CN111304228B

CN111304228B - 一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN111304228B
Application number: CN202010193552.4A
Authority: CN
Inventors: 龙翔宇; 方永军; 房平昌; 秦云霞; 阳江华; 肖小虎
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2040-03-18
Also published as: CN111304228A

Abstract

本发明提供了一种如SEQ ID NO:1所示的橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用。本发明首次克隆了橡胶树己糖激酶HbHXK4基因的全长cDNA，该基因编码的蛋白具有己糖激酶的功能，该基因转入原核表达菌株后获得的转基因菌株在正常培养条件下生长速率明显提高。基因表达分析显示该基因在树皮、种子及叶片中高表达，在胶乳中该基因在同家族基因中表达量为最高；同时受割胶诱导上调表达，与橡胶树胶乳产量呈正相关，受乙烯和高低温胁迫诱导下调表达，该基因可能与外界胁迫刺激相关，可作为靶基因来研究防控非生物胁迫效应。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用。

Description

一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

己糖激酶(hexokinase,HXK,EC 2.7.1.1)作为植物体呼吸代谢过程中的关键酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用，近年来研究表明HXK也参与植物的糖感受和糖信号转导过程，是植物糖与激素联系的一个关键元件(秦巧平，张上隆，徐昌杰.己糖激酶与植物生长发育[J].植物生理学通讯,2003,39(1):1-8.)。大多数高等植物通过光合作用在叶片部位合成碳水化合物，并主要以蔗糖形式通过韧皮部运输分配到库组织中。库组织中的蔗糖可被直接储藏，也可被蔗糖合酶或转化酶作用下分解为己糖(Tang,C.R.,Huang,D.B.,Yang,J.H.,Liu,S.J.,Sakr,S.,&Li,H.P..(2010).The sucrose transporter HbSUT3 plays anactive role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity inexploited trees of Hevea Brasiliensis(para rubber tree).Plant Cell&Environment,33(10),1708-1720.Liu,S.,Lan,J.,Zhou,B.,Qin,Y.,Zhou,Y.,Xiao,X.,Yang,J.,Gou,Q.,Qi,J.,Huang,Y.,&Tang,C..(2015).HbNIN2,a cytosolic alkaline/neutral-invertase,is responsible for sucrose catabolism in rubber-producinglaticifers of Hevea brasiliensis(para rubber tree).New Phytologist,206(2),709-725.)。己糖在被HXK磷酸化之后才能进入糖酵解途径，为植物的生理活动提供能量和中间代谢产物，这一过程对维持植物合成淀粉的碳流和呼吸作用必不可少。HXK是细胞质中糖酵解途径(EMP)起始的关键酶，参与细胞内主要的能量代谢。近年来，研究发现HXK参与多种生理过程，如己糖磷酸化，信号调控等。HXK具有多种同工酶，依据是其存在于不同的亚细胞结构中，具体被分为四种类型：type-A,type-B,type-C和type-D。Type-A HXK被发现于叶绿体中，可能主要参与淀粉的合成；type-B HXK被发现于线粒体中，主要参与糖信号和代谢功能；type-C HXK位于胞质中，主要参与由叶绿体转运至胞质的葡萄糖的磷酸化，也可能涉及NADPH的产生及信号功能；type-D HXK也位于线粒体中，与type B的不同在于线粒体膜锚定肽的差异，其功能与type B相似(Aguilera-Alvarado,G.P.,&Sanchez-Nieto,S..(2017).Plant hexokinases are multifaceted proteins.Plant and Cell Physiology,58(7),1151-1160.Karve,A.,Rauh,B.L.,Xia,X.,Kandasamy,M.,Meagher,R.B.,&Sheen,J..(2008).Expression and evolutionary features of the hexokinase gene familyin Arabidopsis.Planta,228(3),411-425.)。

