CN101671677A - 一种花生水通道蛋白基因AhAQ1及其编码蛋白质及其基因克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物抗逆性基因研究领域。本发明提供了花生中一种水通道蛋白基因AhAQ1基因序列及其编码的蛋白质序列。本发明还提供了花生中所述水通道蛋白基因AhAQ1的克隆方法。本发明所述花生中水通道蛋白基因AhAQ1的表达分析表明在盐胁迫条件下该基因在花生不同组织中的表达量均明显上升，表明该基因与植物耐盐性相关。通过转基因试验分析也表明该基因的超量表达能一定程度上增强花生的耐盐性。

Description

一种花生水通道蛋白基因AhAQ1及其编码蛋白质及其基因克隆方法

技术领域

本发明涉及植物抗逆性基因研究领域，具体涉及一种与花生耐盐性相关的水通道蛋白基因AhAQ1及其编码的蛋白质以及基因克隆方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物。从国产食用植物油的生产和供给看，花生油占25％的份额，是我国唯一不需要进口的大宗油脂，是保障我国油脂供应的主要油料作物。近年来，随着世界油脂资源和能源资源的日益紧迫，花生的生产受到越来越多的重视，扩大花生的种植面积成为解决我国油脂资源紧张的重要途径。本着“不与粮食作物争地”的原则，提高花生的抗逆性，如耐盐性、抗旱性、耐旱性，对扩大花生的种植面积，提高我国花生的总产量，增加我国油脂供应具有重要的经济效益和社会效益。

目前对花生抗逆性基因的研究较少，有研究表明水通道蛋白的表达受高盐条件、旱胁迫、寒胁迫的调控，可能与植物的抗逆性相关，但调控机制还需要进一步研究(Jang J Y，Kim D G，Kim Y，el al.I lanl Mol Biol.2004.54(5)：713-725)。水通道蛋白大量存在于动物、植物等多种生物中(张正斌.作物抗旱节水的生理遗传育种基础[M].北京：科学出版社，2003.84-96)。第一个植物水通道蛋白-TIP是从是从拟南芥中分离出来的(Hofte G M，Hubbard L，Reizer J，et al.Plant Physiol，1992，17(256)：385-387)，它位于液泡膜上。随后，第一个植物质膜AQP-拟南芥RD28也被发现(Daniels M J，Mirkov T E，Chrispeels M J.Plant Physiology，1994，106(4)：1325-1333)。到目前为止，在拟南芥、烟草、玉米、豌豆、水稻等多种植物中都发现了AQP。另外，从蛋白数据库中也发现了大量AQP的同源物，它广泛存在于单子叶和双子叶植物、C3和C4代谢植物中(Schaffner A R.Planta，1998，204：131-139)。水通道蛋白属于古老的通道蛋白MIP(Membrane intrinsic protein)成员，根据水通道蛋白(AQP)的亚细胞定位，结合序列同源性，AQP大致分为4种类型：plasma intrinsicproteins(PIPs)，tonoplast intrinsic proteins(TIPs)，NOD26-like intrinsicproteins(NIPs)和mall basic intrinsic proteins(SIPs)(Kjellbom P，Larsson C，Johansson I，et al.T rends Plant SCi，1999，4：308-314；曹志方，赵南明，刘强.植物膜水通道蛋白[J].生命的化学，2000，20(1)：13-16)。水通道蛋白的发现对于研究植物的水分关系具有重要意义(Quigley F，Rosenberg J M，Shachar-HillY，et al.Genome Biol，2002，3：1-17)。但到目前为止，对于每一个AQP以及整个植株AQP在不同生理条件下功能的研究仍然较少。AQP基因研究较为清楚的是模式植物拟南芥、水稻和烟草等，已经从许多植物中分离鉴定出了AQP，玉米中有36种AQP基因已经被测序(Chaumont F，Barrieu F，Wojcik E，etal.2001，125：1206-1215)，拟南芥中有35种(Quigley F，Rosenberg J M，Shachar-Hill Y，et al.Gen ome Biol，2002，3：1-17)，水稻中有33种(SakuraiJ，Ishikawa F，Yamaguchi T，et al.Plant Cell Physlol，2005，46(9)：1568-1577)。

