CN106432447B - 一种植物淀粉合成相关蛋白OsPKp1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物淀粉合成相关蛋白OsPKp1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白分选相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的植物淀粉合成相关蛋白影响植物胚乳中淀粉的合成。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的植物中，可以培育淀粉合成正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物淀粉合成相关蛋白OsPKp1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物淀粉合成相关蛋白OsPKp1及其编码基因与应用。

背景技术

在植物中，淀粉是主要的储能物质，其合成途径中的许多合成酶和调控因子都已经被很好地鉴定和研究。淀粉是稻米籽粒最主要的组成成分，其含量和特性直接影响稻米的各项品质指标及最终适口性，同时淀粉的积累水平还可能影响水稻的产量，因此，深入研究水稻这一单子叶模式植物淀粉合成途径中的关键因子及调控网络具有重要的理论意义与应用价值。

水稻胚乳水不溶的淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成。支链淀粉占75％以上，它由分支的α-1,6糖苷键连接，而占少量的直链淀粉线性的α-1,4糖苷键连接。植物中大量参与淀粉合成的关键酶已经被研究。直链淀粉由颗粒结合型淀粉合酶(IGBSSI)合成，它由Waxy基因编码。支链淀粉的合成由淀粉合酶(SSs)，淀粉分支酶(BEs)和淀粉去分支酶(DBEs)。植物中SSs，BEs，DBEs存在多种异构体SSI-IV，BEI-II，DBE1-3和DBE。在水稻中这些基因的突变，都会是胚乳淀粉表现异常特征。BEIIb突变表现心白胚乳，支链淀粉结构，淀粉颗粒的糊化特性都发生改变。ALK编码一个预测为可溶淀粉合酶IIa的基因，SSIIa关键氨基酸的改变导致籼稻和粳稻支链淀粉结构和淀粉特性的差异。

除了合成酶之外，水稻中一些其它因子间接地参与淀粉的合成。参与内质网中蛋白成熟的类二硫键异构酶(PDIL-1)基因功能丧失同样影响淀粉的合成，突变体表现粉质胚乳和淀粉颗粒变小。MADS29是水稻MADS-BOX家族的成员，参与讲解珠心和珠心突起。抑制MADS29的表达减少淀粉的合成和形成异常的胚乳。因此发现并克隆淀粉合成和调控相关基因，将有助于我们通过基因工程的手段来对稻米进行改良。

发明内容

本发明的目的是提供一种淀粉合成相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的淀粉合成相关蛋白(OsPKp1)，来源于稻属水稻(Oryza sativa var.越光(Koshihikari))，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.1由578个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的OsPKp1便于纯化和研究在水稻细胞的亚细胞位置，可在由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如SEQ IDNO.8所示的MBP标签或SEQ ID NO.9所示的GFP标签。

上述(b)中的OsPKp1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsPKp1的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述淀粉合成相关蛋白的基因(OsPKp1)也属于本发明的保护范围。

所述基因OSFSE可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码调控淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

SEQ ID NO.2由1737个核苷酸组成，为OsPKp1的CDS。

SEQ ID NO.3由4639个核苷酸组成，为OsPKp1的DNA序列。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCUBi 1390载体的多克隆位点KpnI和BamHI之间重组插入所述基因(OsPKp1)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCUBi 1390–OsPKp1；所述pCUBi 1390-OsPKp1是由OsPKp1基因组编码序列通过重组技术插入到pCUBi 1390多克隆位点HindIII和BamHI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

将含有OsPKp1的pCUBi 1390命名为pCUBi 1390-OsPKp1。

含有以上任一所述基因(OsPKp1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsPKp1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围；如SEQ ID NO.4所示的primer 1/SEQ ID NO.5所示的primer 2；SEQ ID NO.6所示的primer3/SEQ ID NO.7所示的primer 4。

