CN104845980B - 一种膜结合NAC转录因子HbNTL2及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种膜结合NAC转录因子HbNTL2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种膜结合NAC转录因子HbNTL2，由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码而成。本发明运用从巴西橡胶树中分离得到新的膜结合NAC转录因子HbNTL2，对NAC转录因子尤其是膜结合转录因子在巴西橡胶树中的功能的进一步研究具有重要意义，且试验证实HbNTL2在叶中的表达量高于其他部位，受割胶、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)处理以及低温胁迫调控，可提高转基因酵母细胞对低温和干旱胁迫的耐受力，可用于在植物的抗逆基因工程改良，应用前景广阔。

Description

一种膜结合NAC转录因子HbNTL2及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种膜结合NAC转录因子HbNTL2及其编码基因。

背景技术

NAC转录因子是植物特有的基因家族，来源于最初报道的三个具有相似保守DNA-结合域的基因的首字母，即NAM(no apical meristem)，ATAF1/2(Arabidopsistranscription activation factor)和CUC2(cup-shaped cotyledon)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)、水稻(Oryza sativa L.)、大豆(Glycine max(L.)Merr)、马铃薯(Solanum tuberosum L.)、玉米(Zea mays(L.)Sp.)和中国白菜(Brassicarapa L.)中都发现有100多个NAC家族转录因子。大部分NAC蛋白的N-末端具有约160个氨基酸残基组成的保守NAC结构域(NAC domain)，根据序列保守性，还可以进一步分为5个亚结构域(A-E)；C-末端是转录调控区(transcription regulatory region，TRR)，具有转录激活活性或转录抑制活性。部分NAC的C-末端还具有跨膜结构域(transmembrane motif，TM)，可以锚着在细胞质膜上，是膜结合转录因子(membrane-associated transcriptionfactors，MTFs)，又称为NTL(NAC with transmembrane motif1-like)。这类NAC蛋白在不同物种中数量不等，目前为止，已经从拟南芥基因组发现有18个NAC蛋白是膜结合NAC，水稻有5个，大豆有11个，马铃薯有13个，玉米有7个，中国白菜有17个，木豆(Cajanus cajan(L.)Millsp.)有4个，甘蓝型油菜(Brassica napus L.)有6个，谷子(Setaria italica L.)有8个。

膜结合转录因子(membrane-associated TFs，MTFs)在面对生长发育信号和胁迫时，通过蛋白酶水解从细胞质膜释放到细胞核，是植物细胞中一个快速反应体系。膜结合NAC转录因子蛋白参与调控植物的多种生长发育过程如细胞分裂、开花、发芽和叶片衰老。越来越多的研究还发现NTL蛋白在冷胁迫、盐胁迫和干旱胁迫反应和ABA信号转导中发挥重要作用。Yang等发现NAC家族的膜结合转录因子NAC089(又称为NTL11)，是拟南芥一个重要的细胞程序化死亡(programmed cell death，PCD)调节器。内质网(endoplasmicreticulum，ER)胁迫促使NAC089基因表达上调，从ER膜转移到细胞核中，通过调控PCD下游相关基因的表达控制ER胁迫诱导的PCD过程。另一个拟南芥膜结合NAC转录因子NAC062(又称为ANAC062，NTL6)在非折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)中具有重要功能，联系从质膜到细胞核的ER应激反应。遗传分析表明NAC062对于ER胁迫中细胞的存活非常重要，以一个去掉C-末端跨膜区的核定位短链的形式从细胞质膜转移到细胞核上，调控拟南芥UPR下游基因的表达。迄今为止，只有拟南芥、水稻和血桃的膜结合NAC TFs功能已经报道。大戟科(Euphobiaceae)植物巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)作为天然橡胶的主要来源，已经有NAC转录因子的研究报道。本项目组前期也从巴西橡胶树中克隆了一个膜结合NAC转录因子HbNTL1，并对其进行了生物信息学分析和功能预测，但是NAC转录因子尤其是膜结合转录因子在巴西橡胶树中的功能还有待于进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从巴西橡胶树中克隆的新的膜结合NAC转录因子HbNTL2，本发明还提供了该膜结合NAC转录因子HbNTL2的编码基因，以实现NAC转录因子尤其是膜结合转录因子在巴西橡胶树中的功能的进一步研究。

本发明的第一个方面是提供一种膜结合NAC转录因子HbNTL2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二个方面是提供一种膜结合NAC转录因子HbNTL2，由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码而成。

本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述的编码基因的表达载体

本发明的第四个方面是提供含有本发明第一个方面所述的编码基因的细胞系。

本发明的第五个方面是提供含有本发明第一个方面所述的编码基因的宿主菌。

本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的编码基因在提高宿主菌抗寒性和耐旱性中的应用。

本发明的第七个方面是提供本发明第一个方面所述的编码基因在提高植物抗寒性和耐旱性中的应用。

本发明运用从巴西橡胶树中分离得到新的膜结合NAC转录因子HbNTL2，对NAC转录因子尤其是膜结合转录因子在巴西橡胶树中的功能的进一步研究具有重要意义，且试验证实HbNTL2在叶中的表达量高于其他部位，受割胶、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)处理以及低温胁迫调控，可提高转基因酵母细胞对低温和干旱胁迫的耐受力，可用于在植物的抗逆基因工程改良，应用前景广阔。

