CN109112117B - 一种分离的二化螟cyp15c1基因及其编码蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明属于昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种分离的二化螟CYP15C1基因及其编码蛋白。本发明分离的二化螟CYP15C1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还包括二化螟CYP15C1基因RNA干扰序列如SEQ ID NO：3的应用，所述的序列对二化螟CYP15C1基因具有良好的沉默效果。涂抹饲喂该干扰序列，显著提高了二化螟幼虫的死亡率，抑制了二化螟的变态发育，最终导致二化螟的畸形，从而可以有效的控制其种群的发展。进一步，本发明的基因及蛋白可用于转基因抗虫植物的开发以及二化螟的生物防治。

Description

一种分离的二化螟CYP15C1基因及其编码蛋白
技术领域
本发明涉及昆虫基因工程技术领域。具体涉及一种分离的二化螟CYP15C1基因及其编码蛋白，本发明还包括该蛋白的应用，所述的应用包括一条二化螟CYP15C1基因的RNA干扰序列的应用，通过生物学验证，本发明的CYP15C1基因的RNA干扰序列可用于转基因抗虫植物的开发。
背景技术
二化螟(Chilo suppressalis(Walker))(鳞翅目：螟蛾科)是一种重要的多食性农业害虫，给水稻生产带来了巨大的经济损失(Xu et al.2011)。近年来，随着水稻种植结构的变更、耕作制度的改革和气候变暖等因素，二化螟在亚洲范围内的发生数量和危害程度明显上升(Srensen JG et al.,2012；张扬等，2014)。目前对于二化螟的防治还是以施用化学杀虫剂为主，由于长期大量使用化学农药给环境造成了压力以及抗药性等问题(唐涛，2016；Zibaee et al.2009)，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施成为了当前的防治热点(Ma et al.,2012)。
细胞色素P450(简称P450)是广泛存在于生物体的一种蛋白质，已记载基因组的昆虫中P450基因的数量在36～170种之间(Feyereisen,2012)。昆虫P450具有氧化酶的功能，参与了许多内源性物质的合成或分解，催化植物有毒物质、杀虫剂和环境污染物等物质的代谢以及蜕皮激素，保幼激素和性信息素的合成，在昆虫的生长发育和防御方面起着非常重要的作用(Feyereisen,2012)。在分子水平上,已证明至少6种P450参与了果蝇蜕皮激素代谢,直翅目昆虫的CYP15A1和家蚕的CYP15C1在保幼激素的合成过程中起重要作用(Igaand Kataoka,2012)。此外，还发现果蝇CYP4G1参与了表皮烃类物质的生物合成(Qiu etal.,2012)。大量事实表明，P450对植物次生性有毒物质的代谢解毒能力决定了昆虫的寄主范围(Schuler,2011)；其对杀虫剂解毒或活化关系到昆虫对杀虫剂的耐受性，P450介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是昆虫产生抗药性的机制(邱星辉，2014)。
P450在昆虫抗药性中的作用已被广泛认知，但由于P450的种类多样性、催化方式的复杂性和研究技术的难度等条件的限制，P450在分子机制方面的介导作用还没有被全面的报道，本发明的目的在于通过分离、克隆二化螟CYP15C1基因及其编码蛋白，通过二化螟的媒介从分子机制上研究二化螟多P450基因的抗性及应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的技术的不足，提供一种分离的二化螟CYP15C1基因及其编码蛋白，其中包括开发该基因的RNA干扰序列，为利用CYP15C1控制二化螟种群的发展提供新的途径。
本发明运用RNA干扰技术，通过饲喂二化螟CYP15C1基因干扰序列的dsRNA，发现抑制二化螟CYP15C1基因的表达，显著提高了二化螟幼虫的死亡率。本发明首次发现CYP15C1基因的缺失会显著提高二化螟的死亡率，最终导致种群发展的衰退，为实现绿色防治二化螟及其他鳞翅目昆虫特别是螟蛾科昆虫提供技术基础。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人分离了一种二化螟CYP15C1基因，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长为1763bp。
申请人分离了一种二化螟CYP15C1基因编码的蛋白，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，编码486个氨基酸残基。
基于上述基因的分离和克隆，本发明还提供CYP15C1基因的RNA干扰序列，该干扰序列为双链RNA分子，利用特异性引物体外合成该序列的dsRNA，通过涂抹饲喂二化螟初孵幼虫验证二化螟对CYP15C1基因编码蛋白的抗性。结果显示该序列可显著抑制CYP15C1基因的表达。通过进一步研究沉默CYP15C1基因对二化螟幼虫死亡率的影响，结果发现抑制CYP15C1基因的表达显著提高了幼虫的死亡率，减缓了二化螟的变态发育速度和蜕皮不完全，最终抑制二化螟种群的发展。进一步，所述的干扰序列可应用于转基因抗二化螟植物的开发。
合成dsRNA特异性引物的核苷酸序列如下：
上游引物ds CYP15C1-F：tgGAATTCGAGACGCTCAAGCCCTTC，
下游引物ds CYP15C1-R：tgGAATTCCCTAACAATTATCCAGTTCCAAACT。
(注：划线部分序列为EcoR I酶切位点)
本发明的积极有益效果：
