JP2003510088A - 合成及びキメラプロモーター、発現カセット、プラスミド、ベクター、トランスジェニック植物、及びそれらを含む種子、並びにそれらを生産する方法 - Google Patents

合成及びキメラプロモーター、発現カセット、プラスミド、ベクター、トランスジェニック植物、及びそれらを含む種子、並びにそれらを生産する方法

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JP2003510088A JP2001526975A JP2001526975A JP2003510088A JP 2003510088 A JP2003510088 A JP 2003510088A JP 2001526975 A JP2001526975 A JP 2001526975A JP 2001526975 A JP2001526975 A JP 2001526975A JP 2003510088 A JP2003510088 A JP 2003510088A
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ヴェロニーク・グルーベル
フレデリック・ノル
マンフレット・テイセン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、高分子量コムギグルテニン（ＨＭＷＧ）をコードする遺伝子のプロモーターから由来する少なくとも一つの核酸配列を含む合成的且つキメラプロモーターに関する。本発明はまた、上記プロモーターを含む発現カセット、ベクター及びトランスジェニック植物に関し、並びに上記トランスジェニック植物及び種子の生産のための方法に関する。本発明は、最も一般的に使用される現在存在するプロモーターに対して、特に宿主細胞、とりわけ植物細胞において生産されるポリペプチドをコードする遺伝子若しくは核酸配列の発現のレベルを増大することが可能であるキメラプロモーターを生産することに成功したことを報告する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に植物バイオテクノロジーの分野で使用することを企図した、発
現のキメラプロモーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、発現のプロモーターは、バイオテクノロジー及び遺伝学的操作の分
野において周知である。とりわけ植物バイオテクノロジーに関して、宿主細胞に
おいて生産されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルは、しばしば
使用されるプロモーターに依存する。一般的に使用される各種のプロモーターは
、その組織特性若しくは発現の強度のために、特異的な応用若しくは組織にしば
しば制限される。例えばｎｏｓ遺伝子から開始するプロモーターと比較して比較
的強いプロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロ
モーターが挙げられ、これら二つのプロモーターは、植物バイオテクノロジーの
分野でとりわけ使用されている。かくして、現在使用されているプロモーターの
欠点を解消することが可能な新規なプロモーターに対する必要性が存在する。
【０００３】 この必要性を満足する一つの試みが、WO 97/20056のナンバーの下で印刷され
たＰＣＴ特許出願において報告されており、それは周知のプロモーター中で、エ
ンハンサー（即ちプロモーターの活性にポジティブな効果を有する）をしようす
ることによる遺伝子発現のレベルの増大を記載する。エンハンサーのヌクレオチ
ド配列はＡ及びＴ塩基が豊富であり、これらの塩基の全体は、該エンハンサーの
ヌクレオチド配列の５０％以上を構成する。特に、この出願の出願人は、マメの
プラストシアニンプロモーターから開始するエンハンサー領域の使用を推奨する
。
【０００４】 ここでの記載及び請求の範囲において使用される用語は、以下の意味を有する
： 用語、「核酸」は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡを意味する。
【０００５】 用語、「核酸配列」は、５’から３’に向けて読み取られるヌクレオチド塩基
の一本鎖若しくは二本鎖オリゴマー若しくはポリマーを意味し、それらは自己複
製プラスミド、遺伝子、及び感染性である若しくはない、機能的な若しくは非機
能的なＤＮＡ若しくはＲＮＡであるＤＮＡ若しくはＲＮＡポリマーを含む。本出
願において使用されるヌクレオチドの表記において、特に言及されている場合を
