CN110144360B - 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用 - Google Patents

一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110144360B
CN110144360B CN201910491005.1A CN201910491005A CN110144360B CN 110144360 B CN110144360 B CN 110144360B CN 201910491005 A CN201910491005 A CN 201910491005A CN 110144360 B CN110144360 B CN 110144360B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chilo suppressalis
sdr
gene
dsrna
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201910491005.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110144360A (zh
Inventor
马伟华
孙亚杰
赵景
陈浩
林拥军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201910491005.1A priority Critical patent/CN110144360B/zh
Publication of CN110144360A publication Critical patent/CN110144360A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110144360B publication Critical patent/CN110144360B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用，属于昆虫基因工程技术领域，所述二化螟SDR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明提供的二化螟SDR基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率。在本发明中，所述二化螟SDR基因的dsRNA抑制二化螟SDR基因的表达。

Description

一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩 增的引物对和应用
技术领域
本发明属于昆虫基因工程技术领域，尤其涉及一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用。
背景技术
二化螟Chilo suppressalis(鳞翅目：螟蛾科)是一种重要的多食性农业害虫，主要危害水稻、茭白以及玉米等(周睿琦等，二化螟的水稻种群和茭白种群对杀虫剂和Cry蛋白的敏感性比较[J].中国科技论文,2014,9(09):1075-1079)。近年来，随着水稻种植结构的变更、耕作制度的改革和密植高肥等栽培措施的推广、气候变暖等因素，二化螟在全国范围内的发生数量和危害程度明显上升，给我国的水稻生产造成严重威胁(Srensen JG etal.Massrearing of insects for pest management:Challenges,synergies andadvances from evolutionary physiology[J].Crop Protection,2012,38:87-94,2012；张扬等,二化螟抗药性检测方法比较和抗药性监测[J/OL].南京农业大学学报,2014,37(06):37-43)。目前对于二化螟的防治还是以施用化学杀虫剂为主，由于长期大量使用化学农药带来的环境压力以及抗药性等问题(唐涛,不同类型杀虫剂对水稻二化螟及稻纵卷叶螟的田间防治效果评价[J/OL].植物保护,2016,42(03):222-228)，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施成为了当前的防治热点(Ma et al.,Exploring themidgut transcriptome and brush border membrane vesicle proteome of the ricestemborer,Chilo suppressalis(Walker).PLo S One,2012,7:e38151)。
Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)在昆虫细胞中的主要功能是参与蜕皮激素的合成(Ryusuke Niwa et al.,Non-molting glossy/shroud encodes ashort-chain dehydrogenase/reductase that functions in the‘Black Box’of theecdysteroid biosynthesis pathway.Development,2010,137:1991-1999(2010))。SDR广泛存在于各种生物体中，是功能性很强的酶，在哺乳动物，植物，细菌以及昆虫中都起着不同的作用(Kallberg,Y et al.,Short-chain dehydrogenases/reductases(SDRs)–Coenzyme-based functional assignments in completed genomes,Eur.J.Biochem,2002,269:4409–4417)。目前在昆虫中有过报道的主要膜翅目目(Karina R et al.,Amember of the short-chain dehydrogenase/reductase(SDR)superfamily is a targetofthe ecdysone response inhoneybee(Apis mellifera)castedevelopment.Apidologie,2004,35:37–47)，双翅目(Benach et al.,GenesisofDrosophilaADH:the shaping ofthe enzymatic activity from a SDR ancestor,Chem.Biol.Info,2001,130–132,405–415)，鳞翅目(Ryusuke Niwa et al.,Non-moltingglossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions inthe‘Black Box’of the ecdysteroid biosynthesis pathway.Development,2010,137:1991-1999(2010)；Hajime TAKEUCHI et al.,Regulation of ecdysteroid signalling:molecular cloning,characterization and expression of 3-dehydroecdysone 3a-reductase,a novel eukaryotic member of the short-chain dehydrogenases/reductases superfamily from the cotton leafworm,Spodopteralittoralis.Biochem.J,2000,349:239-245)。
