KR20140005883A - 투과효소 활성을 갖는 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 55의 T219에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 갖는 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 55와 50 % 이상 서열 동일성을 갖고 투과효소 활성을 갖는다.

Description

투과효소 활성을 갖는 폴리펩티드{POLYPEPTIDES WITH PERMEASE ACTIVITY}

본 발명은 신규한 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 발현하는 재조합 유기체에 관한 것이다. 일 실시양태에서 본 발명은 신규한 투과효소 폴리펩티드, 보다 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 중 신규한 GAL2에 관한 것이다.

투과효소는 수동 수송에 의해 세포를 출입하는, 여기에서 구체적으로 하나 이상의 당인 막 수송 단백질(특이적 분자의 확산을 촉진하는 다중관통 막통과 단백질의 부류)이다. 반대로, 능동 수송체는 분자 막통과 수송체를 에너지원, 예컨대 ATP 또는 선호하는 이온 구배와 결합한다.

사카로마이세스 세레비지아에 중, 투과효소 GAL2는 세포막 쪽으로 갈락토스를 수송한다. 또한, 이는 막 쪽으로의 글루코스의 수송체로서 공지된다.

본 발명의 목적은 신규한 투과효소 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 세포막 쪽으로 투과 효소를 수송하는 분자의 개선된 흡수를 갖는 투과효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 균주를 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 모 폴리펩티드에 비해 C5 당에 고-친화력을 갖는 투과효소 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 모 폴리펩티드에 비해 C6 당에 감소된 친화력은 갖는 투과 효소 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

이들 목적 중 하나 이상이 본 발명에 따라 달성된다. 본 발명에 따라, 서열번호 55의 T219에 상응하는 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는 폴리펩티드를 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드는 서열번호 55와 50 % 이상의 서열 동일성을 갖고, 상기 폴리펩티드는 투과효소 활성을 갖는다. 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 치환 T219N 또는 T219Q를 갖는다. 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 치환 T219N을 갖는다.

하나 이상의 이들 돌연변이를 갖는 폴리펩티드가 이로운 당 소비 및/또는 발효 생산을 가짐이 도 17, 19 및 20으로부터 명백하다. 또한, 하기 실시예 18을 참조한다.

도 1은 균주 DS62504(도 1(a)), IMK307(도 1(b)) 및 IMK311(도 1(c))의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲) 및 에탄올(■) 농도 및 660 ㎚에서의 광학 밀도(OD660, ●)를 도시한다.
도 2는 균주 DS62504(도 2(a)), IMK307(도 2(b)) 및 IMK311(도 2(c))의 혐기성 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲) 및 에탄올(■) 농도 및 배출 기체 중 CO₂ 백분율(검은 실선)을 도시한다. 발효물에 글루코스-증식된 진탕 플라스크 배양물을 접종하였다.
도 3은 2% 아라비노스 및 다양한 농도의 글루코스(0, 0.11, 0.23, 0.65, 1.3 및 2.5%)를 함유하는 MY우레아 중의 균주 IMK318의 진탕 플라스크 배양물에 대한 660 ㎚에서의 광학 밀도(OD660)를 측정함으로써 측정된 증식 프로파일을 도시한다.
도 4는 표 3에 따라 연속적으로 이동된(시리즈 A: SF1, SF2 및 SF5) 균주 IMK318의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲) 및 에탄올(■) 농도 및 660 ㎚에서의 광학 밀도(OD660, ●)를 도시하며; 상기 단일 콜로니 단리물은 상기 일련의 진탕 플라스크 중에서 선택되었다(IMW018).
도 5는 표 3에 따라 연속적으로 이동된(시리즈 B: SF1, SF2 및 SF3) 균주 IMK318의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲) 및 에탄올(■) 농도 및 660 ㎚에서의 광학 밀도(OD660, ●)를 도시하며; 상기 단일 콜로니 단리물은 상기 일련의 진탕 플라스크 중에서 선택되었다(IMW017).
도 6은 균주 IMW017의 연속적인 혐기성 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲) 및 에탄올(■) 농도 및 배출 기체 중 CO₂ 백분율(회색 실선)을 도시한다.
도 7은 균주 IMW017의 연속적인 혐기성 배양 중 배출 기체 중 CO₂ 백분율(회색 실선) 및 증식률을 도시한다. 상기 비 증식률은 글루코스 및 아라비노스의 혼합물(●) 상에서 또는 오직 아라비노스 상에서만(◆) 배치 배양 중의 CO₂ 생성 프로파일로부터 유도된다.
도 8은 균주 IMW017의 혐기성의 연속적인 배치 배양 중 아라비노스(A) 및 글루코스 및 아라비노스의 혼합물(B)이 공급된 배지 중의 개별적인 배치들의 CO₂ 생성 프로파일을 도시한다. 상기 CO₂ 생성 프로파일들을 동등한 초기 CO₂ 생성 수준을 가정하여 정렬시킨다. 기호 안의 숫자들은 연속적인 배치 번호들을 가리킨다.
도 9는 균주 IMW017의 연속적인 혐기성 배치 배양의 배치 24 및 25 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲) 및 에탄올(■) 농도 및 배출 기체 중 CO₂ 백분율(회색 실선)을 도시한다.
도 10은 균주 DS62504, IMK307, IMK311, IMK318, IMW017 및 IMW018의 헥소키나제 효소 활성을 도시한다.
도 11은 2%의 글루코스 및 2%의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중의 균주 IMW023의 진탕 플라스크 배양 중 OD660(●), 아라비노스 농도(▲), 및 글루코스 농도(◆)를 도시한다.
도 12는 2%의 글루코스 및 2%의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중의 균주 IMW023의 연속적으로 이동된 배양물의 첫 번째(SF1) 및 24 번째(SF24) 진탕 플라스크 배양 중 OD660(●), 아라비노스 농도(▲), 및 글루코스 농도(◆)를 도시한다.
도 13은 2%의 글루코스 및 2%의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중의 균주 IMW023의 연속적으로 이동된 배양물의 개별적인 진탕 플라스크 배양에서 측정된 추정된 비 증식률을 도시한다.
도 14는 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중 균주 IMW023의 연속적인 혐기성 배치 배양 중 배출 기체 중의 CO₂ 백분율(회색 실선) 및 비 증식률, 및 개별적인 배치 배양의 비 증식률(●)을 도시한다. 회색 음영은 공기가 질소 기체 대신에 공급된 경우를 가리킨다. 화살표는 새로운 연속 배치의 시작을 가리킨다.
도 15는 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중 균주 IMW023의 연속적인 혐기성 배치 배양 중 배출 기체 중의 CO₂ 백분율(회색 실선), 아라비노스 농도(▲) 및 글루코스 농도(◆)를 도시한다.
도 16은 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중 균주 IMW023의 연속적인 혐기성 배치 배양 중 개별적인 배치들의 정렬된 CO₂ 생성 프로파일들을 도시한다. 상기 CO₂ 생성 프로파일들을 동등한 초기 CO₂ 생성 수준을 가정하여 정렬시킨다. 기호 안의 숫자들은 연속적인 배치 번호들을 가리킨다.
도 17은 균주 DS62504(도 17(a)), IMK307(도 17(b)), IMK311(도 17(c)), IMW017(도 17(d)), IMW018(도 17(e)) 및 IMW058(도 17(f)), IMW024(도 17(g)), IMW025(도 17(h)), IMW047(도 17(i)), IMW059(도 17(j)), IMW060(도 17(k)), IMW061(l))의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲) 및 에탄올(□) 농도 및 660 ㎚에서의 광학 밀도(OD660, ●)를 도시한다.
도 18은 균주 IMW047의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆) 및 아라비노스(▲) 농도를 도시한다.
도 19는 균주 CEN.PK 113-7D, IMK318, IMW017 및 IMW018의 GAL1 아미노산 정렬을 도시한다.
도 20은 균주 CEN.PK 113-7D, IMK318, IMW017 및 IMW018의 GAL2 아미노산 정렬을 도시한다.
도 21은 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중 균주 IMW059의 혐기성 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲), 에탄올(□) 농도, 바이오매스 건조 중량(●) 및 CO₂ 생성(회색 실선)을 도시한다.
도 22는 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중 균주 IMW060의 혐기성 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲), 에탄올(□) 농도, 바이오매스 건조 중량(●) 및 CO₂ 생성(회색 실선)을 도시한다.
도 23은 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 공급된 MY 배지 중 균주 IMW061의 혐기성 배양 중 글루코스(◆), 아라비노스(▲), 에탄올(□) 농도, 바이오매스 건조 중량(●) 및 CO₂ 생성(회색 실선)을 도시한다.
도 24는 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스의 혼합물 중에서 혐기성 배양 중 균주 DS62504(검은 점선), IMW059(검은 실선), IMW060(검은 실선) 및 IMW061(검은 대시 선)의 CO₂ 생성 프로파일들을 도시한다.
도 25는 배지 CFMM2M 상에서 균주 DS62504의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 만노스(◇), 아라비노스(▲) 및 에탄올(□) 농도를 도시한다.
도 26은 배지 CFMM2M 상에서 균주 IMW060의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 만노스(◇), 아라비노스(▲) 및 에탄올(□) 농도를 도시한다.
도 27은 배지 CFMM2M 상에서 균주 IMW061의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 만노스(◇), 아라비노스(▲) 및 에탄올(□) 농도를 도시한다.
도 28은 배지 CFMM1M 상에서 균주 DS62504의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 만노스(◇), 아라비노스(▲) 및 에탄올(□) 농도를 도시한다.
도 29는 배지 CFMM1M 상에서 균주 IMW060의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 만노스(◇), 아라비노스(▲) 및 에탄올(□) 농도를 도시한다.
도 30은 배지 CFMM1M 상에서 균주 IMW061의 진탕 플라스크 배양 중 글루코스(◆), 만노스(◇), 아라비노스(▲) 및 에탄올(□) 농도를 도시한다.
서열 목록의 간단한 설명
유전자 붕괴 카세트의 제작에 사용된 올리고뉴클레오티드:
서열번호: 1은 올리고뉴클레오티드 HXK2-disA의 서열을 나열한다.
서열번호: 2는 올리고뉴클레오티드 HXK2-disB의 서열을 나열한다.
서열번호: 3은 올리고뉴클레오티드 HXK1-disA의 서열을 나열한다.
서열번호: 4는 올리고뉴클레오티드 HXK1-disB의 서열을 나열한다.
서열번호: 5는 올리고뉴클레오티드 GLK1-disA의 서열을 나열한다.
서열번호: 6은 올리고뉴클레오티드 GLK1-disB의 서열을 나열한다.
진단을 목적으로 사용된 올리고뉴클레오티드:
서열번호 7은 올리고뉴클레오티드 KanA의 서열을 나열한다.
서열번호 8은 올리고뉴클레오티드 KanB의 서열을 나열한다.
서열번호 9는 올리고뉴클레오티드 HXK2-FW의 서열을 나열한다.
서열번호 10은 올리고뉴클레오티드 HXK2-RV의 서열을 나열한다.
서열번호 11은 올리고뉴클레오티드 HXK1-FW의 서열을 나열한다.
서열번호 12는 올리고뉴클레오티드 HXK1-RV의 서열을 나열한다.
서열번호 13은 올리고뉴클레오티드 GLK1-FW의 서열을 나열한다.
서열번호 14는 올리고뉴클레오티드 GLK1-RV의 서열을 나열한다.
서열번호 15는 HXK1의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 16은 HXK2의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 17은 GLK1의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 18은 GAL1의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 19는 YDR516C의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 20은 YLR446W의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 21은 HXK1의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 22는 HXK2의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 23은 GLK1의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 24는 GAL1의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 25는 YDR516C의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 26은 YLR446W의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 27은 올리고뉴클레오티드 GAL1-DisA의 서열을 나열한다.
서열번호 28은 올리고뉴클레오티드 GAL1-DisB의 서열을 나열한다.
서열번호 29는 올리고뉴클레오티드 GAL1-FW2의 서열을 나열한다.
서열번호 30은 올리고뉴클레오티드 GAL1-RV2의 서열을 나열한다.
서열번호 31은 올리고뉴클레오티드 HXK2-FW2의 서열을 나열한다.
서열번호 32는 올리고뉴클레오티드 HXK2-RV2의 서열을 나열한다.
서열번호 33은 올리고뉴클레오티드 HXK2-FW3의 서열을 나열한다.
서열번호 34는 올리고뉴클레오티드 HXK2-RV3의 서열을 나열한다.
서열번호 35는 올리고뉴클레오티드 HXK1-FW2의 서열을 나열한다.
서열번호 36은 올리고뉴클레오티드 HXK1-RV2의 서열을 나열한다.
서열번호 37은 올리고뉴클레오티드 HXK1-FW3의 서열을 나열한다.
서열번호 38은 올리고뉴클레오티드 HXK1-RV3의 서열을 나열한다.
서열번호 39는 올리고뉴클레오티드 GLK1-FW4의 서열을 나열한다.
서열번호 40은 올리고뉴클레오티드 GLK1-RV4의 서열을 나열한다.
서열번호 41은 올리고뉴클레오티드 GLK1-FW5의 서열을 나열한다.
서열번호 42는 올리고뉴클레오티드 GLK1-RV5의 서열을 나열한다.
서열번호 43은 GAL1(CEN.PK 113-7D)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 44는 GAL1(IMK318)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 45는 GAL1(IMW017)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 46은 GAL1(IMW018)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 47은 GAL2(CEN.PK 113-7D)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 48은 GAL2(IMK318)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 49는 GAL2(IMW017)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 50은 GAL2(IMW018)의 DNA 서열을 나열한다.
서열번호 51은 GAL1(CEN.PK 113-7D)의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 52는 GAL1(IMK318)의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 53은 GAL1(IMW017)의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 54는 GAL1(IMW018)의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 55는 GAL2(CEN.PK 113-7D)의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 56은 GAL2(IMK318)의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 57는 GAL2(IMW017)의 아미노산 서열을 나열한다.
서열번호 58은 GAL2(IMW018)의 아미노산 서열을 나열한다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위 전체를 통해, "포함하다" 및 "함유하는"이란 어휘 및 "포함하는", "포함", "함유하는" 및 "함유"와 같은 파생어는 일체를 포함시켜 해석해야 한다. 즉, 이들 어휘는, 내용상 허용되는 한, 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소 또는 정수들의 가능한 포함을 전하고자 한다. 관사 "하나의"는 본 발명에서 하나 또는 하나보다 많은(즉, 하나 또는 하나 이상) 상기 관사의 문법상 목적어를 지칭하는데 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나보다 많은 요소를 의미할 수 있다.

본 발명은 서열번호 55의 T219에 상응하는 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이때 상기 폴리펩티드는 서열번호 55와 50 % 이상의 서열 동일성을 갖고, 상기 폴리펩티드는 투과효소 활성을 갖는다. 일 실시양태에서, T219에 상응하는 위치에서 돌연변이는 C, P, G, A, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, E, K, R 또는 하나의 결실로 치환될 수 있다. X는 임의의 아미노산일 수 있고, X(2)는 2개의 X를 의미한다.

일 실시양태에서, 폴리펩티드는 치환 T219N 또는 T219Q를 갖는다. 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 치환 N376S 또는 N376T를 갖는다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 치환 T219N 및 N376S를 갖는다.

본원에서, GAL2는 고-친화력 갈락토키나아제-의존 및 저-친화력 갈락토키나아제-비의존 갈락토스 수송 과정 둘다에 요구되는 촉진된 확산 수송체이다. 이는 주요 촉진자 슈퍼패밀리인, 당 수송체(TC 2.A.1.1) 과에 속한다. "투과효소 폴리펩티드"는 또한 "폴리펩티드 투과효소" 또는 "폴리펩티드"로서 본원에서 명시된다. "투과효소 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드"는 본원에서 투과효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 일 실시양태에서, 투과효소 폴리펩티드는 서열번호 55와 60 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상 서열 동일성을 갖는다.

일 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 하나 이상의 하기 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하고:

(a) G90;

(b) G135;

(c) G147;

(d) G184-X(3)-G188-X(11)-E200-X(2)-P203-X(3)-R207-X(7)-Q215

(e) Q215;

(f) G345-X(1)-N347;

(g) Y352;

(h) Y446;

(i) E460;

(j) F504; 및/또는

(k) E521

이때, 폴리펩티드 중(a) 내지 (k)의 위치는 서열번호 55의 위치에 상응한다. 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 GXXXGXXXXXXXXXXXXEXXPXXXRXXXXXXXQ를 포함한다.

본원에서 돌연변이는 한 문자 아미노산 및 이들 아미노산의 위치에 의해 나타낸다. 예를 들어, A6은 여기서 서열번호 1의 특정 위치에서 아미노산(한 문자 코드), 즉, 단백질의 위치 6에서 A(알라닌)를 나타낸다. A6(L/N/Q/G/V/I/Y/S/E/K)은 여기서 특정 위치에서 아미노산의 돌연변이, 즉, 단백질의 위치 6에서 A(알라닌)가 임의의 L(류신), N(아스파라긴), Q(글루타민), G(글리신), V(발린), I(이소류신), Y(티로신), S(세린), E(글루탐산) 또는 K(리신)으로 교환되었음을 나타낸다.

본 발명의 투과효소 폴리펩티드는 당 투과효소 활성을 제외한 하나 이상의 다른 활성 및/또는 추가의 활성을 가질 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 투과효소 폴리펩티드는 전형적으로 당 투과효소 활성을 가질 것이다. 그러나, 본 발명의 투과효소 폴리펩티드는 하나 이상의 상기한 활성뿐만 아니라 또는 상기 활성과 다른 활성을 가질 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열

본원에 개시된 바와 같이 투과효소 폴리펩티드 및 이의 아미노산 서열에 따라, 당업자는 투과효소 폴리펩티드를 코딩하는 적합한 폴리뉴클레오티드를 결정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 투과효소 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열, 뿐만 아니라 이의 코딩 서열을 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단리되거나 합성될 수 있다. 본원에서 투과효소 폴리펩티드 및 투과효소 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드는 각각 합성 폴리펩티드, 합성 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 합성 폴리뉴클레오티드는 코돈 사용에서 최적화될 수 있고, 바람직하게는 국제특허출원공개 제 2006/077258 호 및/또는 제 PCT/EP2007/055943 호(이는 참고로서 본원에 혼입됨)에 기재된 방법에 따를 수 있다. 제 PCT/EP2007/055943 호는 코돈-쌍 최적화를 설명한다.

용어 "폴리뉴클레오티드 분자"는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단리된 형태로 존재하거나, 재조합 핵산 분자 또는 벡터에 포함될 수 있거나, 숙주 세포에 포함될 수 있다.

단어 "폴리펩티드"는 7개 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 쇄를 위해 본원에서 사용된다. 본원의 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 수식 또는 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여지고 아미노 말단에서부터 카복시 말단으로의 방향이다. 본원에서 사용된 아미노산의 한 문자 코드는 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 단백질은 이의 고유한 환경으로부터 제거된 폴리펩티드 또는 단백질로 의도된다. 예를 들어, 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은 임의의 적합한 기술, 예컨대, 문헌[Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)]에 개시된 단일-단계 정제 방법에 의해 실질적으로 정제된, 본 발명의 목적을 위해 단리된 고유한 또는 재조합 폴리펩티드로서 간주된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 투과효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 기술 및 본원에 제공된 서열 정보를 사용하여 단리되거나 합성될 수 있다.

본 발명의 투과효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 다르게는 유전체 DNA 및 표준 PCR 증폭 기술에 따른 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산은 적절한 벡터 내로 복제될 수 있고 DNA 서열 분석에 의해 특징화될 수 있다.

형질전환

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 따라서, 표준 형질전환 기술이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 이전에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 벡터를 포함하는 핵산 구축물에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 투과효소 폴리펩티드 단백질을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 작용적인 등가물 및 적합한 숙주 세포, 예를 들어 본 발명의 투과 효소의 발현이 발생하는 조건하에 이러한 벡터의 증식, 형질전환 또는 형질감염 방법을 포함하는 벡터(클로닝 및 발현 벡터를 포함)에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 또 다른 핵산을 이의 연결된 것에 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 복제가능한 벡터, 예를 들어 클로닝 또는 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 벡터는 호환가능한 숙주 세포 내로 핵산을 복제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 복제가능한 벡터 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계, 호환가능한 숙주 세포 내로 벡터를 도입하는 단계, 및 벡터의 복제를 유발할 수 있는 조건하에 숙주 세포의 증식 단계에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 하기에 기재된다.

발현 벡터는 형질전환될 숙주 세포, 목적 단백질의 발현 수준 등의 선택으로서 이러한 인자에 따를 수 있도록 고안됨이 당업자에게 인지될 것이다. 본 발명의 벡터, 예컨대 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입됨으로써 본원에 기재된 바와 같이 핵산에 의해 코딩된 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다. 본 발명의 벡터, 예컨대 재조합 발현 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 투과 효소 폴리펩티드 단백질의 발현을 위해 고안될 수 있다.

예를 들어, 투과효소 폴리펩티드는 세균 세포, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 곤충 세포(배큘로바이러스 발현 벡터를 사용), 사상균, 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에서 추가로 논의된다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 이하에 기재된다.

상기된 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당해 분야에 공지된다.

대부분의 사상균 및 효모에 대하여, 벡터 또는 발현 구축물은 바람직하게는 안정한 형질전환체를 수득하기 위해 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 그러나, 특정 효모에 대하여 또한 적합한 에피솜 형태의 벡터는 안정하게 혼입될 수 있고 고 수준 발현에서 이용가능하고, 이의 예는 각각 사카로마이세스 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)의 2μ 및 pKD1 플라스미드로부터 유래된 벡터, 또는 AMA 서열(예를 들어 아스페르길루스(Aspergillus)로부터의 AMA1)을 함유하는 벡터를 포함한다. 발현 구축물이 숙주 세포 게놈으로 통합되는 경우, 구축물은 상동 재조합을 사용하여 게놈의 무작위 좌위 또는 예정된 표적 좌위에서 통합되고, 표적 좌위의 경우에 바람직하게는 주로 발현된 유전자를 포함한다.

따라서, 본 발명에 유용한 발현 벡터는 염색체-, 에피솜 형태의- 및 바이러스-유래된 벡터, 예를 들어, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 요소, 바이러스, 예컨대 배큘로바이러스, 파포바 바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대 플라스미드 및 박테리오파지 유전적 요소, 예컨대 코스미드 및 파지미드로부터 유래된 것을 포함한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드가 배양 배지 내의 숙주 세포로부터 분비될 경우, 숙주 세포의 분비 경로에 폴리펩티드가 직접 새롭게 합성되도록 하기 위해 적절한 신호 서열이 폴리펩티드에 더해질 수 있다. 당업자는 특이적 숙주에 대한 적절한 신호 서열을 선택하는 것을 알고 있다.

벡터는 진핵 유전체 서열 또는 바이러스성 유전체 서열에 상동의 서열을 포함하는 RNA를 야기하는 폴리뉴클레오티드를 담당하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이는 숙주 세포의 게놈 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 도입을 허용할 것이다.

통합적인 클로닝 벡터는 통합될 숙주 세포내의 염색체 중 무작위 또는 예정된 표적 좌위에서 통합될 수 있다.

벡터 시스템은 단일 벡터, 예컨대 단일 플라스미드, 또는 2개 이상의 벡터, 예컨대 2개 이상의 플라스미드일 수 있고, 이는 함께 숙주 세포의 게놈 내에 도입될 전체 DNA를 함유한다.

벡터는 안티센스 방향으로 지향되어 안티센스 RNA의 생성을 위해 제공되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 외부 핵산(예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위해 당업계에 인지된 다양한 기술, 예컨대, 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 형질도입, 감염, 리포펙션, 양이온 지질 매개된 형질감염 또는 전기 천공법을 지칭하고자 한다. 숙주 세포의 형질전환화 또는 형질감염화를 위한 적합한 방법은 문헌[Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)] 및 다른 실험실 매뉴얼에서 발견될 수 있다.

