JPH04506155A - 初期種子形成において優先的に発現される新規配列およびそれに関連する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 初期種子形成において優先的に発現される新規配列およびそれに関連する方法 本発明は、種子組織転写を指令することができる新規試験管内作製ＤＮＡ発現カ セットに関する。本発明は、アブラナ属の植物における種子組織転写において有 用なプロモーターにより例示される。

！貝 植物成長の特定の段階でまたは特定の植物組織中で遺伝子発現を調節できること が、遺伝子工学においてしばしば所望される。これを達成するためには、植物成 長周期の所望の段階で所望の組織において転写を開始するであろう核酸配列が必 要である。この関心の１つの応用は種子組織の表現型を変えること、例えばタン パク質組成、油組成、栄養価等を変えることができることである。

有用な核酸配列を単離するために、所望の組織には存在するが他の組織には存在 しない生産物を同定しなければならない。この生産物を用いて、隣接の調節領域 を含む植物ゲノム中の核酸配列を同定することができる。一度調節領域が同定さ れ単離されたら、それらの配列により調節されるべき位置に着目のＤＮＡ配列を 便利に配置できるように、構成物を操作しなければならない。最後に、該構成物 を植物ゲノム中に組み込み、そしてそれの存在の効果、即ち転写を開始させそし て表現型を発現させる能力を測定しなければならない。

関連文献 ヨーロッパ特許出願０２５５３７８（およびヨーロッパ特許出願０２５５３７７ ）は、一般的に種子特異的転写調節を記載しており、そして種々の種子組織にお いて優先的転写を開始させることができる幾つかのプロモーターの例を記載して いる。

発明の要約 分子プローブとして使用するかまたは植物宿主中に挿入することができる新規Ｄ ＮＡ構成物が提供される。それらの構成物は、着目の核酸配列に連結された、少 なくとも開花後１１日日目ど初期から開花後的３０〜３５日日まで種子組織中の 転写を指令することができるＢｃｅ４遺伝子から得られる配列、および転写終結 領域を含んで成る。従って、Ｂｃｅ４調節領域の支配下での核酸配列によりコー ドされる情報の転写は、種子形成の特定の時期（二′起こるであろう。こうして 、外因性生産物の生産、並びに内因性生産物の改変を行うことができる。

そのような構成物で形質転換されたアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　）　、植物細胞および植物も提供される。

プラスミドｐＣＧＮ１８５７上に前記転写開始領域を含む大腸菌をアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖ　ｉ　ｌ　ｌｅ。

ＭＤ）に寄託した。

図面の説明 図１は、Ｂｃｅ４のｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（配列番号ｌ）である。

図２は、Ｂｃｅ４のゲノムクローンの種々のゲノムサブクローンの部分制限地図 を示す。箱はＢｃｅ４コード領域の位置を示す。

Ｂ　：ＢａｍＨＩ　、Ｂｇ　：　ＪｌｇｌＩｌ、　Ｃニル１．　Ｈ：止ｊＬ　Ｐ 　：ＰｓｔＩ、Ｓ　：釦」１．Ｘ：珈Ｉ０ 図３は、Ｂｃｅ４ゲノムクローンのＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。

図４は、試験管内突然変異誘発後のＢｃｅ４ゲノムクローンのＤＮＡ配列（配列 番号３）を示す。変異誘発された配列は太字で示されている。

図５は、ＢＣ８４発現カセットｐｃＧＮ１８７０の作製の略図である。

図６は、ＢＨ３ｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号４）である。

発明の詳細な説明 植物の部分および植物全体の植物細胞を含む新規ＤＮＡ配列、そのような配列を 使った構成物、そのような構成物を含む植物細胞が提供される。ここで前記配列 はＢｃｅ４に関連する。

Ｂｃｅ４は、最初にアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の肝 組織から単離された植物遺伝子であり、植物バイオテクノロジ−に利用される着 目の発現プロフィールを示す。即ち、胚発生の初期に比較的高レベルのＢｃｅ４ 　ｍＲＮＡか観察される。試験は、Ｂｃｅ４　ＲＮＡか開花後少なくとも１１日 目には存在し、開花後約１７〜１９８目に最大レベルに達し、そして開花後３５ 日目には検出できないことを示す。Ｂｃｅ４は種子の肝組織において優先的に発 現される。ＢＣｅ４　ｍＲＮＡは種子の外皮組織に少量レベルで検出されている か、根、実生または葉組織中には検出されていない。

Ｂｃｅ４　ＲＮＡ転写産物から翻訳されたタンパク質の機能は未知であるけれど も、Ｂｃｅ４の発現は植物種子中の脂肪の蓄積と同時に起こるため、モしてＢｃ ｅ４は種子組織において優先的に発現されるため、Ｂｃｅ４のゲノム配列に関係 する調節領域、即ち構造遺伝子に隣接して見出される非コード領域、が遺伝子工 学的用途に重要である。Ｂｃｅ４に相当する約２　ｋｂのゲノム配列（配列番号 ２）を図１に示す。

Ｂｃｅ４をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２）も図２に提供される。該ｃＤ ＮＡ配列、即ち構造遺伝子のコード領域は比較的短い。それはわずか約３００　 ｂｐの転写解読枠を有する。また、それがイントロン配列を全（含まないことも 注目される。バイオテクノロジー適用のためのＢｃｅ４遺伝子の容易な操作を考 慮に入れて、Ｂｃｅ４コード領域の長さが短い。

従って、Ｂｃｅ４遺伝子に関連する調節領域は、植物宿主細胞中での着目のＤＮ Ａ配列の転写および翻訳を行うことが所望される。構成物において使用する時、 Ｂｃｅ４配列は標的宿主に対して内因性であっても標的宿主に対して外因性であ ってもよい。加えて、転写の終結に関連するＢｃｅ４調節領域も、特にＢｃｅ４ 上流転写開始配列と合同して使用される時、着目される。

Ｂｃｅ４コード領域のすぐ５′上流に見出される領域は、Ｂｃｅ４構造遺伝子の 転写および翻訳の開始のために用意される。成る用途では、例えば、アンチセン ス方向において着目のＤＮＡ配列の転写を調節するためにＢｃｅ４転写開始領域 が使用される時には、翻訳開始配列を伴わずに転写開始領域を用いることができ る。転写開始領域としては、“ＴＡＴＡＡ”および“ＣＡＡＴ“ボックス配列の ような転写調節領域、並びに転写産物の時期および組織特異性を調節するであろ う配列が挙げられる。好ましくは、Ｂｃｅ４翻訳開始領域、リポソーム結合部位 および“ＡＴＧ”開始コドンのｍＲＮＡ配列のタンパク質発現に関係する他の関 連配列がＢＣｅ４転写開始領域と合同して使用される。“ＡＴＧ”開始コドンは しばしば着目のＤＮＡ配列により提供される。Ｂｃｅ４転写／翻訳開始領域の組 み合わせ使用は、“Ｂｃｅ４プロモーター“と呼称される。あるいは、成る態様 では、ＢＣｅ４の転写または翻訳開始領域を他の５′非コード領域と組み合わせ て異種プロモーターを作製することもできる。

ＢＣｅ４転写開始領域は、構造遺伝子の転写開始部位から最少で５００　ｂｐ　 ５’上流に及ぶ。より好ましくは、転写開始領域は構造遺伝子の転写開始部位の 少なくとも１　ｋｂ上流を含み、最も好ましくは、“ＡＴＧ”翻訳開始点のすぐ ５′側に見つかる少なくとも約５〜７　ｋｂのＢＣｅ４プロモーター、即ち転写 と翻訳の両方の配列を含むものが使用される。

転写終結を調節する構造遺伝子のすぐ３′下流の調節領域は、コード領域の転写 終結コドン゛’ＴＡＡ”の後方の少なくとも１００　ｂｐ、より好ましくは５０ ０ｂｐ　、より好ましくは約７００　ｂｐ、最も好ましい態様では少なくとも約 １．５ｋｂに及ぶ。終結コドンの下流の１．９ｋｂのＢｃｅ４３’配列を使用す る配列も好ましい。

証拠はＢｃｅ４かアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）におい ては単−遺伝子族に属するか、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａｎａｐｕ ｓ）では多重遺伝子族に属することを暗示する。多重遺伝子族の中で、高レベル の転写を提供する転写開始調節領域を見つけることが望ましい。転写開始調節領 域は、全Ｂｃｅ４ｍＲＮＡの少なくとも約ｌＯ％、好ましくは少なくとも約２０ ％、より好ましくは少なくとも約３０％に備えるべきである。これは、一方のプ ローブか保存配列を含みそして全てのＢｃｅ４　ｍＲＮＡに結合し、他方のプロ ーブかアッセイしようとするＢｃｅ４遺伝子に特有に結合するＢｃｅＪ座の多形 領域にある、２つのプローブを使うことにより、決定することができる。

本明細書中で提供される核酸配列は、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓ ｔｒｉｓ）以外の植物源からＢｃｅ４遺伝子を同定するのに使用されるプローブ を調製するために用いることができる。

Ｂｃｅ４配列は、様々な方法を使って、他の種子形成植物、特に他のアブラナ属 の植物、および他の油種子植物、例えばヒマワリ、大豆、ベニバナ、トウモロコ シ等を包含する任意の便利な植物から単離することができる。特に、Ｂｃｅ４遺 伝子に関係する目的植物の配列を同定することにより、多数の他の植物源から得 られたＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション用プローブとして任意の 保存配列を使用することがてきる。

通常、該配列は、存在し得る任意の欠失または突然変異を除いて、少なくとも約 ６０％、好ましくは少なくとも約７０９６の塩基対の一致を有するだろう。着目 の植物源からｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして該プローブを使ってＢｃｅ ４のｃＤＮＡ配列を同定することができる。便利には、標的ｃＤＮＡをプラーク 形成ウィルスベクター中でクローニングして、ハイブリダイズするファージをプ ラーク精製することができる。同定されたｃＤＮＡを更にサブクローニングし、 そしてサブクローニングされた配列を分析して別のプローブの調製に使用するこ とができる。ｃＤＮＡ配列から誘導されたプローブを用いて、適当な植物種の植 物ゲノムライブラリー中のゲノム配列を同定し、陽性のクローンを制限酵素消化 により分析する。次いで種々の植物組織において転写のレベルを測定し、植物中 の転写のパターンを証明することができる。こうして、コード領域並びに該遺伝 子の転写調節要素の両方を提供する１または複数の配列を同定することができる 。

該プローブは全長配列より相当短いが、少なくとも約１０、好ましくは少なくと も約１５、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであろう。Ｂｃ ｅ４遺伝子の全長までの、より長いオリゴヌクレオチドも有用である。ＤＮＡプ ローブとＲＮＡプローブの両方を使用することもできる。

使用の際、プローブは典型的には検出可能な方法で標識され（例えば３２ｐ−標 識またはビオチン化ヌクレオチドで）、そして遺伝子を探索しようとする生物か らの一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ　（典型的にはニトロセルロースまたはナイロン フィルターに固定されている）と共にインキュベートされる。こうして、該プロ ーブとハイブリダイズする核酸を同定することかできる。

容易な同定を考慮して検出可能な標識を有するプローブが通常使用されるけれど も、未標識のオリゴヌクレオチドも標識プローブの前駆体としておよびＤＮＡま たはＤＮＡ／ＲＮＡの直接検出に備える方法での使用に有用である。従って、「 オリゴヌクレオチド」なる用語は、標識形と未標識形の両方を指す。

プローブおよび他の目立たない核酸配列はしばしば「断片」と呼称され、そして ＲＮＡまたはＤＮＡを含んで成ることができる。染色体外核酸断片は、ＲＮＡま たはＤＮＡを含んで成る一本鎖または二本鎖断片としてゲノムの外側に存在する ことができ、その上池の配列と共に存在することもできる。断片はウィルスベク ター中に組み込まれているか、ＤＮＡ構成物の一部分としてまたはプラスミド、 即ちウィルス、細菌および／または植物中で機能的な複製開始点を含む環状化さ れた断片であることができる。

上述のＤＮＡ構成物は、５′から３′の転写方向において、Ｂｃｅ４転写開始領 域、および野生型Ｂｃｅ４構造遺伝子配列とは異なる着目のＤＮＡ配列を含むこ とができる。所望により、意図する用途に応じて、ＤＮＡ構成物中に転写終結領 域も存在し、そして存在するならば、着目のＤＮＡ配列中に提供されるか、また は５′から３′の転写方向において着目のＤＮＡ配列の後方に異種ＤＮＡ転写終 結領域により提供され得る。好ましくは、転写終結領域はＢｃｅ４遺伝子から得 られるだろう。Ｂｃｅ４転写開始領域は、好ましくはＢｃｅ４プロモーター中に 見つけることかできるものである。ＤＮＡ配列が転写開始および翻訳開始調節領 域の支配下にある時、ＤＮＡ構成物は「発現カセット」であると見なされる。

