CN103540592A - 一种水稻胚乳特异性表达启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻胚乳特异性表达启动子，含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子，并且本发明还涉及上述启动子在植物转基因工程中的应用。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物胚乳中特异性表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，特别是单子叶植物或胚乳型双子叶植物，尤其能够驱动外源基因在稻米胚乳中特异性表达，因此可以用于提高和改善稻米的品质，从而培育出理想的、品质更加优良的稻米。

Description

一种水稻胚乳特异性表达启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在胚乳中表达。

背景技术

植物种子不仅贮存有作为人类和动物食用植物蛋白主要来源的大量蛋白质，而且植物种子还可用作生物反应器，用来生产在医疗和工业领域中具有重要价丬的蛋白质。其中，为了控制外源基因在转基因植物种子中高效专一表达，寻找具有种子特异表达特性的启动子或其相关调控序列具有重要意义。

启动子是指基因中一段能准确有效起始转录的DNA序列，通常位于基因上游。启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其它蛋白辅助因子等反式作用因子相互作用从而调控基因在转录水平的表达。近年来，随着人们对种子特异性启动子结构、功能的深入研究，发现了一系列的种子特异性启动子，为研究种子发育以及获得外源基因仅在种子中特异表达的转基因植物奠定了基础。如张世平等研究发现水稻醇溶蛋白4a基因启动子在转基因水稻胚乳中特异表达；Hwang等将水稻球蛋白基因启动子控制的溶菌酶基因导入水稻中，结果发现，溶菌酶在水稻种子中表达，并且表达的溶菌酶占水稻种子中全部可溶性蛋白的13%左右；Datta等分离了一个水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子，并申请了专利保护；Qu等2004年将水稻26kDa的球蛋白启动子和GUS报告基因连接后导入水稻，经检测GUS基因仅在种子胚乳中表达；Minic等研究发现拟南芥α-L-阿拉伯糖苷酶基因启动子为胚乳特异性启动子。

水稻是我国最重要的粮食作物，人们经常食用的大米即为水稻的胚乳。胚乳的形成和发育直接影响着水稻的产量和品质，同时胚乳也是一个优良的重组蛋白表达系统。通过生物技术和基因工程策略可以提高种子中稀有蛋白质、维生素和必需氨基酸的含量，提高稻米的营养价丬和改善稻米的品质，从而培育出品质更加优良的稻米。

如何实现外源基因在转基因水稻中定点、定时、高效表达一直是转基因育种工作者追求的目标。选用具有组织特异性、表达水平高的启动子是实现外源基因在转基因植物特定组织中高效表达的关键。在利用基因工程改良技术改良稻米品质的研究中，除了要具有优良的基因资源及相关的转基因技术外，另一个重要的决定因素是要使相关基因能在水稻种子尤其是胚乳中高效特异地表达并积累基因产物。对此，使用胚乳特异性表达的启动子来指导外源基因的表达是一个十分有效的途径。例如，近年来培育成功的“黄金稻米”、“高铁米”和“芝麻营养米”等都是使用了水稻本身来源的谷蛋白GluB-1等胚乳特异性高效表达启动子。因此，分离并鉴定水稻胚乳特异性高表达启动子是开展基因工程改良稻米品质的首要环节之一。

筛选和分离一些具有组织专一性、高表达水平的启动子以及分析有关重要特异性调控元件的功能，在基因工程研究中有着广泛的用途。胚乳是粮食作物营养的最重要组成部分，因此分离胚乳特异性强表达启动子对植物品质的改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻胚乳中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子，所述启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）的水稻胚乳特异表达启动子，本文中称为pENP1或启动子pENP1。

优选地，本发明提供的所述启动子其序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者优选地，所述启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者进一步优选地，所述启动子的核苷酸序列能够与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交。这些启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物胚乳中特异性表达。

根据本发明的具体实施方案，本发明提供的启动子的DNA序列为SEQID No:1所示的序列，即pENP1或启动子pENP1。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物胚乳特异性表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含根据本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子；

优选地，所述重组载体为重组表达载体；进一步优选地，在所述重组表达载体中，本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子可操作地连接于待表达的基因序列的上游。

根据本发明的具体实施方案，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即pENP1或启动子pENP1构建与pCAMBIA1381中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1381-pENP1。

并且，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物胚乳特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。其中所述培育转基因植物，是将本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子可操作地连接于待表达的基因序列上游（例如，所述启动子与目标基因融合），并构建在重组表达载体中，经转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于改良植物品质和积累的基因以及植物营养吸收相关的基因。

并且优选地，所述应用为用于改良植物胚乳性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；更优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1381-pENP1，以用于改良水稻胚乳形状。

本发明的具体内容如下。

本发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的2091bp的DNA序列,并将其命名为pENP1（序列表中的SEQ ID No:1，+1位置处为转录起始位点）。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1381上，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对较低，仅在胚乳处显蓝色，从而证明该2091bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻胚乳中特异性表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动靶标基因在胚乳中的特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物胚乳中的表达量，增加转基因的效果，减轻外源靶标基因由于过量表达而对作物性状的影响。

