CN102146131A - 一种水稻干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种水稻干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是下述氨基酸残基序列之一：（1）如SEQ ID No：1所示；（2）将SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。本发明提供一个水稻抗旱基因及建立于此基因调控元件基础上的有效检测植物所受干旱胁迫程度的方法。经检测，该方法具有快速、准确估量水稻植株所受干旱影响程度的特点。本发明为植物缺水检测提供了一种快速、便捷、有效的方法，并为植物抗旱研究及干旱育种提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值。

Description

一种水稻干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种可以准确应答水稻干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及这种基因的调控元件在水稻抗旱中的应用。

背景技术

植物的生长发育需要水分，矿物质和有机物质的供应，同时也受到植物生长物质的调节与控制。人类种植作物已有上万年的历史，如何增强作物抗灾害能力、提高产量一直是种植业一大难题。其中干旱是危害面积最广，危害程度最大的灾害之一。当植物遭遇干旱逆境时，植物体迅速感知外部信号，并迅速传导到细胞内部，进而激活许多干旱胁迫应答基因的表达，在植物体内产生大量的特异性蛋白，协同调节植物生理生化一级代谢的变化，从而提高对干旱的耐性。与其他旱作植物相比，水稻对水分胁迫更为敏感，水分亏缺会使植株发育受阻，分蘖减少，花粉败育，产量减少等。植物生理学家和育种专家对水稻的长期种植实践和观察发现，生殖发育时期有几个阶段对外界逆境非常敏感，此时遭受胁迫可能会导致产量的大幅度下降，比如说水稻的第一苞分化至颖花原基分化始期（决定花的个数），减数分裂期（决定雌雄育性），灌浆期（决定种子饱满程度，千粒重）。这些时期遭受干旱胁迫会使得花的个数减少、颖花退化、空瘪等（杨弘远编著. 水稻生殖生物学. 2005，浙江大学出版社）。

水稻全基因测序工作的完成，为针对水稻组织应用高通量的全基因组表达技术如基因芯片、蛋白质组分析提供了方便。这些高通量的功能基因组研究技术结合公共数据库中的序列信息，将有利于克隆水分亏缺条件下的响应基因，进而有望从中发现新的抗旱基因，分析这些基因上游的启动子，还能发现可应用于抗旱基因工程育种上的新的调控元件。通过干旱环境下的转录谱分析，我们获得了一个干旱胁迫后诱导表达的基因Os07g0422100。Os07g0422100具有的PM-19（19-kDa Plasma Membrane Polypeptide）结构域，是最重要的ABA（脱落酸，abscisic acid）诱导结构域之一。植物在遭受干旱胁迫时,ABA被普遍认为是一种干旱信号而传递干旱信息，进而调控体内基因的表达以抵御干旱造成的伤害。

对基因Os07g0422100进一步分析后发现Os07g0422100基因的启动子属于诱导型启动子，特异性地在植物体受到干旱胁迫时启动该基因的表达，以抵御干旱逆境。根据这一特性，我们在该启动子3’端连接一个报告基因（gus），在植物受到干旱逆境胁迫时，报告基因便开始表达，经过一种便捷有效的染色方法就可以准确估量植物受灾程度，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。

Os07g0422100蛋白及其编码基因的特性让我们对此基因在研究抗旱功能方面有很高的期望，对深入研究植物抗旱机制及功能有重大意义。Os07g0422100的调控元件启动子驱动报告基因的方法更是提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的手段，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于水稻的可应答干旱的基因及改造该基因后的可以报告干旱程度的基因。

本发明所提供的可应答干旱的蛋白，名称为Os07g0422100，来源于水稻（Oryza sativa ssp. japonica）；是下述氨基酸残基序列之一：

1）序列表中的SEQ ID No:1;

2）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID No:1由173个氨基酸残基组成。

编码本发明的Os07g0422100基因，是下述核苷酸序列之一：

1) 序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列；

2) 编码序列表中的SEQ ID No:1蛋白质序列的DNA；

3) 与序列表中的SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

4) 在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件：用0.1×SSPE（或0.1×SSC），0.1%SDS的溶液，在65°C下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No:2由522个碱基组成，其编码框为自5’端第1-522位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明所提供的可应答干旱的基因Os07g0422100的调控元件为该基因的启动子区域，是是下述核苷酸序列之一：