(1)本发明首次发现CYP15C1基因参与了二化螟的生长发育过程，CYP15C1基因表达的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率，影响蜕皮激素的调控，最终抑制二化螟种群的发展。该基因可用于开发防治螟蛾科昆虫的生物产品。
(2)本发明提供了一种二化螟CYP15C1基因的干扰序列，该干扰序列可显著抑制CYP15C1基因的表达，可利用该序列干扰CYP15C1基因的表达，抑制二化螟的生长，最终控制其种群的发展。本发明可用于开发绿色环保的抗虫植物，最终达到绿色防治害虫的目的。
(3)利用基因工程技术，可以将外源基因导入植物表达的载体，然后导入植物细胞，进一步可以获得抗虫的转基因植物细胞和转基因植株。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是二化螟CYP15C1基因的核苷酸序列，序列全长为1763bp。
序列表SEQ ID NO：2是二化螟CYP15C1基因编码的蛋白质序列，编码486个氨基酸残基。
序列表SEQ ID NO：3是二化螟CYP15C1基因的干扰序列，序列全长为352bp。
图1：CYP15C1基因功能验证流程图。
图2：是本发明涉及的pEASY-T1克隆载体结构示意图。
图3：是本发明涉及的pET-2P表达载体结构示意图。
图4：饲喂CYP15C1基因的dsRNA后，二化螟CYP15C1基因的沉默效率测试结果。附图标记说明：其中“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。图中英文缩写含义：“ds CYP15C1”表示饲喂CYP15C1基因dsRNA的处理组；“dsEGFP”表示饲喂EGFP基因dsRNA的对照组；“H2O”表示饲喂ddH2O的对照组。
图5：饲喂CYP15C1基因的dsRNA对二化螟生长发育的影响。附图标记说明：图5中的a图：饲喂CYP15C1基因的dsRNA对二化螟幼虫死亡率的影响；图5中的b图：饲喂CYP15C1基因的dsRNA对二化螟幼虫干重的影响；其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01。图中英文缩写含义：ds CYP15C1”表示饲喂CYP15C1基因dsRNA的处理组；“dsEGFP”表示饲喂EGFP基因dsRNA的对照组；“H2O”表示饲喂ddH2O的对照组。
具体实施方式
下面实施例中所使用的技术，包括RNA的提取、cDNA合成，PCR扩增与检测，以及dsRNA合成等分子生物学技术，除非特别说明，均为本领域内技术人员已知的常规技术。所使用的仪器设备、试剂等，除非本说明书特别注明，均为本领域技术人员可通过公关途径或商业途径获得。
实施例1：二化螟CYP15C1基因的克隆与分析
1.二化螟总RNA的提取：称取20mg的二化螟样品置于1.5ml无酶管中，利用一次性无酶研磨棒及液氮充分研磨后，使用Promega公司的SV total RNA isolation system提取试剂盒提取总RNA，详细步骤参照该试剂盒操作说明书。
2.cDNA的合成：使用宝生物工程大连有限公司的PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒将上述步骤1中提取的总RNA合成cDNA模板(详细步骤参照该试剂盒操作说明书)。
3.引物设计：利用转录组测序得到CYP15C1基因的核酸序列(见SEQ ID NO：1)，设计引物验证预测的开放阅读框。设计并合成如下引物：
上游引物序列CYP15C1-F：5'-ACTTAAGGATGTGGGCTCTATTAG-3'，
下游引物序列CYP15C1-R：5'-TCCGTGTCTTGGTAGAAACTGT-3'。
以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.PCR扩增：利用上述引物CYP15C1-F和CYP15C1-R进行PCR扩增，PCR体系参照宝生物工程大连有限公司的Ex Taq酶使用说明书。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen公司的的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。
5.PCR产物的克隆：利用TransGen公司的的pEASY-T1Simple Cloning Kit，按照说明书将PCR产物连接到pEASY-T1载体(见图2)上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆子送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。
6.序列分析：利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)将测序所得的CYP15C1基因核苷酸序列与转录组所得的核苷酸序列比对验证其正确性，结果显示，测序结果一致。利用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(见SEQID NO：2)，结果显示，CYP15C1基因开放阅读框架全长1461bp，编码486个氨基酸残基，预测分子量为55.4168KD，理论等电点为9.06。
本发明进一步将CYP15C1基因编码的蛋白与其它昆虫的CYP15C1氨基酸序列进行比对，确认本发明分离的蛋白具有典型的CYP15C1蛋白特征。
实施例2：dsRNA合成
1.dsRNA模板的制备：
根根据实施例1中所获得的CYP15C1基因开放阅读框功能区序列，通过siDirectversion 2.0预测dsRNA区域，并利用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)设计特异性扩增表达引物(5'-端加上适当的酶切位点)，用于CYP15C1基因的dsRNA片段的扩增，设计的特异性引物如下：
