CN101671676A

CN101671676A - 花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1及其编码蛋白质及其基因克隆方法

Info

Publication number: CN101671676A
Application number: CN200810215553A
Authority: CN
Inventors: 禹山林; 江燕; 杨庆利; 陈明娜; 潘丽娟; 朱凤; 任增凯
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2010-03-17

Abstract

本发明公开了花生中响应盐胁迫的一种C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1基因序列及其编码的蛋白质序列。本发明还提供了所述C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1基因的克隆方法。本发明所述C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1的表达分析表明在盐胁迫条件下该基因在花生不同组织中的表达量均明显上升，通过转基因试验分析也表明该基因的超量表达确实能增强花生的耐盐性。

Description

花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1及其编码蛋白质及其基因克隆方法

技术领域

本发明涉及作物耐盐性的基因研究领域，具体涉及一种花生C₂H₂型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1及其编码的蛋白质以及基因克隆方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物。从国产食用植物油的生产和供给看，花生油占25％的份额，是我国唯一不需要进口的大宗油脂，是保障我国油脂供应的主要油料作物。近年来，随着世界油脂资源和能源资源的日益紧迫，花生的生产受到越来越多的重视，扩大花生的种植面积成为解决我国油脂资源紧张的重要途径。我国有3600万hm2盐碱地，200多万hm²沿海滩涂(赵凤云，郭善利，王增兰等.耐盐转基因植物研究进展[J].植物生理与分子生物学学报，2003，35(3)：1-6)。本着“不与粮食作物争地”的原则，提高花生的耐盐性，在这些滩涂地、盐碱地上种植花生，对扩大花生的种植面积，提高我国花生的总产量，增加我国油脂供应具有重要的经济效益和社会效益。提高花生的耐盐性是扩大花生种植面积、保障我国油脂供应的根本途径。

目前国内外对花生耐盐性的研究较少。植物C₂H₂型锌指蛋白是一类重要的胁迫应答相关转录因子，通过控制植物体内胁迫相关基因的表达调节植物胁迫应答反应。锌指蛋白普遍存在于植物中，其中还有一些是植物中特有的。目前已经在拟南芥、矮牵牛、小麦、棉花、大豆以及水稻等植物中报道了一些锌指蛋白(Huang J，Wang J F，Wang Q H，et al..DNA Seq.2005，16：130-136；Huang J，Yang X，Wang MM，，et al.Biochim Biophy Acta.2007，1769：220-227；Iuchi S.Cell Mol Life Sci.2001，58：625-635)。C2H2型锌指蛋白在植物逆境胁迫应答过程中起着重要作用。Kim等从大豆中分离到一个受盐诱导的C₂H₂型锌指蛋白SCOF-1，SCOF-1具有两个典型的C₂H₂锌指结构，过量表达SCOF-1的转基因烟草和拟南芥耐盐性增强(Kim JC，Lee SH，Cheong YH，et al.Plant J.2001，25：247-259)。Sakamoto等研究了拟南芥C₂H₂型锌指蛋白基因STZ/ZAT10和AZFs在逆境胁迫下的表达情况，发现基因在低温、干旱、高盐条件下都受到不同程度的诱导(Sakamoto H，Araki T，Meshi T，et al.Gene.2000，248：23-32)。STZ/ZAT10过量表达转基因植株和缺失突变株的耐盐性相对于野生型都得到提高(Rizhsky L，Davletova S，Liang H，et al.J Biol Chem.2004，279：11736-11743)。

目前在拟南芥、水稻、玉米、小麦等多中作物中已有多篇C₂H₂型锌指蛋白基因提高植物耐盐性的相关报道，但在花生中还没有相关报道，因此，对花生C₂H₂型锌指蛋白基因的克隆以及对它们的生物学功能研究，将有助于明确花生耐盐的分子机理，同时获得可应用于花生耐盐性改良的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于公开一种花生C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含835bp。植物C₂H₂型锌指蛋白是一类重要的胁迫应答相关转录因子，通过控制植物体内胁迫相关基因的表达调节植物胁迫应答反应，而AhZFP1则与耐盐性密切相关。

本发明的第二个目的还提供一种花生C2H2型锌指蛋白基因AhZFP1编码的蛋白序列，单链，拓扑结构为线性，含231个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