着目のＤＮＡ配列は、多数の構造遺伝子のうちの１つを含んでもよい。例えば、 種子に有効な農業形質を付与するために、例えば除草剤または病上耐性を付与す るため、種子中に見つかる栄養素の比率および／または組成を変えるため、また は他の望ましい形質を付与するために、それらの遺伝子を用いることができる。

ＢＣｅ４遺伝子由来の調節配列は、植物の残部に強い影響を与えることなく植物 種子脂肪酸および／または油を変更する用途において特に有用であろう。長さ、 飽和等に関して種々の脂肪酸の比率および／または量を変えるといった種々の変 更が所望され、そして同様に、脂肪酸残基はトリグリセロールに含まれるので植 物貯蔵脂質の組成を変更する。それらの結果は、転写産物の成熟および／または 発現を阻害するように、生来の遺伝子の転写産物に相補的である転写産物を生産 せしめることによって１もしくは複数の内因性生産物、特に酵素もしくは補因子 の発現の減少に備えることにより、または脂肪酸合成に関係する内因性もしくは 外因性の構造遺伝子の発現に備えることにより、獲得することかできる。脂肪酸 合成に関係する発現産物としては、例えば、アシルキャリヤータンパク質（同時 係属ＵＳＳＮ　４３７．７６４に記載）およびステロイル−ＡＣＰ　（本出願と 同時に出願した、出願番号が未指定の同時係属米国特許出願”Ｐｌａｎｔ　５ｔ ｅａｒｏｙｌ−ＡＣＰ　Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ　−Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　 ａｎｄ　Ｕｓｅｓ”）が挙げられる０別々の核酸断片からＤＮＡ構成物を組み立 てることができる。

それらの断片は、様々な技術により種々の源から得ることかできる。断片は制限 酵素の使用により望ましくなｕ　ＸＤＮＡと分離することができる。操作しよう とするＤＮＡ配列中に有用な制限認識部位が好都合に存在しない場合には、部位 特異的突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応、リンカ−等を使って部位を付加す ることができる。

所望の断片を得、そして適合性の「粘着」末端または平滑末端を有するように操 作した後、断片を一緒に連結してプラスミドを形成せしめ、これを用いてクロー ニング用の有用な宿主、例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を形質転換せしめること ができる。細菌からプラスミドＤＮＡを単離し、例えば制限消化、サイズスクリ ーニング、ＤＮＡ配列決定等を使って分析することができる。

ＤＮＡ構成物は、１または複数の追加の要素、例えば選択可能マーカー、生産物 のトランスロケーションのための配列、複製開始点等を更に含んで成ることがで きる。加えて、ＤＮＡ構成物は、ＢＣｅ４とは異なる転写または翻訳開始領域の 調節支配下に第二の着目のＤＮＡ配列を含んでもよい。幾つかの追加要素の例を より詳細に下記に記載する。

着目の配列、形質転換の目的および特定の宿主に応じて、本発明のＤＮＡ構成物 中に含めることができる他の配列は、特定の機能に備える配列である。ある場合 には、細胞質からオルガネラへの発現産物のトランスロケーションまたは分泌に 備えることか望ましいかもしれない。この場合には、着目の配列をオルガネラ、 例えば葉緑体もしくはミトコンドリアにトランスロケーションするために、また はタンノ々り質を細胞外間隙中もしくは細胞表面に分泌するために、シグナルペ プチドを使うことができる。種々のシグナルペプチド、例えばＲｕｂｉｓｃｏ遺 伝子の小サブユニット、植物ＥＰＳＰシンセターゼ、アシルキャリヤータンパク 質等のシグナルペプチドが使用されている。

Ｂｃｅ４調節構成物は、２つの転写開始領域を要求する用途における植物遺伝子 操作のための有効な追加の手段である。例えば、Ｂｃｅ４構成物は、別の種子特 異的５′上流調節領域、例えば１９８８年１月２５日に出願の同時係属出願０７ ／１４７．７８１に記載されたナピンおよび種子−ＡＣＰから得られるもの、を 増大させン１−２」は、開花後１８日目に検出されそして開花後２７日目までに ピークに達する。アブラナの未熟な胚から単離されたＡＣＰ遺伝子からの転写物 ｒＢｃｇ　４−４　Ｊは、種子胚組織中に現れるが種子外皮組織中には現れない 。従って、種子において優先的に発現される他の転写開始領域と合同したＢｃｅ ４５’上上流部領域の使用は、組織特異性、情報レベルおよび時期の種々の組合 せを操作および調整することを可能にする。そのような構成物は、陽性の形質転 換を測定するのを助けるために第一の選択可能マーカーとは異なる第二の選択可 能マーカ−も含むことができる。第二のマーカーはクローニングの際に有用であ り、第一の選択可能マーカーからの別の選択方法を提供することができる。

本発明の形質転換植物としては、ＤＮＡの試験管内付加を体験した細胞、並びに 付加されたＤＮＡを担持している子孫が挙げられる。植物細胞とは、個々の細胞 、植物の器官形成または非器官形成組織、植物の部分および植物全体を意味する 。

着目の植物宿主としては、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）　、特にセイヨウア ブラナおよびアブラナ、ヒマワリ、大豆、ベニバナ、トウモロコシ、並びに他の 種子植物、特に他の油種子植物が挙げられる。植物細胞は、アグロバクテリウム 菌との同時培養、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、マイクロイン ジェクション、マイクロプロジェクタイルを用いた衝撃等により、試験管内で形 質転換せしめることができる。

いて使用されるプラスミドは、しばしばバイナリ−ベクターと呼称される。転写 調節領域に加えて、バイナリ−ベクターましくは少なくとも右ボーダーを含むこ とがてきる。該ベクターは、該プラスミドが大腸菌およびアグロバクテリウム菌 のいずれかの宿主中で複製できるように、大腸菌およびアグロバクテリウム菌中 で活性である複製開始点を含んでもよい。

バイナリ−ベクターを有する宿主細胞の選択を考慮して、該ベクターの他の成分 、即ちＤＮＡ構成物、に選択可能マーカーを連結することかできる。このマーカ ーは好ましくは抗生物質耐性マーカー、例えばゲンタマイシン、クロラムフェニ コール、カナマイシ、アンピシリン耐性マーカー等である。

エンスの毒性はＴｉ　（腫瘍誘導）プラスミドに起因し、そしてＡ、リゾジェネ スの毒性はＲｉ　（毛根病誘発）プラスミドに起因し得る。ＴｉおよびＲｉプラ スミドは、植物宿主ゲノムに組み込まれるようになりそしてそこから腫瘍または 毛根の形成を誘導する、Ｔ−ＤＮＡ　（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ＤＮＡ　）と 呼ばれる領域を育する。便利には、腫瘍の誘導または毛根の形成を引き起こすＴ −ＤＮＡ間の領域が除去されるように、それらのプラスミドを「縮小（ｄｉｓａ ｒｍ）」することができる。続いて、着目のＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ領域間に挿 入することができる。そのような構成物は一般に「発現構成物」と呼称される。

次いでこの新規ＤＮＡ配列がＴ−ＤＮＡと共に植物ゲノム中に組み込まれ、ゲノ ム中にこの着目のＤＮＡ配列を含む植物が生成する。

細胞が一度形質転換されれば、発現構成物に関連するマーカーを用いてトランス ジェニック細胞を選択することができる。通常、発現構成物は、形質転換されて ない細胞に対して形質転換された植物細胞の選択を可能にするであろうマーカー と連結されるだろう。マーカーは、一般に抗生物質、例えばカナマイシン、ゲン タマイシン、ヒグロマイシン等（前記抗生物質は適度な濃度で植物細胞に対して 毒性である）に対する耐性を提供するだろう。

形質転換後、植物細胞を適当な培地中で増殖させることができる。プロトプラス トの場合、適当な浸透圧条件下で細胞壁を再生できるだろう。種子または胚の場 合、適当な発芽またはカルス発生培地が使用されるだろう。外植片については、 適当な再生培地が使用されるだろう。

細胞から生じるカルスを、苗条または根の形成に備えた栄養培地中に導入し、そ して生じた小植物を植え、種子まで生育させることができる。生育中、組織を収 穫し、発現構成物の発現の存在についてスクリーニングすることができる。生育 後、種子を収集し、移植することかできる。次いで１または複数の世代を生育さ せ、該遺伝子がメンデルの法則で遺伝されることを立証することができる。

本発明を一般的に記載したが、例示の目的で含まれ本発明を限定するつもりでは ない次の実施例への参照により、容易に理解されるであろう。

開花後１７〜１９日目に収日日た種子から得られたアブラナＣｏ１ｂｅｒｔら（ ＰＮＡＳ　（１９８３）　８０：２２４８−２２５２）により記載されたように して２５ｒｎｌの４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液中でＲＮＡを抽出する。

６　ｍｌの１　ｘＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ＝８） 中にペレットを再懸濁し、酢酸カリウムを０．０５Ｍの濃度に添加し、そして半 分の容量のエタノールを添加することにより、ＲＮＡ試料から多糖を除去する。

試料を氷上に６０分間置き、３０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心する。酢酸ナトリ ウムを０．３Ｍの濃度に添加し、次いで２容のエタノールを添加することにより 、上清からＲＮＡを沈澱させる。１２，０００Ｘｇでの１０分間の遠心により試 料からＲＮＡを回収し、ＵＶ分光光度法により収量を算出する。２　ｍｇの全Ｒ ＮＡを、０．２５ｇのＳｉｇｍａ　Ｃｅ１ｌ　５０セルロースカラム上で多糖を 除去することによって更に精製する。ＲＮＡを１−の負荷緩衝液（２０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，０，５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ、　０．１ ％５ＤＳ）においてカラムに負荷し、該負荷緩衝液で溶離させ、そして１０個の ５００μβ分画に収集する。１０個の試料にエタノールを添加してＲＮＡを沈澱 させる。試料を遠心し、ペレット（分画２〜７）を無菌蒸留水に再懸濁し、プー ルし、再度エタノールで沈澱させる。試料を遠心し、得られたＲＮＡペレットを オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーＣＭａｎｉａｔｉｓら、　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ （１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 ）によりポリ　（Ａ）”ＲＮＡを富化せしめ、モしてＵＶ分光光度法により定量 する。

５Ｈｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを使ってプラスミドベクターｐｃＧＮ１７０３ においてアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の開花後１７〜 １９日目の胚日日ＮＡライブラリーを作製する。プラスミドクローニングベクタ ーｐｃＧＮ１７０３は、市販のクローニングベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ ｌ：Ｔ　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　；　Ｌａ　Ｊ ｏｌｌａＣＡ）から誘導され、次のように作製される。胆−［での消化、マング ビーンエンドヌクレアーゼでの処理、および平滑末端連結により旧ｕｅｓｃｒｉ ｂｅ　Ｍｌ３−のポリリンカーを変更し、軸胴欠失プラスミドｐｃＧＮ１７００ を作製する。ｐｃＧＮ１７００を■四Ｒ１と５ｓｔｌ　で消化しく近位の制限部 位）、次の配列：（配列番号５） ５　’　ＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡ　３ 　’および（配列番号６） ５　’　ＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣ ＣＧＡＧＣＴ　３　’を有する合成相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングさ せる。それらの配列は、−Ｒ１部位を削除し、ｈｍＨＩ部位をＢｌｕｅｓｃｒｉ ｂｅ　Ｍｌ３−中に見つかる５ｓｔｌ部位の反対側に移動させ、新規制限部位Ｐ ｓｔｌ、　Ｘｂａｌ、　働１．　ＳｍａＩを導入するために挿入する。生じたプ ラスミドＩ）ＣＧＮ１７０２をＨｉｎｄＩ［で消化し、フレノウ酵素で平滑末端 にする。直鎖状ＤＮＡを−■で部分消化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて希釈 溶液中で連結せしめる。ｌａｃプロモーター領域が削除されている形質転換体を 選択しくｐｃＧＮ１７０３）、それをプラスミドクローニングベクターとして使 用する。

４１−６４　）により、約１．５　ｘｔｏ５の形質転換体から成るライブラリー を１）ＣＧＮ１７０３において作製する。簡単に言えば、ターミナルデオキシヌ クレオチジルトランスフエラーゼ酵素と遊離のｄＴＴＰヌクレオチドを使って、 ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを過剰量で、Ｓａｃ　Ｉ部位にＴテールか付けられてい るベクターＤＮＡにアニールさせる。次いでＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡを転写 する逆転写酵素（ＢＲＬ　；　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ ）によるｃＤＮＡの第−鎖の合成のためのプライマーとして、該ベクターＤＮＡ を使用する。

次にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ酵素と遊離のｄＧＴ Ｐヌクレオチドを用いてベクター／ｃＤＮＡ複合体の両方の３′末端にｄＧＴＰ 残基を付加する。この時点で、ベクター当たり２つのｃＤＮＡ分子が存在する。

次いでベクター／ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化する。こ の消化は２種類のＤＮＡ断片を生成する。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中にクローニ ングしようとするＤＮＡは１つのＲＮＡ／　ｃＤＮＡ分子が結合したベクターか ら成る。他方の断片はＲＮＡ／　ｃＤＮＡのみから成り、それは複製に必要な遺 伝情報を欠くため、大腸菌中にクローニングすることはできない。論旧消化後、 次の配列：５’　ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＣ ＣＣＣＣＣＣ３’　（配列番号７）３’　ＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＴＡＡＧＣＴ ＣＧＡ　５　’　（配列番号８）ＢａｍＨＩ　ＮｏｔＩ　ＥｃｏＲＩ　５ａｃＩ のリンカ−ＤＮＡを反応液に添加する。このリンカ−のポリ（Ｃ）残基がＲＮＡ ／ｃＤＮＡ複合体のポリ（Ｇ）テールにアニールする。

次いて反応条件を変更し、現在両端にＢａｍＨＩ制限部位を含むＤＮＡの環化を 可能にする。大腸菌ＤＮＡリガーゼを反応液に添加し、酵素的にそれらの末端を 接合せしめる。最後に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメ ラークー酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐ ｏｌｉｓ、　ＩＮ）を反応液に添加し、元のＲＮＡ鋳型を除去しそしてＤＮＡと 置換する。二本鎖ｃＤＮＡ＋ＤＮＡ−から成るｃＤＮＡ　（プラスミドを含む） を用いて、コンピテント大腸菌ＤＨ５ａ細胞（ＢＲＬ　；　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ。

Ｍａｒｙ　１ａｎｄ）を形質転換せしめ、平板培養しそしてコロニーをかき取る ことにより増幅させ、１０％ＤＭＳＯ中の凍結大腸菌細胞として一８０℃で保存 する。

ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。（ １９７９）　７：１５１３）のアルカリ溶菌法をスケールアップすることにより 、増幅ライブラリーの一部分からＤＮＡを単離し、ＣｓＣ１遠心により精製する 。ライブラリーＤＮＡを―ＲＩで消化し、０．１７Ｍｇを１ＨｇのＥｃｏＲＩ消 化されたバクテリオファージλｇｔｌＯ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ　Ｊｏｌ ｌａ、　ＣＡ）　ＤＮＡ中にクローニングする。製造業者の指示に従ってＰａｃ ｋａｇｅｎｅ試験管内パッケージング抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ　；Ｍａｄｉｓｏ ｎ、　ＭＩ）を使ってＤＮＡをパッケージングする。大腸菌Ｃ６００細胞中のフ ァージの希釈平板分離により測定したファージ原液の力価（Ｈｕｙｎｈら、　Ｄ ＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第１巻、　Ｇｏｖｅｒ、Ｄ、Ｍ。

編（１９８５）　ＩＲＬ　’Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　；　０ｘｆｏｒｄ、 　Ｅｎｇｌａｎｄ、　５６，１１０頁〕は、１ｍｌあたりｌＸｌ０’　ｐｆｕで ある。ｃＤＮＡライブラリー挿入断片を含むファージを、プレートあたり１０３ プラーク形成単位（ｐｆｕ）の濃度において、大腸菌Ｃ６００細胞中のＮＺＹ（ Ｍａｎｉａｔｉｓら前掲により定義されたＮＺＹＭ培地）プレートの周りに２つ の直径１５０　ａｍに塗布する。次のようにしてプレートから２通りのニトロセ ルロースフィルター上にプラークを上昇させる。フィルターを２分間プレート上 に置き、上昇したプラークを変性溶液（１，５Ｍ　ＮａＣ１，０，５Ｍ　Ｎａ０ Ｈ）のトレーに移し、１分間浮遊させる。次いでフィルターを中和溶液（１，５ ＭＮａＣ１，０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０）に２分間移した後、 ２ＸＳＳＣ（ｌｘ　＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム 、　ｐＨ７）中で３分間洗浄する。フィルターを室温で自然乾燥させ、次いで８ ０°Ｃの真空オーブン中で２時間焼く。

種子特異的プロモーター候補をスクリーニングするために、アブラナ（Ｂｒａｓ ｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の葉のｍＲＮＡの逆転写（葉において発現さ れるクローンを排除するため）および開花後１７〜１９日目に採日日たアブラナ の胚のｍＲＮＡの逆転写（胚において発現されるクローンを同定するために）に より調製した放射能標識ＤＮＡを用いて、上記のフィルターを順次スクリーニン グする。しかしながら、胚特異的であると同定されたクローンの大部分は所望で ない種子貯蔵タンパク質ナピンについてのクローンであるかもしれないと考えら れるので、フィルターを放射性ナピンｃＤＮＡともハイブリダイズせしめてナピ ンクローンを同定する。全ての予備ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼー ションは、５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣ。

５×デンハルト液（ｌＸ＝０．０２％ポリビニルピロリドン１０．０２％フィコ ール１０．０２％ウシ血清アルブミン）および０．１％変性サケ精子ＤＮＡ中で ４２°Ｃにて行う。ハイブリダイゼーション後、０．１％ＳＤＳを含む０．１　 ｘＳＳＣの溶液中で６５°Ｃにて全フィルターを洗浄する。映像強化膜を使って 一８０°Ｃにて該フィルターをＸ線フィルムに暴露することによりオートラジオ グラフを得る。

ナピンプローブは製造業者の教示に従ったニックトランスレーションにより（Ｎ ｉｃｋ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｂｌ？Ｌ　：Ｇａｉｔｈｅ ｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）　、アブラナ種子ｃＤＮＡライブラリーか ら単離したナピンｃＤＮＡクローンであるＢＦ２からの０．１　μｇのＸｈｏＩ −３ａｌＩ　ＤＮＡ断片を使って、ナピンプローブを調製する。

図６゜ＢＦ２の単離は、１９８８年１月２５日に出願の同時係属出願Ｌ１．　Ｓ 、第０７／１４７．７８１号に記載されており、この出願は参考として本明細書 中に組み込まれる。アブラナの葉および胚のｍＲＮＡからの放射能標識ｃＤＮＡ は次のようにして調製する。２μｇのｍＲＮＡを１５μｌの無菌蒸留水に再懸濁 し、そして５０μｌの最終反応容積において、１０μｌのＢＲＬ　５　ｘＭ−Ｍ ＬＶ　（モロニーマウス白血病ウィルス）逆転写酵素緩衝液（ＢＲＬ）　、４０ 単位のりボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ　（Ｐｒｏｍｅｇａ　；　Ｍａｄｉ ｓｏｎ、　ＷＩ）、５μｇのウシ血清アルブミン、ヌクレオチドｄＡＴＰ、　ｄ ＧＴＰおよびｄＴＴＰの２０ｍＭ溶液１．５μｌ　、　ｄＣＴＰの０．４ｍＭ溶 液１．０μｍ！、１．２５μｇのオリゴ（ｄ’ｒ）　、　ｓ、１．９　μｇ　（ ７）７クチノマイシンＤ、８ｏμｃｉノα−”Ｐ−ｄＣＴＰ　、並びに５００単 位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）の添加により、ｍＲＮＡから一本鎖のｃＤ ＮＡを合成する。反応を３７°Ｃで６０分間進行させ、次いで５μｌの０．２５ Ｍ　ＥＤＴＡの添加により停止させる。試料をフェノール：クロロホルム（５０ ：５０）で抽出し、次にクロロホルムだけで抽出する。１／２容の７．５Ｍ酢酸 アンモニウムと２容のエタノールの添加によりｃＤＮＡを沈澱させる。試料を一 ２０°Ｃに３０分間置き、超遠心語中で遠心してｃＤＮＡをペレット化する。ペ レットを１００μｌの無菌蒸留水に再懸濁し、そして液体シンチレーション分光 法により取す込まれた放射性ｄＣＴＰの量を測定する。

１７個のｃＤＮＡクローンが、分画スクリーニングにより、種子中で高度に発現 されるか葉では発現されないものと同定された。それらのクローンのうちのｌっ Ｂｃｅ４をプラーク精製し、製造業者の指示に従ってＬａｍｂｄａＳｏｒｂファ ージ吸着剤（Ｐｒｏｍｅｇａ　；Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）を使ってファージＤ ＮＡを単離した。次いでクローンを動曵Ｒ１での消化、連結および大腸菌７１− １８　（Ｙａｎｉｓｃｈ〜Ｐｅｒｒｏｎら、　Ｇｅｎｅ　（１９８５）　３３： １０３−１１９）細胞中への形質転換により、プラスミド形に戻した。更に該ク ローンをＤＮＡ配列決定（下記参照）並びにノーザンおよびサザン分析により分 析した。

合成したオリゴマー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａシンセ サイザー、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　；　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ ｔｙ、　ＣＡ）を使って、ＣＤＮＡクローンＢｃｅ４を５′から３′方向で配列 決定した。該オリゴマーはジデオキシ法ＣＳａｎｇｅｒら、　ＰＮＡＳ　（１９ ７７）　７４：５４６３−５４６７）による配列決定用のプライマーとして働く 。該配列を図１に示す。

子組織において優先的に発現されることを証明する。

多数の組織からＲＮＡを単離するニアプラナ（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の葉 、開花後１５日目、１９日目および２３日目に採取した全種子、（１９８７）靭 ニア５４２−７５５６）の方法の適用により全ＲＮＡを単離する。

２．５ｍｌ／ｇの粉砕緩衝液中てのホモジナイズ、上述したようなフェノール／ クロロホルム抽出および遠心後、１／ｌｏ容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２容のエタ ノールを添加し、次いて一８０°Ｃで３０分間冷凍し、１３．０００Ｘｇで２０ 分間遠心することにより、水相からＲＮＡを沈澱させる。ペレットを８０％エタ ノールで洗浄し、上記と同様に遠心を繰り返す。ペレットを水に再懸濁し、２容 の４Ｍ　ＬｉＣ１を添加し、そして試料を一２０°Ｃに一装置く。

上記と同様に試料を遠心し、ペレットを８０％エタノールで洗浄する。上記と同 様にエタノール沈澱を繰り返す。試料をＳｉｇｍａ　Ｃｅ１ｌ　５０カラム上に 負荷しそしてＲＮＡを溶離させることにより、混入している多糖を除去する。溶 出液をエタノール沈澱させ、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフ ィー（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）によりポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを富化せしめ る。

４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液（Ｃｏｌｂｅｒｔら、前掲）中での抽出に より、アブラナ（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の３日齢の発芽している実生およ び実生の根から全ＲＮＡを単離する。５０ｍＭ酢酸カリウムと１７２容のエタノ ール中での沈澱により多糖を除去する。次いで上記と同様にして上清からＲＮＡ を沈澱させ、ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを富化せしめる。

から全ＲＮＡを単離し、上記と同様にしてポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを富化せしめ る。

Ｕ■分光光度法によりポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを定量する。アブラナ（Ｂ、ｃａ ｍｐｅｓｔｒｉｓ）の開花後１７〜１９日目の胚日日花後１５日目、１９日目お よび２３日目に採取した全種子、開花後１７日目の種子外皮、葉、根並びに実生 からのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡ　２μｇをホルムアルデヒド／アガロースゲル上 で電気泳動しＣＦｏｕｒｎｅｙら。

Ｆｏｃｕｓ　（１９８８）　１０（１）：５−７　）　、そしてＧｅｎｅＳｃｒ ｅｅｎ　Ｐｌｕｓナイロンフィルター（ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕ ｃｔｓ　；　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）上に移行させる。分画スクリーニングにつ いて上述したのと同様にして、４２°Ｃで一晩フイルターを予備ハイブリダイズ しハイブリダイズせしめる。プロットをｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で６５° Ｃにて各回１５分間２回、およびｏ、ｉ　ｘｓｓｃ、　ｏ、ｔ％ＳＤＳ中で６５ ℃にて３０分間１回洗浄し、そしてＸ線フィルムに暴露する。

結果は、開花後１５．１９および２３日目の全種子ＲＮＡ並びに開花後１７〜１ ９日目の胚日日いて〜７００　ｂｐのｍＲＮＡの存在を示す。

種子外皮ＲＮＡには弱いシグナルが検出される。根、実生または葉ＲＮＡには全 くハイブリダイゼーションシグナルが検出さ遺伝子の数をサザンプロット分析に より決定する。Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａらの方法ＣＰｌａｎｔ　Ｍａｔ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｒｅｐ、　（１９８３）　１：１９−２１）により若いアブラナ葉からゲ ノムＤＮＡを単離し、ＣｓＣ１中でのバンド沈降により一回精製する。５０Ｍｇ のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［。

