CN108707614A

CN108707614A - 一种花生抗逆性基因及其应用

Info

Publication number: CN108707614A
Application number: CN201810565222.6A
Authority: CN
Inventors: 隋炯明; 禹山林; 王晶珊; 乔利仙; 杨庆利; 衣艳君; 张芳; 汤松
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2038-06-04
Also published as: CN108707614B

Abstract

本发明公开了一种花生抗逆性基因及其应用，属于生物技术领域。本发明的抗逆性基因序列如SEQ ID No.1或者SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。构建该基因的植物表达载体和微生物表达载体，并将其分别转化到植物和微生物体内，可以增强植物和微生物的耐盐性。

Description

一种花生抗逆性基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生抗逆性基因及其应用。

背景技术

生物在自然环境中经常要面对各种不利条件(如干旱、盐胁迫、低温等)胁迫；这些不利条件能够抑制生物的生长，甚至导致生物体死亡。随着环境的不断恶化，盐碱等逆境胁迫已经成为世界性的问题，培育具有多种抗逆性的生物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。

目前，通常采用常规杂交方法选育生物新品种。当前发展迅速的基因工程技术为生物遗传改良提供了新的途径，利用在盐胁迫应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得耐盐新种质的重要手段。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生抗逆性基因及其应用。

为了到达上述目的，本发明的技术方案为：

一种抗逆性基因，其序列如SEQ ID No.1或者SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。

在上述方案的基础上，克隆该基因的引物序列为：

P1：5'GTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC 3'；

P2：5'TCAACAACCAACTGATTAAACCACC 3'。

扩增所述抗逆性基因任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

在上述方案的基础上，其序列具有2个外显子，对应的碱基分别为第14-354，1083-1092位。

含有上述花生抗逆性基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述花生抗逆性基因编码的蛋白。

在上述方案的基础上，所述花生抗逆性基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.2经一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白。

上述花生抗逆性基因或其编码的蛋白在提高生物抗逆性中的应用。

在上述方案的基础上，所述的生物为植物和微生物；优选的，所述植物为拟南芥，所述微生物为大肠杆菌。

在上述方案的基础上，所述的抗逆性为耐盐性。

一种提高植物耐盐性的方法，将上述花生抗逆性基因构建到植物表达载体，导入植物细胞中，使其在植物中表达，获得高耐盐性植株。

一种提高微生物耐盐性的方法，将上述花生抗逆性基因构建到表达载体，导入微生物细胞中，使其在微生物细胞中表达，获得高耐盐性菌株。

本发明的有益效果：

1、本发明从花生中克隆到一条抗逆性基因，测序结果表明该基因有2个外显子，分别对应的碱基为14-354，1083-1092，将其命名为nsLTP1。

2、构建nsLTP1基因的植物表达载体，并转化拟南芥；结果表明：转入nsLTP1基因的拟南芥植株形态发育正常，转nsLTP1基因拟南芥苗至少可以抗100mM NaCl的胁迫；nsLTP1基因在拟南芥中表达可显著提高其耐盐性。

3、构建nsLTP1基因的原核表达载体，并转化大肠杆菌，重组菌可以抗7.5％NaCl的胁迫。

附图说明

图1nsLTP1基因在花生盐胁迫处理后的表达情况；

图2转基因拟南芥耐盐性分析(左边为转基因组，右边为对照组)；

图3转基因大肠杆菌耐盐性分析(A为转入空载pET22b，B为转入pET22b-nsLTP1)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存；

1、花生抗逆性相关基因的克隆

以花生的基因组DNA为模板，以引物对：

P1：5'GTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC 3'SEQ ID No.3；

P2：5'TCAACAACCAACTGATTAAACCACC 3'SEQ ID No.4；

扩增花生抗逆性相关基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示；测序结果表明该基因有2个外显子，分别对应的碱基为14-354，1083-1092，将其命名为nsLTP1。

2、nsLTP1在花生盐胁迫处理后的表达情况

(1)用0.7％NaCl处理“花育23号”的幼苗，在处理后0h、6h、12h、24h、48h取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNase I处理，并进行纯化。

(2)样品在ABI 7500FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。20μL反应体系包括：10μL2×SybrGreen qPCR Master Mix，20μmol/L正反向引物各0.25μL，20ng反转录产物。扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。结果如图1。

(3)nsLTP1基因定量PCR引物为

正向引物序列为5'-CATGGCCTTGGTGGGTG-3'(SEQ ID No.5)；

反向引物序列为5'-CTTGCGGTCGGCAGTAG-3'(SEQ ID No.6)。

内标基因Actin的正反向引物序列为：

正向引物序列为5'-GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3'(SEQ ID No.7)；

反向引物序列为5'-ATGGATGGCTGGAAGAGAACT 3'(SEQ ID No.8)。

nsLTP1基因在盐胁迫处理前后表达量变化明显，表明其表达受盐胁迫诱导(如图1所示)。

实施例2

根癌农杆菌菌株GV3101购自北京天恩泽基因科技有限公司；

转基因的受体材料为拟南芥野生型品种由青岛农业大学遗传研究室实验室提供。

1、nsLTP1基因植物表达载体的构建

以花的基因组DNA为模板，在扩增时分别在上下游引物中加入KpnI和SacI酶切位点。

P3：5'-GGTACCGTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC-3'(KpnI)(SEQ ID No.9)；

