CN105087590B - 一种启动子元件POsCold8及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种启动子元件POsCold8及其使用方法和应用。该启动子元件特别适合驱动外源基因在冷诱导条件下表达。此外，本发明还提供一种构建物，一种表达盒，一种载体，一种利用启动子元件构建相应宿主细胞的方法。此外，本发明提供了一种构建对寒冷环境具有特异性响应功能的水稻品种的方法，一种制备转基因水稻的方法以及一种获取水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎的方法。这些扩展都是基于本发明的启动子元件进行的。含本发明启动子的转基因水稻可以在冷诱导条件下特异性地改善水稻的农艺性状，具有广阔的应用和市场前景。本发明提供的启动子可以在冷诱导的条件下驱动外源基因在植物中表达，可以提高和改善水稻的生长特性，培育出理想的耐冷水稻品种。

Description

一种启动子元件POsCold8及其使用方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种启动子元件POsCold8及其使用方法和应用，该启动子元件能够在水稻转基因调控体系中有条件地驱动目标基因的表达。

背景技术

水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而，利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着极其重要的意义。将现代生物技术应用到水稻品种改良中，可以解决一些常规方法难以解决的问题。自九十年代以来，水稻生物技术取得了很大的发展，一些控制重要农艺性状基因的相继分离和水稻转基因技术的不断完善为用基因工程技术来改良水稻品种奠定了良好的基础。

冷胁迫包括冷害和冻害。是指最适温度下限温度的环境对植物的伤害。是众多环境胁近中对水稻影响尤为突出的一种。芽期、苗期、幼穗期、抽穗期是水稻对低温敏感时期，苗期遇到冷胁迫时生长缓慢，叶片外观症状表现为秧苗青枯或黄枯，卷曲甚至死亡。在长期进化过程中，植物形成了复杂的途径来感知外界信号进而通过相应的生理变化来应答环境胁迫。这是一个多系统的综合生理过程，不仅受环境影响，也受物种本身遗传基因的控制。

近年来，随着分子生物学的发展，在水稻耐寒性理论的研究方面取得许多进展，包括一些关键的耐冷相关基因或QTL相继被克隆。利用这些关键基因，可以有效提高植物对低温的耐受性。但目前的基因工程操作中，大部分是利用组成型启动子驱动这些关键基因的表达，所获转基因植株虽然能够表现出较强的低温耐性，但组成型启动子往往会带来一些不必要的表达，比如造成植株矮小，发育延滞和物质能量浪费，不利于潜在的实际应用推广。因此，利用冷诱导启动子，特异的激活关键调控基因，将在植物抗冷基因改良中起到重要作用。

因此，植物耐冷基因工程迫切需要解决的问题就是要寻找更广泛的种质资源，包括耐冷基因和相关启动子，从而达到充分挖掘植物本身潜在的耐冷能力的目的。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离鉴定本底信号低、诱导系数高的新型启动子或启动子元件，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种所述启动子元件选自下组：

(a)核苷酸序列包含SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性大于等于80％，优选大于等于85％，更优选大于等于90％，更有选大于等于95％，更优选大于等于≥98％，且具有在低温诱导条件下特异性表达活性的多核苷酸；

(c)在SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1～60个，较佳地1～50，较佳地1～40，较佳地1～20，更佳地1～6个核苷酸，且具有在低温诱导条件下特异性表达活性的多核苷酸。

b)和c)中水稻冷诱导表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同的功能，即在冷诱导条件下驱动目标基因在植物中表达。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的水稻冷诱导表达启动子，本文中称为POsCold8或启动子POsCold8。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列，具有驱动目标基因在冷诱导条件下表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。

优选地，本发明提供的启动子元件POsCold8的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即POsCold8或启动子POsCold8。其可以用作水稻冷诱导表达启动子。

另一方面，本发明提供一种构建物，其特征是，所述构建物含有目的基因以及与目的基因可操作连接的所述启动子元件。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征是，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：所述启动子元件、基因ORF序列和终止子。

另一方面，本发明提供一种载体，其特征是，所述载体含有所述启动子元件或所述表达盒。

另一方面，本发明提供一种利用所述启动子元件构建相应宿主细胞的方法，其特征是，所述方法包括将所述启动子元件导入宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为根癌农杆菌细胞。