本发明的技术效果表明，所克隆的水稻启动子pENP1能够调控基因在胚乳中集中表达，在实际应用中具有显著价丬。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在胚乳中特异性表达，可以提高种子中稀有蛋白质、维生素和必需氨基酸的含量，提高稻米的营养价丬和改善稻米的品质，从而培育出品质更加优良的稻米。

因此，该启动子在转基因作物开发中，可以提高和改善稻米的品质，从而培育出理想的、品质更加优良的稻米，由于其具有在胚乳中特异性表达的特征，可用其代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1A-1B为将pENP1启动子构建于pCAMBIA1381载体质粒中的示意图，其中图1A为pCAMBIA1381示意图，图1B为pCAMBIA1381-pENP1示意图，其中示出了利用pENP1启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2A-2C为利用pENP1启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus染色结果，其中图2A为Tnos：：gus转基因水稻植株，图2B示出了正对照CaMV35S：：gus转基因水稻植株，图2C示出了pENP1：：gus转基因水稻植株，各图中的A表示根，B表示茎，C表示叶，D表示叶鞘，E表示叶枕，F表示花，G表示种子，H表示胚乳横切面；

图3为酶切验证的示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1含有酶切位点的pENP1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare）全基因组序列，依据水稻pENP1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1381（图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No:2）5’端带HindIII，酶切位点（AAGCTT），反向引物（SEQ ID No:3）5’端带E.coRI，酶切位点（GAATTC），引物序列如下：

正向引物：AAGCTTGTCGCTTCACCTACCGCCAAGT    HindIII

反向引物：GAATTCATGACCGGACAAGCACCACCAC    E.coRI由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子 pENP1 的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、正向引物扩增启动子pENP1，按常规PCR体系，扩增程序采用如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2091bp，连接到PGEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和E.coRI进行双酶切验证，如图3。经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子pENP1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

实施例2植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从实施例1获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和E.coRI双酶切，回收启动子pENP1片段。同时HindIII和E.coRI线性化处理、回收pCAMBIA1381，将上述的两个片段用T4连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子pENP1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381-pENP1（图1B），利用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），提取阳性质粒，用HindIII和E.coRI进行酶切验证如图3。

对照：转CaMV35S：gus作为正对照，同时以Tnos：gus作为负对照。利用冻融法将表达载体pCAMBIA1381转入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105，操作步骤及验证同pCAMBIA1381-pENP1的转化方法。

实施例3利用启动子pENP1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%）溶液浸泡种子40min（150r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11d后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5d后用于农杆菌转化。

采用实施例2中转入了3种重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan（Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughputprotocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannoseisomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant CellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.）等的方法。

共获得46株pENP1-1381植株（pENP1：：gus转基因水稻植株），28株35S-1381植株（CaMV35S：：gus转基因水稻植株）和32株Tnos-1381植株（Tnos：：gus转基因水稻植株）。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24h。脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

通过GUS组织染色，检测启动子pENP1在水稻转基因植株中对GUS的启动活性。结果显示，正对照CaMV35S：gus转基因植株的根、茎、叶各组织均有明显染色；而负对照Tnos：：gus转基因水稻植株各组织中，均未检测到Gus基因的活性；pENP1：：gus转基因水稻植株的根经GUS染色后呈现蓝色，且染色与正对照CaMV35S：gus的转基因植株的根部位染色程度相当，而在地上部分组织染色微弱。结果说明，启动子pENP1能够驱动Gus基因在水稻根中特异性高水平的表达。结果见图2A至2C。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种植物胚乳特异性表达启动子，其特征在于，所述启动子包含SEQID No:1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子，其特征在于，所述启动子的序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；

或者，所述启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；

或者，所述启动子的核苷酸序列能够与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交；

优选地，所述启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

3.一种包含根据权利要求1或2所述的植物胚乳特异性表达启动子的表达盒。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含根据权利要求1或2所述的植物胚乳特异性表达启动子；

优选地，所述重组载体为重组表达载体；

进一步优选地，在所述重组表达载体中，根据权利要求1或2所述的植物胚乳特异性表达启动子可操作地连接于待表达的基因序列的上游；

更优选地，所述待表达的基因为Gus基因；

再优选地，所述重组表达载体为pCAMBIA1381-pENP1。

5.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含根据权利要求1或2所述的植物胚乳特异性表达启动子、根据权利要求3所述的表达盒、或根据权利要求4所述的重组载体；

优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

6.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含根据权利要求1或2所述的植物胚乳特异性表达启动子、根据权利要求3所述的表达盒、根据权利要求4所述的重组载体、或根据权利要求5所述的宿主菌。

7.根据权利要求6所述的转化子，其特征在于，所述转化子为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

8.根据权利要求1或2所述的植物胚乳特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述培育转基因植物，是将根据权利要求1或2所述的植物胚乳特异性表达启动子可操作地连接于待表达的基因序列上游，并构建在重组表达载体中，经转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

10.根据权利要求8或9的应用，其特征在于，所述应用为用于改良植物胚乳性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；

优选地，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为pCAMBIA1381-pENP1。

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