JP2001510036A

JP2001510036A - 強い早期種子特異的遺伝子制御領域

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Publication number: JP2001510036A
Application number: JP2000503189A
Authority: JP
Inventors: ブラウン、ピエール; サマービル、クリス
Original assignee: カーネギーインスチチューションオブワシントン; モンサントカンパニー，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2001-07-31
Also published as: AU8404498A; EP1002067A4; WO1999003983A1; US5965793A; US6437220B1; BR9811014A; CA2296760A1; CA2296760C; AU737823B2; EP1002067A1

Abstract

(57)【要約】種子、特に胚細胞中での、外来または内因性遺伝子の発現を制御または修飾するために、早期種子特異的転写を提供する核酸配列およびその使用方法を説明する。該方法が、種子組織での脂肪酸生成を修飾することに結びついて特に有用であることがわかった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（政府の権利）本明細書に記載の発明は、米国エネルギー省の補助金ＤＥ−ＦＧ０２−９４Ｅ
Ｒ２０１３３による研究の過程でなされたものである。従って米国政府は、本発
明に一定の権利を有する。

【０００２】（緒言）１．技術分野隣接するヌクレオチド配列の早期種子特異的転写を促進する、ヌクレオチド配
列を含む転写制御領域が提供される。

【０００３】２．背景成長する種子にのみ発現されるか、または他のタイプの臓器もしくは組織より
はるかに高レベルで、成長する種子中で発現される多くの遺伝子が知られている
。本明細書の目的において、「遺伝子発現」は特定の遺伝子に対応するｍＲＮＡ
の合成を意味する。すなわち、遺伝子発現の量は一般に転写速度を意味するかま
たはｍＲＮＡの合成速度を意味する。便宜上本発明の文脈において、我々は、ｍ
ＲＮＡ蓄積の定常状態レベルの差は、ｍＲＮＡの合成速度の差を反映すると大ま
かに仮定した。ある場合にはｍＲＮＡの定常状態レベルの変化は、ｍＲＮＡ分解
速度の変化により引き起こされることは理解されている。しかし、本明細書で教
示されるプロモーター配列の操作は、一般的にｍＲＮＡ分解速度に影響を与える
可能性は低いと考えられる。

【０００４】種子特異的遺伝子発現に関する知見の多くは、貯蔵タンパク質をコードする遺
伝子の研究から得られている（ビーバン（Bevan）らの総説、１９９３年）。例えば、トランスジェニック植物中で大豆コングリシニン（conglycinin）プロモーターにより胚特異的発現を付与するＤＮＡ配列が、同定されている（チェン（
Chen）ら、１９８８年）。同様に貯蔵タンパク質ナピン（napin）は、ブラシカ・ナプス・エル（Brassica napus L.）（脂肪種子ナタネ）の種子の主要成分の１つである。ナピンプロモーターからの１５２塩基対断片は、成熟したタバコ種
子中のβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子の強い発現を指令した（スタルバ
ーグ（Stalberg）ら、１９９６年）。すなわち、貯蔵タンパク質の強い種子特異
的発現を指令する配列は、遠縁の植物種の間で保存されている。ナピンプロモー
ターは、新規脂肪酸を産生するように設計されたトランスジェニック植物中の遺
伝子の発現を調節するために使用されている（例えば、ヴェールカー（Voelker ）ら、１９９６年）。しかし貯蔵脂質の蓄積は実質的に、ナピンまたは他の貯蔵
タンパク質遺伝子が最大の発現レベルに達する前に始まり（ポスト−ベイテンミ
ラー（Post-Beittenmillar）ら、１９９２年）、貯蔵タンパク質遺伝子のプロモ
ーターは、貯蔵脂質蓄積に関連する遺伝子の発現を調節するのに好適ではないこ
とがある。

【０００５】本発明において、種子脂質組成の修飾を目指した遺伝子の発現または他の応用
についての好適な制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサ
ー）は、種子貯蔵脂質の合成と蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子と同様の
または同一の、発現の時間的および組織特異的パターンを有する遺伝子から得ら
れるであろう。しかし最近まで、脂質代謝に関与し種子特異的に発現される遺伝
子は、あまり知られていない。アブラナ科（Crucifer）のレスケレラ・フェンド
レリ（Lesquerella fendleri）からのカッパヒドロキシラーゼは、このクラスの
遺伝子の最初の例の１つである。本発明のプロモーターは普通、エル・フェンド
レリ（L. fendleri）からのカッパヒドロキシラーゼの発現を調節する。カッパヒドロキシラーゼは、小胞体中に存在し、そこでリン脂質のｓｎ−２位に結合し
た脂肪酸中へのヒドロキシル基の導入を触媒すると考えられている。水酸化脂肪
酸はエル・フェンドレリ（L. fendleri）の種子貯蔵脂質中に豊富に存在するが他の臓器や組織中では検出できる程度に存在しないため、この遺伝子は種子中で
のみ多量に発現される可能性が高い。エル・フェンドレリ（L. fendleri）からのカッパヒドロキシラーゼの単離は、米国特許出願第０８／５３０，８６２号と
０８／５９７，３１３号、およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０２１８７中に記載された
。カッパヒドロキシラーゼのｍＲＮＡは種子中に豊富にあるが、栄養組織中では
検出されないことを示す証拠が提供された。ここで我々は、エル・フェンドレリ
（L. fendleri）カッパヒドロキシラーゼのコード配列から５’方向の制御領域は、エル・フェンドレリ（L. fendleri）以外の植物種の種子特異的プロモーターとして有用なことを証明する。我々はまた、カッパヒドロキシラーゼ以外の遺
伝子の早期種子特異的発現（すなわち、異種遺伝子発現）を引き起こすのに、こ
の制御領域が使用できることも示す。本明細書に記載の所望の性質を有する制御
領域はまた、親出願中で開示されたように単離され同定された他の植物の脂肪酸
アシルヒドロキシラーゼ遺伝子の上流にあるべきである。

【０００６】（発明の要約）本発明の目的は、遺伝子産物の種子特異的発現を示すトランスジェニック植物
で使用するための転写制御領域を提供することである。

【０００７】本発明のさらなる目的は、成長している種子中の遺伝子産物の早期レベルの発
現を示すトランスジェニック植物で使用するための転写制御領域を提供すること
である。

