CN105713077A - 一种大豆MYB类转录因子GmMYB29及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了一种大豆MYB类转录因子GmMYB29及其编码基因与应用。GmMYB29转录因子具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该基因的开放阅读框具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。本发明的转录因子GmMYB29通过促进异黄酮生物合成途径关键结构基因启动子的驱动表达活性从而提高了大豆异黄酮的含量。本发明对培育高异黄酮含量的大豆新品种具有重要价值。

Description

一种大豆MYB类转录因子GmMYB29及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大豆MYB类转录因子GmMYB29及其编码基因与应用。

背景技术

异黄酮是高等植物特有的次生代谢的产物，动物体内不能合成。异黄酮对动植物有着重要作用。在动物体内具有雌激素、抗癌、抗氧化、抗溶血、治疗心血管病、降低胆固醇、预防骨质疏松、促进繁殖、泌乳和生长等多种生物功能。在植物体内则可作为保护性物质，保护植物正常生长、抵制病原菌的侵害，同时也是根瘤菌与植物共生作用所必需的。异黄酮主要分布在豆科的一些物种，近年来虽然也在其它高等植物中检测到具有不同结构类型的异黄酮化合物，但大都以微量形式存在。豆科植物中大豆[GlycineMax(L.)Merr.]的异黄酮含量较高，大约是许多其它豆科植物的100倍左右。异黄酮在食品、医药、美容、动物养殖业和农业中的巨大的应用价值使国际市场对异黄酮的需求正在逐年增加。由于大豆是异黄酮的主要来源，因此培育高异黄酮含量的专用型品种是大豆品质育种的主要目标之一。

目前有研究通过对异黄酮途径结构基因进行修饰，利用基因工程的手段改良异黄酮的合成，主要包括过表达异黄酮合成途径的酶基因和降低其竞争途径关键基因的表达两方面。研究结果显示过表达异黄酮合成途径的个别酶基因虽然可以增加异黄酮的积累，但增幅未达显著水平。而抑制竞争途径虽然能够大幅度地提高异黄酮的含量，但是由于植株中的黄酮、花青素及原花青素等重要代谢通路被阻断，转基因植株在非实验室条件下难以存活。对途径单个基因的修饰难以达到理想的结果，因此目前研究又集中于对调控异黄酮合成的转录因子的鉴定，利用转录因子激活或抑制异黄酮合成途径中不同的结构基因从而定向控制异黄酮的产量是今后调控异黄酮合成的主要基因工程手段。大豆中目前仅鉴定出两个调控异黄酮的MYB类转录因子，仍有待深入的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆MYB类转录因子GmMYB29。

本发明的另一目的是提供编码该转录因子蛋白的基因。

本发明的又一目的是提供该转录因子的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种大豆MYB类转录因子GmMYB29，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

编码所述的大豆MYB类转录因子GmMYB29的基因GmMYB29。

该基因GmMYB29的开放阅读框具有如SEQIDNO.1所示的DNA序列。

含有所述的大豆MYB类转录因子GmMYB29编码基因GmMYB29的重组质粒。

本发明所述的重组质粒，将编码本发明大豆MYB类转录因子蛋白的基因GmMYB29插入pBA002植物过量表达载体中得到的。该编码所述的大豆MYB类转录因子蛋白的基因GmMYB29具有SEQIDNO.1所示的DNA序列。

本发明所述的大豆MYB类转录因子GmMYB29在培育高异黄酮大豆品种中的应用。

本发明所述的大豆MYB类转录因子编码基因GmMYB29在培育高异黄酮大豆品种中的应用。

含本发明所述的大豆MYB类转录因子编码基因GmMYB29的重组质粒在培育高异黄酮大豆品种中的应用。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体,将本发明GmMYB29基因导入植物细胞,可获得异黄酮含量得到提高的转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型的启动子或诱导性启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如可加入植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，也可不加入任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。携带有本发明的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培养成植株。被转化的植物宿主是大豆、苜蓿、百脉根等双子叶豆科植物。

有益效果：

GmMYB29的mRNA表达分析表明其组织表达模式与异黄酮合成关键酶基因IFS2一致，并与异黄酮类化合物的积累密切相关。双荧光素酶报告系统的瞬时表达分析结果表明GmMYB29能够显著促进异黄酮合成关键酶基因IFS2和CHS8的启动子表达活性提高。利用发根农杆菌介导的转化系统将携带有本发明GmMYB29的植物表达载体转化大豆毛状根，与对照相比过表达GmMYB29的大豆毛状根的异黄酮含量显著提高了1.6-3.3倍，说明GmMYB29基因在调控异黄酮生物合成方面起着重要作用，本发明的GmMYB29对培育高异黄酮含量的大豆品种具有重要意义。

