CN104745624A - 生产具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的转基因细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与相应的未转化的野生型细胞相比具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量。
Description
本发明一般涉及生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与相应的未转化的野生型细胞相比具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量。
特别的，本发明涉及与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的植物细胞和植物。
本发明还涉及生产和筛选以及培育此类植物细胞或植物的方法。
γ-氨基丁酸用于增强特定植物的生长，预防葡萄出现白粉病(powderymildew)，以及抑制其他一些植物疾病。人和动物通常以可变的量摄入和代谢γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸于1998年作为生长增强性杀虫活性成分获得注册(批准销售)。γ-氨基丁酸是重要的信号，帮助调控植物的矿物质利用度。矿物质支持控制生长和繁殖的生物化学通路，以及指导植物对多种生物和非生物胁迫的应答的通路。在胁迫期间和植物生长的一些阶段，矿物质的需求特别高。在上述时期，植物中的γ-氨基丁酸水平天然的增加。
γ-氨基丁酸(GABA)作为非蛋白氨基酸，通常在环境刺激后积累在植物中，所述环境刺激也可以导致乙烯产生。外源性GABA在约12h后导致乙烯生产速率增加达14倍。GABA导致ACC合成酶mRNA积累、ACC水平、ACC氧化酶mRNA水平和体外的ACC氧化酶活性增加。提示GABA作为信号转导子的潜在角色。参见PlantPhysiol.115(1):129-35(1997)。
γ-氨基丁酸(GABA)作为四碳的非蛋白质氨基酸，是大部分原核和真核生物中的游离氨基酸库的重要组分。在植物中，胁迫启动信号转导通路，在所述通路中，增加的胞质Ca2+激活Ca2+/钙调素依赖性谷氨酸脱羧酶活性和GABA合成。升高的H+和底物水平也可以刺激谷氨酸脱羧酶活性。GABA积累可能主要由谷氨酸脱羧酶介导。实验证据支持GABA合成参与pH调控、氮储存、植物发育和防御，以及相容性渗透溶质和谷氨酸利用的替代通路，参见Trends Plant Sci.4(11):446-452(1999)。
应答创伤时快速的GABA积累可能在植物的抗虫防御中发挥作用(Ramputh和Brown,Plant Physiol.111(1996):1349-1352)。Shelp等，Canadien Journal of Botany(2003)81,11,1045-1048中综述了γ-氨基丁酸(GABA)作为植物-无脊椎动物害虫体系中的潜在控制试剂的发展。作者描述到，可获得的证据表明，植物响应生物和非生物胁迫时的GABA积累是通过谷氨酸脱羧酶的激活介导的。基于GABA在无脊椎动物害虫中作为抑制性神经递质发挥作用的事实，更多的应用研究表明，摄入的GABA干扰神经发挥功能，并导致对斜纹卷叶蛾幼虫的伤害，以及烟草夜蛾幼虫和斜纹卷叶蛾幼虫的爬行和进食植物分别刺激大豆和烟草中的GABA积累。此外，遗传改造的烟草中内源性GABA水平的升高制止了烟草夜蛾幼虫对其进食和被北方根结线虫感染。因此，作者总结到，具有高GABA生产潜力的遗传改造的作物品种可以作为控制无脊椎动物害虫的化学杀虫剂的替代对策。
在被子植物繁殖过程中，花粉粒形成花粉管，穿过雌花组织到达珠孔，将精子递送到卵细胞。在体外，GABA刺激花粉管的生长。
许多关于植物中的GABA的现有工作都关注于它的代谢作用(Fait等，Trends in Plant Sci.，第13卷，Nr.1，第14-19页，2007)和胁迫/害虫相关性和信号传递作用(Bouche等，Trends in Plant Sci.，第9卷，Nr.3，第110-115页，2004)。
GABA在植物组织和运输液中的积累响应多种非生物胁迫(Allan等，J Exp Bot，第59卷，No.9，第2555–2564页，2008)。Beuve等(PCE,27,1035–1046,2004)发现，硝酸盐内流和GABA在短期和长期实验中正相关，且提供给根的外源性GABA诱导BnNrt2(硝酸盐转运子)mRNA表达的显著增加。
另一方法是使用GABA刺激植物生长，通过将GABA以1:5000ppmGABA溶液施于植物的叶、茎和/或根上，优选与易于代谢的碳源(有机酸、氨基酸、简单碳水化合物，以及有机酸、氨基酸和简单碳水化合物的混合物)一起。
虽然尚未了解GABA在细胞中的作用，也未阐明其作用机制，由于GABA的上述生理学作用和农业技术潜力，故需要鉴别参与GABA代谢的酶和其他蛋白质的基因。
为了提高植物的产量性状，特别需要产生突变体和转基因植物系，用其修饰植物中的GABA含量。
因而，在第一个实施方案中，本发明涉及通过增加或产生一种或多种以下活性而生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与相应的未转化的野生型细胞相比具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶(transporter permease)蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白(Factor arrest protein)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白。
因而，在一个实施方案中，本发明的方法涉及这样的方法，包括：
提供非人的细胞或生物、微生物、非人动物、动物组织或动物细胞，优选植物细胞、植物组织、植物；和
增加或产生一种或多种选自以下的活性：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，例如在所述生物中产生GABA的增加；和
在允许增加的GABA含量产生的条件下，生长所述非人细胞或生物、微生物、非人动物、动物组织或动物细胞，优选植物细胞、植物组织、植物，
和任选的回收或分离由所述生物合成的GABA。
在另一实施方案中，本发明提供了生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与相应的未转化的野生型细胞相比具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，包括至少一个选自以下的步骤：
(i)增加或产生包含如表II或表IV的5或7列所述的多肽、共有序列或至少一种多肽基序的多肽的活性；
(ii)增加或产生包含如表I的5或7列所述多核苷酸的核酸分子的表达产物的活性；
(iii)增加或产生(i)或(ii)的功能等价体的活性。
在另一实施方案中，本发明提供了生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与相应的未转化的野生型细胞相比具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，其中增加或产生了至少一种核酸分子的表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
a)编码表II的5或7列中显示的多肽的核酸分子；
b)表I的5或7列中显示的核酸分子；
c)核酸分子，其由于遗传密码简并性的结果，源自表II的5或7列所述的多肽序列，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量；
d)与包含表I的5或7列所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量的核酸分子；
e)编码这样的多肽的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并具有由包含表I的5列所述多核苷酸的核酸分子表示的活性，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量；
f)在严格的杂交条件下，与(a)至(c)的核酸分子杂交，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量的核酸分子；
g)编码这样的多肽的核酸分子，所述多肽可以在针对(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽而制备的单克隆或多克隆抗体的帮助下分离，并具有由包含表I的5列所述多核苷酸的核酸分子表示的活性；
h)编码包含表IV的栏7所示共有序列或一个或多个多肽基序的多肽、且优选的具有由包含表II或IV的5列所述多核苷酸的核酸分子表示的活性的核酸；
i)编码具有由表II的5列所述蛋白质表示的活性的多肽，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量的核酸分子；
j)包含通过使用表III的7列的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸，且优选的具有由包含表II或IV的5列所述多核苷酸的核酸分子表示的活性的核酸分子；
和
k)可通过在严格的杂交条件下，用包含(a)或(b)的核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得的核酸分子，具有至少15nt，优选核酸分子中20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt与(a)至(e)表征的核酸分子序列互补，且编码具有由包含表II的5列所述多肽的蛋白质所示活性的多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与未转化的野生型细胞相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)的含量，其中转基因细胞是与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的植物细胞、植物或其部分。
在另一实施方案中，本发明提供了生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与未转化的野生型细胞相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)的含量，其中转基因细胞、植物或其部分源自单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。
在另一实施方案中，本发明提供了生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与未转化的野生型细胞相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)的含量，其中转基因植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜(oil seed rape)、包括芥菜(canola)和冬油菜(winter oil seed rape)、玉米、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、球茎甘蓝(turnip rape)、万寿菊、茄科植物、土豆、烟草、茄子、番茄、蚕豆属、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属、油棕、椰子、多年生草、饲料作物和拟南芥。
在其他实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：
a.编码表IIb的5或7列所示多肽的核酸分子；
b.表Ib的5或7列所示核酸分子；
c.核酸分子，其由于遗传密码简并性的结果，源自表II的5或7列中描述的多肽序列，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量；
d.与包含表I的5或7列所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量的核酸分子；
e.编码这样的多肽的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并具有由包含表I的5列所述多核苷酸的核酸分子表示的活性，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量；
f.在严格的杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量的核酸分子；
g.编码这样的多肽的核酸分子，所述多肽可以在针对(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽而制备的单克隆或多克隆抗体的帮助下分离，并具有由包含表I的5列所述多核苷酸的核酸分子表示的活性；
h.编码包含表IV的7列所示共有序列或一个或多个多肽基序的多肽，且优选的具有由包含表II或IV的5列描述的多核苷酸的核酸分子表示的活性的核酸；
i.编码具有由表II的5列所述蛋白质表示的活性的多肽，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量的核酸分子；
j.包含通过使用表III的7列的引物扩增cDNA文库或基因组文库所获得的多核苷酸，且优选的具有由包含表II或IV的5列所述多核苷酸的核酸分子表示的活性的核酸分子，所述引物的5’端不用核苷酸ATA起始；
和
k.可通过在严格的杂交条件下，用包含(a)或(b)的核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得的核酸分子，核酸分子中至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt与(a)至(e)表征的核酸分子序列互补，且编码具有由包含表II的5列所述多肽的蛋白质所示活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了核酸分子，其中根据(a)至(k)的核酸分子至少一个或多个核苷酸与表I A的5或7列描述的序列不同，且优选的编码至少一个或多个氨基酸不同于表II A的5或7列所述蛋白质序列的蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个调控元件的核酸构建体，其产生上述核酸分子的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸分子或所述核酸的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，其已用所述载体、所述核酸分子或所述核酸构建体稳定或瞬时的转化，并由于转化导致与相应的未转化的野生型相比，表现出增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产多肽的方法，其中多肽在如上所述的宿主核或宿主细胞中表达。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过上述方法生产的，或由上述核酸分子编码的多肽，其中所述多肽的一个或多个氨基酸与表II A所示序列不同。
在另一个实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体特异性的结合由上述方法生产的或由上述核酸分子编码的多肽，其中所述多肽的一个或多个氨基酸与表II A所示序列不同。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含上述核酸分子或上述宿主核或宿主细胞的细胞核、细胞、植物细胞核、植物细胞、植物组织、繁殖材料、花粉、后代、收获的材料或植物。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上述源自单子叶植物或双子叶植物的转基因植物细胞核、转基因植物细胞、转基因植物或其部分。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的转基因植物细胞核、转基因植物细胞、转基因植物或其部分，其中相应的植物选自玉米(corn)(玉米(maize))、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜(oil seed rape)、包括芥菜和冬油菜(winter oil seed rape)、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、球茎甘蓝(turnip rape)、万寿菊、茄科植物包括土豆、烟草、茄子、番茄；蚕豆属、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属、油棕、椰子、多年生草、饲料作物和拟南芥。
优选的，转基因植物细胞核、转基因植物细胞、转基因植物或其部分选自玉米、大豆、油菜(包括芥菜和冬油菜)、棉花、小麦和水稻。
在另一个实施方案中，本发明提供了转基因植物，所述转基因植物包含一个或多个植物细胞核或植物细胞、后代、种子或花粉，或者是由上述转基因植物生产。
在另一实施方案中，本发明提供了转基因植物、转基因植物细胞核、转基因植物细胞、包含一个或多个此类转基因植物细胞核或植物细胞的植物、源自或由上述转基因植物生产的后代、种子或花粉，其中所述转基因植物、转基因植物细胞核、转基因植物细胞、包含一个或多个此类转基因植物细胞核或植物细胞的植物、后代、种子或花粉对于与相应的未转化野生型植物细胞、转基因植物或其部分相比，产生增加的产量的转基因是遗传上纯合的。
在另一实施方案中，本发明提供了鉴别与相应的未转化野生型相比，产生增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的化合物的方法，包括步骤：
a)培养维持植物表达本发明的多肽的植物细胞、植物或其部分，其与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，在胁迫条件下产生增加的产量；未转化的野生型植物或其部分和读出系统，在允许多肽与所述读出系统在存在化合物或包含多种化合物的样品时相互作用的适当条件下，所述读出系统能够与多肽相互作用，并且在允许所述读出系统和与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的产量的所述多肽表达的条件下，所述读出系统能够响应化合物与所述多肽的结合而提供可检测的信号；未转化的野生型植物或其部分；
b)通过检测由所述读出系统产生的信号的存在或缺失或增加，来鉴别化合物是否是有效的激动剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产农业组合物的方法，包括上述方法的步骤，和以农业应用可接受的形式配制上文鉴别的化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物包含本发明的核酸分子，本发明的多肽，所述核酸构建体，所述载体，上述化合物，本发明的抗体，和任选的农业可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了如表II，优选表II B描述的分离的多肽，所述多肽选自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、集胞藻属(Synechocystis sp.)和/或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码具有以下活性的多肽的核酸分子的用途，所述活性选自60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b-3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，用于制备与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的细胞，优选植物细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码具有以下活性的多肽的核酸分子的用途，所述活性选自60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b-3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，作为标志物用于植物或植物细胞的选择，所述植物或植物细胞与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法用于生产与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的转基因植物细胞、植物或其部分，所述植物细胞、植物或其部分源自单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。
本发明提供了用于生产转基因植物细胞或植物的方法，所述植物细胞或植物与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，并且通过增加或产生一种或多种上文提及的所述活性，所述植物细胞或植物与相应的(未转化的)野生型或起始植物细胞相比，可以表现出对环境胁迫增加的抗性和/或增加的产量和/或生物量生产。
本发明提供了生产转基因植物细胞或植物的方法，所述植物细胞或植物与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，并且通过增加或产生一种或多种上文提及的所述活性，所述植物细胞或植物与相应的(未转化的)野生型或起始植物细胞相比，具有增加的非生物胁迫抗性。
本发明提供了生产转基因植物细胞或植物的方法，通过增加或产生一种或多种上文提及的所述活性，所述植物细胞或植物与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，并且与相应的(未转化的)野生型或起始植物细胞相比，具有增加的硝酸盐流入。
本发明提供了生产转基因植物细胞或植物的方法，通过增加或产生一种或多种上文提及的所述活性，所述植物细胞或植物与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，并且与相应的(未转化的)野生型或起始植物细胞相比，具有增加的植物生长。
γ-氨基丁酸增强根和叶的营养物摄入，使植物营养物水平高于通过单独使用营养物实现的水平。当植物受胁迫且限制营养物摄入时，γ-氨基丁酸可以促进营养物利用，从而增强胁迫过程中和/或亚优化的生长和培养条件下的植物生长。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了生产与相应的野生型植物相比具有增加的产量的植物的方法，至少包括下列步骤：增加或产生一种或多种选自以下的活性：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b-3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白。
如本文所述，“产量”在一个实施方案中指植物的可收获产量。植物的产量可以取决于在各种情况下所感兴趣的特定植物/作物，及其所感兴趣的预期的应用(例如，食品生产、饲料生产、加工食品生产、生物燃料、生物燃气(biogas)或乙醇生产等)。因此，在一个实施方案中，以收获指数(表达为各个可收获部分的重量除以总生物量的比例)、单位面积(英亩、平方米等)的可收获部分的重量等来计算产量。
优选的，可以在存在或不存在胁迫的条件下，实现根据本发明的本文所述植物的优选提高或改善的产量特征。
因而，“产量“的含义主要取决于所感兴趣的作物和预期的应用，可以理解本领域技术人员可以了解在各种特定情况下本说明书情况的含义。出于描述本发明的目的，增加的或提高的“产量”指选自生物量产量、干生物量产量、地上干生物量产量、地下干生物量产量、鲜重生物量产量、地上鲜重生物量产量、地下鲜重生物量产量；可收获部分的增加产量，干重或鲜重或两者、地上或地下部分或两者；农作物果实的增加产量，干重或鲜重或两者、地上或地下部分或两者；和优选地种子的增加产量，干重或鲜重或两者、地上或地下部分或两者的一个或更多产量参数。
如本文使用的，术语“产量“一般指来自植物，特别是作物的可测量的产物。
可以以多种方式测量产量和产量的增加(与原始或野生型植物相比)。可以理解，本领域技术人员能够根据特定的实施方案、相关的特定作物和特殊的目的或应用，使用正确的方式。
在一个实施方案中，产量的增加指增加的生物量产量和/或增加的种子产量。
在一个实施方案中，“产量“指生物量产量，例如干重生物量产量和/或鲜重生物量产量。生物量产量指植物的地上或地下部分，取决于特殊的环境(测试条件、特定的目的作物、目的应用等)。在一个实施方案中，生物量产量指地上和地下部分。可以以鲜重、干重或湿度调节基础来计算生物量产量。可以基于每株植物或相对于特定的面积(例如，每英亩/平方米/等的生物量产量)来计算生物量产量。
在一个实施方案中，“产量“指种子产量，可以通过一个或多个下列参数测量：(每株植物或每单位面积(英亩/平方米/等)的)种子数或饱满种子数；种子饱满率(饱满种子和种子总数之间的比例)；每株植物的花数；(每株植物或每单位面积(英亩/平方米/等)的)种子生物量或总种子重量；千粒重(TKW；根据所计算的饱满种子数及其总重计算；TKW的增加可以由增加的种子大小、增加的种子重、增加的胚大小和/或增加的胚乳导致)。能够测量种子产量的其他参数也是本领域已知的。可以在干重或鲜重的基础上，或者通常在湿度调节的基础上来确定种子产量，例如在15.5％湿度。
所述根据本发明增加的产量通常可以通过与原始或野生型植物相比，提高或改善植物的一个或多个产量相关性状来实现。植物的此类产量相关性状的改善导致增加的产量，包括但不限于植物的固有生产力(intrinsicyield capacity)的增加、改善的营养物利用效率，和/或增加的胁迫抗性。
因此，在一个实施方案中，产生植物产量增加的产量相关性状是植物的固有生产力的增加，并可以例如通过改善特定的(固有)种子产量(例如，以增加的种子/谷粒大小、增加的谷穗数(ear number)、增加的每谷穗种子数、种子饱满的改善、种子组成的改善、胚和/或胚乳改善等)；(例如，植物高度、植物生长速率、豆荚数、植物上的豆荚位置、节间数、豆荚破裂的发生频率、根瘤和氮固定的效率、碳同化的效率、幼苗萌发势/早期萌发势的改善、提高的发芽效率(在胁迫或非胁迫条件下)、植物构造的改善、细胞周期修饰、光合作用修饰、各种信号传递通路的修饰、转录调控的修饰、翻译调控的修饰、酶活性的修饰等)；和/或其他来展现。
因此，在一个实施方案中，产生植物产量增加的产量相关性状是植物的胁迫抗性的改善或增加，可以通过例如改善或增加植物对胁迫，特别是对非生物胁迫的抗性来展现。在本申请中，非生物胁迫一般指植物通常面临的非生物环境条件，包括通常被称为“非生物胁迫”条件的条件，包括但不限于：干旱(对干旱的抗性可以作为改善的水利用效率的结果来实现)、热、低温和寒冷条件(例如冰冻和寒冷条件)、盐度、渗透胁迫、遮光、高植物密度、机械胁迫、氧胁迫等。
因此，在一个实施方案中，所述根据本发明的增加的产量通常可以通过相比未转化的起始或野生型植物，提高或改善植物的一种或多种产量相关性状来实现。植物的此类导致增加的产量的产量相关性状包括但不限于：植物的固有生产力的增加、改善的营养物利用效率，和/或增加的胁迫抗性，例如增加的干旱抗性和/或低温抗性。
在一个实施方案中，非生物胁迫抗性和/或耐受性指水胁迫抗性，特别是在短暂和重复的非生物胁迫的条件下，优选循环干燥。
因而，在本发明的一个实施方案中，增加的植物产量是通过增加“植物的营养物利用效率”而介导的，例如，通过改善这样的营养物的营养物利用效率，所述营养物包括但不限于磷、钾和氮。
在一个实施方案中，增加的营养物利用效率是提高的氮摄入、同化作用、积累或利用。这些复杂的过程是与植物中的氮吸收、移位、同化和再分布相关的。
例如，植物需要更有效的氮摄入能力，使得生长需要较少的氮，从而导致在氮缺乏或氮受限的条件下改善的产量水平。此外，用现有的或标准的氮供应或摄入水平可以获得较高的产量。
因此，在本发明的一个实施方案中，通过增加植物或其部分的氮摄入来增加植物产量。因而，本发明的另一目标是提供这样的植物，所述植物表现出提高的氮摄入和/或在有限的氮供应的条件下，相比相应的野生型植物表现出增加的产量。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及增加产量的方法，包括下列步骤：
(a)测量土壤中的N含量，和
(b)确定土壤中的N含量对原始或野生型植物，例如作物的生长是否是优化的或亚优化的，和
(c1)如果N含量对原始或野生型植物的生长是亚优化的，在所述土壤中生长本发明的植物，或
(c2)如果N含量对原始或野生型植物的生长是优化的，在所述土壤中生长本发明的植物并将产量与标准、原始或野生型植物的产量相比，选择并生长表现出最高产量的植物。
在本发明的另一实施方案中，通过增加植物的胁迫耐受性来增加植物产量。
一般而言，术语“增加的胁迫耐受性”可以定义为相比未转化的野生型或起始植物，在胁迫条件下植物的存活和/或较高的产量生产。
在其生命周期中，植物一般面临多样的环境条件。在特定的环境下，任何可能对植物产量具有影响的此类条件在本文中都称作“胁迫”条件。环境胁迫一般可分为生物和非生物(环境)胁迫。不利的营养条件有时也称作“环境胁迫”。本发明确实也考虑这类环境胁迫的解决方案，例如适用增加的营养物利用效率。
在本发明的优选的实施方案中，通过增加植物或其部分的非生物胁迫耐受性来增加植物产量。
出于本发明说明书的目的，术语“提高的非生物胁迫的耐受性”、“提高的非生物环境胁迫的耐受性”、“提高的环境胁迫的耐受性”、“对环境胁迫的改善的适应”和与其含义类似的变体和表达方式是可互换使用的，不受限制的指相比相应的原始或野生型植物或其部分，对如本文所述的一种或多种非生物环境胁迫的耐受性的改善。
术语非生物胁迫耐受指例如低温耐受、干旱耐受、热耐受、盐胁迫耐受和其他。
植物中的胁迫耐受(例如低温、干旱、热和盐胁迫耐受)可以具有对植物生长重要的共同主题，即水的可用度。植物在其生命周期中，通常暴露在降低的环境水含量的条件下。保护对策与寒冷耐受的对策相似。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述产量相关性状涉及本发明植物的增加的水利用效率和/或本发明植物的增加的干旱条件耐受性。
在本发明的一个实施方案中，干旱胁迫意指导致植物缺少水或对植物水供养降低的任何环境胁迫，包括由低温和/或盐造成的次级胁迫，和/或在干旱或热的过程中的初级胁迫，例如脱水等。
根据本发明，在一个实施方案中，可以根据下列方法确定和定量对干旱条件增加的耐受：
将转化的植物在生长室(YorkGmbH,Mannheim,Germany)内分别生长在盆中。诱导发芽。在植物是拟南芥的情况下，将播种的种子在4℃下保持在黑暗中3天，从而诱导发芽。然后，将条件改变为20℃/6℃的昼/夜温度3天，具有150μE/m2s的16/8h昼夜周期。然后，将植物生长在标准生长条件下。在植物是拟南芥的情况下，标准生长条件是：16h光照和8h黑暗的光周期，20℃，60％相对湿度，和200μE的光子通量密度。生长和培养植物直至它们发育出叶。在植物是拟南芥的情况下，每天浇水直至约3周龄。从此时开始，通过停水施加干旱。在未转化的野生型植物表现出可见的损伤症状后，开始评估并连续5-6天相比野生型和相邻植物对干旱症状和生物量生产打分。
在一个实施方案中，增加的干旱耐受指对干旱周期的耐受，意指干旱和再灌溉的交替周期。在不导致脱水的条件下，向植物施以重复的胁迫。
在本发明中，例如和优选的，可以根据下列方法确定对周期性干旱的提高的耐受：
将转化的植物在生长室(例如，York,Mannheim,Germany)内生长在盆中。在植物是拟南芥的情况下，按富含营养物的土壤(GS90,Tantau,Wansdorf,Germany)与石英砂(quarz sand)的1:1(v/v)混合物制备土壤。用该混合物装满盆(直径6cm)，并置于盘中。将水添加到盘中，让土壤混合物吸收对播种步骤(第1天)而言适量的水，随后，将转基因拟南芥植物及其野生型对照的种子播种到盆中。然后，用透明的盖子覆盖装满的盘，并转移至预冷(4℃-5℃)和黑暗的生长室中。在4℃-5℃的黑暗中，为期3天的确立分层，或可选的，在4℃的黑暗中实施4天。种子的发芽和生长始于这样的生长条件，即20℃，60％相对湿度，16h光周期和以200μmol/m2s用荧光照明。在播种后7-8天去除盖子。在第10或第11天(播种后9或10天)可以进行BASTA选择，通过从顶部喷雾含小苗的盆。在标准实验中，喷雾1次在自来水中的BASTA浓度0.07％(v/v)溶液(183g/l草胺磷)，或可选的，喷雾3次BASTA 0.02％(v/v)溶液。野生型对照植物仅用自来水(替代用溶解在自来水中的BASTA喷雾)喷雾，但其他处理相同。在播种后13-14天，通过去除过多的幼苗单个化植物，在土壤中保留一株幼苗。转基因事件和野生型对照植物均匀的分布在整个温室内。
在整个实验过程中，水供应是有限的，植物经历干旱和再灌溉的循环。在第1天(播种前)、第14或15天，第21或22天和最后第27或28天进行灌溉。为了测量生物量生产，在最后一次灌溉(第28或29天)一天后，确定植物鲜重，通过切下苗(shoot)并称重。除称重外，在不同于野生型对照的植物的情况下，增加表型信息。当收获时，植物处于开花前和花序生长前的阶段。通过使用Student测试(参数：双侧，不等方差)，计算生物量改变的统计学显著性的显著值。
因此，在本发明的一个实施方案中，相比处于循环干旱的胁迫条件下的野生型对照，本发明的转基因植物在生物量增加中展现出增加的寒冷耐受。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及增加产量的方法，包括下列步骤：
(a)确定种植区域内的水供应对于原始或野生型植物(例如作物)的生长是否是优化的或亚优化的，和/或确定生长在种植区域内的植物损伤的目测症状；和
(b1)如果水供应对原始或野生型植物的生长是亚优化的，或者在生长在区域内的标准、原始或野生型植物上可见干旱的目测症状，则将本发明的植物生长在所述土壤中；或
(b2)如果水供应对原始或野生型植物的生长是优化的，则将本发明的植物生长在土壤中，将其产量与标准、原始或野生型植物的产量相比，选择和生长表现出最高产量的植物。
目测的损伤症状表示一种下列特征或两种、三种或多种下列特征的任意组合：
a)萎蔫，
b)叶枯黄，
c)膨压丧失，导致叶或针叶柄和花下垂(droop)，
d)叶或针叶的下垂或脱落(shed)，
e)叶是绿色的，但相比对照叶轻微的弯向地面，
f)叶片开始向内折叠(卷曲)，
g)叶或针叶的早衰，
h)叶或针叶中的叶绿素丢失和/或发黄。
在本发明的另一实施方案中，本发明植物的所述产量相关性状是所述植物对热条件的增加的耐受。
在本发明的另一个实施方案中，本发明植物的所述产量相关性状是所述植物增加的低温耐受性，例如包括冰冻耐受和/或寒冷耐受。
低温影响许多生物过程。低温阻碍或抑制几乎所有的代谢和细胞过程。植物对低温的应答是它们的生态学范围的重要决定因子。在高海拔或高纬度需要生长季节延长超过短暂的夏季，这一需求加剧了应对低温的难题。
大部分植物已进化出适应性对策，保护自身免受低温。一般而言，对低温的适应可以分为寒冷耐受和冰冻耐受。
寒冷耐受天然的可见于来自温带或或北部地区的物种，允许其在低温但尚未冰冻的温度下存活和提高生长。来自热带或亚热带地区的物种是寒冷敏感的，在发育的一个或多个阶段过程中，在约10℃的温度下通常表现出萎蔫、萎黄病或坏死、缓慢的生长甚至死亡。因此，改善的或提高的“寒冷耐受”或其变体在本文中指对低温但尚未冰冻的温度的改善的适应性，所述低温是约10℃，优选1至18℃，更优选4至14℃，最优选8至12℃之间的温度；在后文中称为“寒冷温度”。
冰冻耐受允许在零度附近，特别是低于零度的温度存活。认为受到名为冷驯化(cold-acclimation)的过程促进，所述过程发生在低温但尚未冰冻的温度下，提供低于零度的温度下增加的冰冻耐受。此外，来自温带区域的大部分物种具有适应于温度的季节变化的生命周期。对于这些植物，在成层和种子促熟的过程中，低温还可以在植物发育中扮演重要角色。很明显，明确的区别或定义寒冷耐受和冰冻耐受是困难的，所述过程可能重叠或相互作用。
改善或提高的“冰冻耐受”或其变体在本文中指对接近或低于零度的温度的改善的适应，即优选低于4℃，更优选低于3或2℃，特别优选0℃或低于0℃或低于-4℃的温度，或者甚至低至-10℃或更低的极低温度，在下文中称为“冰冻温度”。
对环境压力(例如冰冻和/或寒冷温度)的“改善的适应性”在本文中指导致产量增加的改善的植物性能，特别涉及如上文更详细定义的产量相关性状。
因此，在一个实施方案中，相比寒冷敏感型野生型或原始(植物)，本发明的植物可以在暴露于低温后表现出及早幼苗生长，在另一实施方案中，改善种子发芽速率。种子发芽的过程强烈依赖于环境温度，种子的性质决定在暴露于低温时发芽和出苗过程中的表现和活性水平。在一个实施方案中，本发明的方法还提供了在寒冷条件下表现出降低的叶发育推迟的植物。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及耐受性主要作物的生产，例如玉米(玉蜀黍)、菜豆(bean)、稻、大豆、棉花、西红柿、香蕉、黄瓜或土豆，因为大部分主要作物是寒冷敏感型的。
在本发明中，例如和优选的可以根据下列方法确定提高的低温耐受：
将转化的植物在生长室(例如，York,Mannheim,Germany)内生长在盆中。在植物是拟南芥的情况下，将它的种子播种在含富含营养物的土壤(GS90,Tantau,Wansdorf,Germany)与砂为3.5:1(v/v)的混合物的盆中。植物生长在标准生长条件下。在植物是拟南芥的情况下，标准生长条件是：在4℃-5℃的黑暗中，实施为期3天的成层；种子的发芽和生长处于16h光照的光周期，任选以150-200μmol/m2s的荧光照明，和8h黑暗，20℃，60％相对湿度，和200μmol/m2s的光子通量密度。在播种后第9天可以进行BASTA选择，通过从顶部喷雾含小苗的盆。从而，喷雾在自来水中的BASTA浓度0.07％(v/v)溶液(183g/l草胺磷)。野生型对照植物仅用自来水(替代用溶解在自来水中的BASTA喷雾)喷雾，但其他处理相同。生长并培养植物，在植物是拟南芥的情况下，每2天给植物浇水。在9-10天后或在12-13天后，将植物个体化。在播种后14天或14-16天施加寒冷(例如，11-12℃的寒冷)，直至实验结束。在29-31或35-37天的总生长期后收获植物，并通过植物地上部分的鲜重评级，在植物是拟南芥的情况下，优选使用莲座(rossette)。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及增加产量的方法，包括下列步骤：
(a)确定种植区域内的温度对于原始或野生型植物(例如作物)的生长是否是优化的或亚优化的；和
(b1)如果温度对区域内生长的原始或野生型植物的生长是亚优化偏低的，则将本发明的植物生长在所述土壤中；或
(b2)如果温度对原始或野生型植物是优化的，则将本发明的植物生长在土壤中，将其产量与标准、原始或野生型植物的产量相比，选择和生长表现出最高产量的植物。
在本发明的一个实施方案中，术语“非生物胁迫”包括甚至没有基本的非生物胁迫。在本发明中，例如并优选地根据以下方法测定生物量增加：
在生长室(例如York,Mannheim,Germany)的盆中栽培转化的植物。在所述植物是拟南芥的情况下，在含有营养丰富土(GS90,Tantau,Wansdorf,Germany)和任选地石英砂的3.5:1(v:v)混合物的盆中播种其种子。
用土壤混合物填充盆，并将其置于托盘中。向所述托盘中添加水，使土壤混合物吸收适当量的水用于播种步骤。在植物是拟南芥的情况下，在盆(直径6cm)中播种转基因拟南芥植物及其非转基因野生型对照的种子。然后用透明盖子覆盖填满的托盘并将其转移到预冷(4℃-5℃)且黑暗的生长室中。在4℃-5℃黑暗中3-4天的时间里建立分层。在20℃，60％相对湿度，16小时光周期和大约170μmol/m2s的荧光灯照明的生长条件下开始种子的萌发与生长。播种后7-8天去除盖子。在第10天或第11天(播种后9天或10天)通过从顶部喷洒含有小植株的盆完成BASTA选择。在标准实验中，喷洒一次自来水中BASTA浓缩物(183g/l草铵膦)的0.07％(v/v)溶液，或者喷洒三次BASTA的0.02％(v/v)溶液。仅用自来水喷洒(而不是用在自来水中溶解的BASTA喷洒)野生型对照植物，但其它方面进行相同处理。播种后13-14天通过去除多余的幼苗并在土壤中保留一株幼苗将植物个体化。转基因植物和野生型对照植物均匀分布在生长室中。
在标准实验中去除盖子后每隔一天，或者每天进行浇水。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后24-29天)通过切割茎并称重它们测量植物鲜重。当收获时，植物处于开花前阶段和花序生长前阶段。转基因植物与在同一天收获的非转基因野生型对照植物比较。可通过应用“斯氏”t检验(参数：双边，不等方差)计算生物量变化的统计学显著性的显著性值。
可通过称重植物莲座测定生物量产生。生物量增加计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物的平均重量的比值。
在本发明的另一实施方案中，产量相关性状还可以是增加的盐度耐受(盐耐受)、对渗透胁迫的耐受、增加的遮光耐受、增加的对高植物密度的耐受、增加的对机械胁迫的耐受，和/或增加的对氧化胁迫的耐受。
因此，在本发明的一个实施方案中，通过改善一种或多种如本文定义的产量相关性状来增加产量。
因而，本发明提供了生产相比相应的原始或野生型植物，表现出增加的营养物利用效率的转基因植物的方法，通过增加或产生一种或多种选自以下的活性：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白(“活性”)。
在其他实施方案中，本发明提供了生产相比相应的原始或野生型植物，表现出增加的胁迫耐受，特别是非生物胁迫耐受的转基因植物的方法，通过增加或产生一种或多种所述活性。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法实现，并由本发明的转基因植物表现出的非生物胁迫耐受是增加的低温耐受，特别是增加的对寒冷的耐受。
因而，在本发明的另一个实施方案中，提供了方法用于生产转基因植物；源自此类植物的后代、种子和/或花粉；通过增加或产生一种或多种所述活性，相比相应的未转化的野生型植物细胞或植物，均表现出增加的氮摄入和增加的低温耐受，特别是寒冷耐受。
此外，在一个实施方案中，本发明提供了通过增加或产生一种或多种选自上述活性的活性，相比相应的未转化的原始或野生型植物细胞或植物，表现出一种或多种增加的产量相关性状的转基因植物。
此外，本发明涉及生产这样的植物的方法，所述植物相比相应的野生型植物具有增加的产量，包括至少一个选自以下的步骤：
(i)增加或产生这样的多肽的活性，所述多肽包含分别在表II或表IV的5或7列中描述的多肽、共有序列或至少一种多肽基序；
(ii)增加或产生核酸分子的表达产物的活性，所述核酸分子包含表I的5或7列中描述的多核苷酸，和
(iii)增加或产生(i)或(ii)的功能等价体的活性。
在一个实施方案中，所述一种或多种活性的增加或产生是由一种或多种核酸序列产生的，所述核酸序列包含选自如表I 5或7列所示的多核苷酸。因此，所述一种或多种活性的增加或产生是例如由一种或多种所述核酸分子的表达产物产生，如蛋白质。因此，在上述本发明中，所述一种或多种活性的增加或产生是由例如一种或多种均包含选自表II 5列和7所述的多肽的蛋白质产生的。
因而，在一个实施方案中，本发明提供了生产这样的植物的方法，所述植物相比原始或野生型植物，表现出增加的产量，通过增加或产生一种或多种选自以下的活性：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，所述活性是由一种或多种包括选自表I5或7列所示的多核苷酸的核酸序列产生的；或由一种或多种这样的蛋白质产生的，所述蛋白质均包含由一种或多种选自表I的5或7列所示的核酸序列编码的多肽；一种或多种均包括选自表II的5列和7所示的多肽的蛋白质产生的。如上述，增加的产量可由一种或多种产量相关性状介导。因而，本发明的方法涉及表现出所述一种或多种产量相关性状的植物的生产。
因而，本发明提供了生产表现出增加的营养利用效率(例如，氮摄入)、增加的胁迫耐受，特别是非生物胁迫耐受、增加的水利用效率和/或增加的胁迫耐受，特别是非生物胁迫耐受、特别是低温耐受或干旱耐受，或增加的固有产量的植物的方法。
此外，本发明涉及生产相比相应的原始或野生型转基因植物，具有增加的产量的植物的方法，包括：
(a)在植物细胞核、植物细胞、植物或其部分中增加或产生一种或多种选自以下的活性：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白；和
(b)在允许植物细胞、植物或其部分发育的条件下，培养或生长植物细胞、植物或其部分；和
(c)回收相比相应的未转化的原始或野生型植物，表现出增加的产量的植物；
(d)和任选的，选择相比相应的未转化的野生型植物细胞、表现出缺陷和/或死亡的目测症状的转基因植物或其部分而言，表现出增加的产量的植物或其部分。
本发明的另一目标是提供相比相应的未转化的野生型或起始植物细胞和/或植物，具有提高的对非生物环境胁迫的耐受和/或在非生物环境胁迫的条件下表现出增加的产量的植物细胞和/或植物。
发现该目标是提供提供根据本文所述的本发明的细胞、植物细胞和/或植物来实现的。
在本发明的一个实施方案中，上述性状是通过这样的过程来实现的，所述过程关于(优选来自光合活性生物，优选植物的)细胞内对非生物环境胁迫的提高的耐受，相比相应的(未转化的)野生型或起始的光合活性生物。
在另一实施方案中，在光合活性生物中“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的(未转化的)野生型或起始光合活性生物，当面临如上述的非生物环境胁迫(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度，或干旱)时，表现出提高的产量，例如如上述的产量，如种子产量或生物量产量。
在其中的实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的干生物量产量。
在其中的实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的地上部分干生物量产量。
在其中的实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的地下部分干生物量产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的鲜重生物量产量。
在其中的实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的地上部分鲜重生物量产量。
在其中的实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的地下部分鲜重生物量产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的植物可收获部分的产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的干燥的植物可收获部分的产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的干燥的植物地上可收获部分的产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的干燥的植物地下可收获部分的产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的植物可收获部分的鲜重产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的植物地上可收获部分的鲜重产量。
在其中的另一个实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的植物地下可收获部分的鲜重产量。
在另一实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的作物果实产量。
在另一实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的作物果实鲜重产量。
在另一实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的作物果实干燥产量。
在另一实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的谷粒干重。
在另一实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的种子产量。
在其中的实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的种子鲜重产量。
在其中的实施方案中，在光合活性生物中，术语“对非生物环境胁迫提高的耐受”意指光合活性生物，优选植物，相比相应的未转化的野生型光合活性生物，当面临非生物环境胁迫条件(例如，低温条件包括寒冷和冰冻温度)时，表现出提高的种子干重产量。
在本发明的另一个实施方案中，这些性状是通过这样的过程实现的，所述过程是关于在光合活性生物中，优选在植物中，相比相应的(未转化的)野生型或起始光合活性生物，在环境胁迫(特别是非生物环境胁迫)的条件下的增加的产量。
在一个实施方案中，术语“增加的产量”意指在非生物环境胁迫的条件下，相比相应的野生型光合活性生物，光合活性生物(尤其是植物)表现出增加的产量，例如表现出增加的生长速率。
增加的生长速率尤其可以反映在或产生整株植物增加的生物量生产，或者植物地上部分增加的生物量生产，或植物地下部分增加的生物量生产，或植物的一部分的增加的生物量生产，例如茎、叶、花、果和/或种子。
在其中一个实施方案中，增加的产量包括更高的果实产量，更高的种子产量、更高的鲜物质生产和/或更高的干物质生产。
在其中另一个实施方案中，术语“增加的产量”意指相比相应的未转化的野生型光合活性生物，光合活性生物，优选植物，表现出在非生物环境胁迫条件下的延长的生长。延长的生长包括当未转化的野生型光合活性生物表现出目测的缺陷和/或死亡症状之时，光合活性生物，优选植物的存活和/或持续的生长，
在其中另一个实施方案中，术语“增加的产量”意指相比相应的未转化的野生型，光合活性生物，优选植物，表现出增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量。
在另一个优选的实施方案中，光合活性生物，优选植物，在非生物环境胁迫条件下表现出增加的产量，例如植物表现出对非生物环境胁迫的提高的耐受，或另一种产量相关性状。
在另一个实施方案中，本发明满足了鉴别新的、独特的基因的需要，所述基因能够使光合活性生物(优选使植物)基于内源和/或外源基因的表达或过表达，而产生增加的产量，例如，对非生物环境胁迫的提高的耐受或另一种产量相关性状。
在其中的另一个实施方案中，本发明满足了鉴别新的、独特的基因的需要，所述基因能够使光合活性生物(优选使植物)基于内源基因的表达或过表达，而产生增加的产量，例如，对非生物环境胁迫的提高的耐受或另一种产量相关性状，基于内源基因的表达或过表达。
在其中的另一个实施方案中，本发明满足了鉴别新的、独特的基因的需要，所述基因能够使光合活性生物(优选使植物)基于外源基因的表达或过表达，而产生增加的产量，例如，对非生物环境胁迫的提高的耐受或另一种产量相关性状，基于外源基因的表达或过表达。
在另一个实施方案中，本发明满足了鉴别新的、独特的基因的需要，所述基因能够使光合活性生物(优选使植物)基于内源和/或外源基因的表达或过表达，而产生对非生物环境胁迫的提高的耐受与增加的产量的组合。
因此，本发明涉及生产例如转基因光合活性生物或其部分，或植物细胞、植物或其部分的方法，用于例如产生相比未转化的野生型光合活性生物或其部分，或植物细胞、植物或其部分，具有增加的产量的植物，如具有增加的产量相关性状，例如营养利用效率、增加的内在产量，和/或增加的胁迫耐受，优选水胁迫耐受，尤其是在短暂和重复的非生物胁迫条件(优选循环的干旱)下，和/或低温耐受，和/或另一种增加的产量相关性状，所述方法包括：
(a)在光合活性生物或其部分(例如，植物细胞、植物或其部分)中增加或产生一种或多种选自以下的活性：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，
和
(b)在允许光合活性生物或其部分，优选植物细胞、植物或其部分发育的条件下，生长所述光合活性生物或其部分，例如植物细胞、植物或其部分，所述光合活性生物或其部分相比相应的如未转化的、野生型光合活性生物或其部分，优选植物细胞、植物或其部分，具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，如对非生物环境胁迫提高的耐受、增加的营养利用效率、增加的干旱耐受和/或另一种增加的产量相关性状。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产例如这样的转基因光合活性生物或其部分，或植物细胞、植物或其部分的方法，所述转基因光合活性生物或其部分相比相应的如未转化的野生型光合活性生物或其部分，或植物细胞、植物或其部分，具有增加的产量，如增加的产量相关性状，如对非生物环境胁迫提高的耐受、增加的营养利用效率、增加的干旱耐受和/或另一种增加的产量相关性状，所述方法包括：
(a)在光合活性生物或其部分中，优选在植物细胞、植物或其部分中，增加或产生一种或多种选自以下的活性：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，
(b)在非生物环境胁迫的条件下，生长所述光合活性生物或其部分，优选植物细胞、植物或其部分，与例如未转化的、野生型光合活性生物或其部分，优选植物共同生长，
(c)在例如未转化的野生型光合活性生物或其部分(优选植物细胞、植物或其部分)表现出目测的缺陷和/或死亡症状后，选择相比相应的例如未转化的野生型光合活性生物或其部分(优选植物细胞、植物或其部分)，具有增加的产量的光合活性生物或其部分，优选植物细胞、植物或其部分，例如具有增加的产量相关性状，如对非生物环境胁迫提高的耐受、增加的营养利用效率、增加的干旱耐受和/或另一种增加的产量相关性状。
植物的气候和培养条件分类为大环境(mega-environment)，所述大环境是根据CIMMYT在指导其在小麦和玉米的育种项目中使用的。
大环境是宽阔的、但不必然连续的地理区域，具有相似的生物和非生物胁迫和作物系统要求。实际上，大环境是通过作物生产因子(温度、降雨、光照、纬度、海拔、土壤特征和疾病)、消费者偏好(谷粒的颜色及其如何使用)和小麦生长习惯来确定的。
CIMMY研究人员鉴别了春小麦的6种大环境，以及过渡型小麦和冬小麦各3种的大环境。
这类大环境可用于各种植物物种，包括作物。
在一个实施方案中，本发明提供了在亚优化的生长条件下，相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，具有增加的产量的转基因植物、植物或其部分。此类亚优化的生长条件可以是例如具有低降雨的大环境，例如小麦大环境ME1、ME4、ME4A、ME4B、ME4C、ME5、ME5B、ME6、ME6B、ME9、ME12或对特定植物物种而言各自的大环境。
此类大环境适用于各种亚优化的生长条件、温度或营养物处置(disposability)。
为了比较相同物种的植物产量与环境条件的相关性，产量潜力的参数是重要的。产量潜力定义为当生长在其适应的环境中时植物的产量，不限制营养物和水，而有效的控制害虫、疾病、杂草、倒伏和其他胁迫。在该实施方案中，“产量”指最后收获时产物的质量。
在野外条件下实现不了产量潜力。然而，这是定义大环境中的优化培养条件的参数，因为只有在优化条件下才可以实现产量潜力。
在一个实施方案中，亚优化的生长条件是与可实现产量潜力的各种条件不对应的任何条件。
在一个实施方案中，优化的生长条件(包括营养物的处置)是选自以下的条件：
在最近50、25、20、15、10或5年内，在超过3、6、12个月的时期，或者在已知的西澳洲小麦带区域、U.S.A的玉米带(包括爱荷华州、印第安纳州、伊利诺伊州、俄亥俄州、南达科塔州、内布拉斯加州、堪萨斯州、明尼苏达州、威斯康辛州、密歇根州、密苏里州和肯塔基州中的至少一个)这样的大环境的栽培季(cultivation period)期间是占主导地位的气候和环境条件，包括营养物的可处置性，
在最近50、25、20、15、10或5年内，在超过3、6、12个月的时期，或者在CIMMY提及的玉米或小麦的大环境的栽培季期间是占主导地位的气候和环境条件。
在一个实施方案中，本发明涉及增加每英亩或每栽培区域内的产量的方法，包括以下步骤：
实施环境条件分析，测量土壤中可利用的营养物(包括水)水平或在每个栽培循环中的降雨，
比较各种条件的值的结果与优化生长条件下的值，
栽培根据本发明的各个纲/属的植物，使至少一种测量条件偏离在优化生长条件下的值5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
在一个实施方案中，本发明涉及增加大环境中每英亩的产量的方法，包括步骤：
实施土壤分析，测量土壤中可利用的营养物的水平，
将结果与实现某纲/某属植物的产量潜力必需的值相比较，
在至少一种营养物受限制的情况想下，栽培根据本发明的相应纲/属的植物。
在一个实施方案中，本发明涉及增加大环境中每英亩的产量的方法，包括步骤：
测量至少一个植物生长时间段内的降水，
与实现某纲/某属植物的产量潜力必需的值相比较，
在降水减少的情况下，栽培根据本发明的相应纲/属的植物。
在一个实施方案中，本发明涉及增加大环境中每英亩的产量的方法，包括步骤：
测量在至少一代植物生长时间段内的降水之间的时间间隔，
与实现某纲/某属植物的产量潜力的值相比较，
在增加干旱季节的情况下栽培根据本发明的相应纲/属的植物。
当用于该说明书时，用包含/含有及其语法变型说明所述特征、整数、步骤或组分或其组的存在，但不排除一种或更多种特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。
