CN114480380A

CN114480380A - 启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用

Info

Publication number: CN114480380A
Application number: CN202011155879.9A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 李晓凯; 肖本泽
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN114480380B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用，所述的启动子为SEQ ID NO.1所示。该启动子受干旱诱导，且特异性的指导外源蛋白在水稻根系中表达，OsREP4p启动子用于水稻抗旱遗传改良有较大的应用前景，该启动子可用于构建抗旱相关基因的表达载体，通过遗传转化方法达到控制目标基因组织特异地受干旱上调表达，从而实现水稻抗旱遗传育种的目的。

Description

启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。涉及启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用，本发明的启动子可以将其应用于植物的基因工程中，以达到对植物根系性状遗传改良特别是提高植物避旱性的目的。

背景技术

水稻是世界主要的粮食作物之一，以干旱为首的多种逆境环境正在严重影响着世界的水稻产量。中国的淡水资源非常短缺，且近年来干旱灾害频频发生。在无法改变的外界环境眼前，提高水稻的抗旱性显得尤为重要。水稻的抗旱性主要分为三类，逃旱性、避旱性及耐旱性，而植物的根系在避旱性方面起着关键性的作用。在作物遗传改良的方法上，除了传统的正向遗传外，转基因技术因其较高的改良效率已经逐渐成为作物遗传改良的主要手段。在植物中超量表达逆境应答相关基因来提高植物的抗逆性的报道很多(Hu等，Overexpressing a NAM,ATAF,and CUC(NAC)transcription factor enhances droughtresistance and salt tolerance in rice,PNAS.103:12987-92,2006；Hou等A homologof human ski-interacting protein in rice positively regulates cell viabilityand stress tolerance.106:6410-5,2009；Xiang等Characterization of OsbZIP23 as akey player of the basic leucine zipper transcription factor family forconferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance inrice.Plant Physiol,148:1938-52,2008)，但是由于使用目前主流的组成型启动子通常会对植物产生毒害或者使转基因植株致死等产生负面效应(Wei等Ectopic Expression ofDREB Transcription Factor,AtDREB1A,Confers Tolerance to Drought in TransgenicSalvia miltiorrhiza.Plant Cell Physiol.57:1593-609,2016；Wei等ModulatingAtDREB1C Expression Improves Drought Tolerance in Salvia miltiorrhiza.FrontPlant Sci.Jan 24；8:52,2017)。所以使用组织特异型启动子和逆境诱导型启动子来进行遗传改良成为一种新的趋势。虽然近年来采用组织特异型启动子(Jin Seo Jeong等，Root-specific expression of OsNAC10 improves drought tolerance and grain yield inrice under field drought conditions.Plant Physiol.153:185-97,2010；MarkC.F.R.Redillas等，The overexpression of OsNAC9 alters the root architecture ofrice plants enhancing drought resistance and grain yield under fieldconditions.Plant Biotechnol J.10:792-805，2012；Jin Seo Jeong等，OsNAC5overexpression enlarges root diameter in rice plants leading to enhanceddrought tolerance and increased grain yield in the field.Plant BiotechnolJ.11:101-14,2013；)和逆境诱导型启动子(Xiao等，Over-expression of a LEA gene inrice improves drought resistance under the field conditions.Theor Appl Genet115：35-46，2007；Comparative functional analysis of six drought-responsivepromoters in transgenic rice.Planta.239:47-60,2014.Wei等Ectopic Expression ofDREB Transcription Factor,AtDREB1A,Confers Tolerance to Drought in TransgenicSalvia miltiorrhiza.Plant Cell Physiol.57:1593-609,2016；Wei等ModulatingAtDREB1C Expression Improves Drought Tolerance in Salvia miltiorrhiza.FrontPlant Sci.Jan24；8:52,2017)来进行作物抗性改良的研究均有大量报道，但是一种既具有组织特异性又受逆境诱导的启动子几乎从未有过报道。

本发明鉴定了一个在水稻根系中特异性表达且受逆境诱导上调表达一个未知功能的基因的启动子，通过对该启动子活性分析，可以将该启动子用于抗逆性功能基因在水稻等作物中表达，从而有效地提高植株的抗旱性。

发明内容

本发明的目的是提供了启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用，本发明的启动子启动目的基因特异性的在水稻根系表达，同时受干旱诱导，所述的启动子序列为SEQ ID NO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用，所述启动子的序列为SEQ ID NO.1所示。

以上所述的应用中，优选的，其应用过程包括将SEQ ID NO.1所示启动子与目的蛋白连接后连入植物表达载体。

以上所述的应用中，优选的，应用中的载体用于制备转基因水稻。

以上所述的应用中，优选的，所述的外源蛋白为抗逆蛋白，甚至是抗干旱蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次公开启动子OsREP4p具备干旱诱导的，水稻根系特异性表达的特点，因此利用该启动子，可将抗旱基因转入水稻中，制备抗旱转基因水稻，具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中克隆的OsREP4p启动子序列；

