CN103849621A - 一种植物冷诱导表达启动子Poscold1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物冷诱导表达启动子Poscold1及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以在冷诱导的条件下启动外源基因在植物中表达，适用于任何植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株中诱导表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性，从而培育出理想的耐冷水稻品种。

Description

一种植物冷诱导表达启动子Poscold1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物冷诱导基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中在冷诱导条件下驱动目标基因在植株中表达。

背景技术

水稻起源于热带亚热带地区，是世界上一种重要的粮食作物。水稻从种子发芽到成熟的整个生长发育期间都可能受到低温冷害，具体表现为种子发芽不良、生长发育受抑制或拖延、减数分裂期和花粉形成期低温引起不育、开花期的拖延和受精不良、结实率下降等。其中苗期冷害会使植株枯黄、分蘖减少，严重时可引起植株生长发育迟缓，进而导致减产或绝收，所以低温会破坏性地降低其产量。因此，解决水稻冷害问题对于世界食物安全、促进水稻产区的经济发展具有十分重要的现实意义。随着分子生物学和基因组学的发展，现代生物技术开始广泛用于水稻等粮食作物的遗传改良。

随着耐冷基因研究的不断深入和耐冷相关基因的克隆，水稻的转基因研究也在不断的进行中。仲康等（2007）将锌指蛋白类似蛋白OsCOIN基因在水稻中过量表达使转基因水稻中脯氨酸含量升高，提高植物的耐冷性。张红生等（2009）将水稻锌指蛋白ZFP245基因在水稻中过量表达，发现超量表达ZFP245基因水稻在冷胁迫下使脯氨酸积累相关基因OsP5CS和脯氨酸转运基因OsProT基因的表达量提高，促使脯氨酸的量增加，增强植物的耐冷性。余淑美等（2010）发现MYBS3超量表达水稻能在4℃条件下处理后可以存活，且不影响其主要农艺性状。另外，对一些包括DREB/CBF、NAC等转录因子的过量表达可以提高水稻的耐冷性。

目前，植物耐冷基因工程迫切需要解决的问题就是需要更广泛的种子资源，寻找更多的耐冷基因，而采用植物基因工程技术手段提高植物的耐冷能力是耐冷研究的重要途径。

我国水稻资源丰富，从水稻种发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷诱导启动子，将对水稻生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在冷诱导条件下特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物冷诱导表达启动子Poscold1，所述植物冷诱导表达启动子Poscold1包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）的水稻冷诱导表达启动子，本文中称为Poscold1或启动子Poscold1。

优选地，本发明提供的植物冷诱导表达启动子的DNA序列为SEQ IDNo:1所示的序列，即Poscold1或启动子Poscold1。

另一方面，本发明提供一种植物冷诱导表达启动子Poscold1，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述植物冷诱导表达启动子Poscold1为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物冷诱导表达启动子Poscold1具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物冷诱导表达启动子Poscold1序列与SEQ IDNo:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在冷诱导条件下在植物中特异性表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物冷诱导表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物冷诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1381-Poscold1，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即Poscold1或启动子Poscold1构建于pCAMBIA1381中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1381-Poscold1。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物冷诱导表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物冷诱导表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物冷诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物冷诱导表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No：1中相同）：