附图说明

图1为HbNTL2基因的核苷酸序列与推导的氨基酸序列，其中，框中标示为NACdomain；跨膜区以下划线标出；*为终止密码子；

图2为HbNTL2与其他植物NAC MTFs的进化树分析，其中，箭头示为巴西橡胶树HbNTL2；

图3为HbNTL2与同一亚族膜结合NAC蛋白的多重序列比对；

图4为HbNTL2的转录激活实验，其中，A为载体构建示意图；B为HbNTL2的转录激活功能分析；

图5为HbNTL2的表达分析结果。

图6为HbNTL2对转基因酵母细胞的抗逆性的影响结果。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，以更好地理解本发明。

1材料与方法

1.1供试巴西橡胶树材料

本文所用巴西橡胶树均来自中国热带农业科学院试验农场。材料处理：

(1)采集正常割胶的热研7-33-97橡胶树的不同组织，如叶片、雄花和雌花、树皮和胶乳，液氮冻存备用。

(2)割胶处理：选用已达标准而未开割的热研7-33-97橡胶树，按照正常割胶制度(1/2树围，3天1刀)，用液氮采集第1刀、第4刀和第7刀割胶胶乳备用。

(3)外源激素ET和JA处理：处理方法参照康桂娟等(康桂娟,黎瑜,曾日中.巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析[J].基因组学与应用生物学,2014,33(4):1-8.)(康桂娟,曾日中,聂智毅等.巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析[J],中国农学通报,2012,28(31):7-14.)。

(4)低温胁迫实验：选取生长一致的低温敏感品系热垦501和抗寒品系93-114芽接苗于25℃培养箱中正常培养(16h光照/8h黑暗)2天后转移至4℃培养箱低温处理，采集处理2、4、6和8h时叶片，液氮碾磨后用于提取总RNA。1.2总RNA提取与HbNTL2基因克隆

橡胶树不同组织样品总RNA的提取方法参照An等(An,Z W,Wang Q T,Hu Y S,etal.Co-extraction of high-quality RNA and DNA from rubber tree(Heveabrasiliensis)[J].Afr J Biotechnol,2012,11(39):9308-9314.)，cDNA的合成按照Fermentas公司的RevertAid^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)反转录试剂盒。设计一对特异引物HbNTL2-F和HbNTL2-R(表1)，以橡胶树胶乳cDNA为模板对HbNTL2基因的ORF(Open Reading Frame，开放阅读框)全长进行克隆。PCR反应条件为95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min 30s，34个循环。PCR产物经凝胶电泳回收后连接pMD-18T Vector(TaKaRa)并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆测序分析。

表1本文所用引物序列

1.3HbNTL2生物信息学分析

利用InterProScan5和TMHMM server v.2.0进行保守结构域和跨膜区预测分析。文中系统发育树和多重比对所用膜结合NAC转录因子蛋白序列来自NCBI和PlantTranscription Factor Database PlantTFDB(3.0)。利用DNAMAN(v5.10)和MEGA5.05软件进行多重比对分析并构建系统发育树。

1.4HbNTL2转录激活功能分析

参照康桂娟等(康桂娟,曾日中,聂智毅等.巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析[J],中国农学通报,2012,28(31):7-14.)方法对巴西橡胶树HbNTL2转录因子进行转录激活功能分析，

根据保守结构域预测结果，设计引物(表1)将HbNTL2完整ORF序列(1-1380bp)，N端NAC domain(1-516bp)和NAC domain以外的C端序列(517-1380bp)构建到酵母载体pGBKT7中的EcoRI和SalⅠ酶切位点之间(图4,A)，转化酵母菌株Y2HGold，pGBKT7空载作为对照。PCR鉴定阳性克隆后接种到SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal(终浓度40μg/ml)三种缺陷型培养基上，30℃倒置培养3d，通过观察阳性克隆在不同培养基上的生长情况，确认HbNTL2编码蛋白的转录激活活性。

1.5HbNTL2基因表达特性分析

利用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq TM II实时荧光定量PCR试剂盒和BIO-RAD的CFX96Real-Time System荧光定量PCR仪分析HbNTL2基因在巴西橡胶树的不同组织表达情况，以及割胶、外源激素JA和ET和4℃低温胁迫处理对HbNTL2基因表达的影响，以巴西橡胶树Hb18SrRNA作为内参基因。HbNTL2荧光定量引物见表1，内参基因序列参照康桂娟等(康桂娟,曾日中,聂智毅等.巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析[J],中国农学通报,2012,28(31):7-14.)。每个处理设置3个重复。数据分析采用2-△△C(T)方法(Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods,2001,25:402-408.)，利用Excell 2007进行图表绘制。

