrumpida cuádruple.
En una forma de realización, la célula de levadura fermentadora de pentosas comprende una o más hexoquinasas exógenas. Con la reintroducción de la actividad hexoquinasa por medio de una hexoquinasa exógena, es posible restablecer el consumo de glucosa por la célula de levadura fermentadora de pentosas. Preferentemente, la o las hexoquinasas exógenas tienen la misma actividad que la o las hexoquinasas nativas en la célula de levadura. En la presente, dicha célula de levadura en la cual se ha reintroducida la hexoquinasa se denomina célula de levadura fermentadora de pentosas y glucosa o célula de levadura. La invención se relaciona además con una célula de Saccharomyces fermentadora de pentosas y glucosa que tiene la capacidad de consumir simultáneamente y de manera anaeróbica pentosas y glucosa.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra las concentraciones de glucosa (?), arabinosa (A) y etanol (¦) y la densidad óptica a 660 nm (DO660, ·) durante cultivos en frascos de agitación de cepas DS62504 (Figura 1 (a)), IMK307 (Figura 1 (b) ) e IMK311 (Figura 1 (c) ) .
La Figura 2 muestra las concentraciones de glucosa (?) , arabinosa (A) y etanol (¦) y el porcentaje de C02 en el gas de escape (linea negra sólida) durante cultivos anaeróbicos de las cepas DS62504 (Figura 2 (a)), IMK307 (Figura 2 (b) ) e IMK311 (Figura 2 (c) ) . Las fermentaciones fueron inoculadas con cultivos en frascos de agitación que crecieron con glucosa .
La Figura 3 muestra los perfiles de crecimiento determinados por medición de la densidad óptica a 660 nm (DO660) de cultivos en frascos de agitación de la cepa I K318 en MYurea que contiene 2% de arabinosa y diversas concentraciones de glucosa (0, 0,11, 0,23, 0,65, 1,3 y 2,5%).
La Figura 4 muestra las concentraciones de glucosa (?) , arabinosa ( A ) y etanol (¦) y la densidad óptica a 660 nm (DO660,») durante cultivos en frascos de agitación de la cepa I K318, transferidos en serie de acuerdo con la tabla 3 (Serie A: SF1, SF2 y SF5) ; la forma aislada de colonia individual seleccionada de esta serie de frascos de agitación es IMW018.
La Figura 5 muestra las concentraciones de glucosa (?) , arabinosa ( A ) y etanol (¦) y la densidad óptica a 660 nm (DO660,*) durante cúltivos en frascos de agitación de la cepa IMK318, transferidos en serie de acuerdo con la tabla 3 (Serie B: SF1, SF2 y SF3) ; la forma aislada de colonia individual seleccionada de esta serie de frascos de agitación es IMW017.
La Figura 6 muestra las concentraciones de glucosa (?) , arabinosa ( A) y etanol (¦) y el porcentaje de C02 en el gas de escape (linea sólida gris) durante cultivos anaeróbicos sucesivos de la cepa I W017.
La Figura 7 muestra el porcentaje de C02 en el gas de escape (linea sólida gris) y los índices de crecimiento durante cultivos anaeróbicos sucesivos de la cepa IMW017. Los índices de crecimiento específicos derivan del perfil de producción de C02 durante los cultivos por lotes ya sea sobre una mezcla de glucosa y arabinosa (·) o arabinosa solamente (?) .
La Figura 8 muestra los perfiles de producción de C02 de lotes individuales en medio suplementado con arabinosa (A) y una mezcla de glucosa y arabinosa (B) durante cultivo anaeróbico por lotes sucesivo de la cepa IMW017. Los perfiles de producción de C02 se alinean suponiendo un nivel de producción inicial igual de C02. Los números en la leyenda indican números dé lotes consecutivos.
La Figura 9 muestra las concentraciones de glucosa (?), arabinosa ( A ) y etanol (¦) y el porcentaje de C02 en el gas de escape (línea sólida gris) para los lotes 24 y 25 del cultivo anaeróbico por lotes sucesivo de la cepa IMW017.
La Figura 10 muestra la actividad de la enzima hexoguinasa de las cepas DS62504, IMK307, IMK311, IMK318, IM 017 e IMW018.
La Figura 11 muestra la DO660 (·) , la concentración de arabinosa (A) y la concentración de glucosa (?) durante en cultivo en frascos de agitación de la cepa IMW023 en medio MY suplementado con 2% de glucosa y 2% de arabinosa.
La Figura 12 muestra la DO660 (·) , la concentración de arabinosa (A) y la concentración de glucosa (?) durante el primer (SF1) y el 24° (SF24) cultivo en frascos de agitación de un cultivo transferido en serie de la cepa IMW023 en medio MY suplementado con 2% de glucosa y 2% de arabinosa.
La Figura 13 muestra los índices de crecimiento específicos estimados determinados en cultivos en frascos de agitación individuales de un cultivo transferido en serie de la cepa IMW023 en medio MY suplementado con 2% de glucosa y 2% de arabinosa.
La Figura 14 muestra el porcentaje de C02 en el gas de escape (línea sólida gris) y los índices de crecimiento específicos durante cultivos anaeróbicos por lotes sucesivos de la cepa IMW023 en medio MY suplementado con 20 g/litro de glucosa y 20 g/litro de arabinosa, y los índices de crecimiento específicos de cultivos por lotes individuales (·) . El sombreado gris indica los casos en que se suministró aire en lugar de nitrógeno gaseoso. Las flechas indican el comienzo de un nuevo lote consecutivo.
La Figura 15 muestra el porcentaje de CO2 en el gas de escape (linea sólida gris), la concentración de arabinosa (A) y la concentración de glucosa (?) durante cultivos anaeróbicos por lotes sucesivos de la cepa IMW023 en medio MY suplementario con 20 g/litro de glucosa y 20 g/litro de arabinosa .
La Figura 16 muestra los perfiles de producción de C02 alineados de los lotes individuales durante el cultivo anaeróbico por lotes sucesivo de la cepa IM 023 en medio MY suplementado con 20 g/litro de glucosa y 20 g/litro de arabinosa. Los perfiles de producción de C02 se alinean suponiendo un nivel de producción inicial igual de C02. Los números en la leyenda indican números de lotes consecutivos.
La Figura 17 muestra las concentraciones de glucosa (?), arabinosa (A) y etanol (?) y la densidad óptica a 660 nm (DO660,») durante cultivos en frascos de agitación de las cepas DS62504 (Figura 17(a)), IMK307 (Figura 17 (b) , I K311 (Figura 17 (c) ) , IMW017 (Figura 17 (d) ) , IMW018 (Figura 17 (e)) e IMW058 (Figura 17 (f)), IMW024 (Figura 17 (g) ) , IMW025 (Figura 17 (h) ) , IMW047 (Figura 17 (i)), IMW059 (Figura 17 (j)), IMW060 (FIGURA 17 (k)), IMW061 (1) ) .
La Figura 18 muestra las concentraciones de glucosa (?) y arabinosa (A) durante un cultivo en frasco de agitación de la cepa IMW047.
La Figura 19 muestra la alineación de aminoácidos de GAL1 de las cepas CE . PK 113-7D, IMK318, IMW017 e IMW018.
La Figura 20 muestra la alineación de aminoácidos de GAL2 de las cepas CE . PK 113-7D, IMK318, IM 017 e IMW018.
La Figura 21 muestra las concentraciones de glucosa (?) , arabinosa (A), etanol (?) , los pesos secos de biomasa (·) y la producción de C02 (linea sólida gris) durante el cultivo anaeróbico de la cepa IMW059 en medio MY suplementado con 20 g l-1 de glucosa y 20 g l-1 de arabinosa.
La Figura 22 muestra las concentraciones de glucosa (?), arabinosa (A), etanol (?) , los pesos secos de biomasa (·) y la producción de C02 (linea sólida gris) durante el cultivo anaeróbico de la cepa IMW060 en medio MY suplementado con 20 g l"1 de glucosa y 20 g l"1 de arabinosa.
La Figura 23 muestra las concentraciones de glucosa (?) , arabinosa (A) , etanol (?) , los pesos secos de biomasa (·) y la producción de C02 (linea sólida gris) durante el cultivo anaeróbico de la cepa IM 061 en medio MY suplementado con 20 g l"1 de glucosa y 20 g l"1 de arabinosa.
La Figura 24 muestra los perfiles de producción de C02 de las cepas DS62504 (linea negra punteada) , IMW059 (linea negra sólida), IMW060 (linea negra sólida) e IMW061 (linea negra de guiones) durante el cultivo anaeróbico en una mezcla de 20 g l"1 de glucosa y 20 g l"1 de arabinosa.
La Figura 25 muestra las concentraciones de glucosa (?), mañosa ( 0 ) , arabinosa (?) y etanol (?) durante cultivos en frascos de agitación de la cepa DS62504 sobre medio CFMM2M.
La Figura 26 muestra las concentraciones de glucosa (?) , mañosa ( 0 ) , arabinosa ( A ) y etanol (?) durante cultivos en frascos de agitación de la cepa IMW060 sobre medio CFMM2M.
La Figura 27 muestra las concentraciones de glucosa (?), mañosa ( 0 ) , arabinosa ( A ) y etanol (?) durante cultivos en frascos de agitación de la cepa IMW061 sobre medio CF M2M.
La Figura 28 muestra las concentraciones de glucosa (?), mañosa ( 0 ) , arabinosa ( A ) y etanol (?) durante cultivos en frascos de agitación de la cepa DS62504 sobre medio CFMMIM.
La Figura 29 muestra las concentraciones de glucosa (?), mañosa ( 0 ) , arabinosa ( A ) y etanol (?) durante cultivos en frascos de agitación de la cepa IMW060 sobre medio CFMMIM.
La Figura 30 muestra las concentraciones de glucosa (?), mañosa ( 0 ) , arabinosa ( A ) y etanol (?) durante cultivos en frascos de agitación de la cepa IMW061 sobre medio CFMMIM.
DESCRIPCIÓN BREVE DEL LISTADO DE SECUENCIAS Oligonucleótidos usados para la construcción de casetes de interrupción de genes: La SEQ ID N°: 1 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2-disA La SEQ ID N°: 2 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2-disB La SEQ ID N°: 3 muestra la secuencia del oligonucleótido HXKl-disA La SEQ ID N°: 4 muestra la -secuencia del oligonucleótido HXKl-disB La SEQ ID N°: 5 muestra la secuencia del oligonucleótido GLKl-disA La SEQ ID N°: 6 muestra la secuencia del oligonucleótido GLKl-disB Oligonucleótidos usados para fines de diagnóstico: La SEQ ID N°: 7 muestra la secuencia del oligonucleótido KanA La SEQ ID N°: 8 muestra la secuencia del oligonucleótido KanB La SEQ ID N°: 9 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2-FW La SEQ ID N°: 10 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2--RV La SEQ ID N°: 11 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK1--FW La SEQ ID N°: 12 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK1--RV La SEQ ID N°: 13 muestra la secuencia del oligonucleótido GLK1--FW La SEQ ID N°: 14 muestra la secuencia del oligonucleótido GLKl-RV La SEQ ID N°: 15 muestra la secuencia de ADN de HXK1 La SEQ ID N°: 16 muestra la secuencia de ADN de HXK2 La SEQ ID N°: 17 muestra la secuencia de ADN de GLK1 La SEQ ID N°: 18 muestra la secuencia de ADN de GAL1 La SEQ ID N°: 19 muestra la secuencia de ADN de YDR516C La SEQ ID N°: 20 muestra la secuencia de ADN de YLR446W La SEQ ID N°: 21 muestra la secuencia de aminoácidos de HXK1 La SEQ ID N°: 22 muestra la secuencia de aminoácidos de HXK2 La SEQ ID N°: 23 muestra la secuencia de aminoácidos de GLK1 La SEQ ID N°: 24 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL1 La SEQ ID N°: 25 muestra la secuencia de aminoácidos de YDR516C La SEQ ID N°: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de YLR446 La SEQ ID N°: 27 muestra la secuencia del oligonucleótido GALl-DisA La SEQ ID N°: 28 muestra la secuencia del oligonucleótido GALl-DisB La SEQ ID N° : 29 muestra la secuencia del oligonucleótido GAL1-FW2 La SEQ ID N°: 30 muestra la secuencia del oligonucleótido GAL1-RV2 La SEQ ID N°: 31 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2-FW2 La SEQ ID N°: 32 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2-RV2 La SEQ ID N°: 33 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2-FW3 La SEQ ID N°: 34 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK2-RV3 La SEQ ID N°: 35 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK1-F 2 La SEQ ID N°: 36 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK1-RV2 La SEQ ID N°: 37 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK1-FW3 La SEQ ID N°: 38 muestra la secuencia del oligonucleótido HXK1-RV3 La SEQ ID N° : 39 muestra la secuencia del oligonucleótido GLK1-FW4 La SEQ ID N°: 40 muestra la secuencia del oligonucleótido GLK1-RV4 La SEQ ID N°: 41 muestra la secuencia del oligonucleótido GLK1-F 5 La SEQ ID N°: 42 muestra la secuencia del oligonucleótido GLK1-RV5 La SEQ ID N°: 43 muestra la secuencia de ADN de GAL1 (CEN.PK 113-7D) La SEQ ID N°: 44 muestra la secuencia de ADN de GAL1 (IMK318) La SEQ ID N°: 45 muestra la secuencia de ADN de GAL1 (IMW017) La SEQ ID N°: 45 muestra la secuencia de ADN de GAL1 (IMW018) La SEQ ID N°: 47 muestra la secuencia de ADN de GAL2 (CEN.PK 113-7D) La SEQ ID N°: 48 muestra la secuencia de ADN de GAL2 (IMK318) La SEQ ID N°: 49 muestra la secuencia de ADN de GAL2 (I W017) La SEQ ID N°: 50 muestra la secuencia de ADN de GAL2 (IMW018) La SEQ ID N°: 51 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL1 (CEN.PK 113-7D) La SEQ ID N°: 52 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL1 (IMK318) La SEQ ID N°: 53 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL1 (IMW017) La SEQ ID N°: 54 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL1 (IMW018) La SEQ ID N°: 55 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL2 (CEN.PK 113-7D) La SEQ ID N°: 56 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL2 (IMK318) La SEQ ID N°: 57 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL2 (IMW017) La SEQ ID N°: 58 muestra la secuencia de aminoácidos de GAL2 (IMW018) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprende" e "incluye" y las variaciones tales como "comprende", "que comprende", "que incluye" deben interpretarse en un sentido inclusivo. Es decir, estas palabras intentan cubrir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no mencionados específicamente, cuando el contexto lo permite.