이전에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 특허청구범위 제 1 항에 나타낸 돌연변이를 갖는 서열번호 55에 따른 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명에 따른 투과효소 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양으로부터 회수되고 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 정제를 위해 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물, 화학 합성 과정의 생성물, 및 원핵 또는 진핵 숙주, 예를 들어, 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포로부터 재조합 기술에 의해 생성된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 과정에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화될 수 있거나 비-당화될 수 있다. 게다가, 본 발명의 폴리펩티드는 초기 변이된 메티오닌 잔기를 또한 포함할 수 있고, 일부 경우에 숙주-매개된 과정의 결과일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생물학적인 활성 단편을 특색으로 한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주세포가 또한 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈에 이종일 수 있다. 용어 "이종"은 일반적으로 숙주 세포에 관한 것이고, 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 게놈에서 천연적으로 발생하지 않거나 폴리펩티드가 상기 세포에 의해 천연적으로 생성되지 않음을 의미한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포, 예를 들어, 본 발명에 의해 포함된 핵산을 함유하는 형질전환된 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포로 특징된다. "형질전환된 세포" 또는 "재조합 세포"는 재조합 DNA 기술에 의해 본 발명에 따른 핵산이 도입된(또는 원종의) 세포이다. 원핵 및 진핵 세포는 둘다 예를 들어, 세균, 균류 및 효모 등을 포함하고, 특히 예를 들어 사카로마이세스를 포함하는 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에가 바람직하다.

숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하도록 선택될 수 있거나, 특이적인 목적한 방식에서 유전자 생성물을 변이시키고 가공한다. 단백질 생성물의 이러한 변이(예를 들어, 글라이코실화) 및 가공(예를 들어, 분할)은 단백질의 작용화를 최적으로 촉진할 수 있다.

다양한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 과정 및 변이를 위한 특징 및 특이적 기작을 갖는다. 분자 생물학 및/또는 미생물학 분야의 숙련자에게 친숙한 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외부 단백질의 변이 및 가공을 목적하고 정확하게 보장하기 위해 선택될 수 있다. 이 때문에, 유전자 생성물의 1차 전사, 글라이코실화 및 인산화의 적절한 가공을 위한 세포 기관을 갖는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 당해 분야에 널리 공지된다.

필요에 따라, 상기 기재된 세포는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열의 발현(벡터에 의해)을 위해 제공하기 위한 조건하에 숙주 세포(예를 들어, 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염됨)를 배양하는 단계 및 임의적으로 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 복제가능한 벡터, 예를 들어 발현 벡터로 혼입될 수 있다. 벡터는 호환가능한 숙주 세포에서 핵산을 복제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 추가 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터에 도입하는 단계, 벡터를 호환가능한 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 벡터의 복제를 야기하는 조건하에 숙주 세포를 증식하는 단계에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다.

벡터는 상기 기재된 바와 같이 적합한 숙주 세포내로 형질전환되거나 형질감염되어 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공할 수 있다. 이 방법은 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열의 벡터에 의해 발현을 제공하기 위한 조건하에 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에서 표준 단리, 교잡법, 형질전환 및 클로닝 기술이 사용된다(예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]).

상동성 및 동일성

아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 일정한 수준의 유사성을 나타내는 경우 상동이라고 한다. 상동인 2 개 서열은 공통의 진화 기원을 가리킨다. 2 개의 상동 서열이 밀접하게 관련되는지 또는 더 멀게 관련되는지는 "일치성 퍼센트" 또는 "유사성 퍼센트"(각각 높거나 낮다)에 의해 지시된다. 논쟁의 여지는 있지만, "일치성 퍼센트" 또는 "유사성 퍼센트"를 나타내기 위해서, "상동성의 수준" 또는 "상동성 퍼센트"가 흔히 호환적으로 사용된다.

2 개 서열 간의 서열 비교 및 일치성 퍼센트의 측정을 수학적 연산을 사용하여 수행할 수 있다. 당업자는 여러 가지 상이한 컴퓨터 프로그램을 2 개 서열의 정렬 및 2 개 서열간의 상동성 측정에 이용할 수 있다는 사실을 알 것이다(문헌[Kruskal, J. B. (1983) An overview of squence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley]). 2 개 아미노산 서열 간의 일치성 퍼센트를 2 개 서열의 정렬을 위한 니들맨과 분치(Needleman and Wunsch) 연산을 사용하여 측정할 수 있다(문헌[Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453]). 상기 연산은 아미노산 서열들뿐만 아니라 뉴클레오티드 서열들을 정렬시킨다. 상기 니들맨-분치 연산은 컴퓨터 프로그램 NEEDLE에서 실행되었다. 본 발명의 목적을 위해서 엠보스(EMBOSS) 패키지로부터의 NEEDLE 프로그램을 사용하였다(버전 2.8.0 이상, 문헌[EMBOSS : The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277], http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열의 경우, 치환 행렬을 위해 EBLOSUM62가 사용된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, EDNAFULL이 사용된다. 다른 행렬들을 상세히 기술할 수 있다. 아미노산 서열들의 정렬에 사용된 임의의 매개변수들은 10의 끊김 벌점(gap-open penalty) 및 0.5의 끊김 확장 벌점(gap extension penalty)이다. 당업자는 모든 이러한 상이한 매개변수들이 약간 다른 결과를 제공할 것이지만 2 개 서열의 전체 일치성 백분율은 상이한 연산을 사용하는 경우에도 현저하게 변경되지 않음을 알 것이다.

전체적인 상동성 정의

상동성 또는 일치성은 임의의 끊김 또는 확장을 포함하여 전체 정렬 영역에 대해서 2 개의 완전한 서열들 간에 일치하는 합치의 백분율이다. 상기 2 개의 정렬된 서열들 간의 상동성 또는 일치성을 하기와 같이 계산한다: 상기 두 서열 중에 일치하는 아미노산을 나타내는 정렬에서 상응하는 위치의 수를 상기 끊김을 포함하는 정렬의 총 길이로 나눈다. 본원에서와 같이 정의된 일치성을 NEEDLE로부터 획득할 수 있으며 이를 "IDENTITY"로서 상기 프로그램의 결과에 표지한다.

최장 일치성 정의

2 개의 정렬된 서열들 간의 상동성 또는 일치성을 하기와 같이 계산한다: 상기 두 서열 중에 일치하는 아미노산을 나타내는 정렬에서 상응하는 위치의 수를 상기 정렬 중 총 끊김 수의 공제 후의 상기 정렬의 총 길이로 나눈다. 본 발명에서와 같이 정의된 일치성을 NOBRIEF 옵션을 사용하여 NEEDLE로부터 획득할 수 있으며 이를 "최장-일치성"으로서 상기 프로그램의 결과에 표지한다.

본원에 기재된 본 발명의 다양한 실시양태는 교차 결합될 수 있다.

당 조성물

본 발명에 따라 사용되는 당 조성물은 글루코스 및 하나 이상의 펜토스, 예를 들어 아라비노스 및/또는 자일로스를 포함한다. 상기 기준을 충족하는 임의의 당 조성물을 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 당 조성물 중의 임의의 당은 갈락토스 및 만노스이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 당 조성물은 하나 이상의 리그노셀룰로스 물질의 가수분해생성물이다. 본 발명에서 리그노셀룰로스는 바이오매스의 헤미셀룰로스 및 헤미셀룰로스 부분을 포함한다. 또한 리그노셀룰로스는 바이오매스의 리그노셀룰로스 분획을 포함한다. 적합한 리그노셀룰로스 물질들이 하기의 목록에서 발견될 수 있다: 과수원 토엽, 관목, 분쇄 폐기물, 도심 숲 폐기물, 일반 폐기물, 벌목 폐기물, 삼림 간벌, 단기 목재 작물, 산업 폐기물, 밀짚, 귀리짚, 볏짚, 보리짚, 호밀짚, 아마대, 콩 껍질, 벼 껍질, 볏짚, 옥수수 글루텐 사료, 귀리 껍질, 사탕수수, 옥수수 짚, 옥수수 대, 옥수수 속, 옥수수 껍데기, 스위치 그라스, 억새, 단수수, 카놀라 줄기, 대두 줄기, 프래리 그라스, 가마그라스, 강아지풀; 사탕무 펄프, 시트러스 열매 펄프, 종자 껍질, 셀룰로스성 동물 폐기물, 잔디 부스러기, 목화, 해초, 나무, 연재, 경재, 포플러, 소나무, 관목, 목초, 밀, 밀짚, 사탕수수 깍지, 옥수수, 옥수수 껍질, 옥수수 홉, 옥수수 핵, 핵으로부터의 섬유, 곡물의 습식 또는 건식 분쇄로부터의 생성물 및 부생성물, 도시 고형 폐기물, 폐지, 정원 폐기물, 초본 물질, 농업 잔사, 삼림 잔사, 도시 고형 폐기물, 폐지, 펄프, 종이 분쇄 잔사, 가지, 수풀, 줄기, 옥수수, 옥수수 껍질, 에너지 작물, 삼림, 열매, 꽃, 곡물, 잔디, 초본 작물, 잎, 껍질, 침엽수 잎, 통나무, 뿌리, 묘목, 관목, 스위치 그라스, 나무, 식물, 열매 껍질, 덩굴, 사탕무 펄프, 밀 미들링, 귀리 껍질, 경재 또는 연재, 농사로부터 발생하는 유기 폐기 물질, 삼림 목재 폐기물, 또는 이들의 임의의 2 개 이상의 조합.

리그노셀룰로스로부터 유래한 일부 적합한 당 조성물 및 그의 가수분해생성물의 당 조성물의 개관을 표 1에 나타낸다. 나열된 리그노셀룰로스는 옥수수 속, 옥수수 섬유, 벼 껍질, 멜론 껍질, 사탕무 펄프, 밀짚, 사탕수수 버개스, 목재, 관목 및 올리브 압착물을 포함한다.

리그노셀룰로스 물질로부터의 당 조성물의 개관. Gal = 갈락토스, Xyl = 자일로스, Ara = 아라비노스, Man = 만노스, Glu = 글루코스, Rham = 람노스. 갈락토스 백분율(% Gal) 및 문헌 출처를 제공한다.
리그노셀룰로스 물질	Gal	Xyl	Ara	Man	Glu	Rham	합계	%. Gal .	문헌
옥수수 속 a	10	286	36		227	11	570	1,7	(1)
옥수수 속 b	131	228	160		144		663	19,8	(1)
벼 껍질 a	9	122	24	18	234	10	417	2,2	(1)
벼 껍질 b	8	120	28		209	12	378	2,2	(1)
멜론 껍질	6	120	11		208	16	361	1,7	(1)
사탕무 펄프	51	17	209	11	211	24	523	9,8	(2)
아이다호(Idaho) 밀짚	15	249	36		396		696	2,2	(3)
옥수수 섬유	36	176	113		372		697	5,2	(4)
줄기 버개스	14	180	24	5	391		614	2,3	(5)
옥수수 짚	19	209	29		370		626		(6)
아델(Athel) (목재)	5	118	7	3	493		625	0,7	(7)
유칼립투스(Eucalyptus) (목재)	22	105	8	3	445		583	3,8	(7)
CWR (목초)	8	165	33		340		546	1,4	(7)
JTW (목초)	7	169	28		311		515	1,3	(7)
MSW	4	24	5	20	440		493	0,9	(7)
리드 카나리 그라스 식물	16	117	30	6	209	1	379	4,2	(8)
리드 카나리 그라스 종자	13	163	28	6	265	1	476	2,7	(9)
올리브 압착물 잔사	15	111	24	8	329		487	3,1	(9)

표 1로부터, 상기 리그노셀룰로스에서 다량의 당이 글루코스, 자일로스, 아라비노스 및 갈락토스의 형태로 존재함이 분명하다. 따라서 글루코스, 자일로스, 아라비노스 및 갈락토스의 발효 생성물로의 전환은 경제적으로 대단히 중요하다. 또한 만노스가 일부 리그노셀룰로스 물질 중에, 대개는 앞서 언급한 당보다 적은 양으로 존재한다. 따라서 유리하게는 또한 만노스가 상기 효모 세포에 의해 전환된다.

형질전환된 숙주 세포

일 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 자일로스 이성화효소 유전자의 하나 이상의 복제 및/또는 자일로스 환원효소 및/또는 자일리톨 탈수소효소의 하나 이상의 복제, 및 araA, araB 및 araD의 10 개 중 2 개 복제 유전자를 포함할 수 있고, 이때 이들 유전자는 세포 게놈에 융화된다.

일 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 유전자, 예를 들어 상기 자일로스 이성화효소 유전자 및/또는 자일로스 환원효소 및/또는 자일리톨 탈수소효소의 하나 이상의 복제, araA, araB 및 araD의 10 개 중 2 개 복제 유전자를 포함할 수 있고, 형질전환된 숙주 세포 게놈에 융화된다.

복제 수는 임의의 공지된 방법으로 당업자에 의해 측정될 수 있다. 실시예에서, 적합한 방법이 기재된다.

일 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 글루코스, 아라비노스, 자일로스 및 갈락토스를 발효시킬 수 있다.

일 실시양태에서, 세포는 90 % 이상의 글루코스, 자일로스 아라비노스, 갈락토스 및 만노스를 발효 생성물로 전환시킬 수 있다. 일 실시양태에서, 세포는 91 % 이상, 92 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상 또는 100 %의 모든 글루코스, 자일로스 아라비노스, 갈락토스 및 만노스를 발효 생성물로 전환시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서 형질전환된 숙주 세포는 하나 이상의 추가의 당, 바람직하게는 C5 및/또는 C6 당, 예를 들어 만노스를 발효시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서 형질전환된 숙주 세포는 형질전환된 숙주 세포를 자일로스로 발효시키는 하나 이상의 xylA-유전자, XYL1 유전자 및 XYL2 유전자 및/또는 XKS1-유전자; 알도스 환원효소(GRE3) 유전자의 결실; 세포에서 펜토스 인산 경로를 통해 플럭스를 증가시키는 PPP-유전자 TAL1, TKL1, RPE1 및 RKI1의 과발현을 포함한다.

일 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 산업용 세포, 보다 바람직하게는 산업용 효모이다. 산업용 세포 및 산업용 효모 세포를 하기와 같이 정의할 수 있다. 산업 공정에서 (효모) 세포의 생존 환경은 실험실에서와 현저하게 상이하다. 산업용 효모 세포는 상기 과정 동안 변할 수 있는 복잡한 환경 조건 하에서 잘 수행될 수 있어야 한다. 상기와 같은 변동은 영양 공급원, pH, 에탄올 농도, 온도, 산소 농도 등의 변화를 포함하고, 이들은 사카로마이세스 세레비지아에의 세포 증식 및 에탄올 생산에 잠재적으로 영향을 미친다. 불리한 산업 조건 하에서, 상기 환경 허용성 균주들은 확고한 증식과 생산을 허용해야 한다. 산업용 효모 균주는 일반적으로 상기 균주가 사용되는 분야에서, 예를 들어 제빵 산업, 주류 산업, 와인 제조 및 에탄올 산업에서 존재할 수 있는 환경 조건의 변화들에 대해 더 확고하다. 일 실시양태에서, 상기 산업용 효모 세포를 산업용 숙주 세포를 토대로 제작하며, 여기에서 상기 제작을 이후에 개시하는 바와 같이 수행한다. 산업용 효모(사카로마이세스 세레비지아에)의 예는 에탄올 레드(Ethanol Red: 등록상표)(퍼멘티스(Fermentis)) 페르미놀(Ferminol: 등록상표)(디에스엠(DSM)) 및 써모색(Thermosacc: 등록상표)(랄레맨드(Lallemand))이다.

일 실시양태에서 형질전환된 숙주 세포는 억제제 허용성이다. 억제제 허용성은 억제 화합물에 대한 내성이다. 리그노셀룰로스 중의 억제성 화합물의 존재 및 수준은 공급원료, 전처리 방법 가수분해 공정의 변화에 따라 광범위하게 다양할 수 있다. 억제제 범주의 예는 카복실산, 푸란 및/또는 페놀계 화합물이다. 카복실산의 예는 락트산, 아세트산 또는 폼산이다. 푸란의 예는 푸르푸랄 및 하이드록시-메틸푸르푸랄이다. 페놀계 화합물의 예는 바닐린, 시링산, 페룰산 및 쿠마르산이다. 억제제의 전형적인 양은 카복실산의 경우 공급원료, 전처리 및 가수분해 조건에 따라 수 그램/리터 내지 20 그램/리터 이상이다. 푸란의 경우 공급원료, 전처리 및 가수분해 조건에 따라 수백 밀리그램/리터 내지 수 그램/리터이다.

페놀계 화합물의 경우 공급원료, 전처리 및 가수분해 조건에 따라 수십 mg/ℓ 내지 1 g/ℓ이다.

본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포는 억제제 허용성이다, 즉 상기 세포는 상기 세포가 통상적인 전처리 및 가수분해 조건과 관련된 수준의 통상적인 억제제를 견딜 수 있으며, 따라서 상기 효모 세포는 광범위한 용도를 찾을 수 있다, 즉 상기 세포는 상이한 공급원료, 상이한 전처리 방법 및 상이한 가수분해 조건에 대해 높은 응용성을 갖는다.

일 실시양태에서, 산업용 형질전환된 숙주 세포를 억제제 허용성 숙주 세포를 토대로 제작하며, 여기에서 상기 제작을 이후에 개시하는 바와 같이 수행한다. 억제제 허용성 숙주 세포를 문헌[Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858](여기에서 억제제 허용성 사카로마이세스 세레비지아에 균주 ATCC 26602가 선택되었다)에 예시되는 바와 같이, 억제제 함유 물질 상에서의 증식에 대해서 균주를 선별함으로써 선택할 수 있다.

일 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 표지-부재이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "표지"란 용어는 상기 표지를 함유하는 숙주 세포의 선택 또는 선별을 허용하는 특징 또는 표현형을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 표지-부재는 표지가 형질전환된 숙주 세포 중에 필수적으로 존재하지 않음을 의미한다. 표지-부재임은 항생제 표지가 형질전환된 숙주 세포의 제작에 사용되었고 그 후에 제거되는 경우 특히 유리하다. 표지의 제거를 임의의 적합한 종래 기술의 기법, 예를 들어 세포 내 재조합을 사용하여 수행할 수 있다. 표지의 적합한 제거 방법을 실시예에 예시한다.

형질전환된 숙주 세포는 식물 바이오매스, 셀룰로즈, 헤미셀룰로즈, 펙틴, 녹말, 녹말 유도체, 예를 들어 발효성 당으로 전환할 수 있다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 하나 이상의 효소, 예컨대 셀룰로스를 글루코스 단량체로 전환하기 위해 필요한 셀룰라제(엔도셀룰라제 또는 엑소셀룰라제) 및 헤미셀룰로스를 자일로스 및 아라비노스 단량체로 전환하기 위해 필요한 헤미셀룰라제(엔도- 또는 엑소-자일라네즈 또는 아라비네즈), 펙틴을 글루쿠론산 및 갈락투론산으로 전환할 수 있는 펙티나제 또는 녹말을 글루코스 단량체로 전환하는 아밀라제를 포함할 수 있다.

형질전환된 숙주 세포는 피루베이트의 목적하는 발효 생성물, 예를 들어 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 푸마르산, 말산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 또는 세팔로스포린으로의 전환에 필요한 효소 활성들을 추가로 포함할 수 있다.

일 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 자연적으로 알콜 발효, 바람직하게는 혐기성 알콜 발효를 할 수 있는 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 바람직하게는 에탄올에 대한 높은 허용성, 낮은 pH(즉, 약 5, 약 4, 약 3 또는 약 2.5 미만의 pH에서 증식할 수 있는) 및 유기물에 대한 높은 허용성 및/또는 승온에 대한 높은 허용성을 갖는다.

형질전환된 숙주 세포의 상기 특징 또는 활성 중 어느 하나가 상기 세포 중에 자연적으로 존재하거나 또는 유전자 변형에 의해 도입되거나 변형될 수 있다.

형질전환된 숙주 세포의 구성

실시양태에 따라, 유전자는 숙주 세포 내로 도입 및 형질전환된 숙주 세포를 생성하기 위한 적응 진화에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다:

(a) 강력한 구성 프로모터의 제어하에 유전자 araA, araB 및 araD로 이루어진 클러스터:

(b) 임의적인 강력한 구성 프로모터의 제어하에 PPP-유전자 TAL1, TKL1, RPE1 및 RKI1; 및 알도스 환원효소 유전자의 결실로 이루어진 클러스터;

(c) 강력한 구성 프로모터의 제어하에 xylA-유전자 및 XKS1-유전자로 이루어진 클러스터;

(d) 강력한 구성 프로모터의 제어하에 xylA 유전자를 포함하는 구축물로서, 다양한 좌위 상에 게놈으로 통합될 수 있는 능력을 갖는 구축물.

상기 세포는 재조합 발현 기술을 사용하여 구성될 수 있다.

재조합 발현

형질전환된 숙주 세포는 재조합 세포이다. 즉, 형질전환된 숙주 세포는 문제의 세포 중에 자연적으로 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 서열로 형질전환되거나, 상기 서열로 유전자 변형된다.

세포에서 효소의 재조합 발현뿐만 아니라 형질전환된 숙주 세포의 추가적인 유전자 변형을 위한 기법들은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로 상기와 같은 기법은 관련된 서열을 포함하는 핵산 구조물에 의한 세포의 형질전환을 수반한다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 표준 편람, 예를 들어 문헌[Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 또는 [F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]으로부터 공지되어 있다. 숙주 세포의 형질전환 및 유전자 변형에 대한 방법들은 예를 들어 유럽특허 제 0635 574 호, 국제특허출원공개 제 98/46772 호, 국제특허출원공개 제 99/60102 호, 국제특허출원공개 제 00/37671 호, 국제특허출원공개 제 90/14423 호, 유럽특허 제 0481008 호, 유럽특허 제 0635574 호 및 미국 특허 제 6,265,186 호로부터 공지되어 있다.

전형적으로, 핵산 구축물은 플라스미드, 예를 들어 저복제 플라스미드 또는 고복제 플라스미드일 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 단일 또는 다중 복제, 예를 들어 뉴클레오티드 구축물의 다중 복제 또는 효소 서열의 다중 복제를 갖는 구축물의 사용을 포함할 수 있다.

핵산 구축물은 에피솜으로 유지될 수 있고 따라서 자율 복제를 위한 서열, 예컨대 염색체 복제 서열을 포함한다. 적합한 에피솜 형태의 핵산 구축물은 예를 들어 효모 2μ 또는 pKD1 플라스미드(문헌[Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975]), 또는 AMA 플라스미드(문헌[Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489])에 기초할 수 있다. 다르게는, 각 핵산 구축물은 세포의 게놈으로 하나 이상의 복제가 통합될 수 있다. 세포의 게놈으로의 통합은 비-상동 재조합에 의해 무작위로 발생할 수 있지만, 바람직하게는 핵산 구축물은 당해 분야에 널리 공지된 상동 재조합에 의해 세포의 게놈으로 통합될 수 있다(예를 들어, 국제특허출원공개 제 90/14423 호, 유럽특허 제 0481008 호, 유럽특허 제 0635 574 호 및 미국특허 제 6,265,186 호 참조).

대부분의 에피솜 형태 또는 2μ 플라스미드는 각 세대 후 약 10^-2 개 이상의 세포를 손실하는 효모에서 비교적 불안정하다. 선택적인 증식의 조건하에서도, 오직 60 % 내지 95 %의 세포가 에피솜 형태의 플라스미드를 유지한다. 대부분의 에피솜 형태의 플라스미드의 복제 개수는 cir⁺ 숙주의 세포당 20 내지 100 개의 범위이다. 그러나, 플라스미드는 세포 사이에 동일하게 분포되지 않고, 개체 중에 세포당 복제 개수의 높은 변화량을 갖는다. 통합적인 플라스미드로 형질전환된 균주는 심지어 선택적인 압력의 부재하에 극도로 안정하다. 그러나, 플라스미드 손실은 벡터 서열의 루프 아웃(loop out)을 야기하는 나란히 반복된 DNA 사이에서 상동 재조합에 의해 약 10^-3 내지 10^-4의 빈도에서 발생할 수 있다. 바람직하게는, 안정한 통합의 경우에 벡터 고안은 통합된 구축물의 루프 아웃인 선택 표지 유전자(이는 또한 분자 내 상동 재조합에 의해 발생함)의 손실에 따라 더 이상 가능하지 않다. 따라서 바람직하게는 유전자는 안정하게 통합된다. 안정한 통합은 게놈 내로의 통합으로서 본원에 한정되고, 통합된 구축물의 루프 아웃은 더 이상 가능하지 않다. 바람직하게는 선택 표지가 없다. 전형적으로, 서열을 코딩하는 효소는 효소 서열의 전사 및/또는 번역을 위해 제공할 수 있거나 도울 수 있는 하나 이상의 핵산 서열에 가능하게 연결될 것이다.

용어 "가능하게 연결된"은 기재된 요소가 이의 의도된 방식에서 작용하도록 허용되는 관계인 병치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 상기 프로모터 또는 인핸서의 코딩 서열에 가능하게 연결된다.