天然橡胶作为一种特殊的战略需求物质，主要来源于巴西橡胶树，因其比合成橡胶具有更大的强度和韧性，被广泛应用于各行业中。橡胶的生物合成发生于乳管细胞中(一种高度特化的韧皮部细胞)，而糖代谢为之合成提供了物质和能量需求。蔗糖作为橡胶合成的前体，在被分解为己糖后需经过HXK的磷酸化才能进入EMP，进而为三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(PPP)提供底物来源。HXK作为EMP的第一个限速酶，它的活性及功能直接影响了对己糖的利用能力，进而影响了橡胶树产胶能力。此外，橡胶树产胶能力与抵抗外界不良因素能力密切相关，如寒冷、病害等均能直接影响橡胶产量。因此，分析HXK在橡胶树的生长发育(橡胶烃生物合成)以及抵御生物与非生物胁迫中的作用，有助于进一步了解胞质中己糖的代谢机制及其在橡胶树胶乳代谢中的重要作用。目前橡胶树己糖激酶(HXK)基因及酶活特性未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因，其命名为HbHXK4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的橡胶树线粒体型己糖激酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种重组表达载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的橡胶树线粒体型己糖激酶基因或其开放阅读框(SEQ ID NO:1所示的第23-1519位核苷酸序列)。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pMAL-c5E载体质粒或pMD18-T载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pMAL-c5E载体质粒，SEQ ID NO:1所示的第23-1519位核苷酸序列位于pMAL-c5E载体质粒的BamH I和EcoR I两限制性内切酶位点之间。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树线粒体型己糖激酶基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质、或者本发明第三个方面所述的重组表达载体在提高原核表达菌株生长速度中的应用。

其中，所述原核表达菌株可以是基因重组领域中常用的原核表达菌株，本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原核表达菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

本发明的第五个方面是提供一种提高原核表达菌株生长速度的方法，用本发明第三个方面所述的重组表达载体转染原核表达菌株。

本发明的第六个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。

本发明的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示。

本发明的第八个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示。

本发明首次克隆了橡胶树己糖激酶HbHXK4基因的全长cDNA(橡胶树线粒体型)，经原核表达并测定重组蛋白活性表明，该基因编码的蛋白具有己糖激酶的功能，该基因转入原核表达菌株后获得的转基因菌株在正常培养条件下生长速率明显提高。基因表达分析显示HbHXK4基因在树皮、种子及叶片中高表达，而在胶乳中该基因在同家族基因中表达量为最高；同时受割胶诱导上调表达，与橡胶树胶乳产量呈正相关，另外，该基因同时受乙烯和高低温胁迫诱导下调表达，因此该基因可能与外界胁迫刺激相关，可作为靶基因来研究防控非生物胁迫效应。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用。

附图说明

图1为HbHXK4基因的组织特异性表达分析结果(胶乳、雌花、雄花、树皮、种子、叶片)。

图2为HbHXK家族基因表达分析结果。

图3为割胶对HbHXK4基因表达的影响。

图4为乙烯利对HbHXK4基因表达的影响。

图5为高温胁迫对HbHXK4基因表达的影响。

图6为低温胁迫对HbHXK4基因表达的影响。

图7为HbHXK4的原核表达分析结果。

图8为HbHXK4重组蛋白纯化后酶活检测结果。

图9为HbHXK4蛋白最适pH测定结果。

图10为HbHXK4蛋白米氏常数测定结果。

图11为转基因菌株在正常条件下的生长速率测定结果。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.橡胶树己糖激酶编码基因(HbHXK)的获得

分析已在NCBI登陆的拟南芥、水稻、蓖麻及麻风树的己糖激酶(HXK)的核苷酸序列，通过搜索我们建立的橡胶树胶乳转录组数据库，筛选并拼接一条1800bp左右的橡胶树己糖激酶基因组装后序列(contig)，设计一对特异引物扩增得到包含完整读码框的cDNA全长序列。

cDNA克隆具体方法如下：

特异性引物设计如下：

F(5’端)：5'-GCT ATT TTT GCC GCT AGT GCT CAT-3'

R(3’端)：5'-GGC AGG TCT CAA CAT GGA AGC T-3'

以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)胶乳cDNA为模板(以随机引物反转录获得)，F和R为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45S，68℃退火3min，共30次循环；72℃延伸10min。