【０００８】本発明のさらに別の目的は、遺伝子産物の高レベル発現を示すトランスジェニ
ック植物で使用するための転写制御領域を提供することである。

【０００９】植物脂肪酸アシルヒドロキシラーゼ遺伝子からの転写制御領域（例えば、プロ
モーター、エンハンサー、サイレンサー）を含む、単離された核酸（例えば、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）が提供される。好ましくは植物遺伝子はカ
ッパヒドロキシラーゼ遺伝子であり、さらに好ましくはカッパヒドロキシラーゼ
遺伝子はレスケレラ（Lesquerella）由来である。制御領域は配列番号１からのヌクレオチド配列を含有してもよい。制御領域は、約５００ヌクレオチド〜約２
０００ヌクレオチドを含み、高レベルで、成長の初期段階で、種子特異的に、ま
たはこれらの組合せで、発現を指令することができる。単離された核酸はさらに
、天然の脂肪酸アシルヒドロキシラーゼをコードする配列を含有してもよい。

【００１０】上記の単離された核酸と転写されるように機能的に結合した非天然の配列とか
らなる組換え核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）が提供され
る。この配列は制御領域が得られるものと同じ植物種から、または異なる種もし
くは属からでもよく、配列は細菌、真菌、または哺乳動物遺伝子からでもよい。
好ましくは、配列は植物遺伝子由来であり、特に種子の脂質代謝または種子の成
長に関与するものである。配列は、転写に対してセンスまたはアンチセンス方向
でもよい。

【００１１】植物細胞を操作して早期および／または種子特異的転写を与えるために使用さ
れる発現作製体（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）が提供される
。特に脂肪酸アシルヒドロキシラーゼをコードする遺伝子からの転写制御領域は
、天然または同族遺伝子以外に機能的に結合しており、早期および／または種子
特異的転写を与えるようにゲノム内に組み込むために植物細胞宿主中に導入され
る。構築物は、内因性産物の発現の調節ならびに種子中の外因性産物の産生を提
供する。

【００１２】上記の組み込まれたかまたは組み込まれていない核酸、組換え核酸、または発
現構築物を含有する形質転換した宿主細胞、トランスジェニック植物、およびト
ランスジェニック種子が提供される。宿主細胞は、細菌、真菌、植物、動物、ま
たは類似の起源のものでよい。トランスジェニック植物は、早期種子種遺伝子発
現が好ましいアラビドプシス（Arabidopsis）、ブラシカ（Brassica）、綿花、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、亜麻、落花生、または他の双子葉植物でも
よい。本発明の制御領域はまた、単子葉植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、
コメなど）の遺伝子の種子特異的発現を調節するのに有用である。トランスジェ
ニック種子は、同様の植物種から得られる。トランスジェニック種子から、油状
物を圧縮するか、抽出するか、または他の物質（例えば、タンパク質、炭水化物
、ポリアルカノン酸塩、または二次的代謝物）を抽出する。

【００１３】トランスジェニック植物または種子を産生するために、その使用法の説明書と
ともに、前記の核酸、組換え核酸、発現構築物、宿主細胞、またはこれらの組合
せを含有するキットも提供される。

【００１４】（発明の詳細な記述）本発明において、種子特に種子成熟中の胚中の転写の修飾を可能にする発現構
築物が提供される。この発現構築物は、種子形成、好ましくは胚形成と種子成熟
と関連する、制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー）
を含む。

【００１５】種子中で新規機能または産物を提供するために、カッパヒドロキシラーゼ制御
領域の下流かつその転写制御下に、内因性産物を、量、相対分布、タイミングな
どに関して、または外因性発現産物の産生を、調節することにより、種子の表現
型を修飾する目的の配列がある。この構築物は好ましくは、遺伝子が導入される
発現カセットを提供するように、ポリアデニル化および／または停止領域を提供
する。

【００１６】転写開始および停止領域は、遺伝子を制御領域の転写制御下に挿入するための
１つまたは複数の制限部位を有するリンカーまたはポリリンカーにより、転写の
方向で分離して提供することが便利である。通常リンカーは、１〜１０個、さら
に一般的には約１〜８個、好ましくは約２〜６個の制限部位を有する。一般にリ
ンカーは、１００塩基対未満であり、しばしば６０塩基対未満であり、かつ一般
に少なくとも約５塩基対である。核酸増幅により生成される挿入体について、こ
の挿入体は、例えば制限酵素消化、直接の平滑末端連結、連結非依存性クローニ
ング（ＬＩＣ）、およびチミジン残基の単一の３’−オーバーハングへの連結（
米国特許第５，４８７，９９３号）のような技術により、制御領域に連結しうる
。

【００１７】本発明の転写制御領域は、宿主に対して外来または異種であってもよい。外来
とは、制御領域が導入される宿主中にその制御領域が見いだされないことを意味
する。特に関係のあるものは、種子特異的カッパヒドロキシラーゼ遺伝子、特に
エル・フェンドレリ（L. fendleri）のものに関連する転写制御領域である。

【００１８】転写制御領域は種子の表現型を変化させるのに使用される。表現型の種々の変
化が関係する。これらには、種子中の脂肪酸組成の修飾、すなわち長さ、不飽和
度、水酸化、エポキシ化などについての種々の脂肪酸の比および／または量の変
化を含む。すなわち脂肪酸組成は、脂肪酸を修飾する酵素を導入して、宿主植物
中には通常見いだされない脂肪酸を産生することにより変化させることができる
。また本発明のプロモーターを使用して、それ自体が直接有用なタンパク質、例
えば工業的用途の触媒性を有するタンパク質を産生することも好ましい。あるい
は、植物以外の供給源（例えば、哺乳動物、真菌、始原細菌、およびユーバクテ
リア）からの種々の産物を提供してもよい。実際本発明の転写制御領域は、一般
に植物宿主の種子中の目的のタンパク質を産生するのに使用される。

【００１９】発現カセットは、５’→３’方向の転写、転写開始領域、目的のヌクレオチド
配列、および植物中で機能する転写停止領域を含有してもよい。多くの（しかし
すべてではない）場合、発現カセットはまた、翻訳開始および停止配列（すなわ
ち、転写／翻訳カセット）を含む。１つまたはそれ以上のイントロンも存在して
もよい。

【００２０】ヌクレオチド配列は通常、目的のペプチド（例えば酵素）の少なくとも１部を
コードする読みとり枠、またはゲノム配列に相補的な配列（例えばアンチセンス
）を有し、ここでゲノム配列は、読みとり枠、イントロン、非コードリーダー配
列、または他の配列でもよく、相補的な配列は、転写、メッセンジャーＲＮＡプ
ロセシング（例えば、スプライシング）、または翻訳を阻害するであろう。目的
のヌクレオチド配列は、合成されたもの、天然に由来するもの、またはこの組合
せでもよい。核酸は、天然の供給源（例えば、細菌）、鋳型とポリメラーゼ（Ｄ
ＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを産生する）の反応混合物から精製されるか、ま
たは化学合成される。