目前，对于昆虫中Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)的研究主要集中在其分子机理和作用上，对于SDR的应用方面的研究较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用，本发明提供的二化螟SDR基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种二化螟SDR基因，所述二化螟SDR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的二化螟SDR基因编码的蛋白，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的二化螟SDR基因的缺失在提高二化螟死亡率中的应用。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的二化螟SDR基因的dsRNA，所述dsRNA具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的dsRTNA在抑制二化螟SDR基因的表达中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的dsRNA在制备转基因抗二化螟植物中的应用。
优选的，所述应用包括：将所述dsRNA导入植物表达载体中，再导入植物中，得到转基因抗二化螟植物。
本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述的dsRNA的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
所述下游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用，所述二化螟SDR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明提供的二化螟SDR基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率。在本发明中，所述二化螟SDR基因的dsRNA抑制二化螟SDR基因的表达。
本发明的有益效果为：
(1)本发明首次发现Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因参与了二化螟的生长发育过程，Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)表达的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率，最终抑制种群的发展。
(2)本发明提供了一种二化螟Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的干扰序列(dsRNA)，该序列可显著抑制Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的表达，可利用该序列干扰Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的表达，抑制二化螟的生长，最终控制其种群的发展。可用于开发绿色环保的抗虫植物，最终达到绿色防治害虫的目的。
(3)利用基因工程技术，可以将干扰序列导入植物表达的载体，然后导入植物细胞或植物中，可以获得抗虫的转基因细胞和转基因植株。
附图说明
图1为Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因功能验证流程图；
图2为pEASY-T1克隆载体结构示意图；
图3为Pet-2P表达载体结构示意图；
图4为饲喂SDR基因的dsRNA后，二化螟SDR基因的沉默效率，其中“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001，图中英文缩写含义：“SDR”表示饲喂SDR基因dsRNA的处理组；“EGFP”表示饲喂EGFP基因dsRNA的对照组；“H2O”表示饲喂ddH2O的对照组；
图5为饲喂SDR基因的dsRNA对二化螟幼虫死亡率的影响；其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，图中英文缩写含义：“SDR”表示饲喂SDR基因dsRNA的处理组；“EGFP”表示饲喂EGFP基因dsRNA的对照组；“H2O”表示饲喂ddH2O的对照组。
具体实施方式
本发明提供了一种二化螟SDR基因，所述二化螟SDR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：
atgaaaacaattctaattactggtgctaatagaggcttgggtctgggaatggttaagtatctaaccagacagggcagagccgaaaaaatcattgctacatgccgaaaaccttcagaggaactagaaaaaattgctcaagaatcaaacaaactacaaatagtacatttagatgtcacagatttggctagttacggtgacgtgacaactaaaattgccaacgcagtaggcagctccggtctcaatttactcattaacaacgctggaatcgcaacaaaattcactaaactcaatttggtgaaagctgagcagctgctagaaaacctcacagtcaacaccgtcgcaccgataatgctaaccaagtcgatgctgccgctgctgaagcaagccgcggaggcgaacagcagctcgccggtgggcgcagcgcgcgccgccgtcatcaacatgagctccgtgctcggctccatcgcgcagaacgaccagggtggcttctacccctacaggtgttctaaggccgcattgaacgcagcgaccaaatcaatgagcatagacctgaagaaggagcacatactggtggcgtcgatacaccccggctgggttcgcaccgacatgggcggcaagggcgcgccgctcgacgtggtcaccagcgtcgagagcatattcgaaaccatagagaagctgggcgaggcagattcgggcaagttcctgcagtacgacggcgctgagctaccgtggtga。
在本发明中，所述二化螟SDR基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的表达缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率，最终抑制二化螟种群的发展。