El artículo "un" y "una" se usan en la presente para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento. A modo de ejemplo, en la presente la célula puede ser una célula, pero también se refiere a una población de células o a una cepa.
Las diferentes formas de realización de la invención que se describen en la presente se pueden combinar entre si.
Una interrupción se define en la presente como cualquier interrupción de actividad, e incluye, pero en un sentido no limitativo, una supresión, una mutación, una reducción de la afinidad del gen interrumpido y la expresión de ARN antisentido complementario del ARNm de una hexoqüinasa. Un interruptor de genes es una célula que contiene una o más interrupciones del gen respectivo. En la presente, nativo siunifica que el gen estaba presente en la célula de levadura antes de la interrupción. Incluye los casos en que el gen nativo en levadura está presente en una célula de levadura de tipo salvaje, una célula de levadura de laboratorio o una célula de levadura industrial. La célula de levadura también se puede denominar cepa de levadura o parte de una cepa de levadura en la presente.
En una forma de realización, la célula de levadura termentadora de pentosas y glucosa que produce etanol a una velocidad general mayor que la correspondiente cepa de tipo salvaje y que tiene un menor tiempo de fermentación y/o presenta co-consumo de pentosas y glucosa, preferentemente co-consumo de pentosas anaeróbicamente y simultáneamente, a diferencia de sucesivamente.
En una forma de realización, la levadura comprende una hexoquinasa exógena. Preferentemente, la hexoquinasa exógena introduce una actividad hexoquinasa en la célula.
En la presente, exógena significa que no estaba presente en la célula de levadura antes de la introducción de la hexoquinasa. Una hexoquinasa exógena puede incluir, pero en un sentido no limitativo, un gen que es nativo en la levadura o un gen que tiene la misma secuencia que la hexoquinasa interrumpida .
En una forma de realización de la invención, la célula de levadura es una cepa en donde la expresión reducida de hexoquinasa en la variante de levadura se obtiene con un medio seleccionado del grupo que consiste de interrupción del gen .de hexoquinasa y expresión del ARN antisentido complementario del ARNm de la hexoquinasa.
En una forma de realización de la invención, la célula de levadura es interruptora de hexoquinasa de . Saccharomyces cerevisiae .
En otra forma de realización, la célula de levadura es IMW017, IMW018, IMK306, IMK307 y/o IMK318 de Saccharomyces cerevisiae.
En una forma de realización, la célula de levadura tiene un índice global de producción de etanol que es al menos aproximadamente un 20% mayor, al menos aproximadamente un 50% o al menos aproximadamente un 100% mayor que el de la correspondiente levadura de tipo salvaje.
La invención se relaciona además con un proceso para producir etanol a partir de la fermentación de pentosas, que comprende el paso de: cultivar una célula de levadura de acuerdo con la invención en una composición de azúcares que contiene pentosas bajo condiciones de fermentación adecuadas por un period de tiempo suficiente como para permitir la fermentación de pentosas en etanol, en donde la célula de levadura fermenta las pentosas para producir etanol a un nivel alto con relación a la correspondiente levadura de tipo salvaje y en donde la célula de levadura presenta una expresión reducida de una hexoquinasa funcional, con relación a la correspondiente levadura de tipo salvaje.
En una forma de realización del proceso, se redujo el tiempo de fermentación con relación a la fermentación correspondiente de levaduras de tipo salvaje, preferentemente el tiempo de fermentación es reducido en un 40% o más.
En una forma de realización del proceso, se co-fermentan las pentosas y la glucosa. En otra forma de realización del proceso, el índice global de producción de etanol es al menos un 20% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente o un 100% aproximadamente mayor que el de un proceso con la correspondiente levadura de tipo salvaje.
En una forma de realización del proceso, la célula de levadura es IMW017, IMW018, IMK306, I K307 y/o I K318 de Saccharomyces cerevisiae .
En una forma de realización del proceso, el material que contiene pentosas comprende un hidrolizado de un material lignocelulosico .
En una forma de realización del proceso, el hidrolizado es un hidrolizado enzimático del material lignocelulosico.
La invención se relaciona además con el uso de una interrupción de una o más hexoquinasas en levadura en un proceso de ingeniería evolutiva y/o un proceso mejoramiento de la cepa de levadura. Estos son procesos conocidos. La ingeniería evolutiva es un proceso en donde los fenotipos industrialmente relevantes de un microorganismo, en la presente una levadura, puede acoplarse a la velocidad de crecimiento específica y/o a la afinidad por un nutriente, mediante un proceso de selección natural establecida racionalmente. Por ejemplo, la Ingeniería evolutiva se describe con detalle en Kuijper, M, et al, FEMS Yeast Research, 5(2005) 925-934, WO2008041840 y WO2009112472. Después de la ingeniería evolutiva, se aisla la célula de levadura fermentadora de pentosas resultante. El aislamiento puede ejecutarse de cualquier manera conocida, por ejemplo por separación de las células de un caldo de células de levadura usado en la ingeniería evolutiva, por ejemplo, tomando una muestra de células o por filtración o centrifugación.
La presente invención es una célula de levadura que fermenta pentosas en mezclas de azúcares que también contienen glucosa a un índice mayor que la correspondiente levadura de tipo salvaje, donde la célula de levadura se caracteriza por una expresión reducida de uno o más genes de hexoquinasa nativa.
Sin limitaciones al alcance de la invención y sin considerar una teoría particular, es muy probable, que este fenómeno sea la consecuencia de una inhibición competitiva del transporte de pentosas por glucosa o debido a la represión por glucosa de los genes cruciales para la fermentación de pentosas o debido a la inactivación o degradación de las proteínas involucradas o a una reducción de afinidad en la presencia de glucosa. En la presencia de glucosa, la ingeniería evolutiva para el crecimiento sobre pentosas de cepas que ya no (pueden) utilizar glucosa debería dar como resultado un fenotipo insensible a glucosa. Dicha cepa, que ya no puede consumir glucosa, se puede obtener, por ejemplo, por supresión de las tres hexo/gluco-quinasas (hxklA hxk2A glklA) . En la presente se muestra que también la supresión de gall (gallA) es ventajosa para disminución aún más el consumo de glucosa en el triple interrumpido, creando asi un interrumpido cuádruple.
La presente invención también está dirigida a un método para producir etanol a partir de la fermentación de pentosas, que comprende el paso de: cultivar una célula de levadura en un material que contiene pentosas bajo condiciones de fermentación adecuadas por un periodo de tiempo suficiente para permitir la fermentación de pentosas en etanol, donde la variante de levadura tiene la capacidad para fermentar pentosas a gran velocidad con relación a la correspondiente levadura de tipo salvaje y que tiene una expresión reducida de hexoquinasas funcionales.
La célula de levadura de la presente invención es interruptora de hexoquinasas. Una interruptora de hexoquinasa, define una variante en la cual se elimina o reemplaza una parte o todo el gen nativo por un ADN cuya expresión no da como resultado un producto de expresión que tenga ninguna función de la hexoquinasa nativa.
En una forma de realización alternativa de la interruptora, la expresión de hexoquinasa se puede subregular mediante el uso de una construcción antisentido en donde parte o toda la cadena antisentido que codifica la hexoquinasa se expresa bajo la regulación de un promotor que responde a una disminución del oxigeno. En esta forma de realización, el ARNm antisentido para la hexoquinasa se expresa bajo condiciones limitantes de oxigeno y de esa manera inactiva a la hexoquinasa funcional.
En otra forma de realización alternativa de interruptora, la región promotora de la hexoquinasa funcional es reemplazada por un promotor que responde a una disminución de oxigeno por subregulación de la expresión del gen de hexoquinasa.
Una levadura "de tipo salvaje", se refiere a una cepa de levadura termentadora de pentosas con niveles normales de hexoquinasas funcionales de la cual deriva la célula de levadura de la presente invención. En determinados casos, la "levadura de tipo salvaje" definida en esta solicitud de patente, puede incluir levadura mutagenizada . Por ejemplo, la cepa DS62504 de Saccharomyces cerevisiae, a partir de la cual se desarrollaron IMW017, IMW018, IMK306, IMK307 e IMK318, es ella misma una cepa de levadura mutada. Sin embargo, DS62504 también es una levadura de tipo salvaje, definida en la presente, porque es una levadura fermentadora de pentosas con niveles normales de hexoquinasas funcionales que se usó para desarrollar una célula de levadura de la presente invención.
En la presente, la hexoquinasa (hxk) es cualquier enzima capaz de fosforilar un azúcar de seis carbonos, una hexosa, en un fosfato de hexosa. En la mayoría de los tejidos y organismos, la glucosa es el sustrato más importante de las hexoquinasas, y glucosa-6-fosfato es el producto más importante.
Se han encontrado hexoquinasas en la mayoría de los organismos evaluados, comprendiendo un rango que abarca desde bacterias, levaduras y plantas hasta seres humanos y otros vertebrados. Se clasifican como proteínas de plegamiento de actina, que comparten un núcleo de un sitio de unión a ATP común rodeado por secuencias más variables que determinan las afinidades de sustrato y otras propiedades. En una sola especie puede haber diversas isoformas o isozimas de hexoquinasas que proporcionan diferentes funciones.
Reacción de la hexoquinasa: Las reacciones intracelulares mediadas por hexoquinasas se pueden tipificar de la siguiente manera: Hexosa + ATP -> Hexosa-P + ADP La célula de levadura De acuerdo con la invención, la interrupción de la actividad hexoquinasa nativa conduce a menores tiempos de fermentación en una fermentación de C5/C6 y/o al co-consumo por la célula de levadura de pentosas y glucosa.
Se obtuvieron las células de levadura resultantes denominadas IMW017, IMW018, IMK306, IMK307 y/o IMK318, y fueron caracterizadas como se describe con mayor detalle más adelante. Se anticipa que una célula de levadura de S. cerevisiae caracterizada por una expresión reducida del gen de hexoquinasa funcional y se puede obtener un rendimiento general incrementado de etanol por otros medios que la eliminación del gen de hexoquinasa mediante un paso de integración especifica del sitio usando un cásete de interrupción. Por ejemplo, se podría obtener una variante que carece de una hexoquinasa funcional, o que expresa hexoquinasa a un nivel reducido, mediante cualquiera de los diversos medios conocidos en el arte, tal como exposición de las células de levadura a agentes de intercalado de ADN o irradiación de células de levadura con luz ultravioleta. Es probable que las células deficientes en hexoquinasas podría distinguirse de las células de tipo salvaje sobre la base del tamaño de colonias y otros patrones morfológicos (es decir, tamaño pequeño, colonias amarillas de aspecto rugoso) . El estado de hexoquinasas de colonias deficientes en hexoquinasas putativas presuntamente identificadas sobre la base de este fenotipo único podría confirmarse, por ejemplo, por la incapacidad para crecer sobre un medio que contiene glucosa como única fuente de carbono o mediante determinaciones de la actividad hexoquinasa.
La célula de levadura típicamente contiene genes de una vía metabólica de pentosas no nativa para la levadura y/o que permitan que la célula de levadura convierta una o más pentosas. En una forma de realización, la célula de levadura puede comprender una o dos o más copias de una o más xilosa isomerasas y/o una o dos o más copias de uno o más genes de xilosa reductasas y xilitol deshidrogenasas, permitiendo que la célula de levadura convierta xilosa. En una forma de realización de la misma, estos genes se pueden integrar en el genoma de la célula de levadura. En otra forma de realización, la célula de levadura comprende a los genes araA, araB y araD. Luego puede fermentar arabinosa. En una forma de realización de la invención, la célula de levadura comprende al gen xylA, al gen XYL1 y al gen XYL2 y/o al gen XKS1, para permitir que la célula de . levadura fermente xilosa; la supresión del gen de aldosa reductasa (GRE3) ; sobreexpresión de los genes PPP, TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, para permitir el incremento del flujo a través de la vía de pentosa fosfatos en la célula, y/o la sobreexpresión de GAL2 y/o la supresión de GAL80. Así, mediante la inclusión de los genes anteriores, se pueden introducir vías metabólicas de pentosas u otras vías metabólicas adecuadas en la célula de levadura, que no eran nativas en la célula de levadura (tipo salvaje) .
En una forma de realización, la célula de levadura deriva de una levadura industrial, por interrupción de hexoquinasas . Una célula de uso industrial y una célula de levadura industrial se pueden definir de la siguiente manera. Los ambientes vivientes de las células (de levadura) en los proceso industriales son significativamente diferentes de los de laboratorio. Las células de levadura industriales deben poder desempeñarse bien bajo múltiples condiciones ambientales que pueden variar durante el proceso. Dichas variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxigeno, etc., que juntos tienen un impacto potencial sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. Bajo condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al entorno deberían permitir un crecimiento y producción robustos. Las cepas de levadura industriales por lo general son más robustas frente a estos cambios de las condiciones ambientales que pueden existir en las aplicaciones en las cuales se usan, tal como en la industria de la panadería, la industria cervecera, la industria de los vinos y la industria del etanol. En una forma de realización, la célula de levadura industrial se construye en base a una célula huésped industrial, en donde la construcción se lleva a cabo como se describe más adelante en la presente. Los ejemplos de levaduras industriales (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand) .
