JPS63112987A - 種子特異的転写調節造成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 種子特異的転写のための植物の遺伝的修飾が提供される
。内因性産出物の生産を調節することができるか又は新
たな性能を提供することができる。

〔従来の技術〕

遺伝的修飾において、主として原核生物及び削孔動物細
胞が重要視されてきた。種々の理由から、植物を遺伝子
的に操作することはその他の真核細胞の場合よりも困難
であることが分かっている。

このことは、一部は、目標が異っているためであり、何
故ならば、大くの場合、植物の修飾は、培養細胞を修飾
することとは異なって、生きている植物について植物全
体又は植物の特定部分を修飾することに向けられてきて
いるからである。

多くの用途について、植物の特定部分に又は植物の生長
サイクルの特定の時期に転写を提供することが望ましい
。この目的のため、その転写又は発現が注目の態様で調
節される内因性植物生成物を同定することにかなりの関
心がよせられている。

そのような生成物を同定する際には、最初に、細胞生長
サイクルの特定の時期に又は植物の特定部分に現れる生
成物を求め、そのものがその他の時期に又はその他の部
分に存在しないことを証明し、その生成物に関連する核
酸配列を同定し、次いで転写と関連する５′−非翻訳配
列を得るために植物のゲノム中の配列を同定しなければ
ならない。

この場合、最初にその特定の配列を同定し、次いでそれ
が正しい配列であることを証明し、そして所望の転写調
節頭載を分離するためにかなりの研究を必要とする。次
いで固有の造成物を立案し、次いでその造成物が所望の
態様で所期の効果をあげることを証明しなければならな
い。

そのような配列を同定することは、かなりの陥りやすい
過ち及び不確実性を伴い、困難な研究課題である。しか
しながら、植物を遺伝子的に修飾することができること
にかなりの関心向けられており、そのため転写配列を同
定しそしてそれらの効用を決定するためにそれらを操作
するためのかなりの経費及び努力が正当化される。

関連文献は次の通りである： ｖａｎ　ＶｌｏＬｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ、　Ｇｒｏｏｔ及
びｆｌａｉ１編、Ｃｒｏｕｃｈ等著＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｆｏｒｍ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ
ｈｅＰｌａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、　１９８５゜ｐｐ５５５
〜５６６　　；Ｃｒｏｕｃｈ及び５ｕｓｓｅｘ、　Ｐｌ
ａｎｔａ（１９８１）１５３　：　６４〜７４　；　Ｃ
ｒｏｕｃｈ等、２ｈ五堕ユＮ叶土、Ｇｅｎｅｔ。

（１９８３）　２　：　２７３〜２８３．及びＳｉｍｏ
ｎ等、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅ−匹圏り肛虹皿１（１９
８５）　５　：　　１９１〜２０１にはプラッシカ・ナ
プス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　　！Ｌ！Ｊ２且り−の貯蔵蛋
白質の種々の態様が記載されている。Ｂｃａｃｈｙ等、
　［ＥＭＢＯＪ。

（１９８５）土：　３０４７〜３０５３　；　Ｓｅｎｇ
ｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ等。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｌｓＡ（１
９８５）旦２　　：　　３３２０〜３３２４　　；Ｇｒ
ｅｅｎｗｏｏｄ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｐｈ　ｓｉｏ＋。

（１９８５）７９　；　６５〜７１及びＣｈｅｎ′：Ｊ
、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ口、Ａｃａｄ。

質及び遺伝子操作に関する研究が記載されている。

Ｒｃｋｅｓ等、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｃｎｅｔ、　（１
９８６）　２０５　：　１４〜２２及びＰｌｕｈｒ等、
　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８Ｇ）　２３２　：　１１０
６〜１１１２には光誘導性植物遺伝子の遺伝子操作が記
載されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

種子特異的転写を提供するために植物細胞を操作するの
に用いられるＤＮＡ告成物が提供される。

特に、貯蔵蛋白質転写領域が野性型遺伝子以外に連結さ
れそして種子特異的転写を提供するために植物ゲノム中
に導入される。その造成物は内因性生成物の修飾並びに
異種性生成物の生産を提供する。

〔問題点を解決するための手段〕

種子中での、特に種子の成熟中の胚中での転写の変更を
可能にする新規なりＮＡ造成物が提供される。そのＤＮ
Ａ造成物は、種子の形成に関連した、好ましくは胚形成
及び種子の成熟に関連した修飾された転写開始領域を含
む、特に関心のあるものとしては、ナピン（ｎａｐｉｎ
）　、クルジフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）　、β
−コングリシニン（β−ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）、フ
ァセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）、等のような貯蔵蛋
白質と関連した転写開始領域がある。

その転写開始領域は好都合な任意の宿主、特に植物宿主
、例えばブランシカ」ユｕ江紅（例えば、ナプスハ鉦閃
）又はカンペストリス兵ｌ阻競セ１ｓ））、大豆グリシ
ン・マクス７　　ｍａｘ）、豆７アセオルス・ブルガリ
ス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　　■ｈ肛ｎ）　、）ウモロコ
シすなわちゼア・マイズ血懸ハ）、綿ゴッシピウム・８
ｐ、Ｃ並ｕｕｈＬ　伝、ベニバナすなわちカルサムス・
チンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　　ｔｉｎｃｔｏ
ｒｉｕｓ）　、）マドすなわちリコペルシカン・エスク
レンッム（敬並匹旦江旦ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ＋）　、
及びクバエ・Ｓｐ　（釦吐並と狙劇上り−から得ること
ができる。

種子特異的転写開始調節領域のもとにあり且つその下流
側は注目の配列があり、このものは、量、相対分布等に
関して内因性生成物の生産を、又は種子中に新規な機能
又は生成物を提供するように異種性発現生成物の生産を
調節することによって、種子の表現型の変更をもたらす
。その中に遺伝子を挿入することができる発現カセット
を得るために、ＤＮＡ造成物に終結領域をもうける。転
写開始領域及び終結領域に、調節領域の転写調節のもと
にあるように遺伝子を挿入するための１個又は複数個の
制限部位をもつリンカ−又はポリリンカーを転写の方向
に別個に設けるのが便利である。

普通には、リンカ−は１〜ｌＯ個、−店普通には約１〜
８個、好ましくは約２〜６個の制限部位を有する。一般
的には、リンカ−は１００ｂｐよりも少なく、しばしば
６０ｂｐよりも少なく、そして一般的には少なくとも約
５ｂｐである。

転写開始領域は宿主に対して生得的又は同種性であり、
あるいは宿主に対して外来性又は異性であることができ
る。“外来性”とは、その中に転写開始領域が挿入され
るべき野性型宿主中にその転写開始領域が見いだされな
いことを意味する。

特に関心のある転写開始領域はブランシカ（Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ　　７又はブランシカ・カンペストリス（Ｂｒａ
ｓｓ　ｉｃａシ堕且ｅｓｔｒｉｓうのナピン遺伝子、ア
シルキャリヤータンパク貿、種子中でほぼ７日〜４０日
に発現を示し、特に約１０日〜約２０日に最大発現を示
す遺伝子に関係するものであり、その発現した遺伝子は
葉中には見いだされないが、一方その発現生成物は種子
中に非常に豊富に見いだされる。

転写カセットは転写の５’−３’の方向に、植物中で機
能する転写及び翻訳開始領域、注目の配列、及び転写及
び翻訳終結領域を含む。１つ以上のイントロンも存在す
ることができる。そのＤＮＡ配列は注目のペプチド例え
ば酵素をコードする任意のオープンリーディングフレー
ム、又はゲノム配列に対する相補的配列をもつことがで
き、この場合にそのゲノム配列は読み取り枠、イントロ
ン、非コード性リーダー配列、又はその他の任意の配列
であることができ、その相補的配列は転写、メツセンジ
ャーＲＮＡプロセシング、例えばスプライシング、又は
翻訳を抑制するであろう。注目のＤＮＡ配列は合成によ
るものでも、天然産でも、又はそれらのｘ■み合わせで
もよい。注目のＤＮＡの性質に依存して、植物の好まし
いコドンをもつ配列を合成ことが望ましい。植物の好ま
しいコドンは注目の特定の植物種中で最大量で発現され
る蛋白質のための最も高い開度のコドンから求めること
ができる。

転写カセットの調製においては、ＤＮＡ配列を適当な方
向で且つ、適切には、適切なリーディングフレームで提
供するように、種々のＤＮＡ断片を操作することができ
る。この目的のため、ＤＮＡ断片を連結するためにアダ
プター又はリンカ−を用いることができ、あるいは好都
合な制限部位、余分なりＮＡの除去、制限部位の除去等
を提供するためにその他の操作を伴うことができる。こ
の目的のためには、生体外での突然変異の誘発、プライ
マー修復、制限酵素処理、アニーリング、切除、連結反
応等を用いることができ、それらの場合に挿入、欠失又
は置換、例えばトランジション及びトランスバージョン
を伴なってもよい。

用いられる終結領域は基本的には好都合なものでよい。

なぜならばその終結領域は比較的互換性であると思われ
るからである。その終結領域は転写開始領域に由来して
も、注目のＤＮＡ配列に由来しても、又はその他に由来
してもよい。好都合な終結領域、例えばオクトピンシン
サーゼ及びノバリンシンサーゼの終結領域はＡ、チュメ
ファシエンス（Ａ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ
ｉ　−プラスミドから人手できる。

制限酵素処理、平滑末端を得るためのオーバーハングの
フィルイン又はチューイングバック、リンカ−の連結等
のごとく適当な操作によって、連結のために断片に相補
的末端を設けることができる。

種々の工程の実施において、ＤＮＡの量を増幅し且つ作
用が適切な方式で生じていることを保証するためにＤＮ
Ａの分析を可能にするために、クローニングを用いる。

広範囲の種々のクローニングベクターが入手でき、この
場合、クローニングベクターとしては大腸菌（Ｐエ　ｃ
ｏｌｉ）中で機能する複製系、及び形質転換細胞の選択
を可能にするマーカーを有する。ベクターの例としては
ｐＢＲ３３２、ｐＬｌｃシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ
、ｐＡＣＹＣ１８４等力くある。従って、配列は１個又
は２個以上の適切な制限部位でベクター中に挿入するこ
とができ、その生成プラスミドは大腸菌（Ｅ、　　ｃｏ
ｌｔ）宿主を形質転換させるのに用いられ、この大腸菌
■、並旦）は適切な栄養培地中で増殖し、そしてその細
胞は収集されて溶解され、そしてプラスミドが回収され
る。分析は配列分析、制限酵素分析、電気泳動等を伴う
ことができる。各々の操作の後に、最終造成物中に用い
られるべきＤＮＡ配列は制限酵素処理されそしてその次
の配列に連結されることができ、この場合に、部分的な
造成物の各々は同−又は異なるプラスミド中でクローニ
ングすることができる。

転写造成物に加えて、転写造成物を植物中に導入する方
式に依存して、その他のＤＮＡ配列が必要となるかもし
れない。例えば、後記するように、植物細胞の形質転換
のためにＴｉ　−又はＲｉ　−プラスミドを用いる時に
は、Ｔｉ　−及びＲｉ　−プラスミドのＴ−ＤＮＡの少
なくとも右ボーダー及びしばしば左右の両ボーダーをフ
ランキング領域として転写造成物に連結する。植物細胞
の形質転換のためにＴ−ＤＮＡを用いることは広範に研
究されており、そして［Ｐ＾−３ｅｒ　Ｎ［Ｌ１２０，
５１６号；　Ｉｌｏｅ−ｋｅｍａ著Ｔｈｅ　Ｂｉｎａｒ
ｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　０ｆｆ
ｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ　Ｂ、Ｖ
、、　Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ＋　１９８５＋ｖ章；
　Ｆｒａｌｅｙ等、　Ｃｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　
Ｓｃｉ、　＋↓：１〜４６；及びＡｎ等、　ＥＭＢＯＪ
、　（１９８５）　４　：　　２７７〜２８４に詳細に
記載されている。