水通道蛋白的鉴定和研究为进一步探讨植物水分关系提供了新的思路。水分在植株中的运输受特定水通道蛋白基因的表达、调控以及亚细胞定位的修饰。水通道蛋白是调节水分在细胞间运输和植株水分传导的分子基础，并且与植物的抗逆性如抗盐性、抗旱性等之间存在着相互调控的关系，因此可以通过研究表达不同膜蛋白的转基因植株，将分子生物学与植物生理学相结合来确定AQP在植株水分运输中的作用以及与植物抗逆性之间的关系。目前在花生中还没有相关报道，因此，对花生水通道蛋白基因的克隆以及对其表达的研究，将有助于明确水通道蛋白基因作用的分子机理，同时获得可应用于花生抗逆性改良的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于公开一种花生水通道蛋白基因AhAQ1的核苷酸序列。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含969bp。

本发明的第二个目的还提供所述花生水通道蛋白基因AhAQ1编码的蛋白序列。

同时，本发明还提供该所述水通道蛋白基因AhAQ1的克隆方法。

本发明所提供的水通道蛋白基因，来自花生(Arachis hypogaea)，命名为AhAQ1基因。

上述花生水通道蛋白基因AhAQ1编码的蛋白质，来自花生(Arachishypogaea)，命名为AhAQ1蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，含287氨基酸。

上述花生水通道蛋白基因AhAQ1的克隆方法，包括如下步骤：

(1)选用花生种子作为实验材料，经盐诱导后取植物组织置于研钵中，室温下采用Trizol reagent(Tiangen)抽提总RNA，并且采用DNase I(Takara)处理，以去除样品中的基因组DNA污染。RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA。

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计花生AhAQ1基因编码区引物：

正向引物：5’-CACACTTACCCATCTCATCAC-3’(如SEQ ID NO：3所示)

反向引物：5’-CAATAATCAAGCACTTGCATT-3’(如SEQ ID NO：4所示)

反应体系：2.5μl 10×PCR缓冲液(含MgCl2)，0.5μl 10μM的引物，1.0μl20mM的dNTPs，1μl cDNA样品，0.5μl Ex-Taq酶(Takara)，19μl双蒸水。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃复性30s，72℃延伸1min，28个循环后，72℃延伸10min。

(4)PCR产物回收后与pMD18-T simple vector(Takara)连接，连接产物转化E.coli Top 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得AhAQ1基因。

本发明公开了一种花生C2H2型锌指蛋白基因AhAQ1的核苷酸序列及其编码蛋白序列以及基因克隆方法。C2H2型锌指蛋白基因AhZFP1是一类重要的盐胁迫应答相关转录因子，与植物的耐盐性密切相关。

本发明的有益效果：

本发明公开了一种花生水通道蛋白基因AhAQ1及其所编码的蛋白质。该基因来自花生(Arachis hypogaea)，该基因超量表达，可提高花生的耐盐性，从而增强花生的抗逆性。

本发明提供的AhAQ1基因来自花生，在盐胁迫条件下，在不同花生组织中的表达量均明显提高，具有适合于花生等双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等之外更加适合于大豆、棉花、烟草等双子叶植物。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1  花生水通道蛋白基因AhAQ1的分子克隆

选用鲁花28花生种子作为实验材料，经盐诱导后室温下采用Trizol reagent(Tiangen)抽提花生组织总RNA，并且采用DNase I(Takara)处理，以去除样品中的基因组DNA污染。利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA。根据NCBI数据库中的EST信息设计花生AhAQ1基因编码区引物：正向引物：5’-CACACTTACCCATCTCATCAC-3’，反向引物：5’-CAATAATCAAG-CACTTGCATT-3’。采用Takara的Ex-Taq酶进行PCR扩增，PCR产物回收后与MD18-T simple vector(Takara)连接，连接产物转化E.coli Top 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得AhAQ1基因。