본원에 사용된 용어 "프로모터"는 하나 이상의 유전자(유전자의 전사 개시 부위의 전사의 방향과 관련된 상부에 위치됨)의 전사를 조절하기 위한 기능인 핵산 단편을 지칭하고, DNA-의존 RNA 폴리머라제에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위 및 당업자에게 공지된 임의의 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인된다. "구성" 프로모터는 대부분의 환경 및 개발 조건하에 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 개발 조절하에 활성인 프로모터이다.

본 발명에 따른 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는 발현될 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 고유하지 않을 수 있다(즉, 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열(코딩 서열)에 이종인 프로모터임). 그러나, 프로모터는 숙주 세포에 상응할 수 있다(즉, 내생임).

프로모터는 광범위하게 이용가능하고 당업자에게 공지된다. 이러한 프로모터의 적합한 예는 예를 들어 당분해 유전자로부터의 프로모터, 예컨대 포스포프룩토키나제(PFK), 3탄당 인산 이성질체화 효소(TPI), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GPD, TDH3 또는 GAPDH), 피루베이트 키나아제(PYK), 효모 또는 사상균으로부터의 포스포글리세라이트 키나아제(PGK) 프로모터를 포함하고; 효모로부터의 상기 프로모터에 관한 보다 구체적인 것은 국제특허출원공개 제 93/03159 호에서 발견될 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 유전자 프로모터, 락타아제 유전자 프로모터(LAC4), 알코올 탈수소효소 프로모터(ADH1, ADH4 등) 및 에놀라아제 프로모터(ENO)를 코딩하는 리보솜 단백질이다. 구조성 및 유도성 둘다인 다른 프로모터, 및 인핸서 또는 상부 활성화 서열은 당업자에게 공지될 것이다. 본 발명의 숙주 세포에서 사용된 프로모터는 필요에 따라 변이되어 이의 제어 특징에 영향을 미칠 수 있다. 본 맥락에서 적합한 프로모터는 구조성 및 유도성 둘다 천연 프로모터일 뿐만 아니라 조작된 프로모터를 포함하고, 이는 당업자에게 널리 공지된다. 진핵 숙주 세포에서 적합한 프로모터는 GAL7, GAL10 또는 GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1 및 AOX1일 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 및 TDH3을 포함한다.

형질전환된 숙주 세포에서, 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 산 서열의 3'-말단은 바람직하게는 전사 종결자 서열에 가능하게 연결된다. 바람직하게는 종결자 서열은 숙주 세포의 선택, 예컨대 효모 종의 선택을 가능하게 한다. 어떤 경우에도 종결자의 선택은 중요하지 않고; 예를 들어 비-효모, 원핵, 유전자로부터 선택될 경우, 종결자가 때때로 작동할 수 있을지라도, 임의의 효모 유전자로부터일 수 있다. 일반적으로 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 종결자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 종결자는 형질전환된 숙주 세포에서 넌센스 매개된 mRNA 깨짐을 막기 위해 돌연변이와 결합된다(예를 들어, 문헌[Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482] 참조).

전사 종결 서열은 바람직하게는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.

임의적으로, 선택가능한 표지는 본 발명에서 사용하기에 적합한 핵산 구축물로 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "표지"는 표지를 함유하는 숙주 세포의 선택 또는 스크리닝을 허용하는 형질을 특성을 코딩하는 유전자 또는 표현형을 지칭한다. 표지 유전자는 적절한 항생제가 형질전환되지 않은 세포 중에서 형질전환된 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있는 항생제 내성 유전자일 수 있다. 적합한 항생제 내성 표지의 예는 예를 들어 다이하이드로폴레이트 환원효소, 하이그로마이신-B-포스포전이효소, 3'-O-포스포전이효소 II(카나마이신, 네오마이신 및 G418 내성)를 포함한다. 항생제 내성 표지는 배수체 숙주 세포의 형질전환을 위해 가장 편리할 수 있다. 또한 무항생 내성 표지는, 예컨대, 영양요구 표지(URA3, TRP1, LEU2) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) TPI 유전자(문헌[Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130]에 의해 기재됨)가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서 핵산 구축물로 형질전환된 숙주 세포는 표지 유전자가 없다. 재조합 표지 유전자가 없는 미생물 숙주 세포를 구성하기 위한 방법은 유럽특허 제 635 574 호에 개시되고 양방향 작용성 표지, 예컨대 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) amdS(아세타미다제) 유전자 또는 효모 URA3 및 LYS2 유전자의 사용에 기초한다. 다르게는, 스크리닝 가능한 표지, 예컨대 녹색 형광 단백질, lacL, 루시퍼라제, 클로람페니콜 아세틸전이효소, 베타-글루쿠로니다제는 형질전환된 세포를 스크리닝하기 위해 허용되는 본 발명의 핵산 구축물로 혼입될 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 핵산 구축물에 존재할 수 있는 임의적인 추가 요소는 하나 이상의 선도 서열, 인핸서, 통합 인자, 및/또는 리포터 유전자, 인트론 서열, 센트로머, 텔로머 및/또는 기질 부착(MAR) 서열을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 핵산 구축물은 자율 복제를 위한 서열, 예컨대 ARS 서열을 추가로 포함할 수 있다.

따라서 재조합 공정은 공지된 재조합 기술로 실행될 수 있다. 다양한 방식은 형질전환된 숙주 세포에서 효소의 발현 및 과발현에 대하여 당업자에게 공지된다. 특히, 효소는 숙주 세포에서 효소에 대한 유전자 코딩의 복제 개수를 증가시키는 방법에 의해, 예를 들어 숙주 세포의 게놈 중 유전자의 추가적인 복제를 통합하는 방법에 의해, 에피솜 형태의 다중 복제 발현 벡터로부터 유전자를 발현하는 방법에 의해 또는 유전자의 다중 복제를 포함하는 에피솜 형태의 발현 벡터를 도입하는 방법에 의해 과발현될 수 있다.

다르게는, 본 발명의 숙주 세포에서 효소의 과발현은 과발현될 효소를 코딩하는 서열에 고유하지 않은 프로모터, 즉 가능하게 연결된 코딩 서열에 이종인 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 비록 프로모터가 바람직하게는 가능하게 연결된 코딩 서열에 이종일지라도, 프로모터가 상동인, 즉, 숙주 세포에 내성인 것이 또한 바람직하다. 바람직하게는 이종 프로모터는 코딩 서열에 고유한 프로모터보다 코딩 서열을 포함하는 전사의 높은 정상 상태 수준(또는 보다 전사 분자를 생성할 수 있는, 즉 시간의 단위당 mRNA 분자)으로 생성할 수 있다. 이 맥락에서 적합한 프로모터는 구조성 및 유도성 모두 천연 프로모터뿐만 아니라 조작된 프로모터를 포함한다.

일 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 표지가 없고, 이는 영양요구 또는 우성 표지가 없음을 의미하고, 특히 항생제 내성 표지는 게놈 또는 추가-염색체로 존재한다.

상기 언급된 효소의 과발현을 위해 사용된 코딩 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 상응할 수 있다. 그러나, 숙주에 이종인 코딩 서열이 사용될 수 있다.

유전적으로 변이된 세포에서 효소의 생성을 언급하는 경우, 효소의 과발현은 동일한 조건하에 비변이된 숙주 세포에 비해 효소가 높은 수준의 특이적 촉매 활성에서 생성됨을 의미한다. 일반적으로 이는 효소학적으로 활성 단백질(또는 다중-아단위 효소의 경우에서 단백질)이 동일한 조건하에 비변이된 숙주 세포에 비해 더 높은 정상 상태 수준에서 오히려 더욱 더 많은 양을 생성함을 의미한다. 유사하게는 이는 효소학적으로 활성 단백질을 코딩하는 mRNA가 동일한 조건하에 비변이된 숙주 세포에 비해 더 높은 정상 상태 수준에서 오히려 더욱 다시 더 많은 양을 생성함을 의미한다. 바람직하게는 숙주에서, 과발현될 효소는 과발현을 야기하는 유전자 변형을 제외한 유전적으로 동일한 균주에 비해 약 1.1, 약 1.2, 약 1.5, 약 2, 약 5, 약 10 또는 약 20의 하나 이상의 인자에 의해 과발현된다. 이는 이들 수준의 과발현이 정상 상태 수준의 효소의 활성, 정상 상태 수준의 효소의 단백질뿐만 아니라 정상 상태 수준의 효소를 코딩하는 전사에 적용할 수 있음이 이해될 것이다.

적응

적응은 진화 과정으로서, 집단이 이의 서식지 또는 서식처에 더욱 적합하도록(적응되도록) 된다. 이 과정은 여러 세대에 걸쳐 발생하고, 생물학의 기본 현상 중 하나이다.

또한, 용어 "적응"은 유기체의 생존에 대해 특히 중요한 특징을 지칭할 수 있다. 이러한 적응은 자연 선택에 의해 보다 성공적으로 재생성되기에 더욱 적합한 형태에 의해 가변적인 집단에서 발생한다.

환경적인 조건의 변화는 새로운 조건하에 유기체의 적응도를 개선하는 이후의 적응의 선택적인 이점에 영향을 미치는, 자연 선택의 결과로 달라진다. 극한 환경적인 변화의 경우, 유익한 적응의 외관 및 고정은 생존에 필수적일 수 있다. 다수의 상이한 인자, 예컨대 양분 유효도, 온도 및 산소의 유효성 등은 진화에 적응하도록 작용할 수 있다.

적응도

적응성(유기체가 주어진 서식지에서 살 수 있고 재생성할 수 있는 정도)과 적응도 사이에 명백한 관련성이 있다. 적응도는 추정치이고 자연 선택의 비율의 예측 변수이다. 자연 선택의 적용에 의해 유전가능한 경우, 다른 표현형의 상대 빈도는 시간에 달라질 것이다.

유전적 변화

자연 선택이 집단의 유전적 가변성에서 작용하는 경우, 유전적 변화는 근본적인 기작이다. 이 방식에 의해, 집단은 유전적으로 이의 환경에 적응한다. 유전적 변화는 볼 수 있는 구조를 야기할 수 있거나, 변화된 서식지에 적합한 방식으로 유기체의 생리적인 활성을 조정할 수 있다.

서식지의 변화는 종종 발생할 수 있다. 따라서, 적응 과정은 결코 마침내 완료되지 않는다. 동시에, 환경적인 변화가 점진적으로 발생하고, 종은 점점 더 이의 환경에 적응할 수 있게 된다. 이에 반해서, 환경에서의 변화는 비교적 빠르게 발생하고, 이어서 종은 점점 덜 적응하도록 될 수 있다. 적응은 유전적 과정이고, 집단의 서식지 또는 환경이 변하지 않을 경우, 상기 과정은 어느 정도까지 줄곧 이어진다.

적응 진화

형질전환된 숙주 세포는 이들의 제조 중 적응 진화에 이용된다. 형질전환된 숙주 세포는 목적한 당, 바람직하게는 단독 탄소원으로서, 더욱 바람직하게는 혐기 조건하에 증식을 위해 자발적 또는 유도된(예를 들어 방사선 또는 화학 물질에 의해) 돌연변이의 선택에 의해 당 이용에 적용될 수 있다. 돌연변이의 선택은 예를 들어 문헌[Kuyper et al., FEMS Yeast Res. 4: 655-664 (2004)]에 기재된 바와 같이 배양물의 연속 이동을 포함하는 기술, 또는 케모스태트 배양 중 선택적인 압력하의 배양에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 바람직한 숙주 세포의 경우 돌연변이의 선택에 의해 수득된 변이를 포함하는, 상기 기재된 하나 이상의 유전자 변형은 탄소원으로서, 바람직하게는 단독 탄소원으로서, 바람직하게는 혐기 조건하에 자일로스에 증식하는 능력을 숙주 세포에게 수여한다. XI이 유전자를 자일로스로 전환하도록 사용된 경우, 바람직하게는 세포는 자일리톨을 본질적으로 생성하지 않고, 예를 들어 생성된 자일리톨은 검출치 미만이거나, 예를 들어 기본적인 질량에서 소비된 약 5, 약 2, 약 1, 약 0.5 또는 약 0.3 % 미만의 탄소이다.

적응 진화는 또한 예를 들어 문헌[Wisselink H.W. et al, Applied and Environmental microbiology Aug. 2007, p. 4881-4891]에 기재되어 있다.

적응 진화의 일 실시양태에서 상이한 매질 중 반복된 주기의 연속 증식을 갖는 반복된 배치 배양으로 이루어진 양생은 예를 들어 상이한 조성물을 갖는 3개의 매질(글루코스, 자일로스 및 아라비노스; 자일로스 및 아라비노스)이 적용된다. 문헌[Wisselink et al.(2009) Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2009, p. 907-914]을 참조한다.

효모 형질전환 및 유전적 안정성

유전 공학, 즉, 효모 세포와 재조합 DNA의 형질전환은 1978년에 처음으로 실현 가능하게 되었다(문헌[Beggs, 1978]; 문헌[Hinnen et al., 1978]). 효모에서 재조합 DNA 기술은 그 이후에 그 자체로 달성되었다. 다수의 상이한 벡터 구축물이 이용가능하다. 일반적으로, 이들 플라스미드 벡터(셔틀(shuttle) 벡터라 불림)는 복제 기원 및 선택 표지(종종 β락타메이즈 유전자, ampR)로 이루어진 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 벡터로부터 유래된 유전적 물질을 함유하고, 이는 효모 세포로 형질전환하기 전 에스케리치아 콜라이 중에 증식될 수 있도록 한다. 게다가, 셔틀 벡터는 효모 중에 선택을 위한 선택 표지를 함유한다. 표지는 특정 아미노산 또는 뉴클레오티드의 합성을 위한 효소를 코딩하여, 상응하는 유전체 결실(또는 돌연변이)을 운반하는 세포가 영양요구 또는 독립영양에 대해 고려되는 유전자일 수 있다. 다르게는, 이들 벡터는 이종 우성 저항성 표지를 함유하고, 이는 특정 항생제, 예컨대 g418(제넥티신), 하이그로마이신B 또는 플레오마이신에 대하여 내성인 재조합 효모 세포(즉, DNA를 취하고 표지 유전자를 발현하는 세포)를 제공한다. 게다가, 다른 방법이 널리 존재할지라도, 이들 벡터는 외부 DNA를 이들 부위로 클로닝할 수 있는 (혼합된) 제한 부위(다중 클로닝 부위 또는 MCS)의 서열을 함유할 수 있다.

통상적으로, 하기 4개 유형의 셔틀 벡터가 추가 유전적 요소의 존재 또는 부재에 의해 구별될 수 있다:

- 제한에 의해 개방되고 선형화된 DNA가 효모 세포의 형질전환에 사용될 경우, 표지 또는 또 다른 유전자의 좌위에서 숙주 게놈으로 융화된 상동 재조합에 의한 통합 플라스미드(YIp). 이는 일반적으로 게놈 중 이 특정 부위에서 삽입된 외부 DNA의 하나의 복제의 존재를 야기한다.

- 효모 세포 중 자율 복제를 위해 필요한 2 μ 플라스미드 DNA 서열의 부분을 운반하는 에피솜 형태의 플라스미드(YEp). 형질전환된 플라스미드의 다중 복제는 효모 세포에서 증식되고 에피솜으로서 유지된다.

- 수백배 증식될 형질전환된 플라스미드를 허용하는 효모 복제 기원(ARS, 자율적으로 복제된 서열)을 운반하는 자율 복제 플라스미드(YRp).

- ARS 서열외에 통상적으로 안정한 유사 분열분리를 보장하고 일반적으로 자가 복제된 플라스미드의 복제 수를 단지 하나로 감소시키는 중심립 서열(핵 염색체 중 하나로부터 유래됨)을 운반하는 CEN 플라스미드(YCp).

이들 플라스미드는 형질전환에 의해 효모 세포 내로 도입된다. 효모 세포의 형질전환은 여러 상이한 기술, 예컨대 세포를 리튬 아세테이트로 투과화하는 방법(문헌[Ito et al, 1983]) 및 전기 천공법에 의해 달성될 수 있다.

재조합 미생물의 상업적 적용에서, 플라스미드 불안정성은 가장 중요한 문제이다. 불안정성은 플라스미드의 변화 또는 손실로 인해 이의 조작된 특성을 상실하는 형질전환된 세포의 경향이다. 이 문제는 문헌[Zhang et al., Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Advances, Vol. 14, No. 4, pp. 401-435, (1996)]에서 자세하게 논의된다. 통합 플라스미드로 형질전환된 균주는 심지어 선택적인 압력의 부재하에 극히 안정하다(셔만(Sherman, F.)의 웹사이트 http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman f/yeast/9.html 및 이의 참고문헌).

이종 DNA는 통상적으로 과잉-염색체 플라스미드(YEp, YCp 및 YRp)의 형태로 유기체에 도입된다. 불행히도, 특히 선택 압력이 지속적으로 적용되지 않는 경우, 신규한 특성이 유지될 수 없음이 세균 및 효모 둘다에서 발견되었다. 이는 재조합 세포가 긴 시간 동안 증식할 경우 하이브리드 플라스미드의 분리 불안정성 때문이다. 이는 집단 이질성 및 복제 가변성을 야기하고, 결국 대다수의 세포에서 세포 집단을 야기하여 형질전환에 의해 도입된 특성을 상실한다. 영양요구 표지를 갖는 벡터가 사용되는 경우, 풍부 매질에서 배양은 종종 벡터의 빠른 손실을 야기하기 때문에, 벡터는 오직 최소 배지에서 유지된다. 우성 항생제 내성 표지의 다른 용도는 종종 생산 과정에서 호환가능하지 않다. 항생제의 용도는 등록 관점(최종 생성물에 이르는 항생제의 미량 가능성)으로부터 또는 경제적 이유(산업적 규모에서 항생제의 사용 비용)에 대해 바람직하지 않을 수 있다.

벡터의 손실은 큰 규모 생성 상황에서 문제를 야기한다. DNA의 도입을 위한 다른 방법은 효모에 존재하는, 예컨대 통합 플라스미드(YIp)의 사용이다. DNA는 재조합에 의해 숙주 게놈에 통합되어, 고 안정성을 야기한다(문헌[Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast. Journal of Biotechnology 9 (1988) 173 - 192]). 본 발명자들은 숙주 전이인자를 사용하는 통합 방법이 우수한 대안임을 발견하였다. 일 실시양태에서 유전자는 형질전환된 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있다. 다중 복제의 초기 도입(즉, 적응 진화 전)이 유전자의 도입을 야기하는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 실행된다. 일 실시양태에서, 이는 숙주 세포의 반복된 서열(전이인자)에 상응하는 부분을 갖는 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. 숙주 세포가 효모 세포인 경우, 적합한 반복된 서열은 Ty 요소의 말단의 긴 반복 서열(LTR)(델타 서열로서 공지됨)이다. Ty 요소는 Ty1 및 Ty2로 불리는 2개의 약간 유사한 서브패밀리로 나뉜다. 이들 요소는 약 6 킬로베이스(kb) 길이이고 말단 긴 반복 서열(LTR), 약 335 염기쌍의 서열에 의해 결합된다(문헌[Boeke JD et al, The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Ty1. Molecular and Cellular Biology, Apr. 1988, p. 1432-1442 Vol. 8, No. 4]). 완전 서열화된 사카로마이세스 세레비지아에 균주인 S288c에서, 가장 풍부한 전이인자는 Ty1(31 복제) 및 Ty2(13 복제)이다(문헌[Gabriel A, Dapprich J, Kunkel M, Gresham D, Pratt SC, et al. (2006) Global mapping of transposon location. PLoS Genet 2(12): e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212]). 이들 전이인자는 2개의 중복된 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 이루어지고, 이들 각각은 여러 단백질을 코딩한다. 코딩 영역은 앞서 언급한 거의 동일한 LTR에 의해 측면에 있다. 다르지만 덜 풍부하고 보다 뚜렷한 사카로마이세스 세레비지아에의 Ty 요소는 Ty3, Ty4 및 Ty5를 포함한다. 전장 Ty 요소의 각각의 과를 위해 게놈을 통해 분산된 더 많은 단독 LTR 요소의 순서가 있다. 이는 내부 단백질 코딩 영역의 루프 아웃을 갖는 전장 요소의 LTR-LTR 재조합에 의해 야기되는 것으로 생각된다.

Ty 레트로전이인자의 레트로전위 기작은 게놈 전반에 걸쳐 다중 복제를 통합하기 위해 이용되어 졌다(문헌[Boeke et al., 1988]; 문헌[Jacobs et al., 1988]). Ty 요소의 말단 긴 반복 서열(LTR)(델타 서열로서 공지됨)은 또한 Ty 연관된 부위 또는 단독 부위가 약 150 내지 200 복제에 존재하는 바와 같이 상동 재조합에 의해 통합하기 위한 우수한 표적이다(문헌[Boeke, 1989]; 문헌[Kingsman and Kingsman, 1988], 문헌[Parekh R.N., An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog. 1996, 12, 16-21]). 적응 진화에 의해, 복제 수는 변할 수 있다.

숙주 세포

숙주 세포는 유용한 생성물의 제조에 적합한 임의의 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 임의의 적합한 세포, 예컨대 원핵 세포, 예컨대 세균, 또는 진핵 세포일 수 있다. 전형적으로, 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모 또는 사상균일 수 있다.

효모는 진핵 미생물로서 본원에 정의되고 단세포 형태로 주로 증식하는 하위 진균류의 모든 종(문헌[Alexopoulos, C. J., 1962, In : Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., New York])을 포함한다.

효모는 단세포 엽상체의 출아에 의한 증식 또는 유기체의 방식에 의해 증식할 수 있다. 형질전환된 숙주 세포로서 바람직한 효모는 속(genera) 사카로마이세스, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 클로에크케라(Kloeckera), 슈와니오마이세스(Schwanniomyces ) 또는 야로위아(Yarrowia)에 속할 수 있다. 바람직하게는 효모는 혐기성 발효할 수 있고, 보다 바람직하게는 혐기성 알코올 발효할 수 있다.

사상균은 하위 진균류의 모든 섬질 형태를 포함하는 진핵 미생물로서 본원에 정의된다. 이들 균류는 키틴, 셀룰로스 및 다른 착체 폴리사카라이드로 구성된 영양 균사체에 의해 특징화된다.

본 발명의 세포로서 사용하기에 적합한 사상균은 형태학상으로, 생리학상으로 및 일반적으로 효모와는 다르다. 사상균 세포는 대부분의 균류가 증식을 위해 무균 조건을 요구하지 않고 박테리오파지 감염에 무신경하기 때문에 유리하게 사용될 수 있다. 사상균에 의한 영양 증식은 균사 인장에 의하고 대부분의 사상균의 탄소 이화작용은 편성 호기성이다. 숙주 세포로서 바람직한 사상균은 속 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 후미콜라(Humicola), 아크레모니우라(Acremoniurra), 푸사리움(Fusarium) 또는 페니실리움(Penicillium)에 속할 수 있다. 보다 바람직하게는, 사상균 세포는 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum) 또는 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae) 세포일 수 있다.

일 실시양태에서 숙주 세포는 효모일 수 있다.

바람직하게는 숙주는 산업용 숙주이고, 더욱 바람직하게는 산업용 효모이다. 산업용 숙주 및 산업용 효모 세포는 하기와 같이 정의될 수 있다. 산업 공정에서 효모 세포의 거주 환경은 실험실에서의 환경과 유의하게 상이하다. 산업용 효모 세포는 공정 동안 달라질 수 있는 다양한 환경 조건하에 잘 수행될 수 있어야 한다. 이러한 변이는 영양 공급원, pH, 에탄올 농도, 온도, 산소 농도 등의 변화를 포함하고, 이는 함께 세포 증식 및 사카로마이세스 세레비지아에의 에탄올 생성에 잠재적인 영향을 갖는다. 불리한 산업용 조건하에, 환경 내성 균주는 증식 및 생성을 양호하게 허용해야 한다. 산업용 효모 균주는 일반적으로 예컨대 제빵 산업, 양조 산업, 와인 제조 및 에탄올 산업에서 사용되는 적용 중 발생할 수 있는 환경적 상태에서 이들 변화에 대하여 보다 양호하다. 산업용 효모(사카로마이세스 세레비지아에)의 예는 에탄올 레드(등록상표)(페르멘티스) 페르미올(등록상표)(디에스엠) 및 테르모사크(등록상표)(랄레만드)이다.

일 실시양태에서 숙주는 내성 억제제이다. 내성 억제제 숙주 세포는 예컨대 문헌[Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol.(2007), Vol. 136-140, 847-858]에 예시된 물질을 함유하는 억제제의 증식에 대한 균주를 스크리닝함으로써 선택될 수 있고, 이때 내성 억제제 사카로마이세스 세레비지아에 균주 ATCC 26602가 선택된다.

araA , araB 및 araD 유전자

형질전환된 숙주 세포는 아라비노스를 사용할 수 있다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 L-아라비노스를 L-리불로스 및/또는 자일룰로스 5-포스페이트로 전환하고/하거나, 목적 발효 생성물, 예를 들어 본원에 언급된 것 중 하나로 전환할 수 있다.