あるいはまた、植物ゲノム中への組込みを増強するため
に、トランスポゾンの末端反復をボーダーとしてトラン
スボサーゼと共に用いることができる。この状態では、
トランスポサーゼの発現は誘４的であるべきであり、又
はトランスボザーゼは不活性化されるべきであり、こう
することによっていったん転写造成物がゲノム中に組込
まれたならば、それは比較的安定に組込まれてホッピン
グが回避される。

転写造成物は通常は、植物細胞中での選択のためにマー
カーに連結される。好都合には、マーカーは殺生物剤、
特に抗生物質、例えばカナマイシン、Ｇ４１８　、プレ
オマイシン、ヒグロマイシン、クロラムフェニコール等
に対する耐性であることができる。用いられる特定のマ
ーカーは、挿入されたＤＮＡを欠いている細胞と比較し
て形質転換細胞の選択を可能にするものである。

ＤＮＡを植物細胞宿主中に挿入するのに種々の技術が利
用できる。これらの技術としては形質転換剤としてＡ、
チュメファシエンス（Ａ、　　ｔｕｍｅｆａ−ｄ並紅又
はＡ、リゾゲネス（紅　止ｎ■並並）を用いてのＴｉ−
ＤＮＡによる形質転換、プロトプラスト融合、注入、エ
レクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）等がある。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏ−ｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）による形質転換のためには、Ｔｉ−プラ
スミドと相同なりＮＡ、特にＴ−ＤＮＡを含有するプラ
スミドを大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）中で調製すること
ができる。そのプラスミドはアグロバクテリウム−θｌ
四あ匹１■力Ｌ）中で複製することができてもできなく
てもよい。即ち、転写造成物がＴｉ　−プラスミド中に
組込まれるべきであるか、または独立のプラスミド上に
保持されるべきであるかに一部分依存して、広域原核性
複製系、例えばＲＫ　２９０をもってももたなくてもよ
い。ヘルパープラスミドによって、転写造成物をＡ、チ
ュメファシエンス（紅　セ」旦す立ｉ旦り−に伝達させ
、そしてその生成する形質転換生物体を植物細胞の形質
転換に用いることができる。

好都合には、外植片をＡ、チュメファシエンス（Ａ、　
　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はＡ、リゾゲネス（Ａ。

拮ｎ■弘競）と共に培養して転写造成物を植物細胞に伝
達させることができ、植物細胞は選択のために適当な選
択的培地中に分散させ、カルスに生育させ、苗化せしめ
、そして発根培地中での生長によって苗から幼植物を再
生させる。アグロバタテリウム■■並虹旦亘叩）宿主は
、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に伝達するのに必要なりｉｒ遺
伝子をもつプラスミドを含有しており、またＴ−ＤＮＡ
をもっていてもいなくてもよい。注入及びエレクトロポ
レーションのために、無力にされたＴｉ　−プラスミド
（腫瘍遺伝子、特にＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　ｖｌ域の欠失し
ているもの）を植物細胞中に挿入することができる。

造成物は種々の方式で用いることができる。特に、その
造成物は種子中の脂肪酸組成を変更するのに、即ち、長
さ、不飽和等に関して、種々の脂肪酸の比及び／又は量
を変化させるのに用いることができる。従って、脂肪酸
組成を変化させて、炭素原子数１６〜１８個の脂肪酸に
比較して炭素原子数１０−１４個の脂肪酸を増加させ、
炭素原子数２０〜２４個の脂肪酸を増加させるか又は減
少させ、飽和又は不飽和の脂肪酸の割合を上昇せしめる
こと等ができる。これらの結果は、１種以上の内因性生
成物、特に酵素又は補因子の発現の低下を提供すること
によって、転写生成物の成熟及び／又は発現を抑制する
ように生来の遺伝子の転写生成物と相補的である転写産
出物を生産せしめることによって、又は脂肪酸合成に関
係した、内因性又は外因性のいずれかの遺伝子の発現を
提供することによって達成される。脂肪酸合成に関連す
る発現生成物としてはアシルキャリヤー蛋白質、チオエ
ステラーゼ、アセチルトランスアシラーゼ、アセチル−
ＣｏＡカルボキシラーゼ、ケトアシルシンサーゼ、マロ
ニルトランスアシラーゼ、ステアロイル−ＡＣＰデサチ
ュラーゼ、及びその他のデサチュラーゼ酵素がある。

あるいはまた、哺乳動物を含むその他の由来からの生成
物、例えば血液因子、リンフ才力イン、コロニー刺激因
子、インターフェロン、プラスミノーゲン活性化因子、
酵素（例えばスーパーオキシドジスムターゼ、キモシン
等）、ホルモン、ラット乳チオエステラーゼ２、エイコ
サペンクエン酸の合成に関与するリン脂質アシルデサチ
ュラーゼ、ヒト血清アルブミンから種々の生成物を得る
ことを望むかもしれない。他の目的は、種子の栄養価に
一層良く適合する改良されたアミノ酸分布をもつ種子蛋
白質、特に突然変異した種子蛋白質のレベルを高めるこ
とである。この状況においては、生来のコード領域又は
非コード領域に対して相補的（ｃｏｍｐ　ｌｅｍｅｎ　
ｔａｒｙ）なりＮＡ配列を作ることによって生来の種子
蛋白質の抑制を提供し、この場合に相補的配列は突然変
異した配列となるようには有効にハイブリダイズしない
か、または生来の転写能力を不活性化する。

形質転換されている細胞はｔｉｌｌｌの方式に従って生
長して植物となる０例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ等、■
と↓工１Ｌル１こ堕（１９８６）　５　：　８１〜８４
を参照のこと。これらの植物を次いで生育させ、そして
同一の形質転換された系統又は異なる系統と授粉せしめ
、所望の表現型特性をもつ雑種を同定する。二世代以上
を生長させて、主題の表現型特性が安定に維持され且つ
遺伝されることを確実にし、次いで種子を収）正して所
望の表現型又はその他の特性が達成されていることを保
証する。

宿主細胞として、注目の種子を提供する任意の植物種を
用いることができる。従って、大くの場合、種子が多量
に生産されるか又は注目の種子特異的産出物が伴なわれ
る植物が選ばれる。注目の種子としては、脂肪種子、例
えばブラソシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子、綿種子、大
豆、ベニバナ、ヒマワリ等、穀物種子、例えばコムギ、
オオムギ、コメ、クローバ−、トウモロコシ等がある。

有用な転写開始領域の同定は多数の方法で達成できる。

種子蛋白質が単離されているか又は単２１Ｉされる場合
には、それを部分的に配列決定することができ、こうし
て種子に対して特異的なメツセンジャーＲＮＡを同定す
るためのプローブを設計することができる。種子と特異
的に関係するメツセンジャーＲＮＡをさらに濃縮するた
めに、ｃＤＮＡを調製し、そしてそのｃＤＮＡを種子と
関連しないメツセンジャーＲＮＡ又はｃＤＮＡにより差
し引くことができる。その残留ｃＤＮＡを次いで、植物
細胞から調製された適切なライブラリーを用いて、相補
的配列についてゲノムをプローブするのに用いることが
できる。次に、ｃＤＮＡにハイブリダイズする配列を単
離し、操作し、そしてコード領域と関係している５′−
非翻訳領域を単離し、そして発現造成物中で用いてその
５′−非１訳領域の転写活性を同定することができる。

ある場合には、ゲノムライブラリーのスクリーニングに
直接にプローブを用いそしてそのプローブとハイブリダ
イズする配列を同定することによって研究努力を更に短
縮することができる。その配列を前記したようにして操
作して５′−非翻訳５貫域を同定する。

５′−非翻訳領域を用いて調製した発現造成物を、（５
′−非翻訳領域と関係した野生型リーディングフレーム
以外の）異種８原の構造遺伝子と共に機能するその能力
及び種子特異性の決定のために、前記したようにして植
物細胞中に形質転換させることができる。こうして、種
子特異的転写のための配列と共に用いるための特異的配
列を同定することができる。特に関心のある発現カセッ
トは、ナピン遺伝子、特にブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃ
ａ）のナビン遺伝子、−ｉ特定的にはブラッシカ・ナプ
ス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　　７又はブラツシ力・カンペス
トリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　　■五且「ｎ）遺伝子；脂
質生産、特に脂肪酸生産と関係した調節構造遺伝子（こ
れは特定の植物に対して内因性又は外因性であってもよ
いアシルキャリヤータンパク質、例えばホウレンソウア
シルキャリヤータンパク質、ブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉ
ｃａ）アシルキャリヤータンパク質、ナプス（旦匹蛙又
はキャンペストリス（匹肚堕ｙｎ）のいずれかのアシル
キャリヤータンパク質、カフエア（（イ）此並）アシル
キャリヤータンハク質を含む）、アセチルトランスアシ
ラーゼ、マロニルトランスアシラーゼ、β−ケトアシル
シンターゼＩ及び■、チオエステラーゼ、特に植物、哺
乳動物、又はバクテリア源からのチオエステラーゼ■、
例えばラットチオエステラーゼ■、アシルＡＣＰ、又は
リン脂質アシルデサチュラーゼからの転写開始領域を含
む。

以下の諸実施例は例示のためであって限定的ではない。

使用したクローニングベクターは、次のものを包含する
：　　ｐＵｃベクター、ｐＵｃ　ａおよびｐＨｃ　９（
ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　、、Ｇｅｎｅ（１
９Ｂ２）１９　：　２５９−２６８）　；　ｐＵｃ　１
Ｂおよびｐｕｃ　１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、Ｇｅｎ
ｅ（１９８３）、ｌｉ　：　１０１−１０６）　；　Ｙ
ｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、、　Ｇｅｎｅ（１９８５
）刹：　１０３−１１９）、および前述のｐＵｃプラス
ミドのアンピシリン耐性のためのマーカーとしてタロラ
ンフェニコール耐性を示すｔＪ’ｆ　（）２のベクター
（ｐＵｃ−ＣＡＭ　（ｐＵｃ　１２−Ｃ＋ａ、　ｐＵｃ
　１３−Ｃｍ）　Ｂｕｃｋｌｅｙ　１に０、Ｐｈ、ＤＳ
ＴｈｅｓｉｓＳＵ、Ｃ，Ｓ、Ｄ、、ＣＡ　１９８５）、
　ｐＬＩｃ　１８およびｐｕｃ　１９ベクターの多数の
クローニング部位をｐＨｃ−ＣＡＭのそれらと交換して
、ＣＡＭ耐性のｐＣＣＮ　５６５およびｐＣＣＮ　５６
６をツ＜ッた。また、ｐＵｃｌｌＢおよびｐｕｃ　１１
９を使用し、これらは、それぞれ、ｐＵｃのＮｄｅ　　
１部位に挿入された、５４６５におけるｊＬｇｉＡ■部
位から５９４１における」的Ｉ１１部位までのＮ１３の
遺伝子開領域をもつｐｕｃ　１Ｂおよびｐｕｃ　１９で
あった。（Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、およびＭｅｓｓｉｎｇ、
Ｊ、Ｗａｋｓｍａｎ＋Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、Ｒｕｔｇｅ
ｒｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｒｕｔｇｅｒｓ＋Ｎ、Ｊ
、から入手可能）。

且−牲 末端デオキシヌクレオシドトランスフェラーゼ（ＴＤＴ
）　、ＲＮアーゼＨＸＥ、コリ　（Ｌ　匹旦）ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ４キナーゼ、および制限酵素はベデスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｄｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉ’ｅｓ）から得た；Ｅ。

コリ（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　リガーゼはニュー・イング
ランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇａｌｎｄ　Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）から得た；逆転写酵素はライフ・サイエン
シズ・インコーホレーテッド（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃ
ｅｓ、　Ｉｎｃ、）から得た；アイソトープ類はベイケ
ム・インコボーレーテソド（Ｂａｃｈｅ１１＋、　Ｉｎ
ｃ、　Ｔｏｒｅｎａｃｅ、　Ｃ＾）から得た。

