CN114908107A

CN114908107A - 花生AhABI5-like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN114908107A
Application number: CN202210692211.0A
Authority: CN
Inventors: 隋炯明; 相杰; 林顺钰; 马涛; 禹山林; 王晶珊; 赵春梅; 乔利仙; 杨庆利; 朱虹; 唐艳艳; 武秀玲
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2042-06-17
Also published as: CN114908107B

Abstract

本发明公开了花生AhABI5‑like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用，属于基因工程技术领域。本发明中用于提高植物含油量和/或耐盐性的花生AhABI5‑like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。将该基因构建植物表达载体，转化花生后，能够显著提高花生籽仁的含油量，相对于野生型，至少提高含油量4.2个百分点；还可显著提高其耐盐性，至少耐受300mM NaCl，在提高植物含油量和/或耐盐性领域具有较好的应用前景。

Description

花生AhABI5-like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种花生AhABI5-like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用。

背景技术

盐害是农业生产上最严重的逆境危害之一，农作物长期遭受盐害会引起植株生长缓慢、甚至死亡，还会导致产量和品质严重下降。随着全球气温的逐步升高，盐害将长期威胁着农作物生产及安全。研究表明，现有农作物品种在长期遭受盐害后会比正常情况下减产30％以上。由于常规育种技术效率低、周期长，短期内难以选育耐盐高产品种，因此挖掘耐盐相关基因，建立耐盐分子标记辅助育种技术，培育耐盐新品种是有效利用盐渍化土壤的重要途径。

花生是世界范围内广泛种植的油料和经济作物，在农业生产中具有重要地位。花生还是食用植物油的主要来源，提高含油量已成为花生品质育种最重要的目标之一。近20年来推广种植的全国主要花生品种的平均含油量仅为51.4％，北方主产区种植的一些大花生品种含油量还不到50％，且我国花生约50％作为榨油用，含油率每提高1个百分点，花生油加工企业可增加纯收入7％。

因此，挖掘花生耐盐和油脂合成相关基因，创制耐盐、高油新材料，进而培育耐盐、高油新品种，有望充分利用广阔的盐渍地，而又不与粮食作物争地。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生AhABI5-like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

花生AhABI5-like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用，所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种用于提高植物含油量和/或耐盐性的重组载体、重组菌、表达盒、转基因细胞系，含有花生AhABI5-like基因的编码区序列，所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQID NO:1所示。

一种提高植物含油量的方法，将花生AhABI5-like基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物含油量；所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个具体的实施例中，所述植物为花生。

在一个具体的实施例中，所述提高植物含油量为相对于野生型至少提高含油量4.2个百分点。

一种提高植物耐盐性的方法，将花生AhABI5-like基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物含油量和/或耐盐性；所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个具体的实施例中，所述植物为花生。

在一个具体的实施例中，所述提高植物耐盐性为至少耐受300mM NaCl。

本发明技术方案的优点

1、本发明从花生中克隆了AhABI5-like基因；将AhABI5-like基因在花生中超量表达，可显著提高其含油量。转基因花生籽仁比非转基因籽仁的含油量最高可提高5个百分点。

2、本发明将AhABI5-like基因在花生中超量表达，还可显著提高其耐盐性。用300mM NaCl的胁迫处理后，转基因花生的耐盐性明显强于非转基因植株。

附图说明

图1为250mM NaCl胁迫处理后花生AhABI5-like基因在不同时间段的相对表达量；

图2为超量表达AhABI5-like的转基因花生(OE)和非转基因对照(WT)籽仁的含油量；

图3为盐胁迫处理后转基因花生(OE-1、OE-2)和非转基因对照(WT)植株的生长情况；

图4为盐胁迫处理后转基因花生(OE-1、OE-2)和非转基因对照(WT)的相对电导率和相对含水量；

图5为盐胁迫处理后转基因花生(OE-1、OE-2)和非转基因对照(WT)叶片的NBT和DAB染色情况；

图6为盐胁迫处理后转基因花生(OE-1、OE-2)和非转基因对照的(WT)H₂O₂、O₂ ^-积累和MDA含量。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所采用的的实验材料的来源如下：