【００２１】発現カセットの調製において、種々のヌクレオチド断片を操作して、正しい配
向かつ適宜正しい読みとり枠で、ヌクレオチド配列が提供される。この目的のた
めに、アダプターまたはリンカーを使用してヌクレオチド断片を結合するか、ま
たは他の操作を使用して、便利な制限部位の付与、余分なヌクレオチドの除去、
制限部位の除去などを提供する。この目的のために、インビトロの突然変異誘発
、プライマー修復、制限切断、アニーリング、切断、連結などが使用され、挿入
、欠失、反転、または置換（例えば、転移、トランスバージョン）などが関与し
てもよい。

【００２２】停止領域は比較的相互に交換可能であるらしいため、使用される停止領域は主
に便利さにより選択されるであろう。停止領域は、転写開始領域と起源が同じで
あるか、目的のヌクレオチド配列と起源が同じであるか、または別の供給源から
得られてもよい。便利な停止領域は、エー・ツメファシエンス（A. tumefaciens
）のＴｉ−プラスミドから得られ、例えばオクトピンシンターゼおよびノパリン
サンターゼ停止領域がある。

【００２３】本発明の核酸と構築物は、外来宿主中の構築物の増殖と選択を可能にする配列
をさらに含んでよい。場合により、核酸または構築物中に複製と選択マーカーの
起源が含まれる。複製開始点は好ましくは、微生物（例えば、細菌、真菌）から
得られるが、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスから得られてもよい。選択マーカーは
、原核生物および／または真核生物中で機能し、抗生物質（例えば、アンピシリ
ン、ヒグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、プロマイシン（puromycin ）、テトラサイクリンなど）に対する耐性を付与する。

【００２４】適当な操作（例えば、制限切断、平滑末端を与えるためのオーバーハングの後
方消化または充填、リンカーの連結など）により、結合および連結のための断片
の相補的な末端またはフラッシュ末端を提供することができる。

【００２５】種々の工程の実施において、クローニングを使用して、ＤＮＡ量を増幅しＤＮ
Ａを解析して、遺伝子操作が正しく起きたことを確認する。広範なクローニング
ベクターが使用でき、ここでクローニングベクターは、大腸菌（E. coli）中で機能性の複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む。ベクタ
ーの例としては、ｐＢＲ３３２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣ
ＹＣ１８４などがある。すなわち配列は、適当な制限部位でベクター中に挿入さ
れ、得られるプラスミドは大腸菌（E. coli）宿主を形質転換するのに使用され、大腸菌（E. coli）は適当な栄養培地中で培養し、細胞を採取し溶解し、プラスミドを回収する。解析には、配列解析、制限解析、発現の誘導、電気泳動など
を含んでよい。各操作後、最終構築物中で使用されるＤＮＡ配列を制限切断し、
次の配列に結合させ、ここで各部分作製体は、同じかまたは異なるプラスミド中
でクローン化してもよい。

【００２６】宿主植物中への転写構築物の導入法に依存して、他のヌクレオチド配列が必要
な場合がある。例えば後述のように植物細胞の形質転換のためにＴｉ−またはＲ
ｉ−プラスミドを使用する時、Ｔｉ−およびＲｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの少
なくとも右の境界そしてしばしば右と左の両方の境界を、フランキング領域とし
て転写構築物に結合させる。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は広
範に研究されており、フラレイ（Fraley）ら（１９８６年）とリンゼイ（Lindse
y）（１９９６年）に詳細に記載されている。

【００２７】植物細胞宿主への核酸の導入のために、多様な方法が利用できる。これらの方
法には、形質転換物質としてエー・ツメファシエンス（A. tumefaciens）または
エー・リゾゲネス（A. rhizogenes）を用いるＴｉ−ＤＮＡによる形質転換、プロトプラスト融合、注入、電気穿孔などがある（リンゼイ（Lindsey）（１９９６年）の総説）。アロバクテリウム（Arobacterium）を用いる形質転換について
、Ｔｉ−プラスミド（特にＴ−ＤＮＡ）と相補的なＤＮＡを含有するプラスミド
を大腸菌（E. coli）中で調製する。プラスミドはアロバクテリウム（Arobacter
ium）中で複製できるかまたは複製できず、すなわち部分的に、転写構築物がＴｉ−プラスミド中に組み込まれるかまたは独立したプラスミド上に保持されるか
に依存して、広域スペクトルの原核生物複製系（例えば、ＲＫ２９０）を有する
かまたは有さない。ヘルパープラスミドを用いて、転写構築物はエー・ツメファ
シエンス（A. tumefaciens）に移され、得られる形質転換生物は植物細胞を形質
転換するために使用される。

【００２８】発現カセットを植物細胞に移すことを可能にするために、外植片をエー・ツメ
ファシエンス（A. tumefaciens）またはエー・リゾゲネス（A. rhizogenes）とともに培養して、植物細胞を選択のための適当な選択培地に分散させ、培養して
カルスにし、苗条を増殖させ、根付け培地中で増殖させて苗条から苗木を再生さ
せることが便利である。アグロバクテリウム（Agrobacterium）宿主は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの輸送に必要なｖｉｒ遺伝子を有するプラスミドを含有し、Ｔ
−ＤＮＡを有することも有さないこともある。注入と電気穿孔法のために、無力
化したＴｉ−プラスミド（腫瘍遺伝子が欠如している、特にＴ−ＤＮＡ領域）を
使用して、植物細胞に遺伝子を導入してもよい。

【００２９】形質転換された細胞は植物まで増殖させ、同じ形質転換した株または異なる株
で授粉し、所望の表現型の特徴を有する得られるハイブリッドを同定する。２つ
またはそれ以上の世代を増殖させて、対象の表現型の特徴が安定に維持され遺伝
していることを確認し、次に種子を採取して所望の表現型または他の性質が達成
されていることを確認する。

【００３０】宿主細胞として、目的の種子を与える任意の植物品種が使用される。すなわち
多くの場合、目的の種子特異的産物が関与している植物が選択されるであろう。
具体的な目的の種子には、脂肪種子、例えばアラビドプシス（Arabidopsis）、ブラシカ（Brassica）、綿花、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、亜麻、落花
生などがある。コムギ、トウモロコシ、コメなどの種の種子も関係がある。

【００３１】本発明のプロモーターを含むヌクレオチド配列は、２０００を超えるヌクレオ
チドを含有する。他の植物のプロモーターの解析に基づくと、本発明のプロモー
ター中に含有される配列の実質的により小さい領域が、同様の性質を示す可能性
が高い。例えば前述のように、１５２塩基対断片は、ビー・ナプス（B. napus）
およびタバコ種子中のβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子の強い発現を指令
した（スタルバーグ（Stalberg）ら、１９９６年）。すなわち我々は、数百ヌク
レオチドまたはこれ以下の配列が、本明細書に開示した完全な配列と同じまたは
類似の性質を有することが見つかると考える。