下划线序列为扩增OsREP4p启动子所用的引物序列，阴影显示的是基本启动子元件序列。根系特异性表达元件用实线框表示，干旱应答元件MBS用波浪线表示。

图2为OsREP4基因在水稻品种“中花11”,“珍汕97”和“日本晴”的根系中特异性表达示意图；

其中A为OsREP4基因在水稻品种中花11的根系中特异性表达示意图、B为OsREP4基因在水稻品种珍汕97的根系中特异性表达示意图、C为OsREP4基因在水稻品种日本晴的根系中特异性表达示意图。

图3为本发明构建的DX2181-OsREP4p表达载体；

该载体含潮霉素抗性筛选基因(HRG)，启动子OsREP4p被融合到GUS基因5’端非翻译区。

图4为OsREP4p启动子驱动GUS报告基因的转基因植株GUS染色情况。

图5为OsREP4p启动子控制下的GUS基因在正常及20％PEG模拟干旱胁迫处理下的GUS活性示意图；

CK是DX2181空载体转化的中花11，作为对照家系，GUS-27是DX2181-OsREP4p转化中花11得到的1个转基因阳性家系，4个时间点分别是胁迫0h、3h、6h、12h。

图6为OsREP4p启动子控制下的GUS基因在干旱胁迫处理下的GUS活性；

CK是DX2181空载体转化的中花11，作为对照家系，GUS-27是DX2181-OsREP4p转化中花11得到的1个转基因阳性家系，3个时间点分别是胁迫前D0、叶片微卷D1、叶片全卷D2三个时间点。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，均来源于商业渠道。

实施例1：

OsREP4p启动子分离和鉴定

通过对水稻成熟期干旱及胁迫条件下根系表型性状的全基因组关联分析，在一个控制正常条件下最大根长的位点范围内，发现了一个具有极强的根系特异性表达(信号值达150000)的基因，其TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)ID为LOC_Os04g11040，被命名OsREP4，其对应的BAC克隆号为AP014960，在KOME数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中对应的全长cDNA编号为AK243272。

利用引物OsREP4p-F和OsREP4p-R以“日本晴”基因组DNA为模板进行扩增，引物为

和

反应体系为20uLGC bufferⅠ体系(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TaKaRa公司)，反应条件是：95℃预变性5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min 30sec，33个循环；72℃延伸7min。PCR产物纯化之后连入用Hind III酶切过的DX2181载体上。筛选阳性克隆并用DX2181上的测序引物DX2181-SeqF(5’-CCAACGCTGATCAATTCCACAG-3’)、DX2181-SeqR(5’-CTTGCCGTAGGTGGCATCG-3’)和一条根据该启动子序列设计的中间测序引物OsREP4p-M(5’-TCAAACGTTCGATGTGACAAA-3’)来进行测序(测序在擎科生物技术有限公司[武汉]完成)。测序结果分析证实：所扩增序列为预期的OsREP4p启动子序列(SEQ ID NO.1所示)，其包含一个根系特异性表达元件和多个干旱、胁迫诱导应答顺式作用元件(图1)。

实施例2：

水稻内源基因OsREP4的组织表达谱

以水稻品种“中花11”为材料，对幼苗及其田间生长的全生育期各种代表性组织进行取样。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，利用反转录酶MLV(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5’-TGTTGGAAGTGGCACCTCTGT-3’和5’-CACCCCCATGGTTGCTGTAC-3’)对OsREP4基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长71bp)。同时用引物(5’-GCCCAAGAAGAAGATCAAGAAC-3’和5’-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3’)对水稻Ubiquitin基因做特异扩增(扩增产物长66bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃10sec，95℃5sec，60℃34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。

结果表明该基因在水稻品种“中花11”的苗期根系中表达量远远高于其他组织，倍数约为叶片的1000倍(图2中A)。OsREP4在水稻品种“明恢63”中的表达量数据从CREP(http://crep.ncpgr.cn/)中下载，从结果可以看出，OsREP4在两分蘖期的根中表达量最高，其次在三叶期的根及叶混合样，萌发后的胚芽及胚根的混合样中表达量较高(图2中B)。OsREP4在水稻品种“日本晴”中的表达量数据从RiceXPRO(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)中下载，从结果可以看出，OsREP4仅在生殖生长阶段及营养生殖阶段的根系样品中有很高的表达，Cy3信号密度值达到10⁶，而在其他各种组织中几乎没有信号(图2中C)。以上结果都能说明OsREP4在根系中特异性表达。

实施例3：

OsREP4p启动子根系特异性表达活性及干旱诱导上调表达活性鉴定

本发明的实施方案就是构建OsREP4p启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种“中花11”中，定量地检测OsREP4p启动子的根系特异性表达活性及干旱诱导上调调表达活性。具体操作如下：

