CN106349353A

CN106349353A - 一种调控植物淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与应用

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Publication number: CN106349353A
Application number: CN201610976753.5A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 龙武华; 王益华; 刘喜; 田云录; 刘世家; 江玲
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2016-11-07
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2036-11-07
Also published as: CN106349353B

Abstract

本发明公开了一个调控植物淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与运用。本发明提供的蛋白质是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控植物淀粉合成相关的由SEQID NO.1衍生的蛋白质。将所述的编码基因导入种子粉质皱缩的植物中，可以培育种子外观表型透明的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以运用于植物遗传改良。

Description

一种调控植物淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种调控植物淀粉合成蛋白OsFSE及其编码基因与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球超过50％人口以稻米为主要口粮。淀粉是水稻种子中储藏量最大的物质，超过种子重量的70％，水稻种子中淀粉积累的多少往往与产量直接相关，同时淀粉的组成变化影响稻米的外观品质和食味品质。因此对其合成调控的深入研究，将有助于我们通过基因工程的手段来对稻米进行改良。

水稻胚乳水不溶的淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成。支链淀粉占75％以上，它由分支的α-1,6糖苷键连接，而占少量的直链淀粉由线性的α-1,4糖苷键连接。植物中大量参与淀粉合成的关键酶已经被研究。直链淀粉由颗粒结合型淀粉合酶I(GBSSI)合成，它由Waxy基因编码。支链淀粉的合成由淀粉合酶(SSs)，淀粉分支酶(BEs)和淀粉去分支酶(DBEs)催化。植物中SSs，BEs，DBEs存在多种异构体SSI-IV，BEI-II，DBE1-3和DBE。在水稻中这些基因的突变，都会使胚乳淀粉表现异常特征。BEIIb突变表现心白胚乳，支链淀粉结构，淀粉颗粒的糊化特性都发生改变。ALK编码一个预测为可溶淀粉合酶IIa的基因，SSIIa关键氨基酸的改变导致籼稻和粳稻支链淀粉结构和淀粉特性的差异。

除了合成酶之外，水稻中一些其它因子间接地参与淀粉的合成。参与内质网中蛋白成熟的类二硫键异构酶(PDIL-1)基因功能丧失同样影响淀粉的合成，突变体表现粉质胚乳和淀粉颗粒变小。MADS29是水稻MADS-BOX家族的成员，参与降解珠心和珠心突起。抑制MADS29的表达，将减少淀粉的合成和形成异常的胚乳。因此发现并克隆淀粉合成和调控相关基因，将有助于我们通过基因工程的手段来对稻米进行改良。

发明内容

本发明的目的是提供一个调控植物淀粉合成相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的调控植物淀粉合成相关蛋白(OsFSE)，来源于稻属水稻(Oryzasativa var.滇粳优(DJY))，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控淀粉合成相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

SEQ ID NO.1由937个氨基酸组成，为OsFSE蛋白的氨基酸序列。

为了观察(a)中的OsFSE在水稻中正确的亚细胞定位，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的羧基末端连接上如(表1)所示的GFP标签氨基酸序列。

表1 GFP标签氨基酸序列

上述(b)中的OsFSE的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个核苷酸的密码子和/或进行一个或几个碱基对的错义突变和/或在其5′端和/或3′端连上GFP标签的编码序列得到。

编码上述调控淀粉合成相关蛋白的基因(OsFSE)也属于本发明的保护范围。

所述基因OSFSE可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码调控淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

SEQ ID NO.2由2811个核苷酸组成，为OsFSE的CDS。

SEQ ID NO.3由10331个核苷酸组成，为OsFSE的DNA序列。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体优选为在pCAMBIA1305.-GFP载体的酶切位点SpeI和XbaI之间插入所述基因OsFSE得到的重组质粒，命名为pCAMBIA1305.1-OsFSE。