根据本发明，本文所理解的术语“植物细胞”或术语“生物”通常指植物细胞或其细胞器，优选质体，更优选叶绿体。
如此处所用，“植物”指包括但不限于整株植物，但也指其部分，即一个或更多个细胞和组织，包括例如，叶、茎、苗、根、花、果实和种子。
令人惊讶的发现，如表II栏3所示蛋白质在植物(例如，拟南芥C24)中的转基因表达，使转基因的植物细胞、植物或其部分相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分具有增加的GABA含量。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:42或多肽SEQ IDNO:43的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“因子停滞蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:42或多肽SEQ ID NO:43相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:654或多肽SEQ IDNO:655的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“转录调节子”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:654或多肽SEQ ID NO:655相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:706或多肽SEQ IDNO:707的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“蛋白磷酸酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:706或多肽SEQ ID NO:707相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:751或多肽SEQ IDNO:752的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“丙酮酸激酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:751或多肽SEQ ID NO:752相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:1156或多肽SEQID NO:1157的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“硫氧还蛋白家族蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:1156或多肽SEQ ID NO:1157相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:1510或多肽SEQID NO:1511的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“harpin-诱导性家族蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQID NO:1510或多肽SEQ ID NO:1511相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:1598或多肽SEQID NO:1599的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“糖基转移酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:1598或多肽SEQ ID NO:1599相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:1670或多肽SEQID NO:1671的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“生长素应答因子”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:1670或多肽SEQ ID NO:1671相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:1874或多肽SEQID NO:1875的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“At4g32480-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:1874或多肽SEQ ID NO:1875相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:1936或多肽SEQID NO:1937的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“钙依赖性蛋白激酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:1936或多肽SEQ ID NO:1937相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:2492或多肽SEQID NO:2493的拟南芥核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“At5g16650-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:2492或多肽SEQ ID NO:2493相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:2553或多肽SEQID NO:2554的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“延伸因子Tu”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:2553或多肽SEQ ID NO:2554相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:3408或多肽SEQID NO:3409的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“ABC转运子透性酶蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:3408或多肽SEQ ID NO:3409相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:3564或多肽SEQID NO:3565的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“水解酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:3564或多肽SEQ ID NO:3565相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:3728或多肽SEQID NO:3729的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“延胡索酰乙酰乙酸水解酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:3728或多肽SEQ ID NO:3729相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4068或多肽SEQID NO:4069的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“葡萄糖脱氢酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:4068或多肽SEQ ID NO:4069相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4176或多肽SEQID NO:4177的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“丝氨酸蛋白酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:4176或多肽SEQ ID NO:4177相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4364或多肽SEQID NO:4365的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“ATP-结合蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:4364或多肽SEQ ID NO:4365相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4717或多肽SEQID NO:4718的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“异分支酸合酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:4717或多肽SEQ ID NO:4718相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4864或多肽SEQID NO:4865的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“MFS型转运子蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:4864或多肽SEQ ID NO:4865相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4903或多肽SEQID NO:4904的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“b1003-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:4903或多肽SEQ ID NO:4904相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4909或多肽SEQID NO:4910的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“b1522-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:4909或多肽SEQ ID NO:4910相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:4954或多肽SEQID NO:4955的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“b2739-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:4954或多肽SEQ ID NO:4955相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:5121或多肽SEQID NO:5122的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“b3646-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:5121或多肽SEQ ID NO:5122相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:5319或多肽SEQID NO:5320的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“B4029-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:5319或多肽SEQ ID NO:5320相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:5387或多肽SEQID NO:5388的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“乙酰转移酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:5387或多肽SEQ ID NO:5388相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:5458或多肽SEQID NO:5459的小立碗藓核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“酰基载体蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:5458或多肽SEQ ID NO:5459相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:6041或多肽SEQID NO:6042的集胞藻属核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:6041或多肽SEQ ID NO:6042相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:6469或多肽SEQID NO:6470的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:6469或多肽SEQ IDNO:6470相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:6739或多肽SEQID NO:6740的嗜热栖热菌核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“高柠檬酸合酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:6739或多肽SEQ ID NO:6740相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:7510或多肽SEQID NO:7511的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“聚半乳糖醛酸酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:7510或多肽SEQ ID NO:7511相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:7633或多肽SEQID NO:7634的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“硫氧还蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:7633或多肽SEQ ID NO:7634相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:53或多肽SEQ IDNO:54的甘蓝型油菜(Brassica napus)核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“丙酮酸激酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:53或多肽SEQ ID NO:54相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:7137或多肽SEQID NO:7138的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“微粒体β-酮还原酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:7137或多肽SEQ ID NO:7138相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:7208或多肽SEQID NO:7209的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:7208或多肽SEQ ID NO:7209相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:7274或多肽SEQID NO:7275的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“泛醌生物合成单加氧酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:7274或多肽SEQ ID NO:7275相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:7489或多肽SEQID NO:7490的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“YHR213W-蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:7489或多肽SEQ ID NO:7490相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:8239或多肽SEQID NO:8240的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“60S核糖体蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:8239或多肽SEQ ID NO:8240相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:8397或多肽SEQID NO:8398的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“自噬作用相关蛋白”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:8397或多肽SEQ ID NO:8398相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:8227或多肽SEQID NO:8228的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“细胞色素C氧化酶VIII亚基”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ ID NO:8227或多肽SEQ ID NO:8228相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
因此，在一个实施方案中，在包含核酸SEQ ID NO:8423或多肽SEQID NO:8424的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性分别增加或产生的情况下，例如，如果分别增加或产生这样的核酸分子或多肽的活性，或者如果在植物细胞、植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，则相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分，产生增加的GABA含量，其中所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸SEQ IDNO:8423或多肽SEQ ID NO:8424相同行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序。
在另一个实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的低温耐受，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2493所示多肽，或由包含SEQ ID NO:2492所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自拟南芥的相应核酸或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:2492所示核酸分子或SEQ ID NO:2493所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“At5g16650-蛋白”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO.:2492或SEQ ID NO.:2493相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受，特别是增加的低温耐受。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，在低温条件下产生了1.05倍至1.075倍的产量增加，例如增加至少100％。
在其他实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的低温耐受，其中所述多肽包含SEQ ID NO:7138所示多肽，或由包含SEQ ID NO:7137所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:7137所示核酸分子或SEQ ID NO:7138所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“微粒体β-酮还原酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO.:7137或SEQ ID NO.:7138相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受，特别是增加的低温耐受。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，在低温条件下产生了1.05倍至1.068倍的产量增加，例如增加至少100％。
在其他实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的低温耐受，其中所述多肽包含SEQ ID NO:7209所示多肽，或由包含SEQ ID NO:7208所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:7208所示核酸分子或SEQ ID NO:7209所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO.:7208或SEQ ID NO.:7209相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受，特别是增加的低温耐受。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，在低温条件下产生了1.05倍至1.206倍的产量增加，例如增加至少100％。
在其他实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的低温耐受，其中所述多肽包含SEQ ID NO:8240所示多肽，或由包含SEQ ID NO:8239所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:8239所示核酸分子或SEQ ID NO:8240所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“60S核糖体蛋白”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO.:8239或SEQ ID NO.:8240相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受，特别是增加的低温耐受。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，在低温条件下产生了1.05倍至1.230倍的产量增加，例如增加至少100％。
在其他实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的低温耐受，其中所述多肽包含SEQ ID NO:8424所示多肽，或由包含SEQ ID NO:8423所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:8423所示核酸分子或SEQ ID NO:8424所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO.:8423或SEQ ID NO.:8424相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受，特别是增加的低温耐受。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，在低温条件下产生了1.05倍至1.206倍的产量增加，例如增加至少100％。
在另一实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量，其中所述多肽包含SEQ ID NO:7209所示多肽，或由包含SEQ ID NO:7208所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:7208所示核酸分子或SEQ ID NO:7209所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:7208或SEQ ID NO:7209相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受，特别是增加的内在产量。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，在标准条件下产生了1.05倍至1.522倍的产量增加，例如增加至少100％，所述标准条件例如不存在营养物缺陷和/或胁迫条件。
例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:7208或SEQ ID NO:7209相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量。优选的，增加发生在质体中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，在标准条件下产生了1.05倍至1.232倍的产量增加，例如增加至少100％，所述标准条件例如不存在营养物缺陷和/或胁迫条件。
在另一实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量，其中所述多肽包含SEQ ID NO:8240所示多肽，或由包含SEQ ID NO:8239所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:8239所示核酸分子或SEQ ID NO:8240所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“60S核糖体蛋白”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:8239或SEQ ID NO:8240相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，在标准条件下产生了1.05倍至1.546倍的产量增加，例如增加至少100％，所述标准条件例如不存在营养物缺陷和/或胁迫条件。
在另一实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量，其中所述多肽包含SEQ ID NO:8398所示多肽，或由包含SEQ ID NO:8397所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:8397所示核酸分子或SEQ ID NO:8398所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“自噬作用相关蛋白”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:8397或SEQ ID NO:8398相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，在标准条件下产生了1.05倍至1.399倍的产量增加，例如增加至少100％，所述标准条件例如不存在营养物缺陷和/或胁迫条件。
在另一实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量，其中所述多肽包含SEQ ID NO:8424所示多肽，或由包含SEQ ID NO:8423所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ IDNO:8423所示核酸分子或SEQ ID NO:8424所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:8423或SEQ ID NO:8424相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量。优选的，增加发生在细胞质中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，在标准条件下产生了1.05倍至1.522倍的产量增加，例如增加至少100％，所述标准条件例如不存在营养物缺陷和/或胁迫条件。
例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:8423或SEQ ID NO:8424相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的内在产量。优选的，增加发生在质体中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，在标准条件下产生了1.05倍至1.232倍的产量增加，例如增加至少100％，所述标准条件例如不存在营养物缺陷和/或胁迫条件。
在另一实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的干旱耐受，优选循环干旱，其中所述多肽包含SEQ ID NO:7209所示多肽，或由包含SEQ ID NO:7208所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ ID NO:7208所示核酸分子或SEQ ID NO:7209所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:7208或SEQ ID NO:7209相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的干旱耐受，优选循环干旱。优选的，增加发生在质体中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，产生了1.05倍至1.351倍的产量增加，例如增加至少100％。
在另一实施方案中，如果增加或产生以下多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的干旱耐受，优选循环干旱，其中所述多肽包含SEQ ID NO:8424所示多肽，或由包含SEQ ID NO:8423所示核酸分子的核酸分子编码，或是所述核酸分子或多肽的同源物。例如，增加或产生来自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选的分别包含SEQ ID NO:8423所示核酸分子或SEQ ID NO:8424所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，或者增加或产生包含表I、II或IV的7列中分别与SEQ ID NO:8423或SEQ ID NO:8424相同的行中描述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，相比相应的未修饰的(例如，未转化的)野生型植物，产生了对非生物环境胁迫的增加的耐受和/或增加的产量相关性状，特别是增加的干旱耐受，优选循环干旱。优选的，增加发生在质体中。
特别的是，相比相应的对照(例如未修饰的、未转化的)野生型植物，产生了1.05倍至1.351倍的产量增加，例如增加至少100％。
为了本发明目的，通常复数旨在包括单数，并且反之亦然。
除非另有说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在该上下文中可互换。除非另有说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在该上下文中可互换。根据术语“序列”使用的上下文，术语“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质。此处使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或“核酸分子”指任何长度的核苷酸的多聚体形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述术语仅指分子的一级结构。
因此，此处使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或“核酸分子”包括双链和单链DNA和/或RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“帽”、类似物对一个或更多个天然发生的核苷酸的替代。优选地，所述DNA或RNA序列包含编码此处定义的多肽的编码序列。
“编码序列”是核苷酸序列，其转录成RNA，例如调节RNA，如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核酶等，或转录成mRNA，当其置于适当调节序列的控制下时翻译成多肽。编码序列的边界由5’末端的翻译起始密码子和3’末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括，但不限于
mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，同时在特定环境下也可存在内含子。
如该上下文中所用，核酸分子也可包括位于编码基因区3’和5’末端的非翻译序列，例如编码基因区5’末端序列上游的至少500，优选200，尤其优选100个核苷酸，以及编码基因区3’末端序列下游的至少100，优选50，尤其优选20个核苷酸。例如在使用反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等技术的情况下，可有利地使用编码区以及5’和/或3’区。
然而，仅经常有利地选择编码区用于克隆及表达目的。
“多肽”指氨基酸(氨基酸序列)的聚合物，并非指特定长度的分子。因此，在多肽的定义中包括肽和寡肽。该术语也指或包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。定义中包括的是，例如，含有氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)的一个或更多个类似物的多肽、具有替代连接以及本领域已知的天然发生的和非天然发生的其它修饰的多肽。
该说明书中使用的术语“表I”用于指定表I A和表I B的内容。该说明书中使用的术语“表II”用于指定表II A和表II B的内容。该说明书中使用的术语“表I A”用于指定表I A的内容。该说明书中使用的术语“表I B”用于指定表I B的内容。该说明书中使用的术语“表II A”用于指定表II A的内容。该说明书中使用的术语“表II B”用于指定表II B的内容。在一个优选实施方案中，术语“表I”表示表I B。在一个优选实施方案中，术语“表II”表示表II B。
当用于该说明书时，术语“包含”或“含有”及其语法变体用于指定所述的特征、整数、步骤或组分或其组的存在，但不排除一个或更多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。
根据本发明，如果相比相应的未转化的野生型，蛋白质或多肽的从头活性(de novo activity)或其增加的表达直接或间接的导致和产生增加的GABA含量，且所述蛋白质具有如表II栏3中所示蛋白质的上述活性，则所述蛋白质或多肽具有“如表II，栏3中所示蛋白质的活性”。在整个说明书中，如果其仍然具有如表II第3列中所示蛋白质的生物学或酶促活性，或者其与表II第3或5列中的蛋白质相比具有至少10％，优选20％，特别优选30％，最特别优选40％的初始酶促活性，那么这类蛋白质或多肽或核酸分子或编码这类蛋白质或多肽的序列的活性或优选生物学活性是相同或类似的。
术语“提高”、“升高”、“延长”、“增强”、“改善”或“扩大”涉及植物、生物、生物的部分，如组织、种子、根、叶、花等中，或细胞中性质的相应改变，并且可互换。优选地，如果提高或增强与基因产物活性的提高或增强相关，而不依赖于基因产物的量或基因产物的比活性，或两者是否提高或增强，或者编码基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否提高或增强，那么体积内的总体活性提高或增强。
术语“提高”涉及生物中，或植物、生物的部分，如组织、种子、根、叶、花等中，或细胞中性质的相应改变。优选地，如果提高与基因产物活性的提高相关，而不依赖于基因产物的量或基因产物的比活性，或两者是否提高或产生，或者编码基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否增加，那么体积内的总体活性提高。
在“性质的改变”之下，应理解相对于对照、参照或野生型的相应体积，特定体积中基因产物的活性、表达水平或量或代谢物含量改变了，包括活性或表达的从头产生。
术语“提高”包括仅部分本发明受试者中所述性质的改变，例如，可在细胞区室，像细胞器中，或在植物部分，像组织、种子、根、叶、花等中发现修饰，但如果检测总体受试者，即完整的细胞或植物，那么检测不到所述修饰。
因此，术语“提高”表示酶的比活性以及本发明化合物或代谢物例如多肽、核酸分子或编码mRNA或DNA的量可以在体积上增加。
术语“野生型”、“对照”或“参照”可互换并可以是细胞或生物的一部分，如细胞器，像叶绿体或组织，或生物，特别是植物，其未被本发明在本文中所述的方法修饰或处理。因此，用作野生型、对照或参照的细胞或生物的一部分，如细胞器，像叶绿体或组织，或生物，特别是植物尽可能地对应于细胞、生物、植物或其部分，并且是任何其它性质，但本发明方法的结果与本发明主题尽可能相同。因此，野生型、对照或参照进行相同或尽可能相同的处理，即仅条件或性质可以不同，其不影响所测性质的质量。
优选地，在相似条件下进行任何比较。术语“相似条件”表示在待比较的实验之间保持所有条件相同，所述条件为例如培养或生长条件、土壤含水量、温度、湿度或环境空气或土壤、测定条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原体品系、浓度等)。
术语“参照”、“对照”或“野生型”优选为受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物，尤其是植物，其未被本发明在本文中所述的方法修饰或处理，并且是与本发明主题尽可能类似的任何其它性质。参照、对照或野生型处于尽可能与本发明主题类似的其基因组、转录组、蛋白质组或代谢物组中。优选地，术语“参照”、“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物涉及细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物，其与本发明的细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物或其部分在遗传上几乎相同，具有优选95％，更优选98％，甚至更优选99,00％，特别是99,10％、99,30％、99,50％、99,70％、99,90％、99,99％、99,999％或更高的同一性。最优选的，“参照”、“对照”或“野生型”是受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物，其与根据本发明方法使用的生物、细胞或细胞器在遗传上相同，只是根据本发明方法改正、操作、交换或引入了应负责核酸分子或活性赋予核酸分子或由它们编码的基因产物。
如果不能提供仅因不是本发明方法的主题而不同于本发明主题的对照、参照或野生型，那么对照、参照或野生型可以是这样的生物，其中例如通过敲除负责基因产物的表达、例如通过反义抑制、通过失活激活剂或激动剂、激活抑制剂或拮抗剂、通过加入抑制性抗体进行抑制、加入活性化合物例如激素、引入负显性突变体等恢复或关闭活性调节的原因或如此处所述本发明核酸分子的表达，所述活性的调节与相应的未转化野生型相比，优选在提高的GABA含量。例如通过引入失活点突变敲除基因产生，其导致对酶活性的抑制或对结合辅因子等的能力的去稳定化或抑制。
因此，优选的参照受试者是本发明方法的起始受试者。优选地，在例如对总RNA、DNA或蛋白质或参照基因的活性或表达，像持家基因，如泛素、肌动蛋白或核糖体蛋白进行标准化并归一化后比较本发明的参照和主题。
本发明的提高或调节可以是瞬时的，例如由于稳定持久的转基因表达或在编码本发明核酸分子的相应内源基因中的稳定突变或对赋予本发明多肽表达的基因的表达或行为的调节，本发明的提高或调节可以是组成型的；例如由于调节物如激动剂或拮抗剂的瞬时转化或短暂添加；例如在用携带诱导型启动子控制下的本发明核酸分子的诱导型构建体转化并添加诱导物，例如四环素或如下文所述后。
与对照、参照或野生型相比，细胞、组织、细胞器、器官或生物或其部分中多肽活性量的提高优选达到至少5％，优选至少20％或至少50％，尤其优选至少70％、80％、90％或更高，特别尤其优选至少200％、300％或400％，最优选至少500％或更高。在一个实施方案中，术语提高表示与生物或其部分的重量相关的量的增加(w/w)。
在一个实施方案中，在细胞器如质体中多肽的活性量增加。
可如实施例中描述来检测本发明核酸分子编码的多肽或本发明多肽的比活性。具体而言，正在讨论的蛋白质在细胞，例如植物细胞中相比于对照的表达是容易的检测并可如本领域中描述的来进行。
术语“提高”包括，向细胞或亚细胞区室或细胞器中从头引入化合物或活性，或之前未曾检测到所述化合物或活性，换言之“产生”所述化合物或活性。
因此，在下文中，术语“增加”还包括术语“产生”或“刺激”。增加的活性自身表现为相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分而增加的GABA含量。
Ymr052w的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为因子停滞蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有酿酒酵母的“因子停滞蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述Ymr052w相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ymr052w相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述Ymr052w相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ymr052w相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“因子停滞蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At1g43850的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示【来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为转录调节子】。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“转录调节子”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At1g43850相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At1g43850相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At1g43850相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At1g43850相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“转录调节子”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At2g28890的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示【来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为蛋白磷酸酶】。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“蛋白磷酸酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At2g28890相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At2g28890相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At2g28890相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At2g28890相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“蛋白磷酸酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At3g04050的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为丙酮酸激酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“丙酮酸激酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At3g04050相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g04050相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At3g04050相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g04050相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“丙酮酸激酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At3g08710的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为硫氧还蛋白家族蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“硫氧还蛋白家族蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At3g08710相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g08710相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At3g08710相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g08710相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“硫氧还蛋白家族蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At3g11650的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为harpin-诱导性家族蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“harpin-诱导性家族蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At3g11650相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g11650相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At3g11650相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g11650相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“harpin-诱导性家族蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At3g27540的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为糖基转移酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“糖基转移酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At3g27540相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g27540相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At3g27540相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g27540相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“糖基转移酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At3g61830的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为生长素应答因子]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“生长素应答因子”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At3g61830相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g61830相同的各行中，或优选包含表I的5列的42行所示核酸分子并编码“生长素应答因子”的基因的基因产物；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At3g61830相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At3g61830相同的各行中，或优选包含表II的5列的42行所示多肽并编码“生长素应答因子”的多肽；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“生长素应答因子”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At4g32480的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为At4g32480-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“At4g32480-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At4g32480相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At4g32480相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At4g32480相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At4g32480相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“At4g32480-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At4g35310的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为钙依赖性蛋白激酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“钙依赖性蛋白激酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At4g35310相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At4g35310相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At4g35310相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At4g35310相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“钙依赖性蛋白激酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
At5g16650的序列来自拟南芥，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为At5g16650-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有拟南芥的“At5g16650-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述At5g16650相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At5g16650相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述At5g16650相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述At5g16650相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“At5g16650-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
AvinDRAFT_2344的序列来自棕色固氮菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为延伸因子Tu]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有棕色固氮菌的“延伸因子Tu”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述AvinDRAFT_2344相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_2344相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述AvinDRAFT_2344相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_2344相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“延伸因子Tu”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