P4：5'-GAGCTCTCAACAACCAACTGATTAAACCACC-3'(SacI)(SEQ ID No.10)。

回收PCR产物，并在T4DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-T(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含nsLTP1基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体Super1300的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体Super1300-nsLTP1。

2、表达载体转化拟南芥

(1)农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将Super1300-nsLTP1重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株GV3101感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mLYEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培养基中，培养到OD600＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体1/2MSB₅悬浮备用。

(2)拟南芥的种植：选取合适的的拟南芥种子，在1％NaClO中浸泡5min，无菌水冲洗4-6次。点种到基质土上。

(3)农杆菌介导的遗传转化：选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的湿度。24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长。大约3w后收取成熟种子。

将转基因拟南芥种子接种到20mL MS(潮霉素30mg/L)培养基中，22℃培养1w左右，选取鲜绿健壮的拟南芥幼苗，移植于基质土。

3、转基因植株的PCR检测

提取转基因植株的基因组DNA，利用上述载体序列和nsLTP1基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，55℃、50s，72℃、1min，32个循环；72℃、10min。

4、植株转基因拟南芥的耐盐性鉴定

为进一步分析转基因植株的耐盐性，将得到的转nsLTP1基因拟南芥与未转nsLTP1基因拟南芥种子接种于MS(含100mM NaCl)培养基上。22℃培养2w左右，观察结果。结果发现转nsLTP1基因拟南芥幼苗生长正常，而未转nsLTP1基因拟南芥幼苗生长受到严重影响(如图2所示)，所以转nsLTP1基因拟南芥幼苗的抗盐浓度为100mM或以上。

实施例3

大肠杆菌BL21、大肠杆菌菌株pET-22b由青岛农业大学遗传研究室实验室保存。

1、nsLTP1基因原核表达载体的构建

提取花生总RNA，通过RT-PCR扩增了nsLTP1基因的编码区(其序列表如SEQ ID No:11所示)，该编码区所编码的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示；所用引物为：

P5：5′-CATATGGCTAGCCTCAAGGTTGCA-3′(NdeⅠ)(SEQ ID No:12)；

P6：5′-AAGCTTATTGATGGTGTTACAATT-3′(HindⅢ)(SEQ ID No:13)；

回收PCR产物，并在T4DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-T进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收含nsLTP1基因的酶切片段，并克隆到原核表达载体pET-22b的对应位点中，获得该基因的原核表达载体。

2、nsLTP1基因在大肠杆菌中的诱导表达

挑取携带pET-22b-nsLTP1的单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床250rpm培养16h，按1∶30的比例转接过夜菌液(约340μL)转到10mL含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床250rpm活化2-3h。当菌液OD600达到0.6-0.8时，加入100mM IPTG使终浓度达1mM，于37℃摇床250rpm诱导培养8h。含pET-22b的大肠杆菌BL21在IPTG诱导8h后的产物作为对照。

3、pET-22b-nsLTP1重组菌的耐盐性测定

按1∶100取经IPTG诱导的重组菌和对照菌株，将其分别置于10mL含0％、3.5％、5.5％、7.5％、10.0％、和15.0％NaCl的液体LB中(含100μg/mL氨苄青霉素)，分别取培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的培养物于600nm测其吸光度，重复3次，根据实验结果绘制其生长曲线，实验结果进行统计分析。pET-22b-nsLTP1重组菌在7.5％NaCl溶液中还能生长，而对照菌的生长受到严重抑制(如图3所示)。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种花生抗逆性基因及其应用