本发明还提供了上述技术方案所述的二化螟SDR基因编码的蛋白，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：
MKTILITGANRGLGLGMVKYLTRQGRAEKIIATCRKPSEELEKIAQESNKLQIVHLDVTDLASYGDVTTKIANAVGSSGLNLLINNAGIATKFTKLNLVKAEQLLENLTVNTVAPIMLTKSMLPLLKQAAEANSSSPVGAARAAVINMSSVLGSIAQNDQGGFYPYRCSKAALNAATKSMSIDLKKEHILVASIHPGWVRTDMGGKGAPLDVVTSVESIFETIEKLGEADSGKFLQYDGAELPW。
在本发明中，所述二化螟SDR基因编码的蛋白的分子质量为59.756KD，等电点为5.10。
本发明还提供了上述技术方案所述二化螟SDR基因的缺失在提高二化螟死亡率中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的二化螟SDR基因的dsRNA，所述dsRNA具有SEQID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
ccgataatgctaaccaagtcgatgctgccgctgctgaagcaagccgcggaggcgaacagcagctcgccggtgggcgcagcgcgcgccgccgtcatcaacatgagctccgtgctcggctccatcgcgcagaacgaccagggtggcttctacccctacaggtgttctaaggccgcattgaacgcagcgaccaaatcaatgagcatagacctgaagaaggagcacatactggtggcgtcgatacaccccggctgggttcgcaccgacatgggcggcaagggcgcgccgctcgacgtggtcaccagcgtcgagagcatattcgaaaccatagagaagctgggcgaggcagattcgggcaagttcctgcagtacgacggc。
本发明还提供了上述技术方案所述的dsRNA在抑制二化螟SDR基因的表达中的应用。在本发明中，所述dsRNA片段能够抑制二化螟SDR基因的表达。
本发明还提供了上述技术方案所述的dsRNA在制备转基因抗二化螟植物中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：将所述dsRNA导入植物表达载体中，再导入植物中，得到转基因抗二化螟植物。本发明对所述植物表达载体没有特殊限定，采用常规即可。本发明对所述将dsRNA导入植物表达载体的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述植物的品种没有特殊限定，采用常规植物即可，如水稻。本发明对所述植物表达载体导入植物的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述的dsRNA的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
TGGAATTCCCGATAATGCTAACCAAGTCGATG；
所述下游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
TGAATTCGCCGTCGTACTGCAGGAA
本发明优选用http://sidirect2.rnai.jp/在线预测siRNA位点，根据siRNA位点用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝ BlastHome在线合成扩增dsRNA的引物。
本发明还提供了上述技术方案所述的dsRNA编码蛋白在制备防治二化螟的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用常规剂型即可。本发明对所述药物的使用方法和使用剂量没有特殊限定，采用常规即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
二化螟Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的克隆与分析
1.二化螟总RNA的提取：称取20mg的二化螟样品置于1.5ml无酶管中，利用一次性无酶研磨棒及液氮充分研磨后，使用Promega公司的SV total RNAisolation system提取试剂盒提取总RNA，详细步骤参照该试剂盒说明书。
2.cDNA的合成：使用宝生物工程大连有限公司的PrimeScriptTM RT MasterMix反转录试剂盒将上述1中提取的总RNA合成cDNA模板(详细步骤参照该试剂盒说明书)。
3.引物设计：利用转录组测序得到Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因核酸序列(见SEQ ID NO：1)，设计引物验证预测的开放阅读框。设计并合成如下引物：
上游引物序列SDR-F(SEQ ID No.6)：
5'-ATGAAAACAATTCTAATTACTGGTGCTA-3'；
下游引物序列SDR-R(SEQ ID No.7)：
5'-TCACCACGGTAGCTCAGCG-3'。
以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.PCR扩增：利用上述引物SDR-F和SDR-R进行PCR扩增，PCR体系参照宝生物工程大连有限公司的Ex Taq酶使用说明书。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen公司的的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。
5.PCR产物的克隆：利用TransGen公司的的pEASY-T1Simple Cloning Kit，按照说明书将PCR产物连接到pEASY-T1载体(见图2)上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆子送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。
序列分析：利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)将测序所得的HeatShockProteins(HSPs)基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列比对验证其正确性，结果显示，测序结果一致。利用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(见SEQ ID No.2)，结果显示，SDR-R基因开放阅读框架全长735bp，编码244个氨基酸残基，预测分子质量为59.756KD，理论等电点为5.10。本发明进一步将其与其它昆虫的Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)氨基酸序列进行比对，确认本发明分离的蛋白具有典型的Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)蛋白特征。