1) 序列表中的SEQ ID No:3的核苷酸序列；

2) 与序列表中的SEQ ID No:3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；

3) 在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件：用0.1×SSPE（或0.1×SSC），0.1%SDS的溶液，在65°C下杂交并洗膜。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供上述基因的应用，包括提供一种用上述基因检测植物遭受干旱胁迫程度的方法 。

在实际应用中，将Os07g0422100的启动子与报告基因（gus）融合，将该构建Os07g0422100p-gus转化水稻，得到可以比较准确地估量植物受到干旱胁迫程度的植株。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

本发明的Os07g0422100是一个抗旱基因，可以在水稻受到干旱胁迫时大量表达，以抵御干旱逆境。而Os07g0422100p-gus的转基因植株可以报告水稻干旱程度。本发明不但提供了一种抗旱基因，更提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法，同时也对深入研究植物抗旱机制及功能有重大意义。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。

附图说明

图1为水稻幼苗(seedling)、未进行干旱处理的水稻花序(flower)和进行干旱处理后的水稻花序(drought flower)中Os07g0422100的表达水平。

图2为pCAMBIA1301-Os07g0422100p-gus转化水稻植株与野生型水稻经过干旱处理后花苞中的gus染色结果。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物由英骏生物技术有限公司完成，测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。

实施例1.水稻抗旱基因Os07g0422100的筛选。

在水稻二级枝梗形成时，停止灌溉，监测土壤含水量，使之保持在20-30%，持续一周。取水稻花苞为材料，提取总RNA（Promega，SV total RNA isolation system），通过基因芯片比较分析对照植物与被胁迫植物的基因表达谱，初步筛选到包括Os07g0422100的一些候选基因。以水稻的总RNA为模板，用AMV反转录酶（TaKaRa）合成cDNA（依据Plant RT－PCR Kit 2.01（TaKaRa）的用户手册进行），用荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）检测对照植物与被胁迫植物中Os07g0422100的表达情况（依据TaKaRa的用户手册进行）。所用5’和3’引物分别为：

5'-TGTGACAGTGTGACTGTGAGGC-3'（ SEQ ID No:4）；

5'-CAAACCCAACACACAACGCTA-3' （ SEQ ID No:5）。

反应按照下列程序进行：预变性 95℃ 3分钟，1个循环；变性95℃ 10秒，退火与延伸60℃ 30秒，40个循环。对比该基因的在幼苗时期（seedling）、未受干旱胁迫的花期（flower）和受到干旱胁迫的花期（drought flower）的表达量，我们发现Os07g0422100的表达具有非常高的专一性，仅在受到干旱胁迫后的水稻花穗中特异表达（图1）。

实施例2. Os07g0422100启动子的克隆。

提取水稻总DNA，以水稻总DNA为模板，PCR扩增Os07g0422100的启动子部分。5’和3’引物序列分别为：

5’-AAGTAAACCGTTTTTTAAGGAT-3’（ SEQ ID No:6）；

5’-TGAGCTATCAGGGTAGCAGCC-3’（SEQ ID No:7）。

50ul PCR反应体系包含：模板2ul，高保真酶KOD plus（TOYOBO） 1ul，10×缓冲液5ul，2.5uM dNTP 8ul，20uM的 5'和3’引物各1ul，水32ul。反应条件为：94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，55°C退火1分钟，68°C延伸2分钟，共30个循环。反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约2kbp的扩增片段。PCR产物经HindIII和BglII位点克隆到大肠杆菌表达载体pCAMBIA1301中，测序验证其正确后得到大肠杆菌表达质粒pCAMBIA1301-Os07g0422100p-gus。

实施例3. 重组质粒pCAMBIA1301-Os07g0422100p-gus转化水稻植株。

将重组质粒pCAMBIA1301-Os07g0422100p-gus转化到水稻中。参照Hiei等（Plant Mol Biol，1997，35：205－218）的方法转化水稻。将质粒pCAMBIA1301-Os07g0422100p-gus通过电激法转入根瘤农杆菌EH105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒pCAMBIA1301-Os07g0422100p-gus的农杆菌EH105接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中28℃摇菌培养至对数生长期晚期，再1：100扩大培养到OD600为0.5左右。收集农杆菌菌体并重悬于转染培养基中。按照常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至10cm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得T1代种子。