ＢａｍＨＩ、　５ａｌｔ、　Ｘｈｏｌまたは皿ＩＩて完全消化する。ＤＮＡ消化 物を０．７％アガロースゲル上で電気泳動する。Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）に より記載されたようにして、ゲルを変性させ、中和し、そしてＤＮＡをニトロセ ルロースフィルターに移行させる。製造業者の教示（Ｎｉｃｋ　Ｔｒａｎｓｌａ ｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、　ＢＲＬ　；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）に 従って放射能標識されているＢｃｅ４　ｃＤＮＡクローンからの精製Ｐｓｔｌ断 片を用いてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションと洗浄条件 はノーザン分析について上述したものと同じである。

ハイブリダイゼーションの結果は上記消化物の各々から一本のバンドを示し、ア ブラナにはＢｃｅ４をコードする単一の遺伝子が存在することを示唆する。Ｂａ ｍ旧消色消化物消化物の中で最大の断片（＞１５ｋｂ）を与えた。セイヨウアブ ラナ（Ｂ。

ダイゼーションを示した。このことは、セイヨウアブラナ（Ｂ、　ｎａｐｕｓ） のゲノムにはＢｃｅ４と同等の３遺伝子か存在することを暗示する。

Ｄ、Ｂｃｅ４の存在位置および時期の分析種子形成中のＢｃｅ４の発現の時期を ノーザン分析により決定する。アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒ ｉｓ）　ｃｖ、Ｒ５００の未熟種子を開花後１１．１３．１５．１７．１９．２ １．２５．３０．３５．４０．５５および６０日日日収集する。５ｃｈｅｒｅｒ およびＫｎａｕｆ　（前掲）により記載された方法により全ＲＮＡを調製する。

各時点からのＲＮＡ　２５μｇを、Ｆｏｕｒｎｅｙ、Ｆｏｃｕｓ　（１９８８） 　１０（１）＋５−７により記載されたホルムアルデヒド含有１．５％アガロー スゲル上で電気泳動し、そし７７　：　５２０１−５２０５）。ニックトランス レーション（ＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　；　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。

ＩＮ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰて標識されたＢｃｅ４　ｃＤＮＡクローンのＰｓ ｔｌ挿入断片を用いてプロットを探査する。プロットを５０％ホルムアミド、ｉ ｏ　ｘデンハルト液、５　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ、　５ｍＭＥＤＴＡ、　１ ００８μｌｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび１０％硫酸デキストラン（ハイブリダイ ゼーションのみ）中で４２℃にて予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダ イゼーションを行う（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。５５°ＣにてｌＸ５ｓｃと ０．１％ＳＤＳ中て３０分間１回、０．Ｉ　Ｘ５ＳＣと０．１％ＳＤＳ中で各回 １５分間２回洗浄を行う。映像強化膜を使って該プロットをＸ線フィルムに暴露 する。

オートラジオグラフは、Ｂｃｅ４情報が調査した最も早い時期（１１日日日（こ 存在し、１７〜１９日目にピ日日（こ達し、そして開花後３５日月末でには検出 できなくなることを示す。

実施例２　：　Ｂｃｅ４ゲノムクローンの単離上述のサザン分析はＢｃｅ４ゲノ ムが＞１５ｋｂのＢａｍＨＩ断片上に含まれることを示す。従って、下記に記載 のようにして大の実生の一次葉（水平に発芽）から全ゲノムＤＮＡを単離する。

葉を摘み取り、使用前に液体窒素中で凍結させる。５ｃｏｆ　１ｅｌｄおよびＣ ｒｏｕｃｈの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８７）　２６２：１ ２２０２−１２２０８　）により全ゲノムＤＮＡを単離する。２００μｇのゲノ ムＤＮＡをＢａｍＨＩで完全消化し、ショ糖勾配上で分画する（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、前掲）。Ｂｃｅ４ゲノム断片にツクトランスレーションしたＢｃｅ４　ｃ ＤＮＡ断片を使って、分画からのアリコートのサザン分析により測定した時に＞ １５ｋｂのもの）を含む分画をプールし、そしてエタノール沈澱により濃縮する 。

ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ制限断片を用いて作製されたアブラナのゲノムライブ ラリーを、Ｍａｎｉａｔｉｓ　（前掲）のクローニング方法を使って、Ｐｒｏｍ ｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）からのラムダファージベクターＬａｍｂｄａ ＧＥＭ−１１（ＢａｍＨＩアーム）を用いて確立する。

生じた組換えファージを製造業者の教示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　；　ＬａＪｏ ｌｌａ、　ＣＡ）に従ってＧｉｇａＰａｃｋ　Ｇｏｌｄを用いてパッケージング し、そしてライブラリーを大腸菌株ＮＷ２　（Ｗｏｏｄｃｏｃｋら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８９）　１７：３４６９−３４ ７８）上に塗布する。

該ライブラリーの力価は約２．６　ｘｌＯ’　ｐｆｕ／ｍｌである。

３７°Ｃで２０分間ファージをＮＷ２大腸菌細胞に吸着させ、ＮＺＹ＋１０ｍＭ 　ＭｇＳＯ４および０．９％アガロース中のＮＺＹプレート上に置くことにより 、該ライブラリーを平板培養する。全部で約１５０、０００個の組換えバクテリ オファージを７５．０００プラ一ク／９ｃｍＸ９ｃｍプレートの密度てスクリー ニングする。プレートを３７°Ｃで一晩インキユベートし、４°Ｃで２．５時間 冷却する。

予め切ったフィルターを約１分間プレート上に載せることにより、ファージＤＮ Ａを二速りにおいてＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ　Ｆｉｌｔｅｒ（ＮｅＷＥ ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）上に移行させる。１．５Ｍ　ＮａＣ１，、０， ５ＭＮａＯＨ中で１分間変性させ、１．５Ｍ　ＮａＣ１，０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ、　ｐＨ８，０中で２分間中和し、そして２ＸＳＳＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓ 、前掲）中て３分間洗浄することにより、ファージＤＮＡをフィルターに固定す る。フィルターを丁度湿った状態まで風乾し、Ｍａｎｉａｔｉｓ（前掲）に記載 された通りに４２°Ｃにて予備ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーショ ンを行う。Ｂｃｅ４　ｃＤＮＡから単離された３２Ｐ−標識ＰｓｔＩ断片（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｎ１ｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉ ｔ）を使ってフィルターを探査する。５５°ＣにおいてｌＸ５ＳＣ，０，１％Ｓ ＤＳ中で３０分間、そして０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で各回１５分間２ 回、洗浄を行う。映像強化膜を用いてフィルターをＸ線フィルムに暴露する。全 部で６個のプラークが２通りのフィルターにおいて強いハイブリダイゼーション シグナルを示す。その幾つかを大腸菌株ＮＷ２およびＬＥ３９２中でプラーク精 製するＣＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）前掲）　、　ＰＩＣＩと命名した１つ のクローンを部分制限マツピングとＤＮＡ配列決定により更に特徴づける。図２ ゜Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　 （１９８７）　１５（１６）：６７３７　）の方法の変形によりファージＤＮＡ を単離する。簡単に言えば、プラークを取り、吸着緩衝液（１０ｍＭ　ＭｇＣ１ ，と１０ｍＭ　ＣａＣｌ２）　０．３　ｍｌとＮＺＹ培地中のＬε３９２培養物 ０．２−の入った試験管に入れる。試験管を３７°Ｃで１０分間インキュベート し、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と０．１％グルコースを含むＥＣＬＢ（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、前掲）１０ｉを添加する。試験管を３７°Ｃで一晩振盪する。溶菌が目に 見えるようになったら、試験管を５〜８Ｋ　ＰＰＭで１０分間２回遠心する。次 いで上清をＳＷ４１０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で３０Ｋ　ＲＰＭて３０分間 遠心する。ペレットを２００μｌのＳＭ（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓら、前掲）中に再 懸濁し、そして１．５ｍｊ’の超遠心管に移す。２μｌのｌＯ％ＳＤＳを試験管 に添加し、よく混合し、試験管を室温で１０分間インキュベートする。混合物を フェールで１回、クロロホルムで１回抽出する。１ｏｏμｌの７．５Ｍ酢酸アン モニウムと１ｍｌのエタノールの添加によりＤＮＡを沈澱させる。

ゲノムクローンＰＩＣＩのＤＮＡ配列は、ｐｃＧＮ１８５５の二本鎖ジデオキシ 配列決定により得られる。ｐｃＧＮ１８５５は、Ｂｃｅ４ゲノムを含むＰＩＣＩ の５．５　ｋｂ　Ｘｂａｌ断片をｐＵｃ１８　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、　Ｇｅ ｎｅような一連の繰り込まれた欠失のジデオキシ配列決定により、ＤＮＡ配列を 得る。欠失は、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ　（Ｇｅｎｅ　（１９８４）　２１５：３５１ −３５９〕の方法に従って、Ｅｘｏ　Ｉ［とＳＩヌクレアーゼを使って、鋤Ｉ／ −旧消化された［）ＣＧＮ１８５５上に５′から３′方向に作られる。得られた 配列はｃＤＮＡ配列の開始の６６２　ｂｐ上流で始まり、そしてｃＤＮＡ配列の 終わりの８５６　ｂｐ下流まで続く。図３゜ＰＩＣＩは、Ｂｃｅ４のヌクレオチ ド配列に対する完全な相同性により、Ｂｃｅ４　ｃＤＮＡをコードすることが証 明される。

せしめ、バイナリ−ベクター１）ＣＧＮ１５４７　（下記参照）のＢａｍＨＩ部 位に挿入し、１）ＣＧＮ１８５３を得る。８ｃｅ４遺伝子を含むｐｃＧ’Ｎ１８ ５３のＰｓｔＩ断片をｐＵｃ１８　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら（１９８３）前掲〕 のＰｓｔ［部位に挿入し、ｐｃＧＮ１８５７を得る。プラスミドＩ）ＣＧＮ１８ ５７は１９９０年３月９日に受入番号６８２５１のもとにＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ、　ＭＤに寄託された。Ｂｃｅ４遺伝子を含むｐｃＧＮ１８５７のＣｌ ａｌ断片をＣ１ａｌ消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ　”　（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ　；　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）中に連結せしめ、ｐｃＧＮ１８６ ４を作製する。ｐｃＧＮ１８６４から一本鎖ＤＮＡを作り、次のオリゴヌクレオ チド ＢＣＥ４５Ｐ　（配列番号９） （５’　ＧＡＧＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＴ ＧＡＡＡＡＣＣＴＡＧＡ　３”）およびＢＣＥ４３Ｐ　（配列番号１０）（５’ 　ＣＡＡＴＧＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＡＣＴ ＡＧＧＡＡＡＡＧＧ　３　”）を使って、Ａｃｌｅｌｍａｎら（ＤＮＡ　（１９ ８３）　２：１８３−１９３）により記載されたようにして試験管内突然変異誘 発により変更する。二本鎖ＤＮＡ分子の収量を高くするために、反応液にＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔの一部分に相補的なオリゴヌクレオチドＢＳＣＰ２　（配列番号 １１）（５’　ＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧ　３　’　 ）を含める。生じたプラスミドＩ）ＣＧＮ１８６６はＢｃｅ４開始コドンのすぐ ５′側にＸｈｏｌとＢａｍＨＩ部位（ＢＣ８４５Ｐ由来）を含み、そしてＢｃｅ ４終結コドンのすぐ３′側にＢａｍＨＩ　とＳｍａ１部位（ＢＣＥ４３Ｐ由来） を含む。突然変異誘発された配列を含むｐｃＧＮ１８６６のＣｌａｌ断片をＩ） ＣＧＮ２０１６　（後述）のＣｌａｌ部位に挿入し、ｐＣＧＮ１８６６Ｃを生ぜ しめる。１）ＣＧＮ１８６６ＣのりａＩ断片を用いてｐｃＧＮ１８６７　Ｃ後述 ）の対応する野生型Ｃ１ａｌ断片を置換し、ｐｃＧＮ１８６８を得る。石器での ｐｃＧＮ１８６８の消化および該プラスミドの再環化によりＢｃｅ４コードニー を除去し、ｐｃＧＮ１８７０を得る。図５゜Ｂｃｅ４発現カセットｐＣＧＮ１８ ７０は、クローニング部位ＸｈｏＩ、　ＢａｍＨＩおよびＳｍａｌにより隔てら れたＢＣｅ４ゲノムクローン由来の７．４ｋｂの５′調節配列と１．９ｋｂの３ ′調節配列を含む。

ｐｃＧＮ１８６７ 結することにより、ｐＬＪｃ１８　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら（１９８３）前掲〕 のＢａｍＨＩ　とＳｍａ、１部位を除去し、Ｉ）ＣＧＮ１８６２を作製する。Ｂ ｃｅ４遺伝子を含むｐｃＧＮ１８５７の履Ｉ断片をｐｃＧＮ１８６２のハυ部位 に挿入し、ｐＣＧＮ１８６７を作製する。