首先将实施例1中分离的OsREP4p启动子的PCR产物纯化后直接连接到酶切后的GUS表达载体DX2181(来自CAMBIA公开使用的载体，载体含有GUS报告基因)。酶切验证阳性克隆并测序正确后，通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种“中花11”中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6:271-282)同时将不连接外源片段的DX2181空载体转化水稻品种“中花11”作为对照。

申请人采用构建DX2181-OsREP4p载体(图3)转化水稻“中花11”中，得到转基因阳性植株22株；不连接外源片段的DX2181空载体转化水稻“中花11中”得到转基因阳性植株6株。

选取1个转启动子阳性家系对T1代种子进行潮霉素(HN)抗性筛选发芽，将发芽的苗子种于小方盒中生长至3、4叶期，取整株幼苗置于GUS染液中，在37度烘箱中，约36小时后可观察到样品染色，用75％乙醇进行脱色直到叶片叶绿素完全脱去后，观察拍照。

从染色的情况可以看出，叶片中几乎没有染色，而根中的染色较深，并且染色集中在根的成熟区(图4)。这个结果与之前表达量检测的结果很一致，表明本发明的启动子是水稻根系特异性启动子。

选取1个转启动子阳性家系对T1代种子进行潮霉素(HN)抗性筛选发芽，选取1个转空载体阳性对照家系进行非潮霉素培养基发芽，将发芽的阳性及对照苗子一半种于小方盒内长至3、4叶期做20％PEG模拟干旱处理，另一半种植于沙土中长至3、4叶期进行实际干旱处理。其中PEG处理取0小时，3小时，6小时和12小时后的根及叶片样品，以及对照的根及叶片样品。干旱胁迫的取样为胁迫前d0、叶片微卷d1、叶片全卷d2三个时间点的根及叶片样品。每份样品取的是该家系的混合样(不少于10株)。

样品用液氮磨样，通过GUS抽提液(50mM Na₂HPO4,pH7.0,10mMβ-mercaptoethanol,10mM Na₂EDTA,0.1％Triton-100)抽提总蛋白，从样品中取出一定量的蛋白进行GUS活性定量分析。通过分析荧光结果获得原样品的GUS比酶活。具体步骤如下：通过Bradford法测得样品的总蛋白浓度，再根据浓度用移液器量取一定体积的相同质量的总蛋白，用相同量的总蛋白质提取物+0.4mL GUS提取缓冲液+10μL 40mM底物MUG(4-methylumbelifferyl－β–D-glucuronide)在37℃水浴一定时间(1h以内)后，加入1.6mL反应终止液(0.2M Na₂CO₃)；每个反应设置三个技术重复。用Tecan光栅型酶标仪infiniteM200测量各个样品在激发光365nm，发射光455nm处的荧光值，同时以50nM MU的荧光值作为参比。进而通过以上数据计算出各个样品中GUS蛋白的比酶活，即1μg总蛋白每分钟反应底物MU的量(单位pmol MU/μg protein/min)。

通过GUS蛋白活性定量测量发现，OsREP4p启动子控制下的GUS蛋白活性具有根系特异性且受干旱诱导上调表达。正常条件下，转基因材料根系样品中的GUS蛋白活性是叶片中GUS蛋白活性的50倍左右(如图5)；同时，相比于胁迫前，转基因家系在PEG模拟干旱处理胁迫12小时的根系样品中，GUS蛋白活性上调2倍以上(如图5)。对于沙土中进行的胁迫处理，结论同样存在。因此，OsREP4p启动子控制下的GUS蛋白活性具有根系特异性，在正常条件下转基因材料根系样品中的GUS蛋白活性是叶片中GUS蛋白活性的35倍左右(如图6)且受干旱诱导上调表达，上调倍数约1.3倍(如图6)。

通过超量表达逆境应答相关基因来提高植物的抗逆性的报道很多，而且目前主要使用的是组成型表达的启动子，而组成型启动子通常会对植物产生毒害或者使转基因植株致死等产生负面效应。在这种背景之下，使用组织特异型启动子和逆境诱导型启动子来进行遗传改良成为了一种新的趋势。而本发明提供的启动子OsREP4p具有受干旱诱导及根系特异性的特点，OsREP4p启动子用于水稻抗旱遗传改良有较大的应用前景，该启动子可用于构建抗旱相关基因的表达载体，通过遗传转化方法达到控制目标基因组织特异地受干旱上调表达，从而实现水稻抗旱遗传育种的目的。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatgcagct tacccagctc tacccatgtc ctgtacgtat atacatagca agcttgcaag 60