L-아라비노스로부터 에탄올을 생성할 수 있는 유기체, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에 균주는 적합한 공급원으로부터 araA(L-아라비노스 이성화효소), araB(L-리불로키나아제) 및 araD(L-리불로스-5-P4-에피머라제) 유전자를 도입하는 세포를 변이시킴으로써 생성될 수 있다. 형질전환된 숙주 세포로 도입될 수 있는 이러한 유전자는 아라비노스를 사용할 수 있도록 허용한다. 상기 접근은 국제특허출원공개 제 2003/095627 호에 기재되어 있다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로부터 araA, araB 및 araD 유전자가 사용될 수 있고 국제특허출원공개 제 2008/041840 호에 개시되어 있다. 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis)로부터 araA 유전자 및 에스케리치아 콜라이로부터 araB 및 araD 유전자가 사용될 수 있고 유럽 특허 제 1499708 호에 개시되어 있다. 또 다른 실시양태에서, araA, araB 및 araD 유전자는 국제특허출원공개 제 2009011591 호에 개시된 바와 같이 속 클라비박터(Clavibacter), 아르트로박터(Arthrobacter) 및/또는 그라멜라(Gramella) 중 하나 이상, 특히 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis), 아르트로박터 아우레스센스(Arthrobacter aurescens), 및/또는 그라멜라 포르세티(Gramella forsetii) 중 하나로부터 유도될 수 있다.

PPP -유전자

형질전환된 숙주 세포는 펜토 인산 경로의 유동을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 특히, 유전자 변형은 펜토스 인산 경로의 비-산화 부를 통해 증가된 유동을 야기할 수 있다. 펜토스 인산 경로의 비-산화 부의 증가된 유동을 야기하는 유전자 변형은 증가된 유동을 야기하는 유전자 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 균주의 유동에 비해 적어도 약 1.1, 약 1.2, 약 1.5, 약 2, 약 5, 약 10 또는 약 20의 인자에 의해 유동을 증가시키는 변이를 의미하는 것으로 본원에서 이해된다. 펜토스 인산 경로의 비-산화 부의 유동은 임의의 자일리톨이 생성되는 경우, 단독 탄소원으로서 자일로스의 변이된 숙주의 증식화, 특정 자일로스 소비율의 측정화 및 특정 자일로스 소비율로부터 특정 자일리톨 생성률의 가감화에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 펜토스 인산 경로의 비-산화 부의 유동은 단독 탄소원으로서 자일로스의 증식률, 바람직하게는 단독 탄소원으로서 자일로스의 혐기성 증식률과 비례한다. 단독 탄소원(μ_max)으로서 자일로스의 증식률과 펜토스 인산 경로의 비-산화 부의 유동 사이의 관계는 선형이다. 당의 바이오매스의 수율이 지속적이기 때문에 특정 자일로스 소비율(Q_s)은 증식률(μ)을 당(Y_xs)의 바이오매스의 수율로 나누는 것과 동일하다(주어진 조건하에: 혐기성, 증식 배지, pH, 균주의 유전적 배경 등; 즉, Q_s = μ/ Y_xs). 따라서 펜토스 인산 경로의 비-산화 부의 증가된 유동은 수송하지 않는 한(흡수가 제한됨) 이들 조건하에 최대 증식률에서의 증가로부터 추정될 수 있다.

펜토스 인산 경로의 유동을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형은 다양한 방식으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 이들 방식은 예를 들어 자일룰로스 키나아제의 더 높은 일정 상태 활성 수준 및/또는 비-산화 부 펜토스 인산 경로의 하나 이상의 효소, 및/또는 비특이적 알도스 환원효소 활성의 감소된 일정 상태 수준을 달성하는 단계를 포함한다. 일정 상태 활성 수준에서 이들 변화는 돌연변이의 선택(화학 물질 또는 방사선에 의해 자발적 또는 유도됨) 및/또는 재조합 DNA 기술, 예를 들어 각각 이들 유전자를 조절하는 효소 또는 인자를 코딩하는 유전자의 과발현 또는 비활성화에 의해 수행될 수 있다.

바람직한 숙주 세포에서, 유전자 변형은 (비-산화 부) 펜토스 인산 경로의 하나 이상의 효소의 과발현을 포함한다. 바람직하게는 효소는 리불로스-5-포스페이트 이성화효소, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 케톨전이효소 및 알돌전이효소를 코딩하는 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. (비-산화 부) 펜토스 인산 경로의 효소의 다양한 조합이 과발현될 수 있다. 예를 들어 과발현된 효소는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소 및 리불로스-5-포스페이트 에피머라제; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소 및 케톨전이효소; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소 및 알돌전이효소; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 에피머라제 및 케톨전이효소; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 에피머라제 및 알돌전이효소; 또는 적어도 효소 케톨전이효소 및 알돌전이효소; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 케톨전이효소 및 알돌전이효소; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소, 케톨전이효소 및 알돌전이효소; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제 및 알돌전이효소; 또는 적어도 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제 및 케톨전이효소일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서 각각의 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 케톨전이효소 및 알돌전이효소는 숙주 세포에서 과발현된다. 숙주 세포가 이미 자일로스에서 혐기성 증식을 할 수 있는 바와 같이 효소 케톨전이효소 및 알돌전이효소 둘다의 적어도 과발현을 포함하는 유전자 변형에서의 숙주 세포가 보다 바람직하다. 사실상, 오직 숙주 세포가 과발현되는 일부 조건하에 케톨전이효소 및 알돌전이효소는 이미 모든 4개의 효소, 즉, 리불로스-5-포스페이트 이성화효소, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 케톨전이효소 및 알돌전이효소를 과발현하는 숙주 세포로서 자일로스에서 동일한 혐기성 증식률을 갖는다. 더욱이, 효소 리불로스-5-포스페이트 이성화효소 및 리불로스-5-포스페이트 에피머라제 둘다 과발현시키는 숙주 세포는 이들 효소 중 오직 하나가 대사 불균형을 생성할 수 있는 과발현으로서 단지 이성화효소 또는 단지 에피머라제를 과발현시키는 숙주 세포가 바람직하다.

효소 "리불로스 5-포스페이트 에피머라제"(EC 5.1.3.1)는 D-자일룰로스 5-포스페이트를 D-리불로스 5-포스페이트로 에피머화 및 이의 역반응을 촉진하는 효소로서 본원에서 정의된다. 또한, 효소는 포스포리불로스 에피머라제; 에리트로스-4-포스페이트 이성화효소; 포스포케토펜토스 3-에피머라제; 자일룰로스 포스페이트 3-에피머라제; 포스포케토펜토스 에피머라제; 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제; D-리불로스 포스페이트-3-에피머라제; D-리불로스 5-포스페이트 에피머라제; D-리불로스-5-P3-에피머라제; D-자일룰로스-5-포스페이트 3-에피머라제; 펜토스-5-포스페이트 3-에피머라제; 또는 D-리불로스-5-포스페이트 3-에피머라제로서 공지된다. 리불로스 5-포스페이트 에피머라제는 이의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의될 수 있다. 마찬가지로 리불로스 5-포스페이트 에피머라제는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 리불로스 5-포스페이트 에피머라제를 코딩하는 참조 뉴클레오티드 서열을 교배하는 뉴클레오티드 서열에 의해 정의될 수 있다. 리불로스 5-포스페이트 에피머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 RPE1로 지칭한다.

효소 "리불로스 5-포스페이트 이성화효소"(EC 5.3.1.6)는 D-리보스 5-포스페이트를 D-리불로스 5-포스페이트로 직접 이성질화 및 이의 역반응을 촉진하는 효소로서 본원에서 정의된다. 또한, 효소는 포스포펜토스이성화효소; 포스포리보이성화효소; 리보스 포스페이트 이성화효소; 5-포스포리보스 이성화효소; D-리보스 5-포스페이트 이성화효소; D-리보스-5-포스페이트 케톨-이성화효소; 또는 D-리보스-5-포스페이트 알도스-케토스-이성화효소로서 공지된다. 리불로스 5-포스페이트 이성화효소는 이의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의될 수 있다. 마찬가지로 리불로스 5-포스페이트 이성화효소는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 리불로스 5-포스페이트 이성화효소를 코딩하는 참조 뉴클레오티드 서열을 교배하는 뉴클레오티드 서열에 의해 정의될 수 있다. 리불로스 5-포스페이트 이성화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 RKI1로 지칭한다.

효소 "케톨전이효소"(EC 2.2.1.1)는 하기 반응 및 이의 역반응을 촉진하는 효소로서 본원에서 정의된다:

D-리보스 5-포스페이트 + D-자일룰로스 5-포스페이트 <-> 세도헵툴로스 7-포스페이트 + D-글리세르알데하이드 3-포스페이트

또한, 효소는 글리세롤알데하이드전이효소 또는 세도헵툴로스-7-포스페이트:D-글리세르알데하이드-3-포스페이트 글리세롤알데하이드전이효소로서 공지된다. 케톨전이효소는 이의 아미노산에 의해 추가로 정의될 수 있다. 마찬가지로 케톨전이효소는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 케톨전이효소를 코딩하는 참조 뉴클레오티드 서열을 교배하는 뉴클레오티드 서열에 의해 정의될 수 있다. 케톨전이효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 TKL1로 지칭한다.

효소 "알돌전이효소"(EC 2.2.1.2)는 하기 반응 및 역반응을 촉진하는 효소로서 본원에서 정의된다:

세도헵툴로스 7-포스페이트 + D-글리세르알데하이드 3-포스페이트 <-> D-에리트로스 4-포스페이트 + D-프룩토스 6-포스페이트

또한, 효소는 다이하이드록시아세톤전이효소; 다이하이드록시아세톤 합성효소; 포름알데하이드 케톨전이효소; 또는 세도헵툴로스-7-포스페이트: D-글리세르알데하이드-3-포스페이트 글리세론전이효소로서 공지된다. 알돌전이효소는 이의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의될 수 있다. 마찬가지로 알돌전이효소는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 알돌전이효소를 코딩하는 참조 뉴클레오티드 서열을 교배하는 뉴클레오티드 서열에 의해 정의될 수 있다. 케톨전이효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 TAL1로 지칭한다.

자일로스 이성화효소 또는 자일로스 환원효소 유전자

본 발명에 따라, 하나 이상의 자일로스 이성화효소 유전자 및/또는 하나 이상의 자일로스 환원효소 및 자일리톨 탈수소효소의 하나 이상의 복제는 숙주 세포의 게놈으로 도입된다. 이들 유전적 요소의 존재는 이성질화 또는 환원에 의해 자일로스를 전환하기 위한 능력을 세포에 부여한다.

일 실시양태에서, 하나 이상의 자일로스 이성화효소 유전자의 하나 이상의 복제는 숙주 세포의 게놈으로 도입된다.

"자일로스 이성화효소"(EC 5.3.1.5)는 D-자일로스를 D-자일룰로스로 직접 이성질화 및/또는 이의 역반응을 촉진하는 효소로서 본원에서 정의된다. 또한, 효소는 D-자일로스 케토이성화효소로서 공지된다. 본원에서 자일로스 이성화효소는 또한 D-글루코스와 D-프룩토스 사이의 전환을 촉진할 수 있다(따라서 글루코스 이성화효소로서 지칭될 수 있음). 본원에서 자일로스 이성화효소는 공인자로서 2가 양이온, 예컨대 마그네슘, 망간 또는 코발트를 필요로 할 수 있다.

따라서, 이러한 형질전환된 숙주 세포는 자일로스를 자일룰로스로 이성질체화 할 수 있다. 자일로스를 자일룰로스로 이성질체화하는 능력은 한정된 자일로스 이성화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구축물을 사용하여 숙주 세포의 형질전환에 의해 숙주 세포에 부여된다. 형질전환된 숙주 세포는 자일로스의 직접 이성질화에 의해 자일룰로내의 자일로스를 자일룰로스로 이성질체화한다.

자일로스 이성화효소 활성의 단위(U)는 문헌[Kuyper et al., FEMS Yeast Res. 4: 69-78 (2003)]에 기재된 조건하에, 1 분당 1 nmol의 자이룰로스를 생성하는 효소의 양으로서 본원에서 정의된다.

자일로스를 이성질체화하는 유전자는 다양한 기원을 가질 수 있는데, 예컨대 국제특허출원공개 제 2006/009434 호에 개시된 바와 같은 피로마이세스 종(Pyromyces sp .)이다. 다른 적합한 기원은 박테로이데스(Bacteroides), 특히 ㅈ제 T/EP2009/52623 호에 기재된 바와 같이 박테로이데스 우니포르미스(Bacteroides uniformis), 바실러스(Bacillus), 특히 제 PCT/EP2009/052625 호에 기재된 바와 같이 바실러스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus)이다.

또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 자일로스 환원효소 및 자일리톨 탈수소효소 유전자의 하나 이상의 복제는 숙주 세포의 게놈으로 도입된다. 이 실시양태에서 자일로스의 전환은 각각 자일로스 환원효소 및 자일리톨 탈수소효소에 의해 촉매화된 바와 같이 자일리톨 중간체를 통해 자일로스를 자일룰로스로 전환하는 2 단계 전환으로 수행된다. 이의 일 실시양태에서 자일로스 환원효소(XR), 자일리톨 탈수소효소(XDH) 및 자일로키나아제(XK)는 과발현될 수 있고, 국제특허출원공개 제 2004085627 호에 개시된 바와 같이 임의적으로 효소를 생성하는 NADPH를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 상향 조정되고 효소를 소비하는 NADH를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 상향 조정된다.

XKS1 유전자

형질전환된 숙주 세포는 특정 자일룰로스 키나아제 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는 유전자 변형은 자일룰로스 키나아제의 과발현을 야기하는데, 예를 들어 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 과발현에 의해 야기된다. 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자는 숙주 세포에 내생일 수 있거나 숙주 세포에 이종인 자일룰로스 키나아제일 수 있다. 숙주 세포에서 자일룰로스 키나아제의 과발현을 위해 사용된 뉴클레오티드 서열은 자일룰로스 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

효소 "자일룰로스 키나아제"(EC 2.7.1.17)는 하기 반응을 촉진하는 효소로서 본원에 정의된다:

ATP + D-자일룰로스 = ADP + D-자일룰로스 5-포스페이트

또한, 효소는 인산화 자일룰로키나아제, D-자일룰로키나아제 또는 ATP: D-자일룰로스 5-포스포전이효소로서 공지된다. 본 발명의 자일룰로스 키나아제는 이의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의될 수 있다. 마찬가지로 자일룰로스 키나아제는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 참조 뉴클레오티드 서열을 교배하는 뉴클레오티드 서열에 의해 정의될 수 있다.

형질전환된 숙주 세포에서, 특정 자일룰로스 키나아제 활성을 증가시키는 유전자 변형은 상기 기재된 바와 같이 펜토스 인산 경로의 유동을 증가시키는 임의의 변이와 혼합될 수 있다. 그러나, 이는 필수적이지 않다.

따라서, 숙주 세포는 특정 자일룰로스 키나아제 활성을 증가시키는 유전자 변형만을 포함할 수 있다. 본 발명의 숙주 세포에서 자일룰로스 키나아제의 과발현을 달성하고 분석하기 위한 당해 분야의 이용가능한 다양한 방식은 펜토스 인산 경로의 효소에 대해 상기 기재된 바와 동일하다. 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포에서, 과발현될 자일룰로스 키나아제는 과발현을 야기하는 유전자 변형을 제외하고 일반적으로 동일한 균주에 비해 적어도 약 1.1, 약 1.2, 약 1.5, 약 2, 약 5, 약 10 또는 약 20의 인자에 의해 과발현된다. 이들 수준의 과발현이 일정 상태 수준의 효소의 활성, 일정 상태 수준의 효소의 단백질뿐만 아니라 효소에 대한 일정 상태 수준의 전사 코딩에 적용될 수 있음이 이해된다.

알도스 환원효소( GRE3 ) 유전자 결실

실시양태에서, 유전자로서 사용된 XI가 자일로스를 전환할 경우, 이는 알도스 환원효소 활성을 유리하게 감소시킬 수 있다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포에서 비특이적 알도스 환원효소 활성을 감소시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비특이적 알도스 환원효소 활성은 비특이적 알도스 환원효소를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나 비활성화시키는 하나 이상의 유전자 변형에 의해 숙주 세포에서 감소된다. 바람직하게는, 유전자 변형은 숙주 세포에서 비특이적 알도스 환원효소를 코딩하는 유전자의 각각의 내생의 복제(본원에서 GRE3 결실로 지칭됨)의 발현을 감소시키거나 비활성화시킨다. 형질전환된 숙주 세포는 이배수성, 다배수성 또는 이수성의 결과로서 비특이적 알도스 환원효소를 코딩하는 유전자의 다중 복제를 포함할 수 있고/있거나, 숙주 세포는 아미노산 서열에 대해 상이하고 상이한 유전자에 의해 각각 코딩되는 알도스 환원효소 활성을 갖는 여러 상이한 (이소)효소를 함유할 수 있다. 또한 상기 예에서 바람직하게는 비특이적 알도스 환원효소를 코딩하는 각각의 유전자의 발현은 감소되거나 비활성화된다. 바람직하게는, 유전자는 유전자의 적어도 부분의 결실에 의해 또는 유전자의 분열에 의해 비활성화되고, 본 맥락에서 용어 "유전자"는 또한 코딩 서열의 상류 또는 하류의 임의의 비-코딩 서열, 숙주 세포에서 비특이적 알도스 환원효소 활성의 발현의 감소로 야기하는 (부분적) 결실 또는 비활성화를 포함한다.

숙주 세포에서 감소될 활성을 갖는 알도스 환원효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알도스 환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

따라서, 숙주 세포에서 비특이적 알도스 환원효소 활성을 감소시키는 유전자 변형만을 포함하는 숙주 세포가 분명하게 본 발명에 포함된다.

효소 "알도스 환원효소"(EC 1.1.1.21)는 자일로스 또는 자일룰로스를 자일리톨로 환원할 수 있는 임의의 효소로서 본원에 정의된다. 본 발명의 맥락에서 알도스 환원효소는 본 발명의 숙주세포에서 네이티브(내생적)이고 자일로스 또는 자일룰로스를 자일리톨로 환원활 수 있는 임의의 비특이적 알도스 환원효소일 수 있다. 비특이적 알도스 환원효소 하기 반응을 촉진한다:

알도스 + NAD(P)H + H⁺ ↔ 알디톨 + NAD(P)⁺

효소는 광범위한 특이성을 갖고 또한 알도스 환원효소; 폴리올 탈수소효소(NADP⁺); 알디톨:NADP 산화환원효소; 알디톨:NADP⁺ 1-산화환원효소; NADPH-알도펜토스 환원효소; 또는 NADPH-알도스 환원효소로서 공지된다.

이러한 비특이적 알도스 환원효소의 특정 예는 사카로마이세스 세레비지아에에 내생적이고 GRE3 유전자에 의해 코딩된다(문헌[Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74]). 따라서, 본 발명의 알도스 환원효소는 이의 아미노산 서열에 의해 추가로 한정될 수 있다. 마찬가지로 알도스 환원효소는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해서뿐만 아니라 알도스 환원효소를 코딩하는 기준 뉴클레오티드 서열을 교배하는 뉴클레오티드 서열에 의해 한정될 수 있다.

바이오제품 생산

수년에 걸쳐 당류 작물로부터 바이오-에탄올의 생산을 위해 다양한 유기체들의 도입이 제안되어 왔다. 그러나, 실제로, 모든 주요 바이오-에탄올 생산 공정들은 에탄올 생산자로서 계속해서 사카로마이세스 속의 효모들을 사용해 왔다. 이는 산업 공정에 대한 사카로마이세스 종의 많은 매력적인 특징들, 즉 높은 산-, 에탄올- 및 삼투-허용성, 혐기성 증식 능력, 및 물론 그의 높은 알콜 발효 능력에 기인한다. 숙주 세포로서 바람직한 효모 종은 사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 바르네티(Saccharomyces barnetti), 사카로마이세스 엑시구우스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 유바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 또는 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis)를 포함한다.

형질전환된 숙주 세포는 에탄올의 생산에 적합한 세포일 수 있다. 그러나, 형질전환된 숙주 세포는 에탄올 이외의 발효 생성물의 생산에도 적합할 수 있다.

상기와 같은 비-에탄올성 발효 생성물은 원칙적으로 효모 또는 사상균과 같은 진핵 미생물에 의해 생산될 수 있는 임의의 벌크 또는 정제 화학물질을 포함한다.

비-에탄올성 발효 생성물의 생산에 바람직한 형질전환된 숙주 세포는 감소된 알콜 데하이드로게나제 활성을 생성시키는 유전자 변형을 함유하는 숙주 세포이다.

일 실시양태에서 형질전환된 숙주 세포는 리그노셀룰로스로부터 유래하는 당을 에탄올로 전환하는 공정에서 사용될 수 있다.

리그노셀룰로스

리그노셀룰로스(잠재적인 재생 공급원료로서 간주될 수 있다)는 일반적으로 폴리사카라이드 셀룰로스(글루칸) 및 헤미셀룰로스(자일란, 헤테로자일란 및 자일로글루칸)를 포함한다. 또한, 일부 헤미셀룰로스는 예를 들어 목재-유래 공급원료에서 글루코만난으로서 존재할 수도 있다. 이들 폴리사카라이드의 용해성 당(단량체 및 다량체를 모두 포함한다), 예를 들어 글루코스, 셀로비오스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 프럭토스, 만노스, 람노스, 리보스, 갈락튜론산, 글루코론산 및 다른 헥소스 및 펜토스로의 효소적 가수분해는 일제히 작용하는 상이한 효소들의 작용 하에서 발생한다.

또한, 펙틴 및 다른 펙틴 물질, 예를 들어 아라비난이 전형적으로 비-목재 식물 조직으로부터의 세포벽의 건조 질량의 상당 부분을 구성할 수도 있다(대략 건조 질량의 1/4 내지 절반이 펙틴일 수 있다).

전처리

효소 처리 전에, 상기 리그노셀룰로스 물질을 전처리할 수도 있다. 상기 전처리는 상기 리그노셀룰로스 물질을 산, 염기, 용매, 열, 과산화산물, 오존, 기계적 절단, 분쇄, 연마 또는 고속 감압, 또는 이들 중 임의의 2 개 이상의 조합에 노출시킴을 포함할 수도 있다. 이러한 화학적 전처리를 종종 열-처리, 예를 들어 150 내지 220 ℃에서 1 내지 30 분 동안의 열처리와 병행한다.

효소적 가수분해

상기 전처리된 물질에 통상적으로 효소적 전처리를 가하여 본 발명에 따라 발효될 수도 있는 당을 방출시킨다. 이는 통상적인 방법, 예를 들어 셀룰라제, 예를 들어 셀로바이오하이드롤라제, 엔도글루카나제, 베타-글루코시다제 및 임의로 다른 효소와의 접촉에 의해 실행될 수도 있다. 상기 셀룰라제에 의한 전환을 주변 온도 또는 더 높은 온도에서 충분량의 당을 방출시키는 반응 시간으로 실행할 수 있다. 상기 효소적 가수분해의 결과는 C5/C6 당을 포함하는 가수분해 생성물(여기에서 당 조성물로서 나타낸다)이다.

발효

상기 발효 공정은 호기성 또는 혐기성 발효 공정일 수 있다. 혐기성 발효 공정을 본 발명에서는 산소 부재 하에서 실행되거나 또는 실질적으로 산소가 소비되지 않는, 바람직하게는 약 5, 약 2.5 또는 약 1 mmol/L/h, 보다 바람직하게는 0 mmol/L/h 미만이 소비되는(즉 산소 소비가 검출되지 않는) 발효 공정으로서 정의하며, 여기에서 유기 분자는 전자 공여체 및 전자 수용체 모두로서 작용한다. 산소의 부재 하에서, 해당작용 및 바이오매스 형성에서 생성된 NADH는 산화적 인산화에 의해 산화될 수 없다. 이 문제를 해결하기 위해서 다수의 미생물들이 전자 및 수소 수용체로서 피루베이트 또는 그의 유도체들 중 하나를 사용하며, 이에 의해 NAD⁺를 재생성시킨다.

따라서, 바람직한 혐기성 발효 공정에서 피루베이트는 전자(및 수소 수용체)로서 사용되고 발효 생성물, 예를 들어 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 말산, 푸마르산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 및 세파로스포린으로 환원된다.