En una forma de realización, la célula de levadura es tolerante a inhibidores. La tolerancia a inhibidores es la resistencia a compuestos inhibidores. La presencia y el nivel de los compuestos inhibidores en la lignocelulosa pueden variar ampliamente con la variación de la materia prima, el método de pretratamiento y el proceso de hidrólisis. Los ejemplos de categorías de inhibidores son ácidos carboxílicos, furanos y/o compuestos fenólicos. Los ejemplos de ácidos carboxílicos son ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico. Los ejemplos de furanos son furfural e hidroximetilfurfural . Los ejemplos de compuestos fenólicos son vanilina, ácido siríngico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Las cantidades típicas de inhibidores para ácidos carboxílicos comprenden: varios gramos por litro, hasta 20 gramos por litro o más, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis. Para furanos: varios cientos de miligramos por litro hasta varios gramos por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.
Para fenólicos: varias decenas de miligramos por litro, hasta un gramo por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.
Las células de levadura de acuerdo con la invención preferentemente son tolerantes a inhibidores, o sea las mismas puede resistir los inhibidores comunes al nivel en que típicamente se encuentran bajo las condiciones comunes de pretratamiento y de hidrólisis, de modo que las células de levadura pueden encontrar un amplio rango de aplicaciones, o sea las mismas tienen una gran aplicabilidad para diferentes materias primas, diferentes métodos de pretratamiento y diferentes condiciones de hidrólisis.
En una forma de realización, la célula de levadura industrial se construye en base a una célula huésped tolerante a inhibidores, en donde la construcción se lleva a cabo como se describe más adelante en la presente. Las células huésped tolerantes a inhibidores se pueden elegir mediante selección de cepas según su crecimiento sobre materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al, Appl . Biochem. Biotechnol., (2007), Volumen 136-140, 847-858, en donde se eligió la cepa tolerante a inhibidores ATCC 26602 de S. cerevisiae.
En una forma de realización, la célula de levadura está libre de marcadores. Según se utiliza en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o fenotipo que permite la selección, o el examen, de una célula huésped que contiene al marcador. Libre de marcador significa que los marcadores están esencialmente ausentes en la célula de levadura. Estar libre de marcadores es particularmente ventajoso cuando se han usado marcadores antibióticos en la construcción de la célula de levadura transformada y luego se los ha eliminado. La eliminación de los marcadores se puede efectuar usando cualquier técnica apropiada del arte previo, por ejemplo, recombinación intramolecular. Un método apropiado para la eliminación de marcadores se ilustra en los ejemplos.
La célula de levadura puede comprender además las actividades enzimáticas necesarias para convertir piruvato en el producto de fermentación deseado, tal como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico ß lactámico o una cefalosporina .
En una forma de realización, la célula de levadura es una célula que naturalmente puede realizar una fermentación alcohólica, preferentemente, una fermentación alcohólica anaeróbica. Una célula de levadura tiene preferentemente una gran tolerancia al etanol, una gran tolerancia a valores de pH bajos (o sea, puede crecer en un pH menor que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 o aproximadamente 2,5) y a orgánicos y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.
Cualquiera de las características o actividades anteriores de una célula de levadura puede estar presente en forma natural en la célula o se puede introducir o modificar por modificación genética.
CONSTRUCCIÓN DE LA CÉLULA DE LEVADURA De acuerdo con una forma de realización, los genes se pueden introducir en la célula de levadura mediante introducción en una célula huésped de: a) una agrupación que consiste de los genes PPP TAL1, TKL1 , RPE1 y RKI1, opcionalmente bajo el control de un promotor constitutivo fuerte; b) una agrupación que consiste de un gen xylA bajo el control de un promotor constitutivo fuerte; c) una agrupación que comprende un gen XKS1 bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, d) una agrupación que consiste de los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte e) supresión de un gen de aldosa reductasa f) interrupción de uno o más genes de hexoquinasa nativos en la levadura; g) ingeniería evolutiva de la cepa resultante de a) a e) ; y opcionalmente h) introducción de uno o más genes de hexoquinasas exógenas en la célula resultante de la ingeniería evolutiva para producir la célula de levadura.
La célula anterior se puede construir usando técnicas de expresión recombinante conocidas.
EXPRESIÓN RECOMBINANTE La célula de levadura es una célula recombinante. Es decir, una célula de levadura comprende o está genéticamente modificada con una secuencia de nucleótidos que no existe de manera natural en la célula de interés.
Las técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, así como también para las modificaciones genéticas adicionales de una célula de levadura son bien conocidas por los especialistas en el arte. Típicamente dichas técnicas comprenden la transformación de una célula con construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia relevante. Dichos métodos se conocen, por ejemplo, de textos estándar tales como Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 3ra edición) , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al., eds . , "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987) . Los métodos de transformación y modificación genética de células huésped fúngicas son conocidos, por ejemplo, de EP-A- 0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186.
IDENTIDAD DE SECUENCIA Se considera que las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son homologas cuando exhiben un determinado nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo común. El hecho de si dos secuencias homologas están estrechamente relacionadas o más lejanamente relacionadas, está indicado por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque discutido, con frecuencia se usan indistintamente los términos "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", "nivel de homología" o "porcentaje de homología".
Los términos "homología", "homología porcentual", "identidad porcentual" o "similitud porcentual" se utilizan aquí como sinónimos. A los efectos de esta invención, se define aquí que con el fin de determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias completas para una comparación óptima. Con el fin de optimizar la alineación entre las dos secuencias, se pueden introducir huecos o faltas de coincidencia en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Dicha alineación se lleva a cabo sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Como alternativa, la alineación se puede llevar a cabo sobre una longitud más corta, por ejemplo sobre aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/bases o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada informada.
Se puede realizar una comparación de secuencias y determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias usando un algoritmo matemático. El especialista sabe que existen diversos programas de computación diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of squence comparison, en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, páginas 1-44, Addison esley) . El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para la alineación de dos secuencias. (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo permite alinear secuencias de aminoácidos, así como también secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa de computadora NEEDLE. En esta invención se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A., Trends in Genetics, 16, (6) páginas 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para las secuencias de proteínas, se usó EBLOSUM62 como matriz de sustitución. Para las secuencias de nucleótidos, se usó EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros opcionales usado para la alineación de secuencias de aminoácidos comprenden una penalidad por apertura de faltas de coincidencia o hueco de 10 y una penalidad por extensión de faltas de coincidencia o hueco de 0,5. El especialista podrá apreciar que todos estos diferentes parámetros darán resultados levemente diferentes pero que la identidad porcentual global de dos secuencias no cambia significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.
DEFINICIÓN DE HOMOLOGÍA GLOBAL La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de la región alineada total que incluye cualquier falta de coincidencia o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula de la siguiente manera: número de las correspondientes posiciones en la alineación muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación, incluyendo las faltas de coincidencia o huecos. La identidad, según se define en la presente, se puede obtener con NEEDLE y se señala a la salida del programa como "IDENTITY [IDENTIDAD] ".
DEFINICIÓN DE IDENTIDAD MÁS LARGA La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: número de posiciones correspondientes en la alineación que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación después de sustraer el número total de faltas de coincidencia en la alineación. La identidad según se define en la presente, se puede obtener con NEEDLE utilizando la opción NOBRIEF y se señala a la salida del programa como "identidad más larga". A los efectos de la invención, el nivel de identidad (homología) entre dos secuencias (aminoácidos o nucleótidos) se calcula de acuerdo con la definición de "identidad más larga" que se puede efectuar usando el programa NEEDLE.
Las secuencias de proteínas usadas en la presente invención se pueden usar además como una "secuencia de consulta" para efectuar una búsqueda contra bases de datos de secuencias, por ejemplo para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden efectuar usando los programas BLAST. El software para conducir análisis BLAST se encuentra disponible al público en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Se usa BLASTP para secuencias de aminoácidos y BLASTN para secuencias de nucleótidos. El programa BLAST emplea los siguientes valores predeterminados: -Costo de apertura de hueco: valor predeterminado = 5 para nucleótidos/ 11 para proteínas -Costo de extensión de hueco: valor predeterminado = 2 para nucleótidos/ 1 para proteínas -Penalidad por falta de coincidencia de nucleótidos: valor predeterminado = -3 -Recompensa por coincidencia de nucleótidos: predeterminado = 1 -Valor esperado: predeterminado = 10 -Tamaño de palabra: predeterminado = 11 para nucleótidos/ 28 para megablast/ 3 para proteínas Además, se determina el grado de identidad local (homología) entre la secuencia de aminoácidos de consulta o la secuencia de ácido nucleico de consulta y las secuencias homologas recuperadas utilizando el programa BLAST. Sin embargo, solamente se comparan aquellos segmentos de secuencia que dan una coincidencia por encima de un determinado umbral. Por consiguiente, el programa solamente calcula la identidad para estos segmentos coincidentes. Por ello, la identidad calculada de esta manera se denomina identidad local.
PRODUCCIÓN DE BIOPRODUCTOS A lo largo de los años se ha sugerido introducir diferentes organismos para la producción de bioetanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de bioproduccion de etanol han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productores de etanol. Esto se debe a las numerosas características atractivas de las especies de Saccharomyces para los procesos industriales, o sea, una gran capacidad de crecimiento anaeróbico con tolerancia a ácido, etanol y osmolaridad, y por supuesto, su gran capacidad termentadora de alcoholes. Las especies de levaduras preferidas como células huésped incluyen S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus o K fragilis .
Una célula de levadura puede ser una célula adecuada para la producción de etanol. Sin embargo, una célula de levadura puede ser adecuada para la producción de productos de fermentación distintos de etanol Dichos productos de fermentación no etanolicos incluyen, en principio, cualquier sustancia química a granel o refinada que se pueda producir mediante un microorganismo eucariota, tal como una levadura o un hongo filamentoso.
Una célula de levadura que se puede utilizar para la producción de productos de fermentación no etanolicos es una célula de levadura que contiene una modificación genética que resulta en una menor actividad alcohol deshidrogenasa .
LIGNOCELULOSA La lignocelulosa, que se puede considerar como una materia prima potencialmente renovable, por lo general comprende los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xyloglucanos ) . Además, parte de la hemicelulosa puede estar presente como glucomananos , por ejemplo en materias primas que derivan de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles, incluyendo tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, rhamnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas tiene lugar bajo la acción de diferentes enzimas que actúan conjuntamente.
Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos, pueden representar una proporción considerable de la masa seca de las paredes celulares típicas de tejidos vegetales distintos de la madera (aproximadamente entre un cuarto y la mitad de la masa seca puede comprender pectinas) .
PRETRATAMIENTO Antes del tratamiento enzimático, se puede pretratar el material lignocelulósico . El pretratamiento puede comprender la exposición del material lignocelulósico a un ácido, una base, un solvente, calor, un peróxido, ozono, ruptura mecánica, afinado, molienda o despresurización rápida, o una combinación de dos o más cualquiera de los mismos. Este pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento con calor, por ejemplo entre 150 y 220°C entre 1 y 30 minutos.
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA El material pretratado comúnmente es sometido a hidrólisis enzimática para liberar azúcares que se pueden fermentar de acuerdo con la invención. Esto se puede realizar utilizando métodos convencionales, como por ejemplo contacto con celulasas, como celobiohidrolasa (s) , endoglucanasa (s) , beta-glucosidasa (s) y opcionalmente otras enzimas. La conversión con las celulasas se puede efectuar a temperaturas ambiente o a tempaturas mayores, con un tiempo de reacción para liberar suficientes cantidads de uno o más azúcares. El resultado de la hidrólisis enzimática es un producto de hidrólisis que comprende azúcares C5/C6, en la presente conocida como la composición de azúcares.
COMPOSICIÓN DE AZÚCARES La composición de azúcares usada de acuerdo con la invención comprende glucosa y una o más pentosas, por ejemplo arabinosa y/o xilosa. Se puede usar cualquier composición de azúcares en la invención que cumpla con esos criterios. Los azúcares opcionales para la composición de azúcares son galactosa y mañosa. En una forma de realización preferida, la composición de azúcares es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos . En la presente, la lignocelulosa incluye hemicelulosa y partes de hemicelulosa de una biomasa. La lignocelulosa incluye además fracciones lignocelulósicas de biomasa. Se pueden encontrar materiales lignocelulósicos apropiados en el siguiente listado: iniciadores de huerta, chaparrales, desechos de molino, desechos de madera urbanos, desechos municipales, desechos de podas, materiales de poda de bosques, cultivos de arbolados de rotación corta, desechos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscara de soja, cáscara de arroz, paja de arroz, alimento de gluten de trigo, cáscara de avena, azúcar de caña, residuos de maíz, cañas de maíz, mazorcas de maíz, vainas de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de cañóla, tallos de soja, pasto de pradera, pasto gama, cola de zorro; pulpa de remolacha dulce, pulpa de frutas cítricas, 'cáscara de semillas, desechos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, vainas de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de molienda de granos secos o húmedos, desechos sólidos municipales, papel de desecho, desechos de patio, materiales herbáceos, residuos agrícolas, residuos forestales, desechos sólidos municipales, desechos de papel, pulpa, residuos de molienda de papel, ramas, arbustos, cañas, vainas de maíz, un cultivo energético, bosque, frutos, flores, granos, hierbas, cultivos herbáceos, hojas, cortezas, espinas, troncos, raíces, árboles jóvenes, árboles achaparrados, pasto varilla, árboles, verduras, piel de frutos, vides, pulpa de remolacha dulce, cascarillas de trigo, cáscara de avena, madera dura o blanda, material de desecho orgánico generado en un proceso industrial, desechos de madera de silvicultura o una combinación de dos o más cualesquiera de los mismos.