実施■土 ナピンプロモーターの構成 ｐｇＮ　１クローン上のナピン（ｎａｐｉｎ）遺伝子の
ＡＴＧ開始コドンより２９８上流に、ｐＵｃ　ａにクロ
ーニングされたナビン遺伝子を含有するＢ、ナプス（Ｂ
、　　ｕ匹吐ゲノムＤＮＡの３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片が存在する（Ｍａｒｉ　Ｃｒｏｕｃｈ、　Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｉａｎａから入手可能）　、
　ｐｇＮＩ　ＤＮ八をＥｃｏＲＩおよび５ｓｔｌで消化
し、そして」並Ｒ１／　Ｓ旦Ｉ消化ｐＣＧＮ　７０６に
連結した。　　（ｐＣＧＮ　７０６はｐＣＧＮ　５６６
の韮１部位およびＰｓｔ１部位においてクローニングさ
れた他のナピンｃＤＮＡクローンｐＮ２の３′およびポ
リアデニル化配列（Ｃｒｏｕｃｈ等、　１９８３且肛紋
を含有する。

Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｐｓｔ　ｌ断片である。）得られるク
ローンｐＣＧＮ　７０７をづ刺」で消化し、そして酵素
」１３１で処理して、ナビン遺伝子のコード領域のいく
らかを除去した。得られる切除されたＤＮＡを、」紅３
１処理後Ｓｍａ　Ｉで消化し、そして再連結した。クロ
ーンの１つ、ｐＣＧＮ　７１３、を大きさにより選択し
、ＥｃｏＲＩおよび１旧消化によりＥｃｏＲＩ／　Ｂａ
ａ旧消化ｐＥＭＢＬ　１Ｂ（Ｄｅｎｔｅ等、Ｎｃ、１ｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８３）旦：　１６
４５−１６５５）およびｐｕｃ　１１Ｂ　（７）両者ニ
サブクローニングして、それぞれ、Ｅ４１８およびＥ　
４１１Ｂを得た。Ｂａ１３１の消化の程度は、Ｅ　４１
Ｂ鋳型のＳａｎｇｅｒのジデオキシ配列決定によって確
証された。

プロモーター領域の」旦３１欠失は開始コドンより下流
の５７ヌクレオチドにのみ及び、こうしてナピンのコー
ド配列の５′末端および５′末端の約３００ｂｐを含有
した。８４１１ＢをＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈの方
法（Ｎｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８２
）１０　：　６４８７−６５００）によりオリゴヌクレ
オチドのプライマー５′−ＧＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴ
ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣ−３’を使用して、
ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によって調節してＡＴ
Ｇ出発コドンを含むナピンのコード領域のすべてを欠失
させた。適当な突然変異体についてのスクリーニングを
、Ｅ、コリ　（Ｌｃｏｌｉ）菌株ＪＭ　８３系の２回の
形質転換（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｊ、、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、
　Ｎ１１ｌ　Ｐｕ１ｊｌｉｃａｔｉｏｎ　！’ｋＬ７９
−９９．２　Ｎ１２．１９７９．　ｐｐ４３−４８）お
よび推定のＳｍａ　Ｉ消化によって実施した。得られる
ナピンプロモーターのクローンは、ｐＣＧＮ　７７Ｂで
あり、そしてｐｇＮ　１のＥｃｏＲ１部位からナピンの
ＡＴＣ開始コドンの直前の、Ａヌクレオチドまでの２９
８ヌクレオチドを含有する。プロモーター領域を、Ｅｃ
ｏＲ１および［ｌａｍｌｌｌによる 一一一一■−■■１−−■１ 消化並びに」並Ｒ１／　Ｂ憇１１１消化ｐＣＧＮ　５６
５への連結によりクランフェニコール耐性バックグラウ
ンドへサブクローニングしてｐＣＧＮ　？７９ｃを得た
ピンプロモーターのクローンの１− ｐＣＧＮ　７７９ｃは潜在的５′−調節配列の２９８ヌ
クレオチドのみを含有する。ナビンプロモーターをもと
のλｎＮａクローン上の５　’　−ＥｃｏＲ１部位より
上流に存在する１、８ｋｂの断片で伸張した。λＢｎＮ
ａ（Ｍ、　Ｇｒｏｕｃｈから入手可能）の、約３．５ｋ
ｂの」凰ｌ断片（これはンピン領域を含む）を５ａｌｔ
消化ｐｕｃ　１１９にサブクローニングしてｐｃＧＮ９
３０を得た。

５’Ｘｔ＋ｏｆ部位に密接する１ｌｉｎｄｌ１１部位を
使用して、ｐＣＧＮ　９３０の」旦ｄｌｌｌ／　Ｅ印Ｒ
１断片を」旦ｄｌｌｌ／　ＵｃｏＲＩ消化ブルースクリ
プト（Ｂｕｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　＋（Ｖｅｃｔｏｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ）にサブクローニングしてｐＣＧＮ　９４２を得た
。ＥｃｏＲｒで消化したｐＣＧＮ　？７９ｃとＥｃｏＲ
ＩおよびＰｓｔｌで消化したｐＣＧＮ　９４２とを結合
してｐＣＧＮ　９４３を造ることによって、伸張したナ
ピンプロモーターを構成した。このプロモーターは、Ａ
ＢｎＮａ上に含有されるナビン遺伝子のもとのＡＴＧよ
り上流に約２．１ｋｂの配列を含有する。プロモーター
領域の部分的配列を次の式で示す。

以下余白 ｆａＮＩ ｂｏｌ１ ＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＧＡＧＴＡＧＴＡＧ
ＡＡ５ＧＡＴＴＴＧｄｅ１ ＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＧＡ
ＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣ２Ｓａｐ［ ２１４ＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡ
ＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＧＥｃｏＲ１ ３５６ＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡ
ＡＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＡａｅｌｌ ｂ４ ＴＴＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡ
ＣＴＡＣＡＡ＾＾Ｃ八　　６ＳＩＴＥ　　（ＮＡＰ−２
７０）　　　：　　Ｑ丈Ｓ］りしトム１ 伸張したナピンプロモーターおよびナピン３′−調節領
域を結合して、種子特異的遺伝子を発現するためのナピ
ンカセットをつくる。使用するナピン３′−領域は、」
並Ｒ１／　Ｓ虱Ｉ消化ｐＣＧＮ　５６５にサブクローニ
ングしたｐｇＮ　１からのＸｈｏ　Ｉ　／ＥｃｏＲＩ断
片を含有するプラスミドｐＣＧＮ　１９２４　（Ｘｈ。

１部位はナビン遺伝子の停止コドンから１８ヌクレオチ
ドに位置する）からのものである、　　１ｌｉｎｄＩＩ
Ｉ　／　Ｐ旦ｌ消化ｐＣＧＮ　９４３およびｐＣＧＮ　
１９２４を連結して、遺伝子を挿入するためのユニーク
クローニング部位Ｓｓａ　Ｉ　ｓ　　Ｓａｌ　Ｉおよび
Ｐｓｔｌをもつ、ナピンカセットｐＣＧＮ　７４４をつ
くる。

ホウレンソウの８からのｃＤＮＡ−イフ゛う警−の゛龜
戒 Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　　（
１９８５）　３　：　２４１−２４６に記載されるよう
にして、全体のＲＮＡを若いホウレンソウの葉から４モ
ルのグアニジンチオシアネート緩衝液中で抽出した。全
体のＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースのカラムクロ
マトグラフィーに２回かけて、Ｍｎ１ａｔｉｓ等、　（
１９８２）Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　　
：＾　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｓ　Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ
　Ｗｏｒｋに記載されているようにして、ポリ　（Ａ）
　”　ＲＮＡを生成した。　ｃＤＮ＾ライブラリーを、
ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆａ＋ａｎ、　Ｇｅｎｅ（１
９８３）２５　：　２６３−２６９の方法に従い、わず
かの変更を用いてｐｌＪｃ　１３−Ｃａ＋中で構成した
。ＲＮａｓｉｎは、完全に除去されない場合、第２の鎖
の合成を妨害するので、第２鎖の合成において省略し、
そして上の論文に記載されている逆転の代わりに、ｄＣ
ＴＰを使用してベクターＤＮＡをテール形成し、モして
ｄＧＴＰを用いて２末鎖ｃＤＮＡをテール形成した。ア
ニールしたｃＤＮＡを、１Ｉａｎａｈａｎ＋　　Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ｂｉｏｌ、　（１９８３）」餞：　５５７−５８
０に従い、コンピテントＥ、コリ（Ｅ、　　ｃｏ旦）　
ＪＭ３　（Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９７９）　赳肛し）に形
質転換し、そして５０．／ａ１のクロランフェニコール
および０．００５％のＸ−Ｇａ１を含有するＬＢ寒天平
板（Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉ＋ｍｅｎｔ
　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）上に
拡げた。

ホウレンソウＡＣＰ−１ｃＤＮＡの６・合計はぼ８００
０のｃＤＮＡクローンを、各々が２００ｃＤＮ＾を代表
する４０プールからのクローン分析ＤＮＡ　（下を参照
）とのサザン・プロット（Ｓｏｕ−ｔｈｅｒｎ、　　Ｊ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　（１９７５）９８：５０
３　）　、Ａイブリダイゼーションを実施することによ
って、スクリーニングした。ホウレンソウＡＣＰ−１０
の１６アミノ酸領域（５’　−ＧＡＴＧＴＣＴＴＧＡＧ
ＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＴＡＣＣ
Ａ八＾ＣＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’　）と少なくとも６６
％が相同性である５′へ端標識合成オゴヌクレオチド（
ＡＣｒ’Ｐ４）は、１６アミノ酸のペプチドｇ　ｌｕ−
ｇｌｕ−ｇ　ｌｕ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−１１ｅ−ａｓｎ−
ｖａ　ｌ−ａｓｐ−ｇｌｕ−ａｓｐ−１ｙｓ−ａｌａ−
ｇｌｎ−ａｓｐ−ｉｌｅ　　（ホウレンソウＡＣＰ−■
の残基）　　（ＫｕｏおよびＯｈｌｒａｇｇｅ、　Ａｒ
ｃｈ、　８ｉｏｃｈｅｍ。

影旦吐１Ｌ（１９８４）韮：２９０〜２９６〕をコード
することができるＤＮＡに対する相補体であり、そして
ＡＣＰプローブのために使用した。

サザン・プロットおよびドツト・プロットハイブリダイ
ゼーションのためのクローン分析ＤＮＡを次のようにし
て調製した。形質転換体を、寒天平板から、５０＆／ｌ
ｌ１１のクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地へ、
１０クローン／１０ｍｌ培地の群として移した。培地を
３７℃の振盪インキュベーターで一夜インキュ、ベーシ
ョンし、次いで等体積の培地で希釈し、そしてさらに５
時間増殖させた。各々２００のｃＤＮＡクローンのプー
ルを、２０の試料の内容物を混合することによって得た
。

ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ＋　Ｎｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９７９）７　：　１５１３−
１５２３に記載するようにして、ＤＮＡをこれらの細胞
から抽出した。ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム
で抽出し、次いでエタノール沈殿によって精製して、制
限酵素で消化できるようにした。ＤＮＡを無菌の蒸留水
中に再懸濁し、次いでｌ＆の４００のプールしたＤＮＡ
試料の各々を」並Ｒ１およびＨ３ｎｄｌｌｌで消化し、
そして０．７％のアガロースゲルで電気泳動した。ＤＮ
Ａをニトロセルロースのフィルターに移し、次いでサザ
ン・プロットハイブリダイゼーション技術にかけた。