상기 발효 공정을 바람직하게는 상기 세포에 최적인 온도에서 실행한다. 따라서, 대부분의 효모 또는 진균 숙주 세포의 경우, 상기 발효 공정을 약 42 ℃ 미만, 바람직하게는 약 38 ℃ 미만인 온도에서 수행한다. 효모 또는 사상균 숙주 세포의 경우, 상기 발효 공정을 바람직하게는 약 35, 약 33, 약 30 또는 약 28 ℃ 미만인 온도 및 약 20, 약 22 또는 약 25 ℃ 초과인 온도에서 수행한다.

상기 공정에서 자일로스 및/또는 글루코스에 대한 에탄올 수율은 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 95 또는 약 98% 이상이다. 본 발명에서 상기 에탄올 수율을 이론적인 최대 수율의 백분율로서 정의한다.

본 발명은 또한 발효 생성물의 생산 공정에 관한 것이다.

본 발명에 따른 발효 공정을 호기성 및 혐기성 조건 하에서 실행할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 공정을 미-호기성 또는 산소 제한된 조건 하에서 수행한다.

혐기성 발효 공정을 본 발명에서는 산소 부재 하에서 실행되거나 또는 실질적으로 산소가 소비되지 않는, 바람직하게는 약 5, 약 2.5 또는 약 1 mmol/L/h 미만이 소비되는 발효 공정으로서 정의하며, 여기에서 유기 분자는 전자 공여체 및 전자 수용체 모두로서 작용한다.

산소-제한된 발효 공정은 상기 산소 소비가 기체에서 액체로의 산소 이동에 의해 제한되는 공정이다. 산소 제한의 정도는 유입 기류의 양 및 조성뿐만 아니라 사용되는 발효 장비의 실제 혼합/물질 이동 성질에 의해 결정된다. 바람직하게는 산소-제한된 조건 하의 공정에서, 산소 소비율은 약 5.5 이상, 보다 바람직하게는 약 6 이상, 예를 들어 7 mmol/L/h 이상이다. 본 발명의 공정은 발효 생성물의 회수를 포함할 수도 있다.

바람직한 공정에서, 상기 세포는 자일로스와 글루코스를 모두 발효하며, 바람직하게는 2 단계 적응 증식을 방지하는 글루코스 억제에 둔감한 세포를 사용하는 경우에는 동시에 발효한다. 탄소원으로서 자일로스(및 글루코스)의 공급원 이외에, 상기 발효 배지는 상기 세포의 증식에 필요한 적합한 성분을 추가로 포함할 것이다. 효모와 같은 미생물의 증식을 위한 발효 배지의 조성은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

상기 발효 공정을 배치 방식, 유가 방식 또는 연속 방식으로 수행할 수 있다. 분리된 가수분해 및 발효(SHF) 공정 또는 동시적인 당화 및 발효(SSF) 공정을 또한 적용할 수도 있다. 이들 발효 공정 방식의 조합이 또한 최적의 생산성을 위해 가능할 수 있다. 이러한 공정들을 이후에 보다 상세히 개시한다.

SSF 방식

동시적인 당화 및 발효(SSF) 방식에 대해서, 액화/가수분해 또는 예비당화 단계를 위한 반응 시간은 목적하는 수율, 즉 셀룰로스에서 글루코스로의 전환 수율을 실현하는 시간에 따라 변한다. 상기와 같은 수율은 바람직하게는 가능한 한 높고, 바람직하게는 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 심지어 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상이다.

본 발명에 따라 SHF 방식에서 매우 높은 당 농도 및 SSF 방식에서 매우 높은 생성물 농도(예를 들어, 에탄올)가 실현된다. SHF 작업에서 상기 글루코스 농도는 25 g/ℓ 이상, 30 g/ℓ 이상, 35 g/ℓ 이상, 40 g/ℓ 이상, 45 g/ℓ 이상, 50 g/ℓ 이상, 55 g/ℓ 이상, 60 g/ℓ 이상, 65 g/ℓ 이상, 70 g/ℓ 이상, 75 g/ℓ 이상, 80 g/ℓ 이상, 85 g/ℓ 이상, 90 g/ℓ 이상, 95 g/ℓ 이상, 100 g/ℓ 이상, 110 g/ℓ 이상, 120 g/ℓ 이상이거나, 또는 예를 들어 25 g/ℓ 내지 250 g/ℓ, 30gL/L 내지 200 g/ℓ, 40 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 50 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 60 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 70 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 80 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 90 g/ℓ 내지 200 g/ℓ일 수도 있다.

SSF 방식에서 생성물 농도

SSF 작업에서, 생성물 농도(g/ℓ)는 생성되는 글루코스의 양에 따라 변하지만, 이는 당이 상기 SSF에서 생성물로 전환되기 때문에 볼 수 없으며, 생성물 농도를 이론적인 최대 수율(글루코스 그램 당 생성물 그램으로 Yps max)과의 곱에 의해 근원 글루코스 농도와 관련지을 수 있다.

발효 생성물의 이론적인 최대 수율(글루코스 그램 당 생성물 그램으로 Yps max)은 생화학 교과서에 나와 있을 수 있다. 에탄올의 경우, 1 몰의 글루코스(180 gr)는 효모에서 통상적인 해당 발효 경로에 따라 2 몰의 에탄올(= 2x46 = 92 gr 에탄올)을 제공한다. 따라서 글루코스에 대한 에탄올의 이론적인 최대 수율은 92/180 = 0.511 gr 에탄올/gr 글루코스이다.

부탄올(MW 74 gr/몰) 또는 아이소부탄올의 경우, 이론적인 최대 수율은 글루코스 몰당 부탄올 1 몰이다. 따라서 (아이소-)부탄올에 대한 Yps max는 74/180 = 0.411 gr (아이소-)부탄올/gr 글루코스이다.

락트산의 경우 호모락트산 발효에 대한 발효 수율은 글루코스 몰당 2 몰의 락트산(MW = 90 gr/몰)이다. 상기 화학량론에 따라, Yps max는 1 gr 락트산/gr 글루코스이다.

다른 발효 생성물들에 대해서 유사한 계산을 수행할 수도 있다.

SSF 방식

SSF 작업에서 생성물 농도는 25 g * Yps g/ℓ/L 이상, 30 * Yps g/ℓ 이상, 35 g * Yps /L 이상, 40 * Yps g/ℓ 이상, 45 * Yps g/ℓ 이상, 50 * Yps g/ℓ 이상, 55 * Yps g/ℓ 이상, 60 * Yps g/ℓ 이상, 65 * Yps g/ℓ 이상, 70 * Yps g/ℓ 이상 , 75 * Yps g/ℓ 이상, 80 * Yps g/ℓ 이상, 85 * Yps g/ℓ 이상, 90 * Yps g/ℓ 이상, 95 * Yps g/ℓ 이상, 100 * Yps g/ℓ 이상, 110 * Yps g/ℓ 이상, 120g/ℓ * Yps 이상이거나 또는 예를 들어 25 * Yps g/ℓ 내지 250 * Yps g/ℓ, 30 * Yps g/ℓ 내지 200 * Yps g/ℓ, 40 * Yps g/ℓ 내지 200 * Yps g/ℓ, 50 * Yps g/ℓ 내지 200 * Yps g/ℓ, 60 * Yps g/ℓ 내지 200 * Yps g/ℓ, 70 * Yps g/ℓ 내지 200 * Yps g/ℓ, 80 * Yps g/ℓ 내지 200 * Yps g/ℓ, 90 * Yps g/ℓ , 80 * Yps g/ℓ 내지 200 * Yps g/ℓ일 수 있다.

따라서, 본 발명은

a. 본 발명에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 리그노셀룰로스를 분해하는 단계; 및

b. 상기 생성되는 물질을 발효하는 단계

를 포함하는, 발효 생성물의 제조 방법을 제공한다.

발효 생성물

본 발명의 발효 생성물은 임의의 유용한 생성물일 수도 있다. 일 실시양태에서, 상기 생성물은 에탄올, n-부탄올, 아이소부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 이타콘산, 말레산, 시트르산, 아디프산, 아미노산, 예를 들어 리신, 메티오닌, 트립토판, 쓰레오닌, 및 아스파트산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 및 세파로스포린, 비타민, 약제, 동물 사료 보충제, 특수 화합물, 화학 공급원료, 플라스틱, 용매, 바이오 연료 및 바이오 가스를 포함한 연료 또는 유기 중합체, 및 산업용 효소, 예를 들어 프로테아제, 셀룰라제, 아밀라제, 글루카나제, 락타제, 리파제, 라이아제, 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제 및 자일라나제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 생성물이다. 예를 들어 발효 생성물은 본 발명에 따른 세포에 의해 생성된 후 종래 세포 제조 방법 및 발효 공정에 의해 생성될 수 있지만, 본원에서 예시로 한정되는 것은 아니다. n-부탄올은 국제특허출원공개 제 2008121701 호 또는 국제특허출원공개 제 2008086124 호에 기재된 바와 같은 세포; 미국특허 제 2011053231 호 또는 미국특허 제 2010137551 호에 기재된 바와 같은 락트산; 국제특허출원공개 제 2010010291 호에 기재된 바와 같은 3-하이드록시-프로피온산; 국제특허출원공개 제 2009153047 호에 기재된 바와 같은 아크릴산에 의해 생성될 수 있다.

발효 생성물의 회수

발효 생성물의 회수를 위해서 기존의 기술들을 사용한다. 상이한 발효 생성물의 경우 상이한 회수 공정들이 적합하다. 수성 혼합물로부터 에탄올을 회수하기 위한 기존의 방법은 통상적으로 분별 및 흡착 기법을 사용한다. 예를 들어, 수성 혼합물 중에 에탄올을 함유하는 맥주가 여전히 발효된 생성물의 처리에 사용되어 농축된 에탄올-함유 혼합물을 생성시킬 수 있으며, 이어서 상기 혼합물에 분별을 수행한다(예를 들어 분별 증류 또는 다른 유사한 기법들). 이어서, 최고의 에탄올 농도를 함유하는 분획들을 흡착기에 통과시켜 상기 에탄올로부터 나머지 물을, 전부는 아니더라도, 대부분 제거할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예

균주 및 보존. 본 연구에 사용된 균주들(표 1)의 보관을 위해서, 진탕 플라스크 배양을, 2% 글루코스(YPD), 2% 에탄올 + 1.5% 글리세롤(YP-EtOH/Glyc) 또는 2% 아라비노스(YP-Ara)가 보충된, 10 g/ℓ 효모 추출물(BD 디프코(Difco)) 및 20 g/ℓ 펩톤(비디 디프코)으로 이루어지는 복합 배지(YP)에서 수행하였다. 배양물을 정지 증식기까지 궤도 진탕기(200 rpm)에서 30 ℃에서 배양하였다. 30%(v/v) 글리세롤의 첨가 후에, 진탕-플라스크 배양물로부터의 샘플을 -80 ℃에서 2 mL의 분액들로 보관하였다.

진탕-플라스크 배양. 진탕 플라스크에서의 배양을 2.3 g/ℓ 우레아, 6.6 g/ℓ K₂SO₄, 3 g/ℓ KH₂PO₄, 0.5 g/ℓ MgSO₄·7H₂O, 및 미량 원소(MY우레아)를 함유하는 합성 배지에서 30 ℃에서 수행하였다[7]. 진탕 플라스크 배양을 위해서, 배지 pH를 멸균 전에 2M KOH로 4.7로 조절하였다. 가열 멸균(121 ℃, 20 분) 후에, 필터-멸균된 비타민 용액[7] 및 당을 가하였다. 진탕-플라스크 배양물을, 500-mL 진탕 플라스크 중에 적합한 당을 함유하는 100 mL 배지를 동결된 원 배양물로 접종함으로써 제조하고, 30 ℃에서 궤도 진탕기(200 rpm)에서 배양하였다.

혐기성 배치 배양. 혐기성 배치 배양을 1 L의 작용 부피로 2 리터 발효기(아플리콘(Applikon), 네덜란드 취담 소재)에서 30 ℃에서 수행하였다. 배양을 5 g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 3 g/ℓ KH₂PO₄, 0.5 g/ℓ MgSO₄·7H₂O, 및 미량 원소를 함유하는 합성 배지에서 수행하였다[7]. 가열 멸균(121 ℃, 20 분) 후에, 상기 배지에 에탄올에 용해된 0.01 g/ℓ 에르고스테롤 및 0.42 g/ℓ 트윈(Tween) 80[1,2], 규소 소포제, 미량 원소, 필터 멸균된 비타민 용액[7], 및 적합한 탄소원을 보충하였다. 배양물을 800 rpm에서 교반하고 0.5 ℓ/분 질소 기체(<10 ppm 산소)를 살포하고 2M KOH의 자동 첨가에 의해 pH 5.0에서 유지시켰다. 산소 확산을 최소화하기 위해서, 발효기에 노르프렌(Norprene) 튜빙(콜 팔머 인스트루먼트 캄파니(Cole Palmer Instrument Company), 미국 버논 힐스 소재)을 장착하였다. 산소의 부재를 산소 전극(아플리센스(Applisens), 네덜란드 취담 소재)으로 확인하였다. 배치 배양을 100 mL 글루코스-증식된 진탕 플라스크 배양물의 접종에 의해 출발하였다.

증식률 측정. 진탕 플라스크 배양물에 대해서 때에 맞춰 660 ㎚에서 광학 밀도(OD660)를 측정함으로써 증식 프로파일을 작성하였다. 발효기에서 혐기성 배양을 위해 비 증식률을 배출 기체 중의 CO₂ 농도를 근거로 측정하였다. 상기 비 증식률을 지수 곡선에 데이터 점들을 대입함으로써 측정하였다.

이산화 탄소 및 세포외 대사생성물 분석. 혐기성 발효기로부터의 배출 기체를 응축기(2 ℃)에서 냉각시키고 페르마퓨어(Permapure) 건조기 유형 MD-110-48P-4(페르마퓨어, 미국 톰스 리버 소재)로 건조시켰다. 이산화 탄소 농도를 NGA 2000 분석기(로즈마운트 어낼리티컬(Rosemount Analytical), 미국 오르빌 소재)로 측정하였다. 배출 기체 유량 및 비 이산화 탄소 생성률을 앞서 개시된 바와 같이 측정하였다[6,8].

글루코스, 아라비노스, 아세테이트, 락테이트, 숙시네이트, 글리세롤 및 에탄올을, 바이오래드(BioRad) HPX 87H 컬럼(바이오래드, 미국 헤르큘레스 소재), 워터스(Waters) 2410 굴절률 검출기 및 워터스 2487 UV 검출기가 공급된 워터스 알리안스(Alliance) 2690 HPLC(워터스, 미국 밀포드 소재)를 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 상기 컬럼을 60 ℃에서 0.5 g/ℓ 황산 및 0.6 mg/분의 유속으로 용출시켰다.

헥소키나제 활성 측정. 본 연구에 사용된 균주의 세포 추출물에서 헥소키나제 활성을, 형성된 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 효소에 의해 6-포스포글루코네이트로 전환하는 커플링된 효소 반응(반응 2)을 사용하여, 글루코스의 글루코스-6-포스페이트로의 전환(반응 1)을 측정함으로써 측정한다. 상기 커플링 반응에서 형성된 NADPH의 비율은 상기 헥소키나제 활성과 동등하며 340 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 측정된다.

D-글루코스 + ATP ↓ ADP + D-글루코스 6-포스페이트 (1)

D-글루코스 6-포스페이트 + NADP⁺ ↓ 6-포스포 글루코노락톤 + NADPH (2)

실시예 1

유전자 결실

본 발명에서 유전자 결실을, 표적 유전자를 대체하는 G418 내성 카세트의 통합에 의해 성취하였다. HXK2, HXK1 및 GLK1의 결실을 위해서, pUG6으로부터의 KanMX 카세트를 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드들을 사용하여, PCR에 의해 증폭시켰다[4].

유전자 결실의 제작 및 관련된 진단 목적을 위해 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오타이드들. KanMX 유전자 결실 카세트를 DisA 및 DisB 올리고뉴클레오타이드의 조합을 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 유전자를 표적 유전자와 상기 KanMX 유전자 결실 카세트 간의 상동 재조합에 의해 붕괴시켰다. 재조합 부위는 상기 올리고뉴클레오타이드 중의 밑줄그은 영역에 의해 나타낸다. 결실 또는 붕괴를 표적 유전자와 상응하는 FW 및 RV 진단 프라이머와 병용된 진단 프라이머 KanA 및 KanB를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다(예를 들어 KanA를 HXK2-FW와 병용하고 KanB를 HXK2-RV와 병용하였다).
명칭	5'-3' DNA 서열
유전자 붕괴 카세트의 제작에 사용된 올리고뉴클레오타이드들
HXK2-disA	GTTGTAGGAATATAATTCTCCACACATAATAAGTACGCTAATTCAGCTGAAGCTTCGTACGC
HXK2-disB	AAAAGGGCACCTTCTTGTTGTTCAAACTTAATTTACAAATTAAGTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG
HXK1-disA	TTTCTTTTAATCAAACTCACCCAAACAACTCAATTAGAATACTGCAGCTGAAGCTTCGTACGC
HXK1-disB	GAATAATAATATTAAGGGAGGGAAAAACACATTTATATTTCATTACAGCATAGGCCACTAGTGGATCTG
GLK1-disA	CTCGGACAAAGGTCTTCCTATGATTCCGGCGTTCGTCACCGGGTCCAGCTGAAGCTTCGTACGC
GLK1-disB	TAAAGGAGAGAAGATGGTAAGTACGGTGGGATACGTACACAAACATAGGCCACTAGTGGATCTG
진단 목적으로 사용된 올리고뉴클레오타이드들
KanA	CGCACGTCAAGACTGTCAAG
KanB	TCGTATGTGAATGCTGGTCG
HXK2-FW	TTCGCCACTGTCTTATCTAC
HXK2-RV	CCGTTCGTTCCAGAATTATC
HXK1-FW	CCTTAGGACCGTTGAGAGGAATAG
HXK1-RV	TCCCGGAGAACAAAGTAAGTGG
GLK1-FW	AAAAACGGGAAATAACAATAACGAC
GLK1-RV	TGCGATCTTATTAGTGTGTGACATT

상기 PCR 생성물들의 정제 후에(젠일루트(GenElute) PCR 클린-업 키트, 시그마(Sigma), 독일 슈타인하임 소재), 밤새 배양물을 상기 유전자 붕괴 카세트로 형질전환시켰다[3]. 형질전환된 세포를 100 ㎍/㎖ G418(인비보젠(InvivoGen), 미국 샌디에고 소재)을 함유하는 YPD-아가 상에서 선택하였다. 상기 KanMX 카세트의 정확한 통합을 상기 KanMX 카세트 및 표적 유전자(표 1)의 상류 및 하류 영역들에 결합하는 진단 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 단일 콜로니 상에서 PCR에 의해 확인하였다.

다중 유전자 결실을 위해서, 다음 유전자의 결실 전에 상기 KanMX 표지를 보호하였다. 이를 위해서, 세포를, 유도성 Cre-리콤비나제를 발현하고 플레오마이신 내성 유전자 ble^r을 수반하는 pSH65로 형질전환시켰다[5]. 형질전환된 세포를 플레오마이신을 함유하는 YPD 플레이트 상에 펴바르고 콜로니가 나타날 때까지 30 ℃에서 배양하였다. 7.5 ㎍/mL 플레오마이신(인비보젠, 미국 샌디에고 소재)을 함유하는 액체 YP-갈락토스에 여러 플레오마이신 내성 콜로니를 접종하고, 상기 Cre 리콤비나제의 유도를 위해 30 ℃에서 밤새 배양하고, 이를 플레오마이신이 있는 고체 YPD로 옮겼다. 상기 Cre-리콤비나제에 의한 상기 KanMX 카세트의 제거를, YPD 및 YPD-G418 상에서의 플레오마이신-내성 효모 콜로니의 반복 도말에 의해서 및 G418 내성을 상실한 단일 콜로니 상에서의 진단 PCR에 의해서 확인하였다. 후속으로, pSH65의 상실을, 플레오마이신이 없는 YPD에서 5 내지 10 세대 동안 세포를 비-선택적으로 증식시킴으로써 성취하였으며, 그 후에 플레오마이신 내성의 상실을, 플레오마이신의 존재 및 부재 하에서 고체 YPD 상에서의 단일 콜로니의 반복 도말에 의해서 확인하였다. HXK2 , HXK1 및 GLK1의 후속 결실, 및 각 결실 후 KanMX 유전자의 제거는 균주 IMK306, IMK307, IMK311, IMK312 및 IMK318를 생성시켰다(표 3).

본 발명에서 제작되고 사용된 사카로마이세스 세레비지아에 균주
균주	관련 유전자형/특징
DS62504	MAT a MAL2-8c SUC2 ygr059w::{TDH3p-araA; ENO1p-araB; PGI1p-araD} gre3::{TPI1p-TAL1; ADH1p-TKL1; PGI1p-RPE1; ENO1p-RKI1} yel023c::{TPI1p-XylA; TDH1p-XKS1}
IMK306	DS62504로서; Δhxk2::LoxP-KanMX-LoxP
IMK307	DS62504로서; Δhxk2::LoxP
IMK311	DS62504로서; Δhxk2::LoxP Δhxk1::LoxP-KanMX-LoxP
IMK312	DS62504로서; Δhxk2::LoxP Δhxk1::LoxP
IMK318	DS62504로서; Δhxk2::LoxP Δhxk1::LoxP glk1::LoxP-KanMX-LoxP
IMW017	DS62504로서; Δhxk2::LoxP Δhxk1::LoxP glk1::LoxP-KanMX-LoxP; IMK318로부터 유도되고, 글루코스-둔감성 아라비노스 소비에 대해 선택된 단일 콜로니 단리물; 글루코스 및 아라비노스를 공동-소비한다
IMW018	As DS62504; Δhxk2::LoxP Δhxk1::LoxP glk1::LoxP-KanMX-LoxP; IMK318로부터 유도되고, 글루코스-둔감성 아라비노스 소비에 대해 선택된 단일 콜로니 단리물; >2%(w/v) 글루코스의 존재 하에서 아라비노스를 소비한다

글루코스 및 아라비노스 소비에 대한 hxk2 및 hxk2 hxk1 결실의 영향

글루코스 및 아라비노스 소비에 대한 HXK2 및 HXK1 결실의 영향을 측정하기 위해서, 균주 DS62504, IMK307(hxk2Δ) 및 IMK311/IMK312(hxk2Δ hxk1Δ)를 모두 진탕 플라스크(도 1) 및 혐기성 발효기(도 2)에서 2% 아라비노스 및 2% 글루코스의 혼합물이 보충된 MY 중에서 30 ℃에서 배양하였다.

상기 진탕 플라스크 배양을 MY-glc에서 증식시킨 진탕 플라스크 배양물의 접종에 의해 대략 0.05의 초기 OD660에서 시작하였다. 균주 DS62504(도 1)는 21 시간 이내에 글루코스를 소비하였고, 글루코스 고갈 시, 아라비노스 소비를 시작하였다. 상기 두 당은 모두 총 50 시간을 넘는 시간 후에 소비되었다. 균주 IMK307의 배양에서(도 1), 글루코스는 25 시간에 완전히 소비되었고 아라비노스는 그 후 15 시간 안에 고갈되었다. 전체적으로 IMK307은 DS62504에 비해 전체 발효 시간에 있어서 20% 이상의 감소를 나타내었다. 균주 IMK311(도 1)은 대략 30 시간 이내에 2% 글루코스를 소비하였다. 상기 배양물 중에 여전히 대략 10 mM의 글루코스를 남기면서, 아라비노스 소비가 관찰되었다. 상기 아라비노스는 48 시간 이내에 완료되었다. IMK307보다 더 느리지만, IMK311의 전체 발효 시간은 여전히 DS62504의 경우보다 더 짧았다.

