CN104073490A - 一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3，该植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3包含序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物基因工程中。本发明提供的启动子可以在干旱胁迫下特异的启动基因在植物中表达，因此可以用于提高和改善植物在干旱胁迫下的生长特性和环境适应性，从而有效改良水稻农艺性状。

Description

一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物干旱胁迫诱导基因表达启动子及其应用，通过水稻转基因操作，该启动子能够在干旱胁迫诱导条件下驱动目标基因在植株中表达。

背景技术

栽培稻的抗旱性研究一直是稻作科学研究的重要课题之一。随着全球水资源的日益匮乏和灾害的日趋严重，栽培稻的抗旱性研究显得愈来愈重要。水资源短缺成为制约我国农业发展的重要因素，我国21世纪的稻米安全将面临威胁，这对旱稻的快速发展提出了迫切要求。

由于高等生物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。在此过程中基因表达的开启、关闭、表达部位和表达量的高低都将会受到精细的调控，基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制，也是在多阶段水平来实现的。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，是众多转录因子及RNA聚合酶的最终作用靶标，因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义。因此，人们在开发一些新的转化技术如细胞器转化、定向转化等的同时，越来越注重通过控制目的基因的时空表达来达到相应的转化目的。研究者们通过寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子或者是诱导表达启动子来代替组成型启动子，以期更好地调控植物基因表达。

随着人们日益关注水稻的抗旱性研究，水稻的遗传改良的一个重要策略是将来源于水稻或其它植物的抗旱相关基因置于组成型表达或诱导型表达启动子控制之下直接转化水稻。但是，组成型启动子在植物的各组织器官中均有广泛的表达，难以避免转基因植株所造成的食品安全性问题。而利用诱导型表达启动子既可以达到在特定时期(如植株受到干旱胁迫时)、特定组织中特异表达抗旱相关基因，又可以避免组成型表达启动子表达所带来的可能的不利影响，增加转基因的效果。因此，挖掘一些受干旱诱导的启动子在改良作物抗旱育种上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在干旱胁迫诱导条件下表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明的发明人发现了一个受干旱胁迫诱导的水稻基因的启动子，并且对该启动子进行了鉴定。通过启动子活性定量分析表明，可以将该启动子用于抗旱性相关基因在水稻等作物中的表达，从而能有效地改善植株的抗旱能力。

具体而言，一方面，本发明提供一种植物干旱胁迫诱导表达启动子，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)的水稻干旱胁迫诱导表达启动子，本文中称为PosDro3或启动子PosDro3。

优选地，本发明提供的植物干旱胁迫诱导表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即PosDro3或启动子PosDro3。

另一方面，本发明提供一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性；或者，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物干旱胁迫诱导表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物中表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物干旱胁迫诱导表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3，在所述重组表达载体中，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosDro3，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即PosDro3或启动子PosDro3构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-PosDro3。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“taggtgtata tgttgcacga at”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“ca gttcaggtggtagtagcaaa”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得LOC_Os03g22590.1基因上游包括转录起始位点在内的1980bp的DNA序列，并将其命名为PosDro3(序列表中的SEQ IDNo:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在干旱胁迫诱导处理后，在根、茎、叶各组织中的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1980bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻干旱胁迫诱导处理后表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在干旱胁迫诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子PosDro3能够调控基因在干旱处理后集中表达，在实际应用中具有显著价值。利用该启动子对农作物品种进行基因工程改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，将显著提高植物耐旱能力同时避免能量浪费从而实现关键农艺性状的有效改良。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将PosDro3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-PosDro3示意图，其中示出了利用PosDro3启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为将萌发5天后的PosDro3：：gus转基因幼苗，在多层滤纸上干燥3小时，来模拟干旱处理条件，同时以在培养基中正常生长的幼苗为对照。其中A、B、C分别为未进行干旱失水处理的PosDro3：：gus转基因材料的根、茎、叶组织GUS染色状况，表现为均未有着色；而D、E、F则为干旱处理后的PosDro3：：gus转基因材料的根、茎、叶组织GUS染色状况，均表现出明显的蓝色。图中标尺为2mm。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂、耗材原料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的PosDro3启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻PosDro3基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GTCGACTAGGTGTATATGTTGCACGAAT SalI

反向引物：GAATTCTTTGCTACTACCACCTGAACTG EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子PosDro3的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增DNA中的启动子PosDro3，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1980bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子PosDro3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子PosDro3的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子PosDro3片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的PosDro3片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子PosDro3与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-PosDro3(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子PosDro3驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phosphomannose isomerase positive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得52株PosDro3-pCAMBIA1391植株(PosDro3：：gus转基因水稻植株)。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

在多层滤纸上脱水干旱处理24小时后，通过GUS组织染色，检测启动子PosDro3在水稻转基因植株中对GUS的启动活性。结果显示，干旱处理后的PosDro3：：gus转基因水稻植株的根、茎、叶组织经GUS染色后呈现蓝色，而正常生长未处理的对照PosDro3：：gus植株的根、茎、叶组织无染色。结果说明，在干旱条件下，启动子PosDro3能够驱动Gus基因在水稻植株中高水平表达，结果见图3。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (7)

1.一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3，其特征在于，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3，其特征在于，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1-2中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3，在所述重组表达载体中，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3连接于载体中待表达的基因序列的上游；

优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosDro3，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。

5.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro3、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体。

6.一种根据权利要求1-2中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1-2中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。