AvinDRAFT_2521的序列来自棕色固氮菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为ABC转运子透性酶蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有棕色固氮菌的“ABC转运子透性酶蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述AvinDRAFT_2521相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_2521相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述AvinDRAFT_2521相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_2521相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“ABC转运子透性酶蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
AvinDRAFT_5103的序列来自棕色固氮菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为水解酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有棕色固氮菌的“水解酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述AvinDRAFT_5103相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_5103相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述AvinDRAFT_5103相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_5103相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“水解酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
AvinDRAFT_5292的序列来自棕色固氮菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为延胡索酰乙酰乙酸水解酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有棕色固氮菌的“延胡索酰乙酰乙酸水解酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述AvinDRAFT_5292相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_5292相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述AvinDRAFT_5292相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述AvinDRAFT_5292相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“延胡索酰乙酰乙酸水解酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B0124的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为葡萄糖脱氢酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“葡萄糖脱氢酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B0124相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0124相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B0124相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0124相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“葡萄糖脱氢酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B0161的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为丝氨酸蛋白酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“丝氨酸蛋白酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B0161相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0161相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B0161相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0161相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“丝氨酸蛋白酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B0449的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为ATP结合蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“ATP结合蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B0449相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0449相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B0449相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0449相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“ATP结合蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B0593的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为异分支酸合酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“异分支酸合酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B0593相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0593相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B0593相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0593相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“异分支酸合酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B0898的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为MFS型转运子蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“MFS型转运子蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B0898相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0898相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B0898相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B0898相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“MFS型转运子蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B1003的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为b1003-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“b1003-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B1003相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B1003相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B1003相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B1003相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“b1003-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B1522的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为b1522-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“b1522-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B1522相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B1522相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B1522相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B1522相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“b1522-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B2739的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为b2739-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“b2739-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B2739相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B2739相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B2739相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B2739相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“b2739-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B3646的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为b3646-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“b3646-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B3646相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B3646相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B3646相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B3646相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“b3646-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B4029的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为B4029-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“B4029-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B4029相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B4029相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B4029相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B4029相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“B4256-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
B4256的序列来自大肠杆菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为乙酰转移酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有大肠杆菌的“乙酰转移酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述B4256相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B4256相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述B4256相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述B4256相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“乙酰转移酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
C_PP034008079R的序列来自小立碗藓，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为酰基载体蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有小立碗藓的“酰基载体蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述C_PP034008079R相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述C_PP034008079R相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述C_PP034008079R相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述C_PP034008079R相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“酰基载体蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
Slr0739的序列来自集胞藻属，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有集胞藻属的“牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述Slr0739相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Slr0739相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述Slr0739相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Slr0739相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
TTC0019的序列来自嗜热栖热菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自嗜热栖热菌的“Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述TTC0019相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述TTC0019相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述TTC0019相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述TTC0019相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
TTC1550的序列来自嗜热栖热菌，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为高柠檬酸合酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自嗜热栖热菌的“高柠檬酸合酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述TTC1550相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述TTC1550相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述TTC1550相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述TTC1550相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“高柠檬酸合酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
Yjr153w的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为聚半乳糖醛酸酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“聚半乳糖醛酸酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述Yjr153w相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Yjr153w相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述Yjr153w相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Yjr153w相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“聚半乳糖醛酸酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
Ylr043c的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为硫氧还蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“硫氧还蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述Ylr043c相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ylr043c相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述Ylr043c相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ylr043c相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“硫氧还蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
51340801_CANOLA的序列来自甘蓝型油菜，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为丙酮酸激酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自甘蓝型油菜的“丙酮酸激酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述51340801_CANOLA相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述51340801_CANOLA相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述51340801_CANOLA相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述51340801_CANOLA相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“丙酮酸激酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
Ybr159w的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为微粒体β-酮还原酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“微粒体β-酮还原酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述Ybr159w相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ybr159w相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述Ybr159w相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ybr159w相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“微粒体β-酮还原酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
YDR046C的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为支链氨基酸透性酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“支链氨基酸透性酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述YDR046C相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YDR046C相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述YDR046C相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YDR046C相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“支链氨基酸透性酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
YGR255C的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为泛醌生物合成单加氧酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“泛醌生物合成单加氧酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述YGR255C相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YGR255C相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述YGR255C相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YGR255C相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“泛醌生物合成单加氧酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
YHR213W的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为YHR213W-蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“YHR213W-蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述YHR213W相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YHR213W相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述YHR213W相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YHR213W相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“YHR213W-蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
YPL249C-A的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为60S核糖体蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“60S核糖体蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述YPL249C-A相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YPL249C-A相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述YPL249C-A相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YPL249C-A相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“60S核糖体蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
YPR185W的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为自噬作用相关蛋白]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“自噬作用相关蛋白”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述YPR185W相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YPR185W相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述YPR185W相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YPR185W相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“自噬作用相关蛋白”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
Ylr395c的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为细胞色素C氧化酶VIII亚基]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“细胞色素C氧化酶VIII亚基”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述Ylr395c相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ylr395c相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述Ylr395c相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述Ylr395c相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“细胞色素C氧化酶VIII亚基”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
YDR046C_2的序列来自酿酒酵母，例如表I的5列中所示[来自酿酒酵母的序列已公开在Goffeau等，Science 274(5287),546-547,1996中；来自大肠杆菌的序列已公开在Blattner等，Science 277(5331),1453-1474(1997)；它的活性公开描述为支链氨基酸透性酶]。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括增加或产生具有自酿酒酵母的“支链氨基酸透性酶”活性的基因产物或其功能等价体或其同源物的活性，例如，增加：
(a)包含表I的5列所示的核酸分子，并描述在与所述YDR046C_2相同的各行中的基因的基因产物，或其功能等价体，或其同源物，如表I的7列所述，优选如表IB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YDR046C_2相同的各行中；或
(b)包含表II的5列所示的多肽、共有序列或多肽基序，并描述在与所述YDR046C_2相同的各行中的多肽，或其功能等价体，或其同源物，如表II或IV的7列所述，优选如表IIB的7列所述的同源物或功能等价体，并描述在与所述YDR046C_2相同的各行中；
如本文所述，增加的GABA含量是与所述相应的未转化的野生型比较的。
因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中增加了活性的分子是具有所述“支链氨基酸透性酶”活性的基因产物，优选是本段的(a)或(b)节的分子。
还观察到在拟南芥中增加或产生表XIII中所示基因(例如源自表XIII中所示核酸分子的核酸分子)的活性，相比野生型对照，产生了增加的胁迫耐受，例如增加的低温耐受。因而，在一个实施方案中，将表XIII中表示的核酸分子或其同源物(如表I所示)或表达产物用于本发明的方法，以增加植物相比野生型对照的胁迫耐受，例如增加低温耐受。
还观察到在拟南芥中增加或产生表XII中所示基因(例如源自表XII中所示核酸分子的核酸分子)的活性，相比野生型对照，产生了增加的胁迫耐受，例如增加的对循环干旱的耐受。因而，在一个实施方案中，将表XII中表示的核酸分子或其同源物(如表I所示)或表达产物用于本发明的方法，以增加植物相比野生型对照的胁迫耐受，例如增加对循环干旱的耐受。
还观察到在拟南芥中增加或产生表XI中所示基因(例如源自表XI中所示核酸分子的核酸分子)的活性，相比野生型对照，产生了增加的内在产量，例如在标准条件下增加的生物量，例如增加在无缺陷或无胁迫条件下的生物量。因而，在一个实施方案中，将表XI中表示的核酸分子或其同源物(如表I所示)或表达产物用于本发明的方法，以增加植物相比野生型对照的内在产量，例如在标准条件下增加的生物量，例如增加在无缺陷或无胁迫条件下的生物量。
令人惊讶的，观察到在拟南芥中增加或产生至少一个选自以下活性的基因：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，或者包含表I的5列中所述核酸序列的基因，相比相应的未转化的野生型，产生了增加的GABA含量。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“因子停滞蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和12.35倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:42的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“转录调节子”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和5.47倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:654的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“蛋白磷酸酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和12.21倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:706的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“丙酮酸激酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和26.89倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:751的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“硫氧还蛋白家族蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.64倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:1156的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“harpin-诱导性家族蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.21倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:1510的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“糖基转移酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和4.27倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:1598的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“生长素应答因子”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和16.46倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:1670的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“At4g32480-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和7.44倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:1874的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“钙依赖性蛋白激酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和5.40倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:1936的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“At5g16650-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.07倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:2492的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“延伸因子Tu”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和6.42倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:2553的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“ABC转运子透性酶蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和1.99倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:3408的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“水解酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和10.13倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:3564的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“延胡索酰乙酰乙酸水解酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和14.56倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:3728的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“葡萄糖脱氢酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和4.07倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:4068的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“丝氨酸蛋白酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和16.31倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:4176的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“ATP结合蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和15.36倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:4364的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“异分支酸合酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.59倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:4717的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“MFS型转运子蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和175.83倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQID NO:4864的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“b1003-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和9.49倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:4903的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“b1522-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和22.61倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:4909的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“b2739-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和14.55倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:4954的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“b3646-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.02倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:5121的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“B4029-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和77.37倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:5319的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“乙酰转移酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.19倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:5387的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“酰基载体蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.02倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:5458的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.55倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:6041的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和7.25倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:6469的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“高柠檬酸合酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和2.93倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:6739的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“聚半乳糖醛酸酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和6.77倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:7510的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“硫氧还蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和2.10倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:7633的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“丙酮酸激酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和3.22倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:53的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“微粒体β-酮还原酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和2.23倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:7137的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“支链氨基酸透性酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和48.39倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:7208的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“泛醌生物合成单加氧酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和31.94倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQID NO:7274的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“YHR213W-蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和7.79倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:7489的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“60S核糖体蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和6.64倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:8239的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“自噬作用相关蛋白”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和47.89倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:8397的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“细胞色素C氧化酶VIII亚基”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和131.19倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ ID NO:8227的核酸序列的基因编码的。
观察到在拟南芥中增加或产生具有“支链氨基酸透性酶”活性的基因产物的活性，相比野生型对照，产生了如实施例所示在1.1％和48.39倍之间的增加的产量，优选增加的GABA含量，其中所述蛋白是由包含SEQ IDNO:8423的核酸序列的基因编码的。