ｐｃＧＮ２０１６ ｐＵＣ１２−Ｃｍ　（Ｂｕｃｋｌｅｙ、に、、　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、　Ｕ Ｃ３Ｄ、　ＣＡ　（１９８５））の多重クローニング部位をｐＵｃ１８のものに より置き換え、ｐＣＧＮ５６５を生ぜしめる。クロラムフェニコール耐性遺伝子 を含むｐＣＧＮ５６５のＨｈａ　Ｉ断片を切り出し、マングビーンヌクレアーゼ を使って平滑末端化し、そしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ　−（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ　；　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）のＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐｃＧ Ｎ２００８を得る。ｐｃＧＮ２０’０８のクロラムフェニコール耐性遺伝子をＥ ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ［消化により取り出す。フレノウ酵素で処理して平滑末 端にした後、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する断片をＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ　ＫＳ−のＤｒａ１部位に挿入してＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−のアンピ シリン耐性遺伝子を置換し、ｐｃＧＮ２０１６を作製する。

ｐｃＧＮ１５４７ ｐＣＧＮ１５４７　ＣＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、　ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９０）１４（２７）　：２６９−２７６） は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）オクトビンＴｉ−プラスミド１）ＴｉＡ６　（Ｃｕｒｒ ｉｅｒおよびＮｅ５ｔｅｒ、　虹」肛見（１９７６）（ＨｉｒｓｃｈおよびＢｅ ｒｉｎｇｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８４）　９：２８７１−２８９０）の ゲンタマイラン耐性遺伝子、ｐＬＪｂＢｌｌ　（Ｊｏｕａｎｉｎら、　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９８５）　２０１：３７０−３７４　）からのアグ ロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅ ｎｅｓ）　Ｒｉプラスミド複製開始点、Ｔｎ５　（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、前掲 ）のカナマイシン耐性遺伝子を有するｐＴ　ｉ　Ａ６のｍａｓプロモーター領域 とｍａｓ３’領域、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、　Ｇｅｎｅ　（１９７１ ）　２：９５−１３３）からのＣｏ１Ｅ１複製開始点、並びにｐＵｃｌｓ　ＣＮ ｏｒｒａｎｄｅｒら（１９８３）前掲〕からの１．ａｃＺ’スクリーニング可能 マーカー遺伝子を含むバイナリ−植物形質転換ベクターである。

ｐｃＧＮ１５４７を作製するのに３つの主な中間構成物が使用される。

ｐｃＧＮ１５３２　（下記参照）は、ｐｃＧＮ１５４７骨格、ｐＲｉプラスミド 複製開始点、およびＣｏ１Ｅｌ複製開始点から構成される。

ｐｃＧＮ１５３６　（、下記参照）はｍａｓ５’　−ｋａｎ−ｍａｓ３’植物選 択可能マーカー領域を含む。

ｐｃＧＮ１５４１ｂは、Ａ、ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）オクトビンＴｉ−プラスミドの右および左Ｔ−ＤＮＡボーダー、並びにｐＵｃ １９　ＣＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、　Ｇｅｎｅ　（１９８５）　３３： １０３−１１９）からの多重クローニング部位を有する１８ＣＺ’領域（細菌中 での選択可能マーカーとして使用する）を含む。このプラスミドの作製は後述す る。

上記プラスミドからｐｃＧＮ１５４７を作製するために、ｐｃＧＮ１５３６を珈 Ｉて消化し、そしてｍａｓ５’　−ｋａｎ−ｍａｓ３’領域を含む断片をｐｃＧ Ｎ１５４１ｂの艶１部位にクローニングし、Ｔ−ＤＮＡ左ボーダー／ｍａｓ５’ 　−ｋａｎ　−ｍａｓ３’　／１ａｃＺ’　／Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーを含むプラ スミドＩ］ＣＧＮ１５４３を得る。１）ＣＧＮ１５４３を顕ＩＩて消化し、そし てＴ−ＤＮＡ左ボーダー／ｍａｓ５’　−ｋａｎ　−ｍａｓ３’　／１ａｃＺ’ 　／Ｔ−ＤＮＡ右ボーダー領域を含む断片を、…旧で消化された１）ＣＧＮ１５ ３２中に連結せしめ、完全なバイナリ−ベクターを作製をＩ）ＰｈｌＪｌ　（Ｈ ｉｒｓｃｈおよびＢｅｒｉｎｇｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８４）　１２： １３９−１４１）からＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ消化により取り出し、そしてＥ ｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉで消化されたｐＵｃ９　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓ ｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９：２５９−２６８）中にクローニングし 、ｐＣＧＮ５４９を得る。ｐＣＧＮ５４９のＨｉｎｄｌ［−Ｐｓｔｌ消化により 、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む３．１ｋｂ断片を得、これをＤＮＡポリメラ ークーのフレノウ断片により平滑末端にし、そしてＰｖｕ　ＩＦで消化されたｐ ＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、　Ｇｅｎｅ　（１９７７）　２　：９５−１１ ３　）中にクローニングし、ｐＢＲ３２２Ｇｍを作製する。ｐＢＲ３２２Ｇｍを ｍＩとｆｉＩで消化し、フレノウ酵素で処理して平滑末端化し、そしてＡＪ３１ で消化されフレノウ酵素で平滑末端化されているＲｉ複製開始点含有プラスミド ｐＬＪｂＢ１１　（Ｊｏｕａｎｉｎ　ら、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、 （１９８５）２０１：３７０−３７４　）中にクローニングし、ｐＬＨｂＢｌｌ Ｇｍを得る。

石器消化によりｐＬＨｂ８１１０ｍから余分なＣｏ１Ｅｌ複製開始点およびカナ マイシン耐性遺伝子を除去した後、自己環化によりｐＧｍＢ　ｌ　ｌを作製する 。ＨｉｎｄｎＩ消化によりｐＧｍＢ　ｌ　１の損ユｄＩＩ［部位を除去した後、 フレノウ酵素での処理および自己環化によりｐＧｍＢｌ　１Ｈを得る。Ｐｓｔｌ 消化によりｐＧｍＢｌｌＨのＰｓｔ１部位を除去し、次いてフレノウ酵素での処 理および自己環化によりＩ）ＣＧＮ１５３２を得る。

ｐｃＧＮ１５３６ ｐＶＫ２３２　（ＫｎａｕｆおよびＮｅ５ｔｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８ ２）　８：４５　）かｐｃＧＮ１４を作製する。ｍａｓ　５　’領域ＣＢａｒｋ ｅｒら、　Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏ。

Ｂｉｏｌ、（１９８３）　２：３３５−３５０のナンバリングによればｂｐ　２ ０１２８−２１５６２）を含むＩ）ＣＧＮ１４の１４３　ｂｐＩＩＩ漣■断片を 、慇■−鎧虫Ｉ消化されたｐＵｃ１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら（１ ９８５）前掲〕中にクローニングし、ｐｃＧＮ４０を作製する。ｐｃＧＮ４０を 陸ＲＶと狙猛■で消化し、そして合成ＸｈｏＩリンカ−の存在下で連結せしめる ことにより、ｍａｓ　５　’領域の７４６　ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−ＮａｅＩ断片を Ｘｈｏ　Ｉ部位により置き換え、ｐｃＧＮ１０３６を得る。ｍａｓ　３　’領域 を含むｐｃＧＮ１４の７６５　ｂｐ顕■−旧ｎｄＩ［Ｉ断片（ｂｐ　１８４７４ −１９２３９）を、ム封−Ｈ１ｎｄＩ［消化されたＩ）ＵＣｌ３　（Ｎｏｒｒａ ｎｄｅｒら（１９８３）前掲〕中にクローニングし、ｐＣＧＮ４３を得る。Ｈｉ ｎｄＩ［での消化、フレノウ酵素による平滑末端化および合成ＥｃｏＲＩ　リン カ−ＤＮＡの連結により、Ｉ）ＣＧＮ４３のＨｉｎｄＩＩＩ部位をＥｃｏＲＩ部 位により置換し、ｐｃＧＮ１０３４を得る。ｍａｓ　５　’領域の近位にｍａｓ 　３　’領域のｂｐ１９２３９を置くような方向で、ｐＣＧＮ１０３４の７６’ ７　ｂｐ陸ＲＩ断片を独Ｒ１消化１）ＣＧＮ１０３６中にクローニングし、ｐｃ ＧＮ１０４０を作製する。ｐｃＧＮ１０４０を加Ｉでの部分消化にかけ、Ｔ４　 ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端にし、そして合成ＸｈｏＩリンカ−の存 在下で連結せしめる。ｂｐ　１８４７４とベクターＤＮＡとの接合点の所ｐｃＧ Ｎ１０４７を得る。

ｐＣＧＮ５６５　（上記参照）をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ［で消化し、フレノウ 酵素で処理して平滑末端化し、そして合成ＸｈｏＩリンカ−の存在下で連結せし めることにより、ｐＣＧＮ１００３を作製する。こ１］ｃＧＮ１００７を作製す る。間に多重クローニング部位を有するｍａｓ　５　’領域とｍａｓ　３　’領 域を含むｐｃＧＮ１０４７の１．５　ｋｂ　Ｘｈｏｌ断片を、ＸｈｏＩで消化さ れたｐＣＧＮ１００７中にクローニングしてｐｃＧＮ１０５２を得る。Ｉ）ＣＧ Ｎ１０５２の多重クローニング部位の一部分をＸｂａ　Ｉと５ｓｔＩでの消化に より削除し、フレノウ酵素で処理して平滑末端化しそして連結せしめることによ り、ｐＣＧＮ１０５２ΔＸＳを得る。

ｐＣＧＮ７８３は、Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの左および右Ｔ−ＤＮＡポーダ ーン耐性遺伝子、Ｔｎ５　（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎら、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇ ｅｎｅｔ。

（１９７９）　１７７：６５およびＷｏｌｆｆ　ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８５）１３：３５５−３６７）のカナマイシン耐 性遺伝子、およびｐＴｉＡ６　（Ｂａｒｋｅｒら、前掲（１９８３））の転写産 物７からの３′領域を含むバイナリ−プラスミドである。このプラスミドｐＣＧ Ｎ７８３は、１９８８年１２月２３日に受入番号６７８６８のもとにＡＴＣＣ（ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）に寄託されている。ｌ　ＡＴＧ−カナマイシン耐 性遺伝子を含むｐＣＧＮ７８３の１　ｋｂ妙Ｒ１−漉Ｉ断片を、鏝ＲＩ−３ｍａ 　［で消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｍ２Ｓ−ＫＳ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ、　Ｉｎｃ、。

ＣＡ）中にクローニングし、ｐＢＳＫｍを作製する；このプラスミドは一本鎖Ｄ ＮＡの生成を可能にするＭ１３領域を含む。供給者の教示に従って一本鎖ＤＮＡ を作製し、そして配列５’　ＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣ３’　（配列 番号１２）を存する合成オリゴヌクレオチドを使って試験管内突然変異誘発を行 いＣＡｄｅ　１ｍａｎら、　ＤＮＡ　（１９８３）　２：１８３−１９３）　、 カナマイシン耐性遺伝子のＰｓｔ１部位を変更してそれを消化できないようにし 、ｐｃＧＮ１５３４を得る。ｐＣＧＮ１５３４をＳｍａｌで消化し、合成シ四Ｒ １リンカ−ＤＮＡの存在下で連結せしめ、Ｉ）ＣＧＮ１５３５を作製する。

ｐｃＧＮ１５３５の１　ｋｂ論Ｒ１断片を凪遼Ｒ１消化されたｐｃＧＮ１０５２ ΔＸＳ中にクローニングし、ｍａｓ５’　−ｋａｎ　−ｍａｓ３　’植物選択可 能マーカーカセットＩ）ＣＧＮ１５３６を作製する。

１）ＣＧＮ１５４１ｂ １）ＣＧＮ５６５ＲＢα２Ｘ　（下記参照）をＩＩＩと加Ｉで消化し、そしてＴ −ＤＮＡ右ボーダー断片と１ａｃＺ’遺伝子とを含む７２８　ｂｐ断片を、加Ｉ Ｉ−珈ｌ消化されたＩ）ＣＧＮ６５ΔＫＸ−３＋Ｋ　（下記参照）と連結せしめ 、ｐＣＧＮ６５ΔＫＸ−Ｓ＋にの■ＩＩ−珈１右ボーダー断片を置換する。生じ たプラスミドｐＣＧＮ６５α２Ｘは、Ｔ−ＤＮＡボーダーも１ａｃＺ’遺伝子も 両方含む。ｐＣＧＮ６５α２ＸをＣ１ａＩで消化し、フレノウ酵素を使って平滑 末端化し、そしてＸｈｏＩリンカ−ＤＮＡと連結せしめることにより、ｐＣＧＮ ６５α２Ｘの」■断片をＸｈＯ［部位により置き換え、プラスミドｐＣＧＮ６５ α２ＸＸを生せしめる。