【００３２】このサブ配列はスタルバーグ（Stalberg）ら（１９９６年）の研究、およびベ
ーバン（Bevan）ら（１９９３年）の総説で引用されたような他の研究に例示の実験により同定される。最小プロモーター配列は、プロモーター配列からヌクレ
オチドを連続的に除去（例えば末端切断）し、修飾したプロモーターの活性を天
然のプロモーターの活性を比較することにより、確認することができる。さらに
リンカー走査または飽和突然変異誘発を使用して、修飾プロモーターを産生して
もよい。評価されるプロモーター活性には、例えばカッパヒドロキシラーゼプロ
モーターの転写の量、転写の時間的特異性（すなわち、早期）、転写の空間的特
異性（すなわち、種子）、またはこれらの組合せがある。同様に、エンハンサー
またはサイレンサー配列を同定し修飾してもよい。エンハンサーまたはサイレン
サー配列は、転写開始の位置を決定しないが、プロモーターに対していずれの配
向でも機能し、プロモーターからある程度の距離で位置してもよい。エンハンサ
ーまたはサイレンサー配列を認識する同族の結合因子の存在のために、エンハン
サーは、機能的に結合したプロモーターからの転写を上昇させ、サイレンサーは
機能的に結合したプロモーターからの転写を低下させるであろう。エンハンサー
結合因子は、早期種子組織中に存在すると予測され、サイレンサー結合因子は、
種子以外の組織または早期成長以外の時期に存在すると予測される。プロモータ
ー、エンハンサー、サイレンサー、またはこれらの組合せは、カッパヒドロキシ
ラーゼ制御領域による早期種子特異的転写の原因かも知れない。遺伝子操作によ
り同定されるプロモーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーモジュ
ールは、天然の配列または他の遺伝子（好ましくは植物遺伝子）からの異種制御
配列と組合せてもよい。

【００３３】異なる植物脂肪酸アシルヒドロキシラーゼ遺伝子の間に保存されている５’非
翻訳領域のコンピューター比較を使用して、転写制御領域を同定してもよい（グ
リブスコフ（Gribskov）とデヴェロー（Devereux）、１９９１年）。制御領域は
また、既知転写結合因子により認識されるコンセンサス配列を探索することによ
り同定され、そのようなコンセンサス配列はしばしば二分子対称を示す。各推定
の制御領域の機能は、ゲル遅延またはヌクレアーゼ保護により確認される。

【００３４】転写制御領域を同定するための測定法は、典型的には領域を適当なレポーター
遺伝子（例えば、大腸菌（E. coli）β−グルクロニダーゼ）に融合させ、次にレポーター構築物をトランスジェニック植物に導入し、産生されたβ−グルクロ
ニダーゼ活性、タンパク質、またはｍＲＮＡの量を測定する（ガラハー（Gallag
her）、１９９２年を参照）。他のレポーター遺伝子も使用され、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ル
シフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光性タンパク質、またはこれらの誘
導体がある。好ましくは測定は、安定に形質転換された植物で行われるが、有用
な情報はしばしば、粒子衝撃法などにより構築物で一過性に形質転換された組織
を測定することにより得られる。すなわち類似のまたは同じレベルの活性を有す
るであろう本明細書に開示の制御領域の多くの誘導体が包含される。さらに、転
写制御領域または誘導体の配列中の多くのヌクレオチドの変化も同等の活性を有
すると考えられる。すなわち、開示したヌクレオチド配列中の欠失、挿入、反転
、および／または置換は、同様の生物活性（例えば、転写の量、早期転写、種子
特異的転写）を有する制御領域の誘導体を産生する。好ましくは配列番号１の機
能的に同等の誘導体は、少なくとも２０００塩基対、少なくとも１６００塩基対
、少なくとも１４００塩基対、少なくとも１２００塩基対、少なくとも１０００
塩基対、少なくとも８００塩基対、少なくとも６００塩基対、少なくとも４００
塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも１００塩基対、または少なくとも
５０塩基対を含む。

【００３５】以下の例は例示のために示されるものであり、決して本発明を限定するもので
はない。

【００３６】（実施例）略語：Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グル
クロン酸）およびＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）

【００３７】材料と方法クローニングベクターバイナリーＴｉプラスミドｐＢＩ１２１をクロンテク（Clontech）（パロアル
ト、カリホルニア州）から購入した。ＣｏｌＥ１由来ベクターｐＭＯＮ２６１１
２はモンサント（Monsanto）から得て、これを図１に示す。ブラシカ・ナプス（
Brassica napus）からのナピンプロモーターを含有するこのプラスミドを大腸菌
（E. coli）中で複製し、これはアンピシリン耐性を付与する。バイナリーＴｉプラスミドｐＭＯＮ１７２２７（図２）は、大腸菌（E. coli）での複製を可能にするｐＢＲ３２２の複製開始点、細菌宿主中での選択のためのスペクチノマイ
シン／ストレプトマイシン耐性遺伝子、およびグリホセート上の選択のためのＣ
Ｐ４シンターゼ遺伝子の両側に位置するＴｉプラスミドの左の境界と右の境界、
およびノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター遺伝子の上流のＮｏｔＩクロー
ニング部位を含有する。プラスミドｐＭＯＮ１７２２７−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳは
、後述するようにｐＭＯＮ１７２２７から得られるバイナリーＴｉプラスミドで
ある。

【００３８】ＧＵＳ活性を検出するためのプロトコールは以下の通りである。染色緩衝液（
２０％メタノール、０．５％トリトンＸ−１００、１mMフェロシアン酸カリウム
（potassium ferrocyanide）、および３mM Ｘ−Ｇｌｕｃを含有する５０mM Ｋ
ＰＧ、緩衝液、ｐＨ７．０）中で組織をインキュベートした。典型的には組織を
この溶液中で約１２時間インキュベートしたが、ある場合には（染色が強い場合
）組織を速やかに取り出し、より短時間で染色を完了した。試料を６５０mmHgの
真空チャンバー中に２分間入れ、次に３７℃で１５時間インキュベートした。染
色後、試料を２０％、４０％、６０％および７０％エタノール中に連続的に５分
浸けて清澄化した。