本发明的另一个目的是提供一种培育淀粉合成正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入淀粉合成异常的植物中，得到淀粉合成正常的转基因植物；所述淀粉合成异常植物为胚乳表现为粉质表型的植物；所述淀粉合成正常的转基因植物为胚乳表现透明非粉质的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入淀粉合成异常植物中；所述淀粉合成异常植物可为W59。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明的淀粉合成相关蛋白影响水稻胚乳中谷淀粉合成的过程。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的粉质胚乳植物中，可以得到胚乳透明非粉质的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为野生型越光和突变体W59的籽粒表型。

图2为野生型越光和突变体W59的籽粒扫描电镜观察。

图3为野生型越光和突变体W59胚乳半薄切片观察。

图4为野生型越光和突变体W59灌浆速率及千粒重对比。

图5为野生型越光和突变体W59理化性质比较。

图6为突变基因在第7染色体上的精细定位。

图7为转pCUBi 1390-OsPKp1的T₀代植株的T₁籽粒表型。

图8为转pCUBi 1390-OsPKp1的T₀代植株的T₁籽粒提蛋白western检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物淀粉合成相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻淀粉合成突变体W59表型分析及其遗传分析

粳稻品种越光经MNU诱变突变体库中筛选出种子粉质不透明突变体W59。

图1左图为越光成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为胚乳完全透明的表型，右图为W59成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为胚乳心白的表型。

图2为越光和W59扫描电镜分析图。越光的成熟种子扫描电镜表现为淀粉颗粒排列紧密，大小均一，而W59中淀粉颗粒排列松散，使得颗粒之间存在间隙。因此在光线通过时会发生散射，导致W59籽粒外观呈现不透明表型。

利用半薄切片后的I₂-KI染色来观察越光和W59复合淀粉颗粒的形态(图3)。在野生型越光胚乳里层细胞中，每个造粉体内部产生多个独立存在的淀粉颗粒，这是水稻典型的复合淀粉颗粒结构，淀粉颗粒排列紧密(图3)。进一步观察突变体W59，发现其胚乳里层细胞的胞质中，存在许多小的、零散分布的单粒淀粉颗粒，而且淀粉颗粒之间排列不紧密，会有空泡，并且淀粉颗粒差生异常融合，表明突变体中淀粉发育的滞后性(图3)。

在整个种子发育过程中，W59突变体的灌浆速率明显低于野生型(图4)。从开花后5天开始，突变体的干物质积累开始显著低于野生型，并且这个差异一直维持到灌浆结束。与灌浆速率明显降低相对应的结果是，成熟的W59突变体种子千粒重明显低于越光(图4)。

W59突变体的种子具有较低含量的脂肪，同时淀粉含量较野生型显著降低(图5)。相应地，直链淀粉含量显著降低(图5)。

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

用突变体W59与NJ11杂交，在W59/NJ11的F₂分离群体中随机选取籽粒粉质的种子，发芽后，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA。首先，用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物在越光和NJ11之间进行多态性分析，之后每间隔10cM挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本DNA连同群体DNA共计三个DNA样本，利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后将淀粉合成关键基因OsPKp1定位在第7染色体SSR标记N7-9和N7-15之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman InstrumentInc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O 5.1ul，共10ul。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发SSR标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体位点。从越光/NJ11杂交组合获得的F₂分离群体中挑出确认为突变表型的F₂种子，用于突变位点的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在越光和NJ11之间的多态性，表现多态者用作精细定位OsPKp1基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表3。