大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存；

根癌农杆菌菌株GV3101(购自北京天恩泽基因科技有限公司)；

根癌农杆菌菌株EHA105(购自北京天恩泽基因科技有限公司)；

拟南芥哥伦比亚野生型品种(青岛农业大学遗传研究室实验室提供)；

转基因的花生受体材料为花育23(青岛农业大学花生分子育种实验室提供)。

实施例1花生AhABI5-like基因的克隆及表达分析

1、花生AhABI5-like基因的克隆

提取宇花9号材料(由青岛农业大学选育的高油花生品种)的RNA，并将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，以如下引物对克隆花生AhABI5-like基因，获得其基因cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，编码产生的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

扩增引物序列如下：

P1：5′-ATACTATGGGGTCTCAAGGTGGTG-3′(SEQ ID NO:3)；

P2：5′-GATGTCAGAACGAGGCAGATGAT-3′(SEQ ID NO:4)；

2、盐胁迫对花生AhABI5-like基因表达的影响

a、用250mM NaCl处理‘宇花9号’的幼苗，在不同时间段(处理后的0h、6h、12h、24h和48h)取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNase I处理，并进行纯化。

b、样品在ABI 7500FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。

20μL反应体系包括：10μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，20μmol/L正反向引物各0.25μL，20ng反转录产物。

扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。

c、AhABI5-like基因定量PCR的引物为：

正向引物序列：5'-TCCCTCCACAAGGTCCAATGA-3'(SEQ ID NO:5)；

反向引物序列：5'-TGTGCAATGGCTGTGCTATGT-3'(SEQ ID NO:6)。

以花生Actin基因为内标，内标基因的引物为：

正向引物序列：5'-GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3'(SEQ ID NO:7)；

反向引物序列：5'-ATGGATGGCTGGAAGAGAACT 3'(SEQ ID NO:8)。

测得AhABI5-like基因在盐胁迫处理前后表达量变化情况，结果如图1所示，由图1可知，AhABI5-like基因在盐胁迫处理后表达量明显发生变化，表明其受盐胁迫诱导。

实施例2AhABI5-like基因植物表达载体的构建

(1)以宇花9号的cDNA为模板，克隆AhABI5-like基因的编码区，并分别在上下游引物上引入KpnI和SacI酶切位点；所采用的的引物序列为：

正向引物：5′-GGTACCATACTATGGGGTCTCAAGGTGGTG-3′(SEQ ID NO:9)；

反向引物：5′-GAGCTCGATGTCAGAACGAGGCAGATGAT-3′(SEQ ID NO:10)；

(2)回收PCR产物，并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-T(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含AhABI5-like基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI121-AhABI5-like。

实施例3AhABI5-like基因在提高植物含油量中的应用

一种提高花生含油量的方法，步骤如下：

将实施例2制备的植物表达载体pBI121-AhABI5-like转化花生，包括以下步骤：

a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pBI121-AhABI5-like重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mL YEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培养基中，培养到OD600＝0.6。将菌液于5000rpm离心10min后，用相同体积的液体MSB5悬浮备用。

b、花生外植体的分离：选取饱满的花生种子(花育23号)，在70％酒精中浸泡1min，0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗3-5次，将每片子叶纵向切成2半。

c、农杆菌介导的遗传转化：切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染10min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3d。转移到添加250mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。

将形成丛生芽的外植体转移外到250mg/L头孢霉素、100mg/L卡那霉素的SEM培养基上筛选抗性芽，培养2w，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。

培养2w后，切下不定芽部分转移到250mg/L头孢霉素、150mg/L卡那霉素的SEM培养基上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培养4w左右，期间继代培养2-3次。

d、转基因植株的PCR检测

提取再生植株的基因组DNA，利用上述载体序列和AhABI5-like基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，58℃、50s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min。

e、转基因阳性植株的嫁接移栽

以15d左右苗龄的无菌实生苗为砧木，切除距子叶节约2cm以上的主茎部分，用手术刀将砧木上端垂直劈开，切口深约1cm。当转基因植株幼苗长到约3cm时，从芽丛基部切下再生小苗做接穗，下端切成长约1cm的V形伤口，切口平整。将接穗插入砧木中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，然后用封口膜缠绕接口，松紧适度。将嫁接苗置于MSB5培养基中无菌培养3-4d；然后移栽于灭菌的育苗基质中进行驯化2w，之后移栽到基质土中，至收获荚果。