除いて、一本鎖ヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端である。
【０００６】 フレーズ、「〜から由来する核酸配列」は、例えば一つ以上のヌクレオチドの
置換、欠失、付加、突然変異、断片化、及び／または合成によって、参考文献が
言及している配列から該配列が直接若しくは間接に由来することを意味する。
【０００７】 用語、「プロモーター」若しくはフレーズ「プロモーター核酸配列」は、翻訳
開始コドンの上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写のための他のタンパク
質の認識及び結合に関与する核酸領域を意味する。
【０００８】 「植物プロモーター」は、植物細胞中で転写を開始できるプロモーターである
。
【０００９】 「構成的プロモーター」は、宿主生物の発達を通じて上記生物の全ての組織若
しくは実質的に全ての組織において、機能的な態様で上記プロモーターと連結し
た核酸配列を発現可能なプロモーターである。
【００１０】 「特異的組織プロモーター」は、宿主生物の特定の特異的組成基において、機
能的な態様で上記プロモーターと連結した核酸配列を選択的に発現可能なプロモ
ーターである。
【００１１】 フレーズ、「機能的な態様で連結した」若しくは「機能的に連結した」は、例
えばプロモーターまたは調節若しくは機能的ボックスである核酸配列が、例えば
別の調節若しくは機能的ボックスまたは生産されるタンパク質をコードする発現
される遺伝子といった別の核酸配列に連結していることを意味し、且つ該配列が
、それらが導入されている細胞、ゲノム、ベクター若しくは発現カセット中でそ
の主要な機能を発揮すること、即ちそれらが上記環境中で機能的であることを意
味する。プロモーターの場合、プロモーターの配列はまた、転写開始部位と翻訳
開始部位の間に転写される配列を含むことが理解されるべきである。
【００１２】 用語、「発現カセット」は、上記配列と適合的である宿主細胞において、生産
されるポリペプチドをコードする配列若しくは遺伝子の発現に向けることが可能
なヌクレオチド配列を意味する。上記カセットは、少なくとも一つのプロモータ
ーと一つの転写終結シグナル、並びに任意に発現のために必要とされる若しくは
有用な他の因子を含む。
【００１３】 用語、「ベクター」は、例えばＤＮＡコート化発射体、核酸ベース輸送ビヒク
ル、及び核酸を輸送するのに適している核酸分子、並びに例えばプラスミド、コ
スミド、ファージミド等といった自律的自己複製環状ＤＮＡのような発現システ
ムを意味する。もし組換え細胞培養物若しくは微生物が、「発現ベクター」の宿
主であると記載されたならば、これは染色体外環状ＤＮＡ（例えばミトコンドリ
ア若しくはクロロプラストＤＮＡのような）及び宿主染色体内に挿入されている
ＤＮＡを含み、ベクターは宿主のゲノム内に挿入された自律的構造体として細胞
分裂の間細胞によって安定に複製されるか、宿主の核若しくは細胞質において維
持されるかのいずれかが可能である。
【００１４】 用語、「プラスミド」は、細胞中で複製可能な自律的環状ＤＮＡ分子を意味し
、「発現」プラスミドと称されるものと、「非発現」プラスミドと称されるもの
の両者を含む。もし組換え細胞培養物若しくは微生物が、「発現」プラスミドの
宿主として記載されたならば、これは染色体外環状ＤＮＡ分子と、宿主染色体内
に挿入されているＤＮＡの両者を含む。もしプラスミドが宿主細胞によって維持
されるのであれば、プラスミドは自律的構造体として細胞分裂の間細胞によって
安定に複製されるか、宿主のゲノム中に挿入されるかのいずれかである。
【００１５】 用語、「異種配列」若しくは「異種核酸配列」は、その環境に対して外来であ
るソース若しくは種から由来する配列、またはもしそれが同じ環境から由来する
のであれば、そのもともとも形態に対して修飾されている配列を意味する。核酸
配列の修飾は、例えば機能的な態様でプロモーターに連結可能な核酸断片を生産
するように、核酸を制限酵素で処理することによって生じさせることができる。
修飾はまた、サイトディレクトミュータジェネシスのような方法を介して生じさ
せることができる。
【００１６】 用語、「ボックス」は、調節機能が貢献する核酸配列を意味する。
【００１７】 用語、「様」は、この用語が結びついているボックス及び／または核酸配列が
、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％
の配列同一性、とりわけ少なくとも９０％の配列同一性で、ボックス及び／また
は周知の参考核酸配列と称される配列と特定の配列同一性若しくはコンセンサス