表3用于精细定位的分子标记

标记	正向引物	反向引物	物理距离bp	类型
					W59-3	CACCACGATATCCACCTCTAGC	CCTAGGATGAACACTGATGATGG	4660420	InDel
W59-8	CACGTACGCCACCAGCATCC	CACATGGCCTACTCCAAGTTCTGG	3317940	InDel
					W59-11	CTATCTCGCTCTCGCAAACACC	TCACCCTATCAGTGTGGGTAATGG	3770854	InDel
W59-13	CAAGCTGCCGTGTTCTACTGG	GCACACAACAAGAGACAGTAACATGC	4028504	InDel
					W59-14	TCCGGTCGTCCTCATCGTATCC	GCCCTCTTGCTCCCACATCG	4419897	InDel
W59-15	ACAAGTCCACAAGGACCACAACC	TGCTCCACCCAAAGATACAGAGC	4561618	InDel
					W59-16	TTACCGACCGCAGTTATCT	TTGTTTCCCTCAACTCACTG	4346594	InDel
W59-19	CTCAAATCCAAGAACCCATC	GATGGCACAGTACAAGGTTC	4499486	InDel
					W59-34	CCCCCGTAAGTGAAGAG	TGTCGGTGACGGTGAGT	4107398	InDel
W59-35	GCAAAGACCAAAACCCC	TGGGCACGGAAAAAATA	4124772	InDel
					W59-37	GCAACGAAGGACTAGATGTG	AACCTATGACTGGGTGTGAC	4197976	InDel
7-9	TCACTAGCTCTGCCCTGACC	TGATGAGAGTTGGTTGCGAG	2677960	SSR
					N7-12	AGACGTACACCCCGAACTTG	GAGGTGTTCGGAGTGAGGAG	4320108	SSR
N7-15	GAGAGGAATGGAATGGAATGAGG	GAACAGGCATGGTGAAGAGTGC	6765604	SSR

根据F₂群体中胚乳粉质单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法，最终把OsPKp1基因精细定位在W59-40和W59-45之间，物理距离约为170kb(图6)。候选区段基因组测序显示，在W59中，基因Os07g0181000中存在一个碱基的突变，由G突变为A，导致蛋白翻译提前终止。

(3)突变基因的获得

根据定位的位点设计引物，序列如下所述：

primer1：5'-AACGCCTCGTCTGAACACAAAACC-3'(SEQ ID NO.4)

primer2：5'-AAAGAATCTTTACTGGGCTC-3'(SEQ ID NO.5)

以primer1和primer2为引物，以越光的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。该对引物位于SEQ ID NO.2上游71bp和下游335bp，扩增产物为2022bp的目的片段。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃2min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码578个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TGA)(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQIDNO.1所示的蛋白命名为OsPKp1(即为基因定位中所述的OsPKp1基因)，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsPKp1。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以越光的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsPKp1基因的编码序列，PCR引物序列如下：

primer3：5'TTCTGCACTAGGTACCATGGCCGCCACCGCCG 3'(SEQ ID NO.6)

primer4：5'GAATTCCCGGGGATCCTCAAGGTACGTTCATG 3'(SEQ ID NO.7)

上述引物分别位于序列2所示基因的ATG开始到TGA结束，扩增产物包含了该基因的全部编码区部分，将PCR产物回收纯化。采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCUBi1390中，构建成pCUBi1390-OsPKp1；重组反应体系(10.0μL)：PCR产物5.4μL(50-100ng)，pCUBi1390载体1.6μL(30-50ng)，5×Infusion buffer 2.0μL，Infusionenzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴0.5h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。

37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ IDNO.3所示基因的重组表达载体，将含有OsPKp1的pCUBi1390命名为pCUBi1390–OsPKp1,OsPKp1基因插入在多克隆位点KpnI和BamHI之间。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pCUBi1390–OsPKp1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为pCUBi1390–OsPKp1。

三、转基因植物的获得

将pCUBi1390–OsPKp1转化突变体W59具体方法为：

(1)28℃培养pCUBi1390–OsPKp1培养16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的W59水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(Phyto TechnologyLaboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、潮霉素抗性鉴定

本研究中利用1‰浓度的潮霉素溶液鉴定转基因植株。具体方法：将新鲜的转基因植株叶片(没有转基因植株叶片做阴性对照)放在培养皿中，用新配的1‰的潮霉素溶液浸泡，放在28℃培养箱中暗培养48小时，与对照比较，叶片坏死的表明不抗，没有坏死的表明抗，将抗潮霉素的三个家系命名为HB-1，HB-2和HB-3。