含有以上任一所述基因(OsFSE)的表达盒、转基因细胞系及重组菌。

扩增所述基因(OsFSE)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

一种植物调控淀粉正常合成的方法。

本发明提供一种植物调控淀粉正常合成的方法，是将所述基因导入淀粉合成受阻，种子表现粉质皱缩的植物中，得到的种子正常透明的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入种子粉质皱缩的植物中；所述种子粉质皱缩的植物可为突变体fse。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的植物调控淀粉合成相关的基因OsFSE。抑制该基因的表达可导致植物种子中淀粉合成受阻，淀粉粒形态变小，不规则，总淀粉和直链淀粉含量显著减少，支链淀粉链长分布改变，从而可以培育出淀粉合成受阻，种子粉质皱缩的转基因植物。将所述基因导入种子粉质皱缩的植物中，可以培育出种子表型正常透明的植物。所述蛋白和其编码基因可以用于植物遗传改良。

附图说明

图1野生型DJY(a图)和突变体fse(b图)成熟种子外观比较。Bars＝5mm

图2野生型DJY和突变体fse成熟种子横切面扫描电镜观察比较。

图3野生型DJY和突变体fse灌浆种子半薄切片观察比较。

图4野生型DJY和突变体fse成熟种子总淀粉和直链淀粉含量比较。

图5野生型DJY和突变体fse成熟种子直链淀粉链长分布比较。

图6野生型DJY和突变体fse发育种子中淀粉合成相关基因表达量比较。

图7突变基因在第8染色体上的精细定位。

图8突变基因osfse的测序结果和OsFSE基因结构。

图9转pCAMBIA1305.1-OsFSE的T2代籽粒表型。Bar＝2mm

图10转pCAMBIA1305.1-OSFSE的T2代发育种子荧光定量PCR鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、调控植物淀粉合成相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻粉质皱缩种子突变体fse表型分析

粳稻品种滇粳优1号(DJY)经MNU诱变突变体库中筛选出种子粉质皱缩突变体fse。

与野生型DJY相比，突变体fse的主要特征是：成熟种子表现粉质不透明和皱缩表型(图1)，成熟种子横切面扫描电镜观察，野生型DJY淀粉颗粒规则，排列紧密，而突变体fse中粉质不透明部分淀粉颗粒不规则，排列疏松(图2)。对发育中的种子进行半薄切片观察发现突变体fse中有大量发育受阻，形态较小的淀粉颗粒(图3)，这说明突变体中淀粉颗粒发育受阻，不能形成规则的淀粉颗粒，从而导致淀粉颗粒排列不紧密，留有大量空隙，形成不透明的胚乳。

对发育中的种子进行淀粉合成途径关键基因的表达量分析发现，种子发育早期(10DAF之前)突变体fse中淀粉合成途径关键基因的表达量较野生型DJY显著降低(图6)。对成熟种子中淀粉含量和组分分析发现，与野生型DJY比较，突变体fse种子中总淀粉含量和直链淀粉含量极显著下降(图4)。支链淀粉链长分析发现，与野生型比较，突变体fse中支链淀粉链长在聚合度为9-15时增加，链长在6-8和16以上时减少(图5)。

综上所诉，突变体fse种子发育过程中淀粉合成途径关键基因表达量显著下调，导致淀粉颗粒发育受阻，不能形成规则的淀粉颗粒，导致淀粉粒排列疏松，淀粉含量下降，形成种子粉质皱缩表型。

二、突变体基因定位

1、突变基因初步定位

用突变体fse与广亲和品种N22(来自南京农业大学水稻所种质资源库)杂交，在fse/N22的F2种子中挑选出10粒粉质皱缩表型的种子，提取基因组DNA，利用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对10个极端个体进行连锁分析，将调控淀粉合成相关基因fse定位在第8染色体上标记RM408和WH-1之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单粒种子的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取1粒粉质皱缩的种子置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品20S。

②加入660μL提取液(含100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mL CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μL 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μL 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μL10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μL 1×TE(121g Tris溶于1升水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Beckman InstrumentInc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer(MgCl₂free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl₂(25mM)0.6μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH₂O 5.1μL，共10μL。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在Biometro热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初定位的结果，在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变位点。从fse/N22杂交组合获得的F₂分离群体中挑选出155粒粉质皱缩种子用于突变基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、dCAPS分子标记对突变基因进行精细定位，并根据定位结果确定候选基因。具体方法如下：