因而，根据本发明的方法，可以在植物细胞、植物或其部分中实现相对于对照或野生型增加的GABA含量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“因子停滞蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ IDNO:43，或是由包含核酸SEQ ID NO:42的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:42或多肽SEQ ID NO:43相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“转录调节子”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:655，或是由包含核酸SEQ ID NO:654的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:654或多肽SEQ ID NO:655相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“蛋白磷酸酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:707，或是由包含核酸SEQ ID NO:706的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:706或多肽SEQ ID NO:707相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“丙酮酸激酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:752，或是由包含核酸SEQ ID NO:751的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:751或多肽SEQ ID NO:752相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“硫氧还蛋白家族蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:1157，或是由包含核酸SEQ ID NO:1156的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:1156或多肽SEQ IDNO:1157相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“Harpin诱导性家族蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:1511，或是由包含核酸SEQ ID NO:1510的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:1510或多肽SEQ IDNO:1511相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“糖基转移酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:1599，或是由包含核酸SEQ ID NO:1598的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:1598或多肽SEQ ID NO:1599相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果分别增加或产生“生长素应答因子”或“生长素转录因子”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:1671，或是由包含核酸SEQ ID NO:8590的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:8589或多肽SEQ ID NO:1670相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“At4g32480-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:1875，或是由包含核酸SEQ ID NO:1874的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:1874或多肽SEQ ID NO:1875相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“钙依赖性蛋白激酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:1937，或是由包含核酸SEQ ID NO:1936的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:1936或多肽SEQ ID NO:1937相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“At5g16650-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:2493，或是由包含核酸SEQ ID NO:2492的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:2492或多肽SEQ ID NO:2493相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“延伸因子Tu”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:2554，或是由包含核酸SEQ ID NO:2553的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:2553或多肽SEQ ID NO:2554相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“ABC转运子透性酶蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:3409，或是由包含核酸SEQ ID NO:3408的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:3408或多肽SEQ IDNO:3409相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“水解酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:3565，或是由包含核酸SEQ ID NO:3564的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:3564或多肽SEQ ID NO:3565相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“延胡索酰乙酰乙酸水解酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:3729，或是由包含核酸SEQ ID NO:3728的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:3728或多肽SEQ IDNO:3729相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“葡萄糖脱氢酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ IDNO:4069，或是由包含核酸SEQ ID NO:4068的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4068或多肽SEQ ID NO:4069相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“丝氨酸蛋白酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ IDNO:4177，或是由包含核酸SEQ ID NO:4176的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4176或多肽SEQ ID NO:4177相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“ATP结合蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ IDNO:4365，或是由包含核酸SEQ ID NO:4364的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4364或多肽SEQ ID NO:4365相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“异分支酸合酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ IDNO:4718，或是由包含核酸SEQ ID NO:4717的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4717或多肽SEQ ID NO:4718相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“MFS型转运子蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:4865，或是由包含核酸SEQ ID NO:4864的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4864或多肽SEQ ID NO:4865相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“b1003-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:4904，或是由包含核酸SEQ ID NO:4903的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4903或多肽SEQ ID NO:4904相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“b1522-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:4910，或是由包含核酸SEQ ID NO:4909的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4909或多肽SEQ ID NO:4910相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“b2739-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:4955，或是由包含核酸SEQ ID NO:4954的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:4954或多肽SEQ ID NO:4955相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“b3646-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:5122，或是由包含核酸SEQ ID NO:5121的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:5121或多肽SEQ ID NO:5122相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“B4029-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:5320，或是由包含核酸SEQ ID NO:5319的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:5319或多肽SEQ ID NO:5320相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“乙酰转移酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:5388，或是由包含核酸SEQ ID NO:5387的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:5387或多肽SEQ ID NO:5388相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“酰基载体蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ IDNO:5459，或是由包含核酸SEQ ID NO:5458的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:5458或多肽SEQ ID NO:5459相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:6042，或是由包含核酸SEQ ID NO:6041的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:6041或多肽SEQ ID NO:6042相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:6470，或是由包含核酸SEQ ID NO:6469的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:6469或多肽SEQ ID NO:6470相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“高柠檬酸合酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ IDNO:6740，或是由包含核酸SEQ ID NO:6739的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:6739或多肽SEQ ID NO:6740相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“聚半乳糖醛酸酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:7511，或是由包含核酸SEQ ID NO:7510的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:7510或多肽SEQ ID NO:7511相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“硫氧还蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:7634，或是由包含核酸SEQ ID NO:7633的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:7633或多肽SEQ ID NO:7634相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“丙酮酸激酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:54，或是由包含核酸SEQ ID NO:53的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:53或多肽SEQ ID NO:54相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“微粒体β-酮还原酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:7138，或是由包含核酸SEQ ID NO:7137的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:7137或多肽SEQ ID NO:7138相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:7209，或是由包含核酸SEQ ID NO:7208的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:7208或多肽SEQ ID NO:7209相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“泛醌生物合成单加氧酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:7275，或是由包含核酸SEQ ID NO:7274的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:7274或多肽SEQ IDNO:7275相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“YHR213W-蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:7490，或是由包含核酸SEQ ID NO:7489的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:7489或多肽SEQ ID NO:7490相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“60S核糖体蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:8240，或是由包含核酸SEQ ID NO:8239的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:8239或多肽SEQ ID NO:8240相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“自噬作用相关蛋白”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:8398，或是由包含核酸SEQ ID NO:8397的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:8397或多肽SEQ ID NO:8398相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“细胞色素C氧化酶VIII亚基”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQ ID NO:8228，或是由包含核酸SEQ ID NO:8227的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:8227或多肽SEQ ID NO:8228相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
因此，在一个实施方案中，如果在生物体中增加或产生这样的多肽的活性，或者如果增加或产生“支链氨基酸透性酶”的活性，则优选在所述生物体中产生相比野生型增加的GABA含量，其中所述多肽是根据多肽SEQID NO:8424，或是由包含核酸SEQ ID NO:8423的核酸分子编码的多肽或是所述核酸分子或多肽的同源物，例如如果分别增加或产生包含如表I、II或IV的7列中分别与核酸分子SEQ ID NO:8423或多肽SEQ ID NO:8424相同的行中所述的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性。
术语“表达”指基因的编码性基因片段的转录和/或翻译。一般而言，获得的产物是mRNA或蛋白质。然而，表达产物也可以包括功能性RNA，例如反义、核酸、tRNAs、snRNAs、rRNAs、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是系统的、局部的或临时的，例如限制到某些细胞类型、组织器官或细胞器或时间段。
在一个实施方案中，本发明的方法包括一个或多个下列步骤：
a)稳定化这样的蛋白质，所述蛋白质产生由本发明的核酸分子编码的蛋白质或具有本文所述活性的本发明的多肽的增加的表达，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量，其中所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白；
b)稳定化这样的mRNA，所述mRNA产生由本发明的核酸分子或其同源物编码的蛋白质或编码具有本文所述活性的本发明的多肽的mRNA的增加的表达，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量，其中所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白；
c)增加蛋白质的比活，所述蛋白质产生由本发明的核酸分子编码的蛋白质或本发明的多肽的增加的表达，或降低本发明多肽的抑制性调控；
d)产生或增加介导这样的蛋白表达的内源性或人工转录因子的表达，所述蛋白质产生由本发明的核酸分子编码的蛋白质或具有本文所述活性的本发明的多肽的增加的表达，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量，其中所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白；
e)通过向生物体或其部分添加一种或多种外源性诱导因子，刺激这样的蛋白质的活性，所述蛋白质产生由本发明的核酸分子编码的蛋白质或具有本文所述活性的本发明的多肽的增加的表达，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量，其中所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白；
f)表达编码这样的蛋白质的转基因，所述蛋白质产生由本发明的核酸分子编码的蛋白质或具有本文所述活性的本发明的多肽的增加的表达，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量，其中所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白；和/或
g)增加产生这样的核酸分子的的基因的拷贝数，所述核酸分子增加编码由本发明的核酸分子编码的多肽或具有本文所述活性的本发明的多肽的表达，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量，其中所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白；
h)通过添加阳性表达元件或去除阴性表达元件，增加编码本发明多肽或其同源物的内源性基因的表达，例如，可以使用同源重组将阳性调控元件(例如对于植物，35S增强子)导入启动子，或从调控区去除抑制子元件。可以使用其他的基因转化方法破坏抑制子元件或增强阳性元件的活性——通过T-DNA或转座子突变，可以向植物中随机的导入阳性元件，并可以鉴别其中在本发明的基因附近整合了阳性元件的种系，从而增强所述基因的表达；
i)以这样的方式调节植物的生长条件，使得增强了编码本发明蛋白质的基因的表达或活性，或增强所述蛋白质本身的表达或活性；
j)从天然的或突变的来源中，选择具有特别高活性的本发明蛋白质的生物体，将它们培育成目标生物体，例如良种(elite crop)。
优选地，所述mRNA是本发明的核酸分子和/或蛋白质，与相应的未转化野生型相比，在提高编码多肽的表达或活性或具有如表II第3列中所示蛋白质或其同源物的活性的多肽的活性后，所述蛋白质赋予本发明核酸分子单独编码的蛋白质或连接转运核酸序列或转运肽编码核酸序列所编码的的蛋白质或具有此处提及活性的多肽提高的表达，例如赋予提高的GABA含量。
一般而言，生物的细胞或区室中mRNA或多肽的量与编码蛋白质的量相关，因此与所述体积中编码蛋白质的总体活性相关。所述相关性并不总是线性的，所述体积中的活性依赖于分子的稳定性或激活或抑制性辅因子的存在。此外，熟知并在教科书例如Stryer,Biochemistry中描述了酶的产物和离析物抑制。
一般而言，生物的细胞或区室中mRNA、多核苷酸或核酸分子的量与编码蛋白质的量相关，因此与所述体积中编码蛋白质的总体活性相关。所述相关性并不总是线性的，所述体积中的活性依赖于分子的稳定性、分子的降解或激活或抑制性辅因子的存在。此外，例如在Zinser等“Enzyminhibitoren”/Enzyme inhibitors“中熟知酶的产物和离析物抑制。
可以多种方式提高本发明核酸分子编码的上述蛋白质和/或多肽的活性。例如，通过增加基因产物的数目，例如通过提高表达速率，像引入更强的启动子，或通过提高表达的mRNA的稳定性，因此提高翻译速率，和/或提高基因产物的稳定性，因此减少降解的蛋白质来提高生物或其部分，像细胞中的活性。此外，可以这样的方式影响酶的活性或更新，所述方式实现对反应速率的降低或提高或对底物的亲和力的修饰(降低或提高)的结果。本发明多肽，例如酶的催化中心中的突变可调节酶的更新速率，例如必需氨基酸的敲除可导致酶的活性降低或彻底敲除，或调节子结合位点的缺失或突变可减少负调节，像反馈抑制(或底物抑制，如果所述底物水平也提高)。可提高本发明酶的比活性，使得提高更新速率或改善辅因子的结合。改善编码mRNA或蛋白质的稳定性也可提高基因产物的活性。活性的刺激也在术语“提高的活性”的范围内。
[此外，可修饰上述核酸序列的调节，以便增强基因的表达。这可有利地通过异源调节序列或通过修饰例如突变所存在的天然调节序列来实现。有利的方法也可相互组合。
一般而言，可通过在所述生物或其部分中增加特定编码mRNA或相应蛋白质的量来提高生物或其部分，特别是植物细胞或植物细胞的细胞器、植物、或植物组织或其部分或微生物中基因产物的活性。“蛋白质或mRNA的量”理解为表示生物、组织、细胞或细胞区室中多肽或mRNA分子的分子数量。蛋白质的量的“增加”表示与野生型、对照或参照相比，生物、组织、细胞或细胞区室如细胞器(像质体或线粒体或其部分)中所述蛋白质的分子数量(例如通过下文描述的一种方法)定量增加。
分子数量的增加优选总计至少1％，优选高于10％，更优选30％或更高，尤其优选50％、70％或更高，非常尤其优选100％，最优选500％或更高。然而，也认为从头表达是本发明的主题。
可通过内源或外源因素引起修饰，例如提高。例如，可通过向培养基或营养物中添加基因产物或前体或激活剂或激动剂，或可通过向生物中暂时或稳定引入所述受试体引起生物或其部分中活性的提高。此外，可通过转化和/或靶定分别向例如细胞核或细胞质或质体引入本发明的核酸序列或在正确细胞区室中编码的蛋白质来实现这种提高。
在一个实施方案中，与相应的未转化野生型植物细胞相比，通过提高本发明多肽的内源水平实现植物或其部分，例如细胞、组织、器官、细胞器等中环境胁迫耐受性和/或抗性的提高或降低。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中增加编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的基因拷贝数。此外，例如可通过修饰多肽的转录或翻译调节提高本发明多肽的内源水平。
在一个实施方案中，可通过靶定或随机诱变本发明的内源基因改变细胞中提高的GABA含量。例如同源重组可用于向启动子引入正调节元件(对植物而言，像35S增强子)或从调节区去除抑制元件。此外，基因转换，像Kochevenko和Willmitzer(Plant Physiol.2003
May；132(1):174-84)及其中的引用中描述的方法可用于破坏抑制元件或增强正调节元件的活性。
此外，可通过T-DNA或转座子诱变在(植物)基因组中随机引入正元件，并可筛选这样的株系，其中所述正元件已经整合到本发明基因的附近，由此增强其表达。Hayashi等,1992(Science 258:1350-1353)或Weigel等,2000(Plant Physiol.122,1003-1013)及其中引用的其它文献已经描述了通过随机整合增强子元件对植物基因的激活。
在多种情况下已经描述了在目的基因附近鉴定插入(其最终携带激活元件)的反向遗传学策略，例如Krysan等,1999(Plant Cell 1999,11,2283-2290)；Sessions等,2002(Plant Cell 2002,14,2985-2994)；Young等,2001,(Plant Physiol.2001,125,513-518)；Koprek等,2000(Plant J.2000,24,253-263)；Jeon等,2000(Plant J.2000,22,561-570)；Tissier等,1999(Plant Cell 1999,11,1841-1852)；Speulmann等,1999(Plant Cell1999,11,1853-1866)。简言之，收获来自大T-DNA或转座子诱变的植物群体的所有植物的材料，并制备基因组DNA。然后根据例如Krysan等,1999(Plant Cell 1999,11,2283-2290)中描述的特定结构合并所述基因组DNA。然后通过特定的多重PCR反应筛选基因组DNA的库，检测插入诱变剂(例如T-DNA或转座子)和目的基因的组合。因此，用T-DNA或转座子边界引物和基因特异引物的特定组合在DNA库上进行PCR反应。可再次从Krysan等,1999(Plant Cell 1999,11,2283-2290)中获得用于引物设计的一般原则。重新筛选更低水平的DNA库导致对个别植物的鉴定，在所述植物中通过插入诱变剂激活目的基因。
也可通过一般的诱变技术实现正调节元件的增强或负调节元件的破坏或减弱。化学诱变或放射诱变群体的产生是常用的技术，并为技术人员所知。Koorneef等1982及其中的引用和Lightner和Caspar在“Methods inMolecular Biology”第82卷中描述了用于植物的方法。这些技术一般诱导点突变，其可使用如TILLING(Colbert等2001)方法在任何已知基因中鉴定到。
因此，如果通过同源重组、Tilling方法或基因转换修饰编码赋予本发明多肽增强表达的多肽的内源基因，特别是包含本发明核酸分子的基因，那么可提高表达水平。也可以如上提及向本发明核酸序列中添加靶向序列。
调节序列(除靶序列或其部分外)可优选有效连接内源蛋白质的编码区并控制其转录和翻译或编码mRNA或表达蛋白质的稳定性或衰退。为了修饰和控制表达，可改变、添加或修改启动子、UTR、剪接位点、加工信号、多腺苷酸化位点、终止子、增强子、抑制子、转录后或翻译后修饰位点。例如，Hayashi等,1992(Science 258:1350-1353)或Weigel等,2000(Plant Physiol.122,1003-1013)及其中引用的其它文献已经描述了通过随机整合增强子元件激活植物基因。例如，可通过用更强的转基因启动子替换内源启动子或用3’UTR(其提供更高的稳定性，但不改变编码区)替换内源3’UTR来调节内源蛋白质的表达水平。此外，可如实施例中所述通过引入人工转录因子调节转录调节。下文中描述了备选启动子、终止子和UTR。
也可通过引入合成的转录因子(其结合到编码如表II第3列中所示蛋白质的基因编码区附近并激活其转录)增强内源多肽的激活，所述内源多肽具有上述活性，例如具有如表II第3列中所示蛋白质或本发明多肽的活性，其例如与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量。可构建嵌合的锌指蛋白质，其包含特定的DNA结合域和激活域，例如单纯疱疹病毒的VP16结构域。特定结合域可结合编码如表II第3列中所示蛋白质的基因的调节区。生物，特别是植物中的嵌合转录因子的表达导致如表II第3列中所示蛋白质的特异表达，参阅例如WO01/52620,Oriz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,第99卷,13290或Guan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,第99卷,13296。
在本发明方法的一个其它实施方案中，使用这样的生物，其中突变一个上述基因，或一个上述核酸，所述突变以这样的方式进行：与未突变蛋白质相比编码基因产物的活性受细胞因子影响更小或根本不受其影响。例如，酶活性的众所周知的调节机制是底物抑制或反馈调节机制。在下文相应段落及其中列出的参考文献，例如Sambrook等,MolecularCloning,Cold Spring Habour,NY,1989中描述了引入相应序列的一个或更多碱基、核苷酸或氨基酸替换、缺失和添加的方法和技术。本领域技术人员将能够利用现有技术，通过计算机软件方法或通过向核酸分子或蛋白质中引入系统突变并测定导致每体积，特别是每个细胞中比活性提高或活性提高的那些突变来比较本发明核酸分子的序列或其表达产物来鉴定调节子的调节结构域和结合位点，所述计算机软件方法包含用于鉴定结合位点和调节结构域的算法。
因此有利地在生物中表达本发明的核酸分子或来自进化远源生物的本发明的多肽(例如在真核宿主中使用原核基因)，因为在这些情况中，宿主细胞的调节机制不会削弱基因的活性(细胞活性或比活性)或其表达产物。
以这样的方法引入突变，其中不会不利地影响提高的产量。
对基因或其基因产物调节的更少影响理解为对酶或生物活性的减少的调节，导致基因或其产物的比活性或细胞活性提高。酶或生物活性的提高理解为表示酶或生物活性，其与初始生物相比提高至少10％，有利地至少20、30或40％，尤其有利地至少50、60或70％。与相应的未转化野生型相比，这导致提高的产量。
本发明提供可进行上述方法，以便提高胁迫耐受性。也可能获得胁迫耐受性的降低。
本发明不限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或特定方法等，因为这些可以变化，并且其中的多种修饰和变型对本领域技术人员而言是显而易见的。也应理解，此处所用的术语仅为描述特定实施方案的目的，并不旨在限制。
本发明还涉及包含核酸分子的分离的核酸，所述核酸分子选自：
a)编码表II B第7列中所示多肽的核酸分子；
b)在表I B第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，因为遗传密码的简并性，其可来自表II第5列或第7列中所述多肽序列并与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量；
d)核酸分子，其与多核苷酸的核酸分子序列(其包含表I第5列或第7列中显示的核酸分子)具有至少30％的同一性，并与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的GABA含量；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的GABA含量；
g)核酸分子，其编码可在制备的针对(a)到(e)的核酸分子之一编码的多肽的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码具有如表II第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的GABA含量；
i)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV第5列中所述多肽的蛋白代表的活性；
和
j)核酸分子，其通过在严格杂交条件下利用包含(a)或(b)核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得，所述探针或其片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并且所述核酸分子编码具有包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽；
由此，(a)到(j)的核酸分子至少在一个或更多核苷酸中不同于表I A第5列或第7列中所述的序列，并且其优选编码至少在一个或更多氨基酸中不同于表II A第5列或第7列中所述的蛋白质序列的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明涉及上述序列同源物，它们可有利地分离自酵母、真菌、病毒、藻类、细菌，例如醋化醋杆菌(Acetobacteraceti，醋杆菌亚属)；Acidithiobacillus ferrooxidans；不动杆菌属(Acinetobacter)；放线杆菌属(Actinobacillus)；杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；Aquifex aeolicus；化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)；翠菊黄化植原体(Asteryellows phytoplasma)；芽孢杆菌属(Bacillus)；双岐杆菌属(Bifidobacterium)；布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；扩展短杆菌(Brevibacterium linens)；马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)；巴克纳氏菌属(Buchnera)；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；衣原体(Chlamydia sp.)；Chlamydophila sp.；泥生绿菌(栖泥绿菌)(Chlorobiumlimicola)；Citrobacter rodentium；梭菌(梭状芽孢杆菌)(Clostridium sp.)；睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)；棒杆菌(棒状菌)(Corynebacterium sp.)；伯氏考克斯氏体(Q热病原体，伯氏立克次氏体)(Coxiella burnetii)；耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)；节瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆菌(Enterobacter sp.)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠杆菌(Escherichia coli)；黄杆菌(Flavobacterium sp.)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)；弗兰克氏菌(Frankia sp.CpI1)；具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；Geobacillus stearothermophilus；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)；嗜血菌(Haemophilus sp.)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；乳杆菌(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；利斯特氏菌(Listeriasp.)；Mannheimia haemolytica；Mesorhizobium loti；深海噬甲基菌(Methylophaga thalassica)；铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)；微颤蓝细菌(Microscilla sp.PRE1)；莫拉氏菌(Moraxella sp.TA144)；分枝杆菌(Mycobacterium sp.)；枝原体(Mycoplasma sp.)；奈瑟氏球菌(Neisseriasp.)；亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)；念珠蓝细菌(Nostoc sp.PCC7120)；Novosphingobium aromaticivorans；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)；坑形席蓝细菌(Phormidiumfoveolarum)；Phytoplasma sp.；Plectonema boryanum；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)；丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)；普通变形菌(Proteus vulgaris)；假单胞菌(Pseudomonas sp.)；Ralstonia sp.；根瘤菌(Rhizobium sp.)；马红球菌(Rhodococcus equi)；海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；立克次氏体(Rickettsia sp.)；鸭瘟立默氏菌(Riemerella anatipestifer)；生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)；沙门氏菌(Salmonella sp.)；反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)；嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)；希瓦氏菌(Shigella sp.)；苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；葡萄球菌(Staphylococcus sp.)；链球菌(Streptococcus sp.)；链霉菌(Streptomyces sp.)；聚球蓝细菌(Synechococcus sp.)；集胞蓝细菌(Synechocystis sp.PCC 6803)；海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；密螺旋体(Treponema sp.)；解脲鸟枝原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森氏菌(Yersinia sp.)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选沙门氏菌(Salmonella)或大肠杆菌或植物，优选分离自酵母，例如分离自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或者植物，如拟南芥、玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、向日葵、亚麻子、报春花、油菜籽、芸苔和球茎甘蓝、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊；茄科植物包括马铃薯、烟草、茄子、西红柿；蚕豆属物种、豌豆、苜蓿；灌木植物如咖啡、可可、茶；柳属物种；树木如油棕榈、椰子；多年生草本植物如黑麦草和羊茅草；饲料作物如苜蓿和三叶草；以及分离自例如云杉、松或冷杉。更优选地，上述序列的同源物可分离自酿酒酵母、大肠杆菌或植物，优选欧洲油菜、大豆、玉米、棉花或稻。
本发明的(GABA相关)蛋白质优选通过重组DNA技术产生。例如，将编码该蛋白的核酸分子克隆进表达载体中，例如克隆进双元载体中，将该表达载体引入宿主细胞，例如拟南芥野生型NASC N906或下文实施例中所述任何其他植物细胞，并在所述宿主细胞中表达胁迫相关蛋白质。双元载体的实例是pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen或pPZP(Hajukiewicz,P.等,1994,Plant Mol.Biol.,25:989-994和Hellens等,Trends in Plant Science(2000)5,446–451.)。
在一个实施方案中，本发明的(GABA相关)蛋白质优选在细胞区室(更优选在质体)中产生。将核酸引入质体并在该区室中产生蛋白质的方法为本领域技术人员已知，并描述于本申请中。
有利地，本发明的核酸序列或基因构建体与至少一个报告基因一起克隆进表达盒中，该表达盒通过载体引入生物中，或者直接引入基因组中。该报告基因应允许通过生长、荧光、化学物质、生物发光或抗性测定或通过光度测量而容易地进行检测。可以提到的报告基因的实例为抗生素或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因，例如Ura3基因、Ilv2基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-去氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、β-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因(也称为乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、D-氨基酸代谢酶基因或BASTA(＝草铵膦抗性)基因。这些基因允许容易地测量和定量转录活性，从而测量和定量基因表达。这样，可以鉴定显示不同生产力的基因组位置。
在一个优选的实施方案中，核酸构建体(例如表达盒)包含编码序列上游(即5’末端)的启动子和下游(即3’末端)的多腺苷酸化信号，以及任选的其他调节元件，它们与具有表I第5列和第7列中所示SEQ ID NO的核酸之一的间插编码序列有效连接。有效连接指启动子、编码序列、终止子和任选的其他调节元件依次排列，以使得每个调节元件可以正确的方式在编码序列的表达中发挥其功能。优选用于有效连接的序列为确保亚细胞定位至质体的靶向序列。然而，也可以利用确保亚细胞定位至线粒体、内质网(＝ER)、细胞核、油小体或其他区室的靶向序列，以及翻译启动子例如烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等,Nucl.Acids Res.15(1987),8693-8711)。
例如，核酸构建体(例如表达盒)可以含有组成型启动子或组织特异性启动子(优选USP或油菜籽蛋白启动子)、待表达基因和ER滞留信号。就ER滞留信号而言，优选使用KDEL氨基酸序列(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨酸-X-停止，其中X表示每一种其他已知的氨基酸)。
为在宿主生物(例如植物)中进行表达，有利地将表达盒插入载体中，例如质粒、噬菌体或其他允许该基因在宿主生物中最佳表达的DNA。合适的质粒的实例为：大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214；棒杆菌中的pSA77或pAJ667；真菌中的pALS1、pIL2或pBB116；其他有利的真菌载体描述于Romanos,M.A.等,[(1992)”Foreign gene expression in yeast:a review“,Yeast 8:423-488]和van den Hondel,C.A.M.J.J.等[(1991)”Heterologous gene expression infilamentous fungi“以及More Gene Manipulations in Fungi[J.W.Bennet&L.L.Lasure,编辑,396-428页:Academic Press:San Diego]和”Genetransfer systems and vector development for filamentous fungi“[van denHondel,C.A.M.J.J.&Punt,P.J.(1991):Applied Molecular Genetics ofFungi,Peberdy,J.F.等,编辑,1-28页,Cambridge University Press:Cambridge]。有利的酵母启动子的实例为2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子的实例为pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKH或pDH51(参阅Schmidt,R.和Willmitzer,L.,1988))。上文指出的载体或者上文所指出载体的衍生物仅为可能的质粒中的一部分。其他质粒为本领域技术人员所熟知，并可见于例如”Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等编辑Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0444904018)。合适的植物载体描述于“Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology”(CRC Press,Ch.6/7,71-119页)等。有利的载体已知为能在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载体或双元载体。
载体指除质粒以外本领域技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体；病毒如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒；转座子；IS元件；噬粒；噬菌粒；粘粒；线性或环状DNA。这些载体可在宿主细胞中自主复制或随染色体复制，优选随染色体复制。
在载体的另一实施方案中，本发明的表达盒还可有利地以线性DNA的形式引入生物中，并通过异源或同源重组整合进宿主生物的基因组中。这种线性DNA可由线性化的质粒构成，或者仅由作为载体的表达盒或本发明核酸序列构成。
在另一有利的实施方案中，本发明的核酸序列还可以其自身引入生物中。
如果除了本发明核酸序列外还向生物中引入其他基因，则在单个载体与报告基因一起或者每个基因在载体中带有一个报告基因均可引入，其中不同载体可同时或连续引入。
所述载体有利地含有至少一个拷贝的本发明核酸序列和/或本发明的表达盒(＝基因构建体)。
本发明还提供分离的重组表达载体，其包含编码表II第5列和第7列中所示多肽的核酸，其中该载体在宿主细胞中的表达导致与宿主细胞的野生型品种相比对环境胁迫的耐受性提高。本文使用的术语“载体”指能运输与其相连的其他核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，指其中可连接其他DNA区段的双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其他DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体能在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合进宿主细胞或细胞器的基因组中，从而与宿主或细胞器的基因组一起复制。此外，某些载体能知道与其有效连接的基因表达。这样的载体称为“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体一般为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最普遍使用的载体形式。然而，本发明旨在包括发挥相同功能的这些其他形式表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其为适于在宿主细胞中表达该核酸的形式，这意味着，重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞选择的与待表达核酸序列有效连接的一个或多个调节序列。在本文中涉及重组表达载体使用时，“有效连接”旨在表示目的核苷酸序列与调节序列以允许表达该核苷酸序列(例如，在体外转录/翻译系统中或当该载体引入宿主细胞的情况下为在宿主细胞中)的方式连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)以及Gruber和Crosby,:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick和Thompson编辑,第7章,89-108,CRC Press；Boca Raton,Florida,包括其参考文献。调节序列包括指导核苷酸序列在许多宿主细胞类型中组成型表达的调节序列以及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞或在某些条件下表达的调节序列。本领域技术人员应该理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的多肽表达水平等因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞中，从而产生本文所述核酸(例如GABA相关蛋白、GABA相关蛋白的突变体形式、融合多肽等)所编码的多肽或肽，包括融合多肽或肽。
本发明的重组表达载体可设计成在植物细胞中表达本发明的多肽。例如可在植物细胞中表达编码GABA相关蛋白基因(参阅Schmidt,R.和Willmitzer,L.,1988,High efficiency Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf andcotyledon explants,Plant Cell Rep.583-586；Plant Molecular Biology andBiotechnology,C Press,Boca Raton,Florida,第6/7章,S.71-119(1993)；F.F.White,B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,in:TransgenicPlants,第1卷,Engineering and Utilization,编辑.Kung和R.Wu,128-43,Academic Press:1993；Potrykus,1991,Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMolec.Biol.42:205-225及其中引用的参考文献)。合适的宿主细胞还讨论于Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press:San Diego,CA(1990)。或者，重组表达载体可以体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
经常使用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体在原核生物中表达多肽。融合载体在其中所编码多肽中加入多个氨基酸，一般在重组多肽的氨基端加入，但也可在C端加入，或者融合进多肽的合适区域中。这些融合载体一般用于三个目的：1)提高重组多肽的表达；2)提高重组多肽的溶解度；和3)通过作为亲和纯化中的配体而帮助纯化重组多肽。在融合表达载体中，经常在融合部分与重组多肽的连接处引入蛋白酶切割位点，以允许在纯化融合多肽后将重组多肽与融合部分分离。这些酶及其相应的识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
例如，可将植物表达盒装入pRT转化载体中((a)Toepfer等,1993,Methods Enzymol.,217:66-78；(b)Toepfer等1987,Nucl.Acids.Res.15:5890ff)。
或者，还可以在体外转录和翻译重组载体(＝表达载体)，例如使用T7启动子和T7RNA聚合酶。
用于原核生物的表达载体经常利用含有或不含融合蛋白或融合寡肽的诱导型系统，其中这些融合可同时以N端和C端方式发生，或者在蛋白质的其他有用结构域中发生。这些融合载体一般具有以下目的：i.)提高RNA的表达率；ii.)提高可获得的蛋白质合成率；iii.)提高蛋白质的溶解度；iv.)或通过可用于亲和层析的结合序列来简化纯化。还经常通过融合蛋白引入蛋白酶切割位点，这允许切割融合蛋白部分和纯化。这些蛋白酶识别序列是已知的，例如因子Xa、凝血酶和肠激酶。
典型的有利融合物和表达载体为pGEX[PharmaciaBiotech Inc；Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene 67:31-40]、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或蛋白A。
在一个实施方案中，将本发明多肽的编码序列克隆进pGEX表达载体中，以产生编码融合多肽的载体，所述融合多肽从N端到C端包含GST-凝血酶切割位点-X多肽。该融合多肽可使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析来纯化。可通过用凝血酶切割融合多肽来回收不融合GST的重组GABA相关蛋白。
大肠杆菌表达载体的其他实例为pTrc[Amann等,(1988)Gene69:301-315]和pET v载体[Studier等,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California(1990)60-89；Stratagene,Amsterdam,The Netherlands]。
从pTrc载体表达靶基因依赖于从杂合trp-lac融合启动子转录宿主RNA聚合酶。从pET 11d载体表达靶基因依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的从T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从固有的l原噬菌体提供，其带有lacUV 5启动子转录控制之下的T7gn1基因。
在本发明的一个优选的实施方案中，在植物和植物细胞例如单细胞植物细胞(如藻类)(参阅Falciatore等,1999,MarineBiotechnology 1(3):239-251和其中的参考文献)和来自高等植物(例如种子植物，如作物植物)的植物细胞中表达本发明的增加GABA在细胞内含量的蛋白，即GABA相关蛋白。可通过任何方法将编码表II第5列或第7列中所示GABA相关蛋白的核酸分子“引入”植物细胞中，所述方法包括转染、转化或转导、电穿孔、微粒轰击、农杆菌感染等。本领域技术人员已知的一种转化方法是将开花植物浸入农杆菌溶液中(其中所述农杆菌含有本发明的核酸)，然后对转化的配子进行育种。
用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的其他合适方法可见于Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989以及其他实验手册如Methods in MolecularBiology,1995,Vol.44,Agrobacterium protocols,Gartland和Davey编辑,Humana Press,Totowa,New Jersey。因为生物和非生物胁迫耐受性是希望在多种植物中遗传的一种一般性状，所述植物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽和芸苔、木薯、胡椒、向日葵和万寿菊；茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄；蚕豆属物种、豌豆、苜蓿；灌木植物(咖啡、可可、茶)；柳属物种；树木(油棕榈、椰子)；多年生草本植物和饲料作物，这些作物植物也是本发明另一实施方案中遗传改造的优选靶植物。饲料作物包括但不仅限于冰草(wheatrass)、草(Canarygrass)、雀麦草(Bromegrass)、披碱草(Wildrye Grass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脉根(BirdsfootTrefoil)、杂三叶(Alsike clover)、红三叶(red clover)和草木樨(Sweet clover)。
在本发明的一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移将编码表II第5列或第7列中所示GABA相关蛋白的核酸分子转染进植物中。农杆菌介导的植物转化可使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell,1986,Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株来进行。转化可通过标准转化和再生技术来进行(Deblaere等,1994,Nucl.Acids Res.13:4777-4788；Gelvin,Stanton B.和Schilperoort,Robert A,Plant Molecular Biology Manual,第二版-Dordrecht:KluwerAcademic Publ.,1995.–在Sect,Ringbuc Zentrale Signatur:BT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick,Bernard R.；Thompson,John E.,Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,Boca Raton:CRC Press,1993360S.,ISBN 0-8493-5164-2)。例如，可通过子叶或下胚轴转化来转化油菜籽(Moloney等,1989,Plant cell Report 8:238-242；De Block等,1989,PlantPhysiol.91:694-701)。用于农杆菌和植物选择的抗生素的使用取决于用于转化的双元载体和农杆菌菌株。一般使用卡那霉素作为植物选择标记来进行油菜籽的选择。可使用如Mlynarova等,1994,Plant Cell Report13:282-285所述技术通过农杆菌介导基因转移进亚麻中。此外，可以使用如欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770所述的技术来转化大豆。可通过微粒轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或通过碳化硅纤维技术来实现玉米转化(参阅如Freeling和Walbot“The maize handbook”SpringerVerlag:New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。玉米转化的具体实例可见于美国专利号5,990,387，小麦转化的具体实例可见于PCT申请号WO93/07256。
根据本发明，如果整合进非染色体自主复制子或整合进植物染色体或细胞器基因组中，则所引入的编码表II第5列或第7列所示GABA相关蛋白的核酸分子可在植物细胞中稳定维持。或者，所引入的编码GABA相关蛋白的基因可存在于染色体外的非复制型载体中，并瞬时表达或具有瞬时活性。
在一个实施方案中，可以产生其中编码GABA相关蛋白的基因已整合进染色体中的异源重组微生物，制备载体，其含有编码表II第5列或第7列所示GABA相关蛋白的核酸分子的至少一部分，其中引入了缺失、添加或替换，以改变(例如功能性破坏)GABA相关蛋白基因。优选的，编码GABA相关蛋白的基因是酵母或大肠杆菌或小立碗藓(Physcomitrella patens)或集胞蓝细菌属或嗜热栖热菌或甘蓝型油菜的基因，但也可以是来自相关生物体或植物，甚至是来自哺乳动物或昆虫来源的同源物。载体可设计成使得在同源重组时编码表II第5列或第7列所示GABA相关蛋白的内源核酸分子被突变或以其他方式改变，但仍编码功能性多肽(例如，可以改变上游调节区，从而改变内源GABA相关蛋白的表达)。在一个优选的实施方案中，本发明蛋白质的生物活性在同源重组后提高。为了通过同源重组产生点突变，可以在称为嵌合修复术(chimeraplasty)的技术中使用DNA-RNA杂交体(Cole-Strauss等,1999,Nucleic acidsResearch 27(5):1323-1330和Kmiec,1999Gene therapy American Scientist.87(3):240-247)。展叶剑叶藓(Physcomitrella paten)中的同源重组操作也是本领域技术人员所熟知的，并考虑用于本文中。
而在同源重组载体中，编码表II第5列或第7列中所示GABA相关蛋白的核酸分子中改变的部分在其5’和3’末端的侧翼为额外的GABA相关蛋白基因核酸分子，以允许在该载体所携带的外源GABA相关蛋白基因与微生物或植物中的内源编码GABA相关蛋白的基因之间发生同源重组。所述额外的侧翼编码GABA相关蛋白的核酸分子为足以与内源基因发生成功的同源重组的长度。载体中一般包含数百个碱基对至数千碱基对的侧翼DNA(5’和3’端都是如此)。对同源重组载体的描述参阅如Thomas,K.R.,和Capecchi,M.R.,1987,Cell 51:503，或者对展叶剑叶藓中基于cDNA的重组参阅Strepp等,1998,PNAS,95(8):4368-4373。将该载体引入微生物或植物细胞中(例如通过聚乙二醇介导的DNA)，并使用本领域已知的技术选择所引入GABA相关蛋白编码基因已与内源GABA相关蛋白编码基因发生同源重组的细胞。