2、Western Blot鉴定

对T₀代植株所结的T₁代种子提取总蛋白，种子蛋白提取液配方(5M UREA,4％SDS,0.125M Tris-Hcl pH6.8，β-Me 5％，少量溴酚蓝)，每一粒种子加入350ul提取液，于50℃烘箱放置12-16个小时，上下颠倒混匀，12000rpm离心2分钟，吸取10ul进行SDS-PAGE，转到尼龙膜后，用OsPKp1一抗和兔二抗分别进行孵育。T0代不同家系植株所结的T1代种子中，挑取变透明的个体在目标位置(63kD)有条带的，即为阳性互补家系。图8中后3条泳道在目的位置有条带，且含量高于野生型，表明这两个T1代种子所对应T0代植株为转基因阳性植株，第1、2条泳道分别为野生型和W59。

3、表型鉴定

分别将T₀代转pCUBi1390–OsPKp1的阳性植株，越光和W59种植在南京农业大学牌楼试验基地。对T1代种子进行表型鉴定，发现在T1代显示出(透明：粉质＝3:1)的表型，透明籽粒的表型与越光相同，不透明籽粒的表型与W59相同(图7)，说明导致W59突变体表型确实是OsPKp1基因控制的，即该OsPKp1基因为淀粉合成相关基因。

<110> 南京农业大学

<120>一种植物淀粉合成相关蛋白OsPKp1及其编码基因与应用

<160> 9

<210> 1

<211> 578

<212> PRT

<213> 稻属水稻（Oryza sativa var. 越光（Koshihikari） ）

<220>

<223> 调控淀粉合成相关蛋白 OsPKp1 氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala His Thr Leu Leu His Leu Ala

1 5 10 15

Ala Pro Arg Lys Pro Ser Ala Gly Pro Pro Leu Pro Pro Ala Thr

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ser Arg Arg Leu Ala Arg Leu Thr Ala Ser Cys

35 40 45

Ser Ser Gly Ser Gly Asn Asn Ser Ala Ala Asp Phe Pro Asn Pro

50 55 60

Asn Gly Ile Leu Val Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ala Val Ala Ala

65 70 75

Ala Ser Ser His Ile Asp Val Asp Val Ala Thr Glu Ala Asp Leu

80 85 90

Arg Glu Asn Gly Phe Arg Ser Thr Arg Arg Thr Lys Leu Val Cys

95 100 105

Thr Val Gly Pro Ala Thr Cys Gly Ala Asp Glu Leu Glu Ala Leu

110 115 120

Ala Val Gly Gly Met Asn Val Ala Arg Val Asn Met Cys His Gly

125 130 135

Asp Arg Glu Trp His Arg Gly Val Ile Arg Ala Val Arg Arg Leu

140 145 150

Asn Glu Glu Lys Gly Phe Ala Val Ala Val Met Met Asp Thr Glu

155 160 165

Gly Ser Glu Ile His Met Gly Asp Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala

170 175 180

Lys Ala Glu Asp Gly Glu Ile Trp Thr Phe Ser Val Arg Ser Phe

185 190 195

Glu Ala Pro Pro Pro Glu Arg Thr Ile His Val Asn Tyr Glu Gly

200 205 210

Phe Ala Glu Asp Val Arg Val Gly Asp Glu Leu Leu Val Asp Gly

215 220 225

Gly Met Ala Arg Phe Glu Val Val Glu Lys Leu Gly Pro Asp Val

230 235 240

Lys Cys Arg Cys Thr Asp Pro Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Asn

245 250 255

Leu Thr Phe Trp Arg Asp Gly Ser Ile Val Arg Glu Arg Asn Ala

260 265 270

Met Leu Pro Thr Ile Ser Ser Lys Asp Trp Leu Asp Ile Asp Phe

275 280 285

Gly Ile Ser Glu Gly Val Asp Phe Ile Ala Val Ser Phe Val Lys

290 295 300

Ser Ala Glu Val Ile Asn His Leu Lys Ser Tyr Ile Ala Ala Arg

305 310 315

Ser Arg Gly Ser Asp Ile Ala Val Ile Ala Lys Ile Glu Ser Ile

320 325 330

Asp Ser Leu Lys Asn Leu Glu Glu Ile Ile Arg Ala Ser Asp Gly

335 340 345

Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Met Gly Ala Gln Ile Pro Leu Glu