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在fse和N22之间的多态性，表现多态者用作精细定位fse基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。

表2用于精细定位的分子标记

引物	前引物	后引物	染色体位置
				WH-1	TTCAGAAACGGCATCAATCA	GCATATAAGCCTCAGCATGG	OJ1349_D05
WH-2	GGCAAGATTGGATTGAGGAG	TCGCCAAACGAAAAGAAAAT	P0007D08
				WH-3	CCTGGGGTTTGGAGTTCG	CACCCTTAGTCCTCATGGATC	P0498H04
WH-4	ACGAAACAACACGGCGTCAC	CGTCCAGGTATCCACCATCTCA	P0470F10
				WH-5	GCGCTTATGTGGCAGTAGAA	ACCGCTTCGGGTCTCACC	P0470F10

最终把fse基因精细定位在标记WH-2和WH-4之间，这两个标记物理距离约为190kb(图7)。

3、突变基因的确定

经过对区间内的基因测序发现LOC_Os08g01920基因存在一个单碱基的突变(图8)，根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述：

Primer1：5'CACATTCCCTTCCCTTCC 3'(SEQ ID NO.4)

Primer2：5'CTCCGATTCTGTGGTCAAGTA 3'(SEQ ID NO.5)

以primer1和primer2为引物，以滇粳优1号的发育中胚乳cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后连接到pMD18-T(日本Takara公司上)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码937个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为OsFSE，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsFSE。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以滇粳优1号(来自南京农业大学水稻所种质资源库)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsFSE的CDS，PCR引物序列如下：

Primer3：5’GGACTAGTATGGAGTCCCCCGCGGCGCG 3’(SEQ ID NO.6)

Primer4：5’GCTCTAGAGGAAGATTCACAGCTTGAAT 3’(SEQ ID NO.7)

上述引物包含SEQ ID NO.2所示基因CDS起始和末尾各20个碱基，对扩增PCR产物回收纯化。采用INFUSION重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到pCAMBIA1305.1-GFP中。

INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物1.0μL，pCAMBIA1305.1-GFP6.0μL，5×Infusion buffer 2.0μL，Infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴15min，而后50℃水浴15min，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆、测序，结果表明，得到了含有SEQ ID NO.2所示基因的重组表达载体，将含有OsFSE的pCAMBIA1305.1-GFP命名pCAMBIA1305.1-OsFSE,OsFSE基因片段利用Infusion重组试剂盒(日本Clontech公司)插入到该载体的SpeI和XbaI酶切位点之间。

二、重组农杆菌的获得

用冻融法将pCAMBIA1305.1-OsFSE转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，获得重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-PCAMBIA1305.1-OsFSE。

三、转基因植物的获得

分别将EH-pCAMBIA1305.1-OsFSE和转空载体对照菌株转化水稻种子粉质皱缩突变体fse，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1305.1-OsFSE(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的突变体fse水稻成熟胚愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T0代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、潮霉素抗性鉴定

本研究中利用1‰浓度的潮霉素溶液鉴定转基因植株。具体方法：将新鲜的转基因植株叶片(没有转基因植株叶片做阴性对照)放在培养皿中，用新配的1‰的潮霉素溶液浸泡，放在28℃培养箱中暗培养48小时，与对照比较，叶片坏死的表明不抗，没有坏死的表明抗，将抗潮霉素的三个家系命名为CL-1，CL-2和CL-3。

2、荧光定量PCR鉴定

根据1中潮霉素鉴定的结果，设计荧光定量引物，鉴定转基因阳性植株的表达量。定量引物设计：根据滇粳优在SEQ ID NO.2中的序列运用Premier 5.0软件设计引物。引物序列如下：

Primer5：5’ATGGAAAGGCTGACAGGTTC 3’(SEQ ID NO.8)