无论是存在于染色体外非复制型载体中还是存在于整合进染色体的载体中，编码表II第5列或第7列中所示GABA相关蛋白的核酸分子均优选存在于植物表达盒中。植物表达盒优选地含有调节序列，所述调节序列能在植物细胞中驱动与其有效连接的基因表达，以使每个序列可发挥其功能，例如通过聚腺苷酸化信号来终止转录。优选的多腺苷酸化信号是来源于根癌农杆菌t-DNA(例如Ti质粒pTiACH5中称为章鱼碱合酶的基因3)的那些(Gielen等,1984,EMBO J.3:835)或其功能等同物，但在植物中具有功能活性的所有其他终止子也是合适的。由于植物基因表达经常不仅受限于转录水平，因此植物表达盒优选含有其他有效连接的序列，如翻译增强子，如含有提高多肽/RNA比值的烟草花叶病毒5’非翻译前导序列的超驱动序列(Gallie等,1987,Nucl.Acids Research 15:8693-8711)。植物表达载体的实例包括Becker,D.等,1992,New plant binary vectorswith selectable markers located proximal to the left border,Plant Mol.Biol.20:1195-1197；和Bevan,M.W.,1984,Binary Agrobacterium vectors forplant transformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；和Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；in:Transgenic Plants,第1卷,Engineering andUtilization,编辑:Kung和R.Wu,Academic Press,1993,S.15-38中详细描述的那些。
“转化”在本文中定义为将异源DNA引入植物细胞、植物组织或植物的方法。这可在天然或人工条件下使用本领域熟知的多种方法来进行。转化可依赖于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞的任何已知方法。基于所转化的宿主细胞来选择方法，包括但不仅限于病毒感染、电穿孔、脂转染和微粒轰击。这些“转化”细胞包括稳定转化的细胞，其中所插入的DNA能作为自主复制质粒复制，或作为宿主染色体的一部分复制。它们包括在有限的时间内瞬时表达所插入DNA或RNA的细胞。转化的植物细胞、植物组织或植物应理解为不仅包括转化方法的终产物，而且还包括其转基因后代。
术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”指已引入异源核酸分子的宿主生物，例如细菌或植物。所述核酸分子可稳定整合进宿主的基因组中，或者该核酸分子也可作为染色体外的分子存在。这样的染色体外分子可以自主复制。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅包括转化方法的终产物，而且还包括其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。
本文使用的“转基因植物”指含有插入其核基因组或细胞器基因组的外源核苷酸序列的植物。其还包括后代，例如T1、T2和后续世代，或者BC1、BC2和后续世代，及其与非转基因植物或其他转基因植物的杂种。
宿主生物(＝转基因生物)有利地含有至少一个拷贝的本发明核酸和/或本发明的核酸构建体。
原则上，所有植物均可用作宿主生物。优选的转基因植物为例如选自以下科：槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacadiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)并优选来源于选自槭树科、漆树科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科植物。优选作物植物，如有利地选自如下属的植物：花生、欧洲油菜、卡诺拉油菜、向日葵属、红花、橄榄(olive)、芝麻(sesame)、榛子(hazelnut)、扁桃(almond)、鳄梨(avocado)、月桂(bay)、南瓜(pumpkin/squash)、胡麻、大豆(soya)、阿月混子(pistachio)、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱(sorghum)和粟(millet)、黑小麦、稻、大麦、木薯(cassava)、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿和多年生草本和饲用植物、油棕榈、蔬菜(芸苔属植物、根用蔬菜、块茎类蔬菜、荚果蔬菜、果类蔬菜、葱蒜类蔬菜、叶用蔬菜和茎用蔬菜)、荞麦(buckwheat)、菊芋(Jerusalem artichoke)、蚕豆(broad bean)、野豌豆(vetches)、小扁豆(lentil)、四季豆(dwarf bean)、羽扇豆、三叶草和紫花苜蓿，此处仅提到它们中的某些。
在本发明的一个实施方案中，转基因植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
在一个优选的实施方案中，宿主植物选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、Carifolaceae、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科并优选来源于选自槭树科、漆树科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科植物。优选作物植物并且特别是本文中以上提到的植物作为宿主植物，如以上提到的科和属，例如优选的物种是腰果(Anacardium occidentale)、金盏花(Calendula officinalis)、红花(Carthamustinctorius)、菊芋(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynara scolymus)、向日葵(Helianthus annus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)、细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)；胡萝卜(Daucus carota)；欧洲榛(Corylusavellana)、土耳其榛(Corylus colurna)、琉璃苣(Borago officinalis)；欧洲油菜、芜青(Brassica rapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassicajuncea)、芥菜原变种(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassicajuncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra、Brassica sinapioides、Melanosinapis communis)、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥菜、凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜(Carica papaya)、大麻(Cannabis sative)、甘薯(lpomoea batatus)、提琴叶牵牛花(lpomoea pandurata)、Convolvulusbatatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(lpomoea triloba)、Convolvulus panduratus、甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜(原变种)(Beta vulgaris var.vulgaris)、沿海甜菜(Beta maritima)、Beta vulgaris var.perennis、Betavulgaris var.conditiva、Beta vulgaris var.esculenta、笋瓜(Cucurbitamixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、油橄榄(Oleaeuropaea)、木薯(Manihot utilissima)、Janipha Manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinus communis)、豌豆(Pisumsativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicagovaria)、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida、Soja max、椰子(Cocos nucifera)、茶簏子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、Oleum cocoas、月桂(Laurus nobilis)、鳄梨(Persea americana)、花生(Arachis hypogaea)、亚麻(linumusitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linumbienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinumgrandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linum trigynum、石榴(Punica granatum)、陆地棉Gossypium hirsutum、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypiumthurberi)、香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉(Musa spp.)、油棕(Elaeis guineensis)、东方罂粟(Papaverorientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、Papaver dubium、胡麻(Sesamumindicum)、树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piperangustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜菝(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piperelongatum、Steffensia elongata、大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon.、Hordeumhexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦(原变种)(Avena fatua var.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghumhalepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghumdrummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcus halepensis)、黍(Sorghummiliaceum)(谷子(millet))、稷(Panicum militaceum)、玉米、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)、咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)、大果咖啡(Coffealiberica)、辣椒(Capsicum annuum)、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒(Capsicum frutescens)、辣椒(Capsicum annuum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄(Solanummelongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersiconlycopersicum.)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanumintegrifolium)、番茄(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或大叶茶(Camellia sinensis)。
漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如物种阿月混子(Pistacia vera)[pistachios、Pistazie]、芒果(Mangifer indica)[Mango]或腰果(Anacardium occidentale)[Cashew]；菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如物种金盏花[Marigold]、红花[safflower]、矢车菊(Centaurea cyanus)[cornflower]、菊苣(Cichorium intybus)[blue daisy]、洋蓟[Artichoke]、向日葵[sunflower]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、Lactuca esculenta、Lactuca scariola L.ssp.sativa、Lactuca scariola L.var.integrata、Lactucascariola L.var.integrifolia、Lactuca sativa subsp.romana、Locustacommunis、莴苣缬草(Valeriana locusta)[lettuce]、香叶万寿菊、万寿菊或细叶万寿菊[Marigold]；伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如物种胡萝卜[carrot]；桦木科(Betulaceae)如榛属(Corylus)例如物种欧洲榛或土耳其榛[hazelnut]；紫草科(Boraginaceae)如琉璃苣属(Borage)例如物种琉璃苣[borage]；十字花科如芸苔属、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥菜属例如物种欧洲油菜、芜青[卡诺拉油菜、欧洲油菜、甘蓝型油菜]、野欧白芥、芥菜、芥菜(原变种)、皱叶芥菜、大叶芥菜、黑芥、黑芥(Brassicasinapioides)、黑芥(Melanosinapis communis)[mustard]、甘蓝[fodder beet]或拟南芥菜；凤梨科如the genera凤梨属(Anana)、Bromelia例如物种凤梨、Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科如番木瓜属例如物种番木瓜[papaya]；大麻科(Cannabaceae)如大麻属例如物种大麻[hemp]、旋花科(Convolvulaceae)如番薯属、旋花属例如物种甘薯、提琴叶牵牛花、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoeafastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯或Convolvulus panduratus[sweetpotato、Man of the Earth、wild potato]、藜科(Chenopodiaceae)如甜菜属即物种甜菜、甜萝卜、甜菜(原变种)、沿海甜菜、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva或Beta vulgaris var.esculenta[sugar beet]；葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如物种笋瓜、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦或南瓜[pumpkin、squash]；胡颓子科(Elaeagnaceae)如胡颓子属例如物种油橄榄[olive]；杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如物种宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、窄叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmiamicrophylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistuschamaerhodendros或Kalmia lucida[American laurel、阔叶月桂、calicobush、spoon wood、sheep laurel、alpine laurel、bog laurel、westernbog-laurel、swamp-laurel]；大戟科如木薯属、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)例如物种木薯、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、Manihot esculenta[Manihot、arrowroot、tapioca、cassava]或蓖麻[castorbean、Castor Oil Bush、Castor Oil plant、Palma Christi、Wonder Tree]；豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja例如物种豌豆、饲料豌豆、早生矮豌豆[pea]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、大叶合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormionberteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrdajulibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleealebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[bastard logwood、silk tree、East Indian Walnut]、紫花苜蓿、野苜蓿、杂交苜蓿[苜蓿]、大豆、Dolichossoja、宽叶蔓豆、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida或Sojamax[大豆]；牛儿苗科如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如物种椰子、茶簏子天竺葵或Oleum cocois[椰子]；禾本科如甘蔗属例如物种甘蔗(Saccharum officinarum)；核桃科(Juglandaceae)如核桃属、Wallia例如物种核桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃Juglanssieboldiana、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglansintermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglansmicrocarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[胡桃、黑胡桃、commonwalnut、Persian walnut、白胡桃、灰胡桃、黑胡桃]；樟科如鳄梨属、月桂属例如物种月桂[bay、laurel、bay laurel、sweet bay]、鳄梨、鳄梨(Perseagratissima)或鳄梨(Persea persea)[avocado]；豆科如落花生属(Arachis)例如物种花生[peanut]；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)、Adenolinum例如物种亚麻(linum usitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linumaustriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linumcatharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linumnarbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perennevar.lewisii)、linum pratense、linum trigynum[亚麻属、胡麻]；Lythrarieae如石榴属(Punica)例如物种石榴[pomegranate]；锦葵科如棉花属(Gossypium)例如物种陆地棉、树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉(Gossypiumthurberi)[棉花]；芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如物种香蕉、小果野蕉、大蕉、芭蕉[banana]；柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia、月见草属(Oenothera)例如物种月见草(Oenothera biennis)或Camissoniabrevipes[primose、evening primose]；棕榈科如油棕属(Elacis)例如物种油棕榈(Elaeis guineensis)[oil plam]；罂粟科如罂粟属(Papaver)例如物种东方罂粟、虞美人、长果罂粟(Papaver dubium)[poppy、oriental poppy、cornpoppy、field poppy、shirley poppies、field poppy、long-headed poppy、long-pod poppy]；胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属例如物种胡麻[sesame]；胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如物种树胡椒、Piper amalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎叶、毕澄茄、荜菝、胡椒、假荜菝、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[Cayennepepper、wild pepper]；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属、小麦属(Triticum)例如物种大麦、芒颖大麦草、鼠大麦、黑麦状大麦草、栽培二棱大麦、三叉大麦、栽培六棱大麦、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草[barley、pearl barley、foxtail barley、wall barley、meadow barley]、黑麦(Secale cereale)[rye]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、野燕麦(原变种)、杂种野燕麦、双色高粱、石茅高粱(Sorghumhalepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱、垂穗高粱草、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草、Sorghumguineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草、甜高粱、Sorghumsubglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱、石茅高粱(Holcushalepensis)、黍(Sorghum miliaceum millet)、稷(Panicummilitaceum)[Sorghum、millet]、稻、玉米[corn、maize]、普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybernum、马卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[wheat、breadwheat、common wheat]、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果黍(Macadamia)例如物种澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；茜草科如咖啡属例如物种咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[coffee]；玄参科如毛蕊花属(Verbascum)例如物种毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascum chaixii)、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum longifolium、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、Verbascum phlomoides、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascumthapsus)[mullein、white moth mullein、nettle-leaved mullein、密花毛蕊花(dense-flowered mullein)、silver mullein、长叶毛蕊花、white mullein、darkmullein、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫花毛蕊花(purple mullein)、hoary mullein、great mullein]；茄科如辣椒属、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如物种辣椒、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒[辣椒]、辣椒[红辣椒(paprika)]、烟草、花烟草(Nicotiana alata)、Nicotiana attenuate、光烟草(Nicotiana glauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]、马铃薯[potato]、茄[egg-plant]、番茄、番茄、梨形番茄、红茄或番茄[番茄]；梧桐科(Ste rculiaceae)如可可属例如物种可可树[可可]；山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如物种茶(Camelliasinensis)[茶]。
原则上，可通过本领域技术人员已知的所有方法向生物(如植物)中引入本发明的核酸、表达盒或载体。核酸序列的引入产生了重组生物或转基因生物。
除非另外指明，否则术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用。除非另外指明，否则术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于使用术语“序列”的上下文。本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语仅涉及分子的一级结构。
因此，本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链的DNA和RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、将一个或多个天然核苷酸替换为类似物。优选地，本发明的DNA或RNA序列包含编码本文所述多肽的编码序列。
“编码序列”是核苷酸序列，其在置于适当调节序列控制之下时转录成mRNA和/或翻译成多肽。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不仅限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，在某些情况下也可存在内含子。
将外源基因转移进植物基因组中称为转化。为此，使用就转化植物组织或植物细胞并再生植物方面描述的方法进行瞬时或稳定转化。合适的方法是通过聚乙二醇诱导的DNA摄取进行的原生质体转化、使用基因枪进行的“生物射弹”法(称为微粒轰击法)电穿孔、干胚在DNA溶液中温育、显微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,in:Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)。优选将待表达的核酸或构建体克隆进适用于转化根癌农杆菌的载体(例如pBin19)中(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。转化有这些载体的农杆菌接着可以已知方式用于转化植物，特别是作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤或剪断的叶浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养它们。通过根癌农杆菌进行的植物转化描述于例如和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16,9877，或者可从F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,AcademicPress,1993,第15-38页等中获知。
通过本发明表达载体转化的农杆菌可类似地以已知方式(例如将擦伤或剪断的叶浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养它们)用于转化植物，例如实验植物如拟南芥，或者作物植物如谷类作物、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、红辣椒、油菜、树薯、木薯、竹芋、万寿菊、苜蓿、莴苣和多种树木、坚果和藤本物种，特别是含油作物植物，例如大豆、花生、蓖麻植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、油棕榈、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆。
可以通过本领域技术人员已知的所有方法产生经遗传修饰的植物细胞。合适的方法可见于上文提到的S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或和Willmitzer的出版物。
因此，本发明的另一方面涉及以至少一种本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的转基因生物，以及来自这些生物的细胞、细胞培养物、组织、部分(例如对于植物生物的情况为叶、根等)或繁殖材料。术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物”和“转基因(宿主)细胞”可互换使用。当然，这些术语不仅涉及特定的宿主生物或具体的靶细胞，而且还涉及这些生物或细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境效应，可以在后续世代中产生某些改变，因此这些后代不一定与亲本细胞相同，但仍包括在本文使用的该术语中。
就本发明目的而言，“转基因”或“重组”指例如含有本发明核酸序列的核酸序列、表达盒(＝基因构建体、核酸构建体)或载体，或者以本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有通过遗传工程方法产生的构建体，其中
a)表I第5列或第7列中所示核酸序列或其衍生物或部分；或
b)与(a)所述核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如3’和/或5’遗传控制序列，例如启动子或终止子，或
c)(a)和(b)
不在其天然遗传环境中，或者已通过重组方法进行了修饰，所述修饰可以是例如替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境指来源生物或宿主生物中的天然基因组或染色体基因座或者在基因组文库中存在。对于基因组文库的情况，核酸序列的天然遗传环境优选至少在一定程度上保留。该环境在核酸序列的至少一侧，并且序列长度为至少50bp，优选至少500bp，更优选至少1000bp，最优选至少5000bp。天然表达盒(例如本发明核酸序列的天然启动子与相应δ-8-去饱和酶、δ-9-延伸酶和/或δ-5-去饱和酶基因的天然组合)在所述基因经非天然合成(“人工”)方法(例如诱变)修饰时成为转基因表达盒。已经描述了这样的方法，例如US 5,565,350或WO 00/15815。
用于本发明核酸、表达盒或载体的合适的生物或宿主生物有利地为基本上所有适于表达上述重组基因的生物。可以提到的其他实例为植物，例如拟南芥，紫菀科例如金盏花，或者作物植物如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、亚麻、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、油棕榈、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明核酸、表达盒或载体的宿主植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
本发明的另一目的涉及核酸构建体(例如表达盒)用于转化植物细胞、组织或植物部分的用途，所述核酸构建体含有编码表II中所示多肽的DNA序列或者与其杂交的DNA序列。
为此，取决于启动子的选择，可以在叶、种子、根瘤、根、茎或其他植物部分中特异性表达表I所示序列。这些过量产生表I所示序列的转基因植物、其繁殖材料及其植物细胞、组织或部分是本发明的另一目的。
此外，含有根据表I的序列的本发明表达盒或核酸序列或构建体还可用于转化例如上文提到的生物，例如细菌、酵母、丝状真菌和植物。
在本发明框架内，提高的GABA含量表示，例如在至少一代植物的时间内，通过与未经遗传修饰的原始植物相比，人工获得的提高的GABA含量、浓度、活性，其归因于在本发明生物(有利地在本发明的转基因植物)中对例如由表I第5列或第7列中所示相应核酸分子和/或同源物编码的表II的多肽序列的功能性过表达。
此外，组成型表达由表I第5列或第7列中所示相应核酸分子和/或同源物编码的表II多肽序列是有利的。然而，另一方面，也可能期望诱导型表达。本发明多肽序列的表达可导向宿主细胞(优选植物细胞)的胞质或细胞器，优选质体。
可通过如嫩枝分生组织繁殖来测定由表I第5列或第7列中所示相应核酸分子和/或同源物编码的表II序列的表达效率。此外，可在温室试验中对测试植物测试在性质和水平上发生了改变的由表I第5列或第7列中所示核酸分子和/或同源物编码的表II序列的表达及其对代谢途径性能的影响。
本发明的另一目的包括转化有包含根据本发明的表I第5列或第7列中所示序列或与其杂交之DNA序列的表达盒的转基因生物，例如转基因植物，以及这些植物的转基因细胞、组织、部分和繁殖材料。这种情况下特别优选转基因作物植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、稻、棉花、甜菜、油菜和芸苔、向日葵、亚麻、大麻、大蓟、马铃薯、烟草、番茄、树薯、木薯、竹芋、苜蓿、莴苣以及多种树木、坚果和藤本物种。
在本发明的一个实施方案中，转化有含有根据本发明的表I第5列或第7列中所示序列或与其杂交之DNA序列的表达盒的转基因植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
就本发明的目的而言，植物是单子叶植物和双子叶植物、藓类或藻类。
本发明的另一对象是如上述的转基因植物，其含有本发明的核酸序列或构建体或者本发明的表达盒。
然而，转基因也指本发明的核酸位于其在生物基因组中的天然位置，但该序列与天然序列相比进行了修饰和/或天然序列的调节序列进行了修饰。优选地，转基因/重组应理解为指本发明的并且显示于表I中的核酸的转录存在于基因组中非天然的位置，也就是说，该核酸的表达是同源的，或者优选是异源的。这种表达可以是瞬时的，或者是稳定整合进基因组的序列的表达。
本发明使用的术语“转基因植物”还指转基因植物的后代，例如T1、T2、T3和后续的植物世代或者BC1、BC2、BC3和后续的植物世代。因此，可以产生本发明的转基因植物，并且自交或者与其他个体杂交，以获得其他本发明的转基因植物。还可通过无性繁殖转基因植物细胞来获得转基因植物。本发明还涉及来自于本发明转基因植物群的转基因植物材料。这些材料包括植物细胞和某些组织、器官和植物部分的所有表现形式，例如种子、叶、花药、纤维、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物，它们来自于实际的转基因植物和/或可用于产生转基因植物。
根据本发明获得的任何转化植物可用于常规育种方案或体外植物繁殖，以产生更多具有相同特征的转化植物和/或可用于将同一特征引入相同或相关物种的其他变种中。这些植物也可以是本发明的一部分。得自转化植物的种子一般也含有相同的特征，并且也是本发明的一部分。如上文所述，本发明基本上可用于可以本领域技术人员已知的任何转化方法进行转化的任何植物和作物。
有利的诱导型植物启动子为例如PRP1启动子[Ward等,Plant.Mol.Biol.22(1993),361-366]、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 388186)、四环素诱导型启动子[Gatz等,(1992)Plant J.2,397-404]、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、脱落酸诱导型启动子(EP 335528)或乙醇或环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)。可以有利地使用的植物启动子的其他实例为来自马铃薯的胞质溶胶FBPase启动子、来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等,EMBO J.8(1989)2445-245)、来自大豆的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(还参阅gene bank登记号U87999)或)EP 249 676所述的nodiene特异性启动子。特别有利的是在环境胁迫，例如干旱或寒冷早期开始后保证表达的那些启动子。
在一个实施方案中，种子特异性启动子可用于单子叶或双子叶植物。
原则上，所有带有其调节序列的天然启动子均可使用，例如上文针对本发明表达盒和本发明方法所描述的那些。除此以外，还可以有利地使用合成启动子。
在表达盒的制备中，可以操作多种DNA片段以获得核苷酸序列，其有用地以正确方向阅读并带有正确的读码框。为了将DNA片段(＝本发明核酸)彼此连接，可在片段上附着调节元件或衔接头或接头。
启动子和终止子区可以有用地在转录方向上带有接头或多聚接头，其包含用于插入此序列中的一个或多个限制性位点。接头一般含有1至10个、常为1至8个、优选2至6个限制酶位点。一般而言，调节区中的接头的大小小于100bp，经常小于60bp，但至少为5bp。启动子可以与宿主生物(例如宿主植物)是天然或同源的，是外源或异源的也可。在5’-3’转录方向上，表达盒含有启动子、表I所示DNA序列以及用于终止转录的区域。不同的终止区可以任何期望的方式彼此交换。
本文使用的术语“核酸”和“核酸分子”旨在包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该术语还包括位于基因编码区3’和5’末端的非翻译序列——基因编码区5’末端上游至少约1000个核苷酸的序列以及编码区3’末端下游至少约200个核苷酸的序列。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选双链DNA。
“分离的”核酸分子是与该核酸天然来源中存在的其他核酸分子基本分开的核酸分子。这意味着，所存在的其他核酸分子为所需核酸重量的少于5％，优选少于2％重量，更优选少于1％重量，最优选少于0.5％重量。优选地，“分离的”核酸不含该核酸来源生物的基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的一些序列(即位于该核酸5’和5’末端的序列)。例如，在多个实施方案中，分离的胁迫相关蛋白的编码核酸分子可含有该核酸来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。此外，“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)可不含与其天然相关的其他细胞材料，或者在通过重组技术产生的情况下不含培养基，或者在化学合成的情况下不含化学前体或其他化学物质。
可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息来分离本发明的核酸分子，例如编码GABA相关蛋白或其部分的核酸分子，其在植物中赋予对环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。例如，可以使用表I所示序列之一的全部或部分，从拟南芥cDNA文库中分离拟南芥胁迫相关蛋白的编码cDNA，或者从集胞藻、欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的cDNA文库中分别分离集胞藻、欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的胁迫相关蛋白的编码cDNA。此外，可以使用基于表I序列设计的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离包含表I序列的全部或部分的核酸分子。例如，可以从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等,Biochemistry 18,5294(1979)的硫氰酸胍提取法)，并可使用逆转录酶(例如Moloney MLV逆转录酶，可得自Gibco/BRL,Bethesda,MD；或者AMV逆转录酶，可得自Seikagaku America,Inc.,St.Petersburg,FL)制备cDNA。可以基于表I所示核苷酸序列之一设计用于聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物。可以使用cDNA或基因组DNA作为模板，并使用适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可克隆进适当的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，可以通过标准合成技术(如使用自动化DNA合成仪)来制备对应于GABA相关蛋白编码核苷酸序列的寡核苷酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含编码GABA相关蛋白的表I所示核苷酸序列之一(即“编码区”)以及5’非翻译序列和3’非翻译序列。
此外，本发明的核酸分子可仅包含表I核酸序列之一的编码区的一部分，例如可用作探针或引物的片段或者编码GABA相关蛋白的生物活性部分的片段。
本发明GABA相关蛋白编码核酸分子编码的蛋白质的部分优选是此处描述的生物学活性部分。本文所用的术语GABA相关蛋白的“生物活性部分”旨在包括部分，例如GABA相关蛋白质的结构域/基序，其在植物中参与GABA增加，优选参与增加的营养利用效率或胁迫耐受性和/或抗性应答。为了测定GABA相关蛋白或其生物学活性部分是否在植物中产生GABA增加，优选增加的胁迫耐受性或增加的营养利用效率，可进行包含所述GABA相关蛋白的植物的代谢物分析。此类分析方法为本领域技术人员所熟知，如在实施例中详细描述。更具体地，可以如下制备编码GABA相关蛋白之生物活性部分的核酸片段：分离表I核酸序列之一的一部分，表达所编码的GABA相关蛋白或肽的部分(例如通过体外重组表达)，以及评估所编码的GABA相关蛋白或肽的部分的活性。
GABA相关蛋白的生物活性部分包括在本发明之中，并包括含有来自GABA相关蛋白编码基因之氨基酸序列的氨基酸序列或者与GABA相关蛋白同源之蛋白质的氨基酸序列的肽，其包含比全长GABA相关蛋白或与GABA相关蛋白同源的全长蛋白更少的氨基酸，并显示GABA相关蛋白的至少某种酶活性或生物活性。一般地，生物活性部分(例如长度为5,10,15,20,30,35,36,37,38,39,40,50,100或更多个氨基酸的肽)包含具有至少一种GABA相关蛋白活性的结构域或基序。此外，可以通过重组技术制备缺失了该蛋白质中另一些部分的其他生物活性部分，并评估本文所述的一种或多种活性。优选地，GABA相关蛋白的生物活性部分包括其具有生物活性的一种或多种选定的结构域/基序或其部分。
术语“生物活性部分”或“生物活性”指表II第3列所示多肽，或者所述多肽中仍具有该天然或起始酶或蛋白之酶活性或生物活性的至少10％或20％，优选30％、40％、或50％，特别优选60％、70％或80％的部分。
在本发明的方法中，可以使用适当时含有可掺入DNA或RNA中的合成、非天然或修饰核苷酸碱基的核酸序列。例如，所述合成、非天然或修饰碱基可提高该核酸分子在细胞外或细胞内的稳定性。本发明的核酸分子可含有与上述相同的修饰。
本文使用的术语“核酸分子”还可包含位于基因编码区3’和5’末端的非翻译序列，例如编码区5’末端上游至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸的序列，以及基因编码区3’下游至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸的序列。仅选择编码区用于克隆和表达目的经常是有利的。
[优选地，用于本发明方法的核酸分子或本发明的核酸分子是分离的核酸分子。
“分离的”多核苷酸或核酸分子与该核酸分子天然来源中所存在的其他多核苷酸或核酸分子分开。分离的核酸分子可以是若干kb的染色体片段，或者优选是仅包含基因编码区的分子。因此，本发明的分离的核酸分子可包含5’和3’的相邻染色体区或其他相邻染色体区，但优选不包含该核酸来源生物的基因组或染色体环境中天然位于该核酸分子序列侧翼的这些序列(例如编码该核酸分子5’和3’UTR的区域附近的序列)。例如，在多个实施方案中，用于本发明方法的分离的核酸分子可以包含该核酸分子来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。
用于本方法的核酸分子(例如本发明的多核苷酸或其部分)可使用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息来分离。还可以例如借助于比较算法来鉴定在DNA或氨基酸水平上的同源序列或同源保守序列区。前者可在标准杂交技术中用作杂交探针(例如Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual.第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989所述)，用于分离可用于该方法的其他核酸序列。
还可以通过聚合酶链式反应分离包含本方法所用核酸分子(例如本发明的多核苷酸)的完整序列或其部分的核酸分子，其中使用基于该序列或其部分的寡核苷酸引物。例如，可以使用基于该特定序列产生的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离包含完整序列或其部分的核酸分子。例如，可以从细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等(1979)Biochemistry 18:5294-5299所述的硫氰酸胍提取法)，并可通过逆转录酶(例如Moloney MLV逆转录酶，可得自Gibco/BRL,Bethesda,MD,或者AMV逆转录酶，可得自Seikagaku America,Inc.,St.Petersburg,FL)产生cDNA。
用于通过聚合酶链式反应进行扩增的合成寡核苷酸引物(例如表III第7列中所示)可基于本文所示序列产生，例如基于表I第5列和第7列中所示序列或者衍生自表II第5列和第7列的序列。
此外，可以通过与本发明核酸分子所编码多肽(特别是与表I第5列或第7列中所示核酸分子所编码的序列)进行蛋白质序列比对来鉴定保守蛋白基序或结构域，由此可以产生保守区并进而产生简并引物。
保守区是在来自不同来源的若干同源物中一个特定位置上的氨基酸极少显示变异的区域。表IV第7列中所示共有的序列和多肽基序来自于所述比对。此外，可以通过与本发明核酸所编码的多肽(特别是与表II第5列或第7列中所示多肽分子所编码的序列)进行蛋白质序列比对来从多种生物中鉴定保守区，由此可以产生保守区并进而产生简并引物。
在一个有利的实施方案中，在本发明方法中提高了多肽的活性，所述多肽包含表IV申请1第7列中所示共有序列或多肽基序或者由其组成，在另一实施方案中，本发明涉及多肽，其包含表IV申请1第7列中所示共有序列或多肽基序或者由其组成，其中所标明氨基酸位置中20或更少，优选15或10，优选9、8、7或6，更优选5或4，甚至更优选3，甚至更优选2，甚至更优选1，最优选0个可被任何氨基酸替换。在一个实施方案中，以一字母标出的氨基酸位置中的不高于15％，优选10％，甚至更优选5％、4％、3％或2％，最优选1％或0％被另一氨基酸替换。在一个实施方案中，共有序列或蛋白质基序中插入了不高于15％，优选10％，甚至更优选5％、4％、3％或2％，最优选1％或0％个氨基酸。
共有序列来自于表II中所列序列的多重比对。字母代表单字母氨基酸代码并且指出氨基酸在至少80％的比对蛋白质中是保守的，而字母X代表氨基酸，其在至少80％的序列中不是保守的。共有序列从比对中第一个保守的氨基酸开始，到所研究的序列的比对中最后一个保守的氨基酸结束。给定的X数字指出保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21,23)-F表示比对中保守的酪氨酸和苯丙氨酸残基在所有研究的序列的比对中通过最少21最多23个氨基酸残基彼此隔开。
保守结构域从所有序列中鉴定，并且使用标准Prosite记法的子集描述，例如图谱Y-x(21,23)-[FW]表示保守的酪氨酸与苯丙氨酸或色氨酸通过最少21最多23个氨基酸残基隔开。图谱必须匹配至少80％的研究蛋白质。
保守性图谱使用软件工具MEME3.5.1版鉴定，或者人工鉴定。MEME由美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校计算机科学与工程学院的Timothy L.Bailey和Charles Elkan开发，并由Timothy L.Bailey和Charles Elkan描述(Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs inbiopolymers,Proceedings of the Second International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology,28-36页,AAAI Press,MenloPark,California,1994)。公众可在圣地亚哥超级计算机中心(http://meme.sdsc.edu)获得该独立程序的源代码。
为了使用软件工具MEME鉴定所有序列中的共有基序，使用以下设置：-maxsize 500000,-nmotifs 15,-evt 0.001,-maxw 60,-distance 1e-3,-minsites分析中所用的序列数。MEME的输入序列是Fasta格式的非比对序列。其他参数可以本版软件中的默认设置使用。
保守性结构域的Prosite图谱使用软件工具Pratt 2.1版产生，或者人工产生。Pratt由挪威Bergen大学信息学院的Inge Jonassen开发，并由Jonassen等描述(I.Jonassen,J.F.Collins和D.G.Higgins,Finding flexiblepatterns in unaligned protein sequences,Protein Science 4(1995),1587-1595页；I.Jonassen,Efficient discovery of conserved patterns using apattern graph,Submitted to CABIOS Febr.1997]。该独立程序的源代码(ANSI C)是公众可获得的，例如在已建立的生物信息学中心如EBI(欧洲生物信息学研究所)。
为了使用软件工具Pratt产生图谱，使用以下设置：PL(最大Pattern长度):100,PN(最大图谱标记数):100,PX(最大连续x数):30,FN(最大柔性间隔区数):5,FL(最高柔性):30,FP(最高柔性产物):10,ON(最大图谱数):50。Pratt的输入序列是由软件工具MEME鉴定的显示高度相似性的蛋白质序列的不同区域。必须与所产生图谱匹配的最小序列数(CM，最小匹配序列数)设置为所提供序列的至少80％。此处未提及的参数以其默认设置使用。
可以使用保守性结构域的Prosite图谱来检索与该图谱匹配的蛋白质序列。多个已建立的生物信息学中心提供在数据库检索中使用这些图谱的公众互联网入口(例如PIR(Protein Information Resource,位于乔治城大学医学中心)或ExPASy(Expert Protein Analysis System))。或者，有独立软件可以使用，如Fuzzpro程序，它是EMBOSS软件包的一部分。例如，Fuzzpro程序不仅允许检索准确的图谱-蛋白质匹配，还允许在所进行的检索中设置多种模糊度。
比对使用ClustalW软件(1.83版)进行，并描述于Thompson等[Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.(1994)CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting,positions-specific gap penalties and weightmatrix choice.Nucleic Acids Research,22:4673-4680]。公众可从德国海德堡的欧洲分子生物学实验室获得该独立程序的源代码。使用ClustalWv1.83的默认参数进行分析(缺口罚分:10.0；缺口延伸罚分:0.2；蛋白质矩阵:Gonnet；蛋白质/DNA endgap:-1；蛋白质/DNA gapdist:4)。
接着，这些片段可作为杂交探针用于分离完整基因序列。或者，可以通过RACE-PCR分离缺少的5’和3’序列。可以使用cDNA或基因组DNA作为模板，使用合适的引物，按照标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可克隆进合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。可以通过标准合成法(例如使用自动化DNA合成仪)产生对应于本方法所用核酸分子之一的寡核苷酸。
有利地用于本发明方法的核酸分子可基于其与本文所述核酸分子的同源性来分离，其中使用该序列或其部分作为杂交探针，并遵循标准杂交技术在严格杂交条件下进行。在这种情况下，可以使用例如在严格条件下与上述核酸分子杂交(特别是与这样的核酸分子杂交：其包含本发明方法所用核酸分子的核苷酸序列，或者编码本发明所用蛋白质的核苷酸序列，或者本发明核酸分子的核苷酸序列)的长度为至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸(优选至少15、20或25个核苷酸)的分离的核酸分子。还可以使用含有30、50、100、250或更多个核苷酸的核酸分子。
术语“同源性”指各个核酸分子或所编码的蛋白质在功能和/或结构上是等同的。例如，与上述核酸分子同源或者作为所述核酸分子之衍生物的核酸分子是所述核酸分子的变异，其中代表具有相同生物功能(特别是编码具有相同或基本相同的生物功能的蛋白质)的修饰。它们可以是天然的变异，例如来自其他植物变种或物种的序列，或者是突变。这些突变可天然发生，或者可通过诱变技术获得。等位基因变异可以天然的等位基因变异以及合成产生的或遗传工程产生的变体。例如，结构等同物可通过测试所述多肽与抗体的结合或者通过基于计算机的预测来鉴定。结构等同物具有相似的免疫学特征，例如包含相似的表位。
“杂交”指这些核酸分子在常规杂交条件下杂交，优选在严格条件下杂交，如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6所述。