将该PCR获得的片段连接到pMD18-T载体(TaKaRa)进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明的己糖激酶(HXK)基因，该片段具有序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，序列表中SEQ ID NO:1全长为1741个核苷酸，包含一个长度为1497个核苷酸的开放阅读框(ORF，自SEQ ID NO:1的5’端第23-1519位核苷酸序列)、22个核苷酸的5’-UTR(自SEQ IDNO:1的5’端第1-22位核苷酸序列)和222个核苷酸的3’-UTR(自SEQ ID NO:1的5’端第1520-1741位核苷酸序列)，编码一个长度为498个氨基酸、分子量约为54kDa的蛋白，即为己糖激酶(HXK)，将该己糖激酶基因命名为HbHXK4。将上述含有序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸的pMD18-T重组载体命名为pMD18T-HbHXK4。除此之外，利用亚细胞定位在线软件分析该蛋白的氨基酸序列，发现该蛋白定位于线粒体，因此HbHXK4属于橡胶树线粒体型己糖激酶。

2.原核表达与HbHXK4基因的功能验证

利用pMAL-c5E表达载体(pMAL-c5E(质粒)表达载体购自New England Biolabs公司)构建了HbHXK4基因的原核表达载体(本实施例中表达载体仅为举例，本发明也可以采用其他表达质粒和病毒载体等)，同时利用大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)(菌株购自TransGen Biotech公司)诱导重组蛋白，测定重组蛋白活性及其对BL21生长速率的影响，具体方法如下：

<1>含HbHXK4基因编码区重组表达载体的获得

设计HbHXK4基因编码区引物(F：5'-GACGATGACAAGGTACCGCATATGGGTAAGGTCGCGGTGGGT-3'，R：5'-ATTACCTGCAGGGAATTCGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGAGCTTCTGCGACCTCCATGTATTGGG-3')，以pMD18T-HbHXK4质粒为模版，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性45s，68℃退火2min，共30次循环；72℃延伸5min。将扩增产物与pMAL-c5E表达载体(BamH I和EcoR I双酶切)连接，得到重组载体，利用基因特异引物(HbHXK4基因编码区引物)进行PCR鉴定，确保己糖激酶编码片段克隆到表达载体。重组载体进行测序鉴定，将鉴定表明正确的含有序列表中SEQ ID NO:1的第23-1519位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为pMAL-c5E-HbHXK4。

<2>HbHXK4基因的原核表达

将获得的重组载体pMAL-c5E-HbHXK4以及对照载体pMAL-c5E-Empty(空载体)导入E.coli BL21(DE3)中(菌株购自TransGen Biotech公司)，得到重组表达菌，将鉴定正确的重组菌在含100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中培养至OD600＝0.4～0.6，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃下诱导培养4h，离心收集菌体，菌体蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图7所示。结果表明，在IPTG诱导下HbHXK4基因实现了在胞质中的高效异源表达，且重组蛋白包含了HbHXK4以及胞质融合蛋白MBP(麦芽糖结合蛋白)分子量大约在100kDa。

<3>HbHXK4重组蛋白酶活检测

按照“<2>HbHXK4基因的原核表达”上述方法收集菌体，低温超声破碎，离心收集上清，待纯化过后测定己糖激酶活性。活性测定于正常条件下进行(30℃，pH7.0)，测定体系如下(以下均为工作浓度)：

50mM HEPES-NaOH，10mM MgCl₂，1mM ATP，1mM NAD，10mM KCl，2U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1000U/ml)，6μl HXK4(根据实际的蛋白浓度加量)，10mM葡萄糖。补充ddH2O至200μl。

使用酶标仪在340nm波长下连续测定30min内的吸光度值变化，检测NADH的增加量，以此计算酶活(酶活定义：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。计算：HK(U/mg prot)＝[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样×C_pro)÷T＝1286×ΔA÷C_pro)。测定结果如图8所示：酶活结果显示，含有pMAL-c5E-HbHXK4菌株己糖激酶的活性明显高于含有pMAL-c5E-Empty对照菌株(空菌株蛋白纯化后几无活性，可认为是0)，这说明HbHXK4基因编码的蛋白确实具有己糖激酶的活性。

<4>HbHXK4重组蛋白米氏常数测定

米氏常数测定于正常温度(30℃)及最适pH下进行。最适pH测定分别在6.2,6.8,7.4,8.0,8.6下进行，结果如图9所示：确定HbHXK4重组蛋白的最适pH为8.0。按照“<3>HbHXK4重组蛋白酶活检测”上述方法改变底物葡萄糖的上样量(工作浓度分别为2.5,4,8,16,32,64,96,128,160mM)测定HbHXK4的米氏常数变化。结果如图10所示：HbHXK4重组蛋白的K_m为2.929mM，V_max为41.86(nmol/mg pro/min)(数值上同活性)。

