CN1624133A - 利用水稻干旱诱导基因启动子leap改良植物抗旱性 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。特征是：克隆鉴定了水稻(Oryza Sativa L.)OsLEAl 基因的启动子LEAP。该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中OsLEAl基因及其启动子包含序列表SEQ ID NO：1所示的序列中的2155位碱基的核酸序列，该核酸序列编码一个干旱诱导表达蛋白。启动子区域含有两个ABRE顺式作用元件，能特异性地对干旱和ABA起应答反应。利用该基因启动子片段构建的诱导性表达载体可以在植物受到干旱胁迫时强烈地诱导目标基因的表达。本发明还公开了利用该启动子和遗传转化培育抗旱植物的方法及其应用。

Description

利用水稻干旱诱导基因启动子LEAP改良植物抗旱性

                                    技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。涉及植物逆境诱导启动子的克隆及其应用。通过鉴定、克隆一个水稻干旱强烈诱导基因的启动子，将其应用于植物抗逆基因特别是用于水稻抗旱基因的遗传转化，达到提高水稻抗旱性的目的。

                                    背景技术

干旱、高盐、低温等非生物胁迫是自然界常见的不利环境因子，它们严重地制约了植物生长发育。植物生长在土壤里，自身不能移动，为了抵抗或适应这些不利的环境因子，植物自身会诱导表达一批应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子(Xiong等，Cell signaling duringcold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。尽管已有文献报道从植物中分离了大量抗逆相关基因(Thomashow等，Plant cold acclimation：Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.50：571-599，1999；Shinozaki等，Molecular response to dehydration andlow temperature：Differences and cross-talk between two stress signaling pathways.Curr.Opin.Plant Biol.3：217-223，2000)和一些逆境应答的启动子，如SalT启动子(Garcia等，The expression of the salt-responsive gene salT from rice is regulatedby hormonal and developmental cues，Planta 207：172-180，1998)，RD29A启动子(Yamaguchi-Shinozaki 等，Characterization of the expression of adesiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoterin transgenic plants.Mol Gen Genet.23：331-340，1993；Kasuga等，A combinationof the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol.45：346-350，2004)。但在重要农作物水稻中尚未分离到受干旱强烈诱导表达基因的启动子用于植物抗逆遗传工程。LEA是一类胚胎发生晚期丰富表达蛋白并且受逆境诱导(Baker等，Sequence and characterization of 6 LEA proteins and their genes from cotton.PlantMol Biol 11：277-291，1988)。许多这类基因已在大麦中被分离出来并且用于植物抗逆遗传改良(Xu等，Expression of a late embryogenesis abundant protein gene，HVA1，frombarley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice.PlantPhysiol.110：249-257，1996；Ho和Wu等，Production of water stress or salt stresstolerant transgenic cereal plants US patent，US5981842，1999)。但是很少有关于LEA基因启动子鉴定利用的报道。

另一方面，前人关于利用逆境诱导基因及其启动子提高逆植物抗逆性的实验证据基本上是以拟南芥或烟草等模式植物为研究体系获得的结果。这些结果能否成功地在禾谷类作物中重复还很少有报道。

水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，水稻抗旱遗传改良一直是一个难以突破的重要难题。本发明是通过鉴定一个干旱强烈诱导的水稻LEA基因的启动子，将其用于调控LEA基因本身以及其它抗逆相关基因在水稻中的表达，显著地提高了水稻的抗旱性。

                                    发明内容

本发明的目的是克隆、鉴定一个干旱强烈诱导表达的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗旱相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到提高植物的抗逆性，例如利用该克隆的抗旱启动子基因培育抗旱型的水稻品种。