实施例2  AhAQ1的序列信息与特性分析

本发明的AhAQ1基因长969bp，其开放阅读框为861bp，位于58-918bp处。BioXM软件分析表明AhAQ1共编码287个氨基酸。序列的生物信息学分析预测该蛋白分子量为30.57Kda，等电点为9.04。分析结果还表明AhAQ1为高度疏水性蛋白，包含六个跨膜结构域。序列的比对分析还表明AhAQ1与玉米、大麦、烟草、橄榄、拟南芥等的水通道蛋白存在非常高的相似性。系统进化分析表明AhAQ1应该属于PIP2型蛋白。

实施例3：AhAQ1的表达研究

利用花生AhAQ1基因部分序列设计引物，采用半定量RT-PCR技术，分析盐胁迫条件下该基因表达量的变化以及在不同花生组织中的表达差异。结果表明在盐诱导条件下，该基因在根、茎、叶中的表达量均有所升高，但在茎、叶中受诱导6h后表达量开始上升，叶中呈持续上升，而茎中的表达量在盐胁迫24小时后有所回落。在根中的表达量从盐胁迫1h后即开始稳步上升。结果表明AhAQ1基因的表达对盐胁迫产生响应，推断其在抗盐过程中起到一定的作用，但在不同组织中的响应程度不同。

实施例4：AhAQ1的转基因功能验证

利用农杆菌侵染方法获得AhAQ1基因超量表达的转基因花生植株，与正常植株进行耐盐性对比试验，发现AhAQ1超量表达的转基因花生确实在一定程度上比正常植株具有较高的耐盐性。

上述实施例表明本发明中克隆的花生水通道蛋白基因AhAQ1，是首次从双子叶植物花生(Arachis hypogaea)中分离获得。mRNA表达分析表明AhAQ1在盐胁迫条件下在花生不同组织中的表达量均有所提高，并且转基因实验也表明该基因的超量表达在一定程度上可增强花生的耐盐性，因此可进一步加强利用基因工程手段增强花生耐盐性及其它抗逆性研究。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>山东省花生研究所