实施例4. pCAMBIA1301-Os07g0422100p-gus转基因水稻植株报告干旱胁迫效果的检测。

将得到的转基因水稻T1代种子正常种植，在水稻二级枝梗形成时，停止灌溉，监测土壤含水量，使之保持在20-30%，持续一周。取下花序浸于gus染液中，于37℃放置24h，70%乙醇浸泡24h以洗脱杂色，观察经过干旱处理与对照组的花器染色程度。图2即为转基因水稻植株和野生型水稻花序的gus染色结果。未受干旱处理的转基因水稻植株，其花序里报告基因gus的表达水平非常之低，而受过干旱处理的转基因水稻植株，其报告基因却呈现了高度表达，因而证明了Os07g0422100的启动子为一种干旱诱导型的启动子，在植物受到干旱胁迫后在花器官中诱导表达。同时我们的结果还提供了一种检测植株水分缺亏的方法，即通过便捷有效的染色就可以较为地准确估量植物水分缺失的程度，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。

序列表

                         序列表

<110>  一种水稻干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用

       复旦大学

<120>  一种水稻干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用

<130>  001

<160>  7    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  173

<212>  PRT

<213>  稻属水稻

<400>  1

 

Met Ala Gly Val Gly Arg Asn Met Leu Ala Pro Leu Leu Val Leu Asn

1               5                   10                  15     

 

Leu Ile Met Tyr Leu Ile Val Ile Gly Phe Ala Ser Trp Asn Leu Asn

            20                  25                  30         

 

His Phe Ile Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Pro Gly Val Ala Gly Asn Gly

        35                  40                  45             

 

Ala Thr Phe Tyr Phe Leu Val Phe Ala Ile Leu Ala Gly Val Val Gly

    50                  55                  60                 

 

Ala Ala Ser Lys Leu Ala Gly Val His His Val Arg Ala Trp Arg His

65                  70                  75                  80 

 

Asp Ser Leu Ala Thr Asn Ala Ala Ser Ser Leu Ile Ala Trp Ala Ile

                85                  90                  95     

 

Thr Ala Leu Ala Phe Gly Leu Ala Cys Lys Glu Ile His Ile Gly Gly

            100                 105                 110        

 

His Arg Gly Trp Arg Leu Arg Val Leu Glu Ala Phe Val Ile Ile Leu

        115                 120                 125            

 

Ala Phe Thr Gln Leu Leu Tyr Val Leu Met Leu His Thr Gly Leu Phe

    130                 135                 140                

 

Gly Gly Gly Asp Gly Ala Tyr Arg Asp His Asp Tyr Gly Val Gly Ala

145                 150                 155                 160

 

Gly Ala Ala Ala Gly Glu Pro Lys Gly Thr Ala Arg Val

                165                 170            

 

<210>  2

<211>  522

<212>  DNA

<213>  稻属水稻

<400>  2

atggccggag tcgggaggaa catgctggcg ccgctcttgg tgctcaacct catcatgtac     60

 

ctcatcgtca tcggcttcgc gagctggaac ctcaaccact tcatcaatgg ccagaccaac    120

 

tacccaggcg tggcgggcaa cggcgcgacg ttctacttcc tggtgttcgc catcctggcc    180

 

ggggtggtgg gcgcggcgtc caagctggcg ggcgtccacc acgtgcgcgc gtggcgccac    240

 

gacagcctcg ccaccaacgc ggcctcctcc ctcatcgcgt gggccatcac cgcgctcgcc    300

 

ttcggcctcg cctgcaagga gatccacatc ggcggccacc gcgggtggcg cctccgcgtg    360

 

ctcgaggctt tcgtcatcat cctcgccttc acgcagctgc tctacgtgct catgctccac    420

 

acgggcctct tcggtggcgg cgacggcgcc taccgggacc acgactacgg cgttggcgcc    480

 

ggtgctgccg ccggcgagcc caaggggaca gcgagggtct ga                       522

 

<210>  3

<211>  2071

<212>  DNA

<213>  稻属水稻

<400>  3

gtaagtaagt aaaccgtttt ttaaggatcc gcatgtaaaa atagaaggac gatttttcta     60

 

gacacagtca attatggatc gtctggaatc taataaggag ctcgtacaga aaaatcgttt    120

 

tttatatttt tatagtggca acgataacag ctgcttggat cagtcctaat caaacaagga    180

 

atatacctcc ggaacctcta ggcaatttat gcggagaaaa gatcaaacaa agaaagttcc    240

 

taaaagaagc attcagaaac tctaaatagc tcatgtagag aaaagatggg agaaaacagg    300

 

aaccgtaaga ataatgagct gaagaatacc acctcgaaga tgactctttt taaaaactag    360

 

atacaatttt accacgtaga ttagattttc attataaaaa taaacctaat ataaatgtaa    420

 