上游引物ds CYP15C1-F：tggaattcGAGACGCTCAAGCCCTTC，
下游引物ds CYP15C1-R：tggaattcCCTAACAATTATCCAGTTCCAAACT。
(注：划线部分序列为EcoR I酶切位点)
利用上述引物ds CYP15C1-F和ds CYP15C1-R进行PCR扩增，PCR反应体系参照宝生物工程大连有限公司的Ex Taq酶使用说明书进行。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。最后通过TA克隆将其连接到pEASY-T1载体(见图2)上。
2.表达载体构建
①利用AxyGen的AxyPrep Plasmid Miniprep kit试剂盒提取含有目的片段的质粒并酶切。酶切，试剂按照表1所示的体系配制。
表1 PCR反应体系-1
Figure BDA0001398281190000051
37℃反应30min，85℃反应5s以终止反应。1.2％琼脂糖凝胶电泳切下目的片段并回收。
②酶切的目的片段与pET-2P载体(见图3)的连接反应体系按照表2所述的顺序配制，16℃过夜连接。
表2 PCR反应体系-2
Figure BDA0001398281190000052
重组载体转化入感受态细胞HT115的过程：将感受态细胞HT115从-80℃超低温冰箱中取出至于冰上融化5min，然后将连接产物用移液枪加入到HT115感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰上放置30min，然后于42℃水浴热激45s，再于冰上复苏2-3min，加入已灭菌的LB液体培养基至1ml，然后于37℃、150rpm摇床培养1h。取200μl菌液均匀涂布在卡那霉素(50mg/ml)抗性的LB培养基平板上，37℃倒置过夜培养。隔天挑取圆润饱满的单菌落，在卡那霉素抗性的LB液体培养基中扩大培养，将新鲜菌液于-80℃保存在30％已灭菌的甘油中，备用。
实施例3 饲喂CYP15C1基因的dsRNA后基因的沉默效率及其对二化螟生长发育的影响。
检测体外表达的CYP15C1dsRNA：
取10μl保存在-80℃的重组质粒加入到1ml Kana(50mg/ml)抗性的LB培养基中在37℃、150rpm条件下过夜培养活化，然后加入到10ml LB+Kana培养基中扩大培养，待其OD600值约为0.5-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导表达dsRNA，继续在摇床培养4h。
取100ml大肠杆菌中表达好的菌液，在5000rpm离心5min，弃上清，用5ml((体积比20:1)ddH2O悬浮菌液沉淀，置于4℃冰箱内保存待用或直接用于饲喂试验。步骤如下：
①提前两天用脱脂棉加水浸泡水稻种子明恢63(简称MH63)(一种常规水稻品种)，饲喂试验时种子发芽。
②用浓缩后的大肠杆菌菌液均匀涂抹水稻种子，将三粒MH63水稻种子，置于U形管中并保持环境湿润，取30头二化螟初孵幼虫接种于每个U形管中，饲喂二化螟幼虫72h。每个饲喂试验设置5个重复，分别用ddH2O、dsRNA(GFP、CYP15C1)饲喂。
③饲喂72h后，取一部分干扰的幼虫收集作为定量样品来检测干扰效率，每个处理3个重复，每个重复15头幼虫。
④7天后统计二化螟的死亡率，并记录实验结果。
试验结果及分析：
(1)饲喂CYP15C1基因的dsRNA后该基因的沉默效率检测
qRT-PCR检测结果显示：与对照组相比，饲喂CYP15C1基因的dsRNA显著抑制了CYP15C1在二化螟体内(见图4)的表达。由此可见，该二化螟CYP15C1基因的干扰序列可显著抑制CYP15C1基因的表达。
(2)饲喂CYP15C1基因dsRNA对二化螟死亡率和表型的影响
在实验室内，申请人观察饲喂处理7天后二化螟的生长情况，统计了死亡率和虫重，结果显示，与对照组相比，饲喂CYP15C1基因dsRNA处理组的二化螟死亡率提高了35.56％(见图5中的a图)，虫重下降了22.03％(见图5中的b图)。因此本发明提供的RNA干扰序列可应用于转基因抗二化螟植物的开发。进一步开发其蛋白可应用于二化螟的生物防治。
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<212> DNA
<213> 二化螟(Chilo suppressalisWalker)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1763)
<220>
<221> CDS
<222> (38)..(1498)
<400> 1
acatggggag atagatatca ggcgtttgaa cttaagg atg tgg gct cta tta gta 55
Met Trp Ala Leu Leu Val
1 5
ata ata ctt tta acg ttt tac ctt ttg aaa gaa aat aat aaa aga cct 103
Ile Ile Leu Leu Thr Phe Tyr Leu Leu Lys Glu Asn Asn Lys Arg Pro
10 15 20
act aaa ttt cca cca ggg cca aag cct ttg ccg ctt gtt gga aac ctt 151
Thr Lys Phe Pro Pro Gly Pro Lys Pro Leu Pro Leu Val Gly Asn Leu
25 30 35
ttt tcc gtg tta ttc gaa ctc aaa aag gta aag tat cat cat agc tta 199
Phe Ser Val Leu Phe Glu Leu Lys Lys Val Lys Tyr His His Ser Leu
40 45 50