根据本发明，可使用本发明核酸的DNA和RNA分子作为探针。此外，作为用于鉴定功能同源物的模板，可以进行Northern印迹测定和Southern印迹测定。Northern印迹测定有利地提供了关于所表达基因产物的进一步信息：例如表达谱、加工步骤(如剪接和加帽)的存在情况等。Southern印迹测定提供了关于编码本发明核酸分子之基因染色体定位和组织的进一步信息。
严格杂交条件的一个优选的非限制性实例为在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，然后在50至65℃(例如50℃、55℃或60℃)下在0.2×SSC、0.1％SDS中进行一次或多次洗涤步骤。本领域技术人员了解，这些杂交条件作为核酸类型的函数而变化，并且例如在存在有机溶剂时随温度和缓冲液浓度而变化。例如，“标准杂交条件”下的温度作为核酸类型的函数在0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4或5×SSC(pH 7.2)浓度的水性缓冲液中可为42℃至58℃不等，优选45℃和50℃。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度约为40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂交分子的杂交条件优选为0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选30℃至45℃。DNA:RNA杂交分子的杂交条件优选为例如0.1xSSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选45℃到55℃。上述杂交温度是在例如不存在甲酰胺的情况下对长度约100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸确定的。本领域技术人员了解借助于教科书来确定杂交条件，所述教科书为例如上文提到的那些，或者以下教科书：Sambrook等,”Molecular Cloning”,Cold Spring HarborLaboratory,1989；Hames和Higgins编辑1985,”NucleicAcids Hybridization:A Practical Approach”,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford；Brown编辑1991,”Essential Molecular Biology:A Practical Approach”,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。
一个这种严格杂交条件的另一实例是在65℃下在4×SSC中杂交，其后在65℃下以0.1×SSC洗涤1小时。或者，一个示例性严格杂交条件为50％甲酰胺、4×SSC，42℃。此外，洗涤步骤过程中的条件可以在划分为低严格条件(约2×SSC，50℃)至高严格条件(约0.2×SSC，50℃，优选65℃)的范围内选择(20×SSC：0.3M柠檬酸钠、3M NaCl，pH 7.0)。此外，洗涤步骤过程中的温度可从室温(约22℃)下的低严格条件提高至约65℃的高严格条件。盐浓度和温度这两个参数可同时改变，或者可将这两个参数之一保持恒定而改变另一个。杂交过程中还可以使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在下，杂交优选在42℃下进行。可在各个情况下组合相关的因素例如1)处理的长度、2)盐条件、3)洗涤剂条件、4)竞争DNA、5)温度和6)探针的选择，因此本文无法提及所有的可能性。
因此，在一个优选的实施方案中，在68℃下将Northern印迹在Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth,Karlsruhe)中预杂交2小时。与放射性标记探针的杂交在68℃进行过夜。其后在68℃下用1×SSC进行洗涤步骤。
对于Southern印迹测定，在68℃下将膜在Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth,Karlsruhe)中预杂交2小时。与放射性标记探针的杂交在68℃进行过夜。其后弃去杂交缓冲液，并用2×SSC、0.1％SDS短暂地洗涤滤器。弃去洗涤缓冲液后，加入新的2×SSC、0.1％SDS缓冲液并在68℃下孵育15分钟。将该洗涤步骤进行两次，其后在68℃下使用1×SSC、0.1％SDS进行10分钟的额外洗涤步骤。
用于DNA杂交(Southern印迹测定)和洗涤步骤的一些条件实例在下文给出：
(1)杂交条件可选自例如以下条件：
a)4×SSC，65℃,
b)6×SSC，45℃,
c)6×SSC,100mg/ml变性的片段化鱼精DNA，68℃,
d)6×SSC,0.5％SDS,100mg/ml变性的鲑精DNA，68℃,
e)6×SSC,0.5％SDS,100mg/ml变性的片段化鲑精DNA,50％甲酰胺，42℃,
f)50％甲酰胺,4×SSC，42℃,
g)50％(v/v)甲酰胺,0.1％牛血清白蛋白,0.1％Ficoll,0.1％聚乙烯吡咯烷酮,50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5,750mM NaCl,75mM柠檬酸钠，42℃,
h)2×或4×SSC，50℃(低严格条件),或
i)30到40％甲酰胺,2×或4×SSC，42℃(低严格条件)。
(2)洗涤步骤可选自例如以下条件：
a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃。
b)0.1×SSC，65℃。
c)0.1×SSC,0.5％SDS，68℃。
d)0.1×SSC,0.5％SDS,50％甲酰胺，42℃。
e)0.2×SSC,0.1％SDS，42℃。
f)2×SSC，65℃(低严格条件)。
其它DNA序列可编码具有上述活性，即与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量的多肽，所述其它DNA序列与表I第5列和第7列中所示序列在松弛条件下进行杂交并编码肽的表达，其与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量。
此外，一些应用必须在低严格杂交条件下进行，而对杂交特异性无任何影响。例如，可以用本发明核酸分子检测总DNA的Southern印迹分析，并低严格洗涤(55℃下，2×SSPE、0.1％SDS)。杂交分析可仅显示出编码本发明多肽或本发明方法所用多肽(即具有本文所述与相应的例如未转化的野生型相比提高对环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产的活性)的基因的简单图谱。这些低严格杂交条件的另一实例是4×SSC，50℃，或者在42℃下用30至40％甲酰胺进行杂交。这些分子包括这样的分子：其为本发明多肽或本发明方法所用多肽的片段、类似物或衍生物，其差异为氨基酸和/或核苷酸的缺失、插入、替换、添加和/或重组或者本领域技术人员已知的单独或组合地对上述氨基酸序列或其内在核苷酸序列的任何其他修饰。然而，优选使用高严格杂交条件。杂交应有利地以至少5、10、15、20、25、30、35或40bp的片段进行，有利地为至少50、60、70或80bp，优选至少90、100或110bp。最优选至少15、20、25或30bp的片段。还优选至少100bp或200bp、更特别优选至少400bp长度的杂交。在一个特别优选的实施方案中，杂交应以上述条件用整个核酸序列进行。
术语“片段”、“序列片段”或“序列部分”表示所指代原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)的长度可广泛变化，最小尺寸是这样的序列，其大小足以为序列提供与所指代原始序列至少相当的功能和/或活性，或者在严格杂交条件下与本发明核酸分子或本发明方法所用核酸分子杂交，而最大尺寸则不是关键性的。在一些应用中，最大尺寸一般不显著大于提供原始序列的期望活性和/或功能所需的大小。
截短的氨基酸序列的长度一般为约5至约310个氨基酸。然而，更一般地，序列长度最高将约为250个氨基酸，优选最高约200或100个氨基酸。经常期望选择至少约10、12或15个氨基酸上至最高约20或25个氨基酸的序列。
术语“表位”涉及抗原中的特异性免疫反应性位点，也称为抗原决定簇。这些表位可以是多聚组合物中单体(如蛋白质中的氨基酸)的线性排列，或者包含更复杂的二级结构或三级结构或者由其组成。本领域技术人员会认识到，免疫原(即能引发免疫应答的物质)是抗原，但一些抗原(如半抗原)则不是免疫原，而是可能通过与载体分子偶联而具有免疫原性。术语“抗原”包括提及可对针对其产生抗体和/或抗体对其具有特异免疫反应性的物质。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明多肽或用于本发明方法中的多肽的表位，并与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量。
术语“一个或多个氨基酸”指至少一个氨基酸，但不多于将导致同源性低于50％同一性的氨基酸数。优选地，同一性高于70％或80％，更优选85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选96％、97％、98％或99％的同一性。
此外，本发明的核酸分子包括作为上述核酸分子的核苷酸序列之一或其部分之互补序列的核酸分子。与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列之一互补的核酸分子是这样的核酸分子，其与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列之一充分互补，以使其能与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列之一杂交，从而形成稳定的双链体。优选地，所述杂交在严格条件下进行。然而，本文所述序列之一的互补序列优选是根据本领域技术人员熟知的核酸分子碱基配对与其互补的序列。例如，碱基A和G分别与碱基T以及U或C碱基配对，反之亦然。对碱基的修饰可能影响碱基配对的配偶体。
本发明的核酸分子包括这样的核苷酸序列，其与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列或其部分具有至少约30％、35％、40％或45％的同源性，优选至少约50％、55％、60％或65％，更优选至少约70％、80％或90％，甚至更优选至少约95％、97％、98％、99％或更高的同源性，并且优选地具有上述活性，特别是通过例如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而提高表I第3列中所示基因产物的活性后具有对环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高生物量生产的活性。
本发明的核酸分子包含这样的核苷酸序列，所述序列与表I的5列和7所示核苷酸序列之一或其部分杂交，优选是在本文定义的严格条件下杂交，并编码具有上述活性的蛋白质，例如相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量，通过例如在细胞质或在细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中的表达，并任选的，所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、因子停滞蛋白、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微粒体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白。
在本申请的上下文全文中，这样的核苷酸序列在质体中的表达是特别优选的，所述核苷酸序列包含表I的5列和7所示的核苷酸序列，或编码包含如表II的5或7列所示多肽序列的蛋白质，如果上述序列与ORF(栏3)显示在表I或II的相同的行中，关于所述序列表I、II、III或IV在“目标”栏显示“质体的”。
此外，本发明的核酸分子可以仅包含表I第5列和第7列中所示序列之一的一部分编码区，例如可用作探针或引物的片段或者编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的生物活性部分的片段，即具有上述活性，例如通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而赋予与相应未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。从本发明蛋白质编码基因的克隆中测定的核苷酸序列允许产生用于在其他细胞类型和生物中鉴定和/或克隆其同源物的探针和引物。所述探针/引物一般包含基本纯化的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列区域，其在严格条件下与(例如表I第5列和第7列中)所示序列之一的有义链、(例如表I第5列和第7列中)所示序列之一的反义链、或其天然存在的突变体的至少约12、15个、优选至少约20或25个、更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交。基于本发明核苷酸的引物可用于PCR反应中来克隆本发明多肽或本发明方法所用多肽的同源物，例如作为本发明实施例中所述的引物，例如实施例中所示。用表III第7列中所示引物进行的PCR将产生表II第3列中所示基因产物的片段。
引物组可互换。本领域技术人员了解组合所述引物来产生期望的产物，例如全长克隆或部分序列。基于本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子的探针可用于检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。探针还可包含其上附着的标记基团，例如所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这些探针可作为基因组标志物试剂盒的一部分，用于鉴定表达本发明多肽或本发明方法中所用多肽的细胞(例如通过测量细胞样品中编码核酸分子的水平(例如检测mRNA水平))，或者用于确定包含本发明多核苷酸序列或本发明方法中所用多核苷酸序列的基因组基因是否已突变或缺失。
本发明的核酸分子编码多肽或其部分，其包括与表II申请号1第5列和第7列中所示氨基酸序列充分同源的氨基酸序列，从而该蛋白质或其部分保持参与与相应例如未转化的野生型相比提高GABA含量，优选提高其他产量相关性状的能力，特别是在所述植物中提高上文所述活性或实施例中所述活性。
本文使用的术语“充分同源”指蛋白质或其部分，其具有这样的氨基酸序列，其包含最少数目的与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列相同或等同的氨基酸残基(例如与本发明多肽序列之一中的氨基酸残基具有相似侧链的氨基酸残基)，以使该蛋白质或其部分能参与与相应未转化的野生型相比提高GABA含量。例如，具有表II第3列中所示和本文所述的蛋白质的活性。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括编码本发明蛋白质的一部分的核酸。所述蛋白质与表II第5列和第7列中所示完整氨基酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％或50％的同源性，优选至少约55％、60％、65％或70％，更优选至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％，最优选至少约95％、97％、98％、99％或更高的同源性，并且具有上述活性，例如通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而赋予与相应例如未转化的野生型相比提高的GABA含量。
本发明核酸分子编码的蛋白质的部分优选具有生物学活性，优选具有上文提及的注释活性，例如在提高活性后与相应的未转化野生型细胞相比赋予提高的GABA含量。
如此处提及，术语“生物学活性部分”旨在包括部分，例如结构域/基序，其与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量，或具有免疫活性，使得其结合特异性结合本发明的多肽或用于本发明方法中的多肽的抗体，用于与相应的未转化野生型相比提高的GABA含量。
本发明还涉及这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于表IA第5列和第8列中所示核苷酸序列之一(及其部分)，并因而编码本发明的多肽，特别是具有上述活性的多肽，例如表II第5列和第7列中所示序列表示的多肽或其功能同源物。有利地，本发明的核酸分子包含(或在另一些方案中具有)编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含(或在另一些实施方案中具有)表II第5列和第7列所示氨基酸序列或其功能同源物。在另一些实施方案中，本发明的核酸分子编码全长蛋白，其与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列或功能同源物基本同源。然而，在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子不由表I(优选表IA第5列和第7列)中所示序列组成。
此外，本领域技术人员会理解，在种群中可能存在导致氨基酸序列改变的DNA序列多态性。编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因中的这种遗传多态性可由于天然变异而在种群的个体中存在。
本文使用的术语“基因”和“重组基因”指这样的核酸分子，其包含编码本发明多肽的可读框，或者包含本发明的核酸分子，或者编码本发明方法中所用的多肽，优选来自作物植物或者来自可用于本发明方法的微生物。这些天然变异一般可导致基因的核苷酸序列中1至5％的变异。本发明范围中旨在包括编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因中的任何及所有核苷酸变异及其引起的氨基酸多态性，这些变异由于天然变异而产生，并且不改变所述功能活性。
可以基于其与本文所述核酸分子的同源性，使用本发明核酸分子或其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件下分离与本发明核酸分子同源之天然变体的相应核酸分子，其也可以是cDNA。
因此，在另一实施方案中，本发明的核酸分子长度至少为15、20、25或30个核苷酸。优选地，其在严格条件下与包含本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子之核苷酸序列(例如包含表I第5列和第7列中所示序列)的核酸分子杂交。所述核酸分子的长度优选为至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸。
上文定义了术语“在严格条件下杂交”。在一个实施方案中，术语“在严格条件下杂交”旨在描述这样的杂交和洗涤条件，在所述条件下彼此具有至少30％、40％、50％或65％同一性的核苷酸序列一般保持彼此杂交。优选地，该条件使得彼此具有至少约70％、更优选至少约75％或80％、甚至更优选至少约85％、90％或95％或更高同一性的序列一般保持彼此杂交。
优选地，在严格条件下与表I第5列和第7列中所示序列杂交的本发明核酸分子对应于本发明的天然核酸分子。本文使用的术语“天然”核酸分子指具有在自然界中存在的核苷酸序列(例如编码天然蛋白质)的RNA或DNA分子。优选地，该核酸分子编码具有上述活性的天然蛋白质，所述活性为例如在提高其表达或活性或者通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达基因产物的核酸序列提高本发明蛋白质或本发明方法中所用蛋白质之活性后赋予赋予对环境胁迫提高的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
除了本发明多肽或核酸分子以及本发明方法中所用多肽或核酸分子之序列的天然变体以外，本领域技术人员会认识到，可通过突变向编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入改变，从而导致编码所述多肽的氨基酸序列的改变，而不改变该多肽的功能能力，优选不降低所述活性。
例如，可以在本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子(例如表I第5列和第7列中所示)的序列中产生导致在“非关键”氨基酸残基处发生氨基酸替换的核苷酸替换。
“非关键”氨基酸残基是在野生型序列中发生变化而不改变所述多肽之活性的残基，而“关键”氨基酸残基是上述活性(例如在提高该多肽的活性后导致与相应未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫的耐受性和/或抗性提高和生物量产生提高)所需的氨基酸残基。然而，其他氨基酸残基(例如在具有所述活性的结构域中不保守或仅半保守的残基)可能不是活性所必需的，因此很可能适于进行改变而不改变所述活性。[0180.1.1.1]此外，本领域技术人员了解，生物之间的密码子使用可能不同。因此，可以使本发明核酸分子中的密码子使用适用于表达所述多核苷酸或多肽的生物或细胞区室(例如质体或线粒体)中的使用。
因此，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而在生物或其部分中具有上述活性，并在所述活性的非关键氨基酸残基中含有改变。这些多肽在氨基酸序列上不同于表II第5列和第7列中所示序列中含有的序列，但仍保留本文所述活性。所述核酸分子可包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，并且能在通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而提高其活性(例如其表达)后参与与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高GABA含量。优选地，该核酸分子所编码的蛋白质与表II第5列和第7列中所示序列具有至少约60％的同一性，更优选与表II第5列和第7列中所示序列之一具有至少约70％的同一性，甚至更优选与表II第5列和第7列所示序列具有至少约80％、90％、95％的同源性，最优选与表II第5列和第7列中所示序列具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。
为了测定两氨基酸序列或两核酸分子之间的百分比同源性(＝同一性，本文中可互换使用)，将序列一个写在另一个下方用于最佳比较(例如，可以向蛋白质或核酸中插入缺口，以产生与另一蛋白质或另一核酸的最佳比对)。
接着比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核酸分子。如果一个序列中的位置被与另一序列中相应位置上相同的氨基酸残基或相同的核酸分子占据，则所述分子在此位置上是同源的(即，本文中使用的氨基酸或核酸“同源性”对应于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列间的百分比同源性是所述序列间共有的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/总位置数×100)。因此，术语“同源性”和“同一性”应认为是同义的。
为了确定两个或更多个氨基酸或者两个或更多个核苷酸序列之间的百分比同源性(＝同一性)，已经开发了若干计算机软件程序。两个或更多个序列的同一性可以使用例如fasta软件来计算，该软件目前使用的版本是fasta3(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),Improved Tools forBiological Sequence Comparison.PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1990)Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA,Methods in Enzymology 183:63-98；W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS85:2444-2448；W.R.Pearson(1990)；Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTAMethods in Enzymology 183:63–98)。另一种可用于计算不同序列间同源性的程序是标准blast程序，其包括在Biomax pedant软件中(Biomax,Munich,Federal Republic ofGermany)。遗憾的是，这有时产生非最优的结果，因为blast不总是包括主题和查询的完整序列。尽管如此，该程序非常高效，可用于比较大量序列。一般在这样的序列比较中使用以下设置：-p程序名[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i检索文件[File In]；默认＝stdin；-e期望值(E)[实数]；默认＝10.0；-m比对视图选项:0＝配对；1＝查询固定，显示名称；2＝查询固定，无名称；3＝平查询固定，显示名称；4＝平查询固定，无名称；5＝查询固定，无名称，平末端；6＝平查询固定，无名称，平末端；7＝XML Blast输出；8＝列表；9有注解行的表[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[File Out]可选；默认＝stdout；-F过滤查询序列(DUST使用blastn,SEG使用其他)[字符串]；默认＝T；-G打开缺口的消耗(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-E延伸缺口的消耗(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-X X缺口比对的降低值(比特)(0调用默认行为)；blastn 30,megablast 20,tblastx 0,其他均为15[整数]；默认＝0；-I Show GI's indeflines[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅用于blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配奖分(仅用于blastn)[整数]；默认＝1；-v对(V)显示一行描述的数据库序列数[整数]；默认＝500；-b对(B)显示比对的数据库序列数[整数]；默认＝250；-f延伸命中的阈值,0为默认；blastp 11,blastn 0,blastx 12,tblastn 13；tblastx 13,megablast 0[整数]；默认＝0；-g进行缺口比对(tblastx不提供)[T/F]；默认＝T；-Q使用的查询遗传密码[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数[整数]；默认＝1；-O序列比对文件[File Out]可选；-J相信查询defline[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字号,0为默认(blastn 11,megablast 28,其他均为3)[整数]；默认＝0；-z数据库有效长度(实际大小使用0)[实数]；默认＝0；-K区域中保留的最佳命中数(默认关闭，如果使用则推荐值为100)[整数]；默认＝0；-P多个命中使用0,单个命中使用1[整数]；默认＝0；-Y检索空间有效长度(实际大小使用0)[实数]；默认＝0；-S针对数据库检索的查询链(用于blast[nx]和tblastx)；3为都是,1为上,2为下[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认＝F；-l将数据库检索限制在GI列表[字符串]可选；-U使用FASTA序列的小写过滤[T/F]可选；默认＝F；-y无缺口延伸的X降低值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn 20,megablast 10,其他均为7[实数]；默认＝0.0；-Z最终缺口比对的X降低值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn/megablast 50,tblastx 0,其他均为25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN checkpoint file[File In]可选；-n MegaBlast search[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]可选；-A多重命中的窗口大小,0为默认(blastn/megablast 0,其他均为40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(blastx使用OOF算法)[整数]；默认＝0；-ttblastn中用于连接HSP的最大允许内含子长度(0不进行连接)[整数]；默认＝0。
使用Needleman和Wunsch或者Smith或Waterman的算法得到了高质量的结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列比较可以使用PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins等,CABIOS 5,151(1989))或优选使用“Gap”和“Needle”程序来进行，它们都基于Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))，还有“BestFit”,它基于Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics ComputerGroup,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711(1991)；Altschul等,(Nucleic Acids Res.25,3389(1997))，“Needle”是The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)的一部分(Trends inGenetics 16(6),276(2000))。因此，优选地，在完整序列范围内使用“Gap”或“Needle”程序进行用于确定序列同源性百分比的计算。对“Needle”使用以下标准调整用于核酸序列比较：矩阵:EDNAFULL,缺口罚分:10.0,延伸罚分:0.5。对“Gap”使用以下标准调整用于核酸序列比较：缺口权重:50,长度权重:3,评价匹配:10.000,评价错配:0.000。
例如，在核酸水平上与序列SEQ ID NO:42具有80％同源性的序列应理解为在以上述参数组通过上述程序“Needle”与序列SEQID NO:42比较后具有80％的同一性。
两多肽间的同源性应理解为完整序列长度上氨基酸序列的同一性，通过借助上述程序“Needle”进行比较来计算，其中使用矩阵:EBLOSUM62,缺口罚分:8.0,延伸罚分:2.0。
例如，在蛋白质水平上与序列SEQ ID NO:42具有80％同源性的序列应理解为在以上述参数通过上述程序“Needle”与序列SEQID NO:42比较后具有80％的同一性。
来自本发明表II第5列和第7列中所示的多肽之一的功能等同物通过替换、插入或缺失与本发明表II第5列和第7列中所示的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，尤其优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常尤其优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并因与表II第5列和第7列中所示的多肽具有基本相同的性质进行区分。
通过对根据本发明表I第5列和第7列中所示核酸序列进行替换、插入或缺失而产生的功能等同物与根据本发明表II第5列和第7列中所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且编码与表II第5列和第7列中所示多肽具有基本相同特性的多肽。
功能等同物的“基本相同的特性”首先应理解为指该功能等同物具有上述活性，例如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而提高所述功能等同物在生物(如微生物、植物或植物组织或动物组织、植物或动物细胞或其部分)中的蛋白量、活性或功能。
可以这样产生编码表II第5列和第7列之蛋白质序列的同源物的核酸分子：向本发明核酸分子(特别是表I第5列和第7列)的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替换、添加或缺失，以使所编码蛋白质中引入一个或多个氨基酸替换、添加或缺失。可以通过标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)向表I第5列和第7列的编码序列中引入突变。
优选地，在一个或多个预测的非关键氨基酸残基处产生保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是这样的氨基酸替换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似测量的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括带有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
因此，本发明多肽或本发明方法所用多肽中预测的非关键氨基酸残基优选被来自同一家族的另一氨基酸残基替换，或者，在另一实施方案中，可在本发明核酸分子或本发明方法所用核酸分子的编码序列的全部或部分中随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，并可在所得突变体中筛选本文所述活性，以鉴定保留或甚至提高上述活性(例如与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量)的突变体。
在诱变本文所示序列之一后，可以重组表达所编码的蛋白质并可使用如本文所述的测定(见实施例)来测定蛋白质的活性。
通过Gap检索在以下数据库条目中发现本发明方法所用核酸分子的高同源性。
具有表I第5列和第7列中所示序列的所用核酸序列的同源物还包括等位基因变体，其与所示核苷酸序列之一或上述衍生的核酸序列或其同源物、衍生物或类似物或其部分具有至少约30％、35％、40％或45％，优选至少约50％、60％或70％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选至少96％、97％、98％或99％的同源性。特别地，等位基因变体包括功能变体，其可通过在所示序列(优选表I第5列和第7列中所示或衍生的核酸序列)中缺失、插入或替换核苷酸来获得，然而，其目的是所合成的蛋白质的酶活性或生物活性有利地被保留或提高。
在另一个实施方案中，本发明的核酸分子或用于本发明方法中的核酸分子包含了表I的5列和7所示序列，以及额外的天然的5’和/或3’非翻译的序列或其部分。
在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸分子或本发明方法所用核酸分子包含表I第5列和第7列任何中所示序列。优选地，该核酸分子包含尽可能少的在表I第5列和第7列任一中未显示的其他核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸分子包含少于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50或40个其他核苷酸。在另一实施方案中，所述核酸分子包含少于30、20或10个其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法所用的所述核酸分子与表I第5列和第7列中所示序列相同。
还优选本发明方法所用核酸分子编码包含表II第5列和第7列中所示序列的多肽。在一个实施方案中，所述核酸分子编码少于150、130、100、80、60、50、40或30个其他氨基酸。在另一实施方案中，所编码的多肽包含少于20、15、10、9、8、7、6或5个其他氨基酸。在用于本发明方法的一个实施方案中，所编码的多肽与表II第5列和第7列中所示序列相同。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子或者本发明方法中所用核酸分子编码包含表II第5列和第7列中所示序列的多肽，并包含少于100个其他核苷酸。在另一实施方案中，所述核酸分子包含少于30个其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法中所用核酸分子与表I第5列和第7列中所示序列的编码序列相同。
仍具有本发明多肽的赋予与相应未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的GABA含量之必要生物活性或酶活性(即，其活性基本未降低)的多肽(＝蛋白质)的多肽是具有野生型生物活性或酶活性的至少10％或20％、优选30％或40％、特别优选50％或60％、非常特别优选80％或90或更高的多肽，有利地，该活性与在相同条件下表达的表II第5列和第7列中所示多肽之活性相比基本未降低。
表I第5列和第7列的同源物或者表II第5列和第7列中所示衍生序列的同源物还指编码和非编码DNA序列的截短序列、cDNA、单链DNA或RNA。所述序列的同源物还应理解为指衍生物，其包含非编码区，例如UTR、终止子、增强子或启动子变体。所述核苷酸序列上游的启动子可通过一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失进行修饰，但却不干扰该启动子、可读框(＝ORF)或远离ORF的3’调节区(如终止子或其他3’调节区)的功能或活性。还可以如下提高启动子的活性：修饰其序列，或者将其完全替换为活性更高的启动子，甚至来自异源生物的启动子。合适的启动子为本领域技术人员已知，并在下文提及。
除了上述编码GABA相关蛋白的核酸分子以外，本发明的另一方面涉及对选自根据表I第5列和/或第7列(优选第7列)的核酸分子之活性的负调节物。认为其反义多核苷酸抑制这些负调节物的下调活性，这是通过与靶标多核苷酸特异性结合以及干扰靶标多核苷酸的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性来实现的。本领域中描述了用于将反义多核苷酸靶向至染色体DNA、初级RNA转录物或经加工mRNA的方法。优选地，靶标区包括剪接位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子和可读框中的其他序列。
就本发明目的而言，术语“反义”指这样的核酸，其包括多核苷酸，上述多核苷酸与基因、原始转录物或经加工mRNA的全部或部分充分互补，从而干扰内源基因的表达。“互补”多核苷酸是能根据标准Watson-Crick互补原则碱基配对的多核苷酸。具体而言，嘌呤与嘧啶碱基配对，形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和腺嘌呤与胸腺嘧啶(A:T)(DNA的情况)或者腺嘌呤与尿嘧啶(A:U)(RNA的情况)的组合。应该理解，两个多核苷酸即便不彼此完全互补也能彼此杂交，只要各自具有彼此基本互补的至少一个区域即可。术语“反义核酸”包括单链RNA以及能转录产生反义RNA的双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能与核酸分子活性的负调节物选择性杂交的反义RNA分子，所述核酸分子编码与选自根据表II第5列和/或第7列(优选第7列)的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
反义核酸可以与完整的负调节物链互补，或者仅与其一部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码GABA相关蛋白的核苷酸序列的编码链中的“非编码区”反义。术语“非编码区”指编码区侧翼不翻译成氨基酸的5’和3’序列(即，也称为5’和3’非翻译区)。反义核酸分子可以仅与GABA相关蛋白mRNA的非编码区的一部分互补。例如，反义寡核苷酸可以与GABA相关蛋白mRNA翻译起始位点周围的区域互补。例如，反义寡核苷酸的长度可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义分子一般包含与表I的核酸之一的非编码区中至少14个连续核苷酸具有60-100％序列同一性的RNA。优选地，所述序列同一性将为至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％，最优选99％。
可以使用本领域已知的方法，使用化学合成和酶连接反应来构建本发明的反义核酸。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然核苷酸或多种修饰核苷酸来化学合成，所述修饰核苷酸设计用于提高分子的生物稳定性或提高反义与有义核酸之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)-尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。或者，可以使用已经将核酸以反义方向亚克隆(即，从所插入核酸转录的RNA将为目的靶核酸的反义取向，以下章节中进一步描述)的表达载体通过生物方法产生反义核酸。
在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-端基异构核酸分子。α-端基异构效应核酸分子与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与通常的b单元相反，链彼此平行排列(Gaultier等,1987,NucleicAcids.Res.15:6625-6641)。反义核酸分子还可包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等,1987,Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等,1987,FEBS Lett.215:327-330)。
本发明的反义核酸分子一般对细胞施用或者原位产生，以使其与细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合。杂交可通过常规核苷酸互补性进行，以形成稳定双链体，或者例如对于与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用进行。可以修饰反义分子，以使其特异性结合选定细胞表面上表达的受体或抗原，例如将该反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接在一起。也可以使用本文所述载体将反义核酸分子递送至细胞中。为了实现足够的反义分子胞内浓度，优选其中将反义核酸分子置于强原核、病毒或真核(包括植物)启动子控制之下的载体构建体。
作为反义多核苷酸的备选，可以使用核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)以减少本发明致GABA增加的多肽的表达。“核酶”意指具有核糖核酸酶活性的基于催化性RNA的酶，其能够切割与之具有互补区域的单链核酸如mRNA。可以使用核酶(例如Haselhoff和Gerlach,Nature 334,585(1988)所述的锤头状核酶)以催化性切割本发明致GABA增加的多肽mRNA转录物以便因此抑制本发明致GABA增加的多肽mRNA的翻译。对编码本发明致GABA增加的多肽的核酸呈特异性的核酶可以基于如本文中所公开的本发明致GABA增加的多肽cDNA的核苷酸序列或基于根据本发明中已教授的方法而分离的异源序列设计。例如，可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物，在其中活性位点的核苷酸序列与编码GABA相关蛋白的mRNA中待受到切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等的美国专利号4,987,071和5,116,742。备选地，可以使用本发明致GABA增加的多肽mRNA以在RNA分子库内选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参阅如Bartel,D.和Szostak,J.W.,1993,Science 261:1411-1418。在优选的实施方案中，核酶将含有具备至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸并且更优选地7或8个核苷酸的与靶RNA的部分具有100％互补性的部分。用于产生核酶的方法对本领域技术人员为已知。例如参见美国专利号6,025,167；5,773,260和5,496,698。
本文使用的术语“dsRNA”指包含两个RNA链的RNA杂交体。dsRNA的结构可以是线性或环状的。在一个优选的实施方案中，dsRNA对多核苷酸具有特异性，所述多核苷酸编码根据表II的多肽，或者编码与根据表II的多肽具有至少70％序列同一性的多肽。杂交的RNA可以是基本互补或完全互补。“基本互补”意指当使用如上所述的BLAST程序优化比对两种杂交的RNA时，杂交的部分至少95％互补。优选地，dsRNA的长度将是至少100个碱基对。一般地，杂交的RNA长度相同，没有突出的5'或3'端并且没有缺口。然而，达100个核苷酸的具有5'或3'突出端的dsRNA可以用于本发明的方法中。
dsRNA可以包含核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物如2'-O-甲基核糖基或其组合。例如，参见美国专利号4,130,641和4,024,222。dsRNA聚核糖次黄苷酸:聚核糖胞苷酸在美国专利4,283,393中描述。用于产生和使用dsRNA的方法在本领域已知。一个方法包括在体内或在体外单个反应混合物内同时转录两条互补的DNA链。例如，参见美国专利号5,795,715。在一个实施方案中，dsRNA可以通过标准技术直接导入植物或植物细胞。或者，dsRNA可以在植物细胞中通过转录两种互补的RNA得到表达。
用于抑制内源基因表达的其他方法如三螺旋形成(Moser等,1987,Science 238:645-650和Cooney等,1988,Science 241:456-459)和共抑制(Napoli等,1990,The Plant Cell 2:279-289)为本领域已知。已经将部分或全长的cDNA用于共抑制内源植物基因。参阅如美国专利号4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等,1990,The Plant Cell2:291-299；Smith等,1990,Mol.Gen.Genetics 224:477-481和Napoli等,1990,The Plant Cell 2:279-289。
对于有义抑制，认为导入有义多核苷酸封闭相应靶基因的转录。有义多核苷酸具有与靶植物基因或靶RNA至少65％的序列同一性。优选地，同一性百分数是至少80％、90％、95％或更高。导入的有义多核苷酸不必在全长上与靶基因或转录物相关。优选地，有义多核苷酸与表I所示核酸之一的至少100个连续核苷酸具有至少65％的序列同一性。同一性的区域可以包含内含子和/或外显子和非翻译区域。导入的有义多核苷酸可以短暂存在于植物细胞中，或可以稳定整合至植物染色体或染色体外复制子。
此外，本发明的目标是包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
a)编码表II第5或7列中所示多肽的核酸分子；
b)在表I第5或7列中所示的核酸分子；
c)由于遗传密码简并性的结果，可以源自表II的5或7列所述多肽序列的核酸分子，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量；
d)与这样的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性的核酸分子，所述多核苷酸包含表I的5或7列所示核酸分子，并相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量；
e)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性的多肽，并具有由包含如表I的5列所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，且相比相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分产生增加的GABA含量；
f)核酸分子，其在严格的杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交，且相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量；
g)核酸分子，其编码可在制备的针对(a)到(e)的核酸分子之一编码的多肽的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)编码具有如表II的5列所述蛋白质代表的活性的多肽的核酸分子，且相比相应的未转化的野生型产生增加的GABA含量；
i)包含这样的多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸是通过使用表III的7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的，并优选的具有由包含如表II或IV的5列所述多肽的蛋白代表的活性；
和
j)核酸分子，其通过在严格杂交条件下利用包含(a)或(b)核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得，所述探针或其片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并且所述核酸分子编码具有包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽。
本发明还提供分离的重组表达载体，其包含如上述的胁迫相关蛋白质编码核酸，其中该载体或胁迫相关蛋白质编码核酸分别在宿主细胞中的表达导致与宿主细胞的相应未转化的野生型相比增加的GABA含量。如本文中所用，术语“载体”指能够转运与之连接的另一种核酸分子的核酸分子。一个类型的载体实例是“质粒”，其指向其中可以连接额外DNA节段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将额外DNA节段连接至病毒的基因组内。其它类型的载可以是线性化的核酸序列，如转座子，其是可以拷贝并自我插入的DNA片段。存在两种类型的已知转座子：称作插入序列的简单转座子以及组合转座子，其可以具有数种基因以及为转座所需要的基因。
某些载体能够在导入这些载体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合至宿主细胞基因组，并且因此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常，用于DNA重组技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包含表达载体的其它形式，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其发挥等效功能。
植物表达盒优选地包含调节序列，此类调节序列能够在植物细胞中驱动基因表达并有效地连接以至每一序列可以充分实现它的功能，如通过聚腺苷酸化信号终止转录。优选的聚腺苷酸化信号不但是源自根瘤农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等,1984,EMBO J.3:835)中称作章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物的那些聚腺苷酸化信号，而且在植物中呈功能活性的所有其它终止子也适合。
由于植物基因表达并不总是在翻译水平受限，因此植物表达盒优选地含有有效连接的其它序列，如转录增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列的增强每RNA对多肽比率的超驱动序列(GaINe等,1987,Nucl.Acids Research 15:8693-8711)。
植物基因表达必须有效地连接至赋予基因以时间、细胞或组织特异性方式表达的适宜启动子。优选的启动子是驱动组成型表达的启动子(Benfey等,1989EMBO J.8:2195-2202)，如那些衍生自植物病毒如35S CaMV(Franck等,1980Cell 21:285-294)、19S CaMV(也参阅美国专利号5352605和PCT申请号WO 8402913)的启动子，或植物启动子，如那些在美国专利号4,962,028中所述来自Rubisco小亚基的启动子。
额外有利的调节序列例如包含在植物启动子如CaMV/35S[Franck等,Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等,Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、Iib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos中或者包含在泛蛋白、油菜籽蛋白或菜豆蛋白启动子内。诱导型启动子在本上下文中也有利，如在EP-A-O 388186(苯磺酰胺诱导型)、Plant J.2,1992:397-404(Gatz等,四环素诱导型)、EP-A-0335528(脱落酸诱导型)或WO 93/21334(乙醇或环己酮诱导型)中描述的启动子。额外有利的植物启动子是马铃薯的胞质溶胶FBP酶启动子或马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等,EMBO J.8,1989,2445)、大豆的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(还参见Genebank登录号U87999)或如EP-A-O 249676中所述节特异性启动子。额外特别有利的启动子是可以用于单子叶植物或双子叶植物并且在US 5,608,152(来自欧洲油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO98/45461(来自拟南芥菜属的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(来自菜豆的菜豆蛋白启动子)、WO 91/13980(来自芥属的Bce4启动子)和Baeumlein等,Plant J.,2,2,1992:233-239(来自豆科植物的LEB4启动子)中描述的种子特异性启动子。所述启动子用于双子叶植物中。如下启动子用于例如单子叶植物：来自大麦中Ipt2或Ipt1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子。其它有用的启动子在WO99/16890中描述。
原则上，可以使用具有其调节序列的所有天然启动子，如以上提及的用于新方法的那些天然启动子。除此之外，还可能并且可以有利地使用合成性启动子。
基因构建体还可含有待插入生物中并例如参与胁迫抗性和生物量生产提高的其他基因。在宿主生物中插入并表达调节基因是可能的并且是有利的，例如编码诱导物、阻遏物或通过其酶活性干预调节作用的酶的基因，或者生物合成途径中一种或多种或全部酶的基因。这些基因在来源上可以是异源或同源的。插入的基因可以具有它们自己的启动子或处于如与表I核酸序列或其同源物的相同启动子控制下。
为了表达存在的其它基因，基因构建体有利地包含根据已选择的宿主生物和基因选择用于最佳表达的3'和/或5'末端调节序列以增强表达。
这些调节序列用于使如上所述的基因特异性表达和蛋白质表达成为可能。根据宿主生物，这可以意指例如仅在诱导后基因才得以表达或过量表达或基因立即得以表达和/或过量表达。
调节序列或因子还可以优选地有益影响导入的基因的表达并且因此提高表达。有可能通过使用强转录信号，如启动子和/或增强子以这种方式有利地在转录水平增强调节元件。然而，除此此外，还有可能例如通过改善mRNA的稳定性增强翻译。
优选用于植物基因表达盒的其它序列是指导基因产物进入适宜细胞区室所需要的靶向序列(综述参阅Kermode,1996Crit.Rev.Plant Sci.15(4):285-423及其参考文献)，如进入液泡、细胞核、所有类型的质粒如淀粉体、叶绿体、细胞外空间、线粒体、色质体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室。
植物基因表达还可以通过诱导型启动子进行促进(综述参阅Gatz,1997Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48:89-108)。当基因表达需要以时间特异性方式发生时，化学诱导型启动子特别合适。
表VI列出了可用于调节胁迫相关蛋白质的核酸编码序列的转录的一些启动子实例。
表VI：植物中组织特异性和胁迫诱导型启动子的实例
其他启动子例如超级启动子(Ni等,Plant Journal 7,1995:661-676)、泛蛋白启动子(Callis等,J.Biol.Chem.,1990,265:12486-12493；US 5,510,474；US 6,020,190；Kawalleck等,Plant.Molecular Biology,1993,21:673-684)或34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)可类似地用于本发明，并为本领域技术人员已知。