Primer6：5’GAGATCCCAGGGCAGATAAG 3’(SEQ ID NO.9)

荧光定量PCR反应：使用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒，在ABI PRISM7500HT上扩增。反应体系：0.4μL cDNA模板，10μL 2×SYBR premix Ex TaqII，0.8μL 10μMPrimer5，0.8μL 10μM Primer6，用ddH₂O补足20μL。反应程序采用两步法：95℃预变性30s，95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。用2-^△△CT法对Real-time PCR实验的结果进行分析，以水稻actin基因作为内参。控制淀粉合成相关酶类基因的定量引物引用于(She et al.,2010)。

结果表明潮霉素鉴定出来的阳性植株CL-1，CL-2和CL-3表达量较野生型和突变体极显著上调，说明为转基因阳性植株(图10)。

3、表型鉴定

分别将T0代转pCAMBIA1305.1-OsFSE植株、突变体fse和滇粳优种植在南京农业大学牌楼种植基地网室内，种子成熟后，收取各材料种子，观察到转pCAMBIA1305.1-OSFSE阳性植株CL-1、CL-2和CL-3出现正常透明种子，突变体种子粉质皱缩，滇粳优种子透明(图9)。因此证明fse中的粉质皱缩表型是由fse突变造成的，pCAMBIA1305.1-OsFSE可以使突变体fse种子粉质皱缩表型恢复野生型正常表型。

