CN105296484A - 植物胚乳特异强表达启动子pENP4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胚乳特异强表达启动子pENP4及其应用。本发明分离到一个可在植物胚乳中特异性强表达的启动子。所述的启动子可指导目的基因在植物胚乳中特异性高表达，而在植物的其它组织中低表达或不表达。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体，以及获得相应宿主菌和转化子的方法并将其应用于植物基因工程中。该启动子对于水稻胚乳相关的研究具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景，可以与对胚乳具有改善功能的基因配合使用改善水稻胚乳的各方面性状。

Description

植物胚乳特异强表达启动子pENP4及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻胚乳特异表达启动子pENP4及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因的表达。

背景技术

水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而，利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着极其重要的意义。将现代生物技术应用到水稻品种改良中，可以解决一些常规方法难以解决的问题。自九十年代以来，水稻生物技术取得了很大的发展，一些控制重要农艺性状基因的相继分离和水稻转基因技术的不断完善为用基因工程技术来改良水稻品种奠定了良好的基础。

概括来讲，植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能大致可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织器官特异型启动子。这种分类大体上反映了它们各自的特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。所谓组织特异型启动子是指除具有一般启动子的结构外，通常还有增强子和沉默子的一般特性。在组织特异型启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并常常表现出发育调节的特性。这些启动子的调控往往受到组织细胞生理状态和化学物理信号等物质的诱导，还受到发育阶段的调控，其表达是多种因子相到作用的结果。

目前，植物基因工程中常用35S启动子构建工程质粒，该启动子能使外源基因在双子叶植物中获得较高的表达。然而35S启动子在单子叶植物中驱动基因表达的能力不强，并且它驱动的表达无明显的组织与器官专一性。

高产水稻品种目前所存在的一个普遍问题就是食味品质较差，而引起食味品质差的主要原因是米粒的直链淀粉含量偏高。水稻种子胚乳中的淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉两种，不同水稻品种稻米胚乳中的直链淀粉含量有所不同，籼稻品种一般为20％～30％，粳稻品种为15％～22％，糯稻为0～2％。直链淀粉含量偏高则往往会使饭质变硬、口感差。

Khush等于1984年在Genetics中报道，水稻第3条染色体上的水稻蜡质基因(Waxy基因)控制着胚乳中直链淀粉的合成。该基因编码结合于淀粉粒上的淀粉合成酶，从而控制水稻花粉、胚乳和胚囊中直链淀粉的合成，是影响水稻胚乳中淀粉组成的一个关键基因。由于该基因只在水稻的花粉、胚乳和胚囊中高效表达，因此它是时空专一性表达的基因。

胚乳是粮食作物营养的最重要组成部分，分离胚乳特异性强表达启动子对植物品质的改良具有重要的意义。

但是，目前所公开报道并且能够投入到研发和生产中使用的胚乳特异性启动子很少，难以满足需要。

发明内容

因此，本发明希望从水稻基因中分离出能在水稻胚乳中专一性表达的启动子和表达调控元件，以用于在单子叶植物、特别包括水稻在内的粮食作物中指导外源基因表达。本发明希望提供一种驱动外源基因在水稻胚乳中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种胚乳特异性强表达启动子pENP4，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4提取自水稻属植物，优选地，提取自日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)，本文中称为pENP4或启动子pENP4。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1942bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻胚乳中特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。

本发明还包含该DNA序列的各种变体。具体而言，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4包含：

1)序列表中所示的DNA分子

2)在严格条件下与1)中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有70％-75％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

4)与1)或2)限定的DNA序列具有75％-80％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

5)与1)或2)限定的DNA序列具有80％-85％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

6)与1)或2)限定的DNA序列具有85％-90％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

7)与1)或2)限定的DNA序列具有90％-95％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

8)与1)或2)限定的DNA序列具有95％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

9)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

10)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中去除一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

11)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。

这些水稻胚乳特异性强表达启动子序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基因在水稻胚乳中特异性表达。

优选地，本发明提供的水稻胚乳特异性强表达启动子的DNA序列为SEQIDNo:1所示的序列，即pENP4或启动子pENP4。

另一方面，本发明提供扩增所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4的全长或其任意片段的引物对。

另一方面，本发明提供所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4的应用，其特征在于，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4用于构建重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

此外，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4还可以用于构建转化子。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

另一方面，本发明提供所述水稻胚乳特异性表达启动子pENP4在培育转基因植物中的应用，所述应用包括：(1)将根据权利要求1中任意一项所述的水稻胚乳特异性表达的启动子pENP4与目标基因相连接，并转化至载体中，从而构建重组表达载体；(2)将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