发育阶段优选的启动子在发育的某个阶段优先受到表达。组织和器官优选的启动子包括在特定组织或器官如叶、根、种子或木质部中优先受到表达的那些启动子。组织优选的启动子包括但不限于果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、柄优选的、果皮优选的和叶优选的、柱头优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、花梗优选的、长角果优选的、茎优选的、根优选的启动子等。种子优选的启动子在种子繁育和/或萌发期间优先受到表达。例如，种子优选地启动子可以是胚优选的、胚乳优选和种衣优选的启动子。参阅Thompson等,1989,BioEssays 10:108。种子优选的启动子实例包括但不限于纤维素合成酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。
其它在本发明表达盒中有用的启动子包括但不限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-伴大豆球蛋白启动子、油菜籽蛋白启动子,大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、萎缩1、萎缩2和青铜色启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)以及合成性或其它的天然启动子。
在植物中控制异源基因表达的额外灵活性可以通过使用来自异源的DNA结合结构域和反应元件(即来自非植物的DNA结合结构域)达到。异源DNA结合结构域的实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne,1985,Cell 43:729-736)。[0220.1.1.1]本发明还提供包含以反义方向克隆至该表达载体的本发明本发明致GABA增加的蛋白DNA分子的重组表达载体。即DNA分子以如此方式有效连接至调节序列，该方式允许(通过DNA分子转录)与本发明致GABA增加的蛋白mRNA呈反义的RNA分子表达。可以选择有效地连接至以反义方向克隆的核酸分子的调节序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达。例如，可以选择指导反义RNA组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子，或调节序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，在其中反义核酸在高效调节区域的控制下产生。调节区域的活性可以通过向其中导入载体的细胞类型加以测定。对于使用反义基因调节基因表达的讨论，参阅Weintraub,H.等,1986,Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis,综述-Trends in Genetics,第1卷(1),和Mol等,1990,FEBS Letters 268:427-430。
本发明的另一方面涉及分离的本发明致GABA增加的蛋白、及其生物活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分在通过重组DNA技术产生时基本不含某些细胞性材料，或在通过化学合成时基本不含化学前体或其它化学品。词组“基本不含细胞性材料”包括这样的本发明致GABA增加的蛋白制品，在所述GABA相关蛋白制品中该多肽与从其中天然或重组地产生此多肽的细胞的某些细胞组分分开。在一个实施方案中，词组“基本不含细胞材料”包括这样的本发明致GABA增加的蛋白制品，其具有少于大约30％(干重)的非本发明致GABA增加的蛋白材料(本文中也称作“杂质多肽”)、优选地少于大约20％的非本发明致GABA增加的蛋白材料、仍更优选地少于大约10％的非本发明致GABA增加的蛋白材料并且最优选地少于大约5％的非本发明致GABA增加的蛋白材料。
当重组产生本发明致GABA增加的蛋白或其生物学活性部分时，它还优选地基本不含培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于大约20％、更优选地少于大约10％并且最优选地少于大约5％。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括本发明致GABA增加的蛋白制品，在其中该多肽与参与合成此多肽的化学前体或其它化学品分开。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括本发明致GABA增加的蛋白制品，其具有少于大约30％(干重)的化学性前体或非本发明致GABA增加的蛋白化学品、更优选地少于大约20％的化学性前体或非本发明致GABA增加的蛋白化学品、仍更优选地少于大约10％的化学性前体或非本发明致GABA增加的蛋白化学品并且最优选地少于大约5％的化学性前体或非本发明致GABA增加的蛋白化学品。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分没有来自在其中衍生本发明致GABA增加的蛋白的同一生物的杂质多肽。这样的多肽一般通过重组表达来产生，例如酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的本发明致GABA增加的蛋白在在除了酿酒酵母、大肠杆菌的植物或微生物，如谷氨酸棒杆菌、藻类或真菌中产生。
本文所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可用于一种或多种以下方法：鉴定酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或水稻及相关生物；对酿酒酵母、大肠杆菌相关生物的基因组进行作图；鉴定和定位酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的目的序列；进化研究；确定功能所需的本发明致GABA增加的蛋白区；调节本发明致GABA增加的蛋白活性；调节一个或多个细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜转运；调节胁迫抗性；以及调节本发明致GABA增加的蛋白核酸的表达。
本发明的核酸分子还用于进化和多肽结构研究。本发明分子所参与的代谢过程和转运过程由种类广泛的原核细胞和真核细胞所利用；通过将本发明核酸分子的序列与来自其它生物的编码类似酶的核酸分子的序列比较，可以评估生物的进化相关性。类似地，此类比较研究允许评估序列的哪些区域保守而哪些区域不保守，这可能有助于确定多肽的哪个区域对酶的功能关键。这种类型的确定对于多肽工程研究极有意义并且可以提供多肽可以耐受何种诱变而不丧失功能的线索。
对本发明核酸分子的操作可导致产生与野生型有功能差异的。这些多肽可具有提高的效率或活性，可以比通常更高的数量存在于细胞中，或者可以具有降低的效率或活性。
有许多本发明的本发明致GABA增加的蛋白改变直接影响胁迫应答和/或胁迫耐受性的机制。在植物表达本发明致GABA增加的蛋白的情况下，增强的转运可导致在植物组织和器官中改善的盐和/或溶质分配。通过增加从细胞输出离子分子的转运蛋白分子的数量或活性，可以影响细胞的盐和寒冷耐受性。
可以如下评估植物中的遗传修饰对胁迫耐受性的影响：在比合适更差的条件下培养修饰的植物，接着分析该植物的生长特征和/或代谢。此类分析技术对本领域技术人员而言众所周知，并且包括干重、湿重、多肽合成、糖合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、整体的植物和/或作物产量、开花、繁殖、结种、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(Applications ofHPLC in Biochemistry in:Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology,第17卷；Rehm等,1993,Biotechnology,第3卷,第III章:Product recovery and purification,469-714页,VCH:Weinheim；Belter等,1988,Bioseparations:downstream processing for biotechnology,John Wiley和Sons；Kennedy和Cabral,1992,Recovery processes forbiological materials,John Wiley和Sons；Shaeiwitz和Henry,1988,Biochemical separations,in:Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry,第B3卷,第11章,1-27页,VCH:Weinheim；和Dechow,1989,Separation and purification techniques in biotechnology,NoyesPublications)。
例如，可以使用标准方法构建包含本文所述核酸或其片段的酵母表达载体并转化进酿酒酵母中。接着对所得转基因细胞测定对干旱、盐和冷胁迫的耐受性的丧失或改变。类似地，可以使用标准方法构建包含本文所述核酸或其片段的植物表达载体并转化进适当的植物细胞中，例如拟南芥、大豆、油菜、玉米、棉花、稻、小麦、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等。接着对所得转基因细胞和/或由其产生的植物测定对干旱、盐、冷胁迫的耐受性的丧失或改变。
对根据表I并编码本发明表II的本发明致GABA增加的蛋白的一个或多个基因进行的改造还可产生改变了活性的本发明致GABA增加的蛋白，其间接影响藻类、植物、纤毛虫、真菌或其它微生物如谷氨酸棒杆菌的的胁迫应答和/或胁迫耐受性。
此外，本文所述序列或其片段可用于在多种生物(如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞)的基因组中产生敲除突变(Girke,1998,The Plant Journal 15:39-48)。然后可评估所得敲除细胞耐受多种胁迫条件的能力、其对多种胁迫条件的应答和对突变表型和/或基因型的影响。基因失活的其他方法参阅美国专利号6,004,804“Non-ChimericMutational Vectors”和Puttaraju等,1999,Spliceosome-mediated RNAtrans-splicing as a tool for gene therapy,Nature Biotechnology 17:246-252。
导致胁迫耐受性提高的上述用于GABA相关蛋白的诱变策略并不意在限制，这些策略的修改对于本领域技术人员来说是很明显的。使用这些策略并结合本文公开的机制，本发明的核酸及多肽分子可用于产生表达突变的GABA相关蛋白核酸及多肽分子从而提高胁迫耐受性的藻类、纤毛虫、植物、真菌或其它微生物如谷氨酸棒杆菌。
本发明还提供特异性结合至如由本文中所述的核酸编码的本发明致GABA增加的蛋白或其部分的抗体。抗体可以通过众多众所周知的方法产生(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies；A LaboratoryManual”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork,(1988))。简而言之，可以将纯化的抗原以足以激发免疫反应的量和间隔期注射至动物。可以直接纯化抗体，或可以自该动物获得脾脏细胞。随后将此细胞与永生细胞系融合并对抗体分泌进行筛选。抗体可用于对核酸克隆文库筛选针分泌抗原的细胞。随后可以将那些阳性克隆测序。参阅如Kelly等,1992,Bio/Technology 10:163-167；Bebbington等,1992,Bio/Technology 10:169-175。
短语与多肽“选择性结合”和“特异性结合”指可确定多肽在异源多肽群体和其它生物中存在的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，结合至特定多肽的指定抗体不以显著量结合至样品中存在的其它多肽。抗体在如此条件下的选择性结合可能需要因其对特定多肽的特异性而选择的抗体。多种免疫方法可以用于选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如固相ELISA免疫分析常规地用于选择与多肽发生选择性免疫反应的抗体。对于可以用于测定选择性结合的免疫方法和条件的描述，参见Harlow和Lane,“Antibodies,A Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)。
在某些情况下，需要制备来自多种宿主的单克隆抗体。用于制备此类单克隆抗体的技术的描述可以在Stites等编辑,“Basic和ClinicalImmunology,”(Lange Medical Publications,Los Altos,Calif.,第五版和及其中引用的参考文献,和在Harlow和Lane,“Antibodies,A LaboratoryManual,”Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)中找到。
植物中的基因表达受蛋白质转录因子与基因调节区域内特定核苷酸序列相互作用的调节。转录因子的一个实例是含有锌指(ZF)基序的多肽。每一ZF模块的长度是大约30个氨基酸，在锌离子周围折叠。ZF蛋白质的DNA识别结构域是插入DNA双螺旋大沟内的α-螺旋结构。模块含有结合至DNA的三个氨基酸，每一氨基酸接触靶DNA序列中的单个碱基对。ZF基序以模块重复方式排列以形成一套识别连续DNA序列的指。例如，三指ZF基序将识别DNA的9个bp。已证实数百个蛋白质含有ZF基序，每一蛋白质中有2至37个ZF模块(Isalan M,等,1998Biochemistry 37(35):12026-33；Moore M,等,2001 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4):1432-1436和1437-1441；美国专利US 6007988和US 6013453)。
植物基因的调节区域含有众多起到识别包括ZF蛋白在内的转录因子的短DNA序列(顺式作用元件)。不同基因中类似的识别结构域允许通过常见转录因子在代谢途径中协同表达数个编码酶的基因。基因家族成员的识别结构域中的变化有利于同一基因家族内部在基因表达的差异，例如在组织和发育阶段以及对环境条件的反应中。
常见ZF蛋白不仅含有DNA识别结构域，还含有使ZF蛋白激活或抑制特定基因转录的功能域。实验上，已经将激活域用于激活靶基因转录(美国专利5789538和专利申请WO9519431)，不过还有可能将转录阻遏物域连接至ZF并且因而抑制转录(专利申请WO00/47754和WO2001002019)。已报道酶的功能如核酸切割可以与ZF联合(专利申请WO 00/20622)。
本发明提供了使得本领域技术人员能够从植物细胞基因组中分离一种或多种胁迫相关蛋白质编码基因的调节区，并能设计与功能结构域连接的锌指转录因子，所述功能结构域与该基因的调节区相互作用。可以以改变该基因表达的方式来设计锌指蛋白与植物基因的相互作用，并优选由此赋予提高的GABA含量。
具体地，本发明提供了产生含有胁迫相关蛋白质编码核酸的转基因植物的方法，其中该核酸在该植物中的表达导致与野生型植物相比对环境胁迫的耐受性提高，该方法包括：(a)用包含胁迫相关蛋白质编码核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)从该植物细胞产生与野生型植物相比具有提高的GABA含量的转基因植物。就这样的植物转化而言，可以使用双元载体，如pBinAR(和Willmitzer,1990Plant Science66:221-230)。其他合适的双元载体为例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Hajukiewicz,P.等,1994,Plant Mol.Biol.,25:989-994)。
双元载体的构建可以通过将cDNA连接至T-DNA进行。位于该cDNA5'端的植物启动子激活cDNA的转录。聚腺苷酸化序列位于cDNA的3'端。组织特异性表达可以通过使用如上所列的组织特异性启动子实现。此外，可以使用任何其它启动子元件。对于在完整植物中的组成型表达，可以使用CaMV 35S启动子。可以使用信号肽将表达的蛋白质靶向至细胞区室例如质体、线粒体或内质网(Kermode,1996Crit.Rev.Plant Sci.4(15):285-423)。将信号肽以符合cDNA读框方式克隆至5’端以实现融和蛋白的亚细胞定位。另外，可以使用应答非生物胁迫的启动子，如拟南芥启动子RD29A。本领域技术人员认识到所用的启动子应当有效地连接至核酸以至该启动子引起核酸的转录，导致合成编码多肽的mRNA。
另一种转染方法包括通过电穿孔或农杆菌介导的基因转移将DNA直接转移至发育的花中。农杆菌介导的植物转化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell,1986Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Ooms等,Plasmid,1982,7:15-29；Hoekema等,Nature,1983,303:179-180)根瘤农杆菌菌株开展。转化可以通过标准转化和再生技术(Deblaere等,1994Nucl.Acids.Res.13:4777-4788；Gelvin和Schilperoort,《Plant Molecular Biology Manual》第二版，Dordrecht:Kluwer Academic Publ.,1995.-in Sect.,Ringbuc ZentraleSignatur:BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick,B R和Thompson,J E,《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》，Boca Raton:CRC Press,1993.-360S.,ISBN 0-8493-5164-2)开展。例如，油菜可以通过子叶或下胚轴转化作用加以转化(Moloney等,1989Plant Cell Reports 8:238-242；De Block等,1989Plant Physio.91:694-701)。用于农杆菌的抗生素以及植物选择取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜的选择通常使用作为可选择植物标记的卡那霉素开展。农杆菌介导至亚麻属植物的基因转移可以使用例如由Mlynarova等,1994Plant Cell Report13:282-285描述的技术开展。此外，大豆的转化可以使用例如由欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770描述的技术开展。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或碳化硅纤维技术(参阅如Freeling和Walbot《The maize handbook》，Springer Verlag:New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)实现。转化玉米的具体实例在美国专利号5,990,387中找到并且转化小麦的具体实例在PCT申请号WO 93/07256中找到。
在胁迫条件下生长修饰的植物并筛选和分析生长特性和/或代谢活性，以评估植物中遗传修饰对提高GABA含量的影响。这些分析技术为本领域技术人员所熟知。它们包括筛选(Rompp LexikonBiotechnologie,Stuttgart/New York:Georg Thieme Verlag 1992,"screening"701页)干重、湿重、蛋白质合成、糖类合成、脂类合成、蒸腾速率、一般植物和/或农作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸作用速率、光合作用速率。(《Applications of HPLC in Biochemistry in:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology》，第17卷；Rehm等,1993《Biotechnology》，第3卷,第III章:《Product recoveryand purification》，469-714页,VCH:Weinheim；Belter,P.A.等，1988,《Bioseparations:downstream processing for biotechnology》，John Wiley和Sons；Kennedy,J.F.和Cabral,J.M.S.,1992,《Recovery processes forbiological materials》，John Wiley and Sons；Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.,1988,《Biochemical separations,in:Ulmann's Encyclopedia of IndustrialChemistry》，第B3卷,第11章,1-27页,VCH:Weinheim；和Dechow,F.J.,1989,《Separation and purification techniques in biotechnology》，NoyesPublications)。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在生物，例如植物的细胞中鉴定基因产物的方法，所述基因产物与相应的未转化野生型细胞相比赋予提高的GABA含量，所述方法包括以下步骤：
a)使样品，例如细胞、组织、植物或微生物或核酸文库的一些或所有核酸分子与表I A或B的第5列或第7列中所示的核酸分子或其功能同源物接触，例如杂交，所述样品可含有编码基因产物的候选基因，所述基因产物赋予提高的GABA含量；
b)鉴定核酸分子并任选地分离全长cDNA克隆或完整的基因组克隆，所述核酸分子在松弛严格条件下与所述核酸分子，特别是表I第5列或第7列中所示的核酸分子序列杂交；
c)在宿主细胞，优选植物细胞中鉴定候选核酸分子或其片段；
d)提高宿主细胞中所鉴定的核酸分子的表达，期望从所述表达中获得提高的GABA含量；
e)测定宿主细胞的提高的GABA含量水平；和
f)鉴定核酸分子及其基因产物，其提高的表达与野生型相比在宿主细胞中赋予提高的GABA含量。
松弛杂交条件是：在标准杂交程序后，在低到中等严格条件下进行洗涤步骤，与例如具有0.1％SDS的60°到68℃的严格洗涤条件相比，所述低到中等严格条件一般具有40°-55℃的洗涤条件和具有0.1％SDS的2xSSC到0.2x SSC之间的盐条件。可在上文为严格杂交条件列出的参考文献中发现其它实例。一般地，以增加的严格性和长度重复洗涤步骤直至检测到有用信噪比，并且所述洗涤步骤依赖于许多因素，如靶标，例如其纯度、GC含量、大小等、探针，例如其长度、其为RNA还是DNA探针、盐条件、洗涤或杂交温度、洗涤或杂交时间等。
在另一实施方案中，本发明涉及用于在细胞中鉴定基因产物的方法，所述基因产物的表达赋予提高的GABA含量，所述方法包括步骤：
a)例如通过在数据库中的同源性搜索鉴定生物中的核酸分子，其与编码下述蛋白质的核酸分子具有至少20％，优选25％，更优选30％，甚至更优选35％、40％或50％，甚至更优选60％、70％或80％，最优选90％或95％或更高的同源性，所述蛋白质包含表II第5列或第7列中所示多肽分子或包含表IV第7列中所示共有序列或多肽基序或由包含表I第5列或第7列中所示多核苷酸或此处描述的其同源物的核酸分子编码。
b)增强宿主细胞中所鉴定核酸分子的表达；
c)测定宿主细胞中提高的GABA含量；和
d)鉴定所述宿主细胞，其中宿主细胞中增强的表达与野生型相比，赋予提高的GABA含量。
此外，本文所述核酸分子(特别是表I A或B第5列或第7列中所示核酸分子)可与相关物种的序列充分同源，从而这些核酸分子可作为标志物用于在相关生物中构建基因组图谱或用于关联作图。此外，本文所述核酸(特别是表IA或B第5列或第7列中所示核酸分子或其同源物)相应的基因组区中的天然变异可导致本文所述蛋白质活性的变异，并因此导致GABA含量产生发生自然变异，所述蛋白质尤其是这样的蛋白质，其包含表IIA或B第5列或第7列中所示多肽，或者包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序及其同源物。
因此，自然变异最终也以更具活性的等位变体的形式存在，其已经导致GABA含量产生的相对提高。可鉴定此处公开的核酸分子，特别是包含表IA或B第5列或第7列中所示核酸分子的核酸的不同变体(其对应于不同的GABA浓度水平)并将其用作标记物辅助育种，用于提高的GABA含量。
因此，本发明涉及用于培育植物，用于提高GABA含量的方法，其包括：
a)基于此处公开的本发明核酸，特别是包含表IA或B第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子或包含表IIA或B第5列或第7列中所示多肽或包含表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽，或如此处所述的其同源物的提高表达选择第一个植物品种，其具有提高的GABA含量；
b)使GABA浓度产生的水平与编码所述多肽的基因或所述核酸分子的表达水平或基因组结构联系起来；
c)使所述第一个植物品种与第二个植物品种杂交，所述第二个植物品种在GABA浓度产生的水平上显著地不同于第一个植物品种，和
e)鉴定哪个后代品种已经通过所述多肽或核酸分子的表达水平或编码所述多肽的基因或本发明核酸分子的基因组结构获得了提高水平的GABA浓度。
在一个实施方案中，提高步骤(b)的基因的表达水平。
本发明的另一实施方案涉及用于鉴定化合物的方法，所述化合物在植物细胞、植物或其部分中与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量，所述方法包括步骤：
a)培养植物细胞；植物或其部分，其维持植物表达表II第5列或第7列中所示或由包含表I第5列或第7列中所示多核苷酸或此处描述的其同源物的核酸分子或编码所述多肽的多核苷酸编码的多肽，所述多肽与相应的未转化野生型相比赋予提高的GABA含量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；未转化野生型植物或其部分并提供读出系统，所述读出系统能够在允许多肽与该读出系统在存在化合物或包含大量化合物的样品下相互作用的合适条件下与多肽相互作用，并能够提供应答在允许表达所述读出系统和表II第5列或第7列中所示的或由包含表I第5列或第7列中所示多核苷酸或如此处描述的其同源物的核酸分子编码的蛋白质的条件下化合物结合所述多肽的可检测信号；和
b)如果所述化合物是有效的激动剂，那么通过检测所述读出系统产生的信号的存在或缺失或减少或增加进行鉴定。
所述化合物可以是化学合成的或者是微生物产生的和/或包含于例如来自如植物、动物或微生物(如病原体)的样品(如细胞提取物)中。此外，所述化合物可以是本领域已知的，但还不了解其能够抑制本发明的多肽。反应混合物可以是无细胞提取物，或者可包含细胞或组织培养物。用于鉴定本发明化合物的方法的合适设置为本领域技术人员已知，并且一般性地描述于例如Alberts等,Molecular Biology of the Cell,第三版(1994),特别是第17章。所述化合物可以例如添加到反应混合物、培养基中，注射到细胞中或者喷洒到植物上。
如果在该方法中鉴定含有化合物的样品，则可以从鉴定为含有与相应未转化的野生型相比能在暂时和反复的非生物胁迫条件下激活或提高产量生产的化合物的原始样品中分离该化合物，或者可以将原始样品进一步细分(例如如果由多种不同化合物组成)，从而减少每个样品中的不同物质数，并以原始样品的细分重复该方法。取决于样品的复杂度，上述步骤可以重复若干次，优选直至根据所述方法鉴定的样品仅含有数目有限的物质或仅含一种物质。优选地，所述样品含有具有相似化学和/或物理特性的物质，最优选地，所述物质是相同的。优选地，将根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物进一步配制成适于在植物育种或植物细胞和组织培养中应用的形式。
可根据所述方法测试和鉴定的化合物可以是表达文库(例如cDNA表达文库)、肽、蛋白质、核酸、抗体、小有机化合物、激素、拟肽、PNA等((Milner,Nature Medicine 1(1995),879-880；Hupp,Cell 83(1995),237-245；Gibbs,Cell 79(1994),193-198及上文引用的参考文献)。所述化合物也可以是已知抑制剂或激活剂的功能衍生物或类似物。用于制备化学衍生物和类似物的方法为本领域技术人员所熟知，并描述于例如Beilstein,Handbook of Organic Chemistry,Springer edition New York Inc.,175Fifth Avenue,New York,N.Y.10010U.S.A.和Organic Synthesis,Wiley,New York,USA。此外，可根据本领域已知的方法测试所述衍生物和类似物的效果。此外，可以使用拟肽和/或计算机辅助设计合适的衍生物或类似物，例如根据上文所述的方法。该方法中可使用的细胞或组织为上文实施方案中所述的本发明宿主细胞、植物细胞或植物组织。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及可根据用于鉴定本发明激动剂的方法获得或鉴定的化合物，所述化合物是本发明多肽的拮抗剂。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及通过用于鉴定本发明化合物的方法鉴定的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性识别本发明化合物或激动剂的抗体。
本发明还涉及诊断组合物，其包含至少一种上述本发明核酸分子、反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、载体、蛋白质、抗体或化合物，并任选地包含合适的检测手段。
本发明的诊断组合物适用于从细胞中分离mRNA，并在杂交条件下使这样获得的mRNA接触包含上述核酸探针的探针，检测与该探针杂交的mRNA的存在情况，从而检测细胞中该蛋白质的表达。检测本发明蛋白质存在与否的其他方法包括本领域熟知的免疫技术，例如酶联免疫吸附测定。此外，可以在植物育种中使用本发明的核酸分子作为分子标记或引物。合适的检测方法为本领域技术人员所熟知，例如，描述于Sambrook等的用于杂交测定的缓冲液和溶液(例如上述溶液和缓冲液)以及用于Southern、Western、Northern等印迹的方法是已知的。在一个实施方案中，诊断组合物含有PCR引物，其设计成特异性检测待在本发明方法中降低的核酸分子(例如本发明的核酸分子)的存在或表达水平，或者设计成区分本发明核酸分子的不同变体或等位基因或者待在本发明方法中降低其活性的变体或等位基因。
在另一实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或病毒核酸分子、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或根据本发明方法鉴定的化合物和/或激动剂。
本发明试剂盒中的化合物可包装在容器(例如小瓶)中，任选地与缓冲液和/或溶液一起或者在缓冲液和/或溶液中。如果合适，所述组分的一种或多种可以包装在一个和相同的容器中。作为补充或替代，可将一种或多种所述组分吸附至固相支持体，例如硝酸纤维素滤膜、玻璃板、芯片或尼龙膜或其微量滴定板的孔。该试剂盒可用于任何本文所述方法和实施方案，例如用于产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物；检测同源序列；鉴定拮抗剂或激动剂；作为食品或饲料或其补充剂；或者作为处理植物的补充剂等。
此外，该试剂盒可包含将该试剂盒用于任何所述实施方案的说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含编码一种或多种所述蛋白质的核酸分子，和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。在另一实施方案中，所述试剂盒包含用于检测和区分待在本发明方法中降低的核酸分子(例如本发明核酸分子)的PCR引物。
在另一实施方案中，本发明涉及用于产生农用组合物的方法，所述农用组合物提供用于本发明方法的核酸分子，本发明的核酸分子，本发明的载体，本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或抗体，本发明的病毒核酸分子或本发明的多肽；或者包含用于鉴定所述化合物或激动剂的本发明方法的步骤；以及制备本发明的核酸分子、载体或多肽；或者根据本发明方法鉴定或可用于本发明主题的激动剂或化合物，它们均为可用作植物农用组合物的形式。
在另一实施方案中，本发明涉及用于产生植物培养组合物的方法，其包括本发明方法的步骤，以及将所鉴定的化合物制备成可用作农用组合物的形式。
“可用作农用组合物”应理解为这样的组合物符合规定杀真菌剂、植物养分、除草剂等含量的法律。优选地，这样的组合物对所保护的植物和所喂饲的动物(包括人)无任何害处。
可以通过在合适的条件下(例如上述的条件)生长修饰的微生物或修饰的植物，并分析培养基和/或细胞组分中提高的γ-氨基丁酸生产，来确定宿主细胞中的遗传修饰对γ-氨基丁酸生产的影响。这类分析技术是熟练的技术人员已知的，包括光谱学、薄层层析、多种类型的染色方法、酶学和微生物学方法，以及分析层析，如高效液相色谱(见例如Ullman,Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第89-90页和第443-613页，VCH:Weinheim(1985)；Fallon,A.等，(1987)“Applications of HPLC inBiochemistry“in:Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，第17卷；Rehm等，(1993)Biotechnology，第3卷，第III章：“Product recovery and purification”，第469-714页，VCH:Weinheim；Belter,P.A.等，(1988)Bioseparations:downstream processing forBiotechnology,John Wiley and Sons；Kennedy,J.F.和Cabral,J.M.S.(1992)Recovery processes for biological Materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.(1988)Biochemical Separations,in:Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第B3卷，第11章，第1-27页，VCH:Weinheim；和Dechow,F.J.(1989)Separation andpurification techniques in biotechnology,Noyes Publications)。
例如，可以通过HPLC、LC或GC分离方法，有利的检测γ-氨基丁酸。通过使用分析标准方法：LC、LC-MS、MS或TLC，分析重组生物体，可以获得对含γ-氨基丁酸的产物的存在的明确检测。可以通过超声、在玻璃研钵中研磨、液氮并研磨、蒸煮或通过其他可应用的方法，破裂待分析的材料。
可以分离和纯化GABA。
通过使用所述的分析标准方法：LC、LC-MS、MS或TLC，分析重组生物体，可以获得对γ-氨基丁酸的存在的明确检测。可以根据例如下列程序，分析用于本发明方法中的生物体(例如酵母)中生产的总量：
可以通过超声、在玻璃研钵中研磨、液氮并研磨、蒸煮或通过其他可应用的方法，破裂待分析的材料，例如酵母、大肠杆菌或植物。
通过持续在研杵中将植物材料初始均质化，使它更易于提取。
典型的样品预处理包括使用极性有机溶剂如丙酮或醇类(如甲醇)或酯类的总液相提取、皂化、相分离、非极性表相与极性更强的低相性衍生物的分离，以及层析。
关于分析，可以使用自动化系统实现溶剂递送和等分移除(aliquotremoval)，所述自动化系统包括单个注射器阀Gilson 232XL和4022S1V稀释加液器[Gilson,Inc.USA,3000W.Beltline Highway,Middleton,WI]。关于皂化，每个小瓶可以添加3ml的50％氢氧化钾乙醇水溶液(4份水-1份乙醇)，然后添加3ml辛醇。可以将小瓶维持在IKA HS 501水平振荡器上，250次移动/分钟，进行15小时，在室温进行皂化处理[Labworld-online,Inc.,Wilmington,NC]，然后是约1个小时的静止阶段。
在皂化后，可以用0.17ml甲醇稀释上清液。可以在压力下进行甲醇添加，保证样品均质。使用0.25ml注射器，可以移出0.1ml等分试样，并转移到HPLC小瓶中用于分析。
关于HPLC分析，可以使用补充了四元泵的Hewlett Packard 1100HPLC、真空脱气系统、六向注射阀、温控自动上样仪、柱加热炉和光电二极管阵列检测仪[Agilent Technologies available through Ultra ScientificInc.，250Smith Street，North Kingstown,RI]。柱可以是Waters YMC30，5微米，4.6x 250mm以及相同材料的保护柱[Waters,34Maple Street,Milford,MA]。用于移动相的溶剂可以是81甲醇：4水：15四氢呋喃(THF)，用0.2％BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)来稳定。注射20l。分离可以是在30℃isocratic，流速为1.7ml/分钟。可以通过在447nm的吸收值测量峰应答。
如果需要且是理想的，则可以后续其他使用合适树脂的层析步骤。有利的，还可以用所谓的RTHPLC进一步纯化γ-氨基丁酸。作为洗脱液，可以使用乙腈/水或氯仿/乙腈混合物。如果必需的话，可以重复这类层析步骤，使用相同的或其他的层析树脂。熟练的技术人员熟知用于待纯化的特定分子合适的层析树脂的选择，以及最有效的用法。
缩写：GC-MS，气相液相层析/质谱；TLC，薄层层析。
可以通过现有技术领域的技术，确定所分离的混合物的同一性和纯度。涵盖了高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、光谱学方法、质谱(MS)、染色方法、薄层层析、NIRS、酶学测定或微生物学测定。这类分析方法汇编在：Patek等，(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140；Malakhova等，(1996)Biotekhnologiya 11 27-32；和Schmidt等，(1998)BioprocessEngineer.19:67-70.Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry(1996)Bd.A27,VCH Weinheim，第89-90页，第521-540页，第540-547页，第559-566页，第575-581页和第581-587页；Michal,G(1999)BiochemicalPathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology,John Wileyand Sons；Fallon,A.等，(1987)Applications of HPLC in Biochemistry in:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷中。
在所述方法中获得的γ-氨基丁酸适合作为起始材料，用于合成有价值的其他产品。例如，它们可以相互组合使用，或单独使用，用于药剂、食品、动物饲料或化妆品的生产。因此，本发明涉及生产药剂、食品、动物饲料、营养物或化妆品的方法，包括根据本发明的方法的步骤，包括分离所生产的γ-氨基丁酸组合物，或需要时分离所生产的GABA，将产物与制药可接受的载体配制，或者以农业应用可接受的形式配制产物。根据本发明的另一实施方案是在所述方法中生产的γ-氨基丁酸或者所述转基因生物体在动物饲料、食品、药品(medicine)、食品添加剂、化妆品或药剂(pharmaceutical)中的用途，或用于生产γ-氨基丁酸，例如，在分离或未分离GABA后，例如在用于所述方法的生物体中，例如原位的生产GABA。
本发明的植物(例如具有增加的GABA含量的)具有增加的氮摄入。此外，这类植物具有增加的氮同化和利用，优选在低的氮安排(nitrogen disposal)和/或氮剥夺(nitrogen deprivation)时。
在本发明的一个实施方案中，增强的氮摄入导致增加的氮利用效率。在一个实施方案中，增加的氮利用效率进一步是增强的氮摄入、同化和利用。
在本发明的一个实施方案中，增强的氮摄入导致增加的植物产量。因此，增加的产量是由增加“植物的氮利用效率”介导的。
在一个实施方案中，本发明的植物表现出增加的GABA含量和增加的氮摄入。在一个实施方案中，这类植物额外具有增加的氮同化和利用，优选在低的氮安排(nitrogen disposal)和/或氮剥夺(nitrogendeprivation)时。
在一个实施方案中，本发明的植物表现出增加的GABA含量和增加的氮利用效率。
在一个实施方案中，本发明的植物具有增加的GABA含量和增加的植物产量。
在另一实施方案中，如果增加或产生这样的多肽的活性，所述多肽包含SEQ ID NO.43所示多肽、或由包含SEQ ID NO.42所示核酸分子的核酸分子编码肽、或是所述核酸分子或多肽的同源物，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。例如，增加或产生源自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选分别包含SEQ ID NO.42所示核酸分子或SEQ ID NO.43所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“因子停滞蛋白”的活性，或者分别包含表I、II或IV的7列中与SEQ ID NO.42或SEQ IDNO.43相同的行所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。优选的，增加发生在细胞质中。
特别地是，相比相应的对照，例如未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生从1.05倍至1.28倍的产量增加，例如增加至少100％。
在另一实施方案中，如果增加或产生这样的多肽的活性，所述多肽包含SEQ ID NO.7138所示多肽、或由包含SEQ ID NO.7137所示核酸分子的核酸分子编码肽、或是所述核酸分子或多肽的同源物，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。例如，增加或产生源自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选分别包含SEQ ID NO.7137所示核酸分子或SEQ ID NO.7138所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“微粒体β-酮还原酶”的活性，或者分别包含表I、II或IV的7列中与SEQ ID NO.7137或SEQ ID NO.7138相同的行所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。优选的，增加发生在细胞质中。
特别地是，相比相应的对照，例如未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生从1.05倍至1.38倍的产量增加，例如增加至少100％。
在另一实施方案中，如果增加或产生这样的多肽的活性，所述多肽包含SEQ ID NO.8240所示多肽、或由包含SEQ ID NO.8239所示核酸分子的核酸分子编码肽、或是所述核酸分子或多肽的同源物，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。例如，增加或产生源自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选分别包含SEQ ID NO.8239所示核酸分子或SEQ ID NO.8240所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“60S核糖体蛋白”的活性，或者分别包含表I、II或IV的7列中与SEQ ID NO.8239或SEQID NO.8240相同的行所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。优选的，增加发生在细胞质中。
特别地是，相比相应的对照，例如未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生从1.05倍至1.223倍的产量增加，例如增加至少100％。
在另一实施方案中，如果增加或产生这样的多肽的活性，所述多肽包含SEQ ID NO.8228所示多肽、或由包含SEQ ID NO.8227所示核酸分子的核酸分子编码肽、或是所述核酸分子或多肽的同源物，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。例如，增加或产生源自酿酒酵母的相应核酸分子或多肽的活性，优选分别包含SEQ ID NO.8227所示核酸分子或SEQ ID NO.8228所示多肽，或其同源物。例如，如果在植物或其部分中增加或产生“细胞色素c氧化酶亚基VIII”的活性，或者分别包含表I、II或IV的7列中与SEQ ID NO.8227或SEQ ID NO.8228相同的行所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，则相比相应的未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生对非生物环境胁迫增加的耐受，和/或增加的产量相关性状，特别是增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。优选的，增加发生在细胞质中。
特别地是，相比相应的对照，例如未修饰的(例如未转化的)野生型植物，产生从1.05倍至1.56倍的产量增加，例如增加至少100％。
还观察到，在拟南芥中增加或产生表X中所示基因的活性，例如源自表X的拟南芥中所示核酸分子的核酸分子，相比野生型对照，产生增加的营养物利用效率，优选氮利用效率。因而，在一个实施方案中，在本发明的方法中使用表X所示核酸分子或其同源物，如表I所示，或其表达产物，以增加植物相比野生型对照的营养物利用效率，优选氮利用效率。
在本发明的一个实施方案中，根据下列方法确定和定量增强的NUE(氮利用效率)：
程序1：
琼脂平板上的生物量生产：
为了筛选转基因植物，使用了特殊的培养装置。出于高通量的目的，在氮供应有限的琼脂平板(从Estelle和Somerville,1987改造的)上，筛选植物的生物量生产。该筛选流水线由2个水平组成。如果相比野生型植物，生物量生产显著改善，则将转基因品种投入后续水平。每个水平都增加重复数和统计严格度。
关于播种，在牙签的帮助下，可以将种子从Eppendorf管中移出，所述种子可储存在冰箱(-20℃)中，并转移到上述琼脂平板上，具有有限的氮供应(0.05mM KNO3)。每个平板(12x 12cm)上可以水平的分布总计约15-30颗种子。
在播种种子后，将平板在4℃下的黑暗中层化2-4天。层化后，测试平板在20℃下以16-h-光照、8-h-黑暗的节律生长22-25天，大气湿度为60％，CO2浓度为约400ppm。所使用的光源产生模拟太阳光光谱的光，光密度为约100μE/m2s。在10-11天后，将植物单株化。在生长20-25天后，通过比较转基因植物和野生型对照植物的茎和根的生物量生产来评估在氮受限条件下的生长改善。
将相比野生型植物，表现出显著改善的生物量生产的转基因品种进行后续水平的下列实验：
在土壤中的生物量生产：
将拟南芥种子播种在含营养缺乏土壤(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau,Wansdorf Germany)和砂的1:1(v/v)混合物的盆中。通过在4℃的黑暗中为期4天，诱导发芽。然后，在标准生长条件下(16h光照和8h黑暗，20℃，60％相对湿度，和200μE/m2s的光子通量密度)生长植物。生长和培养植物，特别是每隔一天用缺乏N的营养溶液浇灌。缺乏N的营养溶液含有例如底层水
| 矿物营养 | 终浓度 |
| KCl | 3.00mM |
| MgSO4x 7H2O | 0.5mM |
| CaCl2x 6H2O | 1.5mM |
| K2SO4 | 1.5mM |
| NaH2PO4 | 1.5mM |
| Fe-EDTA | 40μM |
| H3BO3 | 25μM |
| MnSO4x H2O | 1μM |
| ZnSO4x 7H2O | 0.5μM |
| Cu2SO4x 5H2O | 0.3μM |
| Na2MoO4x 2H2O | 0.05μM |
9-10天后，将植物单株化。在总时间为29-31天后，收获植物，并通过植物地上部分的鲜重评级。可以按各转基因植物和非转基因野生型植物的地上部分鲜重的比例，测量生物量的增加。
程序2：
可以如程序1实施程序2，然而，省略在琼脂平板上的筛选，在土壤上实施一个水平的筛选。
在整个所述应用过程中，参考各种出版物。所有这类出版物及所述出版物中引用的参考文献的公开内容都通过引用完整的整合到该申请中，从而更完整的描述本发明所属领域的现状。
也应该理解，前述内容涉及本发明的优选的实施方案，在不脱离本发明范围的条件下，可以在其中进行多种改变和变化。本发明还通过下列实例进行示例，而不视为以任何方式进行限制。相反，本领域技术人员可以明确的理解，在阅读本文的描述后，在不脱离本发明的本质和/或权利要求的范围的条件下，多种其他的实施方案、其修饰和等价体是不言自明的。
实施例1
通过表达本发明的基因改造拟南芥植物。
实施例1a
克隆如表I的5列所示的本发明的序列，用于在植物中表达。
除非另外说明，使用如Sambrook et al.,Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor 1989,Cold Spring HarborLaboratory Press中所述的标准的方法。
按Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)的规程所述，通过PCR扩增如表I的5列所示的本发明的序列。
用于Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶的规程的组合物如下：1x PCR缓冲液(Stratagene)、0.2mM的各种dNTP、100ng酿酒酵母的基因组DNA(菌株S288C；Research Genetics,Inc.,nowInvitrogen)、大肠杆菌(菌株MG1655；E.coli Genetic Stock Center)、集胞蓝细菌属(菌株PCC6803)、棕色固氮菌(菌株N.R.Smith,16)、嗜热栖热菌(HB8)或50ng来自拟南芥(ecotype Columbia)、小立碗藓、大豆(变种Resnick)或玉米(变种B73、Mo17、A188)的各个组织和发育阶段的cDNA、50pmol正向引物、50pmol逆向引物、有或无1M甜菜碱、2.5u Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶。
扩增循环如下：
94-95℃下2-3分钟，1个循环；然后，94-95℃下30-60秒、50-60℃下30-45秒和72℃下210-480秒，25-36个循环；然后，72℃下5-10分钟，1个循环；然后，4-16℃——优选用于酿酒酵母、大肠杆菌、集胞蓝细菌属、棕色固氮菌、嗜热栖热菌。
在拟南芥、甘蓝型油菜、大豆、水稻、小立碗藓、玉米的情况下，扩增循环如下：
94℃下30-60秒、61℃下30秒和72℃下15分钟，1个循环；
然后，94℃下30秒、60℃下30秒和72℃下15分钟，2个循环；
然后，94℃下30秒、59℃下30秒和72℃下15分钟，3个循环；
然后，94℃下30秒、58℃下30秒和72℃下15分钟，4个循环；
然后，94℃下30秒、57℃下30秒和72℃下15分钟，25个循环；
然后，72℃下10分钟，1个循环；
最后4-16℃。
用RNeasy Plant试剂盒，根据标准规程(Qiagen)产生RNA，并使用Supersript II逆转录酶根据标准规程(Invitrogen)生产标准cDNA。
待表达基因的ORF特异性引物对显示在表III的7列中。出于克隆的目的，向酿酒酵母ORF特异性引物中添加下列衔接子序列：
i)正向引物：5′-GGAATTCCAGCTGACCACC-3′
SEQ ID NO:1
ii)逆向引物：5′-GATCCCCGGGAATTGCCATG-3′
SEQ ID NO:2
这些衔接子序列允许将ORF克隆到含Resgen衔接子的多种载体中，见表VII的栏E。
出于克隆的目的，向酿酒酵母、大肠杆菌、集胞蓝细菌属、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、甘蓝型油菜或小立碗藓的ORF特异性引物中添加下列衔接子序列：
iii)正向引物：5′-TTGCTCTTCC-3′
SEQ ID NO:3
iiii)逆向引物：5`-TTGCTCTTCG-3′
SEQ ID NO:4
这些衔接子序列允许将ORF克隆到含Colic衔接子的多种载体中，见表VII的栏E。
因此，为了扩增和克隆酿酒酵母的SEQ ID NO:42，使用了由衔接子序列i)和ORF特异性序列SEQ ID NO:48组成的引物，以及由衔接子序列ii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:49组成的第二引物，或者由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:48组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:49组成的第二引物。
为了扩增和克隆大肠杆菌的SEQ ID NO:4068，使用了由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:4160组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:4161组成的第二引物。
为了扩增和克隆集胞蓝细菌属的SEQ ID NO:6041，使用了由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:6461组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:6462组成的第二引物。
为了扩增和克隆棕色固氮菌的SEQ ID NO:2553，使用了由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:3397组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:3398组成的第二引物。
为了扩增和克隆嗜热栖热菌的SEQ ID NO:6469，使用了由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:6735组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:6736组成的第二引物。
为了扩增和克隆拟南芥的SEQ ID NO:654，使用了由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:694组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:695组成的第二引物。
为了扩增和克隆甘蓝型油菜的SEQ ID NO:53，使用了由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:649组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:650组成的第二引物。
为了扩增和克隆小立碗藓的SEQ ID NO:5458，使用了由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:6038组成的引物，以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO:6039组成的第二引物。
根据这些实例，表I中优选5列中公开的每条序列，都可以通过融合衔接子序列与表III的7列公开的各自的特异性引物序列，使用表VI所示的各自的载体进行克隆。
表VII.用于克隆ORF的不同载体的概述。列举了它们的SEQ ID(栏A)、载体名称(栏B)、所含的用于表达ORF的启动子(栏C)、额外的人工靶向序列(栏D)、衔接子序列(栏E)、由栏C提及的启动子产生的表达类型(栏F)和图号(栏G)。
实施例1b)
构建进行蛋白质非靶向性表达的二元载体
“非靶向性”表达在上下文中意指没有向待表达的ORF添加任何额外的靶向序列。
为了优先在绿色组织中非靶向性表达，使用下列二元载体进行克隆：pMTX155、VC-MME220-1qcz和VC-MME221-1qcz。