を含むことを意味する。配列同一性のパーセンテージは、少なくとも６のヌクレ
オチド塩基の比較の基準に基づいて計算される。比較の基準の測定は、例えば局
所的ホモロジーアリゴリズム、ホモロジー整列アリゴリズム、及び類似性検索ア
リゴリズムといった、参考配列とのホモロジーを測定するために配列背列アリゴ
リズムを使用して実施でき、これらのアリゴリズムはまた、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦ
ＩＴ及びＴＦＡＳＴＡという周知の名称の下で、コンピューター形態で存在する
。配列同一性のパーセンテージは、ボックス及び／または核酸配列と参考配列を
比較することによって得られる。
【００１８】 用語、「位置する」は、「ボックス」、制限部位、若しくは特異的な機能を有
するコドンのような、同定されたエレメントの核酸配列上の位置を意味する。数
字によって示された位置は、特に言及されている場合を除き、後ろへの読み取り
の方向、即ち５’−＞３’方向で、核酸配列中のエレメントの開始の部位を示す
。
【００１９】 用語、「Element 300」、「ＥＭ」、「胚乳モチーフ」、「Ｐ−ボックス」若
しくは「プロラミン様」ボックスは、多くの穀物の貯蔵タンパク質をコードし、
マメ胚乳の発達の間でゼイン遺伝子の統合的な発現を介在する共通の調節機構に
関与する、調節若しくは機能的モチーフ若しくはエレメントを意味する。
【００２０】 用語、「Ｇ様」ボックスはＡＣＧＴコアモチーフを意味し、その転写調節に体
シル機能的貢献はほとんどの場合に定義されていないが、それはプロモーターの
最大の発現に必要であるようである。
【００２１】 用語、「エンハンサー」ボックスは、その配向とは独立に、標的プロモーター
の上流若しくは下流で、一定の距離を有してｃｉｓに機能でき、プロモーターの
活性において誘導性、組織特異性若しくは一般的な改良を与えることが可能なｔ
ｒａｎｓ因子の組み合わせを結合する複数の短いモチーフより一般的な成ること
ができる、調節ＤＮＡ配列を意味する。
【００２２】 用語、「ＧＡＴＡ」ボックスは、多くの光調節プロモーターの活性に対して必
要とされる調節若しくは機能的モチーフ若しくはエレメントを意味する。
【００２３】 用語、「ａｓ１」若しくは「活性化配列１」ボックスは、ＣａＭＶ（カリフラ
ワーモザイクウイルス）の３５Ｓプロモーターから好ましくは由来する調節若し
くは機能的モチーフ若しくはエレメントを意味し、それは根での発現を与えるこ
とができ、他のｃｉｓ活性化エレメントとの協力的な相互作用を通じてプロモー
ター調節においてより複雑な役割を果たすことができ、任意にサリチル酸で誘導
可能であることができる。
【００２４】 用語、「ａｓ２」若しくは「活性化配列２」ボックスは、ＣａＭＶ（カリフラ
ワーモザイクウイルス）の３５Ｓプロモーターから好ましくは由来する調節若し
くは機能的モチーフ若しくはエレメントを意味し、それは光合成組織での発現を
与えることができ、転写アクチベーター活性を有することができる。
【００２５】 用語、「シリアル」ボックスは、コムギ種子における特異的な発現に関与でき
る調節若しくは機能的モチーフ若しくはエレメントを意味する。
【００２６】 用語、「ＧＣリッチ」ボックスは、例えばジェミニウイルスから由来する、Ｇ
若しくはＣヌクレオチドが豊富な調節若しくは機能的モチーフ若しくはエレメン
トを意味する。
【００２７】 用語、「トランスジェニック植物」は、遺伝学的な操作方法によって得られ流
植物を意味し、上記操作によって得られる植物、そのゲノム内に挿入されている
再生植物、または上記操作で、これらの方法によって得られる根、茎、及び葉と
いった植物器官を発現する植物等の植物全体をカバーする。本発明に従ったトラ
ンスジェニック植物は、各種のレベルの倍数性を有することができ、特に多倍数
体、二倍体若しくは一倍体であることができる。
【００２８】 用語、「繁殖体」は、構造的な若しくは非構造的な、例えば移植片、カルス、
茎、葉、根、切片若しくは種子といった植物全体の再生が可能な植物細胞の塊若
しくは群を意味する。
【００２９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の出願人は、以前に議論されたＰＣＴ出願の出願人のアプローチとは異
なるアプローチを採った。特に本発明の出願人は、驚くべきことに、上述の必要
性を満足することが可能であり、最も一般的に使用される現在存在するプロモー
ターに対して、特に宿主細胞、とりわけ植物細胞において生産されるポリペプチ
