CN103555738A - 一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法，通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、使用RT-PCR进行克隆合成出了逆境胁迫AhROLP1基因，该基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸；基因氨基酸序列与与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶同源性均达到了70%以上。通过荧光定量PCR验证了AhROLP1在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高，并且此后一直维持在较高的水平。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。

Description

一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法。

背景技术

花生为豆科落花生属作物，富含油脂和蛋白，是我国重要的油料作物和经济作物。花生的产量和品质受干旱、盐碱等胁迫影响非常严重，全国每年因干旱引起的花生减产率达20％以上。但由于花生品种资源遗传基础狭窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐盐的基因源，利用常规育种方法难以培育出高抗品种。随着分子生物学的快速发展，近年来利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了显著成果，对胁迫相关基因和信号转导途径也有了更深入的了解。

牛心果碱氧化酶是催化苄基异喹啉(类)生物碱合成过程中的关键酶，催化牛心果碱生成斯氏紫堇碱(Liscombe and Facchini,2008)。目前有关该基因功能的研究较少，其在非生物胁迫中的功能研究尚未见报道。本研究通过芯片杂交发现该基因在花生盐处理芯片中表达上调明显，随后对该基因进行了基因克隆及功能研究。

发明内容

为了提高花生生长的抗逆境能力，增强其耐盐、抗旱、耐低温能力，本发明提供了一种花生逆境胁迫基因AhROLP1的克隆及功能表达方法。

技术方案

一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（1）材料的准备与处理：材料选择花生花育33，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22-28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；

材料的低温处理，将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或重量浓度20%PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用；

（2）RNA的提取和cDNA的合成

按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasy Mini Kit分离提取花生幼苗RNA。RQ1 RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用M-MLVReverseTranscriptase进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μgRNA。在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；

（3）基因克隆

通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA Taq^TMDNA polymerase，在25-μL体系中加入以下成分：含MgCl₂的2.5μL 10×PCR buffer；2.5μL 10mMdNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH₂O。PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min。

扩增基因全长所用引物为AhROLP1-S:5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhROLP1-A:5’-TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’；

PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector并测序；

本发明的AhROLP1基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸。

本发明的AhROLP1基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶同源性均达到了70%以上。

本发明的AhROLP1基因的核苷酸序列是序列表中序列1。

本发明的AhROLP1基因的氨基酸序列是序列表中序列2。

用荧光定量Real-time RT-PCR对AhROLP1基因逆境下的功能表达进行分析，其方法如下：

荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8ng μL^-1，用的聚合酶是SYBR Premix ExTaq polymerase，用的仪器是LightCycler 2.0instrument system，每反应体系加2μL稀释的cDNA。

PCR反应程序如下：(1)95℃，10s；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s；(4)72℃，10s；PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃。actin11为实验的内参基因；

AhROLP1荧光定量验证用的引物序列为：QAhROLP1-S：5’-GTTGTGTTATTAGTTTCCTTAGCA-3’和QAhROLP1-A：5’-GGTGAGAAGAATCTGAATGGT-3’。

内参基因actin11所用引物序列为：QACT11-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’和QACT11-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。

本发明的有益效果：

通过荧光定量PCR验证了AhROLP1在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高（图2）。从图2可以看出，AhROLP1在低温处理的叶片和盐处理的根中表达量均有明显提高，并且此后一直维持在较高的水平(图2A,B’)，在干旱处理的叶片和根中表达量均明显增高，在叶片中增高倍数最高达到了200倍以上（图2C,C’）。以上结果表明AhROLP1可能在花生对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明AhROLP1基因能显著提高植物的抗逆性。

附图说明

图1花生AhROLP1蛋白与其它植物牛心果碱氧化酶蛋白氨基酸序列比较NCBI上蛋白编号：VvROLP，XP_002269462；CaROLP，XP_004486494；

