CN106480068B

CN106480068B - 浮萍转录因子LmMYB基因及其应用

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Publication number: CN106480068B
Application number: CN201611169907.6A
Authority: CN
Inventors: 王文国; 汤晓玉; 祝其丽; 邓良伟; 姜奕歧
Original assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Current assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: CN106480068A

Abstract

本发明公开了一种浮萍转录因子LmMYB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了浮萍转录因子LmMYB蛋白以及包含前述LmMYB基因的重组载体和/重组菌及其用途。本发明浮萍转录因子LmMYB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，其可以调解植物耐高铵胁迫的能力，可以通过转入该基因来增加植物耐高铵胁迫的能力，对生长于受到高铵胁迫的植物有重要意义，具有良好的应用前景。

Description

浮萍转录因子LmMYB基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种浮萍转录因子LmMYB基因及其应用。

背景技术

转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶的辅助因子，若缺少转录因子，RNA聚合酶无法催化DNA模板链转录成RNA，则基因无法进行后续的加工和翻译，只有转录因子结合在相应顺式元件的核心DNA序列上，基因才能正常表达，可见转录因子在植物的各种生命活动中有着不可替代的位置。

MYB转录因子是近年来发现的一类与调控植物生长发育、生理代谢、细胞的形态和模式建成等生理过程有关的一类转录因子，在植物中普遍存在，同时也是植物中最大的转录家族之一，MYB转录因子在植物的代谢和调控中发挥重要作用。MYB基因家族中只有极少数成员在调控某些生理生化过程中起负调控作用，一般起正调控作用，以MYB类转录因子在响应植物逆境过程为例，MYB基因表达量越高，其抵抗逆境的能力越强。

现有研究表明MYB基因在农作物、鲜花、水果、烟草中都大量存在，如拟南芥中已经发现超过198个MYB基因，棉花、草莓和番茄等植物中都发现超过200个MYB基因。

大多数MYB蛋白在N端含有一段氨基酸残基组成的MYB结构域，根据这个高度保守的结构域的结构特征可将MYB转录因子分为四类：

1R-MYB/MYB-related；R2R3-MYB；3R-MYB；4R-MYB(4个R1/R2的重复)。MYB转录因子具有多种生物学功能，广泛参与植物根、茎、叶、花的生长发育，与此同时，MYB基因家族对干旱、盐渍、冷害等非生物胁迫过程也有响应，此外MYB转录因子还与某些经济作物的品质好坏密切相关。

氨氮是指水中以游离氨(NH₃)和铵离子(NH₄ ⁺)形式存在的氮，是水体中主要的污染物之一，会造成富营养化、水生植物多样性减少等危害。我国从“十二五”开始将氨氮纳入污染物控制指标，畜禽养殖业是氨氮减排重点之一。畜禽养殖废水中含有较高浓度的氨氮，目前主要采用厌氧-好氧工艺进行脱氮除磷，其中好氧过程耗能较高。人工湿地、氧化塘等低能耗工艺能够有效的利用植物和微生物的共同作用达到良好的脱氮效果，但是过高的氨氮会对植物造成伤害，不利于其正常运转。NH₃和NH₄ ⁺都可以对植物造成伤害，但是这二者之间的转换受环境温度和pH控制，在大多数的土壤或水体环境中游离氨所占比例较低，对植物造成影响的主要是NH₄ ⁺，因此NH₄ ⁺毒害也受到更多的关注。

NH₄ ⁺毒害会抑制植物的生长发育，对农业和其它生态系统有一定的负面影响，如一些地区的粮食减产、森林面积降低、水生植物减少被认为与土壤中或水环境中NH₄ ⁺的升高密切相关。尤其是在农业方面，过度氮肥的使用、不合理的施肥方式以及大气NH₃/NH₄ ⁺沉降的加剧等因素都会使土壤中NH₄ ⁺浓度增加，NH₄ ⁺毒害对农业生产的威胁将越来越明显。提高作物自身的抗高铵能力有利于减少由NH₄ ⁺毒害带来的经济损失。提高水生植物对高铵的耐受能力有助于更好的利用这些植物净化废水。

未见浮萍的MYB基因相关的报道，也未见MYB基因与植物抗高铵胁迫相关的报道。

发明内容

本发明提供了浮萍Lemna minor L.的MYB基因及其应用。

本发明提供了浮萍转录因子LmMYB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种重组载体，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

优选地，所述重组载体是重组pCAMBIA1302质粒。

本发明还提供了一种重组菌，它包括前述重组载体。

优选地，所述重组菌是重组根癌农杆菌。进一步优选地，所述重组根癌农杆菌是重组根癌农杆菌EHA105。

本发明还提供了一种浮萍转录因子LmMYB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了前述的基因、蛋白、重组载体和/重组菌在提高植物耐高铵能力中的用途。