<110>南京农业大学

<120>一种植物调控淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与应用

<160> 9

<210> 1

<211>937

<212> PRT

<213>稻属水稻（Oryza sativa var.滇粳优（DJY））

<220>

<223>调控淀粉合成相关蛋白OsFSE氨基酸序列

<400> 1

Met Glu Ser Pro Ala Ala Arg Gly Ala Leu Gly Asn Asn Ala Ser Gly Ala Ser Thr Ser

1 5 10 15 20

Gln Ala Ala Pro Gly Ala Val Asn Gly Gly Ala Ser Pro Asn Ser Leu Arg Asn Thr Pro

25 30 35 40

Ser Asn Ile Ala Arg Leu Glu Asn Ala Ile Glu His Cys Ala Ala Arg Arg Lys Tyr Leu

45 50 55 60

Ala Arg Thr Lys Ser Pro Ser Asn Gly Glu Asn Val Arg Trp Tyr Phe Cys Lys Leu Pro

65 70 75 80

Leu Ala Asn Lys Ala Leu Ser Ala Ser Val Pro Arg Thr Glu Ile Val Gly Lys Gly Asn

85 90 95 100

Tyr Phe Arg Phe Ser Met Arg Asn Ser Leu Ala Leu Glu Ala Ser Phe Leu Glu Arg Glu

105 110 115 120

Glu Ala Leu Leu Ala Tyr Trp Trp Arg Glu Tyr Ala Glu Cys Ser Glu Gly Pro Lys Gly

125 130 135 140

Ser Leu Val Ala Ala Asn Ala Ser Asn Ser Lys Ser Leu Tyr Lys Val Glu Glu Glu Arg

145 150 155 160

Val Gly Val Pro Val Lys Gly Gly Leu Tyr Glu Val Asn Leu Met Arg Arg His Cys Phe

165 170 175 180

Pro Val Tyr Trp Asn Gly Glu Asn Arg Arg Val Leu Arg Gly His Trp Phe Ala Arg Lys

185 190 195 200

Gly Gly Leu Asn Trp Ile Pro Leu Arg Glu Asn Val Ser Glu Gln Leu Glu Leu Ala Tyr

205 210 215 220

Asn Cys Gln Val Trp His Arg Arg Lys Phe Gln Pro Ser Gly Leu Phe Ala Ala Arg Val

225 230 235 240

Asn Leu Gln Gly Ser Thr Pro Asn Leu His Ala Leu Phe Thr Gly Glu Asn Asn Thr Trp

245 250 255 260

Glu Ala Trp Leu Val Phe Asn Thr Gly Pro Lys Leu Gly Gly Asn Thr Ile Lys Leu Arg

265 270 275 280

Arg Gly Phe Ser Ser Ser Gly Ser Ala Lys Phe Thr Gln Asn Glu Leu Arg Gln Gln Lys

285 290 295 300

Glu Glu Glu Met Asn Asn Tyr Cys Ser Gln Val Pro Val Gly His Leu Val Phe Met Val

305 310 315 320

His Gly Ile Gly Gln Arg Leu Glu Lys Ala Asn Leu Val Asn Asn Val Val Asn Phe Arg

325 330 335 340

Arg Val Thr Ala Asn Leu Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Phe Tyr Gln Arg Ser Thr Gln Arg