ＡＣＰＰ　４を、製造業者の仕様書に従いγ−”ＰｄＡ
ＴＰおよびＴ４キナーゼで５′末端標識した。クロ−ン
分析ＤＮＡのサザン・プロットの移送からのニトロセル
ロースのフィルターを、Ｂｅｒｅｎ　を等、　Ｂｉｏ−
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８５）　３　：　２０８−
２２０に従い、ハイブリダイゼーションしく４２℃、２
時間）そして洗浄した。ＤＮＡプールの同一の組のドツ
ト・プロットを、１６の各ＤＮＡプールを０．５　Ｍの
Ｎ　ａ　Ｏ１ｌ中ナイロン膜フィルターに適用すること
によって調製した。これらのプロットを、５０％のホル
ムアミド／１％のＳＤＳ／ＬＭのＮａＣ１中で４２℃に
おいて２４時間プローブとハイブリダイゼーションし、
そして２ＸＳＳＣ１０，１％のＳＤＳ　（ＩＸＳＳＣ＝
０．１５ＭのＮａＣ１；　０．０１５　Ｍのクエン酸ナ
トリウム；５ＤＳ−ドデシル硫酸ナトリウム）中で室温
において洗浄した。ＡＣＰＰ　４オリゴプローブとハイ
ブリダイズしたプールからのＤＮＡをＪＭ８３に形質転
換し、そして上のように平板培養して個々の形質転換体
を生成した。これらの個々のｃＤＮＡクローンのドツト
・プロットをニトロセルロースのフィルターに適用し、
これをＡＣＰＰ　４オゴヌクレオチドのプローブとハイ
ブリダイゼーションし、そしてプールしたＤＮＡ試料の
サザン・プロットについてと同一の条件を使用して分析
した。

ヌクレオチド　ｒｌの＼ 陽性のクローン、ｐｃＧＮｌｓＯＬ、を制限酵素で消化
し、そして次の部分的地図を得た。

＊＊示される有効制限部位をもつポリリンカー。

ｃＤＮＡクローンをｐ［Ｉｃ　１１Ｂおよびｐｕｃ　１
１９に、制限酵素処理、連結、形質転換および分析の標
準的実験室技術性使用してサブクローニングした（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ等、　（１９８２）前掲〕。−末鎖のＤＮ
Ａ鋳型を調製し、そしてＤＮＡ配列をＳｉｎｇｅｒのジ
デオキシ技術（Ｓｉｎｇｅｒ等＋　（１９７７）Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７４　：　５４６３　５４６７）
を用いて決定した。

配列の分析はインテリージャネチクス・インコーホレー
テッド（Ｉｎｔｅｌｌｉ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ
、）からのソフトウェアのパッケージを使用して実施し
た。

ｐ（：ＧＮＩＳＯＬは、ｍＲＮＡのポリ　（Ａ）ティル
を表わす３′末端にＡ残基の伸張を包含する、はぼ’ｙ
ｏｏｂｐのｃＤＮＡインサートを含有する。位置６１に
おけるＡＴＧコドンは、ＭＥＴ翻訳開始コドンをコード
すると推定される。このコドンは４１１ヌクレオチドの
オープンリーディングフレームの開始点であり、そのヌ
クレオチド２２９−４７１は、前述のＫｕｏおよびＯｈ
ｌｒｏｇｇｅのＡＣＰ−１の発表されたアミノ酸配列に
ほとんど完全に相当するアミノ酸配列をもつ蛋白質をコ
ードする。成熟蛋白質に加えて、ｐｃＧＮｌｓＯＬは、
また、核によりコードされた葉緑体蛋白質について期待
されうる、５６の残基トランシットペプチド配列をコー
ドする。

ピンーＡＣＰ゛告 一月１旧ＩＩ／勿旧で消化したρＣＧＮＩＳＯＬ、−月
１ｄＩＩＩおよび」憇Ｈ１で消化したｐＨｃ　８、並び
に勿ＩＩＩで消化したｐｕｃ　１１８を結合することに
よって、ｐＣＧＮ　７９６を構成した。ｐＣＧＮ　７９
６からのＡＣＰ遺伝子を、Ｂａｍ１ｌｌＩによる消化お
よびＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ５６５との連結によって、
クロラムフェニコールのバックグラウンド中に移した。

得られるｐＣＧＮ　１９０２をＥｃｏＲＩおよびＳｍａ
　Ｉで消化し、そしてＨｃｏＲＩ　／Ｓｍａ　Ｉ消化ｐ
ｕｃ　１１８に連結してｐＣＧＮ　１９２０を生成せし
めた。ｐＣＧＮ　１９２０中のＡＣＰ遺伝子を」並■部
位において消化し、クレノー断片で処理してフィル−イ
ンし、Ｓｍａ　Ｉで消化し、そして再連結してｐＣＧＮ
　１９１９ＷＰを形成せしめた。これによりＡＣＰ遺伝
子から５′−コード配列を排除し、そしてＡＴＧを再生
した。ｐＣＧＮ　１９１９１を」印Ｒ１で消化し、その
部位をクレノー断片によりフィルインし、そしてコニリ
ンカ−を連結することによって、このＡＣＰは両端に」
１１部位を有するようにされた。このクローンをｐＣＧ
Ｎ　９４５と呼ぶ。

ｐＣＧＮ　９４５のＡＣＰ遺伝子を勿１１１／ｐｓ口断
片として、Ｂａｍ１ｌｌおよび一貞１１で消化してρＵ
Ｃ１１８へ移動せしめてｐＣＧＮ　９４５ａを形成し、
こうして」氾１　　（ｐＵｃ　１１８により提供される
）はＡＣＰ配列の５′−末端に存在してナビンカセット
へｐＣＧＮ９４４へのクローニングを容易にするであろ
う。

」１１および」■１で消化したｐＣＧＮ　９４５ａを、
」坦！および」創」で消化したｐＣＧＮ　９４４に連結
してナピンＡＣＰカセットｐｃＧＮ　９４６を生成せし
めた。

次いで、ナピンＡＣＰカセットを二元ベクター１）ＣＧ
Ｎ　７８３中にＨｉｎｄｌｌｌからのクローニングによ
って移してｐＣＧＮ　９４８を生成せしめた。

ニーベクターＣＧＮ　７８３の　１＆ ｐｃＧＮ　７８３は、Ａ、チュメファシエンス（Ａ。

ｔｕｍｕｆａｃｉｅｎｓの左および右のＴ−ＤＮＡボー
ダー（Ｂａｋｅｒ等、　Ｐｌａｎｔ　　Ｍｏ１．　　Ｂ
ｉｏｌ、（１９８３）　２　：３３５−３５０　）　　
；　ｐＰＨＩＪＩのゲンタマイシン耐性遺伝子（ｌｌｉ
ｒｃｈ等ｐ　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８４）、　１２　
：　１３９−１４１　）、カリフラワーのモザイク病ウ
ィルス（ＣａＭＶ）の３５３プロモーター（（Ｃａｒｄ
ｎｅｔ）等、　Ｎｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、（１
９８１）　９　：　２Ｂ７１　２８９０）　、Ｔ　ｎ５
のカナマイシン耐性遺伝子（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ等＋　
１ｎｆｒａおよび１４ｏ１ｆｆ等、前掲（１９８５）１
３　：　３５５−３６７　）およびｐＴｉＡ６のトラン
スクリプト７からの３′領域（Ｂａｋｅｒ等。

前掲（１９８３）　）を含有するバイナリ−プラスミド
である。

ゲンタマイシン耐性マーカーを得るために、ゲンタマイ
シン耐性遺伝子をｐｐＨＩＪ１の３．１　ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ　−Ｐｓｔ　ｌ断片から分離し、そしてｐｕｃ　９
にクローニングしてｐＣＧＮ　５４９を生成した。ゲン
タマイシン耐性遺伝子を含有する１ｌｉｎｄｌｌｌ　−
Ｂａｍ１ｌｌ断片ヲ、ｐＣＧＮ　５８７（７）　Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ　−」しＩＩｌ断片置換した。

ｐＣＧＮ　５８７を次のように調製した：　　ＡＰＩＩ
Ｉ（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ等、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇ
ｅｎｅｔ、（１９７９）１７？　：６５〕のための全構
造遺伝子を含有するＨｉｎｄｌｌｌ−Ｓｍａ　ｌ断片を
ｐＵｃ　８　　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、
Ｇｅｎｅ（１９８２）月し２５９〕にクローニングし、
」旦■部位にすぐに隣接するＥｃｏＲ１部位が存在する
ので、この断片をＢｉｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩ断片に
転化した。次いで、ＡＰＩＩＩ遺伝子の３′一部分を含
有するＰｓｔｌ−」並ＲＩ断片を一彫辺Ｒ１−Ｂ憇旧−
」１１−一均匹１リンカ−と共にｐｕｃ　７のＥｃｏＲ
１部位中に連結した（ｐｃＧＮ　５４６Ｗ）。この造成
物はカナマイシン耐性を与えないので、カナマイシン耐
性はＡＰＩＩＩＩ遺伝子の」■！Ｉ−血１断片をＢａｍ
１ｌｌ−血１部位中に挿入することによって得た（ｐＣ
ＧＮ　５４６Ｘ）。この手順はＡＰＩＩＩＩ遺伝子を再
構成するので、ＥｃｏＲ１部位が遺伝子の両端にできる
。ＡＴＧコドンは−ＡＰＩＩＩＩのＡＴＧ開始コドンを
もつリン−ディングフレーム外であってそれより上流に
存在する。望ましくないＡＴＧは、ＡＰＩＩＩＩの５′
−末端からの」赳３Ａ−ノ１０断片（この断片は余分の
ＡＴＧを含まない）を、ｐＣＧＮ　５４６Ｗの勿１（１
−Ｐ！；口部位の中に挿入してプラスミドｐＣＧＮ　５
５０を生成することによって回避した。

次いで、ＡＰＨＩＩ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ断片を
、発現のためのオクトピンシンターゼ・カセットを含有
するｐＣＧＮ　４５１のユニークＥｃｏＲ１部位にクロ
ーニングしてｐＣＧＮ　５５２　（ＩＡＴＧ）を生成せ
しめた。

ｐＣＧＮ　４５１はオクトピンカセットを含み、このカ
セットは−ＥｃｏＲＩリンカーを介して、ｐＴｉＡ６の
オクトピンシンターゼ遺伝子の３パ非コード領域へ融合
した５′非コード領域を含有する。ｐＴｉ座標は、Ｂａ
ｋｅｒ等、Ｉ’１ａｎｔ　　Ｍｏ１．　１ｉｏ１．　（
１９８３）２　：３２５により定義されたように、３′
領域については１１　、２０７〜１２，８２３、および
５′領域については１３．６４３〜１５．２０８である
。

５′断片は次のようにして得た。コード領域の５′末端
を含有する小サブクローン断片をＢａｍｆｌｌ−１Ｅｃ
ｏＲＩ断片としてｐＢＲ３２２中でクローニングしてプ
ラスミドｐＣＧＮ　４０７とした。−シ猥１１１−Ｅ並
Ｒ１断片はコード領域中に１つのＸｍｎ　Ｉ部位を有す
るが、ｐＢＲ３２２は２つの」懸１部位を有する。ｐｃ
ＧＮ４０７をＸｍｎ　Ｉで消化し、Ｂａ１３１ヌクレア
ーゼで切除し、そしてＩＥｃｏＲＩリンカ−をこれらの
断片に付加した。

ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ１ｌｌ消化後、断片を大きさで
分画し、分画をクローニングし、そして配列決定した。

１つの場合において、全体のコード領域および１ｏｂｐ
の５′非翻訳配列が除去されて５′非翻訳　　　　−領
域、ｍＲＮＡキャップ部位および１６ｂｐの無傷の５′
非翻訳領域■」１１１へかそのまま残される。この小さ
い断片を７％のアクリルアミドゲル上でのサイズ分画に
よって得、そしてほぼｔ３ｏｂｐの長さの断片を溶出し
た。