【００３９】ＧＵＳ活性を以下のように視覚的に定量化した。半対数スケールで活性のない
のを０とし、最も高いレベルのＧＵＳ活性を４としてスコアをつけた。評価４を
与えたもののほぼ５０％の暗い染色を示した試料を３と評価し、評価４を与えた
もののほぼ５０％の暗い染色を示した試料を３と評価し、評価３を与えたものの
ほぼ５０％の暗い染色を示した試料を２と評価し、そして評価２を与えたものの
ほぼ５０％の暗い染色を示した試料を１と評価した。

【００４０】例１．トランスジェニックアラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana
）中の外来遺伝子の種子特異的発現エル・フェンドレリ（L. fendleri）からの種子特異的プロモーターの単離ムレイ（Murray）とトンプソン（Thompson）（１９８０年）が記載したように
、エル・フェンドレリ（L. fendleri）の若い葉からゲノムＤＮＡを単離した。５００μgのＤＮＡを消化し、ショ糖勾配上でサイズ選択（サムブルーク（Sambr
ook）ら、１９８９年）し、そしてＤＮＡ（平均サイズ１２kb）をＤａｓｈＩＩのＢａｍＨＩ消化したアームに連結することにより、ベクターλＤａｓｈＩＩ（
ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La Jolla）、カリホルニア州）中で作
製したＳａｕ３ＡＩ部分消化物ゲノムライブラリーを調製した。製造業者の条件
に従って全連結物をパッケージングし、大腸菌（E. coli）株ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＡ−Ｐ２（ストラタジーン（Stratagene））上にまいた。これは、５×１
０⁵個の１次組換えクローンを与えた。次に製造業者の説明書に従ってこのライブラリーを増幅した。ゲノムライブラリーの一部を大腸菌（E. coli）ＸＬ１− Ｂｌｕｅ上にまき、得られたプラーク（１５０，０００）を製造業者の説明書に
従って、荷電ナイロン膜（ハイボンド（Hybond）Ｎ⁺、アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）にリフトした。ストラタリンカー（Stratalinker）（ストラタジーン（Stratagene））を使用して
ＵＶ下でＤＮＡをフィルターに結合させた。

【００４１】プラスミドｐＬｅｓｑ２（米国特許出願第０８／５３０，８６２号に記載）上
に存在するエル・フェンドレリ（L. fendleri）カッパヒドロキシラーゼのｃＤＮＡクローンと膜をプローブ結合させることにより、エル・フェンドレリ（L. f
endleri）ヒドロキシラーゼに対応するゲノム配列を有するいくつかのクローンを単離した。プラスミドｐＬｅｓｑ２をランダムプライミングにより³²Ｐで標識
した。フィルターを、７％ＳＤＳ、１mM ＥＤＴＡ、０．２５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄ （ｐＨ７．２）、１％ＢＳＡ中で６５℃で２時間プレハイブリダイズし、同じ溶
液中で１６時間プローブとハイブリダイズさせた。フィルターを、０．１％ＳＤ
Ｓ以外に２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣを含有する溶液中で６５℃で
連続的に洗浄した。ヒドロキシラーゼの完全なコード配列を含有する４．５kbの
ＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩ断片と約２．２kbの５’上流領域を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（ストラタジーン（Stratagene））の対応する部位にサブクローニン
グしてプラスミドｐＬｅｓｑｔｏｔを作成し、自動シーケンサーを使用してジデ
オキシ鎖停止法によりプロモーター領域の配列を完全に決定した。配列データは
、コンピューターソフトウェアパッケージＤＮＡＳＩＳ（ヒタチ（Hitachi）、ブリスバン（Brisbane）、カリホルニア州）を使用して解析した。

【００４２】クローンｐＬｅｓｑｔｏｔ中の挿入体の部分配列を図３に示す（配列番号１）
。配列は３６７０塩基対の連続的ＤＮＡ配列を含む。このクローンは、２２１７
塩基対の非翻訳領域領域（すなわち、最初のＡＴＧコドンに先行するヌクレオチ
ド）、１１５２塩基対の読みとり枠、および３０２塩基対の３’非翻訳領域をコ
ードする。読みとり枠は、予想分子量４４，３７０の３８４アミノ酸のタンパク
質をコードする。

【００４３】ベクターｐＢＩ１０１−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳの構築とアラビドプシス（Arabidop
sis）の形質転換第１の工程で、ｐＬｅｓｑｔｏｔをＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで切断し、２．２kbの挿入体断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ中にクローン化した。得られた
ベクターｐＬｅｓｑｐｒｏｍは、ｐＬｅｓｑｔｏｔ中でＯＲＦの上流に２．２kb
の配列を含有する。プロモーター断片はＢａｍＨＩ部位を含有しないが、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳのポリリンカーは、ＥｃｏＲＩクローニング部位の隣にＢ
ａｍＨＩ部位を含有する。すなわちｐＬｅｓｑｐｒｏｍを次にＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで切断し、挿入体断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。ｐＢＩ１
２１を同じ酵素で切断して３５Ｓプロモーター断片を放出させた。ｐＬｅｓｑｐ
ｒｏｍのＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ挿入体断片を次に、ｐＢＩ１２１の対応する部位に連結して、ベクターｐＢＩ−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳを得た（図４）。ｐＢＩ
−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳを次に、電気穿孔法によりエー・ツメファシエンス（A. t
umefaciens）株ＧＶ３１０１中に導入し、アラビドプシス（Arabidopsis）植物の形質転換に使用した。

【００４４】電気穿孔法のための細胞を以下のように調製した。ＧＶ３１０１をＬＢ培地（
水１リットル当たり１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣｌ）で増
殖させた。２５０mlの培養物をＯＤ₆₀₀＝０．６まで増殖させ、次に４０００rpm
で１５分遠心分離した（ソーバル（Sorvall）ＧＳ−Ａロータ）。ゆるいペレッ
トから上清を直ちに吸引し、これを静かに５００mlの氷冷水中に再懸濁した。細
胞を前記したように遠心分離し、３０mlの氷冷水中に再懸濁し、３０mlの試験管
に移し、５０００rpm （ソーバル（Sorvall）ＳＳ−３４ロータ）で５分遠心分離した。これを３回繰り返し、細胞を連続的に３０mlの氷冷水、３０mlの氷冷し
た１０％グリセロール、そして最後に０．７５mlの氷冷した１０％グリセロール
中に再懸濁した。これらの細胞のアリコートを取り、液体窒素中で凍結し、−８
０℃で保存した。

【００４５】電気穿孔法では、ジーンパルサー（GenePulser）装置（バイオラッド（Bio-Ra
d）、ハーキュリーズ（Hercules）、カリホルニア州）を使用し、水中に４０μ ｌの細胞と１μｌのＤＮＡを含有する冷２mmギャップキュベットを使用して、２
．５KVの電圧と２５μＦの静電容量で使用した。電気穿孔した細胞を１mlのＳＯ
Ｃ培地（サムブルーク（Sambrook）ら、１９８９年、Ａ２ページ）で希釈し、２
８℃で２〜４時間インキュベートした後、カナマイシン（５０mg/l）を含有する
ＬＢ培地上にまいた。