350 355 360

Gln Val Pro Ser Val Gln Gln Lys Ile Val Lys Leu Cys Arg Gln

365 370 375

Leu Asn Lys Pro Val Ile Val Ala Ser Gln Leu Leu Glu Ser Met

380 385 390

Ile Glu Tyr Pro Thr Pro Thr Arg Ala Glu Val Ala Asp Val Ser

395 400 405

Glu Ala Val Arg Gln Arg Ala Asp Ala Leu Met Leu Ser Gly Gly

410 415 420

Ser Ala Met Gly Arg Tyr Pro Glu Lys Ala Leu Ser Val Leu Arg

425 430 435

Ser Val Ser Leu Arg Ile Glu Lys Trp Trp Arg Glu Glu Lys Arg

440 445 450

His Glu Glu Leu Glu Leu Lys Asp Val Ser Ser Ser Phe Ser Asp

455 460 465

Lys Ile Ser Glu Glu Ile Cys Ile Ser Ala Ala Lys Met Ala Asn

470 475 480

Lys Leu Glu Val Asp Ala Val Phe Val Tyr Thr Asn Thr Gly His

485 490 495

Met Ala Ser Leu Leu Ser Arg Cys Arg Pro Asp Cys Pro Ile Phe

500 505 510

Ala Phe Thr Thr Ser Thr Ser Val Arg Arg Arg Leu Asn Leu Gln

515 520 525

Trp Gly Leu Ile Pro Phe Arg Leu Ser Phe Ser Asp Asp Met Glu

530 535 540

Ser Asn Leu Asn Arg Thr Phe Ser Leu Leu Lys Ala Arg Gly Met

545 550 555

Ile Gln Ser Gly Asp Leu Val Ile Ala Leu Ser Asp Met Leu Gln

560 565 570

Ser Ile Gln Val Met Asn Val Pro

575

<210> 2

<211> 1737

<212> DNA

<213> 稻属水稻（Oryza sativa var. 越光（Koshihikari） ）

<220>

<223> OsPKp1基因CDS序列

<400> 2

atggccgcca ccgccgccgc ggcccacacc ctcctccacc tcgcggcccc gaggaagccc 60

tccgcggggc ccccactccc gcccgccacc ctccgcctcc ccagccgccg cctcgcccgt 120

ctcacggcca gctgcagcag cggctccggg aacaacagcg ccgccgactt ccccaacccc 180

aacgggatcc tcgtcgcgcc cccgtccgcc gcggcggtgg cggcggcgtc gtcgcatatc 240

gatgttgacg tggcgacgga ggccgacctg agggagaacg ggttccggag cacgcggcgc 300

accaagctcg tctgcaccgt ggggcccgcc acctgcggcg ccgacgagct ggaggcgctc 360

gccgtcggcg ggatgaacgt cgcgcgcgtc aacatgtgcc acggggaccg ggagtggcac 420

cggggcgtca tccgcgcggt gcggaggctc aacgaggaga aggggttcgc cgtcgccgtc 480

atgatggaca ccgaggggag cgagatccac atgggggacc tcggcggcgc cgccgccgcc 540

aaggcggagg atggagaaat atggacattt agcgtaagat cctttgaggc acctccccca 600

gaacgaacta ttcatgtgaa ctacgaaggc ttcgctgaag atgtgagagt tggtgatgag 660

cttcttgttg atggtggcat ggctcggttt gaggtggttg agaaattagg accagatgtc 720

aagtgccgtt gcacagatcc tggtttgttg ctgccacgtg ccaatcttac attttggcgg 780

gatggtagta ttgtccgtga gaggaacgct atgctaccta ccatttcatc aaaggattgg 840

cttgacatag actttggaat ttctgaaggc gtagatttta ttgcagtttc gtttgtcaaa 900

tctgcagaag taattaacca tctgaaaagc tatatagctg caaggagccg tggcagcgat 960

atagcagtca ttgccaagat cgagagcatt gactctttga agaacttgga ggagataatc 1020

cgtgcttcag atggtgccat ggtagcccga ggggatatgg gtgcacaaat tcccttggag 1080

caagtcccct cagtacaaca aaagatagtt aaactgtgca ggcagctcaa caagccagtc 1140

attgttgcgt cgcagcttct tgaatcgatg attgagtatc ctacgcccac cagggccgag 1200

gttgctgatg tttctgaagc agttcgtcag cgtgcagatg cgcttatgct ttcaggtgag 1260

tcagcaatgg ggagatatcc agagaaagct cttagtgtcc tccggagtgt tagcctaagg 1320

attgagaagt ggtggagaga ggagaagcgc catgaggaac tggaacttaa agatgtttca 1380

tcttccttct ctgacaaaat atcagaagaa atctgcattt cggccgctaa aatggccaac 1440

aaattggagg tagatgccgt tttcgtctac acaaacactg gccacatggc ctcactgctc 1500

tcgcggtgcc gtcctgactg cccgatcttc gccttcacga cctcgacatc tgtgaggaga 1560

cgattgaacc tccaatgggg cctcatcccc ttccgcctca gcttctcgga cgacatggag 1620

agcaacctga accgtacctt ctcgctgctc aaggccaggg gcatgatcca gtccggcgac 1680

cttgtcatcg cgctctccga catgctgcag tccatccagg tcatgaacgt accttga 1737