ドをコードする遺伝子若しくは核酸配列の発現のレベルを増大することが可能で
あるキメラプロモーターを生産することに成功した。さらに出願人は同時に、考
慮される使用及びその実施の環境に従って使用のために適したものを選択するこ
とができ、かくして生産されるポリペプチドをコードする発現される遺伝子の発
現のレベルのいくつかの方法で制御できる、完全な範囲のプロモーターを生産す
ることに成功した。この原理の使用の一つの例は、例えば抗生物質若しくは除草
剤に対する耐性といった植物における選択のための薬剤、若しくはより重要なタ
ンパク質をアセンブリーするために必要とされる補酵素若しくは補因子といった
、タンパク質若しくは酵素の発現に向けた及び／またはそれを制御する本発明の
比較的弱いプロモーターの一つを使用すること、並びに例えば治療上の効果を有
するポリペプチドの発現を制御する本発明に従った比較的強いプロモーターを使
用することであろう。
【００３０】 本発明のまた別の利点は、本発明に従って調製されたプロモーターが、種子に
おける特異的な発現だけでなく、例えば葉、茎及び植物維管束系といった他の器
官における発現を助長するために脱調節も可能である点である。
【００３１】
【課題を解決するための手段】
従って本発明の主な主題は、好ましくは高分子量コムギグルテニンをコードす
るコムギＤｘ５若しくはＢｘ７遺伝子から由来する核酸配列である、高分子量コ
ムギグルテニンをコードする遺伝子から由来する少なくとも一つの核酸配列を含
むキメラプロモーターである。
【００３２】 好ましくは該キメラプロモーターは、高分子量コムギグルテニンをコードする
遺伝子から由来する少なくとも一つの核酸配列を含み、その配列は配列番号０１
のナンバーの下で同定される。
【００３３】 とりわけ高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来する核酸配列
は、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６
、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配
列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２のナンバーの下で同
定される配列よりなる群から選択される配列に相当する。
【００３４】 さらに本出願人は、上述の高分子量コムギグルテニンをコードシリ遺伝子から
由来する核酸配列を使用して、特定数の調節若しくは機能的ボックスを組み合わ
せることによって、双子葉植物及び単子葉植物の両者で有利なプロモーター活性
を有する、特に植物プロモーターであるプロモーターを構築することが可能であ
ることに気付いた。
【００３５】 かくして本発明の別の主題は、高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子
から由来する核酸配列を含み、３’位置で「ＴＡＴＡ」ボックスと転写開始部位
（＋１）を含む、発現のキメラプロモーターである。
【００３６】 好ましくは該プロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスと転写開始部位（＋１）
の上流の５’位置で機能的に連結した少なくとも一つの「エンハンサー」ボック
スを含む。
【００３７】 より好ましくは該プロモーターは、「エンハンサー」ボックスの上流の５’位
置で機能的に連結した少なくとも一つの「Ｇ様」ボックスを含む。
【００３８】 さらにより好ましくは該プロモーターは、「エンハンサー」ボックスの上流の
５’位置で機能的に連結した少なくとも一つの「Ｐ様」ボックスを含む。
【００３９】 有利には該プロモーターは、少なくとも「エンハンサー」ボックスの上流の５
’位置で機能的に連結した少なくとも一つの「ＧＡＴＡ」ボックスを含む。
【００４０】 好ましくは該プロモーターは、「エンハンサー」ボックスの上流の５’位置で
機能的に連結した少なくとも一つのシリアルボックスを含む。
【００４１】 さらにより好ましくは該プロモーターは、「エンハンサー」ボックスの上流の
５’位置で機能的に連結した二つの連続的な「シリアル」ボックスを含む。
【００４２】
【発明の実施の形態】
本発明に従ったプロモーターの一つの好ましい実施態様に従って、それらは転
写開始部位の上流の５’位置に機能的に連結した、少なくとも一つの「ａｓ１」
ボックス若しくは少なくとも一つの「ａｓ２」ボックス、またはこれらの繰り返
し順列を含む。
【００４３】 本発明の別の好ましい実施態様に従って、「ａｓ１」、「ａｓ２」、「ａｓ１