このサイズ分画したＤ　Ｎ　Ａ；ｔ−Ｍ１３ｍｐ９中に
連結し、いくつかのクローンを配列決定し、そして配列
をオクトピンシンターゼ遺伝子の既知の配列と比較した
。Ｍ１３造成物をｐ１４と称し、このプラスミドを」憇
旧およびＥｃｏＲＩで消化して小さい断片を生成し、こ
の断片を、ｐＴｉＡ　（ＧａｒｆｉｎｋｅｌおよびＮｅ
５ｔｅｒ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９８０
）１４４　　：　７３２　）からの上流５′配列を含有
するＸｈｏ　Ｉ　−Ｂａｍ旧Ｉ断片に、および３′配列
を含有するＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片に連結した。

得られるＸｈｏ　Ｉ断片を、ｐＣＧＮ４２６と表示する
ｐｕｃ　８＝！体のＸｈｏ　Ｉ部位にクローニングした
。

これはｐｕｃ　８と異なり、ＤＮＡポリメラーゼ■によ
りフィルインされた唯一のＥｃｏＲ１部位を有し、かつ
西１リンカ−をｐＵｃ　８のユニーク１ｌｉｎｃｌｌ中
に挿入されるとき、ｌｌ１ｎｃＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼのヌクレアーゼ汚染によって」■１およびｔｌ　ｉ
　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉを失っている。得られるプラスミ
ドｐＣＧＮ４５１は、５′非コード領域（これはＴ−Ｄ
ＮＡの右ボーダー、ｍＲＮＡキャップ部位および１６ｂ
ｐの５′非翻訳配列を含む１　、５５０ｂｐを含有する
）と３′領域（これは２６７ｂｐのコード領域、停止コ
ドン、１９６ｂｐの３′非翻訳ＤＮＡ、ポリＡ部位およ
び１、１５３ｂｐの３′非転写配列を含有する）との間
に蛋白質コード配列を挿入するための単一のＥｃｏＲ１
部位を有する。ｐＣＧＮ　４５１は、また、右Ｔ−ＤＮ
Ａボーダーを提供する。

適切な方向でｏｃｓ　　５　’およびｏｃｓ３’を存す
る得られるプラスミドｐＣＧＮ　４５１をＥｃｏＲＩで
消化し、そして無傷のカナマイシン耐性遺伝子を含有す
るｐＣＧＮ　５５１からのＥｃｏＲＩ断片をＥｃｏＲ１
部位に挿入して、適切な方向でカナマイシン耐性遺伝子
を有するｐＣＧＮ　５５２を生成せしめた。

このｏｃｓ　／にＡＮ遺伝子を使用して、トランス型の
二元ベクターｐＣＧＮ　５８７のための選択可能なマー
カーを得た。

操作したオクトピンシンターゼプロモーターのカセット
の５′部分は、ｂｐ１５２０８−１３６４４　（Ｂａｋ
ｅｒの番号）におけるＸｈｏ　ＩからのｐＴｔ＾６　Ｄ
ＮＡから成り、これは、また、Ｔ−ＤＮＡ転移に関連す
るＴ−ＤＮＡ境界配列（ボーダー）を含有する。プラス
ミドｐＣＧＮ　５８７において、ｐＣＧＮ　５５２がら
のｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子は選択可能なマーカーならびに
右ボーダーを提供する。左の境界領域を、まず、ＩＩ　
ｉ　ｎ　ｄＩＩＩ　−Ｓｍａ　１片（ｐＣＧＮ　５０２
）（塩基対６０２−２２１３）としてＭ　１３ｍｐ　９
中でクローニングし、そして血１−Ｅ飴Ｒ１断片として
ｐＣＧＮ　５６５中で再クローニングしテｐＣＧＮ　５
８０を生成した。ｐＣＧＮ　５６５はｐｕｃｓ−Ｃｍに
基づくクローニングベクターであるが、ｐＵＣ１日リン
カ−を含有する。ｐＣＧＮ　５８０を」憇Ｉｌｌで線状
化し、そしてｐＶＣＫ　１０２のより小さいＪｌｌ断片
ＣＫｎａｕｆおよびＮｅ５ｔｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　
（１９８２）、　　８　：　４５）と置換してｐＣＧＮ
　５８５をつくった。ｐＣＧＮ　５８５の小さい」旦Ｉ
断片をｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子を含有するｐＣＧＮ５５２
からのＸｈｏ　Ｉ断片と置換することによって、ｐＣＧ
Ｎ　５８７を得た。

５’−ｏｃｓ−カナマンシン−ｏｃｓ−３’（ｏｃ５は
、プロモーター領域を示す５′および終止領域を示す３
′もつオクトピンシンターゼである、１９８５年に９月
１３日に提出された米国特許出願第７７５．９２３号参
照）断片を含有するｐＣＧＮ　５９４−！に１ｎｄＩＩ
夏−■ＩＩＩ会Ｊｉｊ戎を、ｐｔｌｃ　１８力）らの−
１１ｉ−ノＢｄｌｌｌ−Ｂａｍ１ｌｌ　Ｉポリリンカー
領域と置換した。

ｐｃＧＩＪ　５６６は、ｐＵｃ　１３−ＣｍのＥｃｏＲ
Ｉ　−Ｈ４ｎｄｌ１１部位の中に挿入したｐｔｌｃ　１
８のＥｃｏＲｌ　−ＩＩ旦ｄｌｒｌを含有した。ｐＴｉ
Ａ　６のＯＲＦ　　１および−２を含有するｐＮＷ３１
Ｃ−８■２９−１　（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ等、釦旦（１
９８０）１９ニア２９）の」圏ｄｌｌｌ−Ｂ■ＩＩ断片
を、ｐＣＧＮ　５６ＧのＩＩｉｎｄｌＩＩ−Ｂａｍ旧に
サブクローニングしてρＣＧＮ７０３を生成せしめた。

トランスクリプト７の３′領域を含有するｐＣＧＮ７０
３のＳａｕ　３Ａ断片（ｐＴｉＡ　６　（Ｂａｋｅｒ等
、（１９８３）且肛娃の塩基２３９６−２９２００に相
当する〕を、ｐｔｌｃ１８のＢａｍ１ｌｌにサブクロー
ニングしてｐＣＧＮ　７０９を生成せしめた。ｐＣＧＮ
　７０９のＥｃｏＲＩ　−Ｓｍａ　Ｉプラスミド領域を
、カナマイシン耐性遺伝子（ＡｐＨ３−１１）を含有す
るｐｃｃＮ５８７の」並ＲＩ−Ｓ氾Ｉと置換して、ｐＣ
ＧＮ　７２６を生成した。

ｐＣＧＮ　７２６の一ム遼ＲＩ−３旦■断片＋ｐＣＧＮ
　７３４の１１１−　ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＵｃ８−Ｃ
ｍのＩｌａｍｌｌｌ−Ｓａｌ　１部位の中に挿入してｐ
ＣＧＮ　７３８を生成せしめる。ｐＣＧＮ　７２６ｃは
、９００ｂ、のＥｃｏＲＩ　−」ｃｏＲＩ断片を除去す
ることによって、ｐＣＧＮ　７３Ｂから誘導する。

ｐＣＧＮ　１６７を造成するために、ＣａＭＶ（７）　
Ａｌｕ　Ｉ断片（ｂｐ７１４４−７７３５）　（Ｇａｒ
ｄｎｅｒ等、　Ｎｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８１）　９　：　２８７１−２８８８）をＡｌｕ
　Ｉで消化して生成せしめ、そしてＭ１３ｎ＋ｐ　７　
（Ｍｅｓｓｉｎｇ等、　Ｎｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　　（１９８１）　　９　：　３０９−３２１　）
のｌ１ｉｎｅｌｌ　にクローニングしてＣ６１４をつく
った。Ｃ６１４のＥｃｏＲＩ消化により３５Ｓプロモー
ターを含有するＣ６１４からのＥｃｏＲＩ断片を生成し
、これをｐＵｃ　８の（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｇｅｎｅ（１９８２）１９　：　２５９　）のＥ
ｃｏＲ１部位にクローニングしてｐＣＧＮ　１４６を生
成せしめた。

プロモーター領域をトリミングするために、」紅ＩＩ　
（ｂｐ７６７０）を」れＩＩで処理し、そして」虹３１
で切除し、引続いて」■ＩＩリンカーをＢａｌ　３１処
理したＤＮＡへ取付けてｐＣＧＮ　１４７を生成せしめ
た。

プロモーター領域、選択可能なマーカー（２つのＡＴＧ
をもつＫＡＮ）および３′領域を含有するｐＣＧＮ　１
４７ａは、ｐＣＧＮ　５２ＢをＩＩＩで消化し、そして
ｐＣＧＮ　１４７からの１１１１−ＢれＩＩプロモータ
ー断片を挿入することによって調製した。この断片をｐ
ＣＧＮ　５２ＢのＪ１１部位にクローニングし、こうし
てＵＬＬ１１部位がｐＣＧＮ　５２Ｂのカナマイシン遺
伝子に近接するようにした。

この造成に使用したシャトルベクターｐＣＧＮ　５２Ｂ
は次のようにしてつくった。カナマイシン遺伝子（Ｊｏ
ｒｇｅｎｓｓｏｎ等＋　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、（１９７９）ユＵ：６５〕を収容するＴｎ５を含有
するプラスミドをＢｉｎｄｌｌｌ　−Ｂａｔｓ旧で消化
し、カナマイシン遺伝子を含有ＳるＨｉｎｄｌｌｌ　−
Ｂａｍ旧断片をｐＡＣＹＣ１８４（ＣｈａｎｇおよびＣ
ｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９７Ｂ）
　１３４：１１４１−１１５６）中のＨｉｎｄｌｌｌ　
−Ｂａｍ１１１部位中に挿入することによって、ｐＣＧ
Ｎ　５２５をつくった。ｐＴｉ＾６（Ｔｈｏｍａｓｈｏ
−等、（旦（１９８０）１９　：　７２９−７３９３の
」憇旧断片１９血１部位中に挿入されたＸｈｏ　Ｉリン
カ−で修飾された）をｐＣＧＮ　５２５のＢａｍ１ｌ！
中に挿入することによって、ｐＣＧＮ　５２６をつくっ
た。

ｐＣＧＮ　５２６から小さいコαＵ断片をＸｈｏ　Ｉで
消化しそして再結合することによって、ｐＣＧＮ　５２
８を得た。

ｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩからの」憇ｌ１１−カナマイシン
遺伝子断片をｐＣＧＮ　１４８ａの」亜旧中に挿入する
ことによって、ｐＣＧＮ　１４９ａをつくった。

ｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩはｐＵｃ　４に変異型（Ｖｉｅｉ
ｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ（１９８２）１９
　：　２５９−２６８　）であり、これはＸｈｏ　Ｉを
失っているが、Ｔｎ９０３からの機能的カナマイシン遺
伝子を含有して、アグルバリテリウム（釦匹堕蛙肛旦畦
中の効率よい選択を可能とした。

ｐＣＧＮ　１４９ａを」■ＩＩおよび上■で消化した。

ｐＣＧＮ　１４９ａのこの小さいＪＩＩ−１１断片を、
Ｂａｍ１ｌ！およびＩＩで消化することにより分離した
Ｍｌ　　（下を参照）からのＢａｎ＋ＨＩおよびＩＩ断
片と置換した。これによりｐＣＧＮ　１６７、全長のＣ
ａＭＶプロモーター、ＩＡＴＧ−カナマイシン遺伝子、
３′末端およびバクテリアのＴｎ９０３型カナマイシン
遺伝子を含有する造成物を生成する。ＭｌはＩ）ＣＧＮ
５４６Ｘ　（ｐＣＧＮ　５８７の造成を参照）からの」
並ＲＩ断片であり、そしてこれを、１＾ＴＧ−カナマイ
シン遺伝子中の１１１部位がＭ１３ｍｐ９のポリリンカ
ー領域に隣接するような方法で、Ｍ　１３ｍｐ　９のＥ
ｃｏＲＩクローニング部位にクローニングした。