ｐＣＧＮ６５α２ＸＸをＢｇｌＩＩと独ＲＶで消化し、ＤＮＡポリメラークーの フレノウ断片で処理して平滑末端にし、そしてＢ５ｑ　Ｉ　Ｉ　リンカ−ＤＮＡ の存在下で連結せしめ、ｐＣＧＮ６５α２ＸＸ　’を作製する。ｐＣＧＮ６５α ２ＸＸ　’を顕ＩＩで消化し、ＩＩＩて消化された１）ＣＧＮ１５３８　（下記 参照）と連結せしめると、両方のプラスミド骨格を含むｐｃＧＮ１５４１ａを生 じる。１）ＣＧＮ１５４１ａをＸｈｏｌで消化し、再連結せしめる。ｐＡｃＹｃ １８４由来の骨格を欠くアンピシリン耐性でクロラムフェニコール感受性のクロ ーンを選択し、ｐＣＧＮ１５４１ｂを得る。

ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲｒとハ＋ｕＩＩで消化し、フレノウ酵素で処理して平滑 末端にし、そしてＢ１０　Ｉ　Ｉ　リンカ−と連結せしめることにより、ｐｃＧ Ｎ１５３８を作製する。１）ＣＧＮ１５３８はアンピシリン耐性でありテトラサ イクリン感受性である。

１）ＣＧＮ６５ΔＫＸ−３＋Ｋ Ｔ−ＤＮＡ　（右ボーダー）の塩基１３３６２−１５２０８　ＣＢａｒｋｅｒら 。

中にクローニングすることにより、ｐｃＧＮ５０１を作製する。Ｔ−ＤＮＡ　（ 左ボーダー）の塩基６０２−２２１２を含むｐＴｉＡ６　（７）１．６　ｋｂＨ ｉｎｄＩＩ［−３ｍａｌ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−３ｍａｌで消化されたＭ１３ ｍｐ９中にクローニングすることにより、ｐｃＧＮ５０２を作製する。ｐｃＧＮ ５０１とｐｃＧＮ５０２を共に、ＥｃｏＲ［とＨｉｎｄＩＩＩて消化し、両方の Ｔ−ＤＮＡボーダー含有断片を一緒に、画ｄＩ［Ｉ消化されたｐＵＣ９（Ｖｉｅ ｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９：２５９−２６８ ）中にクローニングすることにより、両方のＴ−ＤＮＡボーダー断片を含むｐｃ ＧＮ５０３を作製する。９ＣＧＮ５０３をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し 、生じた２ツノＨｉｎｄＩ［−ＥｃｏＲＩ断片ＣＴ−ＤＮＡボーダーを含む）を ＥｃｏＲＩ消化されたｐＨＣ７９（ＨｏｈｎおよびＣｏ１１ｉｎｓ、Ｇｅｎｅ　 （１９８０）　ｌＩ：２９１−２９８）中にクローニングし、ｐｃＧＮ５１８を 得る。左Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むｐｃＧＮ５１８かう（７）１．６　ｋｂ　ｎ 里ｒ−ＥｃｏＲＩ断片ヲ堡Ｉ−シ四ＲＩで消化されたｐＣＧＮ５６５中にクロー ニングし、ｐＣＧＮ５８０を得る。ｐＣＧＮ５８０　（７）Ｂａｍ旧−加Ｉ　Ｉ 断片をｐＡｃＹｃ１８４　（Ｃｈａｎｇお右ボーダー断片を含む１）ＣＧＮ６０ 　（下記のｐＣＧＮ５６５α２Ｘの記載を参照のこと）の１．４ｋｂ抑旦旧櫨肋 Ｉ断片を、胆醪１−鋤Ｉで消化されたｐＣＧＮ５１中にクローニングし、右およ び左Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むｐＣＧＮ６５を得る。

ｐＣＧＮ６５を狂１とＸｂａ　Ｉで消化し、フレノウ酵素で処理して平滑末端化 し、そして合成り）１４　Ｉ　Ｉ　リンカ−ＤＮＡの存在下で連結せしめ、ｐＣ ＧＮ６５ΔＫＸを作製する。ｐＣＧＮ６５ΔＫＸを５ａｌｌで消化し、フレノウ 酵素で処理して平滑末端化し、そして合成ＸｈｏＩリンカ−ＤＮＡの存在下で連 結せしめることにより、ｐＣＧＮ６５ΔＫＸ−３＋Ｘを作製する。

ｐＣＧＮ５６５ＲＢα２Ｘ ｐｃＧＮ４５１　（下記参照）をＨＬＬＩで消化し、合成鋤Ｉリンカ−ＤＮＡの 存在下で連結せしめることにより、ｐＣＧＮ５５を作製する。

ｐＣＧＮ５５のＸｈｏ　Ｉ−里１断片〔アグロバクテリウム・ツメファシェンス （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｔ−ＤＮＡ　（Ｂ ａｒｋｅｒら。

（１９８５）前掲〕中にクローニングし、１）ＣＧＮ６０を作製する。

ｐｃＧＮ６０の１．４　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−担醪Ｉ断片をＨｉｎｄｌ［［− 担旧で消化されたｐＳＰ６４　（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｉｎｃ、　）中にクローニ ングし、１）ＣＧＮ１０３９を得る。Ｉ）ＣＧＮ１０３９をカ隘Ｉと画■で消化 しくｂｐ　１４２７３−１５２０８を除去するＨ　Ｂａｒｋｅｒら、　Ｇｅｎｅ 　（１９７７）　２：９５−１１３）　、そして合成りｇｌｌＩ　リンカ−ＤＮ Ａの存在下で連結せしめ、ｐｃＧＮ１０３９ΔＮＳを得る。ｐｃＧＮ１０３９Δ ＮＳの０．４７ｋｌｌ旦辺Ｒトビ■断片を凪逗［−垣ｎｄＩ［で消化されたｐＣ ＧＮ５６５中にクローニングし、ｐＣＧＮ５６５ＲＢを得る。１）ＣＧＮ５６５ ＲＢをＨｉｎｄＩ［で消化し、フレノウ酵素で処理しそして合成ＸｈｏＩリンカ −ＤＮＡの存在下で連結せしめることにより、ｐＣＧＮ５６５ＲＢのＨｉｎｄＩ ［部位をＸｈｏＩ部位により置き換えてｐＣＧＮ５６５ＲＢ−Ｈ＋Ｘを作製する 。

ｐＵＣ１８（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、　Ｇｅｎｅ　（１９８３）前掲〕をＨａｅ Ｉ［で消化して１ａｃＺ’断片を遊離せしめ、フレノウ酵素で処理して平滑末端 にし、そしてＡｃｃＩと力虫Ｉで消化されフレノウ酵素で処理されているｐＣＧ Ｎ５６５ＲＢ−Ｈ＋Ｘ中に、１ａｃＺ’プロモーターが右ボーダー断片に近くな るような方向で１ａｃＺ　’含有断片を連結せしめる。この構成物ｐＣＧＮ５６ ５ＲＢα２Ｘは、適当な宿主上に置いた時１ａｃＺ’発現について陽性であり、 そしてＡｃｃｒ−鋤ｆ断片（ｂｔ）　１３８００−１３９９０）が除去されてい るｂｐ　１３９９０−１４２７３の右ボーダー断片ＣＢａｒｋｅｒら、　Ｐｌａ ｎｔ　Ｍｏ、　Ｂｉｏｌ、　（１９８３）　２：３３５−３５０）ｐｃＧＮ４５ １は、ｐＵｃ８　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、前掲）の誘導体中にク ローニングされたＴ−ＤＮＡ右ボーダーを含むｏｃｓ５’　−ｏｃｓ３′カセッ トを含む。この変更ベクターは、ｐＵＣ８をＨｉｎｃＩＩで消化しそして合成リ ンカ−ＤＮＡの存在下で連結せしめてｐｃＧＮ４１６を得ることにより誘導され 、次いでＥｃｏＲＩ消化後のフレノウ酵素での処理および自己連結によってｐｃ ＧＮ４１６のカセットを作製する。Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーを含む５′末端を生成 するために、ｐＴｉＡ６の鋤Ｒ１断片ｃｂｐ　１３３６２−１６２０２　（密接 に関連するＴｉプラスミドｐＴｉ　１５９５５についてのＢａｒｋｅｒら。

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ、　Ｂｉｏｌ、　（１９８３）　２：３３５−３５０によるナ ンバリング）〕をＥｃｏＲｒ消化により１）ＶＫ２３２　（ＫｎａｕｆおよびＮ ｅ５ｔｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８２）　８：４５　）から取り出し、そし てＥｃｏＲＩ消化されたｐＡｃＹｃ１８４　（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、前 掲）中にクローニングしてｐＣＧＮ１５を作製する。

ｐｃＧＮ１５の２．４　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−凪」ＲＩ断片（ｂｐ　１３７７４− １６２０２）をシ四ＲＩ−以剋旧消化されたｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、 前掲）中にクローニングし、ｐＣＧＮ４２９を得る。ｐｃＧＮ１５の４１２　ｂ ｐ凪遼Ｒ１−石器断片（ｂｐ　１３３６２−１３７７２）を−Ｒ１−胎ＨＩ消化 されたｐＢＲ３２２中にクローニングし、ｐｃＧＮ４０７を得る。Ｉ）ＣＧＮ４ ０７を論Ｉ　（ｂｐ　１３５１２）で消化し、次いでＢａ１３１エキソヌクレア ーゼでの再切断、合成ＥｃｏＲＩ　リンカ−との連結およびＢａｍＨＩでの消化 により、短縮されたプロモーター断片を得る。約１３０　ｂｐの生成断片をゲル 精製し、Ｍ１３ｍｐ９　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、前掲）中にクロ ーニングし、そして配列決定する。転写開始点と翻訳開始コドンとの間のｂｐ　 １３６２にＥｃｏＲＩ　リンカ−が挿入されているクロ位はｍＲＮＡ開始部位の 下流の１３６３９位にある。短縮プロモーターを含む［４の１４１　ｂｐ漫Ｒ１ −軸胴断片を影遼ＲＩ−Ｂ；唄Ｈ１消化されたｐＢＲ３２２中にクローニングし 、ｐＣＧＮ４２８を作製する。

ｐＣＧＮ４２８から（７）１４１　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩプロモーター 断片とｐＣＧＮ４２９からの２．５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ”■旧ｏｃｓ５　’断片 とを一緒に、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＵｃ１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒ ｏｎら（１９８５）前掲〕中にクローニングして１）ＣＧＮ４４２を作製し、短 縮プロモーター断片によりＯＣ３上流領域を再構成する。

ｏｃｓ３’末端を生成するために、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むｐＬＢ４１ 　（Ｄ、Ｆｉｇｕｒｓｋｉ、　ＵＣＳａｎ　Ｄｉｅｇｏ）のＨｉｎｄＩＩ［断片 を、ＨｉｎｄＩ［［消化されたｐＡｃＹｃ１８４　（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅ ｎ、前掲）中にクローニングし、１）ＣＧＮ４１３ｂを作製する。ｏｃｓ３’領 域を含むｐＴｉＡ６　（前掲）の４．７ｋｂ肱−Ｉ断片を、ｌ罰則消化されたの １１２０７位（Ｂａｒｋｅｒら、前掲）の浬１部位を艶■部位に変換し、ｐＣＧ Ｎ４０１．２を作製する。ｐｃＧＮ４０１．２　（７）３．８　ｋｂ　ＢａｍＨ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片をｍ■旧−ＥｃｏＲＩで消化されたｐｃＧＮ４１３ｂ中にク ローニングし、ｐｃＧＮ４１９を得る。

５′領域を含むｐＣＧＮ４４２の２．６４ｋｂ凪遼Ｒ１断片を瞼ＲＩで消化され たｐｃＧＮ４１９中にクローニングしてｐＣＧＮ４４６を作製することにより、 ｏｃｓ５　’　−ｏｃｓ３　’カセットを作製する。ｏｃｓ５’領域ｃｂｐ　１ ３６３９−１５２０８）とｏｃｓ３’領域（ｂｐ　１１２０７−１２８２３）を 有すルｐＣＧＮ４４６　ノ８．１　ｋｂ　Ｘｈｏｒ断片を、ｐＣＧＮ４２６　（ ７）Ｘｂｏｒ部位ニ部位−クローニングｃＧＮ４５１を得る。