／ａｓ２」若しくは「ａｓ２／ａｓ１」ボックス、またはその繰り返し順列は、
エンハンサーボックスの３’位置で下流で機能的に連結している。
【００４４】 本発明のさらに別の好ましい実施態様に従って、該プロモーターは、「エンハ
ンサー」ボックスの上流で機能的に連結した「ＧＣ」ボックスを含む。
【００４５】 特に好ましくは該プロモーターは、「エンハンサー」ボックスの上流の５’位
置で機能的に連結した二つの「シリアル」ボックスを含み、エンハンサーボック
ス自体は、「ａｓ２／ａｓ１」ボックスの上流の５’位置で機能的に連結する。
【００４６】 本発明のプロモーターのさらに別の好ましい実施態様に従って、それらは、逆
の配向及び／または転写開始部位の３’位置での下流で機能的に連結した、「エ
ンハンサー」ボックス、「Ｇ様」ボックス、「Ｐ様」ボックス、「ＧＡＴＡ」ボ
ックス、「シリアル」ボックス、「ａｓ１」ボックス、「ａｓ２」ボックス、及
び／または「ａｓ１／ａｓ２」ボックス若しくは「ａｓ２／ａｓ１」ボックスと
いった任意に繰り返されるボックスの組み合わせ、並びに「ＧＣリッチ」ボック
スより成る群から選択される少なくとも一つのエレメントを含む。
【００４７】 最後に本発明に従ったキメラプロモーターは有利には、配列番号０２、配列番
号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号
０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１
３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０
、配列番号２１及び配列番号２２より成る群から選択される少なくとも一つの核
酸配列を含む。
【００４８】 本発明のまた別の主題は、高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から
由来し、それ自体転写終結核酸配列に連結した生産されるポリペプチドをコード
する発現される核酸配列に機能的な態様で連結している、少なくとも一つのプロ
モーター核酸配列を含む発現カセットである。
【００４９】 好ましくはこの発現カセットは、高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝
子から由来する少なくとも一つのプロモーター核酸配列を含む、その配列は配列
番号０１のナンバーの下で同定される。
【００５０】 さらにより好ましくは該発現カセットは、高分子量コムギグルテニンをコード
する遺伝子から由来し、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号
０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１
０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７
、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２
のナンバーの下で同定される配列よりなる群から選択される、少なくとも一つの
プロモーター核酸配列を含む。
【００５１】 本発明の別の主題は、配列番号０１のナンバーの下で同定される配列から由来
する配列に相当することを特徴とする、単離されたプロモーター核酸配列である
。
【００５２】 好ましくは単離されたプロモーター核酸配列は、配列番号０２、配列番号０３
、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、
配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配
列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列
番号２１及び配列番号２２のナンバーの下で同定される配列よりなる群から選択
される配列に相当する。
【００５３】 本発明の別の主題は、プロモーター若しくはプロモーター核酸配列が、上述の
キメラプロモーター若しくはプロモーター核酸配列に相当することを特徴とする
、生産されるポリペプチドをコードする核酸配列の転写を開始可能な、プロモー
ター若しくはプロモーター核酸配列を含むベクターである。
【００５４】 好ましくは該ベクターは、ｐＭＲＴ１２０７，ｐＭＲＴ１１７７，ｐＭＲＴ１
１７８，ｐＭＲＴ１１７９，ｐＭＲＴ１１８０及びｐＭＲＴ１１８１のナンバー
の下で同定されるバイナリーベクターよりなる群から選択される。本発明にまた
別の主題は、上述の少なくとも一つのプロモーター若しくは少なくとも一つのプ