En la Tabla 1 se muestra un resumen de algunas composiciones de azúcares apropiadas que derivan de lignocelulosa y la composición de azúcares de sus hidrolizados . Las lignocelulosas enumeradas incluyen: mazorcas de maíz, fibras de maíz, cáscara de arroz, cáscara de melón, pulpa de remolacha dulce, paja de trigo, residuos de prensado de caña de azúcar, madera, hierbas y residuos de prensado de olivas.
Tabla 1: Resumen de composiciones de azúcares de materiales lignocelulósicos . Gal = galactosa, Xyl = xilosa, Ara = arabinosa, Man = mañosa, Glu = glutamato, Rham = rhamnosa. Se indica el porcentaje de galactosa (% de Gal) y la fuente de referencia. lignocelulosas hay una gran cantidad de azúcares en la forma de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa. La conversión de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa a productos de fermentación es entonces de una gran importancia económica. También hay mañosa en algunos de los materiales de lignocelulosa aunque habitualmente en cantidades menores que los azucares que se mencionaron previamente. Por ello, ventajosamente la mañosa también es convertida por la célula de levadura.
Se espera que las células de levadura de la presente invención se puedan manipular para obtener otras características deseables, o aún mayor rendimientos globales de etanol.
La selección de células de levadura mejoradas mediante pasajes de las células de levadura sobre un medio que contiene al hidrolizado ha dado como resultado una levadura mejorada con índices de fermentación mejorados. Usando las enseñanzas de la presente invención, se podría obtener fácilmente tales cepas mejoradas.
Un material que contiene pentosas, se refiere a cualquier medio que comprenda pentosas, ya sea líquido o sólido. Los materiales que contienen pentosas adecuados incluyen hidrolizados de polisacáridos o biomasa lignocelulósica, tales como cascarilla de maíz, madera, papel, productos secundarios de la agricultura y semejantes.
Un "hidrolizado" según se usa en la presente, se refiere a un polisacárido que fue despolimerizado por la adición de agua para formar azúcares mono y oligosacáridos . Los hidrolizados se pueden producir mediante hidrólisis enzimática o ácida del material que contiene polisacáridos.
Preferentemente, la célula de levadura puede crecer bajo condiciones similares a las observadas en las fuentes industriales de pentosas. El método de la presente invención seria más económico cuando en el material que contiene pentosas se puede inocular la variante de levadura sin una manipulación excesiva. A modo de ejemplo, la industria de elaboración de pulpa de papel genera grandes cantidades de desechos celulósicos. La sacarificación de la celulosa por hidrólisis ácida permite obtener hexosas y pentosas que se pueden usar en las reacciones de fermentación. Sin embargo, el hidrolizado o licor de sulfito contiene grandes concentraciones de inhibidores fenólicos y de sulfito naturalmente presentes en la madera que inhiben o previenen el crecimiento de la mayoría de los organismos. Más adelante en los ejemplos se describe la fermentación de pentosas en hidrolizados ácidos (o licor de desecho de sulfito) de maderas duras y de maderas blandas por las células de levadura de la presente invención. Se espera razonablemente que las cepas de levadura capaces de crecer en el licor de desechos de sulfito podrían crecer en prácticamente cualquier otro hidrolizado de biomasa.
FERMENTACIÓN El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxigeno o en donde sustancialmente no se consume oxigeno, o preferentemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h, más preferentemente 0 mmol/l/h (o sea el consumo de oxigeno no es detectable) , y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptoras de electrones. En ausencia de oxigeno, el NADH que se produce en la glicólisis y la formación de biomasa, no se puede oxidar mediante una fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno, regenerando asi NAD+.
Por lo tanto, en un proceso de fermentación anaeróbico preferido se usa piruvato como aceptor de electrones (e hidrógeno) y se reduce en productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido mélico, ácido fumárico, un aminoácido y etileno.
El proceso de fermentación se corre preferentemente a una temperatura que es óptima para la célula. Por lo tanto, para la mayoría de las células de levadura o de hongos, el proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura que es menor que aproximadamente 42°C, preferentemente menor que 38°C aproximadamente. Para las células huésped de levaduras o de hongos filamentosos, el proceso de fermentación se lleva a cabo preferentemente a una temperatura que es menor que aproximadamente 35, aproximadamente 33, aproximadamente 30 o aproximadamente 28°C y a una temperatura que es mayor que aproximadamente 20, aproximadamente 22 o aproximadamente 25°C.
El rendimiento de etanol sobre xilosa y/o glucosa en el proceso preferentemente es de al menos aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95 o aproximadamente 98%. El rendimiento de etanol se define en la presente como un porcentaje del rendimiento teórico máximo.
La invención también se relaciona con un proceso para producir un producto de fermentación.
El proceso de fermentación de acuerdo con la presente invención se puede correr bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. En una forma de realización, el proceso se lleva a cabo bajo condiciones microaerófilas o limitadas en oxigeno .
Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxigeno o en el que sustancialmente no se consume oxigeno, preferentemente menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h, y en donde las moléculas orgánicas sirven como donantes y como aceptoras de electrones.
Un proceso de fermentación limitado en oxigeno es un proceso en donde el consumo de oxigeno está limitado por la transferencia de oxigeno desde el gas hacia el liquido. El grado de limitación de oxigeno está determinado por la cantidad y la composición del gas entrante asi como también por las propiedades de transferencia de masa/mezclado del equipo de fermentación usado. Preferentemente, en un proceso bajo condiciones limitadas de oxigeno, el índice de consumo de oxígeno es de al menos aproximadamente 5,5, más preferentemente al menos aproximadamente 6, tal como al menos 7 mmol/l/h. Un proceso de la invención puede comprender la recuperación del producto de fermentación.
En un proceso preferido, la célula fermenta tanto xilosa como glucosa, preferentemente en forma simultánea en cuyo caso preferentemente se usa una célula que no sea sensible a la represión por glucosa para prevenir el crecimiento diáuxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además el ingrediente apropiado requerido para el crecimiento de la célula. Las composiciones de medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras, son bien conocidas en el arte.
Los procesos de fermentación se pueden llevar a cabo en un modo por lotes, por lotes alimentado o continuo. También se puede aplicar un proceso de hidrólisis y fermentación (SHF) separados o un proceso de sacarificación y fermentación (SSF) simultáneos. Es posible asimismo una combinación de estos modos de procesos de fermentación para una óptima productividad. Estos procesos se describirán con mayor detalle más adelante.
MODO SSF Para el modo de Sacarificación y Fermentación Simultáneos (SSF) , el tiempo de reacción para el paso de licuefacción/hidrólisis o presacarificación es dependiente del tiempo para lograr un rendimiento deseado, o sea el rendimiento de conversión de celulosa y glucosa. Preferentemente, dicho rendimiento es tan alto como sea posible, preferentemente 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, 99% o más, aun 99,5% o más o 99,9% o más .
De acuerdo con la invención se logran concentraciones muy altas de azúcares con el modo SHF y concentraciones muy altas de producto (por ejemplo etanol) con el modo SSF. En la operación por SHF la concentración de glucosa es de 25g/l o más, 30 g/1 o más, 35g/l o más, 40 g/1 o más, 45 g/1 o más, 50 g/1 o más, 55 g/1 o más, 60 g/1 o más, 65 g/1 o más, 70 g/1 o más , 75 g/1 o más, 80 g/1 o más, 85 g/1 o más, 90 g/1 o más, 95 g/1 o más, 100 g/1 o más, 110 g/1 o más, 120 g/1 o más e puede ser por ejemplo entre 25g/l y 250 g/1, entre 30gl/L y 200 g/1, entre 40 g/1 y 200 g/1, entre 50 g/1 y 200 g/1, entre 60 g/1 y 200 g/1, entre 70 g/1 y 200 g/1, entre 80 g/1 y 200 g/1, 90 g/1 , entre 80 g/1 y 200 g/1.
CONCENTRACIÓN DE PRODUCTO EN EL MODO SSF En la operación por SSF, la concentración de producto (g/1) depende de la cantidad de glucosa producida, pero esto no es visible debido a que los azúcares son convertidos en producto en el SSF, y las concentraciones de productos se pueden relacionar con la concentración subyacente de glucosa por multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps máximo en gramos de producto por gramo de glucosa) El rendimiento máximo teórico (Yps máximo en gramos de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación se puede consultar en los textos de bioquímica. Para el etanol, 1 mol de glucosa (180 gramos) rinde de acuerdo con la vía normal de fermentación por glucólisis en levaduras, 2 moles de etanol (= 2 x 46 = 92 gramos de etanol. El rendimiento máximo teórico de etanol en glucosa es por lo tanto de 92/180 = 0,511 gramos de etanol/gramos de glucosa.
Para el butanol ( W 74 gramos/mol) o isobutanol, el rendimiento teórico máximo es de 1 mol de butanol por mol de glucosa. Por lo tanto, el Yps máximo para (iso-) butanol = 74/180 = 0,411 gramos de ( iso- ) butanol/gramos de glucosa.
Para el ácido láctico, el rendimiento de fermentación para una fermentación homoláctica es de 2 moles de ácido láctico (MW = 90 gramos/mol) por mol de glucosa. De acuerdo con esta estequiometria, el Yps máximo = 1 gramo de ácido láctico/gramo de glucosa.
Se puede hacer un cálculo similar para otros productos de fermentación.
MODO SSF En la operación por SSF la concentración de producto es de 25 g* Yps g/1 o más, 30 * Yps g/1 o más, 35 g* Yps /L o más, 40 * Yps g/1 o más, 45 * Yps g/1 o más, 50 * Yps g/1 o más, 55 * Yps g/1 o más, 60 * Yps g/1 o más, 65 * Yps g/1 o más, 70 * Yps g/1 o más , 75 * Yps g/1 o más, 80 * Yps g/1 o más, 85 * Yps g/1 o más, 90 * Yps g/1 o más, 95 * Yps g/1 o más, 100 * Yps g/1 o más, 110 * Yps g/1 o más, 120 g/1 * Yps o más o puede ser por ejemplo entre 25 * Yps g/1 y 250 * Yps g/1, entre 30 * Yps gl/L y 200 * Yps g/1, entre 40 * Yps g/1 y 200 * Yps g/1, entre 50 * Yps g/1 y 200 * Yps g/1, entre 60 * Yps g/1 y 200 * Yps g/1, entre 70 * Yps g/1 y 200 * Yps g/1, entre 80 * Yps g/1 y 200 * Yps g/1, 90 * Yps g/1 , entre 80 * Yps g/1 y 200 * Yps g/1 Por consiguiente, la invención provee un método para la preparación de un producto de fermentación, en donde el método comprende: a. degragadar lignocelulosa usando un método descrito en la presente; y b. fermentar el material resultante, para asi preparar un producto de fermentación.
PRODUCTO DE FERMENTACIÓN El producto de fermentación de la invención puede ser cualquier producto útil. En una forma de realización, el mismo es un producto que se selecciona del grupo que consiste de etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido fumárico, ácido mélico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina y ácido aspártico, 1 , 3-propan-diol , etileno, glicerol, un antibiótico ß-lactámico y una cefalosporina, vitaminas, fármacos, suplementos para alimentos para anímale, especialidades químicas, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, incluyendo biocombustibles y biogas o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidoreductasa , una transferasa o una xilanasa .
RECUPERACIÓN DEL PRODUCTO DE FERMENTACIÓN En la recuperación del producto de fermentación se usan las tecnologías existentes. Para los diferentes productos de fermentación son apropiados diferentes procesos de recuperación. Los métodos existentes para recuperar etanol a partir de mezclas acuosas comúnmente emplean técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, aún se puede usar una cerveza para procesar un producto fermentado, que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla enriquecida que contiene etanol que luego se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas) . Luego, las fracciones que contienen las mayores concentraciones de etanol se pueden hacer pasar a través de un absorbente para eliminar la mayoría, sino toda, el agua remanente del etanol.
Los siguientes ejemplos no limitativos se ofrecen a modo meramente ilustrativo.
EJEMPLOS Cepas y mantenimiento .
Para el almacenamiento de las cepas usadas en este estudio (Tabla 1) , se condujeron cultivos en frascos de agitación en un medio complejo (YP) , que consiste de 10 g l"1 de extracto de levadura (BD Difco) y 20 g l"1 de peptona (BD Difco) , suplementado con ya sea 2% de glucosa (YPD) , 2% de etanol + 1,5% de glicerol ( YP-EtOH/Glyc) o 2% de arabinosa (YP-Ara) . Los cultivos se incubaron a 30°C en un agitador orbital (200 rpm) hasta la fase de crecimiento estacionario. Después de la adición de 30% (v/v) de glicerol, las muestras de los cultivos en frascos de agitación se guardaron en como alícuotas de 2 mi a -80°C.
Cultivo en frascos de agitación .
El cultivo en frascos de agitación se efectuó a 30°C en un medio sintético que contiene 2,3 g l-1 de urea, 6,6 g l"1 de K2S0,, 3 g l"1 de KH2P04, 0,5 g l"1 de MgSO„.7H20, y elementos traza (MYurea) [7] . Para el cultivo en frasco de agitación, el pH del se ajustó en 4,7 con KOH 2 M antes de la esterilización. Después de la esterilización con calor (121°C, 20 min) , se agregó una solución de vitaminas esterilizada por filtración [7] y azúcares. Los cultivos en frascos de agitación se prepararon por inoculación de 100 mi de medio que contiene al azúcar apropiado en un frasco de agitación de 500 mi con un cultivo madre congelado y se incubaron a 30°C en un agitador orbital (200 rpm) .
Cultivo por lotes anaeróbico .