本发明还提供了一种提高植物耐高铵胁迫的方法，步骤如下：取前述的基因、重组载体和/重组菌，转入植物的基因组中，即可。

本发明还提供了一种制备转基因水稻的方法，取水稻，转入前述的基因、重组载体和/重组菌，即可。

本发明的LmMYB基因是能够针对性调控植物耐高铵能力提高的转录因子基因；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。

本发明通过对LmMYB基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得效果如下：

1.获得了对高铵胁迫有较高耐受性的转基因水稻。

2.LmMYB基因具有抵抗高铵胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。

本发明LmMYB基因能够提高植物耐高铵胁迫的能力，制备得到的含有LmMYB基因的转基因水稻在高铵环境下生长良好，可以克服由于高铵污染导致的农作物减产等等问题，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1中浮萍叶状体总RNA的琼脂糖凝胶电泳图，图中，M泳道：分子量标记(AL2000 DNAMarker，购自艾德莱公司)，1泳道：浮萍叶状体总RNA。

图2为实施例1中转录组数据使用的LmMYB基因中间片段序列。

图3为实施例1中3'Race扩增LmMYB基因的下游片段电泳图，图中，M泳道：分子量标记(AL2000 DNAMarker)，1泳道：LmMYB下游片段的PCR扩增结果。

图4为实施例1中5'Race扩增LmMYB基因的上游片段电泳图，图中，M泳道：分子量标记(AL2000 DNAMarker)，1泳道：LmMYB上游片段的PCR扩增结果。

图5为实施例1中LmMYB基因ORF的PCR扩增结果电泳图，图中，M泳道：分子量标记(AL2000 DNAMarker)，1泳道：LmMYB基因ORF的PCR扩增结果。

图6为LmMYB与水稻、玉米等植物MYB家族转录因子氨基酸序列同源性比对。

图7为LmMYB与水稻、玉米等其他植物MYB转录因子氨基酸序列比对后所作进化树。

图8为LmMYB基因在不同浓度铵(NH₄Cl)处理条件下的诱导表达谱变化情况。

图9为PCR扩增反应结果。

图10为RT-PCR检测结果。

图11为转浮萍LmMYB基因水稻材料(B、D)与对照(A、C)分别在84mg/L(A、B)和840mg/L(C、D)的NH₄ ⁺-N的Hoagland培养液中的生长情况。

具体实施方式

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。

下述实施例中，所用浮萍为实验室从废水中获得的一株耐高铵浮萍，浮萍为无性繁殖，所有材料均来自同一个克隆，长期培养在Hoagland培养液中。培养箱培养条件为23±1℃，光周期12/12h。

实施例1：浮萍LmMYB基因的分子克隆

1、浮萍叶片总RNA的提取

浮萍叶片总RNA的提取使用Plant RNeasy Kit(Qiagen)，具体步骤如下：

1)取浮萍叶片≤0.1g，液氮充分研磨，加入450μl RLC(预先加入β-巯基乙醇)，剧烈振荡；

2)将液体移入紫色滤柱中，置于2ml收集管，室温，14,000rpm离心2min，滤液入1.5ml EP管，小心勿吸入沉淀；

3)加入相当于滤液1/2体积的无水乙醇，抽打混匀；

4)将样品，包括沉淀移入粉色滤柱，室温，10,000rpm离心15s，弃滤液；

5)加入700μl RW1buffer，室温，10,000rpm离心15s，清洗过柱；

6)加入500μl RPE，室温，10,000rpm离心15s，清洗过柱，重复该操作一次；

7)室温，14,000rpm离心1min，弃滤液；

8)将滤柱放入1.5ml收集管中，加入30～50μl RNase-free水，室温，10,000rpm离心1min即得浮萍叶片总RNA。

其琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

2、浮萍LmMYB基因3'端部分片段和5'端部分片段克隆的获得

2.1Reverse Transcriptase M-MLV合成cDNA第一链

按照反转录酶M-MLV(TaKaRa)的操作说明进行，以步骤1所得浮萍叶状体总RNA为模板，Oligo(dT)₁₈为引物。

在RNase-free的0.2ml PCR管中加入浮萍叶状体总RNA3μl(约500ng)，Oligo(dT)₁₈(50μM)1μl，用RNase-free ddH₂O将体积补充至6μl。混匀后，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上，然后短暂离心使管中溶液集于EP管底部。在冰上依次加入以下试剂：5×M-MLV Buffer 2μl；dNTP(10μM)0.5μl；RNase Inhibitor 0.3μl；RTase M-MLV 0.5μl；RNase-free ddH₂O 0.7μl。混合均匀后再次放入PCR仪42℃反应1h，70℃反应10min，存于-20℃备用。