【００４６】アラビドプシス（Arabidopsis）植物を、基本的にベクトールド（Bechtold）ら（１９９３年）に記載のようにインプランタ（in planta）形質転換法により形質転換した。エー・ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＧＶ３１０１（ｐＢ
Ｉ−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳ）の細胞を液体培養物から遠心分離して採取し、次にＯ
Ｄ₆₀₀＝０．８で浸透培地に再懸濁した。浸透培地は、１０mg/lの６−ベンジルアミノプリンと５％グルコースを含有するムラシゲ（Murashige）とスクーグ（S
koog）マクロとミクロ栄養物質培地（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）である。１２〜１５個の植物のバッチを天然光で、１日の平均温度約２５
℃で、土壌を含有する３．５インチの鉢中で３〜４週間増殖させた。無傷の植物
を細菌懸濁液中に浸漬し、次に真空チャンバー中に移し、組織が均一に水に浸漬
したように見えるまで実験室の真空ポンプで作成した６００mmの真空下に置く（
約１０分）。植物を連続的光（４００〜７００nmの範囲で１００μmolm^-2s^-1照射）で４週間増殖させた。鉢の中のすべて植物から得られた種子を１つのバッチ
として採取した。種子を、エタノールで２分、次に家庭用漂白剤（クロロックス
（Chlorox））、水およびツイーン８０（５０％、５０％、および０．０５％）の混合液中で１０分連続的に処理し、次に無菌水で完全にリンスして滅菌した。
Ｂ５ビタミン（シグマ（Sigma））を補強し５０mg/lのカナマイシンを含有する１／２×ムラシゲ（Murashige）とスクーグ（Skoog）塩培地を含有する１００mm
シャーレ中の寒天固化培地に、種子を高密度（２０００〜４０００／プレート）
でまいた。４℃で４８時間インキュベートして発芽を刺激後、形質転換体が、ク
ロロティックカナマイシン−感受性苗木のバックグランドに対して健康な緑の苗
木が明瞭に同定できるまで７日間苗木を増殖させた。形質転換体を土壌に移し、
成熟するまで増殖させた。２０を超える形質転換体が得られた。

【００４７】トランスジェニック植物の解析カッパヒドロキシラーゼプロモーターの活性を、Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸）で染色してβ−グルクロ
ニダーゼの存在について、トランスジェニックアラビドプシス（Arabidopsis）植物の種々の組織を染色することにより測定した。トランスジェニックアラビド
プシス（Arabidopsis）植物から異なるステージで単離された葉、茎、長角果、花、および成長している胚について組織染色を行なった。３つのトランスジェニ
ック植物からのアラビドプシス（Arabidopsis）胚を種皮から切開し、７．５g/l
寒天を用いてＭＳ−塩培地を含有するプレート上で後期ハート（heart）段階から後期子葉段階までステージ分類をした後、ＧＵＳ染色緩衝液に移した。葉、茎
、および花序をトランスジェニック植物から採取し、直接染色緩衝液に浸漬した
。

【００４８】３つのトランスジェニック植物（１〜３と呼ぶ）で得られた結果を表１に示す
。これらの結果から、カッパヒドロキシラーゼプロモーターは、すでにトーピー
ド（torpedo）段階の胚でＧＵＳ活性の出現を引き起こすことがわかる。ＧＵＳ活性は、胚の以後の成長を通して持続した。ｐＢＩ−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳトラン
スジェニック植物中のＧＵＳ活性の量を、大豆ベータ−コングリシニン（７Ｓ）
遺伝子（ヒライ（Hirai）ら、１９９４年）のアルファサブユニットをコードする遺伝子からのプロモーターにより駆動されるＧＵＳ遺伝子を発現するトランス
ジェニック植物と比較した。高レベルのＧＵＳ発現についてｐ７Ｓ−ＧＵＳ植物
を選択した。レスケレラ（Lesquerella）プロモーターは７Ｓプロモーターより早く活性があった。活性の開始は、アラビドプシス（Arabidopsis）中の貯蔵タンパク質の開始と一致する（表１）。カッパヒドロキシラーゼプロモーターを含
有するトランスジェニック植物中のＧＵＳ活性のレベルは、大豆β−コングリシ
ニンプロモーターを含有するトランスジェニック植物中のものと少なくとも同程
度であった。トランスジェニック植物の葉、茎、または豆果の試料にはＧＵＳ活
性がなかった。すなわち、トランスジェニック植物中の外来遺伝子の種子特異的
発現を引き起こすのにカッパヒドロキシラーゼプロモーターを使用することがで
きる。

【００４９】

【表１】

【００５０】例２．トランスジェニックブラシカ・ナプス（Brassica napus）中の外来遺伝子
の種子特異的発現

【００５１】カノーラ（Canola）の形質転換のためのベクターｐＭＯＮ１７２２７−ｐＬｅｓ
ｑ−ＧＵＳの構築第１の工程で、ベクターｐＢＩ１２１（クロンテク（Clontech））をＳｍａＩ
とＳａｃＩで切断してＧＵＳ遺伝子を精製した。ＧＵＳ遺伝子を含有する挿入体
断片を、ベクターｐＭＯＮ２６１１２のＳｔｕＩ部位とＳａｃＩ部位にクローン
化して、ベクターｐＭＯＮ２６１１２−ＧＵＳを得た。第２の工程で、エル・フ
ェンドレリ（L. fendleri）カッパヒドロキシラーゼプロモーターを含有するｐＬｅｓｑｐｒｏｍからのＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ断片を、ＨｉｎｄIIIとＢｇｌ
IIで切断したｐＭＯＮ２６１１２−ＧＵＳ中にクローン化した。得られたベクタ
ー（ｐＭＯＮ２６１１２−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳ）をＮｏｔＩで切断し、挿入体断
片を、ＮｏｔＩで切断したベクターｐＭＯＮ１７２２７に連結した。最後のベク
ターｐＭＯＮ１７２２７−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳ（図５）を使用して、レスケレラ
（Lesquerella）プロモーター−ＧＵＳカセットを、アグロバクテリウム（Agrob
acterium）介在形質転換を使用してカノーラ（Canola）植物中に導入した。