tgg aag tgt tgg tcg aat aag tat gga ggt ttg ctt gga ttg aga ctc 247
Trp Lys Cys Trp Ser Asn Lys Tyr Gly Gly Leu Leu Gly Leu Arg Leu
55 60 65 70
ggc tct gtc aac aca gtg gtt gtg ttt gga aaa gaa atg att aag gag 295
Gly Ser Val Asn Thr Val Val Val Phe Gly Lys Glu Met Ile Lys Glu
75 80 85
gtg tac tcc agg gaa gtt ttc gac gga aga cct gat ggg ttc atg tac 343
Val Tyr Ser Arg Glu Val Phe Asp Gly Arg Pro Asp Gly Phe Met Tyr
90 95 100
acg tta cga tct ttc ggt aaa aag ctt ggt atc gtc ttt aac gac ggt 391
Thr Leu Arg Ser Phe Gly Lys Lys Leu Gly Ile Val Phe Asn Asp Gly
105 110 115
tct tca tgg gca aag aca agg cga att gct tta aaa ttc atg aag agt 439
Ser Ser Trp Ala Lys Thr Arg Arg Ile Ala Leu Lys Phe Met Lys Ser
120 125 130
cac gga tat gga tcc cga ctt atg gag gaa cac atc tcc gaa gaa tgt 487
His Gly Tyr Gly Ser Arg Leu Met Glu Glu His Ile Ser Glu Glu Cys
135 140 145 150
atg gag ctc gtg aaa atg ctg agc aga act aca aaa cca gta ctc gct 535
Met Glu Leu Val Lys Met Leu Ser Arg Thr Thr Lys Pro Val Leu Ala
155 160 165
aac aac tta ttt gat gtc tcc att atc aat atc gta tgg cgg ctg gtg 583
Asn Asn Leu Phe Asp Val Ser Ile Ile Asn Ile Val Trp Arg Leu Val
170 175 180
gct ggc aaa aga tac aaa ctg gat gat gaa aat ttg aag aaa ctg tgc 631
Ala Gly Lys Arg Tyr Lys Leu Asp Asp Glu Asn Leu Lys Lys Leu Cys
185 190 195
gat ttg atc aca cgc tgc ttc aaa gcg gtc gac atc agc ggt ggt gtg 679
Asp Leu Ile Thr Arg Cys Phe Lys Ala Val Asp Ile Ser Gly Gly Val
200 205 210
atg act ttt atg cca ttc ctg agg tac atc ata cca gat atc att ggg 727
Met Thr Phe Met Pro Phe Leu Arg Tyr Ile Ile Pro Asp Ile Ile Gly
215 220 225 230
tac acg gaa atg acg acc gtc cac cga gca cta cac aag ttc cta aca 775
Tyr Thr Glu Met Thr Thr Val His Arg Ala Leu His Lys Phe Leu Thr
235 240 245
gaa act att agg gaa cac aga ggt act ctc gat ccc gac aat cct cga 823
Glu Thr Ile Arg Glu His Arg Gly Thr Leu Asp Pro Asp Asn Pro Arg
250 255 260
gat gtg ata gac tct ttt tta ata gaa ctg cac cat aat aat ggt agc 871
Asp Val Ile Asp Ser Phe Leu Ile Glu Leu His His Asn Asn Gly Ser
265 270 275
tca gaa gac ctt caa gtc gtc tgc tta gac atg ctc gag gct ggt gtg 919
Ser Glu Asp Leu Gln Val Val Cys Leu Asp Met Leu Glu Ala Gly Val
280 285 290
gag aca gta aac aac aca gct gta tat atg cta ctc cat ttg gtg cga 967
Glu Thr Val Asn Asn Thr Ala Val Tyr Met Leu Leu His Leu Val Arg
295 300 305 310
gaa aga aat gtg cag atg cgg tta caa atg gaa atc gat gag gtc ata 1015
Glu Arg Asn Val Gln Met Arg Leu Gln Met Glu Ile Asp Glu Val Ile
315 320 325
gga aag gaa aga aca cct tct ttg tct gat aaa tcc agg atg gtg tac 1063