引物Oligo(dT)₁₈序列为：

5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)₁₈-3′

2.2浮萍LmMYB基因3'端部分片段克隆的获得

本研究以课题组前期实验获得的浮萍高铵胁迫处理转录组数据为基础，用获得的LmMYB部分序列(图2)为基础，分别设计3’和5’RACE引物。利用正向引物LmMYB3-1和AP进行3′-RACE PCR扩增，第一轮扩增反应如下：

PCR反应体系配比表(20μL)

PCR循环系统

第二轮PCR将所得到的第一轮PCR产物用ddH₂O稀释50倍(0.4ul一扩PCR产物+19.6ulddH₂O)为模板，以LmMYB 3-2和AP₁为引物进行PCR。第二轮PCR如下：

PCR反应体系配比表(50μl)

PCR循环系统

将获得的第二次PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪筛选目的DNA条带，在紫外割胶仪下割下目的条带，用天跟公司的DNA试剂盒进行胶回收，回收后DNA片段连接pEASY-T1载体(TransGen Biotech)，转化大肠杆菌后，挑选白色菌落进行菌落PCR，菌落经PCR验证后选择阳性克隆测序分析，挑取阳性菌落送往北京六合华大基因有限公司测序，所得序列长度为550bp(图3)。

2.3、浮萍LmMYB基因5'端部分片段克隆的获得

5′-RACE采用TaKaRa公司Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)法进行：

1)首链cDNA的合成，将10μl的浮萍叶状体RNA与0.5μl的引物LmMYB5-RT(LmMYB5-RT：TCTCGTTGTCTGTTCTACCC)和1μl的RNase inhibitor混合均匀，70℃放置10min后冰浴2min，短暂离心；随后加入5μl的5×RT Buffer，1.25μl的dNTP Mixture(各10mmol/L)和2.25μl的DTT(100mmol/L)，加去RNase水至总体积24μl，混匀后42℃放置1min，再加入1μl的AMV Reverse Transcriptase XL，55℃下反应2h，再70℃处理15min后，短暂离心。

2)RNA的降解和cDNA的纯化，将前一步得到的25μl cDNA和1μl的RNase混合，37℃下放置30min；随后用天根公司的DNA回收柱进行纯化cDNA。

3)cDNA末端加尾反应体系如下：5μl 5×TDT Buffer，15μl cDNA，2.5μl0.1％BSA，0.5μl dATP(100mmol/L)，加入ddH₂O至总体积24μl。将上述反应液94℃处理2～3min后冰浴1min，加入1μl TdT，37℃放置12h，然后65℃处理10min，冰上冷却后短暂离心。

4)以上一步获得的反应液为模板，以LmMYB5-1(LmMYB5-1:GATAGCGGACCATTTGTTGC)和AP(Oligo dT-3sites Adaptor Primer)为引物，用ExTaq酶PCR，反应中退火温度为50℃，扩增30个循环PCR产物电泳观察结果。将所得产物用ddH₂O稀释50倍为模板，再以

LmMYB5-2(LmMYB5-2:GCCCTTTTTTCAAGCCCG)和AP1为引物进行第二轮PCR。所得产物经回收后克隆到pEASY-T1载体上，转化E.coli Top10感受态细胞。菌落经PCR产物电泳观察结果验证后，挑取阳性菌落送往北京六合华大基因有限公司测序，所得序列长度为490bp(图4)。并将所得序列在NCBI上进行比对分析。

3、浮萍LmMYB基因开放阅读框(ORF)的获得

根据已获得的中间片段、3'片段和5'片段拼接出LmMYB基因全长cDNA，据此设计扩增ORF的特异引物LmMYB1和LmMYB2，以浮萍叶状体的cDNA为模板，于冰上在一个0.2ml的EP管中加入以下组分：

引物序列如下：

LmMYB 1：5′-ATGGGGAGGAGTCCCTGCTG-3′

LmMYB 2：5′-TTAGAATCGTTGATTGGAGACGGAG-3′循环条件为：95℃3min，35个循环(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。