实施例2
dsRNA合成
1.dsRNA模板的制备：
根据实施例1中所获得的Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因序列，通过siDirect version 2.0预测dsRNA区域，并利用NCBI Primer-BLAST
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝ BlastHome)设计特异性扩增引物(5'-端加上适当的酶切位点)，用于HeatShock Proteins(HSPs)基因的dsRNA片段(SEQ ID No.3)的扩增，设计的特异性引物如下：
上游引物序列ds SDR-F(SEQ ID No.4)：
TGGAATTCCCGATAATGCTAACCAAGTCGATG
下游引物序列ds SDR-R(SEQ ID No.5)：
TGGAATTCGCCGTCGTACTGCAGGAA。
注：划线部分系列为EcoRI酶切位点
利用上述引物ds SDR-F和ds SDR-R进行PCR扩增，PCR反应体系参照宝生物工程大连有限公司的ExTaq酶使用说明书。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。最后通过TA克隆将其连接到pEASY-T1载体(见图2)上。
2.表达载体构建
1)利用AxyGen的AxyPrep PlasmidMiniprep kit试剂盒提取含有目的片段的质粒并酶切。
酶切，试剂按照表1体系配制：
表1酶切体系
Figure BDA0002087006490000081
37℃反应30min，85℃反应5s以终止反应。1.2％琼脂糖凝胶电泳切下目的片段并回收。
2)酶切的目的片段与pET-2P载体的连接反应体系按照表2顺序配制：
表2连接体系
Figure BDA0002087006490000082
Figure BDA0002087006490000091
重组载体转化入感受态细胞HT115的过程：将HT115从-80℃超低温冰箱中取出至于冰上融化5min，然后将连接产物用移液枪加入到HT115感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰上放置30min，然后于42℃水浴热激45s，再于冰上复苏2-3min，加入已灭菌的LB液体培养基至1ml，然后于37℃、150rpm摇床培养1h。取200μl菌液均匀涂布在卡那霉素抗性的LB培养基平板上，37℃倒置过夜培养。隔天挑取圆润饱满的单菌落，在卡那霉素抗性的LB液体培养基中扩大培养，将新鲜菌液于-80℃保存在30％已灭菌的甘油中，备用。
实施例3
饲喂Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的dsRNA后基因的沉默效率及其对二化螟生长发育的影响。
取100ml大肠杆菌中表达好的菌液，5000rpm离心5min，弃上清，用5ml(20:1)ddH2O悬浮菌液沉淀，4℃冰箱保存待用或直接用于饲喂实验。
1)提前两天用脱脂棉加水浸泡水稻种子MH63，饲喂实验时种子发芽。
2)用浓缩后的菌液均匀涂抹水稻种子，将三粒MH63水稻种子置于U形管中并保持环境湿润，取30头二化螟初孵幼虫接种于每个U形管中，饲喂二化螟幼虫72h。每个饲喂实验设置5个重复，分别用ddH2O、dsRNA(GFP、HSPs)饲喂。
3)饲喂72h后，取一部分干扰的幼虫收集作为定量样品来检测干扰效率，每个处理3个重复，每个重复15头幼虫。
4)7天后统计虫子的死亡率，并记录实验结果。
试验结果及分析：
(1)饲喂Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的dsRNA后该基因的沉默效率
qRT-PCR检测结果显示：与对照组相比，饲喂Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的dsRNA显著抑制了Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)在二化螟体内(见图4)的表达。由此可见，该二化螟Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的干扰序列可显著抑制Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因的表达。
(2)饲喂Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因dsRNA对二化螟死亡率的影响
在实验室内，申请人观察饲喂处理7天后二化螟生长情况，统计了死亡率和，结果显示，与对照组相比，饲喂Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)基因dsRNA处理组的二化螟死亡率提高了38.88％(见图5)。因此本发明提供的RNA干扰序列可应用于转基因抗二化螟植物的开发如转基因抗二化螟的水稻。进一步开发其蛋白可应用于二化螟的生物防治。
由以上实施例可以得出，本发明提供的二化螟SDR基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率。在本发明中，所述二化螟SDR基因的dsRNA抑制二化螟SDR基因的表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaacaa ttctaattac tggtgctaat agaggcttgg gtctgggaat ggttaagtat 60
ctaaccagac agggcagagc cgaaaaaatc attgctacat gccgaaaacc ttcagaggaa 120
ctagaaaaaa ttgctcaaga atcaaacaaa ctacaaatag tacatttaga tgtcacagat 180
ttggctagtt acggtgacgt gacaactaaa attgccaacg cagtaggcag ctccggtctc 240
aatttactca ttaacaacgc tggaatcgca acaaaattca ctaaactcaa tttggtgaaa 300
gctgagcagc tgctagaaaa cctcacagtc aacaccgtcg caccgataat gctaaccaag 360
tcgatgctgc cgctgctgaa gcaagccgcg gaggcgaaca gcagctcgcc ggtgggcgca 420
gcgcgcgccg ccgtcatcaa catgagctcc gtgctcggct ccatcgcgca gaacgaccag 480
ggtggcttct acccctacag gtgttctaag gccgcattga acgcagcgac caaatcaatg 540
agcatagacc tgaagaagga gcacatactg gtggcgtcga tacaccccgg ctgggttcgc 600
accgacatgg gcggcaaggg cgcgccgctc gacgtggtca ccagcgtcga gagcatattc 660