El cultivo por lotes anaeróbico se llevó a cabo a 30 °C en termentadores de 2 litros (Applikon, Schiedam, Países Bajos) con un volumen de trabajo de 1 1. Los cultivos se condujeron en medio sintético que contiene 5 g l"1 de (NH4)2S04, 3 g l-1 de KH2P04, 0,5 g l"1 de MgS04.7H20 y elementos traza [7]. Después de la esterilización con calor (121°C, 20 min) el medio fue suplementado con 0,01 g 1_1 de ergosterol y 0,42 g l"1 de Tween 80 disuelto en etanol [1,2], antiespumante siliconado, elementos traza, solución de vitaminas esterilizada por filtración [7] y la fuente de carbono apropiada. Los cultivos se agitaron a 800 rpm y se burbujearon 0,5 1 min-1 de nitrógeno gaseoso (<10 ppm de oxigeno) y se mantuvieron a pH 5,0 por adición automática de KOH 2 M. Para minimizar la difusión de oxigeno, los termentadores fueron equipados con tubos de Norprene (Colé Palmer Instrument Company, Vernon Hills, EE.UU.). La ausencia de oxigeno se verificó con un electrodo de oxigeno (Applisens, Schiedam, Países Bajos) . Los cultivos por lotes se iniciaron por inoculación con un cultivo en frasco de agitación con glucosa de 100 mi.
Determinación de la velocidad de crecimiento .
Los perfiles de crecimiento para los cultivos en frascos de agitación se obtuvieron midiendo la densidad óptica a 660 nm (DO660) en el tiempo. Los índices de crecimiento específicos para cultivos anaeróbicos en termentadores se determinaron en base a las concentraciones de CO2 en el gas de escape. Los índices de crecimiento específicos se determinaron ajustando los puntos de datos a una curva exponencial .
Análisis de dióxido de carbono y metabolitos extracelulares .
El gas de escape de los termentadores anaeróbicos se enfrió en un condensador (2 °C) y se secó con un secador Permapure tipo MD-110-48P-4 (Permapure, Toms River, EE.UU.). Las concentraciones de dióxido de carbono se determinaron con un analizador NGA 2000 (Rosemount Analytical, Orrville, EE.UU.). Las velocidades de flujo del gas de escape y los índices de producción específica de dióxido de carbono se determinaron como se describió con anterioridad [6,8].
La glucosa, la arabinosa, el acetato, el lactato, el succinato, el glicerol y el etanol se analizaron por HPLC usando un eguipo para HPLC Waters Alliance 2690 (Waters, Milford, EE.UU.) equipado con una columna BioRad HPX 87H (BioRad, Hercules, EE.UU.), un detector de índice de refracción Waters 2410 y un detector de UV Waters 2487. La columna se eluyó a 60 °C con 0,5 g l"1 de ácido sulfúrico a una velocidad de flujo de 0,6 mi min"1.
Determinación de la actividad hexoquinasa.
La actividad hexoquinasa en extractos celulares de las cepas usadas en este estudio se determina midiendo la conversión de glucosa en glucosa-6-fosfato (reacción 1) , usando una reacción enzimática acoplada (reacción 2) que convierte el glucosa-6-fosfato formado en 6-fosfogluconato por la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa . El índice de NADPH formado en esta reacción de acoplamiento es igual a la actividad hexoquinasa y se determina midiendo la absorbancia a 340 nm.
D-Glucosa + ATP D.ADP + D-Glucosa 6-fosfato (1) + D-Glucosa 6-fosfato + NADP ?. ß-fosfo gluconolactona + NADPH (2) Ejemplo 1 Supresión de genes .
En la presente' la supresión de genes se logró por medio de integración de un cásete de resistencia G418 que reemplaza al gen blanco. Para la supresión de HXK2, HXK1 y GLKl, se amplificó del cásete KanMX a partir del pUG6 por PCR [4], usando los oligonucleótidos indicados en la Tabla 2.
Tabla 2: Oligonucleótidos usados en este estudio para la construcción de supresión de genes y fines de diagnóstico relacionados. Se obtuvo un cásete de supresión del gen KanMX por PCR usando combinaciones de los oligonucleótidos DisA y DisB. Los genes se interrumpieron mediante recombinación homóloga entre el gen blanco y el cásete de supresión con el gen KanMX. Los sitios de recombinación están indicados por las regiones subrayadas en los oligonucleótidos . La supresión o interrupción se confirmó por PCR usando los cebadores de diagnóstico anA y KanB combinados con los cebadores de diagnóstico F y RV correspondientes con el gen blanco (por ejemplo, KanA combinado con HXK2-FW y KanB combinado con HXK2-RV) .
Después de la purificación de los productos de la PCR (conjunto de elementos GenElute PCR Clean-up, Sigma, Steinheim, Alemania) , se transformaron cultivos de toda la noche [3] con el cásete de interrupción de genes. Las células transformadas se seleccionaron sobre agar YPD que contiene 100 ug mi" de G418 (InvivoGen, San Diego, EE.UU.). La integración correcta del cásete KanMX se verificó por PCR en colonias individuales usando oligonucleótidos de diagnóstico que se unen al cásete KanMX y a las regiones 5' y 3' del gen blanco (Tabla 1) .
Para la supresión de múltiples genes, se rescató el marcador KanMX antes de la supresión del siguiente gen. Para ello, se transformaron células con pSH65, que expresan la Cre-recombinasa inducible y contienen al gen de resistencia a fleomicina bler [5] . Las células transformadas se dispersaron sobre placas YPD que contienen fleomicina y se incubaron a 30°C hasta que se observaron colonias. En el medio YP-galactosa liquido que contiene 7,5 pg/ml de fleomicina (InvivoGen, San Diego, EE.UU.) se inocularon diversas colonias resistentes a fleomicina, se incubaron durante la noche a 30°C para la inducción de Cre recombinasa y fueron transferidas a YPD con fleomicina sólido. La eliminación del cásete KanMX por la Cre-recombinasa se confirmó por plaqueado de réplicas de colonias de levadura resistentes a fleomicina sobre YPD y YPD-G418 y por PCR de diagnóstico en colonias individuales que habían perdido la resistencia a G418. A continuación, se logró la pérdida del pSH65 cultivando las células de manera no selectiva por 5-10 generaciones en YPD sin fleomicina, después de lo cual se confirmó la pérdida de resistencia a fleomicina por plaqueado de réplicas de colonias individuales sobre YPD sólido con y sin fleomicina. La subsiguiente supresión de HXK2, HXK1 y GLK1, y la eliminación del gen KanMX después de cada supresión, dio como resultado las cepas IMK306, IMK307, IMK311, IMK312 e ???318 (Tabla 3) .
Tabla 3: Cepas de S. cerevisiae construidas y usadas en la presente.
Efecto de la supresión de hxk2 y hxk2 hxkl sobre el consumo de glucosa y arabinosa.
Para determinar el efecto de la supresión de HXK2 y HXK1 sobre el consumo de glucosa y arabinosa, se cultivaron las cepas DS62504, IMK307 (hxk2¿\) e I K311/IMK312 (hxk2& hxklA) en frascos de agitación (Figura 1) y en fermentadores anaeróbicos ¦ (Figura 2) a 30°C en MY suplementado con una mezcla de 2% de arabinosa y 2% de glucosa.
Los cultivos en frascos de agitación se iniciaron a una DO660 inicial de aproximadamente 0,05 por inoculación con cultivos en frascos de agitación que se hicieron crecer en MY-glc. La cepa DS62504 (Figura 1) consumió glucosa dentro de las 21 horas y con la depleción de glucosa, comenzó el consumo de arabinosa. Ambos azúcares eran consumidos en un tiempo total de más de 50 horas. En el cultivo de la cepa IMK307 (Figura 1), glucosa era consumida totalmente en 25 horas y la arabinosa era eliminada en menos de 15 horas después de ello. La cepa IMK307 en general demostró al menos un 20% de reducción del tiempo total de fermentación en comparación con DS62504. La cepa IMK311 (Figura 1) consumió un 2% de la glucosa en el transcurso de 30 horas aproximadamente. Cuando aún quedaba aproximadamente 10 mM de glucosa en el cultivo, se observó consumo de arabinosa. La arabinosa se completaba dentro de las 48 horas. Aunque era más lenta que IMK307, el tiempo de fermentación general de IMK311 aún era menor que el de DS62504.
Los cultivos anaeróbicos (Figura 2) se iniciaron a una DO660 inicial de aproximadamente 1 por inoculación con cultivos en frascos de agitación que se hicieron crecer en MY-glc. Sobre la base del perfil de producción de C02 se pudo deducir que la cepa DS64205 consumió por completo la glucosa en menos de 15 horas. La velocidad de crecimiento específica durante el consumo de glucosa era de 0,29 h-1. Sin embargo, la arabinosa era consumida a una velocidad mucho menor. Después de 80 horas, aún hay un 90% aproximadamente de la arabinosa en el caldo de fermentación. El consumo de glucosa para la cepa IMK307 (hxk2 ) era más lento. Tanto el perfil de producción de C02 como las mediciones de glucosa indicaron que toda la glucosa se habla consumido en 20 horas. La velocidad de crecimiento especifica durante el consumo de glucosa era de 0,20 h"1. El consumo de arabinosa comenzó con la depleción de glucosa y el 92% de la arabinosa era consumido en 66 horas, lo cual constituye una clara mejora si se compara con la cepa DS62504. La supresión de HXK1 además de HXK2 (cepa IMK312) tenia un efecto severo sobre la velocidad de crecimiento especifica sobre glucosa. La velocidad de crecimiento de 0,05 h"1 para la cepa IMK312 era 75% menor que la velocidad de la cepa IMK307. La glucosa desaparecía en 46 horas. Dentro de estas 46 horas, era consumido aproximadamente un 10% del total de 132 mM de arabinosa. La arabinosa era consumida por completo en menos de 112 horas.
Ejemplo 2 Selección de IMK318 que crece sobre arabinosa en la presencia de glucosa Se confirmó mediante 450 horas de cultivo en frascos de agitación sobre glucosa que la cepa con supresión de hexoquinasa/glucoquinasa IMK318 (hxkl¿\ hxk2& glkl ) no puede crecer sobre glucosa solamente. Por ello la cepa se cultivó en YP-EtOH/Glyc y a continuación se guardó a -80 °C después de la adición de glicerol. Después, se cultivó IMK318 en 100 mi de MY que contiene 2% de arabinosa. Después de 3 días, a una DO660 de aproximadamente 1, se transfirieron 2 mi del cultivo a 100 mi de MY fresco que contiene 2% de arabinosa. Luego de aproximadamente 12 días la DO660 del cultivo era >5 y las muestras se guardaron a -80°C como soluciones madre de glicerol. La cepa IMK318 se cultivó a 30°C durante varios días en MY-ara. A una DO660 de aproximadamente 5, se transfirieron 2 mi del cultivo a 6 frascos de agitación separados que contienen 100 mi de MYurea suplementado con 2% de arabinosa y concentraciones variables de glucosa: 0, 0,11, 0,23, 0, 65, 1,3 y 2,5 (p/v) %. El crecimiento de estos 6 cultivos paralelos se registró con mediciones de DO660 (Figura 3) . Se observó que, en la presencia de glucosa, se demora el crecimiento. Una cantidad creciente de glucosa dio como resultado un crecimiento demorado cada vez mayor sobre arabinosa. Dos de estos cultivos paralelos (Línea A que comenzó con 0,65% p/v de glucosa; Línea B que comenzó con 2,5% p/v de glucosa) fueron transferidos en serie a 100 mi de MY suplementado con arabinosa y glucosa de acuerdo con los esquemas de transferencia que se muestran en la Tabla .
Tabla 4. Representación esquemática de cultivos en frascos de agitación transferidos en serie (SF) de la cepa IMK318 eri MYurea con las concentraciones de arabinosa (ara) glucosa (glc) indicadas. Las series transferidas A y finalmente dieron como resultado las formas aisladas colonias individuales IM 018 e I W017, respectivamente.
En la serie A, cuando los cultivos eran transferidos a un medio con concentraciones crecientes de glucosa (Tabla 3) , la arabinosa se consume por completo en tanto se consumía menos gue un 10% de la glucosa (Figura 4) . A partir de SF7, las muestras se dispersaron sobre YP-ara sólido suplementado con 100 ]iq mi"1 de G418 y se incubaron a 30°C hasta que se observaron colonias. Se transfirieron colonias separadas a YP-ara sólido. Las formas aisladas de colonias individuales se cultivaron en YP-ara y se guardaron a -80°C. Se evaluaron dos formas aisladas de colonias individuales de esta serie de transferidos en serie en frascos de agitación y se encontró que eran cualitativamente similares al cultivo mixto. Una de estas formas aisladas se denominó cepa IMW018.
En la serie B (Tabla 3) , los cultivos en frascos de agitación fueron transferidos a medio Y con concentraciones fijas de 2% de arabinosa y 2% de glucosa (Figura 5) . Sorprendentemente, se observó co-consumo de arabinosa y glucosa después de la primera transferencia (SF1 - SF2) . A partir de SF3, las muestras se dispersaron sobre YP-ara sólido suplementado con 100 g mi"1 de G418 y se incubaron a 30°C hasta que se observaron colonias. Se transfirieron colonias separadas a YP-ara sólido. Las formas aisladas de colonias individuales se cultivaron en YP-ara y se guardaron a -80 °C como soluciones madre de glicerol. Se evaluaron dos formas aisladas de colonias individuales de esta serie de transferidos en serie en frascos de agitación y se encontró que eran cualitativamente similares al cultivo mixto. Una de estas formas aisladas se denominó cepa IMW017.
Se evaluó el consumo de glucosa y arabinosa de ambas formas aisladas de colonias individuales de las cepas IMW017 e IMW018 en cultivos en frascos de agitación (Figuras 4 y 5) . Las formas aisladas de colonias individuales exhibieron perfiles de concentración de glucosa y arabinosa que eran similares a los cultivos en frascos de agitación transferidos en serie de los cuales eran originarios. Notablemente, los regímenes de concentración de glucosa aplicados en esta estrategia de ingeniería evolutiva basada en la cepa IMK318 (hxklA hxk2A glklñ) de supresión de hexoquinasa/glucoquinasa , dieron como resultado dos fenotipos diferentes: (i) consumo de arabinosa insensible a glucosa por la cepa IMW018 y (ii) co-consumo de arabinosa y glucosa por la cepa IMW017.