经测序得到642bp的ORF全长(图5)，其序列(SEQ ID NO：1)：

ATGGGGAGGAGTCCCTGCTGCGAGAACGCGGGCTTGAAAAAAGGGCAGTGGACGGCGCAAGAGGACCAGATACTCGTCTCCTATATTCGCCAATTCGGCCACGCCAACTGGCGCGCTCTCCCCAAGCTCGCCGGCCTTGCGAGATGCGGCAAGAGCTGCAGGCTTCGGTGGATGAACTATCTCCGACCGGATATCAAGCGGGGAAACTTCTCCCCAGAGGAGGAGGACGCCATCCTCAGGCTTCACGCGTCGCTCGGCAACAAATGGTCCGCTATCGCTGCCGAGCTCCCGGGTAGAACAGACAACGAGATCAAGAACGTGTGGCACACGCACTTGAAGAAGAGGGCCAGCCTCCGCAAGATCGATCGTGGCGAACCGTCTTGCGGCGACCTATCTTCGTCTTCTTCTTCTTGTGCGACCGAAGATGGGGCTCAGTTGCTCCCCGAGCTTCTGGAGATGGATGACGAGGAATGGTGGTCGGAGGCTCTCTTCCAGGAGACTTGTACGTCGAATTTGGGATCATCCAGGGCTTCGTCCGAAGGGGGGACGGACGCGTCGTCA GAGGAAGGCGACGACAATTTCTGGGTGAGGCTGCTGATGGCGACCGAGTTTCCCGACTCCGTCTCCAATCAACGATTCTAA。

其编码的蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO：2)：

MGRSPCCENAGLKKGQWTAQEDQILVSYIRQFGHANWRALPKLAGLARCGKSCRLRWMNYLRPDIKRGNFSPEEEDAILRLHASLGNKWSAIAAELPGRTDNEIKNVWHTHLKKRASLRKIDRGEPSCGDLSSSSSSCATEDGAQLLPELLEMDDEEWWSEALFQETCTSNLGSSRASSEGGTDASSEEGDDNFWVRLLMATEFPDSVSNQRF

实施例2：浮萍LmMYB基因的分析

1、生物信息学分析

使用软件DNAMAN、Primer Premier5.0及NCBI上的Blast程序对LmMYB序列(序列表中SEQ ID NO：1)和LmMYB基因编码的多肽的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO：2)进行同源性分析和保守区域分析。

2、荧光定量PCR检测LmMYB基因表达模式

2.1荧光定量PCR引物设计

根据克隆出的LmMYB cDNA全长序列设计了QP1和QP2作为检测LmMYB基因表达水平的荧光定量PCR引物，选取18S作为内参基因，引物为18SP1和18SP2。引物序列如下：

QP1：5′-TGGATGAACTATCTCCGACCG-3′

QP2：5′-CAGCGATAGCGGACCATTTG-3′

18SP1：5′-AGAGGAACAGTCGGGGGCATT-3′

18SP2：5′-CGGCATCGTTTACGGTTGAGA-3′

2.2准备不同浓度铵胁迫条件下基因表达模式分析所用材料

NH₄Cl胁迫处理：将浮萍洗干净后，以Hoagland培养液(84mg L-1 NO₃ ^--N)为对照，设84和840mg L^-1 2个高铵浓度处理，处理7天，分别在0d、2d、4d和7d取叶状体。

2.3RT

按照实施例1的浮萍叶状体总RNA的提取方法，从2.2不同浓度铵胁迫条件下的浮萍叶状体中分别提取它们的总RNA，所得总RNA使用BIO-RAD公司的iScript^TM cDNASynthesis Kit进行反转录。用硅化枪头在0.2ml的RNase-free硅化EP管中加入以下组分：

在PCR仪上按以下程序进行反应：25℃5min，42℃30min，85℃5min。所得cDNA用Nuclease-free water稀释10倍，-20℃保存备用。

2.4荧光定量PCR

荧光定量PCR所用试剂盒为BIO-RAD公司的SsoFast^TM Superemix，PCR反应在IQ5PCR仪(BIO-RAD公司)上进行，用硅化枪头在0.2ml的硅化EP管中加入以下组分：

反应程序为95℃变性2min后，进入95℃10s，60℃1min的45个循环，最后从65℃到95℃进行溶解曲线分析，去除引物二聚体和其他非特异性扩增。每个样品均重复三次以避免加样误差，实验数据利用iQ5-Cycler软件进行分析，分析方法为ΔΔCt法。

3、结果

3.1同源性分析

以序列表中SEQ ID NO：1所述LmMYB基因序列编码的多肽的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO：2)为询问序列，在NCBI上进行Blastp，发现其与水稻(Oryza sativa，CAA74603.1)和玉米(Zea mays，XP_008669188.1)的MYB家族转录因子基因同源性较高，均为80％。随后分别用DNAMAN软件和Mega4.0软件对NCBI公布的高等植物MYB家族转录因子氨基酸序列进行同源性比较和进化树绘制，结果与NCBI Blastp相同，由图6和图7看出，与LmMYB亲缘关系最近的是水稻，其次是玉米和大麦。

3.2保守区域分析

通过同源性比对，如图6所示，本发明所述LmMYB基因编码的氨基酸序列包含2个MYB家族共有的保守区域，即MYB DNA binding site.