<5>HbHXK4重组蛋白对菌株生长速率的影响

按照“<2>HbHXK4基因的原核表达”上述方法活化菌株，并将含有pMAL-c5E-HbHXK4和pMAL-c5E-Empty的菌株培养至相同OD600＝0.4，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃下诱导培养0.5h、1h、2h、4h及8h后分别测定其OD(600nm)值，计算生长速率。结果如图11所示：含有pMAL-c5E-HbHXK4菌株的生长速率高于pMAL-c5E-Empty对照菌株，且在诱导1h更为明显，说明HbHXK4基因编码的蛋白可以提高菌株在正常条件下的生长速率。

3.HbHXK4基因表达模式分析

<1>HbHXK4基因组织特异性表达

以橡胶树7-33-97叶片、雌花、雄花、胶乳、种子及树皮RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbHXK4基因特异引物(F:5'-GCTTGGGTCCATTGCT-3'；R:5'-CTCCTTGCCATCACTTACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图1所示(相对表达量以胶乳的表达量为对照)，HbHXK4基因在树皮、种子及叶片中高表达，雌花、雄花及胶乳中表达相对较低。而在胶乳中，如图2所示，HbHXK4是己糖激酶家族成员中表达丰度最高的成员。

<2>割胶对HbHXK4基因的表达影响

以未开割巴西橡胶树热研7-33-97不同刀次的胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板(三天一刀，连续采样1，3，5，7和9刀)，用HbHXK4基因基因特异引物(F:5'-GCTTGGGTCCATTGCT-3'；R:5'-CTCCTTGCCATCACTTACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图3所示(相对表达量以第一刀胶乳的表达量为对照)。结果表明割胶影响HbHXK4基因的表达，自第三刀开始，HbHXK4基因表达明显上调，与橡胶产量呈正相关。

<3>乙烯利对HbHXK4基因的表达影响

将乙烯利ET涂于橡胶树割线以及割线上方1cm割面处刺激橡胶树(0h、12h、24h及48h)，以胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbHXK4基因特异引物(F:5'-GCTTGGGTCCATTGCT-3'；R:5'-CTCCTTGCCATCACTTACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图4所示(相对表达量以诱导0h的表达量为对照)。结果表明：在乙烯利ET刺激下，12h后HbHXK4基因下调表达，随后在24h，48h后逐渐恢复至初始水平。

<4>高温胁迫对HbHXK4基因的表达影响

将橡胶树幼苗进行高温(45℃)胁迫处理(0、3h、6h、9h、12h及24h)，以叶片RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbHXK4基因特异引物(F:5'-GCTTGGGTCCATTGCT-3'；R:5'-CTCCTTGCCATCACTTACT-3')进行实时荧光定量PC，结果如图5所示(相对表达量以诱导0h的表达量为对照)。结果表明：在高温胁迫下，HbHXK4基因表达呈下调趋势。

<5>低温胁迫对HbHXK4基因的表达影响

将橡胶树幼苗进行低温(4℃)胁迫处理(0、3h、6h、9h、12h及24h)，以叶片RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbHXK4基因特异引物(F:5'-GCTTGGGTCCATTGCT-3'；R:5'-CTCCTTGCCATCACTTACT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图6所示(相对表达量以诱导0h的表达量为对照)。结果表明：在低温胁迫下，HbHXK4基因表达呈下调趋势。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1741