<210> 3

<211> 4639

<212> DNA

<213> 稻属水稻（Oryza sativa var. 越光（Koshihikari） ）

<220>

<223> OsPKp1基因

<400> 3

caacgcctcg tctgaacaca aaaccccgta aaaatctccg cctccgccac cgccaccgcc 60

gccgacgccg ccatggccgc caccgccgcc gcggcccaca ccctcctcca cctcgcggcc 120

ccgaggaagc cctccgcggg gcccccactc ccgcccgcca ccctccgcct ccccagccgc 180

cgcctcgccc gtctcacggc cagctgcagc agcggctccg ggaacaacag cgccgccgac 240

ttccccaacc ccaacgggat cctcgtcgcg cccccgtccg ccgcggcggt ggcggcggcg 300

tcgtcgcata tcgatgttga cgtggcgacg gaggccgacc tgagggagaa cgggttccgg 360

agcacgcggc gcaccaagct cgtctgcacc gtggggcccg ccacctgcgg cgccgacgag 420

ctggaggcgc tcgccgtcgg cgggatgaac gtcgcgcgcg tcaacatgtg ccacggggac 480

cgggagtggc accggggcgt catccgcgcg gtgcggaggc tcaacgagga gaaggggttc 540

gccgtcgccg tcatgatgga caccgagggg agcgagatcc acatggggga cctcggcggc 600

gccgccgccg ccaaggcgga ggtgagctta gctgccgctg gattctgcct ttggcattgc 660

cgccttgcta atttgctttc atgcgttcga tggaattcgg cgagtaccgc gtgcgtggtg 720

ctagcaagta cgtgaattca tactactagt gagtaggaat gcgtgcttta ttcgacttgg 780

aattcggata aagaagatgt cctgacaccg tgactcggta gatctagatt tgagctcagg 840

ttcatgtttg cacagtgaag gggaacacta gtattgttat ggaatattct tccatgaaat 900

gctactagca cccaacattc cctggagtgg ggataccagt ttggattttg cgcaacttta 960

tcgcaagttg ggtgataaca tgaatccaga ttctactgca gagaatataa gagatgctca 1020

ggtagatgca aaagagagag ccacatcata atctcacttg agcaagtgct ccagcccctt 1080

ctgggactac catgttatag acctgtcaac aagctaaatt aaccacctat ttaagcgtgt 1140

aaccattcca agtgctggcc tccttgttaa ctattgaata ctctgcaact tttcatgcta 1200

ttgtccacgc tggtagagaa acacagttag tttggcctaa ttgtcagcta tgtatgtgtt 1260

ttgtacatgg cccaacaggc tcttgttcct gtaatgtcag cctatagtgt aaatcttgct 1320

ttccagctga aaaaggaaca ccgcatctga attttgttta ttagattcag cagaagcatg 1380

caggcatctg tagtttgagt tttattgact tggtttggca gtcataagct ctgttcttgc 1440

tctagtaaag aattgaagtt tcacattaaa aaaagggtaa agaaattgaa gttaacaata 1500

tctgatgctc caaagtttct gtatcaccta tgtcaatgaa ccatgacata atcttagaga 1560

ttaatgaatt ctctcatatg actggctcac cactctcaaa aataagattc ttgcataatt 1620

tttttcattt gaaacatatt acaagtggct tgaccgctat ctagcactcc ctcctagtca 1680

tatccaatga taactacttt actttttcta gccatgcctt ttattggttc tttttgggtt 1740

ttcctagtgg caatatgccc ctctaatagt tatttatttt aatccttttt ttttcttttg 1800

ttggatttca caggatggag aaatatggac atttagcgta agatcctttg aggcacctcc 1860

cccagaacga actattcatg tgaactacga aggcttcgct gaaggttatt ttcaagcaga 1920

tctcttctgt tggtcttatt tatatttcta ttcccctctg taatgtgttt tttgaacact 1980

acacagatgt gagagttggt gatgagcttc ttgttgatgg tggcatggct cggtttgagg 2040

tggttgagaa attaggacca gatgtcaagt gccgttgcac agatcctggt ttgttgctgc 2100

cacgtgccaa tcttacattt tggcgggatg gtagtattgt ccgtgagagg aacgctatgc 2160

tacctaccat ttcatcaaag gtaaattcac tagcatggca aatttgttgc tgcaagcctg 2220

taatcaaaaa gtaggctgaa tggttatgtc attttgttgc acaaacagtt catgttttac 2280

atgttactac tgaggtcagc ccaaatgaat tacctggttt actcaaacca ttgtgttgta 2340

atagtgaata atatctgcat atattcgaaa aagtccacca tccatttctt agaaagcttt 2400

atgtggactg ttaccaagag ttattgttgt tgagaaatga tgattcttat ttctgtgcaa 2460

cttctgcagg attggcttga catagacttt ggaatttctg aaggcgtaga ttttattgca 2520

gtttcgtttg tcaaatctgc agaagtaatt aaccatctga aaagctatat agctgcaagg 2580

agccgtggca ggtaagatga gtataaatac tctcttcttg attgagctca tacctccatg 2640