附图说明

图1大豆不同组织中GmMYB29和IFS2基因的相对表达量及总异黄酮的含量。A：GmMYB29基因的组织表达分析；B：IFS2基因的组织表达分析；C：大豆异黄酮的组织积累模式。图中横坐标的1～12分别代表根、茎、叶、花，花蕾、开花后10天的荚皮、开花后10天种子，开花后20天种子、开花后25天种子、开花后30天种子、开花后40天种子、开花后50天种子和完全成熟的种子

图2GmMYB29调控异黄酮合成关键基因IFS2和CHS8启动子的瞬时表达活性分析。A：GmMYB29调控IFS2启动子的瞬时表达活性分析；B：GmMYB29调控CHS8启动子的瞬时表达活性分析。注：对照加入报告基因载体质粒和内参质粒；MYB29加入报告基因载体质粒,内参质粒及表达GmMYB29蛋白的效应载体质粒

图3为含有GmMYB29的植物表达载体示意图

图4过表达GmMYB29的大豆毛状根的GmMYB29的相对转录水平。注：GmMYB29OE1-4代表4个不同的GmMYB29过表达毛状根株系；**,P≤0.01；***,P≤0.001。

图5过表达GmMYB29的大豆毛状根的相对异黄酮含量。注：GmMYB29OE1-4代表4个不同的GmMYB29过表达毛状根株系；**,P≤0.01；***,P≤0.001。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、大豆GmMYB29及其编码基因GmMYB29的cDNA克隆与鉴定

用植物总RNA提取试剂盒(购自天根公司)提取大豆品种Williams82叶片总RNA,经1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成参照TaKaRaPrimerScript^TMRTreagentkitwithgDNAEraser试剂盒说明操作。设计引物:

GmMYB29-F:‘5-CGGGTCTTTGGAAACGAA-3’(SEQIDNO.3)

GmMYB29-R:‘5-CGCATTACTCTGGCTGGT-3’(SEQIDNO.4)；

按照以下组份顺序配制PCR反应液(50μl体系)：25μl10×PCRBuffer、9μlddH₂O、10μldNTP、1.5μl引物(SEQIDNO.3和SEQIDNO.4)、2μlcDNA和1μlKODFX酶。反应在BIO-RADPTC-200型PCR仪上进行，其程序为94℃变性2min；再98℃10sec，53℃30sec，68℃2min，共33个循环；然后68℃延伸7min；4℃保存。PCR产物回收后经连接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5α、蓝白斑筛选、摇菌、测序,序列如SEQIDNO.1所示。

实施例2、GmMYB29在大豆不同组织的表达分析

大豆品种监利牛毛黄在正常田间生长条件下，盛花期取根、茎、叶、花，开花后10天(10DAF)取荚皮和种子，取20DAF、25DAF、30DAF、40DAF、50DAF和完全成熟的种子，采集的所有样品液氮速冻并于-80℃保存。总RNA的提取及cDNA的反转同实施例1。以大豆组成型表达的Tubulin基因作为内参基因,特异性引物及TaqMan-MGB探针序列如下:

扩增GmMYB29的特异性引物及探针：

上游引物：5'-GCCAGGAAGAACTGACAATGAGA-3'(SEQIDNO.5)

下游引物：5'-TGGAATTGGAATCAGAACGTTTAAT-3'(SEQIDNO.6)

MGB探针：5'-AGTCCAAGCCAAGTTCCAAAAGAGCCAC-3'(SEQIDNO.7)

扩增GmIFS2的特异性引物：

上游引物：5'-ATGAAGTATATAAGCCCTTC-3'(SEQIDNO.8)

下游引物：5'-TTGGGATAAATGATGTGGCAACT-3'(SEQIDNO.9)

扩增Tublin的特异性引物：

上游引物：5'-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3'(SEQIDNO.10)

下游引物：5'-CACTTACGCATCACATAGCA-3'(SEQIDNO.11)

以不同组织的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。结果表明，GmMYB29在根和种子中大量表达，并且随着种子的发育它的表达量显著提高(图1A)，与IFS2基因的转录积累模式一致(图1B)，并与异黄酮类化合物的积累密切相关(图1C)。