gaaaccatag agaagctggg cgaggcagat tcgggcaagt tcctgcagta cgacggcgct 720
gagctaccgt ggtga 735
<210> 2
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Thr Ile Leu Ile Thr Gly Ala Asn Arg Gly Leu Gly Leu Gly
1 5 10 15
Met Val Lys Tyr Leu Thr Arg Gln Gly Arg Ala Glu Lys Ile Ile Ala
20 25 30
Thr Cys Arg Lys Pro Ser Glu Glu Leu Glu Lys Ile Ala Gln Glu Ser
35 40 45
Asn Lys Leu Gln Ile Val His Leu Asp Val Thr Asp Leu Ala Ser Tyr
50 55 60
Gly Asp Val Thr Thr Lys Ile Ala Asn Ala Val Gly Ser Ser Gly Leu
65 70 75 80
Asn Leu Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Ala Thr Lys Phe Thr Lys Leu
85 90 95
Asn Leu Val Lys Ala Glu Gln Leu Leu Glu Asn Leu Thr Val Asn Thr
100 105 110
Val Ala Pro Ile Met Leu Thr Lys Ser Met Leu Pro Leu Leu Lys Gln
115 120 125
Ala Ala Glu Ala Asn Ser Ser Ser Pro Val Gly Ala Ala Arg Ala Ala
130 135 140
Val Ile Asn Met Ser Ser Val Leu Gly Ser Ile Ala Gln Asn Asp Gln
145 150 155 160
Gly Gly Phe Tyr Pro Tyr Arg Cys Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ala Ala
165 170 175
Thr Lys Ser Met Ser Ile Asp Leu Lys Lys Glu His Ile Leu Val Ala
180 185 190
Ser Ile His Pro Gly Trp Val Arg Thr Asp Met Gly Gly Lys Gly Ala
195 200 205
Pro Leu Asp Val Val Thr Ser Val Glu Ser Ile Phe Glu Thr Ile Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Glu Ala Asp Ser Gly Lys Phe Leu Gln Tyr Asp Gly Ala
225 230 235 240
Glu Leu Pro Trp
<210> 3
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgataatgc taaccaagtc gatgctgccg ctgctgaagc aagccgcgga ggcgaacagc 60
agctcgccgg tgggcgcagc gcgcgccgcc gtcatcaaca tgagctccgt gctcggctcc 120
atcgcgcaga acgaccaggg tggcttctac ccctacaggt gttctaaggc cgcattgaac 180
gcagcgacca aatcaatgag catagacctg aagaaggagc acatactggt ggcgtcgata 240
caccccggct gggttcgcac cgacatgggc ggcaagggcg cgccgctcga cgtggtcacc 300
agcgtcgaga gcatattcga aaccatagag aagctgggcg aggcagattc gggcaagttc 360
ctgcagtacg acggc 375
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggaattccc gataatgcta accaagtcga tg 32
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaattcgcc gtcgtactgc aggaa 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaaaacaa ttctaattac tggtgcta 28
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcaccacggt agctcagcg 19

Claims (2)

1.一种二化螟SDR基因的dsRNA在制备转基因抗二化螟植物中的应用；
所述二化螟SDR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述dsRNA的靶序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述dsRNA导入植物表达载体中，再导入植物中，得到转基因抗二化螟植物。
CN201910491005.1A 2019-06-06 2019-06-06 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用 Expired - Fee Related CN110144360B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910491005.1A CN110144360B (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910491005.1A CN110144360B (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110144360A CN110144360A (zh) 2019-08-20
CN110144360B true CN110144360B (zh) 2021-03-16

Family

ID=67590596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910491005.1A Expired - Fee Related CN110144360B (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110144360B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564702B (zh) * 2019-08-07 2021-07-16 华中农业大学 二化螟生长发育相关蛋白ND及其编码基因、dsRNA干扰序列和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104673827A (zh) * 2013-12-02 2015-06-03 华中农业大学 二化螟内源小rna在水稻抗虫改良中的应用