3.3不同浓度铵(NH₄Cl)胁迫下基因表达模式分析

目前对于MYB蛋白功能研究的比较深入的是拟南芥，其家族不同成员可被NaCl、干旱及冷等其他非生物胁迫诱导表达，但未有报道MYB蛋白可被铵胁迫诱导表达，为推测LmMYB蛋白的生物功能，本发明使用不同浓度铵(NH₄Cl)对浮萍进行胁迫处理，如图8所示，本发明所述LmMYB基因的表达受到铵胁迫所诱导。

在84mg/L的铵条件下LmMYB基因的表达量是同等硝态氮浓度下的7倍，在840mg/L的铵条件下该基因的表达量增加到15倍左右。

综合上述LmMYB基因的各类分析，初步推测LmMYB基因可能参与浮萍抗高铵的生物应答活动当中。故构建真核重组质粒转化野生型水稻植株，进一步检验其功能。

实施例3：真核重组质粒的构建及其功能验证

1、材料

1.1植物材料

水稻品种粳稻种子由武汉伯远生物科技有限公司所提供。种子于光照培养箱培养，28℃光照16h，黑暗8h。

1.2菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α:购自TIANGEN公司；

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105：购自北京全式金公司。

1.3质粒

pEASY–T1：是一种高效克隆PCR产物(TA cloning)的专用载体，购自TransGenBiotech；

植物双元表达载体pCAMBIA1302：含有潮霉素抗性基因Hyg、CaMV35S启动子，由农业部沼气科学研究所实验室保存。

1.4培养基和溶液

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 5g/L。LB固体培养基：在液体培养基的基础上加入12.5g/L琼脂粉。

YEB液体培养基：牛肉浸膏5g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L。YEB固体培养基：在液体YEB培养基的基础上加15g/L的琼脂粉。

基本培养基为NB培养基，愈伤组织的诱导与继代，转化与筛选及分化与生根培养基如下(所有培养基的PH均用KOH来调节)：

诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L；PH＝5.8-6.0

继代培养基：NB+2,4-D 2mg/L+Vc 40mg/L；PH＝5.8-6.0

预培养培养基：NB+2,4-D 2mg/L；PH＝5.8-6.0

菌体悬浮培养基：AAM+AS 100μmol/L；PH＝5.2

共培养培养基：NB+2,4-D 2mg/L+AS 100μmol/L；PH＝5.8-6.0

筛选培养基一：NB+2,4-D 2mg/L+Ti 100mg/L+Hyg 30mg/L；PH＝5.8-6.0

筛选培养基二：NB+2,4-D 2mg/L+Ti 100mg/L+Hyg 50mg/L；PH＝5.8-6.0

分化培养基：NB+KT 10mg/L+NAA 0.4mg/L；PH＝5.8-6.0

生根培养基：1/2MS+NAA 0.1mg/L；PH＝5.8-6.0

上述培养基和溶液均在121℃高压灭菌20min后备用，抗生素需待培养基冷却到50℃左右时加入。

2、实验方法

2.1LmMYB基因ORF全长的获得

经测序分析得知，LmMYB基因的ORF序列中没有BamH I和Hind III的酶切位点，因此，我们设计了构建真核重组质粒的引物如下(粗体字为保护碱基，斜体字为酶切位点)：

BamH-F1：5′-ATGGGGAGGAGTCCCTGCTG-3'

Hind-R1：5′-GAATCGTTGATTGGAGACGGAG-3'

按实施例1中的实验方法进行RT-PCR，循环条件为：95℃3min，35个循环(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。然后进行胶回收、连接pEASY–T1载体、转化大肠杆菌后测序。

本发明LmMYB基因ORF全长也可以按照SEQ ID NO：1所示序列直接合成。

2.2pEASY-LmMYB质粒提取

选取测序成功的菌液进行扩大培养，使用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(Omega)，得到质粒pEASY-LmMYB。所有操作均在常温下进行，具体步骤如下：