本发明通过以下技术方案实施：

首先是分离干旱强烈诱导表达的启动子。所提供的干旱强烈诱导表达的启动子来源于水稻。该启动子控制的水稻内源基因为编码胚胎发生后期丰富蛋白(late embryogenesisabundant protein，LEA)家族的一个成员，被命名为OsLEA1，故该启动子命名为LEAP(LEAPromoter)。OsLEA1能被干旱、高盐胁迫、冷害以及脱落酸(ABA)诱导(如附图2所示)。LEAP启动子是具有序列表SEQ ID NO：1中碱基第1-1180位的序列或含有两个串连排列的ABRE顺式元件的序列。LEAP启动子控制的LEA基因是具有序列表SEQ ID NO：1中碱基第1288-1291位的编码序列或含有与编码的蛋白质同源性至少在80％以上具有相同功能的序列。

本发明所提供的LEAP启动子区域含有两个ABRE顺式作用元件(如附图1所示)，能特异性地对干旱和ABA起应答反应。申请人利用LEAP启动子构建的诱导性表达载体(如附图3所示)可以在植物受到干旱胁迫时强烈地诱导报告基因GUS的表达(如附图4所示)。

利用本发明所提供的LEAP启动子构建了抗逆基因OsLEA1的表达载体，并通过遗传转化的方法将该基因导入水稻受体中，对改良水稻的耐旱性有显著的效果(本发明的效果详见具体实施方式，如实施例1中的表1)。

详细的技术方案如下所述：

一种分离出的水稻DNA分子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中OsLEA1基因及其启动子LEAP包含序列表SEQ ID NO：1所示的序列中的2155位碱基的核酸序列，该核酸序列编码一个干旱诱导表达蛋白。

所述的一种分离的DNA分子，其特征在于启动区包含两个串连排列的ABRE顺式作用元件TACGTGTC。

所述的LEAP启动子全部或部分序列构建的植物表达载体。

所述的LEAP启动子全部或部分序列构建植物表达载体，通过遗传转化培育抗旱植物的方法。

所述的LEAP启动子全部或部分序列构建植物表达载体，通过遗传转化培育的抗旱植物材料。所述的抗旱植物的材料是指植株、种子或细胞无性系。

所述的OsLEA1基因，其特征在于，序列表SEQ ID NO：1所示的序列的碱基第1288-1291位及其同原性在90％以上，且能被干旱诱导的同源基因。所述的LEA基因，通过遗传转化培育获得抗旱植物的方法。利用该方法培育获得抗旱植物材料，其中的植物材料包括植株、种子或细胞无性系。

按照以上的技术方案，很显然，申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所提供的LEAP启动子构建抗旱相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗旱性。受体植物主要是包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物，当然也包括其他一些重要的经济作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄作物上的应用。

                                    附图说明

序列表SEQ ID NO：1，公开了本发明克隆的包含启动子序列LEAP的水稻OsLEA1抗旱基因序列全长和引物的序列。

图1显示的是OsLEA1基因启动子区顺式作用元件。斜体标注序列为开放阅读框(ORF)；两个ABRE元件序列用黑色并加文本框表示；阴影显示的是基本启动子元件序列。双下划线序列为扩增OsLEA1基因所用的引物序列；单下划线序列为扩增OsLEA1基因启动子所用的引物序列。

图2显示的是OsLEA1基因能被多种逆境(干旱、冷害、200mM/L NaCl，100μM/L ABA)诱导表达。

图3表示1391Z-OsLEAP表达载体。该载体含潮霉素(HRG)抗性筛选基因，启动子OsLEAP被融合到GUS基因5’端非翻译区。

图4显示的是启动子OsLEAP控制下的GUS基因在不同胁迫处理下诱导表达的活性。OsLEAP-GUS融合基因的水稻转化愈伤分别用高盐(200mM/L NaCl)，ABA(100μM/L)或干旱进行处理后，按图中标注的时间点取样定量测定GUS活性。

                                    具体实施方式

实施例1、LEAP启动子分离和鉴定

通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农业科学院提供的商业品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高12倍以上)的EST(表达序列签)，经序列分析发现，该EST为一个LEA蛋白基因的3’端部分序列。为分离该基因的启动子，首先是分离该基因的全长cDNA。具体步骤如下：