혐기성 배양(도 2)은 MY-glc에서 증식된 진탕 플라스크 배양물의 접종에 의해 대략 1의 초기 OD660에서 시작하였다. CO₂ 생성 프로파일을 근거로, 균주 DS64205는 글루코스를 15 시간 미만으로 완전히 소비하였다. 글루코스 소비 중 비 증식률은 0.29 h^-1이었다. 그러나, 아라비노스는 훨씬 더 느린 속도로 소비되었다. 80 시간 후에, 상기 아라비노스의 대략 90%가 상기 발효 브로쓰 중에 여전히 존재한다. 균주 IMK307(hxk2Δ)의 경우 글루코스 소비는 더 느렸다. 상기 CO₂ 생성 프로파일 및 글루코스 측정은 상기 글루코스가 모두 20 시간 이내에 소비되었음을 가리켰다. 글루코스 소비 중 비 증식률은 0.20 h^-1이었다. 아라비노스 소비는 글루코스 고갈 시 시작되었고 66 시간 이내에 상기 아라비노스의 92%가 소비되었으며 이는 균주 DS62504와 비교 시 분명한 개선이다. HXK2(균주 IMK312)에 더하여 HXK1의 결실은 글루코스에 대한 비 증식률에 심한 영향을 미쳤다. 균주 IMK312에 대한 증식률 0.05 h^-1은 균주 IMK307의 경우보다 75% 더 느렸다. 글루코스는 46 시간 이내에 고갈되었다. 상기 46 시간 이내에, 132 mM의 아라비노스의 전체의 대략 10%가 소비되었다. 아라비노스는 112 시간 이내에 완전히 소비되었다.

실시예 2

글루코스의 존재 하에서 아라비노스 상에서 증식하는 IMK318 의 선택

헥소키나제/글루코키나제 결실 균주 IMK318(hxk1 Δ hxk2 Δ glk1 Δ)이 글루코스 단독에서는 증식할 수 없음이, 글루코스 상에서 진탕 플라스크 중의 450 시간의 배양에 의해 확인되었다. 따라서, 상기 균주를 YP-EtOH/Glyc에서 배양하고 글리세롤 첨가 후에 -80 ℃에서 후속 보관하였다. 후속으로, IMK318을 2% 아라비노스를 함유하는 100 ㎖ MY에서 배양하였다. 3일 후에, 대략 1의 OD660에서 2 ㎖의 상기 배양물을 2% 아라비노스를 함유하는 100 ㎖의 신선한 MY로 옮겼다. 대략 12일 후에 상기 배양물의 OD660은 >5이었고 샘플들을 글리세롤 모액으로서 -80 ℃에서 보관하였다. 균주 IMK318을 수일간 MY-ara에서 30 ℃에서 배양하였다. 대략 5의 OD660에서 2 ㎖의 배양물을, 2% 아라비노스 및 변하는 농도의 글루코스, 즉 0, 0.11, 0.23, 0.65, 1.3 및 2.5(w/v)%가 보충된 100 ㎖ MY우레아를 함유하는 6 개의 별도의 진탕 플라스크들로 옮겼다. 이들 6 개의 병행 배양물들의 증식을 OD660 측정에 의해 기록하였다(도 3). 글루코스의 존재 하에서 증식이 지연되는 것으로 관찰되었다. 증가량의 글루코스는 아라비노스 상에서 점점 더 지연되는 증식을 생성시켰다. 이들 병행 배양물 중 2 개(0.65 w/v % 글루코스에서 출발하는 라인 A; 2.5 w/v % 글루코스에서 출발하는 라인 B)를 표 4에 나타낸 이동-계획에 따라 아라비노스 및 글루코스가 보충된 100 ㎖ MY로 연속해서 옮겼다.

지시된 바와 같은 아라비노스(ara) 및 글루코스(glc) 농도를 갖는 MY유레아 중의 균주 IMK318의 일련의 이동된 진탕 플라스크 배양물(SF)의 개략적인 표현. 시리즈 A 및 B의 이동은 최종적으로 각각 단일 콜로니 단리물 IMW018 및 IMW017을 생성시켰다.
시리즈	SF1	SF2	SF3	SF4	SF5	SF6	SF7	단일 콜로니 단리물
A	2%Ara 0.65 Glc	2% Ara 1% Glc	2% Ara 2.5% Glc	2% Ara 2% Glc	2% Ara 2% Glc	2% Ara 2% Glc	2% Ara 2% Glc	IMW018
B	2% Ara 2.5% Glc	2% Ara 2% Glc	2% Ara 2% Glc					IMW017

시리즈 A에서, 배양물을 증가하는 농도의 글루코스를 갖는 배지로 옮겼을 때(표 3), 아라비노스는 완전히 소비되는 반면 상기 글루코스는 10% 미만이 소비되었다(도 4). SF7로부터, 샘플을 100 ㎍/㎖ G418이 보충된 고체 YP-ara 상에 펴바르고 콜로니가 나타날 때까지 30 ℃에서 배양하였다. 별도의 콜로니들을 고체 YP-ara로 옮겼다. 단일 콜로니 단리물을 YP-ara에서 배양하고 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 시리즈의 일련의 이동된 진탕 플라스크의 2 개의 단일 콜로니 단리물을 시험하였으며 이는 혼합된 배양물과 정성적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 이들 단리물 중 하나를 균주 IMW018로서 나타내었다.

시리즈 B(표 3)에서, 진탕 플라스크 배양물을 고정된 농도의 2% 아라비노스 및 2% 글루코스를 갖는 MY 배지에 옮겼다(도 5). 놀랍게도, 아라비노스와 글루코스의 공동-소비가 1차 이동(SF1 → SF2) 후에 관찰되었다. SF3으로부터, 샘플을 100 ㎍/㎖ G418이 보충된 고체 YP-ara 상에 펴바르고 콜로니가 나타날 때까지 30 ℃에서 배양하였다. 별도의 콜로니들을 고체 YP-ara로 옮겼다. 단일 콜로니 단리물을 YP-ara에서 배양하고 -80 ℃에서 글리세롤 모액으로서 보관하였다. 상기 시리즈의 일련의 이동된 진탕 플라스크의 2 개의 단일 콜로니 단리물을 시험하였으며 이는 혼합된 배양물과 정성적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 이들 단리물 중 하나를 균주 IMW017로서 나타내었다.

상기 두 단일 콜로니 단리물 균주 IMW017 및 IMW018의 글루코스 및 아라비노스 소비를 진탕 플라스크 배양물에서 시험하였다(도 4 및 5). 상기 단일 콜로니 단리물은 이들이 기원한 연속적으로 이동된 진탕 플라스크 배양물과 유사한 글루코스- 및 아라비노스 농도 프로파일을 나타내었다. 흥미롭게도, 상기 헥소키나제/글루코키나제 결실 균주 IMK318(hxk1 Δ hxk2 Δ glk1 Δ)을 기본으로 하는 상기 진화 공학 전략에 적용된 글루코스 농도 섭생은 2 개의 상이한 표현형을 생성시켰다: (i) 균주 IMW018에 의한 글루코스-둔감성 아라비노스 소비, 및 (ii) 균주 IMW017에 의한 아라비노스 및 글루코스의 공동-소비.

실시예 3

아라비노스 및 글루코스의 혐기성 공동-배양

균주 IMW017을 일련의 배치 발효기 설비를 사용하여, 글루코스 및 아라비노스의 혼합물에서 혐기적으로 배양하였다. 상기 글루코스/아라비노스 혼합물에서 3 개의 연속적인 배치를 수행하였다(도 6). 각각의 배치에서 글루코스 및 아라비노스가 동시에 소비되었고 에탄올로 발효되었다. CO₂ 생성 프로파일로부터 추론 시, 상기 글루코스/아라비노스 혼합물 상에서의 비 증식률이 첫 번째 배치에서 0.05 h^-1로부터 세 번째 배치에서 0.07 h^-1로 증가하는 것으로 관찰되었다.

추가의 연속적인 배치 발효 동안, 상기 증식률은 훨씬 더 증가한다. 최종 배치로부터 취한 단일 콜로니 단리물 균주는 IMW017에 비해 증가된 비 소비율로 글루코스 및 아라비노스 공동-소비를 나타낸다.

실시예 4

헥소키나제 활성

균주 DS62504, IMK307, IMK312, IMK318, IMW017 및 IMW018의 세포-추출물에서의 헥소키나제 활성을 측정한다. IMK307(hxk2Δ)의 세포 추출물 중의 헥소키나제 활성은 균주 DS62504의 경우보다 더 낮다. IMK312(hxk1Δ hxk2Δ)의 헥소키나제 활성은 IMK307의 경우보다 더 낮은 반면, IMK318(hxk1Δ hxk2Δ glk1Δ)은 헥소키나제 활성을 최저로 나타내거나 전혀 나타내지 않는다. 균주 IMW018에서의 헥소키나제 활성은 IMK318에 대해 관찰된 헥소키나제 활성과 유사한 반면, IMW017은 IMK318보다 더 큰 헥소키나제 활성을 갖는다.

실시예 5

IMW017 중의 미지의 헥소키나제의 확인

진화된 hxk1 hxk2 glk1 균주에서 측정된 헥소키나제 활성을 근거로, 상기 게놈 중에 존재하는 당 키나제를 암호화하는 가능성을 갖는 또 다른 유전자는 활성으로 되거나 또는 글루코스에 대한 그의 기질 특이성이 변화되는 것으로 예상된다. 상기 활성을 암호화하는 유전자를 게놈 분석에 의해 확인한다. 상기 유전자의 추가적인 결실은 상기 헥소키나제 활성의 감소를 생성시킨다. 이러한 4중 녹-아웃 균주는 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비의 진화 공학에 대한 훨씬 더 강한 근거를 제공한다.

실시예 6

IMK318 에서 헥소키나제 또는 글루코키나제 활성의 재도입

글루코스 상에서의 증식을 복원하기 위해서, HXK1, HXK2 또는 GLK1을 IMK318 내에 재-도입시킨다. 활성 측정은 IMK318 중의 이들 유전자 중 하나의 재도입이 증가된 헥소/글루코키나제 활성을 생성시킴을 보인다. 유일한 탄소원으로서 글루코스 상에서의 증식이 복원된다.

실시예 7

IMW018 에서 헥소키나제 또는 글루코키나제 활성의 재도입

활성 측정은 HXK1, HXK2 또는 GLK1의 IMW018 내의 재-도입이 균주 IMW018에 비해 증가된 헥소/글루코키나제 활성을 생성시킴을 보인다. 유일한 탄소원으로서 글루코스 상에서의 증식이 복원된다. HXK1, HXK2 또는 GLK1의 재도입은 유일한 탄소원으로서 글루코스 및 아라비노스 모두에서 증식을 생성시킨다. 상기 생성되는 균주는 글루코스 및 아라비노스의 혼합물에서 증식하며, 이는 글루코스와 아라비노스의 공동-소비를 나타낸다.

실시예 8

IMW017 및 IMW018 의 글루코스 - 둔감성 표현형의 근원적인 돌연변이의 확인

균주 IMW017 및 IMW018의 글루코스-둔감성 표현형을 글루코스 및 아라비노스 함유 배지에서 균주 IMK318의 선택적인 증식 중 축적된 돌연변이에 의해 설명할 수 있을 것으로 예상된다. 이들 돌연변이를 확인하기 위해서, 균주 IMK318, IMW017 및 IMW018의 게놈을 서열화한다. IMW017 대 IMK318 및 IMW018 대 IMK318의 게놈 서열들을 비교함으로써, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성과 같은 게놈 변형을 확인한다. DS62504에의 이들 단일 뉴클레오티드 다형성의 도입은 아라비노스 상에서의 증식이 글루코스에 대해 둔감한 표현형을 생성시킨다.

실시예 9

GAL1 의 결실

나머지 헥소키나제 활성에 기여하는 단백질을 측정하기 위한 또 다른 접근법은 상기 hxk1 hxk2 glk1 균주에서 헥소키나제 활성을 잠재적으로 암호화하는 유전자를 결실시키는 것이다. 이를 위해서, 상기 GAL1 유전자를 상기 hxk1 hxk2 glk1 균주에서 결실시킨다. 상기 생성 균주는 모 hxk1 hxk2 glk1 균주보다 더 낮은 헥소키나제 활성을 나타내거나 또는 모 hxk1 hxk2 glk1 균주에 비해 유일한 탄소원으로서 글루코스 상에서 증식하는 능력의 감소를 보인다. 상기 4중 녹-아웃 균주는 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비의 진화 공학에 대해 훨씬 더 강한 근거를 제공한다.

실시예 10

YDR516c 의 결실

나머지 헥소키나제 활성에 기여하는 단백질을 측정하기 위한 또 다른 접근법은 상기 hxk1 hxk2 glk1 균주에서 헥소키나제 활성을 잠재적으로 암호화하는 유전자를 결실시키는 것이다. 이를 위해서, 상기 YDR516c 유전자를 상기 hxk1 hxk2 glk1 균주에서 결실시킨다. 상기 생성 균주는 모 hxk1 hxk2 glk1 균주보다 더 낮은 헥소키나제 활성을 나타내거나 또는 모 hxk1 hxk2 glk1 균주에 비해 유일한 탄소원으로서 글루코스 상에서 증식하는 능력의 감소를 보인다. 상기 4중 녹-아웃 균주는 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비의 진화 공학에 대해 훨씬 더 강한 근거를 제공한다.

실시예 11

YLR446w 의 결실

나머지 헥소키나제 활성에 기여하는 단백질을 측정하기 위한 또 다른 접근법은 상기 hxk1 hxk2 glk1 균주에서 헥소키나제 활성을 잠재적으로 암호화하는 유전자를 결실시키는 것이다. 이를 위해서, 상기 YLR446w 유전자를 상기 hxk1 hxk2 glk1 균주에서 결실시킨다. 상기 생성 균주는 모 hxk1 hxk2 glk1 균주보다 더 낮은 헥소키나제 활성을 나타내거나 또는 모 hxk1 hxk2 glk1 균주에 비해 유일한 탄소원으로서 글루코스 상에서 증식하는 능력의 감소를 보인다. 상기 4중 녹-아웃 균주는 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비의 진화 공학에 대해 훨씬 더 강한 근거를 제공한다.

실시예 12

아라비노스 및 글루코스의 혐기성 동시-발효

균주 IMW017의 글루코스 및 아라비노스의 동시-소비를 개선시키기 위해서, 균주 IMW017을 일련의 배치 발효기 설비를 사용하여, 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스의 혼합물이 공급된 MY에서 혐기적으로 배양하였다. 처음에, 상기 글루코스/아라비노스 혼합물에서 4 개의 연속적인 배치를 수행하였다. 각각의 배치에서 글루코스 및 아라비노스가 동시에 소비되었고 에탄올로 발효되었다(도 6, 실시예 3). CO₂ 생성 프로파일로부터 추론 시, 상기 글루코스/아라비노스 혼합물 상에서의 비 증식률이 첫 번째 배치에서 0.05 h^-1로부터 네 번째 배치에서 0.06 h^-1로 증가하는 것으로 관찰되었다. 상기 네 번째 배치 후에, 연속적인 배치 배양을 글루코스 및 아라비노스의 혼합물로(배치 번호 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39) 또는 아라비노스 만으로(배치 번호 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 및 40) 수행하였다. MY-아라비노스 및 MY-글루코스/아라비노스에서 각각 19 및 21 배치 후에, 상기 혐기성 증식률이 유일한 탄소원으로서 아라비노스 상에서 0.09 h^-1로 증가하였고 상기 글루코스/아라비노스 혼합물 상에서 0.01 h^-1로 증가하였다(도 7). 상기 개별적인 배치 배양의 CO₂ 생성 프로파일들의 비교는 반복된 배치 섭생이, 각 배치의 동등한 초기 접종 크기를 가정할 때, 아라비노스 만의 경우 또는 글루코스/아라비노스 혼합물의 경우 대략 120 시간에서부터 대략 80 시간으로 발효 시간을 감소시켰음을 보인다(도 8). 상기 글루코스/아라비노스 혼합물에서의 배치 배양에 대해 관찰된 CO₂ 생성의 단일 피크는 글루코스 및 아라비노스가 연속적이라기보다는 동시에 소비됨을 가리킨다(도 8 및 9).

실시예 13

헥소키나제 활성

균주 DS62504, IMK307, IMK312, IMK318, IMW017 및 IMW018의 헥소키나제 활성을 아라비노스가 공급된 YP에서 증식된 진탕 플라스크 배양물의 세포-추출물 중에서 측정하였다. 상기 헥소키나제 반응 혼합물은 50 mM 이미다졸-HCl, pH 7.6, 1 mM NADP⁺, 10 mM MgCl₂, 2 U 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 10 mm D-글루코스 및 세포 추출물로 이루어졌다. 상기 반응을 1 mM ATP의 첨가에 의해 출발시키고 NADPH의 형성을 340 ㎚에서 상기 반응 혼합물의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 균주 DS62504 및 IMK307(hxk2Δ)의 세포 추출물 중의 헥소키나제 활성은 각각 1.2 및 1.3 μmol/분/㎎ 단백질이었다(도 10). IMK312(hxk2 Δ hxk1 Δ)의 세포 추출물 중의 0.4 μmol/분/㎎ 단백질의 헥소키나제 활성은 IMK307의 경우보다 낮았다. 균주 IMK318 및 IMW018(hxk2 Δ hxk1 Δ glk1 Δ)는 0.02 μmol/분/㎎ 단백질 미만의 헥소키나제 활성을 나타내었다. 상기 삼중 hxk2 hxk1 및 glk1 결실에도 불구하고 글루코스를 소비할 수 있는 균주 IMW017은 균주 IMK318 및 IMW018(이둘은 모두 글루코스를 소비할 수 없다)에 비해 더 높은 헥소키나제 활성을 갖는 것으로 예상되었다. 균주 IMW017의 헥소키나제 활성은 또한 상기 분석 조건 하에서 0.02 μmol/분/㎎ 단백질 미만이었다.

실시예 14

IMW017 에서 헥소키나제로서 GAL1 의 확인

글루코스 및 아라비노스의 혼합물 상의 상기 진화된 hxk2 Δ hxk1 Δ glk1 Δ 균주 IMW017의 증식 실험을 근거로, 상기 게놈 중에 존재하는 당 키나제를 암호화하는 가능성을 갖는 또 다른 유전자는 활성으로 되거나 또는 글루코스에 대한 그의 기질 특이성이 변화되는 것으로 예상되었다. 상기 미지의 헥소키나제 활성이 GAL1에 의해 암호화되었는지의 여부를 조사하기 위해서, 상기 GAL1 유전자를 IMW017에서 결실시켰다. pSH65를 사용하여 glk1 유전자 좌로부터 KanMX 카세트를 제거한 후에(실시예 1 참조), GAL1 결실을, 올리고뉴클레오티드 GAL1-DisA 및 GAL1-DisB를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨 G418 내성 카세트의 통합에 의해 성취하였다(표 5). 상기 형질전환된 세포를 100 ㎍/㎖ G418(인비보젠, 미국 샌디에고 소재) 및 1.5%(w/v) 에탄올 및 탄소원으로서 1.5%(w/v) 글리세롤을 함유하는 YPD-아가 상에서 선택하였다. 상기 KanMX 카세트의 정확한 통합을 진단용 올리고뉴클레오티드 GAL1-FW2/KanA 및 GAL1-RV2/KanB의 조합(표 4)을 사용하여 단일 콜로니 상에서 PCR에 의해 확인하였다. 상기 생성되는 균주 IMW023에서 GAL1의 결실을 유일한 탄소원으로서 갈락토스 상에서의 증식 불능에 의해 확인하였다.

흥미롭게도, IMW023은 탄소원으로서 글루코스를 사용할 수 없었으며, 이는 GAL1이 그의 모 hxk2 Δ hxk1 Δ glk1 Δ 균주 IMW017에서 미지의 헥소키나제 활성을 맡고 있음을 가리킨다. 글루코스 및 아라비노스의 혼합물에서 진탕 플라스크 배양 중에, IMW023은 글루코스를 소비하지 않은 반면 아라비노스는 소비되었다(도 11).

GAL1의 결실 및 관련된 진단 목적을 위해 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오타이드들. KanMX 유전자 결실 카세트를 GAL1-DisA 및 GAL1-DisB 올리고뉴클레오타이드의 조합을 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. GAL1을 표적 유전자와 상기 KanMX 유전자 결실 카세트 간의 상동 재조합에 의해 붕괴시켰다. 재조합 부위는 상기 올리고뉴클레오타이드 중의 밑줄그은 영역에 의해 나타낸다. 결실 또는 붕괴를 표적 유전자와 상응하는 FW 및 RV 진단 프라이머와 병용된 진단 프라이머 KanA 및 KanB를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다
GAL1-DisA	TAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGCAGCTGAAGCTTCGTACGC
GAL1-DisB	AATGAGAAGTTGTTCTGAACAAAGTAAAAAAAAGAAGTATACTTACATAGGCCACTAGTGGATCTG
KanA	CGCACGTCAAGACTGTCAAG
KanB	TCGTATGTGAATGCTGGTCG
GAL1-FW2	ATGGCATTATACTCCTGCTAGAAAG
GAL1-RV2	AAAGGATGGCAGAGCATGTTATCG

실시예 15

글루코스의 존재 하에서 아라비노스의 혐기성 발효를 향함

IMW017에서 GAL1p는 또한 헥소키나제 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌으므로, 상기 hxk1 Δ hxk2 Δ glk1 Δ gal1 Δ 균주 IMW023은, 글루코스의 소비 없이, 진화 공학에 의해 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비를 개선시키는 보다 확실한 근거를 제공한다. 상기 배지 중에서 글루코스의 존재 하에 개선된 아라비노스 소비를 선택하기 위해서, 균주 IMW023을 2% 아라비노스 및 2% 글루코스가 공급된 MY 배지에서 일련의 이동에 의해 진탕 플라스크 배양물에서 배양하였다. OD660 측정에 의해 증식을 모니터하고 비 증식률을 배양물당 2 또는 3 회의 OD660 측정으로부터 평가하였다. 글루코스 및 아라비노스 농도를 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 상기 아라비노스/글루코스 혼합물 상에서 63일 동안의 24 회의 일련의 이동 후에, 상기 균주 IMW023의 이동된 배양물은 글루코스 소비 없이 2% 글루코스의 존재 하에서 여전히 아라비노스 상에서 증식할 수 있었다(도 12). 상기 아라비노스 상에서의 비 증식률은 대략 0.06 h^-1로부터 대략 0.11 h^-1로 증가하였다(도 13).

혐기성 조건 하에서 글루코스의 존재 하에 아라비노스를 소비할 수 있고 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비를 추가로 개선시킬 수 있는 세포를 선택하기 위해서, 2% 아라비노스 및 2% 글루코스가 공급된 MY 배지에서 균주 IMW023의 연속적인 이동을 혐기성의 연속적인 배치 발효 설비에서 속행하였다. 이를 위해서, 상기 균주 IMW023의 연속적으로 이동된 배양물(SF24)의 최종 진탕 플라스크 배양물을 접종물로서 사용하였다. 상기 배양의 처음 1000 시간 동안, 질소 기체 대신에 공기를 상기 발효기의 헤드 공간에 공급한 경우에만 오직 증가된 CO₂ 생성이 관찰되었다(도 14). 네 번째 배치 중에 대략 1000 시간의 배양 후에, 배출 기체 중의 CO₂ 농도의 증가가 관찰되었다. 상기 CO₂ 생성 프로파일로부터 추론 시, 상기 혐기성 증식의 첫 번째 배치는 대략 0.03 h^-1의 비 증식률을 나타내었다. 또 다른 10 회의 이동 후에, 상기 비 증식률은 대략 0.06 h^-1까지 증가하였다(도 14). 상기 연속적으로 이동된 배치 배양 동안 아라비노스가 소비된 반면 글루코스는 소비되지 않았다(도 15). 상기 개별적인 배치 배양의 CO₂ 생성 프로파일은 CO₂ 생성율, 및 따라서 아라비노스 소비율이 상기 연속적인 이동 중에 증가하였으며, 이는 아라비노스를 완전히 소비하는데 필요한 발효 시간을 감소시켰음을 보인다(도 16).

상기 최종 배치로부터 취한 단일 콜로니 단리물(균주 IMW058로서 나타낸다)은 IMW023에 비해 글루코스의 존재 하에서 증가된 아라비노스 소비율을 나타낸다.

실시예 16

IMW018 에서 헥소키나제 또는 글루코키나제 활성의 재-도입

균주 IMW018에서 HXK1 , HXK2 또는 GLK1의 재도입을 수행하여 글루코스 상에서의 증식을 복원시켰다. 이를 위해서, HXK2 , HXK1 및 GLK1을 주형으로서 사카로마이세스 세레비지아에 CENPK113-7D의 게놈 DNA를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 조합 HXK2FW/HXK2RV, HXK1FW/HXK1RV 및 GLK1FW/GLK1RV를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물의 정제 후에(젠일루트 PCR 클린-업 키트, 시그마, 독일 슈타인하임 소재), IMW018의 밤새 배양물을 상기 PCR 생성물로 형질전환시켰다(문헌[Gietz and Woods 2002]). 형질전환된 세포를 2%의 글루코스를 함유하는 MY-아가 상에서 글루코스 상에서의 증식에 대해 선택하였다. HXK1 , HXK2 또는 GLK1의 그의 원래 유전자 좌에서의 상동 재조합에 의한 정확한 통합을 진단용 프라이머 쌍을 사용하여 단일 콜로니 상에서 PCR에 의해 확인하였다(표 6).