1)取菌液1.5～5ml，10,000rpm离心1min，弃上清；

2)向沉淀中加250μl Solution I/RNase A，振荡悬菌；

3)加250μl Solution II，轻摆几次，待菌液澄清后放置2min；

4)加350μl Solution III，上下翻转数次至白色絮状物出现；

5)于13,000rpm，离心10min，取上清或静置待用时取上清；

6)将Hibind DNA结合柱置于收集管，加200μl Buffer GPS，室温放置3～5min；

7)于12,000rpm，离心2min，弃滤液；

8)取步骤5)的上清于Hibind DNA结合柱中，13,000rpm离心1min，弃滤液；

9)加500μl Buffer HB，10,000rpm，离心1min，弃滤液；

10)加700μl DNA Wash Buffer(含无水乙醇)，10,000rpm离心1min，弃滤液；

11)重复步骤10)一次；

12)空柱，13,000rpm，离心2min，弃滤液，室温放置3～5min，挥干乙醇；

13)将Hibind DNA结合柱置于新离心管上，取30～50μl无菌水或Elution Buffer悬空滴加入结合柱中；

14)室温放置1～2min，13,000rpm，离心2min，-20℃保存备用。

2.3构建真核重组质粒pCAMBIA1302-LmMYB

构建方法，操作如下：

将pEASY-LmMYB和pCAMBIA1302分别以BamH I、Hind III(购自TaKaRa)进行双酶切，反应体系如下：

轻轻混匀，37℃水浴12～16h后，跑凝胶电泳分别回收带酶切位点的LmMYB基因片段和pCAMBIA1302载体酶切片段。再用T4连接酶(购自TaKaRa)对上述两种双酶切的胶回收产物进行连接，反应体系如下：

轻轻混匀后，16℃温育12h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取测序正确的菌落扩大培养并提取质粒pCAMBIA1302-LmMYB。

2.4农杆菌感受态的制备

1)从YEB固体培养基上挑取农杆菌EHA105的单菌落，接种到10ml YEB液体培养基(含100μg/ml利福平)中，28℃，200rpm摇菌过夜；

2)吸取1ml菌液，加至50ml YEB液体培养基中，28℃，200rpm摇菌至OD₆₀₀为0.5左右。

3)4℃，5,000rpm，离心5min，弃上清；

4)菌体用10ml预冷的20mM CaCl₂重悬，冰浴30min；

5)4℃，5,000rpm，离心5min，弃上清；

6)菌体用约1ml预冷的20mM CaCl₂重悬，分装后于-70℃保存。

2.5农杆菌的转化

1)从超低温冰箱中取出农杆菌感受态，冰浴冻融；

2)将10μl本实施例2.3所构建的真核重组质粒pCAMBIA1302-LmMYB加入农杆菌感受态，轻轻混匀，冰浴30min；

3)于37℃水浴5min，迅速至冰上放置3～5min；

4)在无菌条件下加入800μl液体YEB培养基，于28℃，175rpm摇菌3～6h；

5)室温下，4,000rpm离心2min，弃上清；

6)菌体用约80μl液体YEB培养基重悬后涂布平板，于28℃培养两天；7)挑取单菌落，用LmMYB全长特异引物LmMYB 1和LmMYB 2(MYB1302-F:CGCggatccATGGGGAGGAGTCCCTGC；MYB1302-R:CCCaagcttGAATCGTTGATTGGAGACGG)进行菌落PCR(PCR反应条件为：94℃5min，35个循环(94℃30s、60℃30s、72℃30s)，72℃5min)，选取PCR成功的培养物进行后续实验。

2.6农杆菌侵染水稻

(1)愈伤组织的预培养

选取自然分散，结构致密，颜色鲜黄且直径约为2-3mm的胚性愈伤组织，转接至预培养培养基中，于培养箱28℃暗培养3-5d。

(2)农杆菌的处理与转化

在YEB固体培养基(Kan 50mg/L，Rif 50mg/L)划线，然后在28℃暗培养两天后，将农杆菌放置4℃冰箱中保存，侵染前两天在固体YEB培养基中划线培养。

农杆菌在固体YEB培养基上28℃暗培养2d后，用5-10ml AAM培养基(100μmol/LAS)将农杆菌洗脱，悬浮于100ml AAM培养基(100μmol/L AS)中，振荡调整菌液浓度至OD_600nm＝0.1-1.0，形成悬浮液，28℃静置1h。将经预培养的愈伤组织转至灭菌的50ml培养瓶中，加入上述处理的农杆菌悬浮液，轻微摇动后，静置30min，倒掉菌液，然后将愈伤于无菌滤纸上晾干并转接于共培养基中，28℃中暗培养3d。

(3)洗脱农杆菌

暗培养3d后，挑取愈伤组织接于灭菌的50ml广口培养瓶中，用灭菌的双蒸馏水冲洗，直至水中不见丝状菌体，最后一次冲洗用含100mg/L Ti的无菌水静置1h，然后倒掉水，将愈伤组织置于无菌滤纸上在操作台中吹干，然后转移至筛选培养基一上进行筛选。

(4)抗性愈伤组织的筛选

每两周将愈伤调换至新的筛选培养基上，约需三周即可见抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出。将抗性愈伤转接于筛选培养基中，10d左右观察抗性愈伤组织的色泽，颜色鲜黄，结构致密的抗性愈伤组织保留，并转至分化培养基二中，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。

抗性愈伤转移至分化培养基2周后开始出现绿点，3周后可长出幼芽，并伴随根也长出。待幼苗长至2-3cm时转移至生根培养基上，每试管中1个克隆。幼苗长至10cm左右且根系生长旺盛时开始炼苗，7-10d后，移出试管，洗净根上的培养基，然后移至大田栽种。