CsROLP，XP_004135723；GmROLP，XP_003546286；FvROLP，XP_004295451；SlROLP，XP_004233150；MtROLP，XP_003594610。

图2AhROLP1在低温，NaCl，PEG6000处理下表达模式分析A,A’：

AhROLP1在低温处理的花生叶片和根中表达变化；B,B’：AhROLP1在200mMNaCl处理下的花生叶片和根中表达变化；C,C’：AhROLP1在20%PEG6000处理下的花生叶片和根中表达变化。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例进一步说明本发明，但并不是对本发明的进一步限定。

本发明的具体实施过程为：

1实验材料与方法

1.1实验材料

实验材料为花生花育33（Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33）。花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22-28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理实验。

对于低温处理，将三叶期花生幼苗至于4℃光照培养箱中进行处理，分别于处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为实验材料；对于耐盐用NaCL处理；对于抗旱，用PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或20%PEG6000溶液中，在处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为实验材料。所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。1.2RNA的提取和cDNA的合成

本实验用天根的RNeasyMiniKit分离提取花生幼苗RNA。RQ1 RNase-freeDNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用M-MLV ReverseTranscriptase进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μg RNA。在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。

1.3基因克隆

通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA Taq^TMDNApolymerase(TaKaRa)，在25-μL体系中加入以下成分：含MgCl₂的2.5μL 10×PCR buffer；2.5μL 10mM dNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH₂O。PCR反应条件为：(1)94℃，5min；(2)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(3)72℃，10min。扩增基因全长所用引物为AhROLP1-S:5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhROLP1-A:5’-TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18-TEasyvector并测序。

1.4荧光定量Real-timeRT-PCR

荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8ngμL^-1，用的聚合酶是SYBRPremix Ex Taq polymerase(Takara)，用的仪器是LightCycler 2.0 instrumentsystem(Roche,Germany)，每反应体系加2μL稀释的cDNA。PCR反应程序如下：(1)95℃，10s；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s；(4)72℃，10s。PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃。actin11为实验的内参基因。

AhROLP1荧光定量验证用的引物序列为：QAhROLP1-S：5’-GTTGTGTTATTAGTTTCCTTAGCA-3’和QAhROLP1-A：5’-GGTGAGAAGAATCTGAATGGT-3’。

内参基因actin11所用引物序列为：QACT11-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’和QACT11-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。

2实验结果

2.1AhROLP1核苷酸全长及其编码的氨基酸序列

通过PCR扩增及测序，得到了目的基因，该基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸。将该基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶(reticulineoxidase-likeprotein)同源性均达到了70%以上(图1)，故将该基因命名为AhROLP1(Arachis hypogaea Reticuline Oxidase-Like Protein 1)。

2.2AhROLP1在非生物胁迫下的表达模式分析

通过荧光定量PCR验证了AhROLP1在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高（图2）。从图2可以看出，AhROLP1在低温处理的叶片和盐处理的根中表达量均有明显提高，并且此后一直维持在较高的水平(图2A,B’)，在干旱处理的叶片和根中表达量均明显增高，在叶片中增高倍数最高达到了200倍以上（图2C,C’）。以上结果表明AhROLP1在花生对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明AhROLP1基因能显著提高植物的抗逆性。

序列1AhROLP1核苷酸序列

tttgtcaaaa attaatatac caaaaacatt attaagctaa gataaagagg ggaaaaaatg    60 gtagttcgtt

ctaataatat tagagcatta ccatcattat tattagttcc cattattgtt     120 gtgttattag tttccttagc

accatgttca acttcagctt caaattcaaa gacattcatt    180 cattgccttg taaaccattc agattcttct

cacccaataa gttcagcaat tttcacacca     240 agaaatgcct cattcacttc ggtgctggat tcctacgtta

gaaaccttcg tttcaacacg     300 tcgacaacaa gaaaaccata cctcataatc actgctttgc atgtatctca

cgtgcaagca     360 gccgttgttt gtggtcaaaa gcacaacctg caaatgaaaa ttcgaagcgg

cgggcatgac     420 tacgaaggag tgtcatatgt ggctgaagtg ccgttcttca tcctagacat gttcaacctg