ロモーター核酸配列をそのゲノム内に安定に挿入されているトランスジェニック
植物である。
【００５５】 好ましくは該トランスジェニック植物は、ジャガイモ、タバコ、綿花、レタス
、トマト、メロン、キュウリ、マメ、アブラナ、ビートの食用根、若しくはヒマ
ワリのような双子葉植物種、またはコムギ、オオムギ、オートムギ、コメ、若し
くはトウモロコシのような単子葉植物種から選択される。
【００５６】 本発明の別の主題は、上述のトランスジェニック植物の繁殖体であり、好まし
くはこの繁殖体は種子である。
【００５７】 本発明のさらに別の主題は、上述のプロモーター若しくはプロモーター核酸配
列を含む細胞であり、好ましくはこの細胞は植物細胞である。
【００５８】 本発明の好ましい主題の中で、以下の工程： − 上述の少なくとも一つのプロモーター若しくは少なくとも一つのプロモータ
ー核酸配列を含むベクターで細胞をトランスフォームする工程； − ポリペプチドをコードする核酸配列若しくは遺伝子の発現を許容する条件下
で細胞の培養物を調製する工程； を含むことを特徴とする、細胞中で生産されるポリペプチドをコードする核酸配
列若しくは遺伝子を発現するための方法もまた存在する。
【００５９】 好ましくは生産されるポリペプチドは、酵素若しくはタンパク質、若しくはタ
ンパク質の誘導体であり、それはin vitroで及び／またはヒト及び／または動物
中で活性を有し、上記活性は、胃腸、膵臓、胆汁、抗ウイルス、抗炎症、肺、抗
微生物、栄養、化粧、及び構造的な活性、血液中での活性、心臓血管、眼、抗原
、及び免疫刺激的な活性、並びに脳内での活性を含む。上記タンパク質の例は、
例えばインスリン、インターフェロン、胃腸、膵臓若しくは胆汁リパーゼ、エラ
スターゼ、アルファ−１アンチトリプシンのようなアンチプロテアーゼ、コラー
ゲンのような構造形成タンパク質、ラクトフェリンのようなトランスフェリン、
ヒトヘモグロビン若しくはアルブミンのような血液由来タンパク質、血液補因子
、並びにスーパーオキシドジスムターゼのような抗酸化剤である。
【００６０】 好ましくはこの方法で使用される細胞は、原核生物若しくは真核生物細胞であ
る。
【００６１】 さらにより好ましくは該細胞は、微生物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞
、及び植物細胞よりなる群から選択される細胞であり、さらにより好ましくはそ
れは植物細胞である。
【００６２】 最後に、本発明の別の主題は、以下の工程： − 上述の少なくとも一つのプロモーター若しくは少なくとも一つのプロモータ
ー核酸配列を含むベクターで植物細胞をトランスフォームする工程； − 該プロモーター若しくはプロモーター核酸配列を挿入した植物細胞を選択す
る工程； − 培養物中で、またはキメラ若しくはトランスジェニック植物全体を再生する
ことによってのいずれかで、トランスフォームされ選択された植物細胞を増殖す
る工程； を含むことを特徴とする、上述のトランスジェニック植物若しくは繁殖体を得る
ための方法である。 本発明は、添付された図面を参考にして、以下の非制限的な実施例によって示
された各種の実施態様の詳細な説明を通じて、より明確に理解されるであろう。
【００６３】 以下の詳細な説明において、制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素を使用して実施され
る酵素処理は、供給者New England Biolabsの推奨に従って実施された。各酵素
処理に引き続いて、ＤＮＡは"QIAquick PCR Purification" (QIAGEN)若しくは"C
oncert Rapid PCR Purification System" (GIBCO BRL Life Technology)の補助
の下で、または特別な場合には"QIAquick Gel Extraction" (QIAGEN)もしくは"C
oncert Rapid Gel Extraction System" (GIBCO BRL Life Technology)キットの
補助の下で、製造者の説明書に従って系統的に精製された。使用された"GeneAmp
PCR System 9700"サーモサイクラーは、Perkin Elmer Applied Biosystemsによ
って販売される。
【００６４】
【実施例】
実施例１ 比較目的物（コントロール）の構築 本特許において記載されるキメラプロモーターの比較を可能にするために、ジ
ャガイモパタチン遺伝子ＳＴ−ＬＳ１のイントロンＩＶ２の配列(Vancenneyt等,