2.7转基因水稻的种植管理

转基因水稻当代(T0代)植株随批及时种植。T0代自交种子(T1代)于2015年10月播种于海南，11月插秧，插植规格为20cm×20cm，单本植，按丰产田进行管理，力求均匀一致，及时防治病虫和其它危害。

2.8转基因水稻的鉴定

2.8.1PCR检测基因整合情况

1)水稻叶片DNA模板的制备

CTAB法制备水稻基因组PCR模板

(a)取约0.1g的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适量的粉末材料转移至1.5ml EP管中。

(b)加入600μl预热(95℃)的1.5×CTAB缓冲液，然后65℃温浴45min。

(c)取出EP管，冷却后加入600μl氯仿:异戊醇(24:1)混合均匀，然后10,000rpm离心10min，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。

(d)加入2/3体积的异丙醇混合均匀，冰浴至DNA丝状物出现。

(e)稍微离心沉淀DNA，倒掉上清液。

(f)加入600μl 75％乙醇洗涤，放置30min。

(g)倒掉上清液，室温下吹干DNA。

(h)加入100μl TE溶解DNA。

2)PCR检测

以上述水稻叶片DNA(野生和转基因)为模板、LmMYB全长的特异引物LmMYB1和LmMYB2进行PCR，循环条件为：95℃3min，35个循环(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析。

2.8.2RT-PCR检测基因转录表达情况

按实施例1方法提取转基因水稻的总RNA，用M-MLV反转录酶反转录合成cDNA第一链。以反转录产物为模板，用LmMYB全长的特异引物

LmMYB1和LmMYB2进行PCR，该反应以水稻的Actin rRNA为参考基因，引物序列如下：

OsActin_f:5'-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3'

OsActin_r:5'-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3'

循环条件为：95℃3min，35个循环(94℃30s、62℃30s、72℃1min)，72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析。

2.8.3转基因水稻种子的筛选

1)用50μg/ml的Hyg(潮霉素)水溶液彻底浸水滤纸，至于培养皿中，将收获的T₀代种子均匀撒在滤纸上，28度培养箱暗培养两天后，于28度光照培养箱培养，每两天补一次Hyg水；

2)一周后，将萌发的Hyg抗性水稻幼苗移栽至花盆中，于光照培养箱生长为T₁代植株，经PCR验证成功的植株分别收获水稻T₂代种子并做好记录；

3)将鉴定成功的水稻T₂代种子置于花盆中继续培养，用于后续实验。

2.9转基因水稻的抗高铵胁迫能力验证

以Hoagland培养液(84mg/L NO₃ ^--N)为对照，设84和840mg L^-1 2个高铵浓度(NH₄Cl)处理，将经过潮霉素筛选和PCR鉴定的阳性植株转入对照和处理中，以没有转基因的水稻苗为对照，10d后测定植株高度、根长等指标。

3、结果

3.1转基因植株的鉴定

3.1.1PCR检测

分别提取野生型水稻和转LmMYB基因植株叶片的DNA，用LmMYB基因特异引物进行PCR扩增反应。结果显示，转基因水稻叶片扩增出642bp的特异片段(如图9)，而野生型对照水稻叶片没有扩增出该片段，因此判定LmMYB基因已整合入水稻的基因组DNA中。

3.1.2RT-PCR检测

为研究LmMYB基因在转基因水稻中的表达情况，对鉴定出的转基因水稻叶片在mRNA水平上进行了检测。分别以转基因水稻和野生型水稻叶片cDNA为模板，以LmMYB基因的特异引物进行RT-PCR反应，以水稻Actin基因为内参基因(如图10)。结果表明3棵阳性株全部都可扩增到目的片段，野生型水稻中无扩增产物，说明整合到转基因水稻基因组中的LmMYB基因可成功转录。

3.1.3潮霉素抗性筛选水稻种子

T1代阳性种子的比率为75.3％，T2代阳性种子的比率为80.2％.

3.2水稻转基因植物的结果及分析

如图11所示转LmMYB基因水稻材料(B、D)与对照(A、C)分别在84mg/L(A、B)和840mg/L(C、D)的NH₄ ⁺-N的Hoagland培养液中的生长情况,具体的数据如下表所示：

如上表和图11所示，在正常条件下，对照组与本发明含有LmMYB基因的转基因水稻的生长类似，在高铵胁迫下，对照组生长不佳，而含有本发明LmMYB基因的转基因水稻则仍然生长良好，说明转入本发明LmMYB基因可以有效对抗高铵胁迫，并且三株转基因植物的抗高铵胁迫能力均显著提升，说明含有本发明LmMYB基因的转基因植物稳定性较好。