Gly Lys Glu Arg Thr Pro Ser Leu Ser Asp Lys Ser Arg Met Val Tyr
330 335 340
acg gaa gca gtg ata tta gaa aca ttg aga ata tca agc ata gct cca 1111
Thr Glu Ala Val Ile Leu Glu Thr Leu Arg Ile Ser Ser Ile Ala Pro
345 350 355
gtg gga ata cca cat atg gct aca gcg gat aca caa tta gga ggc tac 1159
Val Gly Ile Pro His Met Ala Thr Ala Asp Thr Gln Leu Gly Gly Tyr
360 365 370
gat ata ccc aag ggt act ttc ata tta ata ggc ttg cat gat ctc cac 1207
Asp Ile Pro Lys Gly Thr Phe Ile Leu Ile Gly Leu His Asp Leu His
375 380 385 390
aat gga agc cac tgg aag aat cct cag gat ttt agg cca gag cga ttc 1255
Asn Gly Ser His Trp Lys Asn Pro Gln Asp Phe Arg Pro Glu Arg Phe
395 400 405
ctc acc aaa gaa gga aac cta atg caa gat gag acg ctc aag ccc ttc 1303
Leu Thr Lys Glu Gly Asn Leu Met Gln Asp Glu Thr Leu Lys Pro Phe
410 415 420
ggt ttc gga aaa agg cga tgt atc gga gaa gga ttg gca agg tcc gag 1351
Gly Phe Gly Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu Gly Leu Ala Arg Ser Glu
425 430 435
cta ttc ctg ttc atc gct cac ata atg caa aag ttc cat ctg ata gtt 1399
Leu Phe Leu Phe Ile Ala His Ile Met Gln Lys Phe His Leu Ile Val
440 445 450
ccg gat gga gat cct ctc ccc acg gcg gat cct gtt ggt ggc atc acg 1447
Pro Asp Gly Asp Pro Leu Pro Thr Ala Asp Pro Val Gly Gly Ile Thr
455 460 465 470
ctt tct gcc aaa cca ttc aag ata cag ttt cta cca aga cac gga ttt 1495
Leu Ser Ala Lys Pro Phe Lys Ile Gln Phe Leu Pro Arg His Gly Phe
475 480 485
taa ccatattctt tattcagtaa ctaattaagc aatataaggt tataggtatc 1548
tgtcttattt acttgtttaa tgttttgaac aagatattta gtttcaatca taaaagctct 1608
gcttagtttg gaactggata attgttagga atatcccgtg atttgttgtt accgttatta 1668
ataaaatact tatataaaaa ggtcaactga ttctcgataa taataaacaa ataggatttt 1728
aactctggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1763
<210> 2
<211> 486
<212> PRT
<213> 二化螟(Chilo suppressalisWalker)
<400> 2
Met Trp Ala Leu Leu Val Ile Ile Leu Leu Thr Phe Tyr Leu Leu Lys
1 5 10 15
Glu Asn Asn Lys Arg Pro Thr Lys Phe Pro Pro Gly Pro Lys Pro Leu
20 25 30
Pro Leu Val Gly Asn Leu Phe Ser Val Leu Phe Glu Leu Lys Lys Val
35 40 45
Lys Tyr His His Ser Leu Trp Lys Cys Trp Ser Asn Lys Tyr Gly Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gly Ser Val Asn Thr Val Val Val Phe Gly
65 70 75 80
Lys Glu Met Ile Lys Glu Val Tyr Ser Arg Glu Val Phe Asp Gly Arg
85 90 95
Pro Asp Gly Phe Met Tyr Thr Leu Arg Ser Phe Gly Lys Lys Leu Gly
100 105 110
Ile Val Phe Asn Asp Gly Ser Ser Trp Ala Lys Thr Arg Arg Ile Ala
115 120 125
Leu Lys Phe Met Lys Ser His Gly Tyr Gly Ser Arg Leu Met Glu Glu
130 135 140