1.6酵母胁迫试验

将HbNTL2基因构建到酵母表达载体PDR196中，转化酵母菌株W303，挑选阳性克隆加入到SD/-Ura液体培养基中，30℃，220rpm摇动培养过夜，调整至OD600＝1.0，取1ml，短暂离心30s，弃去上清，分别加入8M山梨醇(模拟干旱)和5M NaCl溶液，4℃处理24h(hour)后，依次稀释10倍，100倍，1000倍，分别取5ul点在SD/-Ura平板上，待吸收完全后30℃培养箱中培养3d(day)。另各取1ml依次稀释10倍，100倍，1000倍，分别取5ul点在SD/-Ura平板上,4℃处理4w(week)后30℃培养箱中恢复培养3d，以正常培养作为对照，比较转PDR196-HbNTL2和PDR196空载体质粒的酵母菌株的生长情况。

2结果与分析

2.1HbNTL2的克隆与生物信息学分析

本研究根据课题组巴西橡胶树转录组和基因组数据，设计特异引物对HbNTL2的完整读码框(ORF)进行了克隆和生物信息学分析。结果如图1所示，巴西橡胶树HbNTL2基因的ORF为1380bp，编码459个氨基酸，预测蛋白分子量52.311kD。InterProScan5和TMHMMserver v.2.0软件分析发现在第6～172位氨基酸之间存在一个保守结构域NAC domain，第433～453位氨基酸之间有一跨膜结构。

利用MEGA5.05软件中Neighbor-jointing方法(bootrap 1000)对NCBI数据库和植物转录因子数据库PlantTFDB搜索到的植物膜结合NAC转录因子进行系统进化树分析。分析结果显示HbNTL2与拟南芥NTL10、NTL12、NTL13和油菜BnNAC69关系较近，属于ANAC001亚族(图2)。

利用DNAMAN软件对属于同一亚族的巴西橡胶树HbNTL2、拟南芥NTL10、拟南芥NTL12、拟南芥NTL13、油菜BnNAC69、大白菜Bra033296、大白菜Bra008553和大白菜Bra036327蛋白序列进行多重比对。结果显示这些膜结合NAC转录因子蛋白的NAC domain比较保守，可以进一步划分为5个(A～E)亚结构域，而C-端差异比较大(图3)。

2.2HbNTL2在酵母中的转录激活功能分析

为了检测HbNTL2转录因子的转录激活功能和转录激活域的位置，将pGBKT7-HbNTL2-F(1-459aa)、pGBKT7-HbNTL2-N(1-172aa)、pGBKT7-HbNTL2-C(173-459aa)融合表达蛋白以及pGBKT7空载对照分别接种到三种不同的缺陷型培养基上。培养结果(图4，B)显示，全部转化子在SD/-Trp培养基上均能正常生长，而只有pGBKT7-HbNTL2-F和pGBKT7-HbNTL2-C能在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上正常生长，在X-α-gal存在时呈现蓝色。这说明NAC转录因子HBNTL2蛋白能够与pGBKT7载体中的GAL4-DB结合激活下游报告基因转录，具有转录激活功能，转录激活域在C末端(图4，B)。

2.3HbNTL2基因的表达分析

利用Real-time PCR技术分析巴西橡胶树HbNTL2基因在不同组织和处理中的表达特性，结果如图5所示，该基因没有组织表达特异性，在橡胶树雄花、雌花、叶片、胶乳和树皮中均表达，叶片中表达量最高，其次是雄花，胶乳中的表达量较低，叶片中的表达量是胶乳中的约40倍(图5，A)。割胶处理对HbNTL2基因的表达也有影响，在未开割巴西橡胶树树胶乳中，HbNTL2基因的表达随着割胶刀次增加呈上升趋势(图5，B)。分析外源激素ET或JA处理对HbNTL2基因表达的影响，结果显示随着时间增加表达量逐步升高，在处理72h后检测的表达量最高(图5，C)。低温胁迫对巴西橡胶树抗寒品系93-114和敏感品系热垦501胶乳中HbNTL2基因的表达均有影响，4℃低温处理后HbNTL2基因的表达均有所上升(图5，D)。

2.4酵母胁迫试验结果

结果如图6所示，PDR196-HbNTL2转基因酵母在8M山梨醇模拟干旱和4℃低温处理4w后存活率均高于PDR196空载对照；5M NaCl溶液处理后重组酵母菌株存活率与PDR196空载对照相当，结果表明HbNTL2基因在酵母中的表达，增强了酵母对干旱和低温胁迫的抵抗能力，而对高盐胁迫的抵抗能力无明显提高。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (2)

1.一种膜结合NAC转录因子HbNTL2的编码基因在提高宿主菌抗寒性和耐旱性中的应用，其中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种膜结合NAC转录因子HbNTL2的编码基因在提高植物抗寒性和耐旱性中的应用，其中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。