【００５２】ビー・ナプス（B. napus）の形質転換と再生ｐＭＯＮ１７２２７−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳを含有するアグロバクテリウム（Ag
robacterium）株ＡＢＩを使用して、基本的にフライ（Fry）ら（１９８７年）に
記載のように、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）品種ウェスター（Westar）
を形質転換した。簡単に説明すると苗木をメトロミックス（Metro Mix）３５０中に植え、以下の条件（温度、昼１５℃、夜１０℃、光の強度６００μmolm^-2s^- ¹ 、夜８時間、相対湿度５０％）で増殖チャンバー中で増殖させ、３週令になった時、６インチの鉢に移した。５週令のウェスター（Westar）植物を、とう立ち
した時（しかし開花の前）に一度採取する（最大３つの花を有する植物までが採
取される）。葉と芽を取り、花の芽の下の４〜５インチの茎を、外植片組織源と
して使用する。接種の前に、茎を以下のように滅菌する：７０％のメタノールに
１分浸漬、３８％のクロロックス（Clorox）に２０分浸漬、無菌脱イオン水で２
回リンス、そしてテーブルスプーン２杯分のカプタン（Captan）５０−ＷＰ（Ｉ
ＣＩ）＋５００mlの無菌水に１５分浸漬。

【００５３】アグロバクテリウム（Agrobacterium）調製アグロバクテリウム（Agrobacterium）を、スペクチノマイシン１００mg/l、ストレプトマイシン１００mg/l、クロラムフェニコール２５mg/l、およびカナマ
イシン５０mg/lを含有するＬＢプレート（ＬＢ−ＳＳＣＫと呼ぶ）に画線培養す
る。接種の２日前に、白金耳１０μｌ分のアグロバクテリウム（Agrobacterium ）を、２mlのＬＢ−ＳＳＣＫを含有する試験管に入れ、ローテーターにのせて一
晩増殖させる。接種の前日に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を継代し、２mlの新鮮なＬＢ−ＳＳＣＫに２００μｌを入れ、ローテーターにもどして一
晩増殖させる。接種日に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）をＭＳ液体培地で１：１０希釈する。ＯＤ₆₀₀の読み値をとり、０．２〜０．４の範囲の読み値が許容される。

【００５４】外植片接種茎の根からの方向に注意して茎を４分の１インチの切片に切る。外植片を、１
：１０希釈のアグロバクテリウム（Agrobacterium）を有するシャーレに５分接種し、５つの茎について５mlのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を使用し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）はピペットで直接外植片の上にのせる。５分接種後、外植片からアグロバクテリウム（Agrobacterium）を吸引して除く。最適な苗条再生応答が得られるように、茎外植片を同時培養プレートの上に
基底部を下にして培養する（２mlのＴＸＤ液体培地を有する１／１０ＭＳ培地を
無菌の８．５cmのろ紙で覆う）。ＴＸＤ培地は４．３ｇのギブコ（Gibco）ＭＳ培地、２mlのガンボルグ（Gamborg）ＢＳ混合物（シグマ（Sigma））５００×溶
液、８mlのｐ−クロロフェノキシ酢酸（０．５mg/ml）、０．０１mlのキネチン（Kinetin）（０．５mg/ml）、３０ｇのショ糖を含有し、水で１リットルにする
。同時培養プレートを、裂け目をいれた透明のプラスチック袋に入れ、２５℃で
２４時間の連続的冷白色光下に置く。

【００５５】組織選択と再生２日間の同時培養期間後、茎の外植片を、３日間の遅延期間のために、５００
mg/lのチカルシリン（ticarcillin）、５０mg/lのセフォタキシム（cefotaxime ）、および１mg/lのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含有するＭＳ培地上に移
す。再度プレートを、裂け目をいれた透明のプラスチック袋に入れ、２５℃で２
４時間の連続的冷白色光下に置く。３日間の遅延期間後、茎外植片を、グリホセ
ート（glyphosate）と上記レベルのチカルシリン、セフォタキシム、およびＢＡ
Ｐを含有するＭＳ０．１mMグリホセート選択培地上に３週間移す。次に茎外植
片を同量の上記チカルシリン、セフォタキシム、およびＢＡＰそして０．５mg/l
のジベレリン（gibberellin）（ＧＡ₃）（これは苗条の伸長を促進することがわ
かっている）を含有するＭＳ０．１mMグリホセート選択培地上にさらに３週間
移す。これらのグリホセート選択培地上での６週間後、茎の受容体から緑色の正
常な成長している苗条を切り出す。苗条（プレート当たり４〜５苗条）を根付け
培地［上記レベルのチカルシリンとセフォタキシム、および２mg/lのインドール
酪酸（ＩＢＡ）を含有する、ギブコ（Gibco）ＭＳ塩、ビタミン、３％ショ糖］に入れる。苗条を根付け培地に入れてすでに１週間後には根の成長が始まる。２
週間目の時点で、大きな基部を有する苗条を、鉢土壌（メトロミックス（Metro
Mix）３５０）を有する２．５インチの鉢に移し、平かごを透明のプラスチックドームで覆い、苗条が伸長できるようにする。ストック植物の増殖のために、す
べての植物を上記と同じ条件の増殖チャンバーに入れる。３〜４日後に苗条が硬
くなったら、プラスチックドームに裂け目を入れ、数日後完全に除去する。植物
を２２℃の増殖チャンバー中で、１６時間／８時間の明／暗サイクルで光強度２
２０μEm²S^-1で増殖させ、数週間後、温室に移す。

【００５６】トランスジェニック植物の解析１８個の再生ビー・ナプス（B. napus）植物を、例１に記載の発現レベルと同
じスケールを使用して、ＧＵＳ遺伝子の胚特異的発現について調べる。トランス
遺伝子カノーラ（canola）豆果と種子を、１０、１０、１６、２１、２８、３５
dpaおよび成熟期に採取した。葉、茎、豆果、および種子試料を、上記のように β−グルクロニダーゼ活性について染色した。ＧＵＳ測定の結果を表２に示す。

【００５７】

【表２】

【００５８】表２の結果から、カッパヒドロキシラーゼプロモーターに融合した外来遺伝子
は、種子ではない組織中では有意なレベルで発現されないが、成長している種子
中では多量に発現されることは明らかである。高レベルのＧＵＳ染色が、開花後
すでに１６日で明らかであり、種子の成長の間染色は持続された。すなわちカッ
パヒドロキシラーゼプロモーターは、植物中で外来遺伝子の発現を引き起こすの
に有用なプロモーターである。このプロモーターは、目的の遺伝子が種子成長の
早期段階で高レベルで転写され、これが種子成長の間持続することが好ましい場
合に、特に有用である。このような応用には、種子脂質代謝の修飾がある。

【００５９】本明細書に記載のすべて刊行物および特許出願は、本発明が関係する分野の当
業者のレベルを示す。

【００６０】本明細書に記載のすべて刊行物および特許出願は、各刊行物および特許出願が
参照により具体的かつ個々に示されるように、参照することにより本明細書の一
部とする。