His Ile Ser Glu Glu Cys Met Glu Leu Val Lys Met Leu Ser Arg Thr
145 150 155 160
Thr Lys Pro Val Leu Ala Asn Asn Leu Phe Asp Val Ser Ile Ile Asn
165 170 175
Ile Val Trp Arg Leu Val Ala Gly Lys Arg Tyr Lys Leu Asp Asp Glu
180 185 190
Asn Leu Lys Lys Leu Cys Asp Leu Ile Thr Arg Cys Phe Lys Ala Val
195 200 205
Asp Ile Ser Gly Gly Val Met Thr Phe Met Pro Phe Leu Arg Tyr Ile
210 215 220
Ile Pro Asp Ile Ile Gly Tyr Thr Glu Met Thr Thr Val His Arg Ala
225 230 235 240
Leu His Lys Phe Leu Thr Glu Thr Ile Arg Glu His Arg Gly Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Asp Asn Pro Arg Asp Val Ile Asp Ser Phe Leu Ile Glu Leu
260 265 270
His His Asn Asn Gly Ser Ser Glu Asp Leu Gln Val Val Cys Leu Asp
275 280 285
Met Leu Glu Ala Gly Val Glu Thr Val Asn Asn Thr Ala Val Tyr Met
290 295 300
Leu Leu His Leu Val Arg Glu Arg Asn Val Gln Met Arg Leu Gln Met
305 310 315 320
Glu Ile Asp Glu Val Ile Gly Lys Glu Arg Thr Pro Ser Leu Ser Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Met Val Tyr Thr Glu Ala Val Ile Leu Glu Thr Leu Arg
340 345 350
Ile Ser Ser Ile Ala Pro Val Gly Ile Pro His Met Ala Thr Ala Asp
355 360 365
Thr Gln Leu Gly Gly Tyr Asp Ile Pro Lys Gly Thr Phe Ile Leu Ile
370 375 380
Gly Leu His Asp Leu His Asn Gly Ser His Trp Lys Asn Pro Gln Asp
385 390 395 400
Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Thr Lys Glu Gly Asn Leu Met Gln Asp
405 410 415
Glu Thr Leu Lys Pro Phe Gly Phe Gly Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu
420 425 430
Gly Leu Ala Arg Ser Glu Leu Phe Leu Phe Ile Ala His Ile Met Gln
435 440 445
Lys Phe His Leu Ile Val Pro Asp Gly Asp Pro Leu Pro Thr Ala Asp
450 455 460
Pro Val Gly Gly Ile Thr Leu Ser Ala Lys Pro Phe Lys Ile Gln Phe
465 470 475 480
Leu Pro Arg His Gly Phe
485
<210> 3
<211> 352
<212> DNA
<213> 二化螟(Chilo suppressalisWalker)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(352)
<400> 3
gagacgctca agcccttcgg tttcggaaaa aggcgatgta tcggagaagg attggcaagg 60
tccgagctat tcctgttcat cgctcacata atgcaaaagt tccatctgat agttccggat 120
ggagatcctc tccccacggc ggatcctgtt ggtggcatca cgctttctgc caaaccattc 180
aagatacagt ttctaccaag acacggattt taaccatatt ctttattcag taactaatta 240
agcaatataa ggttataggt atctgtctta tttacttgtt taatgttttg aacaagatat 300
ttagtttcaa tcataaaagc tctgcttagt ttggaactgg ataattgtta gg 352

Claims (4)

1.一种分离的二化螟CYP15C1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种分离的二化螟CYP15C1基因编码的蛋白，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求1所述的基因在二化螟防治中的应用。
4.权利要求1所述的基因在抗二化螟转基因植物中的应用。
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