480 agatccatag aggttgacat agaaagtgaa acagcttggg tacaggctgg tgcacagtta     540

ggtgaggtgt actataatat tgctaagaag agtaaaggtc atggattccc agcaggggtt     600 tgtcccacag

ttggtgttgg agggcacata agtggtggtg gctatggcaa tatgatgaga     660 aaatatggtc

tttcagtcga caacgttgtt gatgcacaaa tagttgatgt tcaaggtaga     720 ctacttgata gagaatcaat

gggagaagat ctgttttggg ccattagagg tggcggtggt     780 ggtagctttg gtgttgtgat tgcctacaaa

atcaagcttg ttaaagtccc agagaaagtt     840 actgtgttca gtgtttatag aaccttagaa gaaaatgcca

ctgacatagt ttataattgg     900 caacatgttg cacctaccat tgacaatgac ctcttcatta ggcttatcat

ggatgtggtg     960 aatgcaacac aaaatggaac taagactctt agggctaact tcatagcctt gtaccttggt

1020 gactccaaaa ccctaatttc tctcttgcat gacaagtttc ctcaattggg tttgaagcaa     1080

caagattgca ttgaaacaac ttggcttcaa tcggtgctct tttggactaa catcaacatt    1140 tcaactcctc

ttgaggtctt gcttgatagg caaccacaat caccagtcaa cttcttgaaa    1200aggaaatctgattatgtgaa

gaaaccaatt tcaaaagagg gtttggaagg aattttcaac    1260 aagatgattg agttggtaga tactatactg

tatttcaatc cttatggtgg aagaatggct    1320 gagattccat caacagaaac tccttttcct catagggctg

gcagattatg gaaggttcag    1380 taccaagcaa attggaaaac tccagggaaa gatgttgctg attactacat

tgacttgact    1440 aggaaacttc ataagtacat gactcctttt gtgtccaaca accctagaga ggctttcttc

1500 aattacaagg atcttgattt gggaattaac cataatggta agaacagcta tgtgcaaggt    1560

agggtttatg gggttgacta tttcaatcaa aacttcaata ggttggttca aattaagacc    1620 aaggttgatc

cttccaactt ctttaggaat gaacaaagca tccctaccct gccacattag    1680 ggtaatcatc attcaaaatt a

1701

序列2AhROLP1氨基酸序列

Claims (8)

1.一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（1）材料的准备与处理：材料选择花生花育33，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22-28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；

材料的低温处理，将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mMNaCl或重量浓度20%PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用；

（2）RNA的提取和cDNA的合成

按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasyMiniKit分离提取花生幼苗RNA，RQ1 RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成，用M-MLV Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μgRNA，在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；

（3）基因克隆

通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA Taq^TM DNA polymerase，在25-μL体系中加入以下成分：含MgCl₂的2.5μL 10×PCRbuffer；2.5μL 10mMdNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH₂O。PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min；

扩增基因全长所用引物为AhROLP1-S:5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhROLP1-A:5’-TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’；

PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18-TEasy vector并测序。

2.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸。

3.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶同源性均达到了70%以上。

4.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的核苷酸序列是序列表中序列1。

5.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的氨基酸序列是序列表中序列2。

6.根据权利要求1至5所述的任意一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的功能表达方法，用荧光定量Real-timeRT-PCR对AhROLP1基因逆境下的功能表达进行分析，其方法如下：

荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8ng μL^-1，用的聚合酶是SYBR Premix ExTaq polymerase，用的仪器是LightCycler 2.0 instrument system，每反应体系加2μL稀释的cDNA；

PCR反应程序如下：(1)95℃，10s；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s；(4)72℃，10s；PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃；actin11为实验的内参基因。

7.根据权利要求6所述的花生逆境胁迫AhROLP1基因的功能表达方法，其特征在于，所述的AhROLP1荧光定量验证用的引物序列为：QAhROLP1-S：5’-GTTGTGTTA TTAGTTTCCTTAGCA -3’和QAhROLP1-A：5’-GGTGAGAAGAATCTGAATGGT-3’。

8.根据权利要求6所述的花生逆境胁迫AhROLP1基因的功能表达方法，其特征在于，所述的内参基因actin11所用引物序列为：QACT11-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAA GGATGC-3’和QACT11-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。

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