以该EST的3’端序列设计了基因特异引物P1：5’-ACACCCGTCAGAAA(互补序列)。采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种“中旱5号”中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用试剂盒(购自Invitrogen公司)分离完整mRNA后用引物P4反转录合成cDNA第一链，反应条件是：72℃ 2min，42℃ 60min，65℃5min。然后通过5’端接头的巢式引物1(5’GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG，此为GeneRacer试剂盒提供的载体上的序列)和巢式引物2(5’CGCTACGTAACGGCATGACAGATG，同样为GeneRacer试剂盒提供的载体上的序列)分别与引物P1进行连续两轮PCR反应(DNA聚合酶，TaKaRa LA)。两轮PCR反应条件均是：94℃预变性5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸10min。将巢式引物2与引物P1扩增获得的PCR产物连入pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，综合多个阳性克隆的测序结果，得到了目标基因5端完整的非翻译区序列(5’UTR)和部分编码序列。根据5’-UTR和3’-UTR序列进而设计扩增全长靶cDNA的引物P2(5-AAGCTTAGGATCAATGGCTT)’和引物P3(5-AAACCACAAATGCGGGCTTT，互补序列)。以干旱胁迫处理水稻品种“中旱5号”的苗期叶片3天，其技术指标是：被处理后的水稻叶片全卷，经测定叶片的相对含水量为70％)，从处理后的水稻品种“中旱5号”的苗期叶片提取的总RNA逆转录获得的第一链cDNA为模板进行PCR，扩增产物经测序证实为目标基因全长cDNA(该序列见序列表SEQ ID NO：1所示)。

在已知该基因全长cDNA的基础上，下一步就是分离控制该基因的启动子。根据全长cDNA序列在GeneBank中找到了对应的粳稻“日本晴”的基因组序列(GenBank登录号为AC104713)并选取该基因的转录起始位点上游2Kb的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。为保证PCR扩增的准确性，设计了两对引物：P4(5’ TCCAAGCTTAGGGCCTCCATAACCTACG)和P5( TCGGGATCCACGCGCGAATGTTAGAACTC)。斜体下划线分别表示添加的限制性酶切位点。首先利用引物P4和P5以中旱5号基因组DNA(CTAB法抽提，Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，TheorAppl Genet，83，495-499)为模板进行第一轮PCR扩增，反应条件是：94℃预变性5min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1mim，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳挖胶回收后连入pGEM-T Easy载体上，筛选阳性克隆并测序(ABI3730，上海国家基因测序中心)，结果证实：PCR产物含有两个与逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)应答的串联排列的ABRE顺式作用元件(Leung等Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1998，49：199-222)，分别位于序列表中核苷酸位1087-1095(TACGTGGC)和核苷酸位1120-1127(TACGTGTC)。LEAP启动子序列和包含的ABRE顺式元件如图1所示。

实施例2、检测水稻内源基因OsLEA1的诱导表达

以水稻品种“明恢63”(一种中国普遍推广的水稻品种)为材料，在3叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及ABA处理。干旱处理是用20％的聚乙二醇(商品名PEG6000)浸泡幼苗根部并每天中午取一次样，连续取5天。冷害处理是将幼苗置于4℃生长箱，0h，1h，3h，6h，12h和24h后取样。高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0h，1h，3h，6h，12h和24h后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100μM/L ABA溶液中并在0h，1h，3h，6h，12h和24h后取样。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，Invitrogen)后按《分子克隆》(科学出版社，1999)有关实验操作方法进行RNA转膜，并以OsLEA1为探针做Northern杂交。结果表明，OsLEA1能被干旱、冷害、高盐和ABA诱导表达(图2)。