ピンＴｉ−プラスミドｐＴｉＡ６　（ＣｕｒｒｉｅｒおよびＮｅ５ｔｅｒ。

Ｊ、　Ｂａｃｔ、　（１９７６）　１２６：１５７−１６５　）の左および右Ｔ −ＤＮＡボーダー、ｐＰｈｌ、ＪＩ　ＣＨｉｒｓｃｈおよびＢｅｒｉｎｇｅｒ、 　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８４）　９　：２８７１−２８９０　）のゲンタマイ シン耐性遺伝子、ｐＬＪｂＢｌ　１（Ｊｏｕａｎｉｎ　ら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、（１９８５）　２０１：３７０−３７４　）からのアグロバクテリ ウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）　Ｒ ｉプラスミド複製開始点、形質転換植物にカナマイシン耐性を付与することかで きる３５Ｓプロモーター−ｋａｎＲ−ｔｍ１３’領域、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉ ｖａｒら、Ｇｅｎｅ　（１９７７）　２：９５−１３３）からのＣｏ１Ｅ１複製 開始点、並びにｐＵｃ１８　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、　（１９８３）前掲〕か らの１ａｃＺ’スクリーニング可能マーカー遺伝子を含むバイナリ−植物形質転 換ベクターである。

１）ＣＧＮ１５５７を作製するのに３つの主な中間構成物が使用される。

ｐｃＧＮ１５３２　（ｐｃＧＮ１５４７の記載を参照のことンは、ｐｃＧＮ１５ ５７骨格、ｐＲｉプラスミド複製開始点、およびＣｏ１Ｅｌ複製開始点を含む。

ｐｃＧＮ１５４６　（下記参照）はＣａＭＶ３５Ｓ５’　−ｋａｎＲ−ｔｍ１３ ’植物選択可能マーカー領域を含む。

ｐｃＧＮ１５４１ｂ（ｐｃＧＮ１５４７の記載を参照のこと）は、Ａ、ツメファ シェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）オクトビンＴｉ−プラスミドの左およ び右Ｔ−ＤＮＡボーダー並びにｐＵＣ１９からの１ａｃＺ’領域を含む。

上記プラスミドからｐｃＧＮ１５４７を作製するために、ｐｃＧＮ１５４６をＸ ｈｏ　Ｉで消化し、そしてＣａＭＶ　３５Ｓ５　’　−ｋａｎ　”−ｔｍ１３’ 領域を含む断片をｐｃＧＮ１５４１ｂのＸｈｏ　Ｉ部位にクローニングし、Ｔ− ＤＮＡ左ボーダー／ＣａＭＶ　３５Ｓ５　’　−ｋａｎ　Ｒ−ｔｍ１３’　／１ ａｃＺ’　／Ｔ−ＤＮＡ左ボーダー領域を含むプラスミドＩ）ＣＧＮ１５５３を 得る。ｐｃＧＮ１５５３をａｇｔｒｔで消化し、モしてＴ−ＤＮＡ左ボーダー／ ＣａＭＶ　３５Ｓ５　’−ｋａｎ　Ｒ−ｔｍ１３’　／１ａｃＺ’　／Ｔ−ＤＮ Ａ左ボーダー領域を含む断片をＢａｍＨＩで消化されたｐｃＧＮＩ５３２中にク ローニングし、完全なバイナリ−ベクターｐＣＧＮ１５５７を得る。

ｐｃＧＮ１５４６の作製 ３５Ｓプロモーター−ｔｍ１３’発現カセットｐＣＧＮ９８６は、カリフラワー モザイクウィルス３５Ｓ　（ＣａＭＶ３５）プロモーターとＴ−ＤＮＡ　ｔｍｌ 　３　’領域を含み、それらの間に多重制限部位を育する。ＣａＭＶ３５Ｓプロ モーターおよび別の３′領域であるＣａＭＶ領域ＶＩ３　’末端を含む別の発現 カセットｐＣＧＮ２０６からＩ）ＣＧＮ９８６を誘導する。ＣａＭＶ３５Ｓプロ モーターをＡｌｕＩ断片（ｂｐ　７１４４−７７３４）生成せしめる。

ｐＣＧＮ５２８を１１　（で消化しそしてｐｃＧＮ１４７からのシ１旧−Ｂｇｌ ＩＩプロモーター断片を挿入することにより、プロモーター領域、選択可能マー カー（２ＡＴＧを存するＫＡＮ）および３′領域を含むｐｃＧＮ１４８ａを調製 する。この断片をＢＩＬ　Ｉ　Ｉ部位かｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝子に 対して近位にくるように１）ＣＧＮ５２８のＢｇｌｌＩ部位にクローニングする 。

この構成物ｐＣＧＮ５２８に使用されるシャトルベクターは次のようにして調製 される。カナマイシン耐性遺伝子を含むＴｎＳ性遺伝子を含む町ｄＩＩ［−Ｂａ ｍＨＩ断片をｐＡｃＹｃ１８４　（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、　（１９７８）　１３４：１１４１−１１５６）のテトラサイク リン遺伝子中の−ｄＩ［−Ｂａｍ旧部位にクローニングすることにより、ｐＣＧ Ｎ５２５を作製する。Ｓｍａ１部位中に挿入されたＸｈｏＩリンカ−により変更 されたｐＴｉＡ６のＢａｍ１９断片ＣＴｈｏｍａｓｈｏｗら、並置（１９８０） 　１９ニア２９−７３０）を、ｐＣＧＮ５２５のＢａｍ旧部位に挿入することに より、ｐＣＧＮ５２６を作製する。

ｐＣＧＮ５２６を艶［で消化して再連結せしめることによりｐＣＧＮ５２６から 小さいＸｈｏ　Ｉ断片を削除し、ｐＣＧＮ５２８を得る。

ｐｃＧＮ１４９ａは、ｐＭＢ９ＫａｎＸＸ　ＩからのＢａｍＨｒ−カナマイシン 遺伝子断片をｐｃＧＮ１４８ａの石器部位にクローニングすることにより作製さ れる。ｐＭＢ９ＫａｎＸＸ　Ｉは、Ｘｈｏ１部位を失っているが、アグロバクテ リウム菌中での効率的選択を考慮してＴｎ９０３からの機能的カナマイシン遺伝 子を含むｐＵｃ４に変異体（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　（ １９８２）　１９：２５９−２６８）である。

ｐｃＧＮ１４９ａをＨｉｎｄＩ［とＢａｍＨＩて消化し、そして−ｄｌ［と’Ｂ ａｍ旧で消化されているｐＵｃ１８と連結せしめ、ｐｃＧＮ１６９を得る。これ はＴｎ９０３カナマイシンマーカーを除去する。ｐＣＧＮ５６５（ｐｃＧＮ２０ １６の記載を参照のこと）とｐｃＧＮ１６９の両方をＨｉｎｄｌ［とＰｓｔＩで 消化し、連結し、ＣａＭＶ　３５ＳプロモーターおよびＴｎ５カナマイシン遺伝 子の５′末端の一部分（ＰｓｔＩ部位まで：Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎら（１９７９） 前掲）を含むプラスミドｐｃＧＮ２０３を形断片（ｂｐ　４０８−６１０５）　 ）をｐｃＧＮ２０３に付加する。生じた発現カセットｐｃＧＮ２０６はｐＣＧＮ ９８６の作製のための基礎である。

Ｂａｍ１９　Ｔ−ＤＮＡ断片ＣＴｈｏｍａｓｈｏｗら、　（１９８０）前掲〕か らｐＴｉＡ６Ｔ−ＤＮＡ　ｔｍｌ　３’配列をＢａｍＨ−ＥｃｏＲＩ断片ＣＢａ ｒｋｅｒら、　ＰｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　（１９８２）　訂３３５−３ ５０におけるようなナンバリングでは、ヌクレオチド９０６２〜１２．８２３） としてサブクローニングし、そしてＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ断片としてのｐ ＡｃＹｃ１８４　（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ　（１９７８）前掲）複製開始 点およびＢａｍＨ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片としてのゲンタマイシン耐性マーカー（ プラスミドｐＬＢ４１がら；Ｄ、　Ｆｉｇｕｒｓｋｉから入手）と連結せしめ、 ｐｃＧＮ４１７を作製する。

リンカ−を使ってＩ）ＣＧＮ４１７のユニークＳｍａｒ部位（…１９１００ヌク レオチド１１．２０７）を５ａｃＩ部位に変更し、そして石器−３ａｃｌ断片を ｐＣＧＮ５６５中にサブクローニングし、ｐｃＧＮ９７１を作製する。リンカ− を使ってｐｃＧＮ９７１のＢａｍＨＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に変更する。生じた ｔｍｌ　３　’調節配列を含むＥｃｏＲｌ−３ａｃ　Ｉ断片を、ＥｃｏＲｌとＳ ａｃ　Ｉての消化によりｐｃＧＮ２０６　ニ連結せしめ、１３ＣＧＮ９７５を得 る。５ａｌｒとＢｇｌＩＩでの消化、平滑末端化および５ａｌＩリンカ−との連 結により、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの３′末端からＴｎ５カナマイシン耐 性遺伝子の小部分を除去する。

最終発現カセットｐＣＧＮ９８６は、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの後に、田 月部位、Ｘｂａ　Ｉ部位、勝旧、　ＳｍａＩ、拘ｔｎｌおよびｔｍｌ　３　’領 域（Ｔ−ＤＮＡのヌクレオチド１１２０７−９０２３）を含む。

３５Ｓプロモーター−ｔｍｌ　３　’発現カセットｐＣＧＮ９８６をｐＣＧＮ９ ８６Ｘと命名する。ニトリラーゼ遺伝子を含む１）ＢＲＸ２５　（下記参照）の 塩■ＨＩ−３ａｃＩ断片をＢａｍＨｌ−３ａｃ　Ｉで消化されたｐＣＧＮ９８６ Ｘ中に挿入し、ｐＢＲＸ６６を得る。

ｐＢＲＸ２５の作製は米国特許公報４．８１０．６４８に記載されており、これ は参考として本明細書に組み込まれる。簡略すれば、この方法は次の通りである 。ブロモキシニル特異的ニトリラーゼをコードする１２１’２ｂｐ　ＰｓｔＩ− ＨｉｎｃＩＩ　ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は６５　ｂｐの５′非翻訳ヌクレ オチドを含む。それらの余分なヌクレオチドの一部の除去を容易にするために、 プラス生成した末端にＢａｍＨＩ　リンカ−を付加する。機能的ブロモキシニル 遺伝子を含む里甲旧−Ｈ１ｎｃＩＩ断片をｐＣＧＮ５６５の、堕旦旧−３ｍａＩ 部位にクローニングする。生じたプラスミドｐＢＲＸ２５は、わずか１１１）ｐ の５′非翻訳細菌配列を含む。

ｐＢＲＸ６６をＰｓｔｆとＥｃｏＲＩで消化し、フレノウポリメラーゼでの処理 により平滑末端にし、そしてＸｈｏＩリンカ−を付加する。

生じたプラスミドｐＢＲＸ６８は、約１．１ｋｂであるｔｍｌ　３　’領域を有 する。ｐＢＲＸ６８を５ａｌＩと５ａｃＩで消化し、フレノウポリメラーゼでの 処理により平滑末端にし、そしてＥｃｏＲＩ　リンカ−を付加する。生じたプラ スミドｐＣＧＮ９８６ＸＥは、ニトリラーゼ遺伝子を欠り３５Ｓプロモーター− ｔｍｌ、　３　’発現カセットである。

次いてｐＣＧＮ９８６ＸＥ中にＴｎ５カナマイシン耐性遺伝子を挿入する。ｐｃ ＧＮ１５３６　（ｐｃＧＮ１５４７の記載を参照のこと）の１．０ｋｂＥｃｏＲ Ｉ断片を、ＥｃｏＲＩで消化した１）ＣＧＮ９８６ＸＥ中に連結せしめる。正し い転写および翻訳方向においてＴｎ５カナマイシン耐性遺伝子を有するクローン を選択し、ｐｃＧＮ１５３７ｂと命名する。

次いで３５Ｓプロモーター−Ｋａｎ　”　−ｔｍｌ　３　’領域をクロラムフェ ニコール耐性プラスミド骨格に移行させる。ｐＣＧＮ７８６ＣｐＣＧＮ５６６中 に挿入されたクローニング部位ＥｃｏＲＩ、　５ａｌＩ、旦ｇｌｌＩ、　Ｐｓｔ ｆ、　Ｘｈｏｌ、以狸旧および地ｎｄＩ［を含む、合成オリゴヌクレオチド ５’　ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧ ＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴ　３’（配列番号１３）を有するｐＵｃ−ＣＡＭベースの ベクター；　ｐＣＧＮ５６６は、ｌ）ＬＩＣ１３−ｃｍ　（Ｋ、Ｂｕｃｋｌｅｙ 　（１９８５）前掲）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位中に挿入されたｐＵｃ １８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［リンカ−を含む］を、生じたクローンをｐｃＧ Ｎ１５４６と命名する。