345 350 355 360

Val Leu Phe Ile Pro Cys Gln Trp Arg Lys Ser Leu Lys Leu Ser Gly Glu Gln Ser Val

365 370 375 380

Glu Lys Ile Thr Leu Asn Gly Val Lys Gly Leu Arg Val Ala Leu Gly Ala Thr Val His

385 390 395 400

Asn Val Leu Tyr Tyr Met Ser Pro Ile Tyr Cys Gln His Ile Ile Asn Ser Val Ser Asn

405 410 415 420

Gln Leu Asn Gln Leu Tyr Thr Lys Phe Ile Lys Arg Asn Phe Gly Tyr Ser Gly Lys Val

425 430 435 440

Ser Ile Tyr Gly His Ser Leu Gly Ser Val Leu Ser Tyr Asn Ile Leu Cys His Gln Glu

445 450 455 460

Ser Ser Ser Ala Pro Phe Pro Val Asn Tyr Met Asn Met Glu Val Ser Ser Asn Glu Gly

465 470 475 480

His Ile Ala Lys Ser Pro Asn Thr Val Thr Ala His Glu Ser Val Met Lys Glu Gln Asn

485 490 495 500

Thr Ser Ser Ile Ser Gly His Ser Cys Ala Asn Asn Val Asn Asn Val Val Asn Glu Gly

505 510 515 520

Ser Thr Arg Thr Gly Thr Ser Cys Thr Glu Asn Thr Thr Leu Pro Thr Cys Ala Leu Glu

525 530 535 540

Asn Ser Pro Lys Leu Thr Thr Asn Ala Leu Pro Thr Ala Val Asn Gly Glu Gln Ile Glu

545 550 555 560

Val Glu Lys Gln Val Asn Asn His Lys Ile Ala Cys Ser Glu Glu Gly Asn Asn Ser Ser

565 570 575 580

Val Arg Ala Lys Asn Ile Asn Ser Cys Ile Ile Ser Arg Ser Ala Glu Gly Val His Ala

585 590 595 600

Asn Val Pro Asn Lys Asn Thr Leu Ile Ser Ser Leu Lys Glu Glu Val Glu Arg Leu Lys

605 610 615 620

Ala Arg Leu Ala Gln Leu Glu Gln His Asn Asn Leu Val Thr Glu Ser Ser Ala Glu Ser

625 630 635 640

His Gln Gly Lys Ser Ala Thr His Ala Val Asn Leu Ser Ser Gly Lys Asn Arg Ile Gly

645 650 655 660

Gln Gly Ser Thr Ser Glu Ser Tyr Thr Pro His Ile Arg Tyr Thr Lys Leu Asn Phe Lys

665 670 675 680

Val Asn Thr Phe Tyr Ala Val Gly Ser Pro Leu Gly Val Phe Leu Ser Leu Arg Asn Val

685 690 695 700

Arg Ile Gly Ile Gly Arg Gly Gln Asn Tyr Trp Gln Asn Glu Asn Ile Val Glu Glu Met

705 710 715 720

Pro Cys Cys Arg Gln Met Phe Asn Ile Phe His Pro Phe Asn Pro Val Ala Tyr Arg Ile

725 730 735 740

Glu Pro Leu Val Cys Glu Asn Tyr Ile Ser Lys Arg Pro Val Ile Val Pro Tyr His Arg

745 750 755 760

Gly Gly Lys Arg Ile His Val Gly Val Gln Glu Phe Thr Glu Asn Ile Ala Ala Arg Ser

765 770 775 780

Gln Ala Val Ala Arg Gln Phe Lys Ser Leu Lys Val Lys Ala Val Ala Ala Leu Leu Ser

785 790 795 800

Leu Ser Arg Asn Asn Thr Asn Glu Asn Val Asn Ser Asn Asn Glu Lys Glu Lys Ser Tyr

805 810 815 820

Gly Tyr Met Met Met Glu Arg Leu Thr Gly Ser Pro Asn Gly Arg Ile Asn His Val Leu

825 830 835 840

Gln Glu Lys Thr Phe Gln His Pro Tyr Leu Ser Ala Leu Gly Ser His Thr Asn Tyr Trp

845 850 855 860

Arg Asn His Asn Thr Ala Leu Phe Ile Leu Lys His Leu Tyr Arg Asn Ile Pro Glu Glu

865 870 875 880

Pro Pro Thr Asn Asn Pro Glu Arg Met Pro Ile Arg Leu Phe Tyr Val Arg Asn Pro Ile

885 890 895 900

Ala Glu Glu Thr Pro Leu Thr Phe Ser Asn Asn Ser Leu Val Lys Glu Phe Ser Arg Lys

905 910 915 920

Val Arg Thr Tyr Ser Arg Lys Ser Glu Asn Asn Ser Ser Cys Glu Ser Sercccccccccc

925 930 935

<210>2

<211> 2811

<212> DNA

<213>稻属水稻（Oryza sativa var.滇粳优（DJY））

<220>

<223>调控淀粉合成相关基因OsFSE的CDS序列

<400>2

atggagtccc ccgcggcgcg tggcgccctc ggggacgacg cgtcgggggc gtccacgagc 60

caggcggccc ccggggccgt ggatggcggc gcgtcgccgg actcgctgcg gaacacgccc 120

tccaacatcg cgaggctgga ggacgccatc gagcactgcg ccgctcgccg caagtacctc 180

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ctcgccgaca aagcgctctc tgcttcagtt ccacggacag agatagtggg aaaaggggac 300

tacttccggt tcagcatgag agactctctt gcattggagg cgtccttctt ggagagggag 360

gaagctctgc ttgcatactg gtggagagag tacgccgagt gcagcgaagg gccaaaaggt 420

tccttagttg cagctgatgc ttcggattct aaaagtctgt ataaggtgga ggaagaacgg 480

gttggggttc ctgtgaaagg cggactttat gaggtcgatt taatgagacg tcattgcttc 540

cctgtgtact ggaatgggga gaacaggcgt gtcttgaggg gccactggtt tgctcgcaaa 600

ggagggcttg attggatccc cttgcgtgaa gatgtttctg aacaacttga gctagcatat 660

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gatctccaag gaagcacccc ggacttgcat gctcttttta ctggagagga tgatacctgg 780

gaagcttggc tggtctttga tactggtcct aagctaggtg gcaacacaat caaattaagg 840

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catggcattg gccagaggtt ggagaaagct aatcttgttg atgatgttgt tgatttccgc 1020

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gagaaaatca ctttggatgg agttaaaggt cttcgtgtag cattaggtgc cacagttcat 1200

gatgttctgt attacatgag tcctatatac tgtcagcaca taattgactc ggtctcaaac 1260

cagttgaacc agttgtacac aaagtttatc aagagaaatc ctggttatag tggaaaggtt 1320

tcaatatatg ggcactcgtt aggaagtgtt ctatcttatg acatactttg ccaccaagaa 1380

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cacatagcaa aatcgcctga cacagttact gcacatgaat cagtcatgaa ggagcaagat 1500

acatcttcca tttctgggca ttcttgtgct gataatgtaa atgatgtagt tgatgaaggg 1560

agcaccagaa ctggcacttc atgtacagag gacaccaccc tcccaacatg tgcacttgaa 1620

aattcaccga aacttaccac agatgcacta cctacagcag tagatggaga acaaattgaa 1680

gtcgaaaaac aggtcgacaa tcataaaatt gcatgcagtg aagaagggga caattcatct 1740

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gatgtccctg acaaagatac attgatatca tcattgaaag aagaggtgga acgccttaaa 1860