CAGTACTTATTAGGAGCATTACAGCACCATAGTCACTAACCAAGATGTTCTTAAACTTCTAATAAAACTGCATCCCCTTCTCAGGGAGTAAAGAAAAGCAAGCAAGCCTACTCAAGCACTTGGTCACAAGTTAGAGCAGCATTAATTTGAAACTATTATTGAAATGGCATCATATTATATAATGTAAAAATGCCAGCTAGTTCCTCTTTCATTTCTGTCTCCTGTGTCAAAACACAATTTATTTTCAACTCCATTACTTGCAGACAACAGGCTCACCAACTATCAGATAGATTGGTAAAAGAAAATACAACAGTTTATAGACCATCGCAGTTGAATGTGAATATAATACATGGTGTGGGGGATCAAGAAATTGCATAGTGCTGTAACCACCTGTAACTACAATGCTTCCTAGCTAAATTCATTCCTCAATACAACTATAAAATAGGACAAAAATGGCACCCATATATTACAAATATCTACTTGACTGGTTCTCTGAAACAAGCGTACCGTGCATTCAAAGCCTACAACACTACTGCGCATACTGACTGAAACAACAATAGTAGAAACTAGTCCAGCTTAAGAAGAGAGAAAAAACTTACTGCTCTATCTGGTACCCCTGGTGGTCCATCAAGCACCTTTATGCGAGCTCTGGACTCCTCACACATTTTCTTGATAAACTCCCCTTTTCGGCCAATGACAGCGCCCACTTTTTGGGCTGGAACAAGTATACGGAACACACTTTCTCCAGGCCAACCTGGCCATTTCTTCTCATCAGTTACTGCATTGGCCTGCTGCTCTCCCTGAGCTTCTCCACCATAGGCATGCCCTTCTTCTGAGGGGATAGCTTGGTCCTCTTCATGCTGATGCCCCACATTTCCATCATTTATGTTCACCTGATCTTCATTGTATGGGATCCCTGATTCTTCATAGCTTGAGTCTTTGGTTTCTTCGTCATATGTATTTTCTGGATCTTCCTTGTACTGCTCAGGCACATCACTGAGAGGAATCGCCTGCTCCTCATTATCAAGATTACTGGCAATCCCACTCATGTCCTCCGCAGGATTCTCGATGTTCCCATCCATATTTTCTGGAAACACACAACATAGACCATGTCAAGTAACACAAAACTGAAGGTGAGATGCTTCTCGGGCAGAAGTGCAGCATAAATTGTAGCAACAGGTGGCTCGCGTAATGCTTTGCGAGGGGCACAGCTCGCACGGAACAATACCAGATGGGGGCAACCCGCTTCCTGCACCAATCTAACTGTGGACTACACGAAAACCCCCAAGTTATTTCTACTCCGGATCCACCTAGATAAAGCTCAGCGCAACGCACAAACCCCTAACACCACAGCAAACTCGTCATAAGCGAGTGAAAAGAAAAAATCAGCCACGAGCCCCATAAACCCTAAATCGAGAGCAGAGCCGCGCCCCCACCACGACGCGAGCGGGCGCATCCAAGCTACACCTCCCGCGGCTACAGCGCGAGTACCACACGGCACAGGAGAACGAGGCCTACAGCGCAAGCAACCAATCTCCGGGCGGGTCGGCGGCGAGCTCTCCGCCGCAGCTACGCTAGACCCGCCCGCACCACCAAAGCTACGGATTCACCGGGAAGTAGATGCCGAGCGAAAGCGCGCTCACCTCACGGAGGAAGAGGACGAGGCCTCGCCAGAGAGGGAGTCCCGCCGCCGCCGCCGTGGAGGGTTTTGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGCACGGGAGCCGTGCGGATTTGGGAGGAAAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGGCTTGGTTGCCTCCTCGGTTTGATTTAACCTGGCTACTCCCACCAGCCCATGGGCCTCACGTTCGCCCACTCCTGGGCCCAGCCCATCCATATACCGGCCCACCGCTGCCAGGTGGGCCTCACTCCCCACCGTGCGCGGCCGCGGGCCCCACCGAAGAAACACCACACTCCCGTGACTCGTGTCGTCGTCTTCCTCGTCACCGCCACTGCCGTCGCGTCGTCTCCAACCTCCTCGCCTTCGCCTCCACCCAGCCATGGCGACGAGCGCCGCCGCGCG