实施例3、LEAP启动子干旱诱导活性鉴定

本发明的实施方案就是构建LEAP启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种“中花11”(来自中国农业科学院作物研究所商业品种)中定量地检测LEAP启动子的干旱诱导表达活性。具体操作如下：

首先将实施例1中分离的LEAP启动子的PCR产物连入pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，转化大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)并筛选阳性克隆。因为该PCR产物在其内部含有一个Hind III酶切位点(PCR产物序列及酶切位点分布详见说明书附图1)，故通过HindIII、Bam H1双酶切可将连入载体的1030bp的插入片段切成预期的两个片段：300bp(启动子上游序列)、730bp(核心启动子序列，含有启动子所有基本元件和两个ABRE顺式作用因子)；然后将730bp的酶切片段连入中间表达载体p1391Z(来自CAMBIA公开使用的载体，载体含有GUS报告基因)的多克隆位点获得报告基因表达载体p1391Z-OsLEAP-GUS。通过蓝白斑筛选阳性克隆并用酶切验证后，将该报告基因表达载体(详见说明书附图3)通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)基础上进行优化。主要步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃)           28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)   4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)   4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)  1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)  1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI)                    0.08g

硼酸(H₃BO₃)                0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)        0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)        0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid)         0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)       0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)     0.1g

甘氨酸(Glycine)              0.2g

肌醇(Inositol)               10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃)         16.5g

硝酸钾                    19.0g

磷酸二氢钾                1.7g

硫酸镁                    3.7g

氯化钙                    4.4g

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾                    0.083g

硼酸                      0.62g

硫酸锰                    0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)    0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X)             100ml

N6mix母液(100X)            10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      10ml

维生素贮存液(100X)         10ml

2，4-D贮存液               2.5ml

脯氨酸(Proline)            0.3g

CH                         0.6g

蔗糖(Sucrose)              30g

Phytagel                   3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X)             100ml

N6mix母液(100X)            10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      10ml

维生素贮存液(100X)         10ml

2，4-D贮存液               2.0ml

脯氨酸                     0.5g

CH                         0.6g

蔗糖                       30g

Phytagel                   3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基

N6max母液(10X)             12.5ml

N6mix母液(100X)            1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      2.5ml

维生素贮存液(100X)         2.5ml

2，4-D贮存液               0.75ml

CH                         0.15g

蔗糖                              5g

琼脂粉(Agarose)                   1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)                   12.5ml

N6mix母液(100X)                  1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)            2.5ml

维生素贮存液(100X)               2.5ml

2，4-D贮存液                     0.75ml

CH                               0.2g

蔗糖                             5g

琼脂粉                           1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)                     5ml

N6mix母液(100X)                    0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              0.5ml

维生素贮存液(100X)                 1ml

2，4-D贮存液                       0.2ml

CH                                 0.08g

蔗糖                               2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)                     25ml

N6mix母液(100X)                    2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              2.5ml

维生素贮存液(100X)                 2.5ml

2，4-D贮存液              0.625ml

CH                        0.15g

蔗糖                      7.5g

琼脂粉                    1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X)            25ml

N6mix母液(100X)           2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)     2.5ml

维生素贮存液(100X)        2.5ml

6-BA贮存液                0.5ml

KT贮存液                  0.5ml

NAA贮存液                 50μl

IAA贮存液                 50μl

CH                        0.15g

蔗糖                      7.5g

琼脂粉                    1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)            100ml

N6mix母液(100X)           10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)     10ml

维生素贮存液(100X)        10ml

6-BA贮存液                2ml

KT贮存液                  2ml

NAA贮存液                 0.2ml

IAA贮存液                 0.2ml

CH                        1g

蔗糖                             30g

Phytagel                         3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10）                   50ml

MSmix母液(100X)                  5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)            5ml

维生素贮存液(100X)               5ml

蔗糖                             30g

Phytagel                         3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