实施例3、GmMYB29调控异黄酮合成关键基因IFS2和CHS8启动子的瞬时表达活性分析

GmMYB29在拟南芥原生质体中转录活性分析的表达载体是由pAN580载体改造而来的。用BamHI和NotI限制性内切酶进行双酶切，去除GFP片段后用Klenow酶平末端处理，继而用T4连接酶连接构建形成中间载体。在中间载体的多克隆位点区段中，克隆连接实施例1克隆的GmMYB29序列，构成CaMV35S::GmMYB29重组质粒，测序正确后作为效应载体Effector待用。

选择XbaI与XmaI两个酶切位点设计引物以pGL3载体为模板通过PCR扩增LUC的完整ORF,经过酶切、回收、T4连接酶连接连入中间载体构的多克隆位点区段构成CaMV35S::LUC重组质粒。用SacI和NheI限制性内切酶进行双酶切，去除CaMV35S::LUC重组质粒中的CaMV35S片段后，分别连入从大豆Williams82DNA中扩增的IFS2和CHS8启动子片段，从而构成IFS2pro::LUC和CHS8pro::LUC载体，测序正确后作为报告载体Reporter待用。海蜃荧光素酶载体作为内参。扩增LUC基因以及IFS2和CHS8基因启动子片段的引物设计如下：

扩增LUC基因完整ORF的引物序列：

上游引物：5'-TGCTCTAGAATGGAAGACGCCAAAAACAT-3'(SEQIDNO.12)

下游引物：5'-TCCCCCCGGGTTACACGGCGATCTTTCC-3'(SEQIDNO.13)

扩增IFS2启动子的特异性引物：

上游引物：5'-TTCCATCACTGTATGAAAGTC-3'(SEQIDNO.14)

下游引物：5'-CGTGTTCTCGTCCTTGGTTTG-3'(SEQIDNO.15)

扩增CHS8启动子的特异性引物：

上游引物：5'-CGAGCTCTGAGCAAGTATACCAACCAT-3'(SEQIDNO.16)

下游引物：5'-CGGACTAGTCTTTCCTTCAAATTAAGTGAT-3'(SEQIDNO.17)

拟南芥原生质体制备与转化方法如下

试剂配制：

酶液：1.5％(w/v，g/ml)cellulaseR10，0.3％(w/v，g/ml)macerozymeR10，0.4M甘露醇，20mMKCl，20mMMES(PH5.7)，10mMCaCl₂，0.1％(w/v，g/ml)BSA，溶解后用0.45μm滤膜过滤后备用。10mL酶液可酶解15片左右的叶子。

PEG4000溶液：40％(w/v，g/ml)PEG4000，0.2M甘露醇，100mMCaCL₂，用ddH2O补齐后，在250rpm的摇床上震荡混匀10-15min，静止30min左右。

W5溶液：2mMMES(PH5.7)，154mMNaCl，125mMCaCl₂，5mMKCl，溶解后用0.45μm滤膜过滤后备用。

MMG溶液：4mMMES(pH5.7)，0.4M甘露醇，15mMMgCl₂，溶解后用0.45μM滤膜过滤后备用。

以上试剂现用现配。

1)分离原生质体：

最好选用3-4周大小还未抽苔的幼苗，剪取健康新鲜圆润的叶片。使用锋利的手术刀将叶片的叶尖和叶柄切除，然后迅速将叶片以垂直叶脉的方向切成0.5-1mm的小条，并放入酶液中(酶液用玻璃培养皿盛放，避免强光照射)。然后置于25℃摇床中，60rpm避光震荡3小时左右，直至叶片全部酶解。如有少许叶条剩余，可以用力震荡酶液以将原生质体完全释放出来。

2)感受态制备：

准备灭菌的50mL圆底离心管和200目的纱布，将纱布折成漏斗状，用W5润洗后，将上述原生质体-酶液缓慢的过滤至离心管中。300g/1min离心沉淀原生质体，尽量去除上清后用5-10mL预冷的W5轻柔重悬，后在冰上静置30min。

室温中，300g/5分钟离心沉淀原生质体，小心去除上清。用适量MMG溶液重悬原生质体，终浓度控制在2x105个/mL。

3)质粒转化：

分别将10μg高浓度质粒(1μg/μL)加入到2mL离心管中，再缓慢加入100μL原生质体轻柔混合。缓慢加入110μLPEG溶液，轻柔弹拨离心管底至混匀。黑暗诱导转化15分钟。