aaacttaatc taatcatgac tattatagtt agttattata tactgcccat caaaatttcg    480

 

cgaacatgca actaactagc tagcacacat atatagcaca catatataga attaatagaa    540

 

cccgcggaaa agatccgtta ttggaaactc ttgtagcgat atgacactgg cgtagctagg    600

 

aatttttcgt tggatagtcc tatttccgta cgtgatggag gatgaaaaaa ttaagtgtgg    660

 

ccatgtaccc ggtagatagc aaatataatg atgcaaaaac aagttatact atgaaattta    720

 

caaaaagttg tccctgatcg tgcctaaaat ttacaacaag ttatactaaa attttaatat    780

 

cagcatacaa tataatatgc atttacaaaa tttgttacag accacttaat ttaaataaat    840

 

catcgtaaca taagacaccg tgattaaaaa aaaagacagc tagctccaat cgtataaaca    900

 

aacacaaaag taacgagttg ataaaacttg acaaaagtgc aataataaat acataacgct    960

 

ctagagttat caagctaact aacgagttta agaagcatga tatatcagta tgttagttcg   1020

 

ttttacaaat gatccataaa ttttaaagac tgaataagag caaaccggtt taagaatata   1080

 

aatctcaaag gtatatacgc cattctttag cagactttgt ggcctaagaa atttatcttg   1140

 

ataataggga ttaaggtatc tagattaaaa tttagggtag tcctgtgccc atatggacta   1200

 

taagctaacc acgccacgcc gatatcactg ttccgagata aaagaagatc gtcgtgttct   1260

 

ttaacagatt gatagggcta gtttagtaca gtaatttagt ttggtagagc agcctgcagt   1320

 

tactccaatc agccgtcacg tacggttttg agaggcgaac ccggccatac attagaaaac   1380

 

ggcaaaatac ttatcgattg agctgaagac gtacgcatat gcttccgcgc gaacacgaca   1440

 

cgatcgagca caagctaagc cagccccgcg aagccactag aatcctcttc cattccagat   1500

 

gtgcaccccg tatcccgcgg cgctaccgct accagctggt aaagcggtgc gccggtgccg   1560

 

ccacgtcctc gcacgcacca cgcatgcata tgcatgccat ccgagcgcgg agcgccccct   1620

 

cctcggaaac accatgcgcg cacacagaca caggacacac atgcactcac tgaccgtctg   1680

 

acccacccgc cgagctgagg agccgagcac cggcccgggg cccctcgacg cggcacgtgg   1740

 

ctcgcacatt cgcagcgctg gcgggcgccc acgggcacgc gtcgctcccg cggtcttcct   1800

 

cccgttgctt cctcatatcc gccgataaaa cggataagcc cggccaccca ccaaaccctg   1860

 

cacttttaaa tccgtcgtcc ttctagctag tgttgcccac cttgatttgc tcgtactttg   1920

 

attctttctg cctctgcgta cgtgcgtgag agagctaagc atagagctag tggagtggac   1980

 

cggcctcact cgatctcagt tctcgatcga tctcttcttc gtcttctgcg tcgtcgtcgt   2040

 

cgtccagcgg tgagctatca gggtagcagc c                                  2071

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  稻属水稻

<400>  4

tgtgacagtg tgactgtgag gc                                              22

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  稻属水稻

<400>  5

caaacccaac acacaacgct a                                               21

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  稻属水稻

<400>  6

aagtaaaccg ttttttaagg at                                              22

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  稻属水稻

<400>  7

tgagctatca gggtagcagc c                                               21

 

 

Claims (10)

1.一种水稻干旱胁迫应答蛋白，其特征在于是下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

（1）SEQ ID No:1;

（2）SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的水稻干旱胁迫应答蛋白的基因，其特征在于为下述核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID No:2；

（2）编码SEQ ID No:1蛋白质序列的DNA；

（3）与SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列； 

（4）在高严谨条件下与SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述水稻干旱胁迫应答蛋白的基因的调控元件即该基因的启动子，其特征在于为下述核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID No:3；

（2）与SEQ ID No:3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；

（3）在高严谨条件下可与SEQ ID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件的工程菌。

7.扩增权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件中任一片段的引物对。

8.权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件在植物生长发育中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述水稻干旱胁迫应答基因的调控元件启动子区域与报告基因gus融合后转化水稻，在受过干旱处理的转基因水稻植株里，其报告基因呈现诱导表达。

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