<130> 2018

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1327

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 1

gtccaatact attatggcta gcctcaaggt tgcatgtgtg gttactttgg tgtgcatggc 60

cttggtgggt gcaccaatgg tccaggccat cacatgtggt caagtggtta gtgcactaac 120

accatgcata gggtacttac gaatgggggg aaatcctaca ccagcatgtt gtagtggggt 180

taggaacctt aaccaggctg ctgccactac tgccgaccgc aagactgcct gtgtctgtct 240

aaaaaatgcg gccggcaata ttggtggcat cagccctacc tattctcagt cacttcctgg 300

caaatgtggg gttaacctcc cttataagtt cagcacttcc accaattgta acacgtaagt 360

tattatcaaa ctcataatat ttactattaa aatttttatt tgtatccgta tcaaaatcaa 420

ttattaaaat taattatcat atatttatgt ataaatatat aatttaattt atttttaata 480

tatattttat attaatttta gtatacgtct actatggtta atttattatg tctaaaacta 540

tagttcaatc gattaaaagt gtgcataaat tggaaaaaga aaaattgcaa ttatgaaaga 600

gaaaagtgat cgtctatata attaactttt agaaagaata tcgaggcatt catagttaca 660

aattaaaagt aacaaattat tatctatgat gcatttaatg tttcttactt aattttggat 720

atctatacta attaggattt agttaaatta tgtttttagg acacatatta aaactattaa 780

taaaaaaata taaaaaaaaa tacacggttc aagtttctta tacattgttg cattttttat 840

tacaataaaa agtttaaaat cttttagaaa taataatttt aatacgtgtc tttaagataa 900

ttgttaacta aattttatta attattggtt aattattaat cactgttttt tgttaattat 960

tggttcatct tacttattgc attgcgaact tactttgact tttttatgag catatagaag 1020

cacatatata cgtacctaac atcattaatt tcttaatttg ttgttttgtt tcaatatgac 1080

agcatcaatt aagatatgaa aagatgtgtt agagaggaag cggattccac tcagccactt 1140

cctactttgg agattatgac acacttcagt ttccgttgca ttattaatta attatttact 1200

aagaataaag ggatatgatg gccactagga cctccactta ggcgagttcc tcatgtatta 1260

gcgtgtccca ttgttttttt tatttaattc gctctccttc ttggtggttt aatcagttgg 1320

ttgttga 1327

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Lys Val Ala Cys Val Val Thr Leu Val Cys Met Ala

1 5 10 15

Leu Val Gly Ala Pro Met Val Gln Ala Ile Thr Cys Gly Gln Val Val

20 25 30

Ser Ala Leu Thr Pro Cys Ile Gly Tyr Leu Arg Met Gly Gly Asn Pro

35 40 45

Thr Pro Ala Cys Cys Ser Gly Val Arg Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ala

50 55 60

Thr Thr Ala Asp Arg Lys Thr Ala Cys Val Cys Leu Lys Asn Ala Ala

65 70 75 80

Gly Asn Ile Gly Gly Ile Ser Pro Thr Tyr Ser Gln Ser Leu Pro Gly

85 90 95

Lys Cys Gly Val Asn Leu Pro Tyr Lys Phe Ser Thr Ser Thr Asn Cys

100 105 110

Asn Thr Ile Asn

115

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 3

gtccaatact attatggcta gcctc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 4

tcaacaacca actgattaaa ccacc 25

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 5

catggccttg gtgggtg 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 6

cttgcggtcg gcagtag 17

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 7

gtggccgtac aactggtatc gt 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 8

atggatggct ggaagagaac t 21

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 9

ggtaccgtcc aatactatta tggctagcct c 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 10

gagctctcaa caaccaactg attaaaccac c 31

<210> 11

<211> 351

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 11

atggctagcc tcaaggttgc atgtgtggtt actttggtgt gcatggcctt ggtgggtgca 60

ccaatggtcc aggccatcac atgtggtcaa gtggttagtg cactaacacc atgcataggg 120

tacttacgaa tggggggaaa tcctacacca gcatgttgta gtggggttag gaaccttaac 180

caggctgctg ccactactgc cgaccgcaag actgcctgtg tctgtctaaa aaatgcggcc 240

ggcaatattg gtggcatcag ccctacctat tctcagtcac ttcctggcaa atgtggggtt 300

aacctccctt ataagttcag cacttccacc aattgtaaca ccatcaatta a 351

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 12

catatggcta gcctcaaggt tgca 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 13

aagcttattg atggtgttac aatt 24

Claims

1.一种抗逆性基因，其特征在于：其序列如SEQ ID No.1或者SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。

2.根据权利要求1所述抗逆性基因，其特征在于：克隆该基因的引物序列为：

P1：5'GTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC 3'；

P2：5'TCAACAACCAACTGATTAAACCACC 3'。

3.根据权利要求1或2所述花生抗逆性基因，其特征在于：其序列具有2个外显子，对应的碱基分别为第14-354，1083-1092位。

4.含有权利要求1～3任一项所述花生抗逆性基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1～3任一项所述花生抗逆性基因编码的蛋白。

6.权利要求1～3任一项所述花生抗逆性基因或其编码的蛋白在提高生物抗逆性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的生物为植物和微生物。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述的抗逆性为耐盐性。

9.一种提高植物耐盐性的方法，其特征在于：将权利要求1～3任一项所述花生抗逆性基因构建到植物表达载体，导入植物细胞中，使其在植物中表达，获得高耐盐性植株。

10.一种提高微生物耐盐性的方法，其特征在于：将权利要求1～3任一项所述花生抗逆性基因构建到表达载体，导入微生物细胞中，使其在微生物细胞中表达，获得高耐盐性菌株。