ＣａＭＶ　−３５３プロモーター、１＾ＴＧ−カナマイ
シン遺伝子およびｐＴｉＡ　６の勿旧−断片１９を含有
するｐＣＧＮ　１６７中の）ｌｉｎｄｌｌｌ　−Ｂａｍ
１ｌｌ断片を、ｐＵｃ　１９の」並旧−１１ｉｎｄｌ１
１部位にクローニングしてｐＣＧＮ９７６をツ＜ッた。

ｐＣＧＮ　９７６　（３５Ｓプロモーター）ノ０．７　
ｋｂ（７）　ｌ１ｉｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩ断片およ
びｐＣＧＮ　７０９の０．５ｋｂの」匹Ｒ１−５紅！断
片（トランスクリプト？＝３’）を、ｐＣＧＮ　５６６
の一旧ｎｄｌｌｌ−旦１部位の中に挿入することよって
、３５３プロモーターおよびトランスクリプト７からの
３′領域を発生させた。

ｐＣＧＮ　７６６ｃの０．７ｋｂの１ｌｉｎｄｌｌｌ−
ＥｃｏＲＩをｐＣＧＮ７２６ｃ中の１．５ｋｂの」ｃｏ
ＲＩ　−Ｓａｌ　Ｉ断片（１ＡＴＧ　−ＫＡＮ３′領域
）中に挿入し、次いでｐＵｃ　１１９の１ｌｔｎｄＩＩ
Ｉ　−Ｓａｌ　１部位中に挿入してｐＣＧＮ　７７８を
生成した。ｐＣＧＮ　７７８（７）　２．２　ｋｂ領領
域すなわち、ＣａＭＶ　−３５３プロモーターおよびＩ
ＡＴＧ−ＫＡＮ　−３’領域を含有するＨｉｎｄｌｌｌ
　−Ｓａｔ　Ｉ断片、を使用してｐＣＧＮ７３９の」釦
ｄｌｌｌ−づ剰」リンカ−領域を置換してｐＣＧＮ　７
８３を生成した。

ｐＣＧＮ　９４Ｂを、アグロバクテリウム・チュメファ
シエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｗ　　ｔｕｍｕｆ
ａｃｉｅｎｓ）ＥＩＩＡ　１０１（Ｈｏｏｄ等、　Ｊ、
　８ａｃｔｅｒｉｏ１．　（１９８６）　１６８　：　
１２９１−１３０１）中に形質転換によって導入した。

２１ｎ１のＥＨＡ　１０１の一夜培養物を、３０℃にお
いてＭＧ／Ｌブロス中で増殖させた。その０．５　ｍを
１００ｍｊのＭＧ／ＬＧａス（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　お
よびＮｅ５ｔｅｒ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９８０）　１４４　：　７
３２−７４３　）中に接種しそして３０℃において５時
間振盪インキュベーター中で造殖させた。細胞を７Ｋに
おける遠心により沈殿させ、１−のＭＧ／Ｌブロス中に
再）種層させ、そして氷上に配置した。はぼ１＆のｐＣ
ＧＮ　９４８のＤＮＡを１００μｌのＭＧ／Ｌブロス中
に入れ、これに２００μｍのＥＩＩＡ　１０１の懸濁液
を添加し、ＤＮＡ−細胞混合物を含有する管を直ちにド
ライアイス／エタノール欲中に５分間配置した。この管
を急速に５分間３７℃の水浴中で融解し、次いで１−の
新しいＭＧ／Ｌ培地の添加後、３０℃において２時間振
盪した。細胞を沈殿させ、そして１００■／ｌのゲンタ
マイシンを含有するＭＣ／Ｌ平板（］、５％の寒天）上
に拡げた。プラスミドＤＮＡを個々のゲンタマイシン耐
性コロニーから分離し１、大腸菌（五−仔旦）中に形質
転換し戻し、そして制限酵素により特徴づけて、ゲンタ
マイシン耐性Ｅ）ＩＡ　１０１がｐｃＧＮ　９４８の無
傷のコロニーを含有することを確認した。単一のコロニ
ーを取り上げ、そして１００■／ｌのゲンタマイシンを
含有するＭＧ／Ｌ平板上にさらに２回ストリークするこ
とによって純化した。

Ｂ、　ブス（Ｂ、ｎａｕｓ）のノ　−　およびブラシカ
・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　　７ｃｖ　Ｗｅｓｔａｒ
の種子を９５％のエタノール中で４分間浸漬した。

５０μｌの「ツイーン２０」界面活性剤／　１００ｄの
無菌の溶液を含む１％の次亜塩素酸ナトリウムの溶液中
でそれらを滅菌した。４５分間浸漬した後、種子を無菌
の蒸留水で４回洗浄した。それらを無菌のプラスチック
箱、幅７Ｃ１１、長さ１ｃｓおよび１０ｃｍの高さくＭ
ａｇｅｎ　ｔａ）に植え、この箱は５０ｍ１の１／１０
の濃度のＭ　Ｓ　（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ最小有機培地、
Ｇｉｂｃｏ）を含有し、ピリドキシン（５００，／　ｌ
　）、ニコチン酸（５０１ｙ／ｌ）およびグ’Ｊ　シン
（２００ｅｔ／ｌ）が添加されており、そして０．６％
の寒天で固化されていた。種子は発芽し、そして光学強
度はぼ６５μＥｍ−２ｓ−’において１６時間−８時間
の明−暗のサイクルで２２℃において生長させた。

５日後、実生を無菌条件下に取り、そして胚軸を切除し
、そして約４鰭の長さの片に切った。胚軸のゼグメント
をフィーダープレート（ｆｅｅｄｅｒ　ｐｌａｔｅ）上
に配置するか、あるいはフィーダープレートなしに、固
化したＢ５　０／１／ｌまたはＢ５　０／１１０培地上
の濾紙の上に配置した。Ｂ５　０／１１０培地はＢ５塩
類およびビタミン（Ｇａｍｂｏｒｇ。

ＭｉｌｌｅｒおよびＯｊｉｍａ、　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　Ｃｅｌ上Ｒｅｓ　。

（１９６８）観：　１５１−１５８　）　、３％のスク
ロース、２■４−ジクロロフェノキシ酢酸（１，０■／
１）を含有し、ｐＨが５．８に調整されており、そして
この培地は０．６％のフィタガ−ＧＰｈｙｔａｇａｒ）
で固化されている；Ｂ５　０／１／１は１．０■／Ｉの
カイネチンを添加した同一のものである。フィーダープ
レートは、Ｂ５　０／Ｉ１０またはＢ５０／１／１培地
上に１．０　ｍの静止相のタバコ懸濁液培養物（Ｆｉｌ
ｌａｔｔｉ等、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、（
１９８７）２０６　：１９２−１９９に　記載するよう
に維持した〕をピペットで加えることによって２４時間
前に調製した。

胚軸セグメントを切断し、そしてアグロバクテリウム（
ねｍ恒狙劇但ｊ１り一処理の前にフィーダープレート上
に２４時間配置した。

アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａ　ｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｕｆａｃｉｅｎｓ）　（菌
株ＥＩＩＡ　１０１　Ｘ９４８）は、ＭＧ／Ｌブロス中
で３０℃においてアグロバクテリウム（＾ｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）の単一のコロニーをインキユベーシツンす
ることによって調製した。バクテリアを１６時間後に収
穫し、そして１０８／−のバクテリアの希釈物をＭＧ／
Ｌブロス中で調製した。胚軸セグメントをアグロバクテ
リウム（ｈ匡倶Ｖ劇徂ｒｉｕり一懸濁液中に入れ、そし
てそれらを３０〜６０分間放置し、次いで取り出し、そ
してＢ５　０／ｌ／１または０／Ｉ１０培地（Ｏ／ｌ／
１は１＋ｇ／２ＱｊＤ４−Ｄおよび１■のカイネチンを
意味しそして０／Ｉ１０はカイネチンを含有しないこと
を意味する）を含有するペトリ平板上へ移すことによっ
て、胚軸セグメントをバクリアと一緒にインキュベーシ
ョンした。平板を低い光学濃度において２２℃において
インキュベーションした。胚軸セグメントと一緒のバク
テリアの同時インキュベーションは２４〜４８時間実施
した。

胚軸のセグメントを取り出し、そして５００■／ｌのカ
ルベニシリンを含有するＢ５　０／ｌ／ｌまたは０／Ｉ
１０　（硫酸カナマイシンを１０■２５または５０■／
ｌでこの時点で時々添加した）上に７日間連続光（はぼ
６５ｐＥｍ−”ｓ−”）中で２２℃で配置した。セグメ
ントを１％のスクロース、３■／ｌのベンジルアミノプ
リン（ＢＡＰ）および１■／ｌのゼアチンを含有するＢ
５塩類の培地に移した。これを５００■／ｌのカルベニ
シリン、１０■２５または５０■／ｌの硫酸カナマイシ
ンを補充し、そして０．６％のフィクガ−（Ｐｈｙ　ｔ
ａｇｅｒ）　（Ｇ　１ｂｃｏ）で固化した。その後、移
植片を新鮮な培地に２週毎に移した。

１ケ月後、緑の発が緑のカルスから発生し、これらをカ
ナマイシン含有培地上で選択した。芽を３月間発育させ
た。芽が少なくとも１ｃＩ１１の高さになったとき、カ
ルスから切断し、そして１％のスクロースを含み、生長
物質を添加せず、３００■／ｌのカルベニシリンを含有
し、そして０．６％のフィタガーで固化したＢ５培地上
に配置する０発芽を生長させ、そしていく枚かの葉を除
去して、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ　
（ＮＰＴ　ＩＩ）活性について試験した。ＮＰＴ　ＩＩ
活性について陽性である発芽を、Ｂ５　０／１／１培地
を含有するマゼンタア（Ｍａｚｅｎ　ｔａ）箱中に配置
し、この培地は１％のスクロース、２■／ｌのイントル
酪酸、２００■／ｌのカルベニシリンを含有し、そして
０．６％のフィタガーで固化されていた。数週間後、芽
は発根し、そして土に移した。植物を生長室内で２２℃
において１６−８時間の明−暗サイクルにおいて光学強
度２００μＥ　ｍ−”　ｓ　−’において生長させ、そ
して数週間後温室へ移した。

土工ｌ■デニＬ ｐＣＧＮ　９４Ｂを含有するアブロバフタ−・チュメフ
ァシエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｕ
ｆａｃｉｅｎｓ）ｔｉｌｌＡ　１０１およびＢ、ナブス
（Ｌ　旦匹蛙胚軸の同時培養物からの再生したＢ、ナプ
ス（Ｂ、　　旦匹紅植物を、ホウレンソウの葉のＡＣＰ
遺伝子の適切な取りこみ（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）及
び胚特異的発現について検査した。Ｄｅｌｌａｐｏｒｔ
ａ等（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　（ｌｉｏｌ、Ｒｅ　。

（１０８３）土：　１９−２１３の方法により、再生し
た植物の葉から分離しそしてＣｓＣ１中のバンディング
（ｂａｎｄｉｎｇ）によて１回精製したＤＮＡを使用し
てサザン分析を実施した。ＤＮＡ　（１０ｇ）を制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化し、０．７％のアガロースゲルで電
気泳動し、そしてニトロセルロースにブロッティングし
た〔参照Ｍａｎｉａｔｉｓ等、　（１９８２）前掲〕、
プロットを、１．８ｋｂのホウレンソウＡＣＰ配列を含
有するｐＣＧＮ　９４５　ＤＮＡで、あるいはニックト
ランスレーションにより〔製造業者、ＢＲＬ　Ｎ１ｃｋ
　ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　、
　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯによって記載されて
いる〕３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したナピン５′配列を含
有するｐＣＧＮ９３６ｃから分離した」ｃｏＲＩ／　Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ断片でプロービングした。プロットをプレ
ハイブリダイゼーションし、そして５０％のホルムアミ
ド、１０×デンハルトの５ｘＳＳＣ，５ミリモルのＥＤ
Ｔ＾、１００ｇ１　／　ｄの子牛胸腺ＤＮＡおよび１０
％の硫酸セキストラン（ハイブリダイゼーションのみ）
中で４２℃においてハイブリダイゼーションした。