3.1愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

(2)用灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

3.7分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

(1)剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

申请人采用构建的p1391Z-LEAP载体(附图3)转化水稻。对产生的抗性愈伤进行干旱、高盐胁迫及ABA处理，通过检测胁迫后的愈伤中GUS的活性来评价启动子LEAP受逆境胁迫诱导强度。其中高盐、ABA处理分别采用200mM NaCl、50μM ABA溶液直接浸泡水稻抗性愈伤；干旱处理则是将抗性愈伤用20％的PEG 6000处理，取样方法参照实施例2进行。

将胁迫后各时间点的样品通过GUS提取缓冲液(50mM NaHPO4，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na2EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提蛋白质，从样品蛋白质提取物中取10μl进行GUS活性的定量分析。具体操作如下：将10μl样品蛋白质提取物+0.4mlGUS提取缓冲液+10μl 40mM底物MUG(4-methylumbelifferyl β-D-glucuronide)在37℃水浴45min后，加入1.6ml反应终止液 (0.2M Na2CO3)；将这2ml反应液通过DyNA Quant 200荧光计测量反应所生成4-MU(4-methylumbelifferyl)的相对荧光吸收值；然后对各样品的总蛋白质通过BSA法进行测量以便对各样品的GUS活性值进行比较分析；综合以上数据得出各个样品的GUS活性的绝对值(pmol MU/min/mg protein)。各种胁迫处理以及不同时间段的样品的GUS活性的绝对值见说明书附图4。

实施例4、利用LEAP启动子控制抗旱相关基因进行水稻遗传转化提高抗旱性

本发明的主要目的是要利用LEAP启动子控制抗旱相关基因进行水稻遗传转化提高抗旱性。为此申请人构建了一系列以LEAP为启动子的抗旱相关基因表达载体(如表1所示)。同时还比较了同一基因OsLEA分别在LEAP启动子和报道的逆境诱导启动子SalT(Garcia等1998，Planta 207：172-180)控制下的转基因水稻抗旱性改良效果(如表1所示)。

表1  转基因水稻T1代苗期抗旱性的比较

启动子¹  抗逆相关     基因来源                干旱胁迫后的

          基因²                               存活率³(％)

无        无           无(即对照品种)          11.2±2.3

无        无           不含启动子和基因的空载  13.8±2.7

                       体

CaMV35S   OsLEA1       本发明                  56.2±5.3

SalT      OsLEA1       本发明                  66.5±7.8

LEAP      OsLEA1       本发明                  85.1±5.5

LEAP      NHX1         Apse等，1999，Science   49.2±9.3

                       285：1256-1258

LEAP      CBF3         Kasuga等，1999，Nat.    57.7±6.6

                       Biotechnol.17：287-291

LEAP      NCED         Thompson等，2000，      48.4±8.2

                       Plant J.23：363-374

¹选用组成型表达启动子、已报道的诱导表达启动子、以及本发明的启动子，比较它们控制抗逆基因表达以提高抗旱性的效果。

²除本发明的OsLEA1基因外，还选用三个已报道的抗逆基因，确定LEAP启动子控制这些基因表达是否会有效提高水稻抗旱性。

³对相同生长条件下3叶期的转基因幼苗进行缺水胁迫，当对照植株100％卷叶时复水，1周后考察植株存活率。

物表达的载体的构建以pCAMBIA1301(来自CAMBIA，公开使用载体)为基础，分别在其多克隆位点处的EcoRI酶切位点处插入CaMV35S启动子(组成型表达)获得pC1301S或在相同位置插入LEAP启动子(pC1301H)或SalT启动子(pC1301T)。启动子的插入方向通过测序确定。通过KpnI和BamHI两个酶切位点定向地把水稻干旱诱导基因OsLEA1和其它抗旱相关基因(表1)分别插入到启动子的后面，从而获得目标基因的遗传转化载体。