Ｂｃｅ４発現カセットの種々の部分を用いて、トランスジェニック植物中での遺 伝子の発現を指令することかでき、そしてそれらの発現パターンを比較すること ができる。ｐＣＧＮ１８７０（実施例３に記載）から誘導される２つの例はｐｃ ＧＮ１８７３とｐｃＧＮ１８７６てあり、これを下記に記載する。

β−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）遺伝子を含むｐＢＩ２２１　ＣＪｅｆｆｅｒｓ ｏｎら、至（１９８７）飢３９０１−３９０７　）のｂ旦Ｈ１−釘」Ｉ断片を、 抛ＨＩｐｃＧＮ１８０４を得る。ｐｃＧＮ１８０４を瞼Ｒ１て消化し、大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼＩでの処理により平滑末端化する。平滑末端化されたＥｃｏＲ １部位に市販のリン酸化ＸｈｏＩＩＪンカー（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ：　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を挿入し、ｐｃＧＮ１８０５を作製する。

Ｘｈｏｌリンカ−との連結は、ｐｃＧＮ１８０５のＸｈｏ　１部位の片側５ａＩ Ｉ−Ｘ堕Ｉ断片をｐＣＧＮ１８７０の里１部位に挿入し、ｐｃＧＮ１８７１を得 る。Ｂｃｅ４カセット中にｇｕｓ遺伝子を含むｐｃＧＮ１８７１のＰｓｔＩ断片 をＩ）ＣＧＮ１５５７　（上述）のカ匹１部位に挿入し、ｐｃＧＮ１８７３を作 製する。ｐｃＧＮ１８７３は、７．４　ｋｂのＢｃｅ４５’調節配列と１．９ｋ ｂのＢｃｅ４３’調節配列の支配下にｇｕｓ遺伝子を含む。

ｇｕｓ遺伝子を含むｐｃＧＮ１８７１のＣｌａｌ断片をｐｃＧＮ２０１６のＣｌ ａｌ部位に挿入することにより、ｐｃＧＮ１８７４を作製する。ＢｃｅＪカセツ を作製する。ｐｃＧＮ１８７６は、５．］、ｋｂのＢｃｅ４５’調節配列と０． ７ｋｂのＢｃｅ４３’調節配列の支配下にｇｕｓ遺伝子を含む。

バイナリ−ベクターｐｃＧＮ１８７３とｐｃＧＮ１８７６をアクロバクテリ中に 形質転換せしめ、そして実施例４に記載のようにしてセのに使用する。

９５％エタノール中に２分間浸し、１滴のＴｗｅｅｎ　２０を含む次亜塩素酸ナ トリウムの１％溶液中で表面滅菌し、そして無菌蒸留水中で３回すすぐ。次いで ピリドキシン（５０μｇ＃）、ニコチン酸（５０μｇ／ｌ）、グリシン（２００ μｇ／ｌ）および０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒ（Ｇｉｂｃｏ）　ｌ）８５．８か補 足された１／１０濃度のムラシゲ最少有機培地（Ｇｉｂｃｏ）の入ったＭａｇｅ ｎｔａ箱の中に種子を置く。

約６５μアインシユタイン／イ／秒（μＥｍ−２Ｓ−’）の強度で冷却蛍光と赤 色光で１６時間の光周期において２２°Ｃで種子を発芽させる。

５〜７日齢の実生から胚軸を切り取り、長さ約４　ｍｍの小片に切断し、そして 支持プレート（Ｈｏｒｓｈら、　１９８５）上に置く。

支持プレートは、約３０ｍ１のＭＳ塩基剤（Ｃａｒｏｌｉｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ）、１００ｍｇ／　ｌのイノシトール、ｌ、　３ｍｇ／　ｊｉ’のチアミ ン−ＨＣｌ、　２００　ｍｇのＫＨ２ＰＯ，，３％ショ糖、２．４−Ｄ　（１， ０ｍｇ／　Ｉり　、０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒを含むペトリ皿（１００Ｘ２５　 ｍｍ）上に１．０艷のタバコ懸濁培養物を置くことにより使用１日前に調製し、 そしてｐＨを５．８に調整した後オートクレーブする（ＭＳＯ／Ｉ１０培地）。

使用前に上記支持細胞層の上に滅菌済濾紙ディスク（Ｗｈａｔｍａｎ　３　ｍｍ ）を載せる。２．４−Ｄ　（０，２ｍｇ／ｌ　）　、Ｋｉｎｅｔｉｎ　（０，１ ｍｇ／ｌ　）を含む支持層について記載されたようにして１００−の新鮮なＭＳ 培地中に１０ｍ１の培養物を移すことにより、タバコ懸濁培養物を毎週継代培養 する。支持細胞を使用しない実験では、胚軸外植片を切断し、ＭＳＯ／Ｉ１０培 地の上の濾紙ディスク上に置く。全ての胚軸外植片を、３０μＥｍ−２３−’　 〜６５μｒｍ−２３−’の強度の連続光で２２°Ｃて２・１時間支持プレート上 でブレインキュベートする。

スに移し、３０°Ｃて一晩増殖させる。ｌＸｌ０”細菌／　ｍｌに希釈された細 菌を含む７〜１２−のＭＧ／Ｌグロス中に胚軸外植片を浸し、１０〜２５分後に 支持プレート上に移す。アグロバクテリウム菌との４８時間の同時インキュベー ション後、濾過滅菌したカルベニシリン（５００ｍｇ／　ＩＩ　、オートクレー ブ後に添加）および２５ｍｇ＃’の濃度の硫酸カナマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むＢ５０／Ｉ１０カルス誘導培地に移す。

６５μＥｍ−”　Ｓ−’の連続光で３〜７日間培養後に切断面にカルス組織が見 られ、そして胚軸外植片を苗条誘導培地Ｂ５ＢＺ　（３ｍｇ／　ｌのベンジルア ミノプリン、１　ｍｇ＃７のゼアチン、１％ショ糖、０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒ が補足され５．８にｐＨ調整されたＢＳ塩とビタミン）に移す。この培地は、カ ルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）および硫酸カナマイシン（２５ｍｇ／　ｊ７　 ）も含む。二連間ごとに新鮮な苗条誘導培地上で胚軸外植片を継代培養する。

１〜３力月後胚軸カルスから苗条が再生する。高さ少なくとも１ｃｍの緑色苗条 をカルスから切り取り、Ｂ５塩およびビタミン、１％ショ糖、カルベニシリン（ ３００ｍｇ／ｌ！　）　、硫酸カナマイシン（５０ｍｇ／　ＩＩ　）および０． ６％Ｐｈｙｔａｇａｒを含む培地上に置く。２〜４週間後、緑色のままの苗条を 元から切り、そして発根誘導培地（Ｂ５塩およびビタミン、１％ショ糖、２ｍｇ ／　ｌのインドール酪酸、５０ｍｇ／　ｌの硫酸カナマイシンおよび０．６％Ｐ ｈｙｔａｇａｒ）を含むＭａｇｅｎｔａ箱に移す。発根した緑色苗条をＮＰＴＩ Ｉ活性について試験する。

上記かられかるように、Ｂｃｅ４５’上上流部配列の調節支配下のＤＮＡ配列は 、種子組織における優先的な発現を証明するだろう。本発明によれば、Ｂｃｅ４ 調節領域は、特に種子の栄養素含量を高める育用な性質を付与する方法を提供す る。

本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当業 者の技術水準を示すものである。これらの全ての刊行物および特許出願は、あた かも各々の刊行物または特許出願が特別に且つ独立的に参考として組み込まれる ものと指摘されたかように本明細書に参考として組み込まれる。

今まで本発明を説明および実施例により幾分詳細に記載してきたけれども、添付 の請求の範囲の範囲内において幾つかの変更および改良を行い得ることは明白で あろう。

要約書 初期種子形成において優先的に発現される新規配列およびそれに関連する方法 分子プローブとして使用するかまたは植物宿主中に挿入することができる新規Ｄ ＮＡ構成物が提供される。それらの構成物は、着目の核酸配列に連結された、少 な（とも開花後１１日日目ど初期から開花後約３０〜３５日日まで種子組織中の 転写を指令することができるＢｃｅ４遺伝子から得られる配列、および転写終結 領域を含んで成る。従って、Ｂｃｅ４ｉ１Ｎ節領域の支配下領域核酸配列により コードされる情報の転写は、種子形成の特定の時期に起こるであろう。こうして 、外因性生産物の生産、並びに内因性生産物の改変を行うことができる。

国際調査報告 １＋ｔ＋ｅ１ｍ’ｍａＩ４１−１−１−ｒ＊ｌｌｍＡｍ、ＰＣＴ）ＩＪｓ９１１ ０１７５０１真の続き ［相］Ｉｎｔ、　ＣＬ　’　識別記号　庁内整理番号光　明　者　クリドル、ジ エーン　シー、　アメリカ合衆国、ｉライブ　５３８ 発　明　者　スケクー、ドナ　イー、　アメリカ合衆国、ｉイーフォース　スト 特表千４−５０６１５５　（１９） カリフォルニア　９５６１６．ディビス、リード　ドカリフォルニア　９５８１ ６．サクラメント、サーテトリート　１０３１

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂｃｅ４から得られる配列を含んで成る染色体外核酸断片。
2. ２．ｃＤＮＡを含んで成る請求項１の断片。
3. ３．ゲノム配列を含んで成る請求項１の断片。
4. ４．Ｂｃｅ４構造遺伝子のすぐ上流の少なくとも５．１ｋｂを含んで成る請求項 １の断片。
5. ５．Ｂｃｅ４構造遺伝子のすぐ上流の少なくとも７．４ｋｂを含んで成る請求項 １の断片。
6. ６．５′から３′の転写方向において、Ｂｃｅ４転写開始領域および野生型Ｂｃ ｅ４構造遺伝子配列とは異なる着目のＤＮＡ配列を含んで成る、ＤＮＡ構成物。
7. ７．５′から３′の転写方向において、Ｂｃｅ４プロモーターおよび着目のＤＮ Ａ配列を含んで成る、請求項６のＤＮＡ構成物。
8. ８．前記Ｂｃｅ４プロモーターがＢｃｅ４構造遺伝子のすぐ上流の少なくとも５ ．１ｋｂを含んで成る、請求項７のＤＮＡ構成物。
9. ９．前記Ｂｃｅ４プロモーターがＢｃｅ４構造遺伝子のすぐ上流の少なくとも７ ．４ｋｂを含んで成る、請求項７のＤＮＡ構成物。
10. １０．植物細胞中で機能的な第一の転写終結領域を更に含んで成る、請求項７の ＤＮＡ構成物。 １０．前記転写終結領域がＢｃｅ４構造遺伝子のすぐ下流の少なくとも０．７ｋ ｂを含んで成る、請求項１０のＤＮＡ構成物。
11. １１．前記転写終結領域がＢｃｅ４構造遺伝子のすぐ下流の少なくとも１．９ｋ ｂを含んで成る、請求項１０のＤＮＡ構成物。
12. １２．第一の選択可能マーカーを更に含んで成る、請求項６のＤＮＡ構成物。
13. １３．前記着目のＤＮＡ配列がアンチセンスＤＮＡ配列である、請求項６のＤＮ Ａ構成物。
14. １４．前記着目のＤＮＡ配列が構造遺伝子配列である、請求項７のＤＮＡ構成物 。
15. １５．第二の転写開始領域、および５′から３′の転写方向において第二の着目 のＤＮＡ配列を更に含んで成り、ここで前記第二の転写開始領域はＢｃｅ４転写 開始領域とは異なり、そして前記第二の着目のＤＮＡ配列はＢｃｅ４転写開始領 域の調節支配下の着目のＤＮＡ配列とは異なる、請求項６のＤＮＡ構成物。
16. １６．植物の表現型を変える方法であって、５′から３′の転写方向においてＢ ｃｅ４転写開始領域および着目のＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物がゲノム 中に組み込まれている植物を生育する段階を含んで成り、それによって前記着目 のＤＮＡ配列の転写が前記植物の表現型を変える方法。
17. １７．前記着目のＤＮＡ配列がアンチセンスＤＮＡ配列である、請求項１６の方 法。
18. １８．前記着目のＤＮＡ配列が前記Ｂｃｅ４転写開始領域を有する読み枠内の構 造遺伝子配列である、請求項１６の方法。
19. １９．前記着目のＤＮＡ配列が脂肪酸合成に関連する、請求項１６の方法。
20. ２０．前記転写開始領域がＢｃｅ４プロモーターである、請求項１６の方法。
21. ２１．前記Ｂｃｅ４プロモーターが少なくとも５．１ｋｂを含んで成る、請求項 ２０の方法。
22. ２２．前記Ｂｃｅ４プロモーターが少なくとも７．４ｋｂを含んで成る、請求項 ２０の方法。
23. ２３．前記植物がアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）に属する、請求項２０の方法 。
24. ２４．前記植物が種子から生育される、請求項２０の方法。