（Ｍｎｉａｔｉｓ等、　（１９８２）ｕ肛りに記載され
ている。〕洗浄は１ｘｓｓｃ、ｏ、ｔ％のＳＤＳ中で３
０分間、そして０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％の
ＳＤＳ中で５５℃において２回実施した。

オートラジヲダラムは、ＡＣＰ遺伝子（ｐＣＧＮ９４５
）でプロービングしたとき、４つの植物からのＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ消化物中でハイブリダイズする３、３および
３．２ｋｂの２本の帯を示し、これにより３．３および
３．２ｋｂの」匹Ｒ１断片はｐＣＧＮ　９４ＢのＴ−Ｄ
ＮＡ中に存在するので、植物のゲノム中にホウレンソウ
の葉ＡＣＰの造成物が適切に組みこまれたことが示され
た。ナピン５′配列でブロービングしたとき検出された
植物ＤＮＡ−造成物ＤＮＡボーダー断片の数によって判
定して、遺伝子の構成体は異なる植物中単一のまたは多
数の位置に存在した。

ノザンのデータ ナビンプロモーターからの組込まれたホウレンソウの葉
のＡＣＰ遺伝子の発現は、ノザン分析により種子中にお
いて検出されたが、造成物ＤＮＡを含有することが示さ
れた形質転換した植物の１つの葉中には検出されなかっ
た。発育する種子を、形質転換した植物から開花後２１
日に集めた。胚を種子から切除し、そして液体窒素中で
凍結した。

全ＲＮＡを種子の胚および形質転換された植物の葉から
、Ｃｒｏｕｃｈ等、　１９８３．　熟肛虹の方法によっ
て分離し、Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ等、　ｕ皿ワ田（１９８
５）１４０．２８１−２８８に記載されているようにし
てホルムアルデヒドを含有する１、５％のアガロースゲ
ル上で電気泳動させ、そしてＴｈｏｍａｓ、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　（１９８０ロユ：　５２０１−５２０５に記載
されているようにしてニトロセルロースにプロッティン
グした。

プロットを、前述のようにして、プレハイブリダイゼー
ションし、ハイブリダイゼーシヨンし、そして洗浄した
。プローブは、ニックトランスレーションにより標識さ
れたホウレンソウの葉のＡＣＰ配列のみを含有する、ｐ
ＣＧＮ　９４５からの分離された」旦１／」すＩＩＩ断
片であった。

約０．８　ｋｇのＲＮＡバンドが肺中に検出されが、形
質転換された植物の葉中では検出されず、このことによ
りホウレンソウの葉のＡＣＰ遺伝子の種子特異的発現が
示された。

大１桝旦 Ｂ、カンペストリス（Ｂ、　ｃａｍ　ｅｓｔｒｉｓ）の
゛ピンプロモー　−カセットの゛告ｒ′ Ｂ、カンペストリス（Ｂ、　　ε狸弘豆ｕ）　（７）　
Ｄ　ＮＡのＩ１１部分的ゲノムライブラリーを、確立さ
れたプロトコールを使用してラムダベクターシャロン（
Ｃｈａｒｏｎ）　３５中でつくった（Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、１９８２、前掲）。増幅したライブラリーのタイタ
ー（Ｌｉｔｅｒ）は約１．２ｘｌＯ”ファージ／１ｄで
あた。

４Ｘ１０’の組換えバクテリオファージを、ＤＩ！１大
腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　　（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ。

（１９８３）　ＩＥ瓜：５５７）細胞へ吸着後ＮＺＹ＋
１０ミリモルのｎｇｓＯｓ　＋　０．９％のアガロース
中でＮＺＹ平板において１０’／９Ｘ９の密度で３７℃
において２０分間平板培養した（ＮＺＹＭ、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ等、１９８２、前掲に記載されている）。平板を
３７′ｃに約１３時間インキュベーションし、４℃に２
．５時間冷却し、そして予備切断したフィルターを平板
上にほぼ１分間層状に配置し、そしてそれらを剥離する
ことによって、ファージを遺伝子スクリーンプラス（Ｇ
ｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）にニュー・イングラ
ンド・ニュークリアー）上に取り上げた。吸着されたフ
ァージのＤＮＡは、フィルターを１．５モルのＮａＣｌ
、０．５モルのＮ　ａ　ＯＩＩ上に１分間浮ばせ、１．
５モルのＮａＣ１，０，５モルのトリス−１１ＣＩ　、
　ｐＨ８，０中で２分間中和し、そしてＺｘＳＳＣ中で
３分間中和することによって、固定した。フィルターを
湿潤直前まで空気乾燥し、そしてサザン分析について前
述したように、プレハイブリダイゼーションしそしてハ
イブリダイゼーションした。フィルターヲナビン含有ク
ローンについて、プローブｐＮ１　　（Ｃｒｏｕｃｈ等
、　１９８３、前掲）を使用して記載したＢ、カンペス
トリス（Ｂ、　　■肚競旦１ｓ）ｆｉｌＮ’ノ（ＤＮＡ
ライブラリーから分離したｃＤＮＡクローンＢＥ５のＸ
ｈｏ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ断片を使用してプロービング
した。これらのプラークは反復実験のフィルター上に強
くハイブリダイズし、そして前述のようにプラーク精製
した（Ｍａｎｊａｔｉｓ等、１９８２．７゜ラムダＣＧ
Ｎ　１−２と命名するクローンの１つを制限マツピング
し、そしてナピン遺伝子を局在化して２．７ｋｂの上Ｉ
および２．１ｋｂの５ａｌｌ制限断片を重ねた。２つの
断片をλＣＧＮ　　１，２ＤＮＡからｐＣＧＮ　７８９
　（ｐｌＪｃ　１１９と同一のベクターに基づくｐＵｃ
　、正常なリンカ−が合成リンカー−５’　ＧＧＡＡＴ
ＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡ
ＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴ３（これはポリリンカー−
陰遼１？ＬづａｌｌＳ上ＩＩ、ノｓｔ　１　、Ｘｈｏ　
Ｔ　％　　Ｂａｍ！ＩＩ、　　ｔｌｉｎｄＩＩＩを表わ
す）により置換されている〕にサブクローニングした。

ナピンとしてのサブクローンの同定は、配列決定によっ
て確証された。全体のコード領域の配列ならびに伸張の
５′上流および３′下流の配列を決定した。これを次の
式で示す。

１　ＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＴＧＡＡ
ＧＴＴＴＧＡＣＧＡＧｄｅ　１ １３９　　ＴＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴ＾＾
ＣＴＴＣＴＡ＾八ＣＴＴＧＴ５Ｏ ｄｅ　１ ＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴへＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴ
ＣＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡ　　２０７２０８　ＴＧＴＡＧ
ＧＴＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣ
ＴＴＣＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＡＡＣＡ
ＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡ　　　２７６３４６＾＾
ＡＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＡＣＴＴＴＧＡ
ＡＡＧＴＴＣｃｏＲＶ ＣＴＣＡＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＡＴＣＴＴＴＴＧＧＴ
ＡＧＡＴＡＴＣＡＣＴＡ　　　４１４遷 ４８４　　ＴＧＴＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＴＣ
ＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＣＡＴ１ｎｆｌ ＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴ
ＴＣＴＣＡＡＧＴＴＴＡ　　　５５２ｊｉｎｆＪ ■ ＡＡＴＣＡＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡ
ＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＴ　　　６２１ｄｅ１ ６２２　ＡＧＴＡＡＡＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣ
ＣＴＴＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡ
ＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣ６９
０ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＴＣＡ
ＡＡＡＧＧＴＴＡＧＴＧＴ　　　７５９７６０　　ＴＴ
ＡＧＴＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＡＣＣ／ＩｃＡ
ＡＡＧＴｃＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＡ
ＣＴＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＴＧＣＴＡＧ　　　８２８ｄ
ｅ　１ ８２９　　ＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧ
ＴＣＡＴＡＣＡ＾八ＧＴＧＡｍｎ　１ ８９８　　ＧＧＡＡＡＧＡＡへＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＡ
ＡＣＣＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＣ
ＧＴＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡ　
　９６６９６７　ＡＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＴ
ＣＡＧＧＴＡＧＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＴＧＴ
ＣＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＴＡ
ＧＴ　　１０３５１０３６　　ＣＴＡＡＴＡＴＧＡＴＡ
ＡＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＧＧ＾１ｕ
ｌ　　　　　　　　Ｒｓａ１ ＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＧＴＡＣＣＣＡＡＧ
ＣＧＡＴＧＧＧＡＴＡＣ１１０４１１０５ＡＴＡＧＧＡ
ＧＧＴＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣ
ＡＴ１１７４　　ＴＡＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＧＣＧＴ
ＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＡｌｕ１ １２４３　　ＣＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＴＴＧＧＴＴＴ
ＣＴＴＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＪｌｉｎｆｌ　　　Ｒｓ
ａｌ ＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴ
ＡＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡ　　１３８０１３８１　　ＡＴ
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７９　　ＴＧＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＣＡ
ＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣラムダＣＧＮＩ−２ナピン遺
伝子は、それらのヌクレオチド配列の正確な地図によっ
て決定した、ＢＥ５ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡをコー
ドするものである。

発現カセットを、ラムダＣＧＮＩ−２ナピン遺伝子の５
′−末端および３′−末端から、次のようにして、ｐＣ
ＧＮ　９４４の造成と同様な方法で造成した。

ｐＣＧＮ　９４０のナピンコード領域の大部分を５ａｌ
Ｉによる消化および再連結により欠失して、ｐＣＧＮ　
１Ｂ００を形成した。ｐＣＧＮ　１８００からの一本鎖
ＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチド５　’　ＧＣＴＴＧ
ＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＣＴＧＴＡＴＧＴ
ＴＣ３’を使用する生体外突然変異誘発（八ｄｅ１ｍａ
ｎ）等、　ＤＮＡ　（１９８３）　２　：　１８３−１
９３）において使用した。このオゴヌクレオチドは、Ｅ
ｃｏＲＶおよびＮｃｏ　Ｉ制限部位を、ナピン遺伝子の
プロモーター領域とＡＴＧコドンとの接合部に挿入した
。

適当な突然変異体は、突然変異誘発および配列分析に使
用したオゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに
よって同定され、そしてｐＣＧＮ　１８０１と命名した
。

１、７　ｋｂのプロモーター断片をｐＣＧＮ　１８０１
から、ＥｃｏＲＶによる部分的消化およびｐＣＧＮ　７
８６　（正常のポリリンカーの代わりに前述の合成ポリ
リンカーヲモつｐＣＧＮ　５６６クロラムフエニコール
に基くベクター）への結合によりサブクローニングし、
ＥｃｏＲＩで切断し、そしてフィルインにより平滑末端
化（ｂｌｕｎｔ）　Ｌ、発現カセットｐＣＧＮ　１８０
３を生成した。

これは１．７２５　ｋｂのナピンプロモーター配列およ
び１　、２６５ｋｂの３′配列を含有し、それらの間の
ユニーククローニング部位上１．ＩＩＬ　　ＰＩ３およ
びＸｈｏ　Ｉを有した。プラッシ力（Ｂｒａｓｓｉｃａ
）において種子特異的転写または発現を必要とする配列
、すなわち、脂肪酸遺伝子は、実施例Ｉにおけるホウレ
ンソウの葉ＡＣＰおよびＢ、ナプス」。