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的2099bp的DNA序列，并将其命名为Poscold1（序列表中的SEQ ID No:1）。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1381上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在冷诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该2099bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻冷诱导处理后特异性表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后，在冷诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。本发明所提到的冷诱导指的是对植物施加低于其正常生长的环境温度的温度（例如，对于水稻而言，4摄氏度），从而通过本发明的启动子诱导目标基因表达。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子Poscold1能够调控基因在冷诱导条件下在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的耐冷转基因植物品种（只需将本发明实施例中所采用的待表达基因换成耐冷基因即可）。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将Poscold1启动子构建于pCAMBIA1381载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1381示意图，图1中B为pCAMBIA1381-Poscold1示意图，其中示出了利用Poscold1启动子驱动位于其下游的gus基因表达；

图2为冷诱导处理图片，图中左侧为对照（未采用冷处理的结果），右侧是4℃冷处理24小时后的染色结果。

图3为将萌发5天后的Poscold1：：gus转基因幼苗，放在4℃条件下分别处理4小时和24小时,来模拟冷处理条件的处理结果，以及将同样的转基因幼苗放在常温水中的处理结果，以作为对照。

图4为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的Poscold1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare）全基因组序列，依据水稻PCole1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1381（图1A，来自于CAMBIA，为公开使用载体，在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No:2）5’端带E.coRI，酶切位点（GAATTC），反向引物（SEQ ID No:3）5’端带HindIII，酶切位点（AAGCTT），引物序列如下：

正向引物：GAATTCTGACTTAGTAATGATAACAACA E.coRI

反向引物：AAGCTTGCCCGCGAGGGCAGCGAGGAAG HindIII

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子Poscold1的获得

以水稻品种日本晴的DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子Poscold1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，执行35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2099bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用E.coRI和HindIII进行双酶切验证，如图4所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Poscold1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子Poscold1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用E.coRI和HindIII双酶切，回收启动子Poscold1片段。同时利用E.coRI和HindIII对pCAMBIA1381进行线性化处理、回收pCAMBIA1381，将上述的Poscold1片段和pCAMBIA1381片段用T4连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子Poscold1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381-Poscold1（图1中的B），利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用E.coRI和HindIII进行酶切验证，验证结果如图4中所示。

利用启动子Poscold1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%）溶液浸泡种子40min（150r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan（Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phosphomannose isomerase positive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.）等提出的方法。

共获得37株pCAMBIA1381-Poscold1植株（Poscold1：：gus转基因水稻植株）。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

在4℃冷诱导条件处理24小时后，通过GUS组织染色，检测启动子Poscold1在水稻转基因植株中对GUS的启动活性。结果显示，Poscold1：：gus转基因水稻植株经GUS染色后呈现蓝色，而对照植株无染色。结果说明，在冷诱导条件下，启动子Poscold1能够驱动Gus基因在水稻植株中高水平表达，结果见图2。

另外，在4℃条件下，对水稻转基因植株分别冷处理4小时和24小时后，将样品用液氮速冻后提取RNA，以actin基因为内参，用RT-PCR来检测Gus基因在转录水平上的相对表达量，进而来反映该启动子的冷诱导活性。结果显示，Gus基因的表达量是未经处理转基因植株的6.5和7.8倍，因此说明，该启动子经4℃条件冷诱导后，特别是在冷诱导处理24h后诱导活性达到最高值，结果见图3。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种植物冷诱导表达启动子Poscold1，其特征在于，所述植物冷诱导表达启动子Poscold1包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1，其特征在于，所述植物冷诱导表达启动子Poscold1的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1，其特征在于，所述植物冷诱导表达启动子Poscold1的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；

或者，所述植物冷诱导表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；

或者，所述植物冷诱导表达启动子Poscold1具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。

4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导表达启动子Poscold1连接于载体中待表达的基因序列的上游；

优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1381-Poscold1，其中pCAMBIA1381为植物双元表达载体。

6.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。

7.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体、或者权利要求6所述的宿主菌。

8.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold1连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。

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