gctagattag cacaacttga acaacataat gatttggtga ctgaaagcag tgctgagtct 1920

catcaaggta aaagtgccac tcatgcagtg aacctatcat caggcaaaaa ccgcataggg 1980

caaggaagca cgagtgagtc ctacacacca cacatcagat acactaaact aaattttaag 2040

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gtgagaactt attcaagaaa atctgagaac gattcaagct gtgaatcttc c 2811

<210>3

<211> 10313

<212> DNA

<213>稻属水稻（Oryza sativa var.滇粳优（DJY））

<220>

<223>调控淀粉合成相关基因OsFSE的DNA序列

<400>3

acgaagcaga gttgagtttt ggagaagaag gaaccatctg gattcccctc gcgaacggca 60

cattcccttc ccttcccacc cacggcgagg cgcgggcccc acctcgccgc ctcctccgtt 120

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gtaagattgt ggactaagtg aattttttta gctctgtcac acacctgtaa tactgtataa 1500

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catacactgt tgcaggtcga tttaatgaga cgtcattgct tccctgtgta ctggaatggg 1620

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tgtaacagca tgacttgctc agaaaagaga gaatggcaac ttaggacaag gctgaataat 2220

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tctttgatac tggtcctaag ctaggtggca acacaatcaa attaaggcgt gggttttcat 2340

cttctggatc agcgaagcct acacaggtca gctgccctgt tgaatgttga tgcttttgcc 2400

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tgagaattta atctgatagt gctatcttgc tactcctgag gtaaactgta caaagtcaat 2640

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gcatataccc tcccaatata tgtagtccaa tgattctgta cacattaata cactatagta 5340

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gatcgtaatg actggaagca tattttttac tcgttatata aaattgagga tttaagtctg 5880

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tatagtggaa aggtttgcac acatcaccct tcggaaatat ctttaggagt gcacttgcat 6000

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cttccatttc tgggcattct tgtgctgata atgtaaatga tgtagttgat gaagggagca 6300

ccagaactgg cacttcatgt acagaggaca ccaccctccc aacatgtgca cttgaaaatt 6360

caccgaaact taccacagat gcactaccta cagcagtaga tggagaacaa attgaagtcg 6420

aaaaacaggt cgacaatcat aaaattgcat gcagtgaaga aggggacaat tcatctgtaa 6480

gagcaaaaga cattgacagt tgtatcattt caagatctgc tgagggagtc catgcggatg 6540

tccctgacaa agatacattg atatcatcat tgaaagaaga ggtgtggcat tatcaaattt 6600

atctaactta taatgtacct gccatcttct attcatctat cttgataagc aagctaaatg 6660

ttggttgcct tgggagaaat ggtcaacagt aatgtataaa atagaatgca agaactcatt 6720

gcaacaccct aactgatagt gttatcttga agcaaagtaa cagcgagaga taaacttgca 6780

tatcaaattg atccctgcac ttctgccctt actgtaggtg gaacgcctta aagctagatt 6840

agcacaactt gaacaacata atgatttggt gactgaaagc agtgctgagt ctcatcaagg 6900

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gaacttcttc attttggatg aacaagaaat atgaaaatct gattttatct tttgaaatag 7860

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tcagatgttc aacatttttc atccctttga tcctgtagca tacaggtttg cagctttcgt 8160

acatatatta atgatgtttt catcacttct ctttatgtac tggagaagac tgtccttatc 8220

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acttgtatgt gaagattaca taagcaagcg ccctgtaatt gtaccctacc atagaggggg 8340