优选地，所述应用用于改良植物胚乳的生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦。

优选地，所述应用包括利用冻融法将所述重组表达载体转入根癌农杆菌EHA105。

优选地，所述应用包括将转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得包含水稻胚乳特异性表达的启动子pENP4和目标基因的转基因水稻植株。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻胚乳特异性强表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻胚乳特异性强表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选的，所述待表达的基因为具有改善胚乳性状功能的基因，比如抑制直链淀粉合成的基因。在一种实现方式中，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-pENP4，该重组表达载体为将SEQIDNo:1所示的序列即pENP4或启动子pENP4构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-pENP4。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQIDNo:1中相同)：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列 为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)pENP4基因上游包括转录起始位点在内的1942bp的DNA序列，并将其命名为启动子pENP4。将该序列经酶切后连接到植物

双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织化学染色检测发现，代表报告基因Gus活性的蓝色仅出现于成熟种子的胚乳细胞中，表明pENP4启动子仅在胚乳细胞内强表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的胚乳部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，避免不必要部位表达带来的物质能量浪费，有效改良水稻的特性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子pENP4能够调控基因在水稻胚乳中特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株胚乳中集中表达，可以提高和改善水稻的生殖和产出特性，从而培育出理想的转基因植物品种，比如，可以培育出高产、耐病虫害的水稻。本发明的启动子可以与抑制直链淀粉合成的基因结合使用，使种植出的稻米口感更好。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将pENP4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-pENP4示意图，其中示出了利用pENP4启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

图3为成熟植株(90天)的根(a)、茎(b)、叶(c)、带壳的成熟种子(d)及其纵截面(e)和横截面(f)。代表报告基因Gus活性的蓝色仅出现于成熟种子的胚乳细胞中，表明pENP4启动子仅在胚乳细胞内强表达(标尺＝2.5mm)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的pENP4启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻pENP4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQIDNo:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQIDNo:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTGTGGCGGTGAGGAAGAGACTGCHindIII

反向引物：GAATTCCTATTGGTGGTTTTATATATAGEcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子pENP4的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子pENP4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1942bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子pENP4，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子pENP4的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和EcoRI酶切，回收启动子pENP4片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的pENP4片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子pENP4与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-pENP4，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子pENP4驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得pENP4::Gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(YongboDuan,ChenguangZhai,etal.Anefficientandhigh-throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedonphOsphomannOseisomerasepOsitiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.)[J].PlantCellReport,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色

将转化pENP4启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、种子分别进行Gus染色：将各组织分别浸于Gus染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录Gus染色的结果。结果如图3所示(由于专利文本中图片需为黑白图片，因此，发明人将彩色图转为灰度图，不过从图中阴影仍然可以分辨出染色的结果，图a中的阴影是由于自身颜色，与图e、f中的染色结果明显不同)，Gus基因只在转基因水稻的胚乳中有很表达，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色；而在其它各器官(根a、茎b、叶片c和种壳d)中，基本没有检测到Gus基因的表达。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株的胚乳中指导其下游的Gus蛋白表达，这种表达具有胚乳组织表达特异性。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (11)

1.一种植物胚乳特异强表达启动子pENP4，其特征在于，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4提取自水稻属植物，优选地，提取自日本晴水稻。

2.根据权利要求1所述的植物胚乳特异强表达启动子pENP4，其特征在于，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4包含：

1)序列表中所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有70％-75％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

4)与1)或2)限定的DNA序列具有75％-80％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

5)与1)或2)限定的DNA序列具有80％-85％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

6)与1)或2)限定的DNA序列具有85％-90％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

7)与1)或2)限定的DNA序列具有90％-95％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

8)与1)或2)限定的DNA序列具有95％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

9)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

10)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中去除一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

11)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。

3.扩增权利要求1所述的植物胚乳特异强表达启动子pENP4的全长或其任意片段的引物对。

4.根据权利要求1所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4的应用，其特征在于，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4用于构建重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4用于构建转化子。

6.根据权利要求1中所述的水稻胚乳特异性表达启动子pENP4在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：(1)将权利要求1所述的水稻胚乳特异性表达的启动子pENP4与目标基因相连接，并转化至载体中，从而构建重组表达载体；(2)将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物胚乳的生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括利用冻融法将所述重组表达载体转入根癌农杆菌EHA105。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括将转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得包含水稻胚乳特异性表达的启动子pENP4和目标基因的转基因水稻植株。

10.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1391的多克隆位点插入权利要求1所述的植物胚乳特异强表达启动子pENP4得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述植物胚乳特异强表达启动子pENP4连接于载体中待表达的基因序列的上游。

11.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的植物胚乳特异强表达启动子pENP4。