综上，本发明发现了浮萍转录因子LmMYB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，确定了其可以调解植物耐高铵胁迫的能力，可以通过转入该基因来增加植物耐高铵胁迫的能力，对生长受到高铵胁迫的植物有重要意义，具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 农业部沼气科学研究所

<120> 浮萍转录因子LmMYB基因及其应用

<130> GY181-16P1567

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 本发明LmMYB ORF全长

<400> 1

atggggagga gtccctgctg cgagaacgcg ggcttgaaaa aagggcagtg gacggcgcaa 60

gaggaccaga tactcgtctc ctatattcgc caattcggcc acgccaactg gcgcgctctc 120

cccaagctcg ccggccttgc gagatgcggc aagagctgca ggcttcggtg gatgaactat 180

ctccgaccgg atatcaagcg gggaaacttc tccccagagg aggaggacgc catcctcagg 240

cttcacgcgt cgctcggcaa caaatggtcc gctatcgctg ccgagctccc gggtagaaca 300

gacaacgaga tcaagaacgt gtggcacacg cacttgaaga agagggccag cctccgcaag 360

atcgatcgtg gcgaaccgtc ttgcggcgac ctatcttcgt cttcttcttc ttgtgcgacc 420

gaagatgggg ctcagttgct ccccgagctt ctggagatgg atgacgagga atggtggtcg 480

gaggctctct tccaggagac ttgtacgtcg aatttgggat catccagggc ttcgtccgaa 540

ggggggacgg acgcgtcgtc agaggaaggc gacgacaatt tctgggtgag gctgctgatg 600

gcgaccgagt ttcccgactc cgtctccaat caacgattct aa 642

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 本发明LmMYB编码的蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Asn Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Ala Gln Glu Asp Gln Ile Leu Val Ser Tyr Ile Arg Gln Phe

20 25 30

Gly His Ala Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ala Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Ser Pro Glu Glu Glu Asp Ala Ile Leu Arg

65 70 75 80

Leu His Ala Ser Leu Gly Asn Lys Trp Ser Ala Ile Ala Ala Glu Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Arg Ala Ser Leu Arg Lys Ile Asp Arg Gly Glu Pro Ser Cys

115 120 125

Gly Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ala Thr Glu Asp Gly Ala

130 135 140

Gln Leu Leu Pro Glu Leu Leu Glu Met Asp Asp Glu Glu Trp Trp Ser

145 150 155 160

Glu Ala Leu Phe Gln Glu Thr Cys Thr Ser Asn Leu Gly Ser Ser Arg

165 170 175

Ala Ser Ser Glu Gly Gly Thr Asp Ala Ser Ser Glu Glu Gly Asp Asp

180 185 190

Asn Phe Trp Val Arg Leu Leu Met Ala Thr Glu Phe Pro Asp Ser Val

195 200 205

Ser Asn Gln Arg Phe

210

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物Oligo(dT)18序列

<400> 3

gctgtcaacg atacgctacg taacggcatg acagtgtttt tttttttttt tttt 54

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> LmMYB5-RT(LmMYB5-RT

<400> 4

tctcgttgtc tgttctaccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> LmMYB5-1

<400> 5

gatagcggac catttgttgc 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> LmMYB5-2

<400> 6

gccctttttt caagcccg 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> LmMYB 1

<400> 7

atggggagga gtccctgctg 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> LmMYB 2

<400> 8

ttagaatcgt tgattggaga cggag 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> QP1

<400> 9

tggatgaact atctccgacc g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> QP2

<400> 10

cagcgatagc ggaccatttg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 18SP1

<400> 11

agaggaacag tcgggggcat t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 18SP2

<400> 12

cggcatcgtt tacggttgag a 21

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> BamH-F1

<400> 13

cgcggatcca tggggaggag tccctgctg 29

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> Hind-R1

<400> 14

cccaagcttg aatcgttgat tggagacgga g 31

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> MYB1302-F

<400> 15

cgcggatcca tggggaggag tccctgc 27

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> MYB1302-R

<400> 16

cccaagcttg aatcgttgat tggagacgg 29

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Os18sF

<400> 17

gactctggtg atggtgtcag c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Os18sR

<400> 18

ggctggaaga ggacctcagg 20

Claims

1.一种浮萍转录因子LmMYB基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是重组pCAMBIA1302质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求2或3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是重组根癌农杆菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组根癌农杆菌是重组根癌农杆菌EHA105。

7.一种浮萍转录因子LmMYB蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.权利要求1～6任意一项所述的基因、重组载体或重组菌在提高植物耐铵能力中的用途；所述植物为水稻。

9.一种提高植物耐铵胁迫的方法，其特征在于：步骤如下：取权利要求1～6任意一项所述的基因、重组载体或重组菌，转入植物的基因组中，即可；所述植物为水稻。