在本实施例中，用于遗传转化选用水稻品种为“中花11”，其转化方法或步骤同实施例3。在转基因T0代，从叶片中提取总DNA(制备方法同实施例1)，利用潮霉素抗性基因通用引物(H1：5’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT；P6：5’-GTCCTGCGGGTAAATAGCTG，上海生物技术公司提供)进行PCR阳性检测，得到转基因阳性植株。

利用T1代转基因阳性(在种子萌发时加入10mg/mL的潮霉素，不含转基因的种子由于不含相应的潮霉素抗性基因而不会发芽)植株进行干旱胁迫试验。具体方法如下：每个转基因水稻选用5个家系，每个家系定为30株，种植在80X120cm²的塑料盒中(每塑料盒种30株水稻品种“中花11“作为对照植株，分散种植成三行)。试验设三次重复。试验用的土壤为南方水稻土与粗沙按1∶1混合而成。出苗2周后施用0.2％尿素。对健康生长的1个月的植株进行断水直至对照植株叶片全部萎焉(以下午6点观测为准)后的第二天进行复水。复水三天后调查植株的成活率(单株绿叶面积在20％以下的植株通常难以继续存活，视为枯死)。

干旱胁迫试验表明：三种启动子控制的OsLEA1转基因水稻的抗旱性有不同程度的提高(表1)，其中LEAP启动子最为显著，存活率比对照提高74％。另外，以LEAP启动子控制的其它3个抗旱相关基因的转基因水稻的抗旱性也得到非常显著的提高。这些结果说明LEAP启动子在抗旱遗传改良中的不仅效果优于前人报道的SalT启动子，而且可以广泛应用植物抗旱遗传改良。

实施例5、LEAP启动子在其它作物中的应用

为证实LEAP启动子及其OsLEA1基因能广泛应用于其它作物中的抗旱遗传改良。申请人利用载体p1391-LEAP(同本发明的实施例3)和pC1301H构建的OsLEA1基因转化载体(同实施例4)分别在玉米(玉米的遗传转化的代表品种是豫玉22，参见文献：Huang等，High-frequency plant regeneration through callusinitiation from mature embryos ofmaize(Zea Mays L.).Plant Cell Rep.2004，22：793-800)、棉花(棉花的遗传转化的代表品种是华棉101，参见中国发明专利说明书，专利号：ZL 01131087.1)、油菜(中油2号，参见文献：油菜遗的传转化，Wang等，Development of a novel Agrobacterium-mediatedtransformation method to recover transgenic Brassica napus plants.Plant Cell Rep.2003，22：274-281))、番茄(番茄的遗传转化代表品种选用华番1号，参见文献：Park等，Efficient and genotype-independent Agrobacterium-mediated tomato transformation JPlant Physiol，200360：1253-1257)等作物上进行了遗传转化实验。以愈伤为材料的转化过程同实施例3。将获得的转基因抗性愈伤转移到含20％PEG6000(PEG6000是广泛用来模拟干旱胁迫的渗透胁迫试剂，该试剂是从商业上购买的)的培养基(同实施例3中的选择培养基，不含抗生素)上生长。分别在3天测定启动子的被诱导活性和在2周后观察愈伤存活率，结果如表2所示。从表2可以看出，LEAP启动子在以上四种作物中都有非常强的干旱诱导活性(比非胁迫时的活性高出10倍以上)，而且含OsLEA1的转基因愈伤在PEG6000处理后的存活率比对照要高出50％以上，说明LEAP启动子及其基因OsLEA1可以广泛用于作物抗旱性遗传改良。

表2  不同作物的LEAP干旱诱导活性和OsLEA1转基因愈伤组织的抗旱性比较

作物    LEAP干旱诱导活性(GUS活OsLEA1转基因愈伤抗旱性

        性，pmolMU/μg.min)       (％)^*

        胁迫前(0d)   胁迫前(3d)   对照(未转化)   转基因愈伤

玉米    3.20         42.7         11.4           65.2

棉花    4.32         38.5         16.2           58.4

油菜    2.28         36.3         15.7           72.3

番茄    2.73         26.5         13.6           61.7

*统计基于至少300块愈伤，以存活百分数表示。

水稻抗旱基因启动子核苷酸序列表

<110>华中农业大学

<120>利用水稻干旱诱导基因启动子LEAP改良植物抗旱性

<130>

<141>2004-10-28

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2155

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2155)