另一方面，本发明提供所述启动子元件、所述构建物以及所述表达盒的用途，其特征是，所述启动子元件、所述构建物以及所述表达盒用于提高水稻的耐寒性能。

另一方面，本发明提供一种构建对寒冷环境具有特异性响应功能的水稻品种的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一种构建物，所述构建物含有目的基因以及与该目的基因可操作连接的所述启动子元件；

(b)将步骤(a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；

(c)将步骤(b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而构建出对寒冷环境具有特异性响应功能的水稻品种。

另一方面，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有所述载体、或其染色体整合有所述启动子元件、或其染色体整合有所述表达盒；

(b)将(a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。

另一方面，本发明提供一种获取水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎的方法，其特征是，所述方法包括：利用PCR扩增方法对日本晴水稻DNA中权利要求1所述的启动子元件进行扩增；

扩增获得的DNA序列利用T4连接酶与含有目的基因的预定载体相连接，获得相应重组载体；

利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌；

采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法利用所述根癌农杆菌将权利要求1所述的启动子元件以及目的基因转入水稻细胞；

利用所述水稻细胞培养水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎。

另一方面，本发明提供一种所述启动子元件在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括将所述启动子元件连接于载体的待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述应用用于改良植物耐寒，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦；所述待表达的基因为耐寒基因。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同)：

TTTATTTTTTTTCAGGTATGCCATCACAAAAGCCTTTTGTGTTGCTTTTCTGATGACATTCTTCTCTGTATTCGACGTTCCTGTCTTCTGGCCAATACTTCTCTGCTATTGGGTTGTGCTTTTTGTCCTGACAATGAAGCGGCAAATTGTGCATATGATAAAGTACAAGTATGTCCCATTCAGCATAGGAAAGCAGGTGAGATCATTATGATATGTATGCATAGTTGATAGTGTTTTCTTCTGCCATTTGGAAGTTCAGTAGTTCATACTGCACCATATGTTAATCTTCCAAGTGGCCATTACTTTGTGTATTTGGTCCTAGTCATGATAGCTGTCTTGGGGGCAGTAAAAATTAGAAAGGCCCTTTATTTGCAATTGCATTGGGGGCTTGTCAGAGTTACATCCCTAGTACCTTCTGATTAAGTTTGTACTTACTGCACTAAGATTCAAGAGTAAATCATATGTTATGAGTAGGAGCTACTGGCCTTGTCTTGATATGTTTTCTCATAGTGTGATATACTCCCCTCTGTTCATCAATATCGGTGTCAAATATTAGTGATCAGAGGTAGTATCATAGCCAAGCACATGTAAGATGATGACAGTAGGTGTGTCACCATGAGAAGACATCGCTAACCAATTTAGATCACTGACTTGTTGCGCTACACATTTTCCTTTTTCCTGAAGGAGTTGCACTATACAATTTTTTAAATGTACAATATATTAGCTTACTGAACTACATTAATTCCAATGCAGAAATATGGTGGAAAGAAAGGCCCGGGAGCCAGTACGTCTAAAGACTGAGACCTGGATTGCAGATCCCTGTGTTGCTCTTGAGGCAACATGCTGGCATGGTGGTTTTTTGGTACCAGCTACTGACAGTGGATGTACACCTCCATTCGCTAGTCGAGAGGAGCTTAAAGAGACTTTGCATCGGTTGATGACCATTTGTGTTGTATATCAGATTCTTCTGTGCAATGACTCGTTCATTTATAGTTCTTGTGCTGTGCGGCTCTTGTGTGGACGAGTAATGAACCTATTGAGTCAGGTGCAATGCAAATCAAAACTATTGGGGCTTGACATGGATTTGTACTGGAATTCAACATGCTCGTTTCCAGACGGGGCCCTTAATTACTCGCATGTTAGTAACACATTTGTTATTCTATTTAGAGTCCTATGAAGGTTGTCTGTTTTGTGTATGCGCATGAGCCATTCGGTAATTGTTACTCCCTTCATCCTACATTGAGCATCCAATAATGTCTGCTATAATGTTTGTGCACCAAGAACAAGAATAATTTAAATCACATCGATCAAGACGTCATGTATAATATGCACACATTCTCTCCTAATGCATGAGTTGGTTAAAACACAATGCACAATTCCACTCTGCCTTTAGCATGCACACATTCTTACATGATGTATTAATTGTGCTCTAATAAAATCCTTATACATGTGATCAATTTGAAAAATTAATTTTAGTTTTTATTATATGATAATCAATTTAAAAAGAAGGGAGTACTATCTTAACTGCACTAATGATTGGTGGCCAAGTGATTTACAACCTCTGATGCCCATCGTAAAATCCCAAGCTGTTTTAGCCTGTGCTAAGTCAAAACTGTCAGCCTACCAGGCAGTTTGTAACTAACTGCAAATATGGTAACCAACCCGCTGGCTGATAGGCGGGGCCGACCGTTCGCTCCGGCCCCACCTGTCAGCCAGCGCATGATCTCTACTCTTTTTTATTTATTAGGAGGTTGCTGCGCTGCGGAGGCTGCATGCATTAGCGCGGAAATTCTCAGGCTCGCCGTCGACGAGGAGGAGGAGGAATCGGGAGGAGATCCGAGATGGCGGCGAGGGAGACGTCGCGCCACGCGTCGCTCTGCCTGTGGCTCGCGCTCGTCGCCGCCACCCTCTCTCTCGCCCAGGTACTCGATTGATGATGCTTGCTCATTCTGTTTATATC