f、转基因花生籽仁含油量的测定

参照油料种子含油量测定(残余法)(NY/T 1285-2007)进行花生籽仁含油量测定。称取T₃代转基因花生籽仁和非转基因籽仁10g以上样品，将其放入烘箱中100±2℃烘干约2h，利用组织破碎机将花生籽仁破碎至均匀粉状。称取花生样品1.5g以上放入烘干的滤纸筒中，将滤纸筒与样品放入105℃士2℃烘箱中干燥3h，然后放入干燥器中冷却至室温。将滤纸筒放入萃取剂中浸泡过夜，取出后对样品抽提8h。称重计算得出含油量，每份样品重复测定3次。结果表明与非转基因花生籽仁的含油量(53.4％)相比，6个转基因株系的花生籽仁含量分别达到58.4％、58.0％、57.8％、57.9％、57.6％、57.8％，含油量可提高4.2-5.0个百分点(图2)。

实施例4AhABI5-like基因在提高植物耐盐性中的应用

一种提高花生耐盐性的方法，步骤如下：

将实施例2制备的植物表达载体pBI121-AhABI5-like转化花生(花育23号)，具体步骤如实施例3中a-e所述。最终获得转基因花生幼苗，即过表达植株。

用200mM NaCl溶液浇灌生长2w的花生幼苗，3d后用300mM NaCl溶液浇灌幼苗15d，观察过表达植株及非转基因对照的表型变化。结果表明经NaCl处理之后，过表达AhABI5-like基因(OE)的植株(OE-1和OE-2)表现出较强的耐盐性，非转基因花生植株(WT)萎蔫严重(图3)。与非转基因对照相比，2个过表达株系(OE-1和OE-2)的相对电导率分别减少30.12％和33.73％；相对含水量分别增加33.32％和28.38％(图4)。

为了检测盐胁迫处理后转基因阳性植株和非转基因对照叶片的活性氧积累情况，利用NBT和DAB对其测定进行染色(图5)，其中，图5中NBT染色结果中，叶片蓝色部分越多，说明了O₂ ^-积累量越多；转基因植株(OE-1和OE-2)比非转基因对照(WT)叶片的蓝色部分少，说明了O₂ ^-积累量少。DAB染色结果中，叶片棕色部分越多，明了H₂O₂积累量越多；转基因植株(OE-1和OE-2)比非转基因对照(WT)叶片的棕色部分少，说明了H₂O₂积累量少。进一步测定转基因阳性植株和非转基因对照叶片的H₂O₂和O₂ ^-积累量和MDA含量，结果表明与非转基因对照相比，2个过表达株系(OE-1和OE-2)的O₂ ^-积累量分别减少26.32％、21.05％；H₂O₂积累量分别减少33.97％、35.59％；MDA含量分别减少43.18％、54.55％(图6)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 花生AhABI5-like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> 花生(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 1