<223>

<220>

<221>TATA_signal

<222>(1154)..(1160)

<223>

<220>

<221>enhancer

<222>(1120)..(1127)

<223>

<220>

<221>enhancer

<222>(1088)..(1095)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1253)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1289)..(1891)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1234)..(1253)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(2)..(20)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(2136)..(2155)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1276)..(1295)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(2027)..(2040)

<223>

<400>1

aagggcctcc ataacctacg cctagcccta gcacgatgga tggcacagtg cgtgcccatc    60

ctgcatctgc atgggttagt gcgtgctacg ctgcgacggc gacgatcgat gtagcctagc    120

cggtgtgtgc agtgcagtgc aggtcaggat tgccactatg accaaaggat gcttgtgtgc    180

gatcaataat ggccgctcaa tgtgtcatcg tacggtgaca caccactcat cctttgttga    240

tctgtggtga tcgacttgag ttaatcggca aggcccagcc catggtttga ggtcagggcc    300

aggctgaatt tggcccagta attttggttt gagaagccca cttcgtcaca gcgtcaggcc    360

gaattactgg cccatggtga gcccatggca tccattcccc atgattgacc ttgtctttct    420

ctttttctct cgatctcgaa aagatgagca gatactcgta attaaaccgc aaacatctgc    480

cacccatgta atgataacaa tcgttaacaa tgccatgcat ctcccgaagc ttctgtgcct    540

actcatttga gtgcgagacc ttcctaacat gtgtcccctt aacattgttt actccctttg    600

ccgccaaagt ggttactaca cactccaaac ttttgtggca gaagtacact caaaagcgaa    660

aggtagcaga acacatcagg catccaaatt aacaacaaca ccatttacaa tcagacctga    720

acacgttgat cggcgacatc aggcgccgca catggcaacg acacccgatc gatcaccaag    780

tgtaaaaact aaagccgcat ccaacttgta ctcgccaaac agccaccgat cgatcgacgt    840

ttcgatcgcc tgtatcgaca cactgatcga tctgatcatg atcagtttca actcgctgtg    900

cccacgtgtc gagagatcgg cacgtgcctg agctctcagc cgctcataaa tacacttgtt    960

tagtagcaac agtatactat agtagtcctc tcctgtttgg cttttagctt gcatcgatgg    1020

atggatggat ggatcgcatg agagggcttc gcgaaggtac ggaaccttac acaacgcgtg    1080

tcctttctac gtggccatcg tgtaggcgtc tcgccatgct acgtgtcccg gaggatgtct    1140

cgatgccaac ccttataaat actgttccat tccaatccca tcgccacagc cagtgcaaat    1200

ctgatcgatc aagatatcga gcaaaatcca tcagagttct aacattcgcg cgtgaatttc    1260

gaggttaatt ttttgaagct taggatca atg gct tcc cac cag gac cag gct     1312

                               Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala

                               1               5

agc tac cgc gcc ggc gag acc aag gcc cac acc gag gag aag gcg ggg    1360

Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Gly

    10                  15                  20

cag gtg atg ggg gcg agc aag gac aag gcg agc gag gcg aag gac agg    1408

Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg

25                  30                  35                  40

gcg tcg gag gcg gcg ggg cac gcc gcc ggc aag ggg cag gat acc aag    1456

Ala Ser Glu Ala Ala Gly His Ala Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys

                45                  50                  55

gag gcg acg aag gag aag gcg cag gcg gcg aag gag agg gcg tcg gag    1504

Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Gln Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ser Glu