Ejemplo 3 Co-fermentación anaeróbica de arabinosa y glucosa La cepa IMW017 se cultivó anaeróbicamente en una mezcla de glucosa y arabinosa, usando un equipo de termentador por lotes sucesivos. Se aplicaron tres lotes consecutivos en la mezcla de glucosa/arabinosa (Figura 6) . En cada lote la glucosa y la arabinosa eran consumidas simultáneamente y fermentadas en etanol. Por lo que se dedujo a partir del perfil de producción de CO2, se observó que la velocidad de crecimiento especifica con la mezcla de glucosa/arabinosa aumentó de 0,05 h"1 en el primer lote a 0,07 h"1 en el tercer lote.
Durante otras fermentaciones por lotes consecutivas, la velocidad de crecimiento aumentó aún más. Una forma aislada de una cepa de colonia individual tomada del lote final, presenta co-consumo de glucosa y arabinosa a mayores índices de consumo específico en comparación con IMW017.
Ejemplo 4 Actividades hexoquinasa .
Se determinan las actividades hexoquinasa en los extractos celulares de las cepas DS62504, IMK307, IMK312, IMK318, IMW017 e IMW018. La actividad hexoquinása en los extractos celulares de IMK307 (hxk2 ) es menor que la actividad de la cepa DS62504. La actividad hexoquinása de IMK312 {hxk2A hxklñ) es menor que la de I K307, en tanto IMK318 (hxk2ñ hxklñ glklñ) no presenta actividad o presenta la actividad hexoquinása más baja. Las actividades hexoquinása en la cepa IMW018 son similares a las actividades hexoquinása observadas para IMK318, en tanto IMW017 tiene actividades hexoquinása mayores que I K318.
Ejemplo 5 Identificación de una hexoquinása desconocida en IMW017 Se espera que otro gen con el potencial de codificar una azúcar quinasa presente en el genoma se haya activado o que haya cambiado su especificidad de sustrato por glucosa basado en la actividad hexoquinása medida en las cepas hxkl hxk2 glkl desarrolladas. El gen que codifica esta actividad se identifica mediante análisis genómico. Una supresión adicional de este gen da como resultado una disminución de la actividad hexoquinása. Esta cepa cuádruple noqueada provee una plataforma aún más fuerte para la ingeniería evolutiva del consumo de arabinosa en la presencia de glucosa.
Ejemplo 6 Re-introducción de actividad hexoquinása o glucoquinasa en I K318 Para restablecer el crecimiento sobre glucosa, se vuelve a introducir HXK1 , HXK2 o GLK1 en IMK318. Las mediciones de la actividad muestran que la reintroducción de uno de estos genes en IMK318 da como resultado una mayor actividad hexo/glucoquinasa . Se restablece el crecimiento sobre glucosa como única fuente de carbono.
Ejemplo 7 Re-introducción de actividad hexoquinasa o glucoquinasa en IM 018 Las mediciones de la actividad muestran que la reintroducción de ya sea HXK1 , HXK2 o GLK1 en IMW018 da como resultado una mayor actividad hexo/glucoquinasa en comparación con la cepa IMW018. Se restablece el crecimiento sobre glucosa como única fuente de carbono. La reintroducción de ya sea HXK1 , HXK2 o GLK1 da como resultado el crecimiento sobre ambos glucosa y arabinosa como única fuente de carbono. La cepa resultante crece en una mezcla de glucosa y arabinosa, mostrando co-consumo de glucosa y arabinosa.
Ejemplo 8 Identificación de mutaciones subyacentes del fenotipo insensible a glucosa de IMW017 e IMW018 Se espera que el fenotipo insensible a glucosa de las cepas IMW017 e I W018 pueda explicarse mediante mutaciones reunidas durante el crecimiento selectivo de la cepa IMK318 en un medio que contiene glucosa y arabinosa. Para identificar estas mutaciones, se secuencian los genomas de las cepas IMK318, IMW017 e IMW018. La comparación de las secuencias genómicas de IMW017 vs I K318 e IMW018 vs I K318 permite identificar modificaciones genómicas, como por ejemplo polimorfismos de un solo nucleótido. La introducción de estos polimorfismos de un solo nucleótido en DS62504 da como resultado fenotipos cuyo crecimiento sobre arabinosa es insensible a glucosa.
Ejemplo 9 Supresión de GAL1.
Otro enfoque para determinar la o las proteínas responsables de la actividad hexoquinasa remanente comprende suprimir genes que potencialmente codifican actividad hexoquinasa en la cepa hxkl hxk2 glkl. Para tal fin, se suprime el gen GAL1 en la cepa hxkl hxk2 glkl. La cepa resultante muestra una menor actividad hexoquinasa que la cepa hxkl hxk2 glkl parental o muestra una capacidad disminuida para crecer sobre glucosa como única fuente de carbono en comparación con la cepa hxkl hxk2 glkl parental. Esta cepa cuádruple noqueada provee una plataforma aún más fuerte para la ingeniería evolutiva del consumo de arabinosa en la presencia de glucosa.
Ejemplo 10 Supresión de DR516c.
Otro enfoque para determinar la o las proteínas responsables de la actividad hexoquinasa remanente comprende suprimir genes que potencialmente codifican actividad hexoquinasa en la cepa hxkl hxk2 glkl. Para tal fin, se suprime el gen YDR516c en la cepa hxkl hxk2 glkl. La cepa resultante muestra una menor actividad hexoquinasa que la cepa hxkl hxk2 glkl parental o muestra una capacidad disminuida para crecer sobre glucosa como única fuente de carbono en comparación con la cepa hxkl hxk2 glkl parental. Esta cepa cuádruple noqueada provee una plataforma aún más fuerte para la ingeniería evolutiva del consumo de arabinosa en la presencia de glucosa.
Ejemplo 11 Supresión de YLR446w.
Otro enfoque para determinar la o las proteínas responsables de la actividad hexoquinasa remanente comprende suprimir genes que potencialmente codifican "actividad hexoquinasa en la cepa hxkl hxk2 glkl. Para tal fin, se suprime el gen YLR446w en la cepa hxkl hxk2 glkl. La cepa resultante muestra una menor actividad hexoquinasa que la cepa hxkl hxk2 glkl parental o muestra una capacidad disminuida para crecer sobre glucosa como única fuente de carbono en comparación con la cepa hxkl hxk2 glkl parental.
Esta cepa cuádruple noqueada provee una plataforma aún más fuerte para la ingeniería evolutiva del consumo de arabinosa en la presencia de glucosa.
Ejemplo 12 Co- ermentación anaeróbica de arabinosa y glucosa Para mejorar el co-consumo de glucosa y arabinosa de la cepa IMW017, se cultivó anaeróbicamente la cepa IMW017 en MY suplementado con una mezcla de 20 g/litro de glucosa y 20 g/litro de arabinosa, usando un equipo de fermentadores por lotes sucesivos. Inicialmente, se aplicaron cuatro lotes consecutivos en la mezcla de glucosa/arabinosa. En cada lote la glucosa y la arabinosa eran consumidas simultáneamente y fermentadas en etanol (Figura 6, ejemplo 3) . Por lo que se dedujo a partir del perfil de producción de C02, se observó que la velocidad de crecimiento específica con la mezcla de glucosa/arabinosa aumentó de 0,05 h"1 en el primer lote a 0,06 h"1 en el cuarto lote. Después del cuarto lote, se aplicaron cultivos por lotes consecutivos ya sea en mezclas de glucosa y arabinosa (números de lote 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 39) o en arabinosa solamente (números de lote 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 40). Después de los lotes 19 y 21 en MY-arabinosa y Y-glucosa/arabinosa, respectivamente, la velocidad de crecimiento anaeróbico aumentó a 0,09 h-1 sobre arabinosa como única fuente de carbono y 0,10 h"1 sobre la mezcla de glucosa/arabinosa (Figura 7). La comparación de los perfiles de producción de C02 de los cultivos por lotes individuales muestra que el régimen de lotes repetidos dio como resultado un menor tiempo de fermentación ya sea para arabinosa solamente o para la mezcla de glucosa/arabinosa desde 120 horas aproximadamente hasta 80 horas aproximadamente, suponiendo un tamaño de inoculo inicial igual para cada lote (Figura 8) . El pico único de producción de C02 que se observó para los cultivos por lotes en la mezcla de glucosa/arabinosa indica que la glucosa y arabinosa son consumidas simultáneamente, en lugar de sucesivamente (Figuras 8 y 9) .
Ejemplo 13 Actividades hexoquinasa .
Las actividades hexoquinasa de las cepas DS62504, IMK307, IMK312, I K318, IMW017 e IMW018 se determinaron en extractos celulares de cultivos en frascos de agitación que se hicieron crecer en YP suplementado con arabinosa. La mezcla de reacción de hexoquinasa consistía de 50 mM de imidazol-HCl, pH 7,6, 1 mM de NADP+, 10 mM de MgCl2, 2 U de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, 10 mm de D-glucosa y extracto celular. La reacción se inició con la adición de 1 mM de ATP y la formación de NADPH se determinó midiendo la absorbencia de la mezcla de reacción a 340 nm. La actividad hexoquinasa en los extractos celulares de las cepas DS62504 e IMK307 {hxk2A) era de 1,2 y 1,3 pmol . min-1. mg"1 de proteina, respectivamente (Figura 10). La actividad hexoquinasa de 0,4 pmol .min-1.mg-1 de proteina en los extractos celulares de IMK312 {hxk2A hxklA) era menor que la de IM 307. Las cepas I K318 e IM 018 {hxk2A hxklA glklA) presentaron una actividad hexoquinasa menor que 0,02 µ???? .min"1.mg-1 de proteina. Se esperara que la cepa IMW017, con capacidad para consumir glucosa a pesar de la supresión triple hxk2 hxkl y glkl, tuviera una mayor actividad hexoquinasa en comparación con las cepas IMK318 e IM 018, ninguna de las cuales tenia capacidad para consumir glucosa. La actividad hexoquinasa para la cepa IMW017 también era menor que 0,02 pmol . min-1. mg"1 de proteina bajo las condiciones de ensayo.
Ejemplo 14 Identificación de GAL1 como una hexoquinasa en IMW017 Se esperaba que otro gene con el potencial de codificar una azúcar quinasa presente en el genoma se haya activado o que haya cambiado su especificidad de sustrato por glucosa basado en los experimentos de crecimiento de la cepa IMW017 hxklA hxk2A glklA desarrollada sobre mezclas de glucosa y arabinosa. Para investigar si la actividad hexoquinasa desconocida era codificada por GAL1, se suprimió el gen GAL1 en IMW017. Después de eliminar el cásete KanMX del1 locus glkl usando pSH65 (véase el ejemplo 1), se pudo suprimir GALl por integración de un cásete de resistencia a G418 que fue amplificado por PCR usando los oligonucleótidos GALl-DisA y GALl-DisB (Tabla 5) . Las células transformadas se seleccionaron sobre YP-agar que contiene 100 iq mi" de G418 (InvivoGen, San Diego, EE.UU.) y 1,5% (p/v) de etanol y l,5%(p/v) de glicerol como fuente de carbono. La integración correcta del cásete KanMX se verificó por PCR en colonias individuales usando combinaciones de los oligonucleótidos de diagnóstico GAL1-F 2 / KanA y GAL1-RV2 / KanB. (Tabla 4). La supresión de GALl en la cepa resultante IMW023 se confirmó por su incapacidad para crecer sobre galactosa como única fuente de carbono.
Notablemente, IMW023 no pudo emplear glucosa como fuente de carbono, lo cual indicaba que GALl era responsable de la actividad hexoquinasa desconocida en su cepa IMW017 hxklA hxk2A glklA parental. Durante un cultivo en frascos de agitación en una mezcla de glucosa y arabinosa, IMW023 no consumió glucosa mientras se consumía arabinosa (Figura 11) .
Tabla 5: Oligonucleótidos usados en este estudio para la supresión de GALl y fines de diagnóstico relacionados. Se obtuvo un cásete de supresión del gen KanMX por PCR usando combinaciones de los oligonucleótidos GALl-DisA y GALl-DisB.
GAL1 se interrumpió mediante recombinación homologa entre el gen blanco y el cásete de supresión con el gen Kan X. Los sitios de recombinación están indicados por las regiones subrayadas en los oligonucleótidos . La supresión o interrupción se confirmó por PCR usando los cebadores de diagnóstico KanA y KanB combinados con los cebadores de diagnóstico FW y RV correspondientes con el gen blanco.
Ejemplo 15 Fermentación anaerobica de arabinosa en la presencia de glucosa Dado que se encontró que GALlp en IMW017 también mostraba actividad hexoquinasa, la cepa IMW023 hxklA xk2ñ glklA gall provee una plataforma más sólida para mejorar el consumo de arabinosa en la presencia de glucosa mediante ingeniería evolutiva, sin consumo de glucosa. Para seleccionar el consumo mejorado de arabinosa en la presencia de glucosa en el medio, se cultivó la cepa IMW023 en cultivos en frascos de agitación por transferencia en serie en medio MY suplementado con 2% de arabinosa y 2% de glucosa. El crecimiento fue monitoreado mediante mediciones de DO660 y los índices de crecimiento específicos fueron estimados a partir de 2 ó 3 mediciones de DO660 por cultivo. Las concentraciones de glucosa y arabinosa se déterminaron mediante análisis por HPLC. Después de 24 transferencias en serie sobre las mezclas de arabinosa/glucosa por 63 días, el cultivo transferido de la cepa IMW023 aún tenía capacidad para crecer sobre arabinosa en la presencia de 2% de glucosa, sin consumo de glucosa (Figura 12) . La velocidad de crecimiento específica sobre arabinosa aumentó de aproximadamente 0,06 h"1 a aproximadamente 0,11 h-1 (Figura 13) .