为了优先在绿色组织中组成型表达来自酿酒酵母的ORF，在载体pMTX155中使用增强的35S(Big35S)启动子(Comai等，Plant Mol Biol15,373-383(1990))。
为了优先在绿色组织中组成型表达来自大肠杆菌的ORF，在载体VC-MME220-1qcz中使用人工启动子A(ocs)3AmasPmas(超级启动子)(Ni等，Plant Journal 7,661(1995),WO 95/14098)。
为了优先在绿色组织和种子中组成型表达，在载体VC-MME221-1qcz中对来自酿酒酵母、大肠杆菌、集胞蓝细菌属、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、甘蓝型油菜、大豆、水稻、小立碗藓或玉米的ORF使用来自欧芹的PcUbi启动子(Kawalleck等，Plant.Molecular Biology,21,673(1993),WO 2003/102198)。
实施例1c)
构建用于蛋白质的质体靶向性表达的二元载体
扩增来自菠菜(Spinacia oleracea)的FNR基因的质体靶向序列，和构建用于优先在绿色组织或优先在种子中质体靶向性表达的载体。
为了从扩增菠菜扩增FNR基因的靶向序列，从4周龄菠菜植株(DNeasy Plant Mini Kit,Qiagen,Hilden)的叶中提取基因组DNA。gDNA用作PCR的模板。
为了能够将转运序列克隆到载体VC-MME489-1QCZ中，将EcoRI限制性内切酶识别序列添加到正向和逆向引物中，而为了克隆到载体VC-MME220-1qcz和VC-MME221-1qcz中，将PmeI限制性内切酶识别序列添加到正向引物中，而将NcoI位点添加到逆向引物中。
FNR5EcoResgen ATA gAA TTC gCA TAA ACT TAT CTT CATAgT TgC C
SEQ ID NO:5
FNR3EcoResgen ATA gAA TTC AgA ggC gAT CTg ggC CCT
SEQ ID NO:6
FNR5PmeColic ATA gTT TAA ACg CAT AAA CTT ATC TTCATA gTT gCC SEQ ID NO:7
FNR3NcoColic ATA CCA Tgg AAg AgC AAg Agg CgA TCT gggCCC T
SEQ ID NO:8
所获得的从菠菜基因组DNA扩增的SEQ ID NO:28序列，包含5’UTR(bp 1-165)和编码区(bp 166-273和351-419)。编码序列bp 274至bp 350被内含子序列中断。
gcataaacttatcttcatagttgccactccaatttgctccttgaatctcctccacccaatacataatccactcctccatcaccc
acttcactactaaatcaaacttaactctgtttttctctctcctcctttcatttcttattcttccaatcatcgtactccgccatgaccac
cgctgtcaccgccgctgtttctttcccctctaccaaaaccacctctctctccgcccgaagctcctccgtcatttcccctgaca
aaatcagctacaaaaaggtgattcccaatttcactgtgttttttattaataatttgttattttgatgatgagatgattaatttgggt
gctgcaggttcctttgtactacaggaatgtatctgcaactgggaaaatgggacccatcagggcccagatcgcctct
(SEQ ID NO:28)
用EcoRI消化源于引物FNR5EcoResgen和FNR3EcoResgen的PCR片段，并连接到用EcoRI消化的载体VC-MME489-1QCZ中。通过测序测试方向正确的FNR靶向序列。在该连接步骤中产生的载体是VC-MME354-1QCZ。
用PmeI和NcoI消化源于引物FNR5PmeColic和FNR3NcoColic的PCR片段，并连接到用SmaI和NcoI消化的载体VC-MME220-1qcz和VC-MME221-1qcz中。在该连接步骤中产生的载体是VC-MME221-1qcz和pMTX447korrp。
为了优先在绿色组织中质体靶向的组成型表达，在载体VC-MME354-1QCZ中对来自酿酒酵母的ORF和在载体VC-MME432-1qcz中对来自大肠杆菌的ORF使用人工启动子A(ocs)3AmasPmas启动子(超级启动子)(Ni等，Plant Journal 7,661(1995)，WO 95/14098)，获得FNR靶向序列与ORF的“符合读框”融合。
为了优先在绿色组织和种子中质体靶向的组成型表达，在载体pMTX447korrp中对来自酿酒酵母、大肠杆菌、集胞蓝细菌属、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、甘蓝型油菜、大豆、水稻、小立碗藓或玉米的ORF使用PcUbi启动子，获得FNR靶向序列与ORF的“符合读框”融合。
实施例1d)
将如表I的5列和7所示的本发明序列克隆到不同的表达载体中。
为了将来自酿酒酵母的ORF克隆到含Resgen衔接子序列的载体中，用限制性内切酶NcoI处理各种载体DNA。为了将来自酿酒酵母的ORF克隆到含Colic衔接子序列的载体中，按照标准规程(MBI Fermentas)用限制性内切酶PacI和NcoI处理各种载体DNA。为了克隆来自大肠杆菌、集胞蓝细菌属、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、甘蓝型油菜、大豆、水稻、小立碗藓或玉米的ORF，按照标准规程(MBI Fermentas)用限制性内切酶PacI和NcoI处理载体DNA。在所有情况下，通过在70℃下灭活20分钟，来终止反应，并按照标准规程(Qiagen或Macherey-Nagel)用QIAquick或NucleoSpin Extract II柱进行纯化。
然后，根据标准规程(MBI Fermentas)，用T4DNA聚合酶处理代表所扩增的具有各自衔接子序列的ORF的PCR产物和载体DNA，产生单链悬臂，使用参数：载体为1单位T4DNA聚合酶，37℃下2-10分钟；代表的PCR产物为1-2u T4DNA聚合酶，15-17℃下10-60分钟。
通过添加高盐缓冲液终止反应，并按照标准规程(Qiagen或Macherey-Nagel)用QIAquick或NucleoSpin Extract II柱进行纯化。
根据该实施例，熟练的技术人员能够克隆表I中优选5列中公开的所有序列。
实施例1e)
植物转化
将约30-60ng的制备的载体和定义量的制备的扩增物混合，并如下杂交：在65℃15分钟，然后0.1℃/1秒至37℃，然后37℃下10分钟，然后按0.1℃/1秒至4-10℃。
将连接的构建体在相同的反应容器中转化，通过添加感受态的大肠杆菌细胞(菌株DH5α)，并在1℃孵育20分钟，然后在42℃热激90秒，并冷却至1-4℃。然后，添加完全培养基，在37℃孵育混合物45分钟。随后，将全部混合物置于含0.05mg/ml卡那霉素的琼脂平板上，37℃孵育过夜。
通过在引物帮助下扩增来验证克隆步骤的结果，所述引物结合于整合位点的上下游，从而允许扩增插入物。如Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)的规程所述，进行扩增。
扩增循环如下：
94℃下1-5分钟，1个循环；然后，每轮94℃下15-60秒、50-66℃下15-60秒和72℃下5-15分钟，35个循环；然后，72℃下10分钟，1个循环；然后，4-16℃。
检测一些克隆，但仅一个菌落检测出预期大小的PCR产物，用于下列步骤中。
将该阳性克隆的一部分转移到装有添加了卡那霉素的完全培养基(LB)的反应容器中，37℃孵育过夜。
按Qiaprep或NucleoSpin Multi-96Plus标准规程(Qiagen或Macherey-Nagel)中说明的，进行质粒制备。
产生转基因植物，所述植物表达SEQ ID NO:42或表I优选5列公开的任何其他序列。
通过电穿孔或转化转染进入菌株GV 3101pMP90(Koncz和Schell,Mol.Gen.Gent.204,383(1986))的根癌农杆菌感受态细胞，转化所分离的1-5ng的质粒DNA。然后，添加完全培养基(YFP)，并将混合物在28℃下转移到新鲜的反应容器中3小时。之后，将所有的反应混合物铺板至添加了各抗体的YEP琼脂平板上，例如利福平(0.1mg/ml)、庆大霉素(0.025mg/ml)和卡那霉素(0.05mg/ml)，在28℃孵育48小时。
然后，将含质粒构建体的农杆菌用于植物转化。
在移液器头的帮助下，从琼脂平板上挑取菌落，并放入3ml的液体TB培养基中，所述培养基也含有上述的合适抗生素。在28℃和120rpm下，生长预培养物48小时。
使用400ml含如上相同的抗生素的LB培养基进行主培养。将预培养物转移到主培养物中。在28℃和120rpm下，生长18小时。在4000rpm离心后，将细胞沉淀重悬在浸润培养基(MS培养基，10％蔗糖)中。
为了生长用于转化的植物，用GS 90底物(标准土壤，WerkverbandE.V.,Germany)半装满培养皿(Piki Saat 80，绿色，提供筛选底部，30x20x 4.5cm，购自Wiesauplast,Kunststofftechnik,Germany)。培养皿用0.05％Proplant溶液(Chimac-Apriphar,Belgium)处理过夜。将拟南芥C24种子(Nottingham Arabidopsis Stock Centre,UK；NASC Stock N906)散布在培养皿上，约1000粒种子/皿。用遮罩盖住培养皿，并置于层化装置中(8h，110μmol/m2s1，22℃；16h，黑暗，6℃)。5天后，将培养皿置于短日照环境控制室中(8h，130μmol/m2s1，22℃；16h，黑暗，20℃)，在其中保留约10天，直到形成第一真叶。
将幼苗移到含相同底物的盆(Teku盆，7cm，LC系列，由GmbH&Co,Germany生产)中。每个盆挑入5株植物。然后，将盆放回到短日照环境控制室中，使植物持续生长。
10天后，将植物转移到温室(补充光照，16h，340μE/m2s，22℃；8h，黑暗，20℃)中，使植物再生长17天。
为了转化，将刚开花的6周龄拟南芥植物浸入上述农杆菌悬浮液中10秒，所述农杆菌预先用10μl Silwett L77(Crompton S.A.,Osi Specialties,Switzerland)处理。所讨论的方法描述在Clough J.C.和Bent A.F.(Plant J.16,735(1998))中。
随后，将植物置于湿润室中18小时。其后，将盆放回温室中使植物继续生长。植物在温室中保留另外10周，直到可以收获种子。
根据用于选择转化植物的抗性标志物，将收获的种子种植在温室中并进行喷雾选择，或者首先灭菌，然后生长在添加了各种选择试剂的琼脂平板上。由于载体含有bar基因作为抗性标志物，则以2-3天的时间间隔，用0.02％喷雾小苗四次，允许转化的植物结籽。
将转基因拟南芥植物的种子储藏在冰箱(-20℃)中。
实施例2
用于生物分析检验的植物材料
为了转基因植物的生物分析检验，将后者一致的生长在特定的培养装置中。为此目的，将GS-90底物导入到上盆机器(Laible System GmbH,Singen,Germany)中，并装入盆中。其后，将35个盆组合到一个盘中，并用Proplant处理。为了处理，将15ml的Proplant装入10L自来水(0.15％溶液)中。该量足够进行约280盆的处理。将盆置入Proplant溶液中，额外的从头浇灌。210盆使用3L Proplant溶液(0.15％)。在5天内用完。
为了播种，将储藏在冰箱(-20℃)中的种子从Eppendorf管分散到盆中。总计约5-10粒种子分布在盆的中央。
在种子播种后，用匹配的塑料遮罩覆盖盆和盘，并置入层化室中4℃黑暗下4天。湿度约90％。在层化后，测试植物在20℃下，以16-h-光照、8-h-黑暗的节律生长22-23天，大气湿度为60％，CO2浓度为约400ppm。使用的光源是Osram的Powerstar HQI-T 250W/D日光灯，产生模拟太阳光光谱的光，具有光密度约220E/m2/s-1。
根据所使用的抗性标志物，选择转基因植物。在bar基因作为抗性标志物的情况下，在播种后8-10天用0.02％Bayer CropScience,Germany,Leverkusen喷雾小苗3次。当达到14天龄时，将抗性植物稀疏化(thinned)。认为在盆中心生长最好的植物是靶植物。在金属镊子的帮助下，仔细的去除所有的剩余植物并丢弃。
在生长过程中，植物接受蒸馏水的从头浇灌，并从底部灌溉到安置沟(placement groove)中。一旦生长的植物达到23或24天龄，则收获植物。
实施例3
转化植物的代谢分析
在上述代谢物的内容中，通过下列程序鉴别根据本发明鉴别的修饰：
a)样品的采样和储藏
在环境控制室中直接实施采样。使用小的实验室剪刀切断植物，在实验室天平是快速称重，移入预冷却的提取套筒(thimble)中，并置入通过液氮冷却的铝条(aluminum rack)中。需要时，可以在-80℃冰箱中储藏提取套筒。在切断植物至将其冷冻到液氮中的时间流逝共计不超过10-20秒。
b)冻干
在实验过程中，采取谨慎措施保证植物保持深度冷冻状态(温度<–40℃)或通过冻干而不含水分，直到第一次接触溶剂。
将提取套筒中的含植物样品的铝条置入预冷(-40℃)的冻干装置中。在主要的干燥相过程中起始温度是-35℃，压力是0.120mbar。在干燥相的过程中，按照压力和温度程序改变参数。12小时后，终温度是+30℃，终压力是0.001至0.004mbar。在关闭真空泵和冷冻机后，用空气(通过干燥管干燥)或氩气冲洗系统。
c)提取
在冲洗冻干装置后，立即将含冻干植物材料的提取套筒移入ASE仪器(Accelerated Solvent Extractor ASE 200,配备Solvent Controller和AutoASE software(DIONEX))的5ml提取盒(cartridges)中。
用植物样品装满ASE仪器(Accelerated Solvent Extractor ASE 200with Solvent Controller and AutoASE software(DIONEX))的24个样品位置，包括一些用作测试质量控制的样品。
用约10ml的甲醇/水(80/20，v/v)在T＝70℃和p＝140bar下，提取极性物质，5分钟加热相，1分钟静态提取。用约10ml的甲醇/二氯甲烷(40/60，v/v)在T＝70℃和p＝140bar下，提取更加亲脂的物质，5分钟加热相，1分钟静态提取。将2种溶剂化合物提取到同一玻璃管(离心管，50ml，配置有ASE(DIONEX)的螺旋盖和可穿刺的隔膜)中。
用可商购的内部标准处理溶液，例如核糖醇、L-甘氨酸-2,2-d2、L-丙氨酸-2,3,3,3-d4、甲硫氨酸-d3、精氨酸_(13C)、色氨酸-d5和α-甲基吡喃糖苷、和甲基十九碳酸、甲基十一碳酸、甲基十三碳酸、甲基十五碳酸和甲基二十九碳酸。
用8ml水处理总提取物。丢弃植物样品的固体残渣和提取套筒。
振荡提取物，然后在至少1400g下离心5-10分钟，从而加速相分离。移出1ml的上清液甲醇/水相(“极性相”，无色)用于进一步的GC检验，移出1ml用于LC检验。丢弃剩余的甲醇/水相。移出0.5ml的有机相(“脂相”，暗绿色)用于进一步的GC检验，移出0.5ml用于LC检验。使用IRDancer红外真空蒸发器(Hettich)，将所有移出的部分蒸发干燥。在蒸发过程中的最大温度不超过40℃。装置中的压力不低于10mbar。
d)加工脂相和极性相用于LC/MS或LC/MS/MS检验
移动相中摄取了已蒸发干燥的脂类提取物。移动相中摄取了已蒸发干燥的极性提取物。
e)LC-MS检验
在购自Agilent Technologies,USA的LCMS系统上进行LC部分。对于极性提取物，将10μl以200μl/min的流速注射到系统中。在层析过程中，将分离柱(Reversed Phase C18)维持在15℃。对于脂类提取物，将5μl以200μl/min的流速注射到系统中。将分离柱(Reversed Phase C18)维持在30℃。用梯度洗脱实施HPLC。
在有涡轮离子喷雾源的Applied Biosystems API 4000三重四极仪器上，实施质谱检验。对于极性提取物，仪器以MRM模式的阴离子模式和100-1000amu的全扫描模式进行测量。对于脂类提取物，仪器以MRM模式的阳离子模式和100-1000amu的全扫描模式进行测量。MS检验更详细的描述在专利公开号WO 03/073464(Walk和Dostler)中。
f)用于GC/MS检验的脂相衍生化
对于跨甲醇分析(transmethanolysis)，将140μl氯仿、37μl盐酸(在水中按重量计37％的HCL)、320μl甲醇和20μl甲苯的混合物添加到蒸干的提取物中。将容器紧密密封，并在100℃加热2小时，振荡。随后，将溶液蒸发干燥。彻底干燥残渣。
通过在紧密密封的容器中与甲氧基胺盐酸盐(在吡啶中5mg/ml，100μl，在60℃下1.5小时)反应，进行氨基的甲氧氨基化(methoximation)。添加20μl奇数的直链脂肪酸(7-25个碳原子的脂肪酸各0.3mg/mL和27、29和31个碳原子的脂肪酸各0.6mg/mL的3/7(v/v)吡啶/甲苯中的溶液)溶液作为时间标准。最后，仍在紧密密封的容器中，在60℃用100μl的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2,2,2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分钟。注射到GC中之前的终体积是220μl。
g)用于GC/MS检验的极性相衍生化
通过在紧密密封的容器中与甲氧基胺盐酸盐(在吡啶中5mg/ml，50μl，在60℃下1.5小时)反应，进行羧基的甲氧氨基化。添加10μl奇数的直链脂肪酸(7-25个碳原子的脂肪酸各0.3mg/mL和27、29和31个碳原子的脂肪酸各0.6mg/mL的3/7(v/v)吡啶/甲苯中的溶液)溶液作为时间标准。最后，仍在紧密密封的容器中，在60℃用50μl的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2,2,2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分钟。注射到GC中之前的终体积是110μl。
h)GC/MS检验
GC-MS系统包括偶联Agilent 5973MSD的Agilent 6890GC。自动点样仪是CTC的CompiPal或GCPal。检验使用普通的商业毛细管分离柱(30m x 0.25mm x 0.25μm)，含不同的聚甲基硅氧烷静态相，根据所分析的样品材料和相分离步骤的级分，含有0％至35％的芳香族部分(例如，DB-1ms、HP-5ms、DB-XLB、DB-35ms，Agilent Technologies)。
无分流的注射达1μl的终体积，炉温程序是起自70℃，终止于340℃，根据样品材料和相分离步骤的级分使用不同的加热速率，从而实现足够的色层分离以及每个分析物峰内足够的扫描数。使用普通的GC-MS标准条件，例如标定的1-1.7ml/min的恒定流速和使用氦气作为流动相气体。通过70eV的电子冲击进行电离，在15-600的m/z范围内扫描，扫描速率从2.5至3次扫描/sec，以及标准调频条件。
实施例4：来自转化植物的代谢分析的数据分析
i)以每系列20至21个植株或种子样品的单个系列(也称作序列)来测量样品，每个序列含有至少5株野生型植物或种子样品作为对照。种子样品来自单个植株。将每个分析物的峰面积除以各自的内部标准的峰面积。将植物或种子样品已确定的鲜重数据分别归一化。将由此计算的数值关联到野生型对照组，通过除以相同序列的野生型对照组的相应数值的均值进行。所获得的值称作ratio_by_WT，它们在序列之间是可比较的，表示变体中的分析物浓度相对于野生型对照有多大的差别。之前已进行了适当的对照，证实载体和转化程序本身对植物的代谢组成没有显著的影响。因此，相比野生型，所述改变是由导入的基因构建体引起的。每个构建体在2次独立的实验中分析了至少3-5个独立的品系。
表VIII.在转基因拟南芥中的GABA增加(ratio_by_WT)。
实施例5
通过表达来自酿酒酵母、大肠杆菌或其他生物体的本发明的核酸，改造具有增加的精细化学品生产的苜蓿植物。
使用McKersie等，Plant Physiol 119,839(1999)的方法，转化苜蓿(Medicago sativa)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生的植株。已描述过获得再生植株的方法。例如，可以选自栽培种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown D.C.W.和AtanassovA.(Plant Cell Tissue Organ Culture 4,111(1985))所述的任何其他商业的苜蓿变种。可选的，选择RA3变种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等，Am.J.Bot.65,654(1978))。
将叶柄外植体与含二元载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，Plant Physiol 119,839(1999))的过夜培养物或LBA4404共培养。已描述过许多用于植物转化的不同的二元载体系统(例如，An G.,inAgrobacterium Protocols,Methods in Molecular Biology，第44卷，第47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编著，Humana Press,Totowa,NewJersey)。许多都是基于Bevan(Nucleic Acid Research.12,8711(1984))描述的载体pBIN19，所述载体包括植物基因表达盒，侧翼是来自根癌农杆菌的Ti质粒的左边界和右边界序列。植物基因表达盒包含至少2个基因——选择标志物基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA的转录的植物启动子。可以使用多种选择标志物基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。相似的，可以使用多种启动子来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，使用34S启动子(Genbank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
将外植体在黑暗中在含288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2SO4和100μm乙酰紫丁香苷(acetosyringinone)的SH诱导培养基上共培养3天。在一半强度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog,1962)中洗涤外植体，并种植在相同的SH诱导培养基，所述培养基不含乙酰紫丁香苷但含合适的选择试剂和合适的抗生素，来抑制农杆菌生长。若干周后，将体细胞胚移至不含任何生长调节剂、抗生素且含50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基上。随后，体细胞胚在一半强度的Murashige-Skoog培养基上发芽。将生根的幼苗移植到盆中，并在温室中生长。
生产T1或T2代的种子植物，并进行与上述相似的实验，确定它们相比各自的对照材料的精细化学品含量。
实施例6
通过表达来自酿酒酵母、大肠杆菌或其他生物体的本发明的核酸，改造具有增加的精细化学品生产的黑麦草植物。
可以使用一些不同的黑麦草变种的种子作为转化的外植体源，包括可购自Weibull种子公司的商业变种Gunne或变种Affinity。在1％Tween-20中1分钟、100％漂白剂中60分钟顺序将种子表面消毒，每次用去离子化和蒸馏的H2O漂洗3次，每次5分钟，然后在黑暗中湿润无菌的滤纸上发芽3-4天。幼苗进一步用1％Tween-20消毒1分钟，75％漂白剂消毒5分钟，并用dd H2O漂洗3次，每次5分钟。
将表面消毒的种子置于愈伤组织诱导培养基上，所述培养基含有Murashige和Skoog基础盐分和维生素、20g/L蔗糖、150mg/L天冬酰胺、500mg/L酪蛋白水解物、3g/L Phytagel、10mg/L BAP和5mg/L麦草畏(dicamba)。平板在25℃下黑暗中孵育4周，进行种子发芽和胚性愈伤组织诱导。
在愈伤组织诱导培养基上4周后，将幼苗的茎和根截短，将愈伤组织移至新鲜基质上，再维持培养4周，然后，转移至MSO培养基上，光照2周。一些愈伤组织(11-17周龄)片或者通过10目(mesh)筛过滤并置于愈伤组织诱导培养基上，或者在250ml烧瓶中培养在100ml的液体黑麦草愈伤组织诱导培养基中(与含琼脂的愈伤组织诱导相同的培养基)。摇瓶包裹在锡箔纸中，并在23℃的黑暗中175rpm振荡1周。用40目得筛过滤液体培养物，收集细胞。种植在筛上收集的级分，并23℃的黑暗中在黑麦草愈伤组织固体诱导培养基上培养1周。然后，将愈伤组织转移并培养在含1％蔗糖的MS培养基上2周。
可以用农杆菌或颗粒轰击方法实现转化。在pUC载体中创制含有组成型植物启动子和基因的cDNA的表达载体。根据生产商的说明，使用Qiagen试剂盒从大肠杆菌锡箔制备质粒DNA。将约2g的胚性愈伤组织分散在Petri培养皿的无菌滤纸的中心。将含10g/L蔗糖的等份的液体MSO添加到滤纸上。根据Sanford等，1993的方法，用质粒DNA包被金颗粒，并用下列参数递送至胚性愈伤组织上：每枪500μg颗粒和2μg DNA，1300psi，从停止板至愈伤组织板为8.5cm的靶距离，和每个平板的愈伤组织1枪。
在轰击后，将愈伤组织移回新鲜的愈伤组织发育培养基上，并在室温的黑暗中维持1周的时期。然后，将愈伤组织移至光照下25℃的生长条件下，用适当的选择试剂启动胚分化，例如250nM Arsenal、5mg/L PPT或50mg/L卡那霉素。茎出现对选择试剂的抗性，一旦生根则移至土壤。
通过PCR分析初代转基因植物(T0)的样品，验证T-DNA的存在。通过Southern杂交验证这些结果，在所述杂交中，DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移至正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。使用PCRDIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)，通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并按照生产商的推荐使用。
通过切除分蘖营养繁殖转基因T0黑麦草植物。将移植的分蘖维持在温室中2个月，直到良好的建系。使芽脱落并允许生长2周。
生产T1或T2代的种子植物，并进行与上述相似的实验，确定它们相比各自的对照材料的精细化学品含量。
实施例7
通过表达来自酿酒酵母、大肠杆菌或其他生物体的本发明的核酸，改造具有增加的精细化学品生产的大豆植物。
根据Texas A&M的专利US 5,164,310所述方法的下列修饰，转化大豆。一些可商购的大豆变种是易于用该方法转化的。栽培种Jack(可购自Illinois Seed Foundation)是常规用于转化的。种子通过在70％(v/v)乙醇中浸泡6min，和在添加了0.1％(v/v)Tween的25％商业漂白剂(NaOCl)中浸泡20min，来消毒种子，然后用无菌的双蒸水漂洗4次。通过从每株幼苗上去除幼根、下胚轴和一片子叶，繁殖7天的幼苗。然后，将带有1片子叶的上胚轴移至petri培养皿中的新鲜的发芽基质上，并在25℃的16-h光周期(约100μE/m2s)下孵育3周。从3-4周龄的植物上切断腋节(长度约4mm)。切出腋节并在农杆菌LBA4404的培养物中孵育。
已描述了许多不同的二元载体系统用于植物转化(例如，An G.,inAgrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology，第44卷，第47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编著，Humana Press,Totowa,NewJersey)。许多都是基于Bevan(Nucleic Acid Research.12,8711(1984))描述的载体pBIN19，所述载体包括植物基因表达盒，侧翼是来自根癌农杆菌的Ti质粒的左边界和右边界序列。植物基因表达盒包含至少2个基因——选择标志物基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA的转录的植物启动子。可以使用多种选择标志物基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。相似的，可以使用多种启动子来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，使用34S启动子(Genbank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
在共培养处理后，洗涤外植体，并移至添加了500mg/L特美汀(timentin)的选择培养基中。切出茎并置于茎延长培养基上。在移植到土壤中之前，将长于1cm的茎置于生根培养基上2至4周。
通过PCR分析初代转基因植物(T0)的样品，验证T-DNA的存在。通过Southern杂交验证这些结果，在所述杂交中，DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移至正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。使用PCRDIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)，通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并按照生产商的推荐使用。
生产T1或T2代的种子植物，并进行与上述相似的实验，确定它们相比各自的对照材料的精细化学品含量。
实施例8
通过表达来自酿酒酵母、大肠杆菌或其他生物体的本发明的核酸，改造具有增加的精细化学品生产的油菜/芥菜植物。
将5-6天龄的幼苗的带柄子叶和下胚轴用作外植体，用于根据Babic等(Plant Cell Rep 17,183(1998))的组织培养和转化。商业栽培种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准变种，但可以使用其他变种。
含二元载体的根癌农杆菌LBA4404可用于芥菜转化。已描述了许多不同的二元载体系统用于植物转化(例如，An G.,in Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology，第44卷，第47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编著，Humana Press,Totowa,New Jersey)。许多都是基于Bevan(Nucleic Acid Research.12,8711(1984))描述的载体pBIN19，所述载体包括植物基因表达盒，侧翼是来自根癌农杆菌的Ti质粒的左边界和右边界序列。植物基因表达盒包含至少2个基因——选择标志物基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA的转录的植物启动子。可以使用多种选择标志物基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。相似的，可以使用多种启动子来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，使用34S启动子(Genbank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
就芥菜种子在70％乙醇中表面消毒2min，然后在含1滴Tween-20的30％Clorox中消毒10min，然后用消毒的蒸馏水漂洗3次。然后，在23℃，16h光照下，种子在不含激素、含1％蔗糖、0.7％植物琼脂的一半强度的MS培养基上体外发芽5天。从体外幼苗上切除附着了子叶的带柄子叶外植体，并通过将叶柄外植体的切口端浸泡在细菌悬浮液中，用农杆菌接种。然后，在23℃，16h光照下，将外植体在含3mg/L BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2天。在与农杆菌共培养2天后，将叶柄外植体移至含3mg/L BAP、氨噻肟头孢菌素、羧苄青霉素或特美汀(300mg/L)的MSBAP-3培养基上7天，然后在含氨噻肟头孢菌素、羧苄青霉素或特美汀和选择试剂的MSBAP-3培养基上培养直到茎再生。当茎的长度是5-10mm时，将它们切断并移至茎延长培养基(含0.5mg/L BAP的MSBAP-0.5)上。将长度约2cm的茎移至生根培养基(MSO)上进行根诱导。
通过PCR分析初代转基因植物(T0)的样品，验证T-DNA的存在。通过Southern杂交验证这些结果，在所述杂交中，DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移至正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。使用PCRDIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)，通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并按照生产商的推荐使用。
生产T1或T2代的种子植物，并进行与上述相似的实验，确定它们相比各自的对照材料的精细化学品含量。
实施例9
通过表达来自酿酒酵母、大肠杆菌或其他生物体的本发明的核酸，改造具有增加的精细化学品生产的玉米植物。
通过Ishida等(Nature Biotech 14745(1996))描述的方法的修饰，实施玉米(Zea Mays L.)的转化。在玉米中，转化是基因型依赖的，仅特定的基因型易于转化和再生。近亲繁殖系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是转化的供体材料的良好来源(Fromm等，Biotech 8,833(1990))，但也可以成功的使用其他基因型。在授粉(DAP)后约11天，当未成熟的胚约1至1.2mm长时，从玉米植株收获叶耳(ear)。将未成熟的胚与携带“超级二元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生恢复转基因植物。日本烟草的超级二元载体描述在WO专利WO 94/00977和WO 95/06722中。按所述构建载体。可以使用多种选择标志物基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6,025,541)。相似的，可以使用多种启动子来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，使用34S启动子(Genbank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
切出的胚生长在愈伤组织诱导培养基上，然后在含咪唑啉酮作为选择试剂的玉米再生培养基上。将Petri平板在光下25℃孵育2-3周，或直到茎发育。将绿色的茎从每个胚移至玉米生根培养基，并在25℃孵育2-3周，或直到根发育。将生根的茎移至温室内的土壤中。从表现出对咪唑啉酮除草剂耐受且转基因是PCR阳性的植物生产T1种子。
然后，根据实施例3所述方法，评估T1转基因植物的增强的NUE和/或增加的生物量生产。T1代的T-DNA单基因座插入可以以3:1的比例分离转基因。含有一份或两份转基因拷贝的那些后代是对咪唑啉酮除草剂耐受的，并且比那些缺少转基因的后代表现出NUE的增强和/或增加的生物量生产。
生产T1或T2代的植物，并进行与WO 2006092449的实施例15c所述相似的实验，确定它们相比各自的对照材料的精细化学品含量。
实施例10
通过表达来自酿酒酵母、大肠杆菌或其他生物体的本发明的核酸，改造具有增加的精细化学品生产的小麦植物。
通过Ishida等(Nature Biotech 14745(1996))描述的方法实施小麦的转化。栽培种Bobwhite(可购自CYMMIT,Mexico)是常规用于转化的。将未成熟的胚与携带“超级二元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生恢复转基因植物。日本烟草的超级二元载体描述在WO专利WO94/00977和WO 95/06722中。按所述构建载体。可以使用多种选择标志物基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6,025,541)。相似的，可以使用多种启动子来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，使用34S启动子(Genbank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
在用农杆菌孵育后，将胚生长在愈伤组织诱导培养基上，然后在含咪唑啉酮作为选择试剂的再生培养基上。将Petri平板在光下25℃孵育2-3周，或直到茎发育。将绿色的茎从每个胚移至生根培养基，并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的茎移至温室内的土壤中。从表现出对咪唑啉酮除草剂耐受且转基因是PCR阳性的植物生产T1种子。
生产T1或T2代的种子植物，并进行与上述相似的实验，确定它们相比各自的对照材料的精细化学品含量。
实施例11
通过表达来自酿酒酵母、大肠杆菌或其他生物体的本发明的核酸，改造具有增加的精细化学品生产的水稻植物。
水稻转化：
将含表达载体的两株农杆菌菌株独立的用于转化水稻植株。粳稻栽培种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，然后在0.2％HgCl2中孵育30分钟进行灭菌，再用无菌的蒸馏水洗涤6次各15分钟。然后，无菌的种子在含2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上发芽。在黑暗中孵育4周后，切出胚性的、盾片来源的愈伤组织，并在相同的培养基上增殖。2周后，愈伤组织倍增，或在相同的培养基上亚培养再增殖2周。在共培养前，将胚性的愈伤组织片在新鲜的培养基上亚培养3天。
根据所选择的表达载体，使用含表达载体的农杆菌菌株LB4404或其他有效的农杆菌菌株进行共培养。将农杆菌接种在含适当的抗生素的AB培养基(EXPLAIN)上，并在28℃培养3天。然后，收集细菌，并悬浮在液体共培养培养基中，密度OD600约为1。然后，将悬浮液移至Petri皿中，并将愈伤组织浸泡在悬浮液中15分钟。然后，将愈伤组织点干(bolotted dry)在滤纸上，并移至固化的共培养培养基上，在25℃黑暗中孵育3天。共培养的愈伤组织在含2,4-D的培养基上生长，在存在选择试剂的条件下，在28℃黑暗中4周，所述选择试剂取决于所使用载体的抗性标志物。在该过程中，快速生长的抗性愈伤组织发育。在将该此类移至再生培养基上，并在光下孵育，释放胚性潜能，并在接下来的4至5周内发育茎。从愈伤组织切出茎，并在含生长素的培养基上孵育2至3周，而后从中转移至土壤。在温室中，将变硬的茎生长在高湿度和短日照下。
在定量PCR检验验证了拷贝数和T-DNA插入物后，仅保留表现出对选择试剂耐受性的单拷贝转基因植物，来收获T1种子。然后，在移植3至5个月后，收获种子。然后，使用来自各独立品系的种子或植物分析精细化学品含量。
实施例12
鉴别相同和异源的基因
可以使用基因序列来鉴别cDNA或基因组文库的相同或异源的基因。可以使用例如cDNA文库，通过核酸杂交分离相同的基因(例如，全长cDNA克隆)。根据目的基因的丰度，种植100,000至1,000,000个重组细菌噬菌体，并移至尼龙膜上。在用碱变性后，通过例如UV交联，将DNA固定在膜上。在高严格条件下进行杂交。在水性溶液中，在1M NaCl的离子强度和68℃的温度下实施杂交和洗涤。通过例如放射性同位素(32P)缺口平移(nick transcription)标记(High Prime,Roche,Mannheim,Germany)产生杂交探针。通过放射自显影检测信号。
可以以类似上述程序的方式，使用低严格杂交和洗涤条件，鉴别相关但不同的部分相同或异源的基因。对于水性杂交，离子强度通常保持在1MNaCl，而温度从68℃逐渐降低至42℃。
可以使用合成的放射性标记的寡核苷酸探针，进行只在特殊的结构域(例如，10-20个氨基酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列的分离。通过用T4多核苷酸激酶在两条互补的寡核苷酸的5-末端磷酸化，来制备放射性标记的寡核苷酸。将互补的寡核苷酸退火，并连接形成连环体(concatemer)。然后，通过例如缺口平移(nick transcription)，放射性标记双链连环体。通常使用高的寡核苷酸浓度，在低严格条件下实施杂交。
寡核苷酸杂交溶液：
6x SSC
0.01M磷酸钾
1mM EDTA(pH 8)
0.5％SDS
100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA
0,1％脱脂奶粉
在杂交过程中，温度是逐步降低至低于估计的寡核苷酸Tm 5-10℃，或降至室温，然后进行洗涤步骤和放射自显影。用低严格度实施洗涤，例如使用4x SSC进行3次洗涤步骤。其他细节描述在Sambrook J.等，1989,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel F.M.等，1994,“Current Protocols inMolecular Biology,”John Wiley&Sons中。
实施例13
通过用抗体筛选表达文库鉴别相同的基因
可以使用cDNA克隆在例如大肠杆菌中生产重组多肽(例如QiagenQIAexpress pQE系统)。然后，通常通过Ni-NTA亲和层析(Qiagen)亲和纯化重组多肽。然后，重组多肽用于生产特异性抗体，例如通过使用标准技术免疫兔子。抗体是使用用重组抗原饱和的Ni-NTA柱亲和纯化的，如Gu等，BioTechniques 17,257(1994)所述。然后，可以使用抗体通过免疫筛选筛选表达cDNA文库，鉴别相同或异源的基因(Sambrook,J.等，1989,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel,F.M.等，1994,“Current Protocols inMolecular Biology”,John Wiley&Sons)。
实施例14
体内诱变
可以通过大肠杆菌或其他微生物(例如，芽孢杆菌或酵母如酿酒酵母)将质粒(或其他载体)DNA传代来实施微生物的体内诱变，所述微生物维持其遗传信息完整性的能力受损。典型的诱变菌株在DNA修复系统的基因中具有突变(例如，mutHLS、mutD、mutT等；关于参考文献，参见Rupp W.D.,DNA repair mechanisms,in:Escherichia coli and Salmonella，第2277-2294页，ASM,1996,Washington)。此类菌株是本领域技术人员普遍已知的。例如Greener A.和Callahan M.,Strategies 7,32(1994)中示例了此类菌株的使用。优选在微生物中选择和测试后，将突变的DNA分子转移到植物中。根据该文件的范例中的各种实例，产生转基因植物。
实施例15
在有限的氮供应的条件下，筛选植物(拟南芥)的生长
使用具有增加的多肽活性的植物，所述多肽在表IX和X的栏SEQ IDNO:或位置中提及。
使用两种不同的程序进行筛选：
程序1：
在琼脂平板上的生物量生产：
为了筛选转基因植物，使用了特殊的培养装置。出于高通量的目的，在氮供应有限的琼脂平板(从Estelle和Somerville,1987改造的)上，筛选植物的生物量生产。该筛选管道由2个水平组成。如果相比野生型植物，生物量生产显著改善，则将转基因品种投入后续水平。每个水平都增加重复数和统计严格度。
关于播种，在牙签的帮助下，将种子从Eppendorf管中移出，并转移到上述琼脂平板上，具有有限的氮供应(0.05mM KNO3)。每个平板(12x 12cm)上可以水平的分布总计约15-30颗种子。
在播种种子后，将平板在4℃下的黑暗中层化2-4天。层化后，测试平板在20℃下以16-h-光照、8-h-黑暗的节律生长22-25天，大气湿度为60％，CO2浓度为约400ppm。所使用的光源产生模拟太阳光光谱的光，光密度为约100μE/m2s。在10-11天后，将植物单株化。在生长20-25天后，通过比较转基因植物和野生型对照植物的茎和根的生物量生产来评估在氮受限条件下的生长改善。
将相比野生型植物，表现出显著改善的生物量生产的转基因品种进行后续水平的下列实验：
将拟南芥种子播种在含营养缺乏土壤(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau,Wansdorf Germany)和砂的1:1(v/v)混合物的盆中。通过在4℃的黑暗中为期4天，诱导发芽。然后，在标准生长条件下(16h光照和8h黑暗，20℃，60％相对湿度，和200μE/m2s的光子通量密度)生长植物。生长和培养植物，特别是每隔一天用缺乏N的营养溶液浇灌。缺乏N的营养溶液含有例如底层水
9-10天后，将植物单株化。在总时间为29-31天后，收获植物，并通过植物地上部分的鲜重评级。表IX总结了上述结果。可以按各转基因植物和非转基因野生型植物的地上部分鲜重的比例，测量生物量的增加。
表IX：生长在有限的氮供应的条件下(增加的NUE)的转基因拟南芥的生物量生产
| seq ID | 靶向 | 位置 | 生物量增加 |
| 42 | 细胞质 | YMR052W | 1.24 |
| 7137 | 细胞质 | YBR159W | 1.38 |
| 8227 | 细胞质 | YLR395C | 1.56 |
程序2：
可以如程序1实施程序2，然而，省略在琼脂平板上的筛选，在土壤上实施一个水平的筛选。每个转基因构建体测试4个独立的转基因品系(＝事件)(16株植物/构建体)。表X总结了上述结果。
表X：生长在有限的氮供应的条件下(增加的NUE)的转基因拟南芥的生物量生产。按各转基因植物和非转基因野生型植物的地上部分鲜重的比例，测量生物量的增加。
实施例16
在标准化的生长条件下，筛选植物的产量增加
在该实验中，在缺少主要的非生物胁迫的标准生长条件下，对植物实施产量增加(在此情况下，生物量产量的增加)的筛选。在标准实验中，按富含营养物的土壤(GS90,Tantau,Wansdorf,Germany)和石英砂为3.5:1(v/v)的混合物制备土壤。可选的，在富含营养物的土壤(GS90,Tantau,Germany)上生长植物。用土壤混合物装满盆，并置入盘中。向盘中加水，使土壤混合物摄取对播种程序合适量的水。在盆(6cm直径)中播种转基因拟南芥植物及其非转基因野生型对照的种子。然后，用透明的遮罩覆盖装满的盘子，并移入预冷(4℃-5℃)和黑暗的生长室中。在4℃-5℃的黑暗中建立层化3-4天。在20℃、约60％相对湿度、16h光周期和约200μmol/m2s照明的生长条件下启动种子的发芽和生长。播种7-8天后去除盖子。在第10或11天(播种后9或10天)，通过从顶部喷雾有幼苗的盆，进行BASTA选择。在标准实验中，用在自来水中0.07％(v/v)的BASTA浓度的溶液(183g/l草胺磷)喷雾1次，可选的，用0.02％(v/v)的BASTA喷雾3次。野生型对照植物只用自来水喷雾(而非用溶解了BASTA的自来水喷雾)，但其它处理均相同。在播种后13-15天，通过去除多余的幼苗并在土壤中留下一株幼苗，将植物个体化。
在标准实验中移除盖子后，每隔1天进行浇灌，或可选的，每天进行。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后24-29天；层化后20-26天)通过切断茎并称重，确定植物鲜重。通常，当收获时，植物处于开花之前和花序生长之前的阶段。将转基因植物与相同年龄、生长在相同的培养装置和同天收获的非转基因野生型对照植物进行比较。
表XI：生长在标准化的生长条件下的转基因拟南芥的生物量生产。
通过称重植物莲座，测量生物量生产。按同一实验的转基因植物均重与野生型对照植物均重的比例计算生物量增加。可选的，按转基因植物的重量中位数与野生型对照植物的重量中位数的比例计算生物量增加。
相比对照植物，含所示SeqID的转基因植物显示了生物量增加10％或更多，具有双侧T检验的p-值低于0.1。
实施例17
在循环干旱的条件下，筛选植物生长
在循环干旱测定中，在不导致脱水的条件下，向植物施用重复的胁迫。在标准实验中，按富含营养物的土壤(GS90,Tantau,Wansdorf,Germany)和石英砂为1:1(v/v)的混合物制备土壤。用土壤混合物装满盆(6cm直径)，并置入盘中。向盘中加水，使土壤混合物摄取对播种程序(第1天)合适量的水，随后，在盆中播种转基因拟南芥植物及其野生型对照的种子。然后，用透明的遮罩覆盖装满的盘子，并移入预冷(4℃-5℃)和黑暗的生长室中。在4℃-5℃的黑暗中建立为期3天的层化，或者可选的，在4℃的黑暗中为期4天。在20℃、60％相对湿度、16h光周期和约200μmol/m2s照明的生长条件下启动种子的发芽和生长。播种7-8天后去除盖子。在第10或11天(播种后9或10天)，通过从顶部喷雾有幼苗的盆，进行BASTA选择。在标准实验中，用在自来水中0.07％(v/v)的BASTA浓度的溶液(183g/l草胺磷)喷雾1次，可选的，用0.02％(v/v)的BASTA喷雾3次。野生型对照植物只用自来水喷雾(而非用溶解了BASTA的自来水喷雾)，但其它处理均相同。在播种后13-14天，通过去除多余的幼苗并在土壤中留下一株幼苗，将植物个体化。转基因事件和野生型对照植物均匀的分布在整个室中。
在整个实验过程中，水供应是有限的，植物经历干旱和再浇灌的循环。在第1天(播种前)、第14天或第15天、第21天或第22天和最后，第27天或第28天，进行浇灌。关于测量生物量生产，在最后一次浇灌(第28天或第29天)后一天，通过切断茎并称重，确定植物鲜重。通常，当收获时，植物处于开花之前和花序生长之前的阶段。通过应用student’s T检验(参数：双侧，不等方差)，计算生物量改变的统计学显著性的显著值。
在连续的实验水平每个转基因构建体测试多达5个品系(事件)。将相比野生型植物表现出增加的生物量生产的转基因品系进行下一个实验水平。通常，在第一个水平每个构建体测试5株植物，在之后的水平测试14-40株植物。如上述评估生物量性能。表XII显示了水平3的数据。
表XII：在循环干燥的生长条件下发育的转基因拟南芥的生物量生产。
通过称重植物莲座，测量生物量生产。按同一实验的转基因植物均重与野生型对照植物均重的比例计算生物量增加。给出了转基因构建体的平均生物量增加(显著值<0.05)。
实施例18
在低温条件下，筛选植物的生长
在标准实验中，按富含营养物的土壤(GS90,Tantau,Wansdorf,Germany)和砂为3.5:1(v/v)的混合物制备土壤。用土壤混合物装满盆，并置入盘中。向盘中加水，使土壤混合物摄取对播种程序合适量的水。在盆(6cm直径)中播种转基因拟南芥植物的种子。在4℃-5℃的黑暗中建立层化3天。在20℃、约60％相对湿度、16h光周期和150-200μmol/m2s荧光照明的生长条件下启动种子的发芽和生长。播种后第9天，通过从顶部喷雾有幼苗的盆，进行BASTA选择。因此，用在自来水中0.07％(v/v)的BASTA浓度的溶液(183g/l草胺磷)喷雾。野生型对照植物只用自来水喷雾(而非用溶解了BASTA的自来水喷雾)，但其它处理均相同。在从盘子去除盖子后，每隔1天进行浇灌。在播种后12-13天，通过去除多余的幼苗并在土壤中留下一株幼苗，将植物个体化。在播种后14-16天，施加寒冷(冷却至11℃-12℃)，直到实验结束。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后35-37天)通过切断茎并称重，确定植物鲜重。通常，当收获时，植物处于开花之前和花序生长之前的阶段。将转基因植物与同天收获的非转基因野生型对照植物进行比较。通过应用student’s T检验(参数：双侧，不等方差)，计算生物量改变的统计学显著性的显著值。
在2至3个后续的实验水平每个转基因构建体测试多达5个品系。只将相比野生型植物表现出阳性性能的构建体进行下一个实验水平。在最后一个水平测试20-28株植物。如上述评估生物量性能。数据显示在至少2个连续的实验水平都表现出增加的生物量性能的构建体。
表XIII：在承受寒冷胁迫后，转基因拟南芥的生物量生产。
通过称重植物莲座，测量生物量生产。按同一实验的转基因植物均重与野生型对照植物均重的比例计算生物量增加。给出了转基因构建体的平均生物量增加(显著值<0.3而生物量增加>5％(比例>1.05))。
附图
图1.用于克隆目的基因进行非靶向性表达的载体VC-MME220-1qcz(SEQ ID NO:35)。
图2.用于克隆目的基因进行非靶向性表达的载体VC-MME221-1qcz(SEQ ID NO:38)。
图3.用于克隆目的基因进行质体靶向性表达的载体VC-MME354-1QCZ(SEQ ID NO:31)。
图4.用于克隆目的基因进行质体靶向性表达的载体VC-MME432-1qcz(SEQ ID NO:36)。
图5.用于克隆目的基因进行非靶向性表达的载体pMTX155(SEQ IDNO:30)。
图6.用于质体靶向性表达的载体pMTX447korr(SEQ ID NO:39)。
图7.用于克隆目的基因进行非靶向性表达和克隆靶向序列的载体VC-MME489-1QCZ(SEQ ID NO:41)。
Claims (8)
1.通过增加或产生一种或多种以下活性生产转基因细胞的方法，所述转基因细胞与相应的未转化的野生型细胞相比具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量，所述活性选自：60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，其中增加或产生至少一种包含选自以下的核酸分子的核酸分子的表达：
a)编码表II的栏5或7中显示的多肽的核酸分子；
b)表I的栏5或7中显示的核酸分子；
c)核酸分子，其由于遗传密码简并性的结果，源自表II的栏5或7所述的多肽序列，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量；
d)与包含表I的栏5或7所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量的核酸分子；
编码这样的多肽的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并具有由包含表I的栏5所述多核苷酸的核酸分子表示的活性，且与相应的未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，产生增加的GABA含量。
2.根据权利要求1的方法，其中转基因植物细胞、植物或其部分源自单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。
3.根据权利要求1的方法，其中转基因植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜(oil seed rape)、包括芥菜和冬油菜(winter oil seed rape)、玉米(corn)、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻籽、报春花、油菜籽、球茎甘蓝(turnip rape)、万寿菊、茄科植物、土豆、烟草、茄子、番茄、蚕豆属、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属、油棕、椰子、多年生草、饲料作物和拟南芥。
4.包含一个或多个调控元件的核酸构建体，其产生权利要求1(a)-(e)所定义的核酸分子的表达。
5.包含权利要求1(a)-(e)所定义的的核酸分子或权利要求4的核酸构建体的载体。
6.细菌宿主细胞，其已用权利要求5所述的载体或权利要求1(a)-(e)所定义的核酸分子或权利要求4的核酸构建体稳定或瞬时转化。
7.编码具有以下活性的多肽的核酸分子的用途，所述活性选自60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，用于制备与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的细胞，优选植物细胞。
8.编码具有以下活性的多肽的核酸分子的用途，所述活性选自60S核糖体蛋白、ABC转运子透性酶蛋白、乙酰转移酶、酰基载体蛋白、At4g32480-蛋白、At5g16650-蛋白、ATP结合蛋白、自噬作用相关蛋白、生长素应答因子、生长素转录因子、b1003-蛋白、b1522-蛋白、b2739-蛋白、b3646-蛋白、B4029-蛋白、支链氨基酸透性酶、钙依赖性蛋白激酶、细胞色素C氧化酶VIII亚基、延伸因子Tu、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、葡萄糖脱氢酶、糖基转移酶、Harpin诱导性家族蛋白、高柠檬酸合酶、水解酶、异分支酸合酶、MFS型转运子蛋白、微体β-酮还原酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白磷酸酶、丙酮酸激酶、Sec非依赖性蛋白质转位酶亚基、丝氨酸蛋白酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白家族蛋白、转录调节子、泛醌生物合成单加氧酶和YHR213W-蛋白，作为标志物用于植物或植物细胞的选择，所述植物或植物细胞与相应的未转化的野生型相比，具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量。
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