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“TTTATTTTTTTTCAGGTATGCC”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“GCTTGCTCATTCTGTTTATATC”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)POsCold8基因上游包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列，并将其命名为启动子POsCold8。在具体实施例中，本发明将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达定量检测发现，转基因植株在冷诱导条件下Gus基因表达水平提高，从而证明该1960bp的序列具有驱动基因在冷诱导条件下特异性表达的活性。

本发明所述的启动子元件POsCold8可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在冷诱导条件下特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POsCold8能够调控基因在冷诱导条件下特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的特性，从而培育出理想的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将POsCold8启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-POsCold8示意图，其中示出了利用POsCold8启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

图3以萌发后10天的POsCold8驱动GUS报告基因转基因水稻为材料，在10℃下低温胁迫处理。在胁迫24小时后，通过对报告基因GUS的定性染色。结果显示，冷处理后，在根茎叶各个组织中都出现代表GUS活性的蓝色信号；而未经胁迫处理的植株各组织均没有检测到GUS表达；这表明POsCold8启动子可受低温胁迫显著诱导。(标尺＝5mm)

图4为4℃低温胁迫的不同时间(0小时/未处理，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时)采集萌发后10天的POsCold:GUS转基因水稻幼苗植株，提取RNA，通过定量RT-PCR的方法检查GUS基因的表达强度来反应POsCold8的冷诱导活性。结果显示，低温诱导后，POsCold8表达强度显著提高，在24小时处理后，活性可达处理前活性的168.5倍。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的POsCold8启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据序列表SEQ ID No.1所示的POsCold8基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTTTTATTTTTTTTCAGGTATGCC HindIII

反向引物：GGATCCGATATAAACAGAATGAGCAAGC BamHI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子POsCold8的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POsCold8，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1960bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子POsCold8，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子POsCold8的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和BamHI酶切，回收启动子POsCold8片段。同时利用HindIII和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的POsCold8片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POsCold8与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-POsCold8，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子POsCold8驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得POsCold8::gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,etal.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色与定量

Gus染色：以萌发后10天的POsCold8驱动GUS报告基因转基因水稻为材料，在10℃下低温胁迫处理。在胁迫24小时后，分别对材料的根、茎和叶染色，并拍照。

Gus定量：取处理0h、4h、8h、12h、24h、48h的全株材料作为样本，使用天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，再使用天根生化科技有限公司的Fastquant RT试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，以ACTIN基因为内参，以天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus实时荧光定量PCR预混液为反应试剂，在ABI公司的PRISM7500荧光PCR仪上，通过qRT-PCR反应检测POsCold8和PActin启动子驱动的Gus表达强度。其中，用于标定ACTIN基因的定量qRT-PCR引物为：

ACTIN上游引物：5’-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3’,

ACTIN下游引物：5’-CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’

用于检测GUS基因表达的qRT-PCR引物为：

Gus上游引物：5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’

Gus下游引物：5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’

如图3和4中的结果显示，低温诱导后，POsCold8表达强度显著提高，在24小时处理后，活性可达处理前活性的168.5倍，因此，POsCold8是一个水稻低温诱导启动子。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (1)

1.一种构建对寒冷环境具有特异性响应功能的水稻品种的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一种构建物，所述构建物含有目的基因以及与该目的基因可操作连接的SEQID NO:1所示的启动子元件；

(b)将步骤(a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；

(c)将步骤(b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而构建出对寒冷环境具有特异性响应功能的水稻品种。