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

gctatttttg ccgctagtgc tcatgggtaa ggtcgcggtg ggtgcgggcg tggtctgcgc 60

ggctgctgtg tgtgctgcga cggcgctggt ggtaaggcac aggatgctca gctcggggag 120

atgggccaag gccatggcca tactcaggga gttcgaggac aagtgtggga cacccatagg 180

aaagctacac caggtggccg atgccatgac cgttgagatg catgccggcc ttgcatcgga 240

aggtgggagc aagcttaaga tgctcatcag ctatgttgac aatcttccca taggcgatga 300

gaagggtttg ttttatgctt tagaccttgg gggcacaaat tttcgtgtcc tacgggtact 360

attgggtggg aaagaagatc gtgttgtcaa acaagaattt gaggaagttt caattcctcc 420

ttacttgatg actggatctt cagatgcatt gttcgattat attgctgaag cacttgctaa 480

atttgttgct acagaaggtg aaggattgca tccttcacct ggtcaacaaa gggaactggg 540

ctttaccttt tcatttccag ttcggcaaac atcaatagca tcaggaactc ttataaaatg 600

gacaaaaggc ttctccatag aggacacgtt tgggcaagat gtggtgggag agttgacaaa 660

agccatggaa agagttggcc ttgacatgcg tgttgcagct ttggtcaatg atacaattgg 720

aacactagct ggaggtagat actacaacca ggatgttatt gctgctgtaa tcttgggtac 780

tggaactaat gcagcatatg tagagcgagc acaagcaatt cccaagtggc atggtcttct 840

tcctagatct ggggaaatgg ttatcaacat ggagtggggt aactttcggt cgtcacacct 900

tccattgaca gaatatgacc aagccctgga tgttgagtct ctgaaccctg gggaacagat 960

ttttgagaag ataatttctg gtatgtattt aggagagatt gtacgcagag ttctattgaa 1020

aatggctcag gaagctgcct tctttggtgt tgatgttcca ccaaaactgg agattccatt 1080

tatcttaagg actccacaca tgtctgcaat tcatcacgat acatcttcag atctgagagt 1140

tgttggaagc aaattaaagg atatcctaga ggtaccaaat acctccctga aaatgaggaa 1200

agctattgtc gagctctgcg acattgttgc cactcgtggt gcccggctat ctgctgctgg 1260

aatcttaggc atcctcaaaa aattggggag agacacagtg agggatgggg aaaagcagaa 1320

gtcagtaata gcattggatg gtgggctgtt tgagcactat actaaatttc gtacctccat 1380

ggaaagcact ctcaaggagt tgctgggaga ggaaatttct gaaagcattg tcattgagca 1440

ctcaaatgat ggctcgggca ttggagcagc tctcctggca gcttcccact cccaatacat 1500

ggaggtcgca gaagcttaaa aaagtatagg tagatgaaaa taatgacatt tttcaaattt 1560

tgtattttac tccttgccat cacttactcc agatagtcta gagctagcga tatctcctag 1620

ttcatggggt atgccagtag atcttaatgc gtggtcttat agagtttata accgagtgat 1680

ggatcaaata ctctcacaaa gtggctagca atggacccaa gcttccatgt tgagacctgc 1740

c 1741

<210> 2

<211> 498

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Gly Lys Val Ala Val Gly Ala Gly Val Val Cys Ala Ala Ala Val

1 5 10 15

Cys Ala Ala Thr Ala Leu Val Val Arg His Arg Met Leu Ser Ser Gly

20 25 30

Arg Trp Ala Lys Ala Met Ala Ile Leu Arg Glu Phe Glu Asp Lys Cys

35 40 45

Gly Thr Pro Ile Gly Lys Leu His Gln Val Ala Asp Ala Met Thr Val

50 55 60

Glu Met His Ala Gly Leu Ala Ser Glu Gly Gly Ser Lys Leu Lys Met

65 70 75 80

Leu Ile Ser Tyr Val Asp Asn Leu Pro Ile Gly Asp Glu Lys Gly Leu

85 90 95

Phe Tyr Ala Leu Asp Leu Gly Gly Thr Asn Phe Arg Val Leu Arg Val

100 105 110

Leu Leu Gly Gly Lys Glu Asp Arg Val Val Lys Gln Glu Phe Glu Glu

115 120 125

Val Ser Ile Pro Pro Tyr Leu Met Thr Gly Ser Ser Asp Ala Leu Phe

130 135 140

Asp Tyr Ile Ala Glu Ala Leu Ala Lys Phe Val Ala Thr Glu Gly Glu

145 150 155 160

Gly Leu His Pro Ser Pro Gly Gln Gln Arg Glu Leu Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Phe Pro Val Arg Gln Thr Ser Ile Ala Ser Gly Thr Leu Ile Lys