ccatgggtta tacacttatt acgtacgctt gattgcatgt agctagtatc catatatgta 120

cggttgtggc tctagttgtg gttgcatgat aattcgaaga tgctttgtag tttctacagt 180

gattgtatat ttgtattgct catgtaaaag tgtttaactg tatttaacct catcacgtgt 240

actaatgtta attaattaaa tactgaataa aatttatacg tccctacatg aagggagagt 300

tcttgttttc tcatttgggg agttcttcgt ggtgatcgat cgatttagtt atgttagtag 360

agccatactg ttgctacttg tgaacttgaa tgatctaatt ataaataatt aaatacaaat 420

aaagcatgca attattagac agttgatgga tcaattagtt atattgctgc ttcacgccat 480

agcatctact gatttgcgcc cttctacatt acaatattat accgtacaca gataaaaatt 540

atgatgacca atttgtagtt ccatgcctct tttttttttg catcaattcc aaatatgctt 600

ggataaatat ttacatttca cattaaggac aaattatttt tatcgaggaa agaacagctg 660

agggaagtgc tccccctccg gtagtggact aaattttcat cgtttcatga tctaagggga 720

tgtttagatc caggggtgta aagttttggc gtaccacatc gggtattata cagggtgtcg 780

tatgtggtgt tcgggcacta ataaaaaaat aattacagaa tccgtcagta aaccacgaga 840

cgaatttatt aagtctaatt aatccattat tagcaaatat ttactgtagc accacattgt 900

caaattatgg agcaatttgg attaaaagat tcgtctcgta aattagtcac aatctgtaca 960

attagttata tttttagcct atatttaata cttcatgcaa gtgttcaaac gttcgatgtg 1020

acaaagtgaa aaattttagg gtgggatcta aacaggacct aaatctcgat cttattgctg 1080

cttctgtgat aagaaagttc atatagtgcc agcagaccat tgggaaggga tggggccttc 1140

taatgcgatg ccccctccgt acacaaatat agcaagagat agtattggat tatatacata 1200

ttaatactac gaatctacat gagtagcaaa tattcaagag ttgtgactct gttcattttg 1260

actatcaagc atacacatgg tatatttgta ataatcaaca ggtggtgtaa aaattaatat 1320

ataaattgtt gcattttaat ataacattaa gcaaacgcat aacattataa tagcaatgct 1380

gtgaaatttt ctgaattaat tactaatatt gtagttcggt atgcatatat ttacagttgt 1440

ctatctacct aaaaaccatg aattatacaa gatagacatt tactaacgat gaatatatgt 1500

acatgaagca caaatgtgga gtataaaaca gccataattc tcaaaaaaaa aaaagccatt 1560

cttaccttag tgaataaaca aattaatgat tcgcttgcaa ttaatggatc cgcaattcgc 1620

agtttgatta tggcatgata tatatgcata ttctttcggt catttattca aaaaaacttg 1680

ttcgcaaaat catcagtagt tttgtttttc cagtagtgtc caaataaaaa aaatgataga 1740

aattagtttg tccagagaca acgccactta cctaactgaa aggaccccac ttgcgataag 1800

ttgaattatt atatggtgag atatatatta gccaataagt gatgtgtcat tttaggggta 1860

cagtaaacct tatatctcta atctataata ttaattaatt agataacttt gtaattaacc 1920

acgtatatat attttttact ggttaagtgt ttagtggatg cttaacattt ctgcatttac 1980

ctctatatgc ttagatgtta gatcaactga ccatgacaca ttcagtggcc gattgaaacg 2040

gtcgggttaa agtttaggca ctgatattcc ccaccagtaa ataaaatatt aagttattgc 2100

taagcaaagc ataaaccact aacttagtgg gaaatactat cgctagtgta ggatgatttc 2160

tgcataattt attatttcaa cgacaaagat tgggccacgt agtcaaacga aatctttaaa 2220

attacgatat tatgacttat tttattttaa cttgccacag taaaaagatg aaaatttggg 2280

tgtcattttg cactaactag attctactgg tccaacagaa caaaaggaga acctttaatt 2340

ttacatccca catgaatgtt tttctatact agtgtagcat tcacgagcca tttttttgta 2400

agcttttctc actatataaa gtgtagctga ccgaacccgt agccttcact acacagttga 2460

atccgaacga a 2471

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agatctacag cgctaagctt agatgcagct tacccagctc 40

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgacctgca gccaagcttt tcgttcggat tcaactgtg 39

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaacgctga tcaattccac ag 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttgccgtag gtggcatcg 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaaacgttc gatgtgacaa a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttggaagt ggcacctctg t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacccccatg gttgctgtac 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcccaagaag aagatcaaga ac 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgattgatt taaccagtcc atga 24

Claims

1.SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用。

2.权利要求1所述的应用中的载体用于制备转基因水稻。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的外源蛋白为抗逆蛋白。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的外源蛋白为抗干旱蛋白。