Para seleccionar células con capacidad para consumir arabinosa en la presencia de glucosa bajo condiciones anaeróbicas, y para mejorar aún más el consumo de arabinosa en la presencia de glucosa, se continuó con la transferencia sucesiva de la cepa IMW023 en medio MY suplementado con 2% de arabinosa y 2% de glucosa en un equipo de fermentación anaeróbica por lotes sucesivos. Para ello, se usó el cultivo en frasco de agitación final del cultivo transferido en serie (SF24) de la cepa IM 023 como inoculo. Durante las primeras 1000 horas de cultivo, solamente se observó una mayor producción de C02 cuando se suministraba aire por el espacio superior del fermentador en lugar de nitrógeno gaseoso (Figura 14). Después de aproximadamente 1000 horas de cultivo, durante el cuarto lote, se observó un incremento de las concentraciones de C02 en el gas de escape. Por lo que se dedujo a partir del perfil de producción de C02, este primer lote de crecimiento anaeróbico mostró una velocidad de crecimiento especifica de aproximadamente 0,03 h"1. Después de otras diez transferencias, la velocidad de crecimiento especifica aumentó a 0,06 h-1 aproximadamente (Figura 14). Durante los cultivos por lotes transferidos sucesivamente, hubo consumo de arabinosa pero no de glucosa (Figura 15) . Los perfiles de producción de C02 de los cultivos por lotes individuales muestran que el índice de producción de C02, y por ende el índice de consumo de arabinosa, habían aumentado durante las sucesivas transferencias, lo cual dio como resultado una disminución del tiempo de fermentación necesario para consumir toda la arabinosa (Figura 16).
Una forma aislada de una colonia individual tomada del lote final, denominada cepa IMW058, mostró índices aumentados de consumo de arabinosa en la presencia de glucosa en comparación con IMW023.
Ejemplo 16 Re-introducción de actividad hexoquinasa o glucoquinasa en IMW018 La reintroducción de ya sea HXK1 , HXK2 o GLK1 en la cepa IMW018 se efectuó para restablecer el crecimiento sobre glucosa. Para ello, se amplificaron los genes HXK2, HXK1 y GLK1 por PCR usando las combinaciones de oligonucleótidos HXK2FW / HXK2RV, HXK1FW / HXK1RV y GLK1FW / GLK1RV, usando el ADN genómico de CENPK113-7D de S. cerevisiae como templado. Después de la purificación de los productos de la PCR (conjunto de elementos GenElute PCR Clean-up, Sigma, Steinheim, Alemania) , se transformaron cultivos de toda la noche de IMW018 (Gietz y oods 2002) con los productos de la PCR. Las células transformadas se seleccionaron por su crecimiento sobre glucosa sobre Y-agar que contiene 2% de glucosa. Se verificó por PCR la integración correcta de HXK2, HXK1 y GLK1 mediante recombinación homologa en sus loci originales en colonias individuales usando los pares de cebadores de diagnóstico (TABLA 6) .
Las cepas resultantes IMW024 [HXK2) , IMW025 (HXK1) e IMW047 ( GLK1 ) se cultivaron con una DO660 inicial de 0,05 ± 0,01 en frascos de agitación a 30°C en medio MY-urea (pH 4,7) suplementado con 2% de glucosa y 2% de arabinosa, usando precultivos que se hicieron crecer sobre glucosa. A efectos comparativos, las cepas DS62504, IMK307 e IMK311 se cultivaron bajo las mismas condiciones. El crecimiento y consumo de azúcares se monitoreó durante 69 horas. Toda las cepas IMW024, IMW025 e IMW047 pudieron utilizar tanto glucosa como arabinosa (Figura 17). La reintroducción de GLK1 en IM 018 (IM 047) dio como resultado un consumo rápido de glucosa y arabinosa. La arabinosa y la glucosa se habían completado dentro de las 43 horas de cultivo, lo cual es similar a lo observado para IMK307 (hxk2A) e IMK311 (hxklA hxk2A) . El consumo de arabinosa observado para IM 024 (HXK2) e IMW025 {HXK1) era más lento en ambas cepas que en I K307 e IMK311, sin embargo era más rápido que para la cepa DS62504 parental sin ninguna supresión de HXK/GLK (Figura 17 (a)). Solamente se observó co-consumo de arabinosa y glucosa en la cepa I W047 (Figura 18). Antes de la depleción de. glucosa a las 22 horas, se había consumido aproximadamente un 7% de la arabinosa. A las 25 horas, cuando la glucosa se había consumido por completo, se había utilizado un 19% de la arabinosa .
Tabla 6. Oligonucleótidos usados en este estudio para la amplificación de HXK2, HXK1 y GLK1. La integración de estos productos de PCR en sus loci originales ,se verificó por PCR usando cebadores de diagnóstico cuyos sitios de alineación están ubicados sobre el inserto y en las regiones flanqueadoras del sitio de integración.
Ejemplo 17 Re-introducción de actividad hexoquinasa o glucoquinasa en IMW058.
La reintroducción de ya sea HXKl, HXK2 o GLK1 en la cepa IMW058 se efectuó para restablecer el crecimiento sobre glucosa. Para ello, se amplificaron los genes HXK2, HXKl y GLK1 por PCR usando las combinaciones de oligonucleótidos HXK2FW / HXK2RV, HXK1F / HXK1RV y GLK1FW / GLK1RV, usando el ADN genómico de CENPK113-7D de S. cerevisiae como templado. Después de la purificación de los productos de la PCR (conjunto de elementos GenElute PCR Clean-up, Sigma, Steinheim, Alemania) , se transformaron cultivos de toda la noche de IMW058 (Gietz y Woods 2002) con los productos de la PCR. Las células transformadas se seleccionaron por su crecimiento sobre glucosa sobre MY-agar que contiene 2% de glucosa. Se verificó por PCR la integración correcta de HXK2, HXK1 y GLK1 mediante recombinación homologa en sus loci originales en colonias individuales usando los oligonucleótidos de diagnóstico (TABLA 5) .
Las cepas resultantes IM 059 ( HXK2) , IMW060 (HXK1) e IM 061 ( GLK1 ) se cultivaron con una DO660 inicial de 0,05 ± 0,01 en frascos de agitación a 30°C en medio MY-urea (pH 4,7) suplementado con 2% de glucosa y 2% de arabinosa, usando precultivos que se hicieron crecer sobre glucosa. El crecimiento y consumo de azúcares se monitoreó durante 72 horas. Todas las cepas IMW059, IMW060 e IMW061 pudieron utilizar tanto glucosa como arabinosa (Figura 17). La reintroducción de HXK2 en IMW058 dio como resultado un consumo sucesivo rápido de arabinosa y glucosa. En tanto la cepa de referencia DS62504 no consumió por completo la arabinosa dentro de las 69 horas (Figura 17 (a)), la cepa IMW059 consumió más del 99% de la arabinosa dentro de las 46 horas aproximadamente (Figura 17 (j)).
Para las cepas IMW060 (HXK1) e IMW061 (GLK1) se observó un consumo simultáneo de glucosa y arabinosa (Figuras 17 (k) y (1) ) . Durante las primeras 22 horas de cultivo, hubo co-consumo de aproximadamente un 18% de la arabinosa junto con aproximadamente un 48% de la glucosa. El 99% de la arabinosa se había consumido dentro de las 50 horas de cultivo, .
Ejemplo 18 Secuenciación comparativa del genoma completo de las cepas IMK318, IMW017 e IMW018 La secuenciación del ADN del genoma completo de las cepas IMK318, IMW017 e IM 018 se efectuó usando la tecnología I Ilumina GAIIx (lecturas de 75 bp, extremos apareados) . Las lecturas de secuencia se alinearon con una secuencia genómica de referencia de CEN.PK 113-7D de S. cerevisiae usando CLC Genomics Workbench versión 4.5. El análisis de SNP se efectuó usando CLC Genomics Workbench versión 4.5.
En total, se obtuvieron cuatro mutaciones en las regiones de codificación según el análisis de SNP dando como resultado un cambio de aminoácidos cuando se comparaban I K318, IMW017 e IMW018 con la sécuencia de referencia de CEN.PK 113-7D.
Una mutación, dio como resultado un cambio de aminoácido Asp376Val en GALl que codifica galactoquinasa. La mutación se encontró en IMK318, I W017 e IMW018 cuando se compara con la secuencia de referencia (Figura 19).
Sorprendentemente, solamente se encontraron dos mutaciones únicas para IMW017. Una de ellas, una mutación Tyr274Phe en GALl, se ubica en el sitio de unión a galactosa de la galactoquinasa, que fue descrita por Thoden et al., (2005) . Combinado con la observación que la supresión de GALl en IMW017 elimina el crecimiento sobre glucosa, parece probable que esta mutación era responsable de la actividad hexoquinasa de GALl que permitió el consumo de glucosa en IMW017. Se encontró una segunda mutación en el motivo transmembrana 5 de GAL2 (Thr219Asn) , que codifica la galactosa permeasa en S. cerevisiae. Se sabe que GAL2p puede transportar arabinosa (Kou et. al 1970; Becker et al., 2003). Una mutación en GAL2 que aumente la afinidad por la arabinosa o disminuya la afinidad por glucosa, dará como resultado un consumo mejorado de arabinosa en la presencia de glucosa.
Sorprendentemente, sólo se encontró 1 mutación única en las regiones de codificación de IMVJ018. Esta mutación se localizaba en el motivo transmembrana 8 de GAL2 (Asn376Ser) , que codifica la galactosa permeasa en S. cerevisiae. Se sabe que GAL2p puede transportar arabinosa (Kou et. al 1970; Becker et al., 2003). Una mutación en GAL2 que aumente la afinidad por la arabinosa o disminuya la afinidad por glucosa, dará como resultado un consumo mejorado de arabinosa en la presencia de glucosa.
Ejemplo 19 Fermentación anaeróbica rápida de glucosa y arabinosa por IMW059 La cepa IMW059 se cultivó anaeróbicamente en medio MY con 20 g l"1 de glucosa y 20 g l"1 de arabinosa. El consumo de azúcares se monitoreó mediante mediciones de HPLC. El crecimiento de la levadura se determinó mediante mediciones de peso seco y monitoreó de la DO660. La producción de CO2 se determinó midiendo las concentraciones de CO2 en el gas de escape. La producción de etanol se calculó basado en la producción de C02. Para corregir la evaporación de etanol se supuro que la cantidad de etanol producida era igual a la producción acumulada medida de C02 menos la producción de CO2 que tuvo lugar debido a la síntesis de biomasa (5,85 mmol de CO2 por gramo de biomasa) y el C02 asociado con la formación de acetato.
La depleción de glucosa tuvo lugar dentro de las 19 horas. Según en el perfil de producción de CO2 y las concentraciones de arabinosa (Figura 21) el consumo de arabinosa comenzó después que se había consumido por completo la glucosa. No se observó co-consumo de glucosa y arabinosa. Después de 74 horas de cultivo anaeróbico se había consumido el 99% de la arabinosa. Se produjo etanol con un rendimiento global de 0,43 g g-1 de azúcares totales. La comparación del perfil de producción de C02 con el de la cepa DS62504 (Figura 24) muestra que, en base al primer pico de producción de C02 durante la fermentación anaeróbica de una mezcla de glucosa/arabinosa, el consumo de glucosa es más lento para la cepa IMW059. Sin embargo, la arabinosa es consumida mucho más rápido por la cepa IMW059, lo cual es reflejado por los mayores niveles de producción de C02 durante el segundo pico de producción de C02 y por el menor tiempo de fermentación total.
Ejemplo 20 Co-consumo anaeróbico de glucosa y arabinosa por IMW060 La cepa IMW060 se cultivó anaeróbicamente en medio Y con 20 g l"1 de glucosa y 20 g 1_1 de arabinosa. El consumo de azúcares se monitoreó mediante mediciones de HPLC. El crecimiento de la levadura se determinó mediante mediciones de peso seco y monitoreó de la DO660. La producción de C02 se determinó midiendo las concentraciones de C02 en el gas de escape. La producción de etanol se calculó basado en la producción de C02. Para corregir la evaporación de etanol se supuro que la cantidad de etanol producida era igual a la producción acumulada medida de C02 menos la producción de C02 que tuvo lugar debido a la síntesis de biomasa (5,85 mmol de C02 por gramo de biomasa) y el C02 asociado con la formación de acetato.
Sobre la base del perfil de producción de' C02 y las concentraciones de glucosa y arabinosa (Figura 22), la arabinosa es consumida simultáneamente con la glucosa dentro de las primeras 40 horas aproximadamente. La glucosa era consumida por completo dentro de las primeras 43 horas, en tanto el se había consumido un 41% de la arabinosa. Después de 74 horas de cultivo anaeróbico se había consumido el 89% de la arabinosa. Después de 140 horas de cultivo anaeróbico se había consumido el 98% de la arabinosa. Se produjo etanol con un rendimiento global de 0,43 g g"1 de azúcares totales. La comparación del perfil de producción de C02 con el de la cepa DS62504 (Figura 24) muestra que, en base al primer pico de producción de C02 durante la fermentación anaeróbica de una mezcla de glucosa/arabinosa, el consumo de glucosa es más lento para la cepa IMW060. Sin embargo, el tiempo total para fermentar la mezcla de glucosa/arabinosa es menor que para DS62504.
Ejemplo 21 Co-consumo anaeróbico de glucosa y arabinosa por IMW061 La cepa IMW061 se cultivó anaeróbicamente en medio MY con 20 g l"1 de glucosa y 20 g l"1 de arabinosa. El consumo de azúcares se monitoreó mediante mediciones de HPLC. El crecimiento de la levadura se determinó mediante mediciones de peso seco y monitoreó de la DO660. La producción de CO2 se determinó midiendo las concentraciones de CO2 en el gas de escape. La producción de etanol se calculó basado en la producción de C02. Para corregir la evaporación de etanol se supuro que la cantidad de etanol producida era igual a la producción acumulada medida de C02 menos la producción de C02 que tuvo lugar debido a la síntesis de biomasa (5,85 mmol de C02 por gramo de biomasa) y el C02 asociado con la formación de acetato.