７ナピンカセツトについて記載したものに類似する方法
において、このカセット中に挿入することができた。

尖隻皿」旦 他の種子特異的プロモーターを、種子トリアジルグリセ
ロール合成に関与する蛋白質、例えば、ブラソセ力（Ｂ
ｒａｓｓ　１ｃａ）種子からのアシルキャリヤー蛋白質
をコードする遺伝子から分離することができる。未熟の
種子をブラッシカ・カンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ
　　姐肚照旦ｎ）ｃｖ、　”Ｒ−５００’％カブの自己
適合性変種から集めた。全部の種子は、開花後１４〜２
８日にほぼ相当する段階で集めた。ＲＮＡ分離およびｃ
ＤＮＡバンクの調製は、使用したベクターがｐＣＧＮ　
５６５である以外、ホウレンソウＡＣＰｃＤＮＡの分離
について前述した通りであった。ｃＤＮＡバンクをプロ
ーブするため、オゴヌクレオチド（５’　）　−ＡＣＴ
ＴＴＣＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧ
Ｃ−（３′）をＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓＬｅｍｓＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）　
３ＢＯＡ型を使用して、製造業者の推奨に従い合成した
。この合成り　Ｎ　Ａ分子は、アミノ酸配列（ａｌａ−
ａｌａ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｔｈｒ−ｖａｌ−ｇ
ｌｕ−１ｙｓ−ｖａｌ）をコードするＤＮＡまたはＲＮ
Ａ！ｉ己列へ低いストリンジエンシーにおいてハイブリ
ダイゼーションするであろう。このアミノ酸配列はブラ
ッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　　ｎ；すｕｓ）Ｏ
＋ｆｆｌ子カら分離されたＡＣＰについて報告された（
Ｓｌａｂａｓ等＋　７ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔ
ｕｒｅａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　
Ｌｉｐｉｄｓ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＣａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ、　Ｄａｖｉｓ＋　ＣＡ＋　１９８６）　
；　Ｂ、カンペストリス（ＢＬ並肚且ｔｒｉｓ）種子か
らのＡＣＰは高度に相同性である。はぼ２２００の異な
るｃＤＮＡクローンを、コロニーハイブリダイゼーショ
ン技術（ＴａｕｂおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、　Ａｎａｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８３）　１２６　：２２２
−２３０）および−ｏｏｄ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、
　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（１９８５）８２　：　１５８５−１５８８）に相当す
るハイブリダイゼーション条件に従い分析した。２つの
ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析はオゴヌクレオチド
のプローブへの明らかなハイブリダイゼーションを示し
、これにより１つのｐｃＧＮＩＢｃｓと表示するプラス
ミドは、Ｂ、ナプス（Ｂ、　　はり且Ｏ−からの記載さ
れたＡＣＰ蛋白質とコードされたアミノ酸配列のかなり
の相同性によって、ＡＣＰ前駆体蛋白質の遺伝情報を確
かにコードすることが示された（Ｓｔａｂｓ等、　１９
８０…肛紅。実施例ＩＩと同様に、ＡＣＰのｃＤＮＡク
ローンを使用してゲノムのクローンを分離することがで
き、このクローンから発現カセットをＢ、カンペストリ
ス（Ｂ　、　　並肚且鉦ｎ）　＋　ヒフ　ｈセットに直
接類似する方法で形づくることができる。

弛ぷり口虹医 開花１ｊｉ１４〜２８日のＢ、カンペストリス（追よＱ
ｕ並江ｎ）からの９６のクローン（前の実施例に記載さ
れている）を、遺伝子スクリーン・プラス・ナイロンフ
ィルター上のミニプレプ（ｍｉｎｐｒｅｐ）ＤＮＡのド
ツト・プロットハイブリダイゼーションによりスクリー
ニングした。使用したプローブは、開花後１４〜２８日
のｍＲＮＡまたはＬ　■７の葉のｏ＋ＲＮＡからつくっ
た、放射線標識した第１鎖合成ｃＤＮＡであった。種子
のｃＤＮＡべ強くハイブリダイズするが、葉のｃＤＮＡ
へほとんどあるいはまったくハイブリダイズしないクロ
ーンを分離した。多数のクローンは、ｐＮｌのＸｈｏ　
Ｉ　／工Ｉ断片（Ｃｒｏｕｃｈ等、１９８３、赳肛紅、
Ｂ、ナブス（β工ｄナプチンｃＤＮＡとの交差ハイブリ
ダイゼーションにより、種子の貯蔵蛋白質ナプチンを発
現するものとして同定された。ＢＨ３を上のようにして
使用して、胚特異的プロモーターの分難源として、Ｂ、
カンペストリス（Ｂ、　　並肚照封ｎ）のゲノムのクロ
ーンを同定した。

他の種子特異的遺伝子は、また、プロモーターの有用な
源として役立ことができる。タルシフニリン（ｃｒｕｃ
ｉｆｅｒｉｎ）のｃＤＮ＾クローン、Ｂ、ナプス（Ｂ、
　　胆ｍの他の主要種子貯蔵蛋白質は同定され（Ｓｉａ
＋ｏｎ等、　１９８０．前掲）そしてプロモーターのた
めのゲノムのライブラリーをスクリーニングするために
使用できた。

それらの特別の機能を知らないで、なお他のｃＤＮＡク
ローンを種子のｍｍ中のそれらの発現レベル、それらの
発現のタイミング（すなわち、開花後それらが発現する
時）およびＢ、カンペストリス（Ｂ、　　並肚競紅ｎ）
のゲノム中のそれらの概算の発現（コピーの数）に関し
て分類できる。脂肪酸の合成または他の種子の機能に関
する遺伝子を発現するために必要な基準に適合するクロ
ーンは、発現に必要な５′および３′調節領域を含有す
るゲノムのクローンのためのゲノムのライブラリーをス
クリーニングするために使用決定できる。非解読調節領
域を操作して、前の実施例におけるナプン遺伝子につい
て記載した一般適方法で、組織特異的発現カセットをつ
くることができる。

ｃＯＮＡのクローンの１つはＥＡ９である。それは種子
中において高度に発現され、そしてＢ、カンペストリス
（Ｂ、　　９肚照江ｎ）の葉からは発現されない。それ
は、ライブラリーからの７つの他のｃＤＮＡの交差ハイ
ブリダイゼーションによって示されるように、ドツト・
プロットハイブリダイゼーションにより高度に豊富なｍ
ＲＮＡを表わず。プローブとしてＥＡ９の７００ｂｐの
ＥｃｏＲＩ断片を使用する、開花後第１４日の種子およ
び第２１日および第２８日の胚から分離したｍＲＮＡの
ノザン・ブ２１１２　　　　　　　　　１　ＬＩ２Ｘｍ
ａｌｌｌ ｌｌａｅｌｌｌ １ａＴＩ１ １ａｌｌ１ ２１４　　ＴＣＡＡＧＣＣＴ八＾＾ＣＡＣＧへＡＣΔ＾
ＴＧＴＧＧＴＣＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴｆａＮ１ Ａ　　Ａ　　　Ａ　Ａ　　ＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
　　４１６０フト分析は、ＥＡ９が第１４日に高度に発
現され、そして第２１日および第２８日に非常に低いレ
ベルで発現されることを示す。ＥＡ９の制限地図を決定
し、そしてクローンを配列決定した。ポリアデニル化の
シグナルおよびＥＡ９の３′−末端におけるポリＡテイ
ルの同定は、ｃＤＮＡの配向およびｍＲＮＡの転写の方
向を確証する。クローンＥＡ９のためのここで提供され
た部分通配列は、ブラッシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）種
子特異的プロモーターの独特のクラスを同定するプロー
ブを合成するために使用できる。この配列を示に示す。

上の結果から明らかなように、転写または発現を特異的
中で特異的に得ることができ、こうして種子の生産物、
とくに胚の性質の表現型または変化の変調を行なうこと
ができる。正常の配列以外の配列に関連して種子中の配
列の転写を使用して、内因性または外因性の蛋白質を生
成すること、あるいは核酸配列の転写または発現を変調
できることが発見された。このようにして、種子を使用
して新規な生産物を生産し、改良された蛋白質組成物を
提供し、脂肪酸の分布などを変更することができる。

この明細凹中に述べたすべの刊行物および特許出願は、
本発明が関係するこの分野の技術水準を示すものである
。すべての刊行物および特許出願は、このような個々の
刊行物または特許出願が特定的にかつ個々に示す程度に
ここに引用によって加える。

真の発明は理解を明瞭とする口約で例示および実施例に
より多少詳述したが、明らかなよように成種の変化およ
び変更は特許請求の範囲を逸脱しないで可能である。

以下余日 手続補正書く方式） 昭和６２年１１月２ρ日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第１９２５３８号 ２、発明の名称 種子特異的転写調節造成物 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　カルジーン、インコーホレイティド４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、
補正の対象 （１１！ｌｉ書の「出願人の代表者」の欄（２）委　任
　状 （３）明　細　書 ７、補正の内容 （１）　＋２）　　別紙の通り （３）明細書の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の
目録 （１）訂正願書　　　　　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発現カセットを含む種子であって、該カセットが種
   子特異的転写開始領域、該開始領域の転写調節のもとに
   ある注目の配列、及び転写終結領域を含み、該発現カセ
   ットが該転写開始領域のための天然部位以外の部位にお
   いて該種子のゲノム中に挿入されていることを特徴とす
   る種子。 ２、前記注目の配列が内因性蛋白質又はその突然変異体
   をコードするリーディングフレームである、特許請求の
   範囲第１項記載の種子。 ３、前記注目の配列が外因性蛋白質をコードするリーデ
   ィングフレームである、特許請求の範囲第１項記載の種
   子。 ４、前記注目の配列が該種子の転写生成物に対して相補
   的な配列をコードしている、特許請求の範囲第１項記載
   の種子。 ５、該種子がブラッシカ（￥Ｂｒａｓｓｉｃａ￥）科の
   ものである、特許請求の範囲第１項記載の種子。 ６、種子特異的転写開始領域、該開始領域の転写調節の
   もとにＤＮＡ配列の挿入のための少なくとも２個の制限
   部位をもつ約１００ｂｐよりも小さいポリリンカー、及
   び転写終結領域を含む発現造成物であって、該ポリリン
   カーの配列が、天然に該開始領域の転写調節のもとにあ
   る遺伝子の配列とは異っている、発現造成物。 ７、前記転写開始領域がブラッシカ￥Ｂｒａｓｓｉｃａ
   ￥）種子遺伝子からのものである、特許請求の範囲第６
   項記載の発現構成体。 ８、前記遺伝子がナピン遺伝子である、特許請求の範囲
   第７項記載の発現構成体。 ９、種子特異的転写開始領域、該開始領域の転写調節の
   もとにある、該開始領域に連結されている天然配列以外
   の注目のＤＮＡ配列、及び転写終結領域を含む発現カセ
   ット。 １０、前記転写開始領域がブラッシカ（￥Ｂｒａｓｓｉ
   ｃａ￥）の遺伝子開始領域である、特許請求の範囲第９
   項記載の発現カセット。 １１、前記遺伝子がナピン遺伝子である、特許請求の範
   囲第１０項記載の発現カセット。 １２、前記注目の配列が構造遺伝子である、特許請求の
   範囲第１０項記載の発現カセット。 １３、前記構造遺伝子が脂肪酸生産のための生合成路中
   の蛋白質をコードしている、特許請求の範囲第１２項記
   載の発現カセット。 １４、該蛋白質がアシルキャリヤータンパク質である、
   特許請求の範囲第１３項記載の発現カセット。 １５、種子特異的転写開始領域、該開始領域の転写調節
   のもとにある、該開始領域に連結されている天然配列と
   は異る注目のＤＮＡ配列、及び転写終結領域を含む発現
   カセットと、原核生物用複製系と、形質転換された原核
   生物の選択のための標識とを含むベクター。 １６、植物を生長させて種子を生産させる、この場合に
   該植物の細胞が、種子特異的転写開始領域、該開始領域
   の転写調節のもとにある、該開始領域に連結されている
   天然配列とは異る注目のＤＮＡ配列、及び転写終結領域
   を含む発現カセットを含んでおり、 こうして修飾された遺伝子型の種子を生産する、ことを
   特徴とする種子の遺伝子型の修飾法。