<120>一种花生水通道蛋白基因AhAQ1及其编码蛋白质及其基因克隆方法

<130>082118-I-CP-HTD

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>969

<212>DNA

<213>AhAQ1基因

<400>1

cacacttacc catctcatca ctttcttttc ttatctcaat tttgagaaac ccaagaaatg      60

acgaaggacc ttgaagttac cgagagaggc tctttctccg gcaaggacta ccatgaccca      120

ccacccgcac ccctcatcga cgccgaggag ctcaccaagt ggtctttcta tagagctctc      180

attgctgagt tcattgccac cctcctcttc ctctacatca ccgtcctcac cgtcattggc      240

tacaagagcc agagcgaccc caaagccggc ggtgatatgt gcggcggtgt tggcattctt      300

ggcattgctt gggcctttgg cggcatgatt ttcatccttg tttactgcac cgccggcatc      360

tcaggaggac acatcaaccc ggcagtgacg ttcgggttgt tcttggcgcg caaggtgtcg      420

ttgataagag caatattgta tatggtggct cagtgcttgg gtgctatctg cggtgttggc      480

ttggtcaagg ccttccagac atccctctac gtcaggtacg gcggcggcgc caactccctc      540

gccgacggtt acagcaaggg caccggtttg ggtgctgaga tcattggtac ctttgttttg      600

gtctacaccg tgttctccgc caccgatccc aagagaaatg ccagagactc tcatgtccct      660

gttttggcac cacttcccat tggatttgct gtgttcatgg ttcacttggc taccatcccg      720

gtcaccggca ccggcatcaa ccctgctagg agtcttggtg ctgctgttat ctacaacaaa      780

tccaagccat gggatgacca ttggatcttc tgggttggac cattcattgg agcagccatt      840

gcagccttct accaccaatt catcttaagg gcaggagcag ctaaggctct tggatcattc      900

aggagcaacc ccaatgtcta agtttgatta atgaatgatc aacaatgcaa tgcaagtgct      960

tgattattg

969

<210>2

<211>287

<212>PRT

<213>AhAQ1基因编码的蛋白质

<400>2

Met Thr Lys Asp Leu Glu Val Thr Glu Arg Gly Ser Phe Ser Gly Lys

1                5                       10                     15

Asp Tyr His Asp Pro Pro Pro Ala Pro Leu Ile Asp Ala Glu Glu Leu

             20                        25                      30

Thr Lys Trp Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Ile Ala Glu Phe Ile Ala Thr

         35                      40                       45

Leu Leu Phe Leu Tyr Ile Thr Val Leu Thr Val Ile Gly Tyr Lys Ser

    50                      55                       60

Gln Ser Asp Pro Lys Ala Gly Gly Asp Met Cys Gly Gly Val Gly Ile

65                      70                       75                   80

Leu Gly Ile Ala Trp Ala Phe Gly Gly Met Ile Phe Ile Leu Val Tyr

                    85                     90                     95

Cys Thr Ala Gly Ile Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Phe

             100                       105                     110

Gly Leu Phe Leu Ala Arg Lys Val Ser Leu Ile Arg Ala Ile Leu Tyr

         115                    120                       125

Met Val Ala Gln Cys Leu Gly Ala Ile Cys Gly Val Gly Leu Val Lys

    130                     135                     140

Ala Phe Gln Thr Ser Leu Tyr Val Arg Tyr Gly Gly Gly Ala Asn Ser

145                    150                      155               160

Leu Ala Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Thr Gly Leu Gly Ala Glu Ile Ile

                  165                     170                   175

Gly Thr Phe Val Leu Val Tyr Thr Val Phe Ser Ala Thr Asp Pro Lys

             180                      185                    190

Arg Asn Ala Arg Asp Ser His Val Pro Val Leu Ala Pro Leu Pro Ile

        195                      200                     205

Gly Phe Ala Val Phe Met Val His Leu Ala Thr Ile Pro Val Thr Gly

    210                     215                     220

Thr Gly Ile Asn Pro Ala Arg Ser Leu Gly Ala Ala Val Ile Tyr Asn

225                     230                     235               240

Lys Ser Lys Pro Trp Asp Asp His Trp Ile Phe Trp Val Gly Pro Phe

                  245                      250                  255

Ile Gly Ala Ala Ile Ala Ala Phe Tyr His Gln Phe Ile Leu Arg Ala

              260                    265                     270

Gly Ala Ala Lys Ala Leu Gly Ser Phe Arg Ser Asn Pro Asn Val

         275                     280                     285

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物

<400>3

cacacttacccatctcatcac                                                    21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>4

caataatcaagcacttgcatt                                                    21

Claims (3)

1.一种花生水通道蛋白基因AhAQ1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种如权利要求1所述花生水通道蛋白基因AhAQ1编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1所述花生水通道蛋白基因AhAQ1的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选用花生种子作为实验材料，经盐诱导后取植物组织置于研钵中，室温下采用Trizol reagent抽提总RNA，并且采用DNase I处理，以去除样品中的基因组DNA污染。RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA。

(3)根据EST信息设计花生AhAQ1基因编码区引物：

正向引物：5’-CACACTTACCCATCTCATCAC-3’

反向引物：5’-CAATAATCAAGCACTTGCATT-3’

反应体系：2.5μl含MgCl2的10×PCR缓冲液，0.5μl 10μM的引物，1.0μl 20mM的dNTPs，1μl cDNA样品，0.5μl Ex-Taq酶，19μl双蒸水。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃复性30s，72℃延伸1min，28个循环后，72℃延伸10min。

(4)PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coli Top10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得AhAQ1基因。