생성되는 균주 IMW024(HXK2), IMW025(HXK1) 및 IMW047(GLK1)를 글루코스 상에서 증식된 예비 배양물을 사용하여, 2% 글루코스 및 2% 아라비노스가 공급된 MY-우레아 배지(pH 4.7)에서 30 ℃에서 진탕 플라스크 중에서 0.05±0.01의 초기 OD660으로 배양하였다. 비교를 위해서, 균주 DS62504, IMK307 및 IMK311을 동일한 조건 하에서 배양하였다. 증식 및 당 소비를 69 시간 동안 모니터하였다. 균주 IMW024, IMW025 및 IMW047은 모두 글루코스와 아라비노스를 모두 사용할 수 있었다(도 17). IMW018(IMW047)에 GLK1의 재-도입은 빠른 글루코스 및 아라비노스 소비를 생성시켰다. 아라비노스 및 글루코스는 배양 43 시간 이내에 완료되었으며, 이는 IMK307(hxk2 Δ) 및 IMK311(hxk1 Δ hxk2 Δ)에 대해 관찰된 것과 유사하다. 상기 IMW024(HXK2) 및 IMW025(HXK1)에 대해 관찰된 아라비노스 소비는 모두 IMK307 및 IMK311보다 더 느리지만, 어떠한 HXK/GLK 결실도 없는 모 균주 DS62504보다는 더 빠르다(도 17(a)). 아라비노스 및 글루코스의 공동-소비는 오직 균주 IMW047의 경우에만 관찰되었다(도 18). 글루코스가 22 시간째에 고갈되기 전에, 상기 아라비노스의 대략 7%가 소비되었다. 25 시간째에, 글루코스가 완전히 소비되었을 때, 상기 아라비노스의 19%가 사용되었다.

HXK2 , HXK1 및 GLK1의 증폭에 대해 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오타이드들. 이들 PCR 산물의 원래 유전자 좌에서의 통합을, 어닐링 부위가 상기 삽입물 상에 위치하고 상기 통합 부위의 측면 인접 영역 중에 위치하는 진단용 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다.
증폭 프라이머 쌍	DNA 서열
HXK2-FW /	TTCGCCACTGTCTTATCTAC
HXK2-RV	CCGTTCGTTCCAGAATTATC
HXK1-FW /	CCTTAGGACCGTTGAGAGGAATAG
HXK1-RV	TCCCGGAGAACAAAGTAAGTGG
GLK1-FW /	AAAAACGGGAAATAACAATAACGAC
GLK1-RV	TGCGATCTTATTAGTGTGTGACATT
진단용 프라이머 쌍	DNA 서열
HXK2-FW2 /	GATTGCGAGATCCACGAAATTACC
HXK2-RV2	AATCACCGGATTCCTTACCAGTTG
HXK2-FW3 /	GAAATTCACGGGATTTATTCGTGAC
HXK2-RV3	TTTCCATGTTTCTAAGCGTAGTGAG
HXK1-FW2 /	CCCGTTTGTTGGAAGATAGC
HXK1-RV2	CACATCAGCCATGGAACC
HXK1-FW3 /	GCAGGTGCTGCTGTTATTG
HXK1-RV3	CCGAGCTATCCTACGACTTTC
GLK1-FW4 /	GCCCGACAGGGTAACATATTATC
GLK1-RV4	CCGGAATCATAGGAAGACCTTTG
GLK1-FW5 /	AGAGGAAGGTGCACTTGAAGATTG
GLK1-RV5	ATAAGATGGAATTGGCCGGTCTTG

실시예 17

IMW058에서 헥소키나제 또는 글루코키나제 활성의 재-도입.

균주 IMW058에서 HXK1 , HXK2 또는 GLK1의 재도입을 수행하여 글루코스 상에서의 증식을 복원시켰다. 이를 위해서, HXK2 , HXK1 및 GLK1을 주형으로서 사카로마이세스 세레비지아에 CEN.PK 113-7D의 게놈 DNA를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 조합 HXK2FW/HXK2RV, HXK1FW/HXK1RV 및 GLK1FW/GLK1RV를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물의 정제 후에(젠일루트 PCR 클린-업 키트, 시그마, 독일 슈타인하임 소재), IMW058의 밤새 배양물을 상기 PCR 생성물로 형질전환시켰다(문헌[Gietz and Woods 2002]). 형질전환된 세포를 2%의 글루코스를 함유하는 MY-아가 상에서 글루코스 상에서의 증식에 대해 선택하였다. HXK1 , HXK2 또는 GLK1의 그의 원래 유전자 좌에서의 상동 재조합에 의한 정확한 통합을 진단용 올리고뉴클레오티드를 사용하여 단일 콜로니 상에서 PCR에 의해 확인하였다(표 5).

생성되는 균주 IMW059(HXK2), IMW060(HXK1) 및 IMW061(GLK1)을 글루코스 상에서 증식된 예비 배양물을 사용하여, 2% 글루코스 및 2% 아라비노스가 공급된 MY-우레아 배지(pH 4.7)에서 30 ℃에서 진탕 플라스크 중에서 0.05±0.01의 초기 OD660으로 배양하였다. 증식 및 당 소비를 72 시간 동안 모니터하였다. 균주 IMW059, IMW060 및 IMW061은 모두 글루코스와 아라비노스를 모두 사용할 수 있었다(도 17). IMW058에 HXK2의 재-도입은 글루코스 및 아라비노스의 빠른 연속적인 소비를 생성시켰다. 기준 균주 DS62504는 69 시간 이내에 상기 아라비노스를 완전히 소비하지 못했지만(도 17(a)), 균주 IMW059는 대략 46 시간 이내에 상기 아라비노스의 99%를 넘게 소비하였다(도 17(j)).

균주 IMW060(HXK1) 및 IMW061(GLK1)의 경우 글루코스와 아라비노스의 동시적인 소비가 관찰되었다(도 17(k) 및 (l)). 배양의 처음 22 시간 동안, 상기 아라비노스의 대략 18%가 상기 글루코스의 대략 48%와 함께 공동-소비되었다. 배양 50 시간 이내에, 상기 아라비노스의 99%가 소비되었다.

실시예 18

균주 IMK318 , IMW017 및 IMW018 의 비교 상의 전체 게놈 서열화.

균주 IMK318, IMW017 및 IMW018에 대한 전체 게놈 DNA 서열화를 일루미나(Illumina) GAIIx 기술(75 bp 판독, 짝지은 단부)을 사용하여 수행하였다. 서열 판독을 CLC 제노믹스 워크벤치 버전 4.5(CLC Genomics Workbench version 4.5)를 사용하여 사카로마이세스 세레비지아에 CEN.PK 113-7D의 기준 게놈 서열에 대해 정렬시켰다. SNP 분석을 CLC 제노믹스 워크벤치 버전 4.5를 사용하여 수행하였다.

전체로서, SNP 분석은 IMK318, IMW017 및 IMW018을 CEN.PK 113-7D의 기준 서열과 비교 시 아미노산 변화를 생성시키는 암호화 영역 중의 4 개의 돌연변이를 제공하였다.

하나의 돌연변이는 갈락토키나제를 암호화하는 GAL1의 Asp376Val 아미노산 변화를 생성시켰다. 상기 돌연변이는 상기 기준 서열과 비교할 때 IMK318, IMW017 및 IMW018에서 발견되었다(도 19).

놀랍게도, IMW017의 경우 오직 2 개의 독특한 돌연변이만이 발견되었다. 이들 중 하나인 GAL1에서의 Tyr274Phe 돌연변이는 갈락토키나제의 갈락토스 결합 부위에 위치하며, 이는 문헌[Thoden et al.(2005)]에 개시되었다. IMW017에서 GAL1의 결실이 글루코스 상에서의 증식을 제거한다는 관찰과 함께, 상기 돌연변이는 IMW017에서 글루코스 소비를 허용하는 GAL1의 헥소키나제 활성을 맡고 있는 것처럼 보인다. 두 번째 돌연변이는 사카로마이세스 세레비지아에에서 갈락토스 퍼미아제를 암호화하는 GAL2의 막관통 동기 5(Thr219Asn)에서 발견되었다. GAL2p는 아라비노스를 운반할 수 있는 것으로 공지되어 있다(문헌[Kou et al. 1970]; [Becker et al. 2003]). 아라비노스에 대한 친화성을 증가시키거나 글루코스에 대한 친화성을 감소시키는 GAL2 중의 돌연변이는 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비를 개선시킬 것이다.

놀랍게도, 오직 하나의 독특한 돌연변이만이 IMW018의 암호화 영역에서 발견되었다. 이러한 돌연변이는 사카로마이세스 세레비지아에에서 갈락토스 퍼미아제를 암호화하는 GAL2의 막관통 동기 8(Asn376Ser)에 위치하였다. GAL2p는 아라비노스를 운반할 수 있는 것으로 공지되어 있다(문헌[Kou et al. 1970]; [Becker et al. 2003]). 아라비노스에 대한 친화성을 증가시키거나 글루코스에 대한 친화성을 감소시키는 GAL2 중의 돌연변이는 글루코스의 존재 하에서 아라비노스 소비를 개선시킬 것이다.

실시예 19

IMW059 에 의한 글루코스 및 아라비노스의 고속 혐기성 발효

균주 IMW059를 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 있는 MY 배지에서 혐기 배양하였다. 당 소비를 HPCL 측정에 의해 모니터하였다. 효모의 증식을 건조 중량 측정 및 OD660 모니터링에 의해 측정하였다. CO₂ 생성을 배출 기체 중의 CO₂ 농도를 측정함으로써 측정하였다. 에탄올 생산을 상기 CO₂ 생성을 기준으로 계산하였다. 에탄올 증발을 보정하기 위해서, 생산된 에탄올의 양을 CO₂의 측정된 누적 생산 - 바이오매스 합성으로 인해 발생한 CO₂ 생성(바이오매스 그램당 5.85 mmol CO₂) 및 아세테이트 형성과 관련된 CO₂와 같은 것으로 추정하였다.

19 시간 이내에 상기 글루코스가 고갈되었다. 상기 CO₂ 생성 프로파일 및 아라비노스 농도를 근거로(도 21), 아라비노스 소비는 글루코스가 완전히 소비된 후에 시작하였다. 글루코스 및 아라비노스의 공동-소비는 관찰되지 않았다. 74 시간의 혐기 발효 후에 상기 아라비노스의 99%가 소비되었다. 에탄올이 전체 당의 0.43 g/g의 총 수율로 생산되었다. 균주 DS62504의 경우에 대한 CO₂ 생성 프로파일의 비교(도 24)는 글루코스/아라비노스 혼합물의 혐기 발효 중 처음 CO₂ 생성 피크를 근거로, 글루코스 소비가 균주 IMW059의 경우 더 느리다는 것을 보인다. 그러나, 아라비노스는 IMW059에 의해 훨씬 더 빨리 소비되며, 이는 두 번째 CO₂ 생산 피크 중 더 높은 CO₂ 생성 및 더 짧은 총 발효 시간에 의해 반영된다.

실시예 20

IMW060 에 의한 글루코스 및 아라비노스의 혐기성 공동-소비

균주 IMW060을 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 있는 MY 배지에서 혐기 배양하였다. 당 소비를 HPCL 측정에 의해 모니터하였다. 효모의 증식을 건조 중량 측정 및 OD660 모니터링에 의해 측정하였다. CO₂ 생성을 배출 기체 중의 CO₂ 농도를 측정함으로써 측정하였다. 에탄올 생산을 상기 CO₂ 생성을 기준으로 계산하였다. 에탄올 증발을 보정하기 위해서, 생산된 에탄올의 양을 CO₂의 측정된 누적 생산 - 바이오매스 합성으로 인해 발생한 CO₂ 생성(바이오매스 그램당 5.85 mmol CO₂) 및 아세테이트 형성과 관련된 CO₂와 같은 것으로 추정하였다.

상기 CO₂ 생성 프로파일 및 글루코스 및 아라비노스 농도를 근거로(도 22), 아라비노스는 처음 대략 40 시간 이내에 글루코스와 동시에 소비된다. 처음 43 시간 이내에 글루코스가 완전히 소비되는 반면 아라비노스는 41%가 소비되었다. 74 시간의 혐기성 발효 후에 상기 아라비노스의 89%가 소비되었다. 140 시간의 혐기성 발효 후에 상기 아라비노스의 98%가 소비되었다. 에탄올이 전체 당의 0.43 g/g의 총 수율로 생산되었다. 균주 DS62504의 경우에 대한 CO₂ 생성 프로파일의 비교(도 24)는 글루코스/아라비노스 혼합물의 혐기 발효 중 처음 CO₂ 생성 피크를 근거로, 글루코스 소비가 균주 IMW060의 경우 더 느리다는 것을 보인다. 그러나, 상기 글루코스/아라비노스 혼합물을 발효하는 총 시간은 DS62504의 경우보다 더 짧다.

실시예 21

IMW061 에 의한 글루코스 및 아라비노스의 혐기성 공동-소비

균주 IMW061을 20 g/ℓ의 글루코스 및 20 g/ℓ의 아라비노스가 있는 MY 배지에서 혐기 배양하였다. 당 소비를 HPCL 측정에 의해 모니터하였다. 효모의 증식을 건조 중량 측정 및 OD660 모니터링에 의해 측정하였다. CO₂ 생성을 배출 기체 중의 CO₂ 농도를 측정함으로써 측정하였다. 에탄올 생산을 상기 CO₂ 생성을 기준으로 계산하였다. 에탄올 증발을 보정하기 위해서, 생산된 에탄올의 양을 CO₂의 측정된 누적 생산 - 바이오매스 합성으로 인해 발생한 CO₂ 생성(바이오매스 그램당 5.85 mmol CO₂) 및 아세테이트 형성과 관련된 CO₂와 같은 것으로 추정하였다.

상기 CO₂ 생성 프로파일 및 글루코스 및 아라비노스 농도를 근거로(도 23), 아라비노스는 처음 43 시간 이내에 글루코스와 동시에 소비된다. 처음 49 시간 이내에 글루코스가 완전히 소비되는 반면 아라비노스는 73%가 소비되었다. 74 시간의 혐기성 발효 후에 상기 아라비노스의 95%가 소비되었다. 140 시간의 혐기성 발효 후에 상기 아라비노스의 99%가 소비되었다. 에탄올이 전체 당의 0.44 g/g의 총 수율로 생산되었다. 균주 DS62504의 경우에 대한 CO₂ 생성 프로파일의 비교(도 24)는 글루코스/아라비노스 혼합물의 혐기성 발효 중 처음 CO₂ 생성 피크를 근거로, 글루코스 소비가 균주 IMW061의 경우 더 느리다는 것을 보인다. 그러나, 상기 글루코스/아라비노스 혼합물을 발효하는 총 시간은 DS62504의 경우보다 더 짧다.

BAM 에서 수행성능 시험

균주 IMW060 및 IMW061의 수행성능을 시험하기 위해서, 상기 균주들을 2% 글루코스가 보충된 베르두인(Verduyn) 배지에 접종하였다. 대조용으로서, 균주 DS62504를 포함시켰다.

회전 진탕기에서 30 ℃ 및 280 rpm에서 밤새 배양 후에, 세포를 원심분리에 의해 수확하고 CO₂ 생성을 위한 배양을 표 7에 나타낸 당들이 보충된 100 mL 베르듀인 배지 중에서, BAM(생물 활성 모니터)에서 33 ℃에서 수행하였다. 상기 세포를 지시된 농도의 당 및 억제제 아세트산, 쿠마르산, 페룰산, 푸르푸랄, HMF 및 폼산이 보충된 100 mL의 베르듀인 배지에 가하였다. 두 번째 실험에서, 당은 보충되었지만 억제제는 없는 100 mL의 베르듀인 배지를 사용하였다. CO₂ 생성을 꾸준히 모니터하고, 샘플을 분석(600 ㎚에서 광학 밀도, 에탄올 및 잔류 당)을 위해 간격을 두고 취하였다.

상기 BAM 실험의 결과를 억제제가 있는 배지의 경우 도 25, 26 및 27, 및 억제제가 없는 배지의 경우 28, 29 및 30에 도시한다. IMW060 및 IMW061은 모두 글루코스 및 아라비노스 당을 에탄올로 빠르고 동시에 전환시킬 수 있는 반면, 균주 DS62504는 할 수 없다, 즉 DS62504는 글루코스가 배지로부터 배출된 후에 아라비노스를 소비한다는 결론을 내릴 수 있다. 동일한 결과, 즉 아라비노스와 글루코스의 동시-소비가 억제제의 존재 하에서 획득되지만, 모든 당을 소비하는데 걸리는 시간이 문헌으로부터 공지된 바와 같이, 억제제의 존재 하에서 더 느리다.

베르두인 배지 CFMM2M의 조성; CFMM1M은 억제제가 없음을 제외하고 동일한 조성을 갖는다.
성분	양 (g/ℓ)
글루코스	55
아라비노스	35
만노스	05
아세트산	3,0
쿠마르산*	0,03
페룰산*	0,2
푸르푸랄**	0,1
HMF	0,1
폼산	0,1