同时，本发明还提供该C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1的克隆方法。

本发明所提供的C₂H₂型锌指蛋白基因，来自花生(Arachis hypogaea)，命名为AhZFP1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述花生C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1编码的蛋白质，来自花生(Arachishypogaea)，命名为AhZFP1蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述花生C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1的克隆方法，包括如下步骤：

(1)选用花生种子作为实验材料，经盐诱导后取植物组织置于研钵中，室温下采用Trizol reagent(Tiangen)抽提总RNA，并且采用DNase I(Takara)处理，以去除样品中的基因组DNA污染。RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA。

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计花生AhZFP1基因编码区引物：

正向引物：5’-CAC TAC TCT GTT CGT ACT CTG-3’(如SEQ ID NO：3所示)

反向引物：5’-TGC TCT TCA ACC TTC TTC-3’(如SEQ ID NO：4所示)

反应体系：2.5μl 10×PCR缓冲液(含MgCl2)，0.5μl 10μM的引物，1.0μl 20mM的dNTPs，1μl cDNA样品，0.5μl Ex-Taq酶(Takara)，19μl双蒸水。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，28个循环后，72℃延伸10min。

(4)PCR产物回收后与pMD18-T simple vector(Takara)连接，连接产物转化E.coli Top 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得AhZFP1基因。

本发明公开了一种花生C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1的核苷酸序列及其编码蛋白序列以及基因克隆方法。C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1是一类重要的盐胁迫应答相关转录因子，与植物的耐盐性密切相关。

本发明的有益效果：

1.本发明公开了一种花生C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1及其所编码的蛋白质。该基因来自花生(Arachis hypogaea)，该基因超量表达，可提高花生的耐盐性，从而增强花生的抗逆性。

2.本发明提供的AhZFP1基因来自花生，在盐胁迫条件下，在不同花生组织中的表达量均明显提高，具有适合于花生等双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等之外更加适合于大豆、棉花、烟草等双子叶植物。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1：花生C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1的分子克隆

选用鲁花28花生种子作为实验材料，经盐诱导后室温下采用Trizol reagent(Tiangen)抽提花生组织总RNA，并且采用DNase I(Takara)处理，以去除样品中的基因组DNA污染。利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA。根据NCBI数据库中的EST信息设计花生AhZFP1基因编码区引物：正向引物：5’-CAC TAC TCT GTT CGT ACT CTG-3’，反向引物：5’-TGC TCT TCA ACCTTC TTC-3’。采用Takara的Ex-Taq酶进行PCR扩增，PCR产物回收后与MD18-T simple vector(Takara)连接，连接产物转化E.coli Top 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得AhZFP1基因。

实施例2：AhZFP1的序列信息与特性分析

本发明的AhZFP1基因长835bp，其开放阅读框为693bp，位于61-753bp处。BioXM软件分析表明AhZFP1共编码231个氨基酸。序列的生物信息学分析表明该蛋白分子量为24.75KDa，含有两个C₂H₂型锌指蛋白结构域。序列的比对分析还表明AhZFP1与大豆、水稻、矮牵牛花、拟南芥等的C₂H₂型锌指蛋白存在很高的相似性，尤其是保守区。

实施例3：AhZFP1的表达研究

利用花生AhZFP1基因部分序列设计引物，采用半定量RT-PCR技术，分析盐胁迫条件下该基因表达量的变化以及在不同花生组织中的表达差异。结果表明在盐诱导条件下，该基因在根、茎、叶中的表达量均有所升高，但在茎、叶中受诱导的速度要高于在根中受诱导的速度。分析结果表明AhZFP1基因的表达对盐胁迫产生响应，推断其在抗盐过程中起到一定的作用。

实施例4：AhZFP1的转基因功能验证

利用农杆菌侵染方法获得AhZFP1基因超量表达的转基因花生植株，与正常植株进行耐盐性对比试验，发现AhZFP1超量表达的转基因花生确实在一定程度上比正常植株具有较高的耐盐性。

上述实施例表明本发明中克隆的花生C₂H₂型锌指蛋白基因AhZFP1，是首次从双子叶植物花生(Arachis hypogaea)中分离获得。mRNA表达分析表明AhZFP1在盐胁迫条件下在花生不同组织中的表达量均有所提高，并且转基因实验也表明该基因的超量表达在一定程度上可增强花生的耐盐性，因此可进一步加强利用基因工程手段增强花生耐盐性及其它抗逆性研究。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>山东省花生研究所