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tgttcagagg acgttgacag caataatgag aaagagaagt catatggtta catgatgatg 8880

gaaaggctga caggttcacc agatggtcgg attgaccatg tacttcaggt tattaaactt 8940

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tgtactctgc tttggatgtg aaaagtactg tacattgctt ttgacatgaa tggtgagagc 9060

ttaaatcatt ctaaccaata taagtgatta atttaacacc ctaaattagc ttcaaggtta 9120

atcttcacaa gagagttaaa cccataaact ctgaagttgg ttaaattttg gctcataaaa 9180

gagcacataa atccaagatg ttaaatacta ttaaatgcac ttctatacca aatgagtgag 9240

gacatgattt aaaatatgcc taatttgttc agtaaccctt tagctaacct atcttaacca 9300

actactgtgg cctaaaagaa ctgacagtgg aaatcatata accactggct aagctttgaa 9360

ttggctggtt cccctgtctc cgctggttta gtggttactg tgtcaggact gcgaaccctt 9420

ttgccaacat gaccaattcc cttgcgcccc cccccctttt tttttctggc ttattgtata 9480

ttatttatgt cagtacaaat atgttgtagc ttacagtccg aatcatttga tttcaggaga 9540

aaacatttca acacccatac ttatctgccc tgggatctca tacgtaagtt ccataatcaa 9600

tcctgttgtt tgctaattgt ttaacatgcc tgttcaccat ttaactggcc tgtgggttta 9660

ttcttgtagc aattattggc gagatcatga tactgctctt ttcattctca aacatctgta 9720

ccgtgatata cctgaagaac ctccaactga tgatcctgaa aggatgccta ttcgactgtt 9780

ttatgtgagg gatccaattg ctgaagagac tcccttgacg ttttcagata attcattagt 9840

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tgaatcttcc tgatggtatg gatgagcaat tgtattcttt tcattctctt ttcaggcgtg 9960

ttgatatggt catgctgatc ttttggcagg ttggctggaa cctgcttaat tttgcatctc 10020

ttgatgaatg atactaaatc acaatgcgac atctctttct tttctgcagg atatgctatg 10080

ataatctcac tgagagggta gattctagac atggaggaac acttagataa agagatgcgt 10140

ggttcatagt tcatacttga ccacagaatc ggagcacccg ggtgaatgtt gtacataaaa 10200

tctgcccggt tgccgtgcaa cttttgtatc taaactaaag aaaatgtaat gttgtacatg 10260

tacaaataag gctatatagg aaatggaaaa agaaaagaga ttagttttga cca 10313

<210> 4

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>primer1

<400> 4

cacattccct tcccttcc 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> primer2

<400> 5

ctccgattct gtggtcaagt a 21

<210> 6

<211>28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> primer3

<400> 6

ggactagtat ggagtccccc gcggcgcg 28

<210> 7

<211>28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> primer4

<400> 7

gctctagagg aagattcaca gcttgaat 28

<210> 8

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> primer5

<400> 8

atggaaaggc tgacaggttc 20

<210> 9

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> primer6

<400> 9

gagatcccag ggcagataag 20

序列表

Claims

1.一种调控淀粉合成相关蛋白OsFSE，其特征在于，所述的调控淀粉合成相关蛋白OsFSE是如下(a)或(b)所述的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白转运储藏相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因OsFSE。

3.根据权利要求2所述的基因OsFSE，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：

1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白OsFSE的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码调控植物淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体、表达盒或重组菌，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1305.1-GFP载体的酶切位点SpeI和XbaI之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.一种植物调控淀粉正常合成的方法，其特征是将权利要求2或3所述基因导入种子粉质皱缩的种子中，得到种子正常透明的转基因植物；所述种子粉质皱缩的植物是种子中淀粉合成受阻，淀粉颗粒形态变小，不规则，排列疏松，形成不透明外观，伴随总淀粉含量和直链淀粉含量显著下降，支链淀粉链长分布改变；所述种子正常透明的转基因植物为种子外观表型透明不皱缩达到野生型的水平的转基因植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入种子粉质皱缩的植物中。

10.一种培育种子粉质皱缩的转基因植物的方法，是抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到种子粉质皱缩的转基因植物；所述目的植物为携带权利要求2或3所述基因的植物。