Sobre la base del perfil de producción de C02 y las concentraciones de glucosa y arabinosa (Figura 23), la arabinosa es consumida simultáneamente con la glucosa dentro de las primeras 43 horas. La glucosa era consumida por completo dentro de las primeras 49 horas, en tanto el se había consumido un 73% de la arabinosa. Después de 74 horas de cultivo anaeróbico se había consumido el 95% de la arabinosa. Después de 140 horas de cultivo anaeróbico se había consumido el 99% de la arabinosa. Se produjo etanol con un rendimiento global de 0,44 g g"1 de azúcares totales. La comparación del perfil de producción de C02 con el de la cepa DS62504 (Figura 24) muestra que, en base al primer pico de producción de C02 durante la fermentación anaeróbica de una mezcla de glucosa/arabinosa, el consumo de glucosa es más lento para la cepa IM 061. Sin embargo, el tiempo total para fermentar la mezcla de glucosa/arabinosa es menor que para DS62504.
Ejemplo 22 Prueba de rendimiento en BAM Con el fin de evaluar el rendimiento de las cepas IMW060 e IMW061, las cepas fueron inoculadas en medio Verduyn, suplementado con 2% de glucosa. Se incluyó la cepa DS62504 como control.
Después de una incubación durante toda la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador rotatorio, las células fueron cosechadas por centrifugación y los cultivos para la producción de C02 se condujeron a 33°C en el BAM (Monitor de Actividad Biológica) , en 100 mi de medio Verduyn suplementado con los azúcares indicatdos en la Tabla 7. Las células se agregaron a los 100 mi de medio Verduyn suplementado con los azúcares y los inhibidores ácido acético, ácido coumárico, ácido ferúlico, furfural, HMF y ácido fórmico a las concentraciones indicadas. En un segundo experimento, se usaron 100 mi de medio Verduyn suplementado con los azúcares pero sin inhibidores. La producción de C02 era monitoreada constantemente, y se tomaron muestras a intervalos para su análisis (densidad óptica a 600 nm, etanol y azúcares residuales) .
Los resultados del experimento con BAM se muestran en las figuras 25, 26 y 27 para el medio con los inhibidores, y 28, 29 y 30 para el medio sin inhibidores. Se puede concluir que ambas IMW060 e I W061 tienen la capacidad de convertir los azúcares glucosa y arabinosa de manera rápida y simultánea en etanol, en tanto la cepa DS62504 no puede hacerlot, es decir DS62504 consume arabinosa después de haber agotado la glucosa del medio. The same result, es decir co-consumo de arabinosa y glucosa, is obtained en la presencia de inhibidores, although the time it takes to consume all azúcares is slower en la presencia de inhibidores, as is known from the literatura.
Tabla 7: Composición del medio Verduyn CFMM2M; CFMM1M tiene la misma composición excepto que no contiene inhibidores : [1] A. A. Andreasen, T.J. Stier, Anaerobic nutrition of Saecharomyees cerevisiae. I. Ergosterol requirement for growth in a defined médium, J. Cell Physiol. 41 (1953) 23-36. [2] A. A. Andreasen, T.J. Stier, Anaerobic nutrition of Saccharomyces cerevisiae. II. Unsaturated fatty acid requirement for growth in a defined médium, J. Cell Physiol. 43 (1954) 271-281. [3] R.D. Gietz, R.A. Woods, Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 350 (2002) 87-96. [4] U. Güldener, S. Heck, T. Fiedler, J. Beinhauer, J.H. Hegemann, A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast, Nucleic Acids Res. 24 (1996) 2519-252 . [5] U. Güldener, J. Heinisch, G.J. Koehler, D. Voss, J.H. Hegemann, A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated múltiple gene knockouts in budding yeast, Nucleic Acids Research 30(6) (2002) e23. [6] H. Van Urk, P.R. Mak, W.A. Scheffers, J.P. Van Dijken, Metabolic responses of Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 and Candida utilis CBS 621 upon transition from glucose limitation to glucose excess, Yeast 4 (1988) 283-291. [7] C. Verduyn, E . Postma, W.A. Scheffers, J.P. Van Dijken, Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation, Yeast 8 (1992) 501-517. [8] R.A. Weusthuis, W. Visser, J.T. Pronk, W.A. Scheffers, J.P. Van Dijken, Effects of oxygen limitation on sugar metabolism in yeasts - a continuous-culture study of the Kluyver effect, Microbiology 140 (1994) 703-715. [9] S.C. Kou, et al. (1970). J. Bact. 102, 67,1-678. [10] J. Becker et al. (2003). Appl. Environ. Microbiol. 69, 4144-4150. [11] J.B. Thodenet al. (2005). J. Biol. Ghem. 280, 36905-36911

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una célula de levadura, CARACTERIZADA PORQUE comprende uno o más genes exógenos de una o más vías metabólicas de pentosas no nativas para la célula de levadura, en donde la célula de levadura tiene una interrupción de los genes nativos hxkl, hxk2 glkl y ga.ll en la célula de levadura.
2. Un proceso para la preparación de una célula de levadura termentadora de pentosas, CARACTERIZADO PORQUE comprende someter una célula de levadura que comprende uno o más genes exógenos de la vía metabólica de pentosas a interrupción del gen hxk2 nativo en la célula de levadura, en donde la cepa interrumpida resultante es sometida a ingeniería evolutiva para mejorar el consumo de pentosa, hasta que la célula de levadura tenga una velocidad de crecimiento de 0,05 h"1 o más sobre la pentosa como única fuente de carbono y aislar la célula de levadura termentadora de pentosas resultante.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, levadura de acuerdo con la reivindicación 1.
4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, CARACTERIZADO PORQUE en la levadura resultante se introducen uno o más genes hxkl, hxk2 glkl y ga.ll, con el fin de restablecer su capacidad para consumir glucosa.
5. Una célula de Saccharomyces fermentadora de pentosas y glucosa, CARACTERIZADA PORQUE tiene la capacidad de consumir de manera anaeróbica simultánea pentosas y glucosa, que se puede obtener de acuerdo con el proceso de las reivindicaciones 2-4.
6. Un proceso para producir un producto de fermentación a partir de la fermentación de pentosas, CARACTERIZADO PORQUE comprende el paso de: cultivar una célula de levadura fermentadora de pentosas y glucosa de acuerdo con la reivindicación 5 en un material que contiene pentosas y glucosa bajo condiciones de fermentación adecuadas por un periodo de tiempo suficiente como para permitir la fermentación de pentosas y glucosa en un producto de fermentación, en donde la célula de levadura fermenta pentosas para producir un producto de fermentación a un nivel mayor con relación a la correspondiente levadura de tipo salvaje.
7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 7, CARACTERIZADO PORQUE el tiempo de fermentación se redujo con relación a la correspondiente fermentación de levadura de tipo salvaje.
8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO PORQUE el tiempo de fermentación se redujo en un 40% o más.
9. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, CARACTERIZADO PORQUE se co-fermentan pentosas y glucosa.
10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, CARACTERIZADO PORQUE el índice global de producción de etanol es al menos un 20% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente o un 100% aproximadamente mayor que el de un proceso con la correspondiente levadura de tipo salvaje.
11. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-10, CARACTERIZADO PORQUE el material que contiene pentosas comprende un hidrolizado de un material lignocelulósico.
12. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-11, CARACTERIZADO PORQUE el hidrolizado es un hidrolizado enzimático de un material lignocelulósico.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2627765B1 (en) 2010-10-13 2017-05-10 DSM IP Assets B.V. Pentose and glucose fermenting yeast cell
AR097805A1 (es) 2013-03-15 2016-04-20 Alder Biopharmaceuticals Inc Células de cambio de temperatura para la expresión de alto rendimiento de polipéptidos en levadura y otros transformados
WO2014195380A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides with permease activity
WO2014195378A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides with permease activity
WO2014195379A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides with permease activity
WO2014195381A2 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides with permease activity
WO2014195521A2 (en) * 2013-12-18 2014-12-11 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides with permease activity
WO2015091757A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides with permease activity
KR102277898B1 (ko) 2014-07-03 2021-07-15 삼성전자주식회사 산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법
MY187130A (en) 2014-10-22 2021-09-02 Butalco Gmbh Variants of gal2 transporter and their uses
BR112018002284A2 (pt) 2015-08-05 2018-12-11 Cargill Inc método de fermentação para produzir um bioproduto, levedura crabtree negativa geneticamente engenheirada e método para reduzir a produção de glicerol por uma levedura engenheirada
US11208670B2 (en) 2015-10-22 2021-12-28 Basf Enzymes Llc Method for producing a fermentation product
CN108883400B (zh) 2016-02-19 2021-09-17 洲际大品牌有限责任公司 由生物质源形成多值料流的方法
CN106222101B (zh) * 2016-07-27 2020-03-27 中国科学技术大学 高温下高效利用菊芋一步生产高纯果糖的耐高温菌株及应用
US11365417B2 (en) * 2017-09-12 2022-06-21 Bio Capital Holdings, LLC Biological devices and methods of use thereof to produce steviol glycosides
CN111344299A (zh) * 2017-11-14 2020-06-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 具有改善的阿拉伯糖转运特异性的多肽
CA3089799A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Dsm Ip Assets B.V. Yeast cell capable of simultaneously fermenting hexose and pentose sugars
CN111304228B (zh) * 2020-03-18 2022-02-22 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用
WO2023000243A1 (zh) * 2021-07-22 2023-01-26 深圳先进技术研究院 重组酵母生物转化生产葡萄糖的方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990014423A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 The Infergene Company Microorganism transformation
CA2063592C (en) 1989-07-07 2003-01-21 Marco L. F. Giuseppin Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector
FR2679920A1 (fr) 1991-08-02 1993-02-05 Rhone Poulenc Rorer Sa Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes, leur preparation et leur utilisation.
DE69432543T2 (de) 1993-07-23 2003-12-24 Dsm Nv Selektionmarker-genfreie rekombinante Stämme: Verfahren zur ihrer Herstellung und die Verwendung dieser Stämme
EP2298913A1 (en) 1997-04-11 2011-03-23 DSM IP Assets B.V. Gene conversion as a tool for the construction of recombinant industrial filamentous fungi
US6265186B1 (en) 1997-04-11 2001-07-24 Dsm N.V. Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces
BR9910532A (pt) 1998-05-19 2001-10-16 Dsm Nv Produção melhorada in vivo de cefalosporina
KR20010089672A (ko) 1998-12-22 2001-10-08 윌리암 로엘프 드 보에르 개선된 생체내 세팔로스포린 생산
ATE418616T2 (de) * 2002-01-23 2009-01-15 Royal Nedalco B V Fermentation von pentosezuckern
SE0202090D0 (sv) 2002-05-08 2002-07-04 Forskarpatent I Syd Ab A modifierd yeast consuming L-arabinose
EP1513923B1 (en) 2002-05-30 2007-07-18 NatureWorks LLC Methods and materials for the production of d-lactic acid in yeast
WO2004085627A1 (en) 2003-03-26 2004-10-07 Forskarpatent I Syd Ab New saccharomyces cerevisiae strains utilizing xylose
US7479385B2 (en) * 2003-12-05 2009-01-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Sugar kinases with expanded substrate specificity and their use
CA2861834A1 (en) 2004-07-16 2006-01-26 Technische Universiteit Delft Metabolic engineering of xylose fermenting eukaryotic cells
US7888489B2 (en) 2005-01-24 2011-02-15 Dsm Ip Assets B.V. Method for producing a compound of interest in a filamentous fungal cell
EA016303B1 (ru) 2006-10-02 2012-04-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Метаболическая инженерия сбраживающих арабинозу дрожжевых клеток
WO2008086124A1 (en) 2007-01-03 2008-07-17 Vialogy Llc Multi parallax exploitation for omni-directional imaging electronic eye
US20100159546A1 (en) 2007-03-30 2010-06-24 Aristos Aristidou Metabolic engineering of yeasts for the production of 1-butanol
WO2008124162A2 (en) * 2007-04-09 2008-10-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Substrate-selective co-fermentation process
US20100304454A1 (en) * 2007-07-19 2010-12-02 Royal Nedalco B.V. Novel arabinose-fermenting eukaryotic cells
JP5992135B2 (ja) 2008-02-04 2016-09-14 東レ株式会社 連続発酵による乳酸の製造方法
AU2009224749B2 (en) 2008-03-13 2015-09-10 Dsm Ip Assets B.V. Selection of organisms capable of fermenting mixed substrates
DE102008029302B4 (de) 2008-06-19 2016-08-11 Insilico Biotechnology Ag Biotechnologische Herstellung von Acrylsäure
FR2934264B1 (fr) 2008-07-22 2012-07-20 Arkema France Fabrication d'esters de vinyle a partir de matieres renouvelables, esters de vinyle obtenus et utilisations
EP2367928B1 (en) * 2008-12-24 2018-03-14 DSM IP Assets B.V. Xylose isomerase genes and their use in fermentation of pentose sugars
WO2010099153A2 (en) * 2009-02-25 2010-09-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Metabolic engineering of a galactose assimilation pathway in the glycoengineered yeast pichia pastoris
WO2010099343A1 (en) 2009-02-25 2010-09-02 Indiana University Research & Technology Corporation Materials and methods for identifying and using yeast strains that metabolize pentose sugars in the presence of d-glucose
EP2627765B1 (en) 2010-10-13 2017-05-10 DSM IP Assets B.V. Pentose and glucose fermenting yeast cell

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Publication number Publication date
AR083449A1 (es) 2013-02-27
WO2012049179A2 (en) 2012-04-19
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JP2013542724A (ja) 2013-11-28
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