【００６１】理解を容易にするために上記発明を説明と例によりある程度詳細に説明したが
、請求の範囲の逸脱することなくこれらの変更および修飾が可能であることは当
業者に明らかであろう。

【００６２】（図面の簡単な説明）

【図１】図１は、プラスミドｐＭＯＮ２６１１２の制限地図である。

【図２】図２は、プラスミドｐＭＯＮ１７２２７の制限地図である。

【図３】図３は、エル・フェンドレリ（L. fendleri）のカッパヒドロキシラーゼ遺伝子のプロモーター領域とコード領域を含有するゲノムクローンｐＬｅｓｑｔｏｔ
の部分ヌクレオチド配列を示す。このクローン（３６７０塩基対の連続的ヌクレ
オチド配列、配列番号１）は、２２１７塩基対の５’非翻訳領域（すなわち、開
始ＡＴＧコドンの前の配列）、１１５２塩基対の読みとり枠、および３０２塩基
対の３’非翻訳領域をコードする。サブクローニングに使用されるＨｉｎｄIII とＥｃｏＲＩ部位は、２重下線で示す。カッパヒドロキシラーゼの第１の翻訳コ
ドンに対応するＡＴＧは下線で示す。

【図４】図４は、プラスミドｐＢＩ−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳの制限地図である。

【図５】図５は、プラスミドｐＭＯＮ１７２２７−ｐＬｅｓｑ−ＧＵＳの制限地図であ
る。

【００６３】

【００６４】

【配列表】

(1) 一般情報 (i) 出願人：BROUN,Pierre SOMERVILLE,Chris (ii) 発明の名称：強い早期種子特異的遺伝子制御領域 (iii)配列の数：１ (iv) 連絡宛先： (A) 受信者：PILLSBURY MADISON & SUTRO,LLP (B) 通り：1100 New York Avenue,N.W. (C) 市：ワシントン (D) 州：D.C. (E) 国：USA (F) 郵便番号：20005-3918 (v) コンピューターの読込み形式 (A) 媒体のタイプ：ディスケット (B) コンピューター：IBM PC コンパチブル (C) オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェア：MS Word (vi) 現在の出願のデータ (A) 出願番号： (B) 出願日： (C) 分類： (2) 配列番号１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：3670ヌクレオチド (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列番号１の配列

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月２８日（２０００．１２．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】強い早期種子特異的遺伝子制御領域

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【００４９】

【表１】

【００５７】

【表２】

【００６２】

【００６３】

【配列表】 (1) 一般情報 (i) 出願人：BROUN,Pierre SOMERVILLE,Chris (ii) 発明の名称：強い早期種子特異的遺伝子制御領域 (iii)配列の数：１ (iv) 連絡宛先： (A) 受信者：PILLSBURY MADISON & SUTRO,LLP (B) 通り：1100 New York Avenue,N.W. (C) 市：ワシントン (D) 州：D.C. (E) 国：USA (F) 郵便番号：20005-3918 (v) コンピューターの読込み形式 (A) 媒体のタイプ：ディスケット (B) コンピューター：IBM PC コンパチブル (C) オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェア：MS Word (vi) 現在の出願のデータ (A) 出願番号： (B) 出願日： (C) 分類： (2) 配列番号１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：3670ヌクレオチド (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列番号１の配列

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【図面の簡単な説明】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ブラウン、ピエールアメリカ合衆国カリフォルニア、バーリンゲームカプチーノ 1249 (72)発明者サマービル、クリスアメリカ合衆国カリフォルニア、ポルトラバレイ、バレイオーク５

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物カッパヒドロキシラーゼ遺伝子からの転写制御領域から
なる核酸。
【請求項２】転写制御領域は、レスケレラ・フェンドレリ（Lesquerella
fendleri）カッパヒドロキシラーゼ遺伝子からである、請求項１記載の核酸。
【請求項３】転写制御領域は、配列番号１のヌクレオチド１〜ヌクレオチ
ド２２１４からなる、請求項２記載の核酸。
【請求項４】植物カッパヒドロキシラーゼ遺伝子のコード配列からさらに
なる、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】請求項１記載の核酸と異種遺伝子とからなる組換え核酸。
【請求項６】異種遺伝子は脂質代謝の酵素である、請求項５記載の組換え
核酸。
【請求項７】異種遺伝子は植物ヒドロキシラーゼ遺伝子である、請求項５
に記載の組換え核酸。
【請求項８】請求項５記載の組換え核酸からなる宿主植物細胞。
【請求項９】植物カッパヒドロキシラーゼ遺伝子からの転写制御領域と、
転写停止領域とからなる、発現構築物。
【請求項１０】転写制御領域は、レスケレラ・フェンドレリ（Lesquerell
a fendleri）カッパヒドロキシラーゼ遺伝子からである、請求項９記載の発現構
築物。
【請求項１１】転写制御領域は、配列番号１のヌクレオチド１〜ヌクレオ
チド２２１４からなる、請求項１０記載の発現構築物。
【請求項１２】転写開始領域と翻訳停止領域とからさらになる、請求項９
記載の発現構築物。
【請求項１３】植物カッパヒドロキシラーゼ遺伝子のコード配列からさら
になる、請求項９記載の発現構築物。
【請求項１４】異種遺伝子のコード配列からさらになる、請求項９記載の
発現構築物。
【請求項１５】異種遺伝子は脂質代謝の酵素である、請求項１４記載の発
現構築物。
【請求項１６】異種遺伝子は、異種遺伝子のセンス転写体が産生されるよ
うに、転写制御領域と転写停止領域に機能的に結合している、請求項１４記載の
発現構築物。
【請求項１７】転写制御領域はプロモーターである、請求項９記載の発現
構築物。
【請求項１８】請求項９記載の発現構築物からなる宿主細胞。
【請求項１９】宿主細胞は宿主植物細胞である、請求項１８記載の宿主細
胞。
【請求項２０】請求項１４記載の発現構築物からなる宿主植物細胞。
【請求項２１】宿主植物細胞はブラシカ（Brassica）種である、請求項２
０記載の宿主植物細胞。
【請求項２２】宿主植物細胞は双子葉植物種である、請求項２０記載の宿
主植物細胞。
【請求項２３】（ａ）宿主植物細胞を請求項６記載の組換え核酸で形質転
換し、（ｂ）形質転換した宿主植物細胞のコレクションから種子を得て、そして（ｃ）脂肪酸の所望の組成について種子をスクリーニングする、ことを特徴とする、種子の脂肪酸組成の改変方法。