aagctaagta catggtttga tggttgaact gatggcacca tatgtatgac taatactgta 2700

actatccaac tcttgtgcat ttgctgcttt tggttcttgt ccaattctgt ggtaccagtt 2760

gggtaagctt ttcagtcagc tacccctcag atgatcagct tagtatgaac gcactgtttt 2820

taactagtta ttacttaaat gttgagttag ccataacttg ctatagtgtc aactcttttg 2880

caccaacaat cttggttttt attaggacat ggtctctttg ttgttagttt ctccaatcaa 2940

ttttttcgat ttgtagtaga gccaagtgga ctatggcagt aagttctgat gtgttgaaga 3000

ttgtcttggt tgctccatac ctgttcaaac aaaaaaactg atcaatatat tattttgtac 3060

tgtttctagt ttagatttgc agtagtgtag taattcactt ttaggttgct ttacgtgtat 3120

tcttttattt ctagaagagt gaacatgatt aataaaatgc atgaatttag atggcttaag 3180

aaaatggacc atacaaatat atcggtatag tgtatagtgt ttatatgtcc caaagaacca 3240

agaaatatta catatatttc tattaaaaaa gctaggcatt gcattcccga aatattagtt 3300

tcctttttgc taacctttat ggttattgta tattgtcact catcagcgat atagcagtca 3360

ttgccaagat cgagagcatt gactctttga agaacttgga ggagataatc cgtgcttcag 3420

atggtgccat ggtagcccga ggggatatgg gtgcacaaat tcccttggag caagtcccct 3480

cagtacaaca aaagatagtt aaactgtgca ggcagctcaa caagccagtc attgttgcgt 3540

cgcagcttct tgaatcgatg attgagtatc ctacgcccac cagggccgag gttgctgatg 3600

tttctgaagc agttcgtcag cgtgcagatg cgcttatgct ttcaggtgag tcagcaatgg 3660

ggagatatcc agagaaagct cttagtgtcc tccggagtgt tagcctaagg attgagaagt 3720

ggtggagaga ggagaagcgc catgaggaac tggaacttaa agatgtttca tcttccttct 3780

ctgacaaaat atcagaagaa atctgcattt cggccgctaa aatgggtaac cactgccaac 3840

tctacttcta ttgttggact gctgctgtat atatgaatcg ttttttcgct gttacttctt 3900

tttgttattg tgcattgcca tggttattat caactcagac tactgaattt tgccatttgc 3960

atatctgggc aaggcctaac cacagctaat ttgagttgca gccaacaaat tggaggtaga 4020

tgccgttttc gtctacacaa acactggcca catggcctca ctgctctcgc ggtgccgtcc 4080

tgactgcccg atcttcgcct tcacgacctc gacatctgtg aggagacgat tgaacctcca 4140

atggggcctc atccccttcc gcctcagctt ctcggacgac atggagagca acctgaaccg 4200

taccttctcg ctgctcaagg ccaggggcat gatccagtcc ggcgaccttg tcatcgcgct 4260

ctccgacatg ctgcagtcca tccaggtcat gaacgtacct tgagaatcat catgctcccc 4320

tctcgtgttt gtttgttctg cccaaaacgg aacacggctt tagttgacat catcttaagg 4380

gcggttttct ggtttgaaat ttattcgttt gttctccatt gtgttagacg acagaaccag 4440

agaatgttac aacaataatg ctgcaacttc cagcgcgttg taaactctat gctatttagc 4500

ctgatgtata aggccatgaa ctgttttgtc gcttactatg ataggctatg tatttaccaa 4560

taaacccttc tatttaagct atgtaagaat tttcctcatc agaaattact ccttgctaga 4620

gcccagtaaa gattcttta 4639

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> primer1

<400> 4

aacgcctcgt ctgaacacaa aacc 24

<210> 5

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> primer2

<400> 5

aaagaatctt tactgggctc 20

<210> 6

<211>32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> primer3

<400> 6

ttctgcacta ggtaccatgg ccgccaccgc cg 32

<210> 7

<211>32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> primer4

<400> 7

gaattcccgg ggatcctcaa ggtacgttca tg 32

<210> 8

<211>387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MBP标签

<400> 8

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp

1 5 10 15

Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys

20 25 30

Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu

35 40 45

Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile

50 55 60

Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly

65 70 75

Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu

80 85 90

Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile

95 100 105

Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys

110 115 120

Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala

125 130 135

Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe

140 145 150

Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp

155 160 165

Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys

170 175 180

Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe

185 190 195

Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp

200 205 210

Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met

215 220 225

Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro

245 250 255

Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala

260 265 270

Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu

275 280 285

Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu

290 295 300

Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp

305 310 315

Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile

320 325 330

Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg

335 340 345

Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu

350 355 360

Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn

365 370 375

Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly Arg

380 385 387

<210> 9

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP标签

<400> 9

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile

1 5 10 15

Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val

20 25 30

Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu

35 40 45

Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr

50 55 60

Leu Val Thr Thr Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr

65 70 75

Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro

80 85 90

Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly

95 100 105

Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu

110 115 120

Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly

125 130 135

Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn

140 145 150

Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn

155 160 165

Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala

170 175 180

Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu

185 190 195

Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys

200 205 210

Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

215 220 225

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Arg Ser

230 235 240

Claims (7)

1.一种调控淀粉合成相关蛋白OsPKp1，其特征在于为由SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1 所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2 所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）或2）所示的DNA 分子：

1）SEQ ID NO.2 所示的DNA 分子；

2）SEQ ID NO.3 所示的DNA 分子。

4.含有权利要求2 或3 所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4 所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCUBi1390载体的多克隆位点KpnI和BamHI之间插入权利要求2 或3 所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2 或3 所述基因的全长的引物对，其特征在于选自SEQ ID NO.4所示的primer 1/ SEQ ID NO.5所示的primer 2或 SEQ ID NO.6所示的primer 3/ SEQ IDNO.7所示的primer 4。

7.权利要求2 或3 所述基因、权利要求4 所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。