            60                  65                  70

acg gcg cag gcg gcg aag gac aag acc tcc agc acg tcg cag gcg gcg    1552

Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Ser Gln Ala Ala

        75                  80                  85

agg gac aaa gcc gcc gag agc aag gac cag acc ggc ggc ttc ctc ggc    1600

Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly

    90                  95                  100

gag aag acc gag cag gcc aag cag aag gcc gcc gag acc gct ggc gcc    1648

Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala

105                 110                 115                 120

gcc aag cag aag acc gcc gag acg gcg cag tac acc aag gac tct gcc    1696

Ala Lys Gln Lys Thr Ala Glu Thr Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala

                125                 130                 135

atc gcc ggc aag gac aag acc ggc agc gtc ctc caa cag gcg agt gag    1744

Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu

            140                 145                 150

cag gtg aag agc acg gtg gtc ggc gcc aag gac gcg gtg atg agc acg    1792

Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr

        155                 160                 165

ctg ggg atg acc gaa gac gag gcc ggc acc gac gac ggc gcc aac aag    1840

Leu Gly Met Thr Glu Asp Glu Ala Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys

    170                 175                 180

gac acc tct gcc acc gcc gcc gcc gcg gag acg acg gcg agg gat cac    1888

Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Thr Thr Ala Arg Asp His

185                 190                 195                 200

tag acgccgtgaa tgatttccct ttgggtctat ttatgtatgt tttcacttca         1941

aattcggtgc aagtttgaat ttgtttttgt gtcgttttga gtctgtatcg atgctgtatg  2001

aagtggtggt cgtcgcaggg gaggatttct gacgggtgtg ggtgatgtgt actgatgatg  2061

ttcagttgtt ttcgtcagag tttctcgtct gtgttctgtt tattatggcg taacaataat  2121

aaaagtttgg gcctaaagcc cgcatttgtg gttt                              2155

<210>2

<211>200

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys

1               5                   10                  15

Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Gly Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp

            20                  25                  30

Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Ala Ala Gly His Ala

        35                  40                  45

Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Gln

    50                  55                   60

Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys

65                  70                  75                  80

Thr Ser Ser Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys

                85                  90                  95

Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln

            100                 105                 110

Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala Ala Lys Gln Lys Thr Ala Glu Thr

        115                 120                 125

Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly

    130                 135                 140

Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly

145                150                  155                 160

Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Thr Glu Asp Glu Ala

                165                 170                 175

Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala

            180                 185                 190

Ala Glu Thr Thr Ala Arg Asp His

        195                 200

Claims (10)

1、一种分离出的水稻DNA分子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中OsLEA1基因及其启动子LEAP包含序列表SEQ ID NO：1所示的序列中的2155位碱基的核酸序列，该核酸序列编码一个干旱诱导表达蛋白。

2、根据权利要求1所述的一种分离的DNA分子，其特征在于启动区包含两个串连排列的ABRE顺式作用元件TACGTGTC。

3、权利要求1所述的LEAP启动子全部或部分序列构建的植物表达载体。

4、权利要求1所述的LEAP启动子全部或部分序列构建植物表达载体，通过遗传转化培育抗旱植物的方法。

5、权利要求1所述的LEAP启动子全部或部分序列构建植物表达载体，通过遗传转化培育的抗旱植物材料。

6、权利要求5所述的抗旱植物的材料是指植株、种子或细胞无性系。

7、权利要求1所述的OsLEA1基因，其特征在于，序列表SEQ ID NO：1所示的序列的碱基第1288-1291位及其同原性在90％以上，且能被干旱诱导的同源基因。

8、利用权利要求7所述的LEA基因，通过遗传转化培育获得抗旱植物的方法。

9、利用权利要求8所述方法培育获得抗旱植物材料，其中的植物材料包括植株、种子或细胞无性系。

10、权利要求1所述的DNA分子在培育抗旱玉米、棉花、油菜、番茄作物上的应用。

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