atactatggg gtctcaaggt ggtggtgaaa gtaatggtaa acatgcacag cttcagcctt 60

tggcacggca aaactcaatg tacagtctta cgctcgatga ggttcagaat caattaggtg 120

acttaggaaa acccctagct agtatgaacc ttgatgagct tctaaaaaat gtatggactg 180

ctgaggccaa ccagtctata ggtatggaaa ttgaccgcac aacacaagct aatcaagctg 240

cgctgcagca tcaagctagt ctatcgataa ctagtgcgct tggcaagaag acagttgatg 300

aggtatggag agatatccag caacataaag ataacaacga gaagaagcct cgagacagac 360

aagctacatt gggagagatg accttggagg ctttcttggc gaaagcaggg gtcgggattg 420

tccctgaagc atcgggtaat actaaaagtg ctggtccttt agctgttgct gattctaatt 480

taacagcacc accattccct ccacaaggtc caatgatgca atatgcacaa ccacagtatc 540

agcatcctca gcaaagttta atggggatgt atatggctgg ccagaacata gcacagccat 600

tgcacatggg ggctggtgct gctttggatg ttccatatgc tgatggtcag gtggcaatgc 660

cttcaccttt gatgggaagc ttgtccgata cgaagataca tgggaggaaa aggggcacac 720

cggaggacat attggagaag acggtggaaa ggaggcagaa gaggatgatc aagaatcggg 780

aatctgctgc ccgatctaga gcaaggaagc aggcttacac aacggaatta gagaataagg 840

tgtcgcgcct ggaagaggaa aatgaaaagc tgaggaaacg gaaggaacta gagaacctgt 900

tgtctagtgc acccccacca ccccaacctc gatatcagat tcgccgaaca tcatctgcct 960

cgttctgaca tc 972

<210> 2

<211> 320

<212> PRT

<213> 花生(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 2

Met Gly Ser Gln Gly Gly Gly Glu Ser Asn Gly Lys His Ala Gln Leu

1 5 10 15

Gln Pro Leu Ala Arg Gln Asn Ser Met Tyr Ser Leu Thr Leu Asp Glu

20 25 30

Val Gln Asn Gln Leu Gly Asp Leu Gly Lys Pro Leu Ala Ser Met Asn

35 40 45

Leu Asp Glu Leu Leu Lys Asn Val Trp Thr Ala Glu Ala Asn Gln Ser

50 55 60

Ile Gly Met Glu Ile Asp Arg Thr Thr Gln Ala Asn Gln Ala Ala Leu

65 70 75 80

Gln His Gln Ala Ser Leu Ser Ile Thr Ser Ala Leu Gly Lys Lys Thr

85 90 95

Val Asp Glu Val Trp Arg Asp Ile Gln Gln His Lys Asp Asn Asn Glu

100 105 110

Lys Lys Pro Arg Asp Arg Gln Ala Thr Leu Gly Glu Met Thr Leu Glu

115 120 125

Ala Phe Leu Ala Lys Ala Gly Val Gly Ile Val Pro Glu Ala Ser Gly

130 135 140

Asn Thr Lys Ser Ala Gly Pro Leu Ala Val Ala Asp Ser Asn Leu Thr

145 150 155 160

Ala Pro Pro Phe Pro Pro Gln Gly Pro Met Met Gln Tyr Ala Gln Pro

165 170 175

Gln Tyr Gln His Pro Gln Gln Ser Leu Met Gly Met Tyr Met Ala Gly

180 185 190

Gln Asn Ile Ala Gln Pro Leu His Met Gly Ala Gly Ala Ala Leu Asp

195 200 205

Val Pro Tyr Ala Asp Gly Gln Val Ala Met Pro Ser Pro Leu Met Gly

210 215 220

Ser Leu Ser Asp Thr Lys Ile His Gly Arg Lys Arg Gly Thr Pro Glu

225 230 235 240

Asp Ile Leu Glu Lys Thr Val Glu Arg Arg Gln Lys Arg Met Ile Lys

245 250 255

Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr

260 265 270

Thr Glu Leu Glu Asn Lys Val Ser Arg Leu Glu Glu Glu Asn Glu Lys

275 280 285

Leu Arg Lys Arg Lys Glu Leu Glu Asn Leu Leu Ser Ser Ala Pro Pro

290 295 300

Pro Pro Gln Pro Arg Tyr Gln Ile Arg Arg Thr Ser Ser Ala Ser Phe

305 310 315 320

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atactatggg gtctcaaggt ggtg 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgtcagaa cgaggcagat gat 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccctccaca aggtccaatg a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgcaatgg ctgtgctatg t 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtggccgtac aactggtatc gt 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggatggct ggaagagaac t 21

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtaccatac tatggggtct caaggtggtg 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagctcgatg tcagaacgag gcagatgat 29

Claims

1.花生AhABI5-like基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用，其特征在于，所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种用于提高植物含油量和/或耐盐性的重组载体、重组菌、表达盒、转基因细胞系，其特征在于，含有花生AhABI5-like基因的编码区序列，所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种提高植物含油量的方法，其特征在于，将花生AhABI5-like基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物含油量；所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述提高植物含油量的方法，其特征在于，所述植物为花生。

5.根据权利要求4所述提高植物含油量的方法，其特征在于，所述提高植物含油量为相对于野生型至少提高含油量4.2个百分点。

6.一种提高植物耐盐性的方法，其特征在于，将花生AhABI5-like基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物含油量和/或耐盐性；所述花生AhABI5-like基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求6所述提高植物耐盐性的方法，其特征在于，所述植物为花生。

8.根据权利要求7所述提高植物耐盐性的方法，其特征在于，所述提高植物耐盐性为至少耐受300mM NaCl。