用室温下的W5加满离心管以稀释转化液，混匀以终止转化。300g/1min沉淀原生质体，去除上清后再加1mLW5溶液清洗一次。

4)原生质体孵育和镜检

用1mLW5溶液轻柔重悬原生质体，移入0.1％(w/v，g/ml)BSA润洗过的24孔细胞培养板中，室温避光培养15-18小时。

报告基因的检测根据荧光素酶双报告基因检测试剂盒使用手册(Promega)进行。结果显示GmMYB29激活IFS2基因的活性与对照相比增加100倍(图2A)，激活CHS8基因的活性与对照相比增加了近200倍(图2B)。转录激活实验分析的结果强烈的支持了GmMYB29在转录水平上调控异黄酮合成的重要作用。

实施例4、转GmMYB29基因的大豆毛状根的异黄酮含量检测

选择XhoI和MluI酶切位点,将实施例1克隆的GmMYB29全长序列正向插入pBA002的CaMV35S启动子后,构建成重组植物表达载体pBA002-GmMYB29(图3)。用冻融法分别将pBA002-GmMYB29和空载质粒pBA002转入发根农杆菌菌株K599(BioVectorNTCCInc.)中，pBA002-GmMYB29和pBA002分别通过发根农杆菌K599介导的遗传转化系统转化大豆，具体方法如下：

利用次氯酸钠+浓盐酸法对选取的饱满无斑点的大豆Jack品种的种子进行灭菌。将灭菌好的种子放置在无菌的培养罐中，用已灭菌的纯水清洗两次后再加入大约1/2的水，放置黑暗环境浸泡10-12h。接着在超净工作台中用无菌镊子除去种皮并接种于1/2MS固体培养基上，每皿10粒豆子，放置单独的光照培养箱中(16h光照/8h黑暗，25℃)培养5到6天至刚长出真叶。

制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液,28℃震荡培养48h后离心(3000rpm/min)10min收集菌体，用10mMMgCL₂重悬浮菌体至OD₆₀₀＝0.5。

在超净工作台中将培养好的大豆子叶剪下，在每个子叶的背部用无菌手术刀挖一个小洞，然后平铺于含有Cef((50μg/mL)头孢)和羧苄霉素(50μg/mL)的Whiter培养基上，将悬浮好的菌液滴在子叶背部的洞里，放置培养箱中(黑暗条件，25℃)培养18-20天。待毛状根长至4-8cm长时取根提取DNA，以35S启动子+GmMYB29基因为目的序列设计特异引物通过PCR鉴定阳性转化株系，引物序列如下：

上游引物：5'-TCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTT-3'(SEQIDNO.18)

下游引物：5'-TGGTCTGATTTCAGCAGCCTCTTC-3'(SEQIDNO.19)

剪取检测为阳性的转基因毛状根和空载对照的毛状根，首先提取总RNA并检测GmMYB29的转录水平，方法同实施例2，然后利用HPLC法测定总异黄酮的含量。结果表明转基因毛状根中GmMYB29的转录水平显著升高14-47倍(图4)，并且与空载对照相比过表达GmMYB29的毛状根的异黄酮含量显著的提高了1.6-3.3倍(图5)，因此我们认为GmMYB29在调控大豆异黄酮生物合成方面发挥了重要的作用。利用GmMYB29基因获得的高异黄酮含量的新材料可用作于豆科植物的育种应用。

Claims (8)

1.一种大豆MYB类转录因子GmMYB29，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.编码权利要求1所述的大豆MYB类转录因子的基因GmMYB29。

3.根据权利要求2所述的基因GmMYB29，其特征在于该基因具有SEQIDNO.1所示的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述基因GmMYB29的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的含有基因GmMYB29的重组质粒，其特征在于所述的表达载体是将SEQIDNO.1所示的大豆MYB类转录因子蛋白基因GmMYB29插入pBA002植物过量表达载体中。

6.权利要求1所述的大豆MYB类转录因子GmMYB29在培育高异黄酮大豆品种中的应用。

7.权利要求2或3所述的基因GmMYB29在培育高异黄酮大豆品种中的应用。

8.权利要求4所述的基因GmMYB29的重组质粒在培育高异黄酮大豆品种中的应用。