CN105753951A (zh) * 2016-05-18 2016-07-13 中国农业科学院生物技术研究所 一种Bt抗虫基因及其编码的蛋白质和应用
CN108064133A (zh) * 2014-05-04 2018-05-22 佛利斯特创新有限公司 用于蚊虫控制的组合物和所述组合物的用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2537844A1 (en) * 2003-09-05 2005-03-17 Cellzome Ag Treatment of neurodegenerative diseases
EP2574234A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-03 Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. Quartet breeding

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104673827A (zh) * 2013-12-02 2015-06-03 华中农业大学 二化螟内源小rna在水稻抗虫改良中的应用
CN108064133A (zh) * 2014-05-04 2018-05-22 佛利斯特创新有限公司 用于蚊虫控制的组合物和所述组合物的用途
CN105753951A (zh) * 2016-05-18 2016-07-13 中国农业科学院生物技术研究所 一种Bt抗虫基因及其编码的蛋白质和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chilo suppressalis isolate HZU2018 scaffold2.len10331172, whole genome shotgun sequence;Lin,Y.;《Genbank database》;20190108;accession NO: RSAL01000002.1 *
Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the ‘Black Box’ of the ecdysteroid biosynthesis pathway;Ryusuke Niwa等;《Development》;20101231;第137卷(第12期);第1991页摘要，第1995页右栏最后1段-1996页右栏第1段 *
PREDICTED: Amyelois transitella C-factor (LOC106141099), transcript variant X2, mRNA;NCBI;《Genbank database》;20150806;accession NO:XM_013342753.1 *
PREDICTED: C-factor isoform X2 [Amyelois transitella];NCBI;《Genbank database》;20150806;accession NO: XP_013198207.1 *
Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR):the 2002 update;Udo Oppermann等;《Chemico-Biological Interactions》;20030219;第143-144卷;第248页右栏第1段-249页左栏第1段，表2 *
利用dsRNA体外饲喂和转基因水稻饲喂抑制褐飞虱相关基因的研究;陆琳等;《农业生物技术学报》;20130925;第21卷(第9期);1028-1036 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110144360A (zh) 2019-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110923251B (zh) 烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用
CN111235165B (zh) 一种百合的易感真菌基因LrWRKY-S1及其应用
CN110468137B (zh) 一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用
CN114574518B (zh) 一种促进豆科作物结瘤尤其是耐盐结瘤的方法
CN110551730B (zh) 茄二十八星瓢虫rps18基因及其在防虫害中的应用
CN109825501B (zh) 一种来源于拟南芥的长链非编码rna t5120及其用途
CN110616223A (zh) 一种防治茄二十八星瓢虫的靶基因及其应用
CN110144360B (zh) 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用
CN110592100B (zh) 一种木薯camta基因及其抑制表达载体的构建和抗病应用
CN113337536A (zh) Rs2z32基因作为植物免疫负调控因子在提高作物抗性中的应用
CN103602705A (zh) 利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法
CN108610405B (zh) 蛋白质TaNRT2.5在调控植物根系发育中的应用
CN110564702B (zh) 二化螟生长发育相关蛋白ND及其编码基因、dsRNA干扰序列和应用
CN109112117B (zh) 一种分离的二化螟cyp15c1基因及其编码蛋白
CN112195178B (zh) 番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法
CN110791503B (zh) 一种低磷诱导型启动子及其应用
CN112852862B (zh) 拟南芥小肽信号分子rgf7基因的应用
CN110511936B (zh) 茄二十八星瓢虫生长发育相关基因chs1及其应用
CN114181956A (zh) 小麦条锈病抗性相关代谢物及其合成相关基因与应用
CN108949769B (zh) 一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用
CN111500595A (zh) 一种木麻黄基因CeDREB1及其应用
CN116751769B (zh) 咖啡短体线虫Pc-CL蛋白、编码基因及其应用
CN109112132A (zh) 一种分离的二化螟HSPs基因及其编码的蛋白
CN110184279A (zh) 甜菊中一个新的促进分枝发育基因SrDREB2A及其表达载体和应用
CN110563828B (zh) 二化螟雄性特异性致死相关蛋白MSL3及其编码基因、dsRNA干扰序列和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210316