참고문헌

<110> DSM IP Assets B.V. <120> POLYPEPTIDES WITH PERMEASE ACTIVITY <130> 28283-WO-PCT <140> PCT/EP2011/067726 <141> 2011-10-11 <150> US 61/392,617 <151> 2010-10-13 <150> EP 10075710.3 <151> 2010-10-13 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial DNA <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gttgtaggaa tataattctc cacacataat aagtacgcta attcagctga agcttcgtac 60 gc 62 <210> 2 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial DNA <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 aaaagggcac cttcttgttg ttcaaactta atttacaaat taagtgcata ggccactagt 60 ggatctg 67 <210> 3 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial DNA <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 tttcttttaa tcaaactcac ccaaacaact caattagaat actgcagctg aagcttcgta 60 cgc 63 <210> 4 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial DNA <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 gaataataat attaagggag ggaaaaacac atttatattt cattacagca taggccacta 60 gtggatctg 69 <210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial DNA <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 ctcggacaaa ggtcttccta tgattccggc 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gggccctggt tatcatatgt ccaagcaaaa tttaatgcgt 600 atcacggtcg ttgcagaaca ttatgttggt gttaacaatg gcggtatgga tcaggctgcc 660 tctgtttgcg gtgaggaaga tcatgctcta tacgttgagt tcaaaccgca gttgaaggct 720 actccgttta aatttccgca attaaaaaac catgaaatta gctttgttat tgcgaacacc 780 cttgttgtat ctaacaagtt tgaaaccgcc ccaaccaact ataatttaag agtggtagaa 840 gtcactacag ctgcaaatgt tttagctgcc acgtacggtg ttgttttacc ttctggaaaa 900 gaaggatcga gcacgaataa aggtaatcta agagatttca tgaacgttta ttatgccaga 960 tatcacaaca tttccacacc ctggaacggc gatattgaat ccggcatcga acggttaaca 1020 aagatgctag tactagttga agagtctctc gccaataaga aacagggctt tagtgttgac 1080 gatgtcgcgc aatccttgaa ttgttctcgc gaagaattca caagagacta cttaacaaca 1140 tctccagtga gatttcaagt cttaaagcta tatcagaggg ctaagcatgt gtattctgaa 1200 tctttaagag tcttgaaggc tgtgaaatta atgactacag agagctttac tgccgatgaa 1260 gactttttca agcaatttgg tgccttgatg aacgagtctc aagcttcttg cgataaactt 1320 tacgaatgtt cttgtccaga gattgacaaa atttgttcca ttgctttgtc aaatggatca 1380 tatggttccc gtttgaccgg agctggctgg ggtggttgta ctgttcactt ggttccaggg 1440 ggcccaaatg gcaacataga aaaggtaaaa gaagcccttg ccaatgagtt ctacaaggtc 1500 aagtacccta agatcactga tgctgagctt gaaaatgcta ttatcgtctc taaaccagca 1560 ttgggcagct gtctatatga attataa 1587 <210> 44 <211> 1587 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae IMK318 <400> 44 atgactaaat ctcattcaga agaagtgatt gtacctgagt tcaattctag cgcaaaggaa 60 ttaccaagac cattggccga aaagtgcccg agcataatta agaaatttat aagcgcttat 120 gatgctaaac cggattttgt tgctagatcg cctggtagag tcaatctaat tggtgaacat 180 attgattatt gtgacttctc ggttttacct ttagctattg attttgatat gctttgcgcc 240 gtcaaagttt tgaacgagaa aaatccatcc attaccttaa taaatgctga tcccaaattt 300 gctcaaagga agttcgattt gccgttggac ggttcttatg tcacaattga tccttctgtg 360 tcagactggt ctaattactt taaatgtggt ctccatgttg ctcactcttt tctaaagaaa 420 cttgcaccgg aaaggtttgc cagtgctcct ctggccgggc tgcaagtctt ctgtgagggt 480 gatgtaccaa ctggcagtgg attgtcttct tcggccgcat tcatttgtgc cgttgcttta 540 gctgttgtta aagcgaatat gggccctggt tatcatatgt ccaagcaaaa tttaatgcgt 600 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1500 aagtacccta agatcactga tgctgagctt gaaaatgcta ttatcgtctc taaaccagca 1560 ttgggcagct gtctatatga attataa 1587 <210> 46 <211> 1587 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae IMW018 <400> 46 atgactaaat ctcattcaga agaagtgatt gtacctgagt tcaattctag cgcaaaggaa 60 ttaccaagac cattggccga aaagtgcccg agcataatta agaaatttat aagcgcttat 120 gatgctaaac cggattttgt tgctagatcg cctggtagag tcaatctaat tggtgaacat 180 attgattatt gtgacttctc ggttttacct ttagctattg attttgatat gctttgcgcc 240 gtcaaagttt tgaacgagaa aaatccatcc attaccttaa taaatgctga tcccaaattt 300 gctcaaagga agttcgattt gccgttggac ggttcttatg tcacaattga tccttctgtg 360 tcagactggt ctaattactt taaatgtggt ctccatgttg ctcactcttt tctaaagaaa 420 cttgcaccgg aaaggtttgc cagtgctcct ctggccgggc tgcaagtctt ctgtgagggt 480 gatgtaccaa ctggcagtgg attgtcttct tcggccgcat tcatttgtgc cgttgcttta 540 gctgttgtta aagcgaatat gggccctggt tatcatatgt ccaagcaaaa tttaatgcgt 600 atcacggtcg ttgcagaaca ttatgttggt gttaacaatg gcggtatgga tcaggctgcc 660 tctgtttgcg gtgaggaaga tcatgctcta tacgttgagt tcaaaccgca gttgaaggct 720 actccgttta aatttccgca attaaaaaac catgaaatta gctttgttat tgcgaacacc 780 cttgttgtat ctaacaagtt tgaaaccgcc ccaaccaact ataatttaag agtggtagaa 840 gtcactacag ctgcaaatgt tttagctgcc acgtacggtg ttgttttacc ttctggaaaa 900 gaaggatcga gcacgaataa aggtaatcta agagatttca tgaacgttta ttatgccaga 960 tatcacaaca tttccacacc ctggaacggc gatattgaat ccggcatcga acggttaaca 1020 aagatgctag tactagttga agagtctctc gccaataaga aacagggctt tagtgttgac 1080 gatgtcgcgc aatccttgaa ttgttctcgc gaagaattca caagagtcta cttaacaaca 1140 tctccagtga gatttcaagt cttaaagcta tatcagaggg ctaagcatgt gtattctgaa 1200 tctttaagag tcttgaaggc tgtgaaatta atgactacag agagctttac tgccgatgaa 1260 gactttttca agcaatttgg tgccttgatg aacgagtctc aagcttcttg cgataaactt 1320 tacgaatgtt cttgtccaga gattgacaaa atttgttcca ttgctttgtc aaatggatca 1380 tatggttccc gtttgaccgg agctggctgg ggtggttgta ctgttcactt ggttccaggg 1440 ggcccaaatg gcaacataga aaaggtaaaa gaagcccttg ccaatgagtt ctacaaggtc 1500 aagtacccta agatcactga tgctgagctt gaaaatgcta ttatcgtctc 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atgtttcgct tggtcattat ttatgattgg cgctttgacg 780 ttagttcctg aatccccacg ttatttatgt gaggtgaata aggtagaaga cgccaagctt 840 tccattgcta agtctaacaa ggtgtcacca gaggatcctg ccgtccaggc agagttagat 900 ctgatcatgg ccggtataga agctgaaaaa ctggctggca atgcgtcctg gggggaatta 960 ttttccacca agaccaaagt atttcaacgt ttgttgatgg gtgtatttgt tcaaatgttc 1020 caacaattaa ccggtaacaa ttattttttc tactacggta ccgttatttt caagtcagtt 1080 ggcctggatg attcctttga aacatccatt gtcattggtg tagtcaactt tgcctccact 1140 ttctttagtt tgtggactgt cgaaaacttg gggcgtcgta aatgtttact tttgggcgct 1200 gccactatga tggcttgtat ggtcatctac gcctctgttg gtgttaccag attatatcct 1260 cacggtaaaa gccagccatc ttctaaaggt gccggtaact gtatgattgt ctttacctgt 1320 ttttatattt tctgttatgc cacaacctgg gcgccagttg cctgggtcat cacagcagaa 1380 tcattcccac tgagagtcaa gtcgaaatgt atggcgttgg cctctgcttc caattgggta 1440 tgggggttct tgattgcatt tttcacccca ttcatcacat ctgccattaa cttctactac 1500 ggttatgtct tcatgggctg tttggttgcc atgttttttt atgtcttttt ctttgttcca 1560 gaaactaaag gcctatcgtt agaagaaatt caagaattat gggaagaagg tgttttacct 1620 tggaaatctg aaggctggat tccttcatcc agaagaggta ataattacga tttagaggat 1680 ttacaacatg acgacaaacc gtggtacaag gccatgctag aataa 1725 <210> 48 <211> 1725 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae IMK318 <400> 48 atggcagttg aggagaacaa tatgcctgtt gtttcacagc aaccccaagc tggtgaagac 60 gtgatctctt cactcagtaa agattcccat ttaagcgcac aatctcaaaa gtattccaat 120 gatgaattga aagccggtga gtcagggcct gaaggctccc aaagtgttcc tatagagata 180 cccaagaagc ccatgtctga atatgttacc gtttccttgc tttgtttgtg tgttgccttc 240 ggcggcttca tgtttggctg ggataccggt actatttctg ggtttgttgt ccaaacagac 300 tttttgagaa ggtttggtat gaaacataag gatggtaccc actatttgtc aaacgtcaga 360 acaggtttaa tcgtcgccat tttcaatatt ggctgtgcct ttggtggtat tatactttcc 420 aaaggtggag atatgtatgg ccgtaaaaag ggtctttcga ttgtcgtctc ggtttatata 480 gttggtatta tcattcaaat tgcctctatc aacaagtggt accaatattt cattggtaga 540 atcatatctg gtttgggtgt cggcggcatc gccgtcttat gtcctatgtt gatctctgaa 600 attgctccaa agcacttgag aggcacacta gtttcttgtt atcagctgat 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1500 ggttatgtct tcatgggctg tttggttgcc atgttttttt atgtcttttt ctttgttcca 1560 gaaactaaag gcctatcgtt agaagaaatt caagaattat gggaagaagg tgttttacct 1620 tggaaatctg aaggctggat tccttcatcc agaagaggta ataattacga tttagaggat 1680 ttacaacatg acgacaaacc gtggtacaag gccatgctag aataa 1725 <210> 49 <211> 1725 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae IMW017 <400> 49 atggcagttg aggagaacaa tatgcctgtt gtttcacagc aaccccaagc tggtgaagac 60 gtgatctctt cactcagtaa agattcccat ttaagcgcac aatctcaaaa gtattccaat 120 gatgaattga aagccggtga gtcagggcct gaaggctccc aaagtgttcc tatagagata 180 cccaagaagc ccatgtctga atatgttacc gtttccttgc tttgtttgtg tgttgccttc 240 ggcggcttca tgtttggctg ggataccggt actatttctg ggtttgttgt ccaaacagac 300 tttttgagaa ggtttggtat gaaacataag gatggtaccc actatttgtc aaacgtcaga 360 acaggtttaa tcgtcgccat tttcaatatt ggctgtgcct ttggtggtat tatactttcc 420 aaaggtggag atatgtatgg ccgtaaaaag ggtctttcga ttgtcgtctc ggtttatata 480 gttggtatta tcattcaaat tgcctctatc aacaagtggt accaatattt cattggtaga 540 atcatatctg gtttgggtgt 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Ala Val Val Lys Ala Asn Met Gly Pro Gly Tyr His 180 185 190 Met Ser Lys Gln Asn Leu Met Arg Ile Thr Val Val Ala Glu His Tyr 195 200 205 Val Gly Val Asn Asn Gly Gly Met Asp Gln Ala Ala Ser Val Cys Gly 210 215 220 Glu Glu Asp His Ala Leu Tyr Val Glu Phe Lys Pro Gln Leu Lys Ala 225 230 235 240 Thr Pro Phe Lys Phe Pro Gln Leu Lys Asn His Glu Ile Ser Phe Val 245 250 255 Ile Ala Asn Thr Leu Val Val Ser Asn Lys Phe Glu Thr Ala Pro Thr 260 265 270 Asn Tyr Asn Leu Arg Val Val Glu Val Thr Thr Ala Ala Asn Val Leu 275 280 285 Ala Ala Thr Tyr Gly Val Val Leu Pro Ser Gly Lys Glu Gly Ser Ser 290 295 300 Thr Asn Lys Gly Asn Leu Arg Asp Phe Met Asn Val Tyr Tyr Ala Arg 305 310 315 320 Tyr His Asn Ile Ser Thr Pro Trp Asn Gly Asp Ile Glu Ser Gly Ile 325 330 335 Glu Arg Leu Thr Lys Met Leu Val Leu Val Glu Glu Ser Leu Ala Asn 340 345 350 Lys Lys Gln Gly Phe Ser Val Asp Asp Val Ala Gln Ser Leu Asn Cys 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Phe Thr Arg Val Tyr Leu Thr Thr Ser Pro Val Arg 370 375 380 Phe Gln Val Leu Lys Leu Tyr Gln Arg Ala Lys His Val Tyr Ser Glu 385 390 395 400 Ser Leu Arg Val Leu Lys Ala Val Lys Leu Met Thr Thr Glu Ser Phe 405 410 415 Thr Ala Asp Glu Asp Phe Phe Lys Gln Phe Gly Ala Leu Met Asn Glu 420 425 430 Ser Gln Ala Ser Cys Asp Lys Leu Tyr Glu Cys Ser Cys Pro Glu Ile 435 440 445 Asp Lys Ile Cys Ser Ile Ala Leu Ser Asn Gly Ser Tyr Gly Ser Arg 450 455 460 Leu Thr Gly Ala Gly Trp Gly Gly Cys Thr Val His Leu Val Pro Gly 465 470 475 480 Gly Pro Asn Gly Asn Ile Glu Lys Val Lys Glu Ala Leu Ala Asn Glu 485 490 495 Phe Tyr Lys Val Lys Tyr Pro Lys Ile Thr Asp Ala Glu Leu Glu Asn 500 505 510 Ala Ile Ile Val Ser Lys Pro Ala Leu Gly Ser Cys Leu Tyr Glu Leu 515 520 525 <210> 53 <211> 528 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae IMW017 <400> 53 Met Thr Lys Ser His Ser Glu Glu Val Ile Val Pro Glu Phe Asn Ser 1 5 10 15 Ser Ala Lys Glu Leu Pro Arg Pro Leu Ala Glu Lys Cys Pro Ser Ile 20 25 30 Ile Lys Lys Phe Ile Ser Ala Tyr Asp Ala Lys Pro Asp Phe Val Ala 35 40 45 Arg Ser Pro Gly Arg Val Asn Leu 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Phe Glu Thr Ala Pro Thr 260 265 270 Asn Phe Asn Leu Arg Val Val Glu Val Thr Thr Ala Ala Asn Val Leu 275 280 285 Ala Ala Thr Tyr Gly Val Val Leu Pro Ser Gly Lys Glu Gly Ser Ser 290 295 300 Thr Asn Lys Gly Asn Leu Arg Asp Phe Met Asn Val Tyr Tyr Ala Arg 305 310 315 320 Tyr His Asn Ile Ser Thr Pro Trp Asn Gly Asp Ile Glu Ser Gly Ile 325 330 335 Glu Arg Leu Thr Lys Met Leu Val Leu Val Glu Glu Ser Leu Ala Asn 340 345 350 Lys Lys Gln Gly Phe Ser Val Asp Asp Val Ala Gln Ser Leu Asn Cys 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Phe Thr Arg Val Tyr Leu Thr Thr Ser Pro Val Arg 370 375 380 Phe Gln Val Leu Lys Leu Tyr Gln Arg Ala Lys His Val Tyr Ser Glu 385 390 395 400 Ser Leu Arg Val Leu Lys Ala Val Lys Leu Met Thr Thr Glu Ser Phe 405 410 415 Thr Ala Asp Glu Asp Phe Phe Lys Gln Phe Gly Ala Leu Met Asn Glu 420 425 430 Ser Gln Ala Ser Cys Asp Lys Leu Tyr Glu Cys Ser Cys Pro Glu Ile 435 440 445 Asp Lys Ile Cys Ser Ile Ala Leu Ser Asn Gly Ser Tyr Gly Ser Arg 450 455 460 Leu Thr Gly Ala Gly Trp Gly Gly Cys Thr Val 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340 345 350 Lys Lys Gln Gly Phe Ser Val Asp Asp Val Ala Gln Ser Leu Asn Cys 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Phe Thr Arg Val Tyr Leu Thr Thr Ser Pro Val Arg 370 375 380 Phe Gln Val Leu Lys Leu Tyr Gln Arg Ala Lys His Val Tyr Ser Glu 385 390 395 400 Ser Leu Arg Val Leu Lys Ala Val Lys Leu Met Thr Thr Glu Ser Phe 405 410 415 Thr Ala Asp Glu Asp Phe Phe Lys Gln Phe Gly Ala Leu Met Asn Glu 420 425 430 Ser Gln Ala Ser Cys Asp Lys Leu Tyr Glu Cys Ser Cys Pro Glu Ile 435 440 445 Asp Lys Ile Cys Ser Ile Ala Leu Ser Asn Gly Ser Tyr Gly Ser Arg 450 455 460 Leu Thr Gly Ala Gly Trp Gly Gly Cys Thr Val His Leu Val Pro Gly 465 470 475 480 Gly Pro Asn Gly Asn Ile Glu Lys Val Lys Glu Ala Leu Ala Asn Glu 485 490 495 Phe Tyr Lys Val Lys Tyr Pro Lys Ile Thr Asp Ala Glu Leu Glu Asn 500 505 510 Ala Ile Ile Val Ser Lys Pro Ala Leu Gly Ser Cys Leu Tyr Glu Leu 515 520 525 <210> 55 <211> 574 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D <400> 55 Met Ala Val Glu Glu Asn Asn Met Pro Val Val Ser Gln Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Gly Glu Asp Val Ile Ser Ser Leu Ser Lys Asp Ser His Leu Ser 20 25 30 Ala Gln Ser Gln Lys Tyr Ser Asn Asp Glu Leu Lys Ala Gly Glu Ser 35 40 45 Gly Pro Glu Gly Ser Gln Ser Val Pro Ile Glu Ile Pro Lys Lys Pro 50 55 60 Met Ser Glu Tyr Val Thr Val Ser Leu Leu Cys Leu Cys Val Ala Phe 65 70 75 80 Gly Gly Phe Met Phe Gly Trp Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val 85 90 95 Val Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe Gly Met Lys His Lys Asp Gly 100 105 110 Thr His Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu Ile Val Ala Ile Phe 115 120 125 Asn Ile Gly Cys Ala Phe Gly Gly Ile Ile Leu Ser Lys Gly Gly Asp 130 135 140 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Gly Leu Ser Ile Val Val Ser Val Tyr Ile 145 150 155 160 Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr 165 170 175 Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Ala Val 180 185 190 Leu Cys Pro Met Leu Ile Ser Glu Ile Ala Pro Lys His Leu Arg Gly 195 200 205 Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ala Gly Ile Phe Leu 210 215 220 Gly 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Cys Met Ile Val Phe Thr Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Tyr Ala Thr 435 440 445 Thr Trp Ala Pro Val Ala Trp Val Ile Thr Ala Glu Ser Phe Pro Leu 450 455 460 Arg Val Lys Ser Lys Cys Met Ala Leu Ala Ser Ala Ser Asn Trp Val 465 470 475 480 Trp Gly Phe Leu Ile Ala Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile 485 490 495 Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met Gly Cys Leu Val Ala Met Phe 500 505 510 Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu 515 520 525 Glu Ile Gln Glu Leu Trp Glu Glu Gly Val Leu Pro Trp Lys Ser Glu 530 535 540 Gly Trp Ile Pro Ser Ser Arg Arg Gly Asn Asn Tyr Asp Leu Glu Asp 545 550 555 560 Leu Gln His Asp Asp Lys Pro Trp Tyr Lys Ala Met Leu Glu 565 570 <210> 56 <211> 574 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae IMK318 <400> 56 Met Ala Val Glu Glu Asn Asn Met Pro Val Val Ser Gln Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Gly Glu Asp Val Ile Ser Ser Leu Ser Lys Asp Ser His Leu Ser 20 25 30 Ala Gln Ser Gln Lys Tyr Ser Asn Asp Glu Leu Lys Ala Gly Glu Ser 35 40 45 Gly Pro Glu Gly Ser Gln Ser Val Pro Ile Glu Ile Pro Lys Lys Pro 50 55 60 Met Ser Glu Tyr Val Thr Val Ser Leu Leu Cys Leu Cys Val Ala Phe 65 70 75 80 Gly Gly Phe Met Phe Gly Trp Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val 85 90 95 Val Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe Gly Met Lys His Lys Asp Gly 100 105 110 Thr His Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu Ile Val Ala Ile Phe 115 120 125 Asn Ile Gly Cys Ala Phe Gly Gly Ile Ile Leu Ser Lys Gly Gly Asp 130 135 140 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Gly Leu Ser Ile Val Val Ser Val Tyr Ile 145 150 155 160 Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr 165 170 175 Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Ala Val 180 185 190 Leu Cys Pro Met Leu Ile Ser Glu Ile Ala Pro Lys His Leu Arg Gly 195 200 205 Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ala Gly Ile Phe Leu 210 215 220 Gly Tyr Cys Thr Asn Tyr Gly Thr Lys Ser Tyr Ser Asn Ser Val Gln 225 230 235 240 Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala Trp Ser Leu Phe Met Ile 245 250 255 Gly Ala Leu Thr Leu Val Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Cys Glu Val 260 265 270 Asn Lys Val Glu Asp Ala Lys Leu Ser Ile Ala Lys Ser Asn Lys Val 275 280 285 Ser Pro Glu Asp Pro Ala Val Gln Ala Glu Leu Asp Leu Ile Met Ala 290 295 300 Gly Ile Glu Ala Glu Lys Leu Ala Gly Asn Ala Ser Trp Gly Glu Leu 305 310 315 320 Phe Ser Thr Lys Thr Lys Val Phe Gln Arg Leu Leu Met Gly Val Phe 325 330 335 Val Gln Met Phe Gln Gln Leu Thr Gly Asn Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr 340 345 350 Gly Thr Val Ile Phe Lys Ser Val Gly Leu Asp Asp Ser Phe Glu Thr 355 360 365 Ser Ile Val Ile Gly Val Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Phe Ser Leu 370 375 380 Trp Thr Val Glu Asn Leu Gly Arg Arg Lys Cys Leu Leu Leu Gly Ala 385 390 395 400 Ala Thr Met Met Ala Cys Met Val Ile Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr 405 410 415 Arg Leu Tyr Pro His Gly Lys Ser Gln Pro Ser Ser Lys Gly Ala Gly 420 425 430 Asn Cys Met Ile Val Phe Thr Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Tyr Ala Thr 435 440 445 Thr Trp Ala Pro Val Ala Trp Val Ile Thr Ala Glu Ser Phe Pro Leu 450 455 460 Arg Val Lys Ser Lys Cys Met Ala Leu Ala Ser Ala Ser Asn Trp Val 465 470 475 480 Trp Gly Phe Leu Ile Ala Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile 485 490 495 Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met Gly Cys Leu Val Ala Met Phe 500 505 510 Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu 515 520 525 Glu Ile Gln Glu Leu Trp Glu Glu Gly Val Leu Pro Trp Lys Ser Glu 530 535 540 Gly Trp Ile Pro Ser Ser Arg Arg Gly Asn Asn Tyr Asp Leu Glu Asp 545 550 555 560 Leu Gln His Asp Asp Lys Pro Trp Tyr Lys Ala Met Leu Glu 565 570 <210> 57 <211> 574 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae IMW017 <400> 57 Met Ala Val Glu Glu Asn Asn Met Pro Val Val Ser Gln Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Gly Glu Asp Val Ile Ser Ser Leu Ser Lys Asp Ser His Leu Ser 20 25 30 Ala Gln Ser Gln Lys Tyr Ser Asn Asp Glu Leu Lys Ala Gly Glu Ser 35 40 45 Gly Pro Glu Gly Ser Gln Ser Val Pro Ile Glu Ile Pro Lys Lys Pro 50 55 60 Met Ser Glu Tyr Val Thr Val Ser Leu Leu Cys Leu Cys Val Ala Phe 65 70 75 80 Gly Gly Phe Met Phe Gly Trp Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val 85 90 95 Val Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe Gly Met Lys His Lys Asp Gly 100 105 110 Thr His Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu Ile Val Ala Ile Phe 115 120 125 Asn Ile Gly Cys Ala Phe Gly Gly Ile Ile Leu Ser Lys Gly Gly Asp 130 135 140 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Gly Leu Ser Ile Val Val Ser Val Tyr Ile 145 150 155 160 Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr 165 170 175 Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Ala Val 180 185 190 Leu Cys Pro Met Leu Ile Ser Glu Ile Ala Pro Lys His Leu Arg Gly 195 200 205 Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met Ile Asn Ala Gly Ile Phe Leu 210 215 220 Gly Tyr Cys Thr Asn Tyr Gly Thr Lys Ser Tyr Ser Asn Ser Val Gln 225 230 235 240 Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala Trp Ser Leu Phe Met Ile 245 250 255 Gly Ala Leu Thr Leu Val Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Cys Glu Val 260 265 270 Asn Lys Val Glu Asp Ala Lys Leu Ser Ile Ala Lys Ser Asn Lys Val 275 280 285 Ser Pro Glu Asp Pro Ala Val Gln Ala Glu Leu Asp Leu Ile Met Ala 290 295 300 Gly Ile Glu Ala Glu Lys Leu Ala Gly Asn Ala Ser Trp Gly Glu Leu 305 310 315 320 Phe Ser Thr Lys Thr Lys Val Phe Gln Arg Leu Leu Met Gly Val Phe 325 330 335 Val Gln Met Phe Gln Gln Leu Thr Gly Asn Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr 340 345 350 Gly Thr Val Ile Phe Lys Ser Val Gly Leu Asp Asp Ser Phe Glu Thr 355 360 365 Ser Ile Val Ile Gly Val Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Phe Ser Leu 370 375 380 Trp Thr Val Glu Asn Leu Gly Arg Arg Lys Cys Leu Leu Leu Gly Ala 385 390 395 400 Ala Thr Met Met Ala Cys Met Val Ile Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr 405 410 415 Arg Leu Tyr Pro His Gly Lys Ser Gln Pro Ser Ser Lys Gly Ala Gly 420 425 430 Asn Cys Met Ile Val Phe Thr Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Tyr Ala Thr 435 440 445 Thr Trp Ala Pro Val Ala Trp Val Ile Thr Ala Glu Ser Phe Pro Leu 450 455 460 Arg Val Lys Ser Lys Cys Met Ala Leu Ala Ser Ala Ser Asn Trp Val 465 470 475 480 Trp Gly Phe Leu Ile Ala Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile 485 490 495 Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met Gly Cys Leu Val Ala Met Phe 500 505 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Gly Ile Ile Leu Ser Lys Gly Gly Asp 130 135 140 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Gly Leu Ser Ile Val Val Ser Val Tyr Ile 145 150 155 160 Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr 165 170 175 Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Ala Val 180 185 190 Leu Cys Pro Met Leu Ile Ser Glu Ile Ala Pro Lys His Leu Arg Gly 195 200 205 Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ala Gly Ile Phe Leu 210 215 220 Gly Tyr Cys Thr Asn Tyr Gly Thr Lys Ser Tyr Ser Asn Ser Val Gln 225 230 235 240 Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala Trp Ser Leu Phe Met Ile 245 250 255 Gly Ala Leu Thr Leu Val Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Cys Glu Val 260 265 270 Asn Lys Val Glu Asp Ala Lys Leu Ser Ile Ala Lys Ser Asn Lys Val 275 280 285 Ser Pro Glu Asp Pro Ala Val Gln Ala Glu Leu Asp Leu Ile Met Ala 290 295 300 Gly Ile Glu Ala Glu Lys Leu Ala Gly Asn Ala Ser Trp Gly Glu Leu 305 310 315 320 Phe Ser Thr Lys Thr Lys Val Phe Gln Arg Leu Leu Met Gly Val Phe 325 330 335 Val Gln Met Phe Gln Gln Leu Thr Gly Asn Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr 340 345 350 Gly Thr Val Ile Phe Lys Ser Val Gly Leu Asp Asp Ser Phe Glu Thr 355 360 365 Ser Ile Val Ile Gly Val Val Ser Phe Ala Ser Thr Phe Phe Ser Leu 370 375 380 Trp Thr Val Glu Asn Leu Gly Arg Arg Lys Cys Leu Leu Leu Gly Ala 385 390 395 400 Ala Thr Met Met Ala Cys Met Val Ile Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr 405 410 415 Arg Leu Tyr Pro His Gly Lys Ser Gln Pro Ser Ser Lys Gly Ala Gly 420 425 430 Asn Cys Met Ile Val Phe Thr Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Tyr Ala Thr 435 440 445 Thr Trp Ala Pro Val Ala Trp Val Ile Thr Ala Glu Ser Phe Pro Leu 450 455 460 Arg Val Lys Ser Lys Cys Met Ala Leu Ala Ser Ala Ser Asn Trp Val 465 470 475 480 Trp Gly Phe Leu Ile Ala Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile 485 490 495 Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met Gly Cys Leu Val Ala Met Phe 500 505 510 Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu 515 520 525 Glu Ile Gln Glu Leu Trp Glu Glu Gly Val Leu Pro Trp Lys Ser Glu 530 535 540 Gly Trp Ile Pro Ser Ser Arg Arg Gly Asn Asn Tyr Asp Leu Glu Asp 545 550 555 560 Leu Gln His Asp Asp Lys Pro Trp Tyr Lys Ala Met Leu Glu 565 570

Claims (14)

1. 서열번호 55의 T219에 상응하는 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호 55와 50 % 이상 서열 동일성을 갖고 투과효소 활성을 갖는 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서,
   치환 T219N 또는 T219Q를 갖는 폴리펩티드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   치환 T219N을 갖는 폴리펩티드.
4. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   GAL2 활성을 갖는 폴리펩티드.
5. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   하나 이상의 하기 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 폴리펩티드 중 (a) 내지 (k)의 위치가 서열번호 55의 위치에 상응하는 폴리펩티드:
   (a) G90;
   (b) G135;
   (c) G147;
   (d) G184-X(3)-G188-X(11)-E200-X(2)-P203-X(3)-R207-X(7)-Q215;
   (e) Q215;
   (f) G345-X(1)-N347;
   (g) Y352;
   (h) Y446;
   (i) E460;
   (j) F504; 및/또는
   (k) E521.
6. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   서열 GXXXGXXXXXXXXXXXXEXXPXXXRXXXXXXXQ를 포함하는 폴리펩티드.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 50에 50 % 이상 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
8. 제 7 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물.
9. 제 8 항에 따른 핵산 구축물로 형질전환된 숙주 세포.
10. 제 9 항에 있어서,
    효모인 형질전환된 숙주 세포.
11. 제 10 항에 있어서,
    사카로마이세스(Saccharomyces) 속(genus)에 속하는 형질전환된 숙주 세포.
12. 제 11 항에 있어서,
    사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 종(species)에 속하는 형질전환된 숙주 세포.
13. 리그노셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 물질의 분해 방법으로서, 리그노셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 물질을 효소 조성물과 접촉시켜 하나 이상의 당을 생성하고, 생성된 당을 발효시켜 발효 생성물을 수득하되, 상기 발효를 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 숙주 세포를 사용하여 수행하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서,
    발효 생성물이 하나 이상의 에탄올, 부탄올, 락트산, 플라스틱, 유기산, 용매, 동물 사료 보충제, 약제, 비타민, 아미노산, 효소 또는 화학 공급원료인 방법.

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