180 185 190

Trp Thr Lys Gly Phe Ser Ile Glu Asp Thr Phe Gly Gln Asp Val Val

195 200 205

Gly Glu Leu Thr Lys Ala Met Glu Arg Val Gly Leu Asp Met Arg Val

210 215 220

Ala Ala Leu Val Asn Asp Thr Ile Gly Thr Leu Ala Gly Gly Arg Tyr

225 230 235 240

Tyr Asn Gln Asp Val Ile Ala Ala Val Ile Leu Gly Thr Gly Thr Asn

245 250 255

Ala Ala Tyr Val Glu Arg Ala Gln Ala Ile Pro Lys Trp His Gly Leu

260 265 270

Leu Pro Arg Ser Gly Glu Met Val Ile Asn Met Glu Trp Gly Asn Phe

275 280 285

Arg Ser Ser His Leu Pro Leu Thr Glu Tyr Asp Gln Ala Leu Asp Val

290 295 300

Glu Ser Leu Asn Pro Gly Glu Gln Ile Phe Glu Lys Ile Ile Ser Gly

305 310 315 320

Met Tyr Leu Gly Glu Ile Val Arg Arg Val Leu Leu Lys Met Ala Gln

325 330 335

Glu Ala Ala Phe Phe Gly Val Asp Val Pro Pro Lys Leu Glu Ile Pro

340 345 350

Phe Ile Leu Arg Thr Pro His Met Ser Ala Ile His His Asp Thr Ser

355 360 365

Ser Asp Leu Arg Val Val Gly Ser Lys Leu Lys Asp Ile Leu Glu Val

370 375 380

Pro Asn Thr Ser Leu Lys Met Arg Lys Ala Ile Val Glu Leu Cys Asp

385 390 395 400

Ile Val Ala Thr Arg Gly Ala Arg Leu Ser Ala Ala Gly Ile Leu Gly

405 410 415

Ile Leu Lys Lys Leu Gly Arg Asp Thr Val Arg Asp Gly Glu Lys Gln

420 425 430

Lys Ser Val Ile Ala Leu Asp Gly Gly Leu Phe Glu His Tyr Thr Lys

435 440 445

Phe Arg Thr Ser Met Glu Ser Thr Leu Lys Glu Leu Leu Gly Glu Glu

450 455 460

Ile Ser Glu Ser Ile Val Ile Glu His Ser Asn Asp Gly Ser Gly Ile

465 470 475 480

Gly Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser His Ser Gln Tyr Met Glu Val Ala

485 490 495

Glu Ala

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

gctatttttg ccgctagtgc tcat 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

ggcaggtctc aacatggaag ct 22

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

gacgatgaca aggtaccgca tatgggtaag gtcgcggtgg gt 42

<210> 6

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

attacctgca gggaattcgg atccttaatg gtgatggtga tgatgagctt ctgcgacctc 60

catgtattgg g 71

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

gcttgggtcc attgct 16

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

ctccttgcca tcacttact 19

Claims

1.橡胶树线粒体型己糖激酶基因、或者蛋白质、或者重组表达载体在提高原核表达菌株生长速度中的应用，所述原核表达菌株为大肠杆菌E. coli BL21（DE3），其中，所述橡胶树线粒体型己糖激酶基因命名为HbHXK4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白质为所述橡胶树线粒体型己糖激酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组表达载体包含原始载体和所述橡胶树线粒体型己糖激酶基因或其开放阅读框。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述原始载体为pMAL-c5E载体质粒，SEQID NO:1所示的第23-1519位核苷酸序列位于pMAL-c5E载体质粒的BamH I和EcoR I两限制性内切酶位点之间。

3.一种提高原核表达菌株生长速度的方法，其特征在于，用重组表达载体转染原核表达菌株，所述原核表达菌株为大肠杆菌E. coli BL21（DE3），其中，所述重组表达载体包含原始载体和橡胶树线粒体型己糖激酶基因或其开放阅读框，所述橡胶树线粒体型己糖激酶基因命名为HbHXK4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述原始载体为pMAL-c5E载体质粒，SEQID NO:1所示的第23-1519位核苷酸序列位于pMAL-c5E载体质粒的BamH I和EcoR I两限制性内切酶位点之间。