<120>花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1及其编码蛋白质及其基因克隆

方法

<130>082119-I-CP-HTD

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>835

<212>DNA

<213>AhZFP1基因

<400>1

cactactctg ttcgtactct gtttttctct ctctctctct ctgtagttaa taaattaaag 60

atggctttgg aggctctgaa ttctcctaca gctgcaggaa tcactccttt cattgccaag 120

ttccaagatc aagaagaaga agaagaagag cttcatcagc tgcgtgagcc gtgggccaag 180

aggaagcgat caaaacgacc gcgtttcgag aaccctccca ccgaagaaga gtaccttgct 240

ctctgcctca tcatgttagc tcacagcggc aacaaggtca ctgccactac tcttaagaac 300

gaacaaacag agtcttcatc ttcacagcaa tcacaagaag cctcatcgtc gccgtcgccg 360

tcgccgccgc cgcctatcaa gcttactcac aggtgcaccg tctgtaacaa ggccttccct 420

tcttaccaag cactcggcgg acacaaggcc agccaccgca aatcatccaa ttctgaaaac 480

aacaccaccg ccgccgccgc cgccacagtc aacagcgaaa acgtgtcagc ctccgccacc 540

acgaacggcg ggccaaggat gcacgagtgt tccatatgtc acaagtcttt ccctaccggt 600

caggctttgg gtggccacaa gcgctgccac tacgaaggtg gcaacaacaa ccacaacaac 660

aacaacaaca atagcagcgc cgtggcatct tcgagggcgg cggcgcctcc tcccagagct 720

tccgtggctt tgacctcaac ctgcctgctc ccctgaccga gtactggtcg ccggcggggc 780

ttgatgacgt cagcgaagcg aagacaaaga acaagaagaa gaaggttgaa gagca 835

<210>2

<211>231

<212>PRT

<213>AhZFP1基因编码的蛋白质

<400>2

Met Ala Leu Glu Ala Leu Asn Ser Pro Thr Ala Ala Gly Ile Thr Pro

1 5 10 15

Phe Ile Ala Lys Phe Gln Asp Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Leu His

20 25 30

Gln Leu Arg Glu Pro Trp Ala Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Pro Arg

35 40 45

Phe Glu Asn Pro Pro Thr Glu Glu Glu Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Ile

50 55 60

Met Leu Ala His Ser Gly Asn Lys Val Thr Ala Thr Thr Leu Lys Asn

65 70 75 80

Glu Gln Thr Glu Ser Ser Ser Ser Gln Gln Ser Gln Glu Ala Ser Ser

85 90 95

Ser Pro Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Ile Lys Leu Thr His Arg Cys

100 105 110

Thr Val Cys Asn Lys Ala Phe Pro Ser Tyr Gln Ala Leu Gly Gly His

115 120 125

Lys Ala Ser His Arg Lys Ser Ser Asn Ser Glu Asn Asn Thr Thr Ala

130 135 140

Ala Ala Ala Ala Thr Val Asn Ser Glu Asn Val Ser Ala Ser Ala Thr

145 150 155 160

Thr Asn Gly Gly Pro Arg Met His Glu Cys Ser Ile Cys His Lys Ser

165 170 175

Phe Pro Thr Gly Gln Ala Leu Gly Gly His Lys Arg Cys His Tyr Glu

180 185 190

Gly Gly Asn Asn Asn His Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Ala Val

195 200 205

Ala Ser Ser Arg Ala Ala Ala Pro Pro Pro Arg Ala Ser Val Ala Leu

210 215 220

Thr Ser Thr Cys Leu Leu Pro

225 230

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>

<400>3

cactactctgttcgtactct g 21

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>反向引物

<400>4

tgctcttcaaccttcttc 18

Claims

1、一种花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2、一种权利要求1所述花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3、一种权利要求1所述花生C₂H₂型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选用花生种子作为实验材料，经盐诱导后取植物组织置于研钵中，室温下抽提总RNA，并且采用DNase I处理，以去除样品中的基因组DNA污染。RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA。

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计花生AhZFP1基因编码区引物：

正向引物：5’-CAC TAC TCT GTT CGT ACT CTG-3’

反向引物：5’-TGC TCT TCA ACC TTC TTC-3’

反应体系：2.5μl含MgCl2的10×PCR缓冲液，0.5μl 10μM的引物，1.0μl 20mM的dNTPs，1μl cDNA样品，0.5μl Ex-Taq酶，19μl双蒸水。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，28个循环后，72℃延伸10min。

(4)PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coliTop 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得AhZFP1基因。