1990)を含む、β−グルクロニダーゼをコードするｕｉｄＡ遺伝子(Jefferson等
, 1986)を、参考プロモーターの一つ、及びAgrobacterium tumefaciensのノパリ
ンシンターゼ遺伝子ターミネーター(term-nos)の制御の下で、Promega Corp. (M
adison, USA)によって販売されるプラスミドｐＧＥＭ３Ｚ中に配置した。
【００６５】 １．１．ネガティブコントロールｐＭＲＴ１１４４の構築 何れのプロモーター配列をも欠いているプラスミドｐＭＲＴ１１４４を、ネガ
ティブコントロールとして使用する。それは、配列"uidA-IV2/term-nos"が導入
されているプラスミドｐＧＥＭ３Ｚから由来する。
【００６６】 初めに、プラスミドｐＢＩ２２１(Clontech, CA, USA)の５μｇを、制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで３７℃で１時間切断した。次いでノパリンシンター
ゼターミネーターの制御の下にあるｕｉｄＡ配列を、"QIAquick Gel Extraction
"キットの補助の下で０．８％アガロースゲル上で単離した。
【００６７】 平行して、プラスミドｐＧＥＭ３Ｚの５μｇを、制限酵素ペアＥｃｏＲＩ及び
ＢａｍＨＩで３７℃で１時間切断した。次いでベクター断片を、"QIAquick Gel
Extraction"キットの補助の下で０．８％アガロースゲル上で単離し、４０Ｕの
ウシ腸アルカリホスファターゼ(New England Biolabs)を使用して３７℃で１時
間緩衝液３（１Ｘ）の存在下で脱リン酸化した。
【００６８】 ライゲーション反応を、５０ｎｇの"uidA-IV2/term-nos"断片と１００ｎｇの
プラスミドｐＧｅｍ３Ｚで実施し、"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラ
ーでＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
(New England Biolabs)の存在下で１０μｌの反応混合物で処理した。それは１
０℃で３０秒の１サイクルと、３０℃で３０秒、１０℃で３０秒及び３０℃で３
０秒よりなる各２００の同一のサイクルよりなる。事前にコンピーテントにされ
た大腸菌ＤＨ５ａ細菌を、全てのライゲーション反応混合物でトランスフォーム
した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補ったLuria-Bertani培地（ＬＢ、１０
ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．
２及び１５ｇ／ｌAgar-Agar）で選択された、得られたクローンのプラスミドＤ
ＮＡを、アルカリ溶解法(BirnboimとDoly, 1983)に従って抽出し、酵素切断で分
析した。生じたプラスミドを、pGEM3Z/uidA/term-nosと名付けた。
【００６９】 第二に、pGEM3Z/uidA/term-nosのｕｉｄＡコード配列中にジャガイモパタチン
遺伝子の１９２ｂｐイントロンＩＶ２を挿入するために、この遺伝子の内部部分
（７１０ｂｐＳｎａＩ／ＢｓｔＩ断片）を摘出し、次いでイントロンＩＶ２を含
む同等な配列（９０２ｂｐＳｎａＩ／ＢｓｔＩ断片）で置換した。
【００７０】 これを実施するために、１０μｇのプラスミドpGEM3Z/uidA/term-nosを、Ｓｎ
ａＩで３７℃で１時間切断し（制限部位はｕｉｄＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの
＋３８３ｂｐ上流の位置に位置した）、次いでＢｓｔＩで６５℃で１時間切断し
た（制限部位は＋１０９３ｂｐで位置した）。かくして７１０ｂｐ断片を欠くプ
ラスミドを、"QIAquick Gel Extraction"キットの補助の下で０．８％アガロー
スゲル上で単離し、４０Ｕのウシ腸アルカリホスファターゼ(New England Biola
bs)で３７℃で１時間緩衝液３（１Ｘ）の存在下で脱リン酸化した。
【００７１】 ｕｉｄＡ配列が引き続くイントロンＩＶ２の配列に対応する９０２ｂｐＢｓｔ
Ｉ／ＳｎａＩ断片を、制限酵素ＳｎａＢＩ（制限部位はｕｉｄＡ遺伝子のＡＴＧ
開始コドンの＋３８３ｂｐ上流の位置に位置する）で３７℃で１時間、並びに制
限酵素ＢｓｔＢＩ（部位は＋１２８５ｂｐの位置に位置する）で３７℃で１時間
を使用して、プラスミドｐ３５Ｓ ＧＵＳ ＩＮＴ(Vancanneyt等, 1990)の１０μ
ｇを切断することによって得た。次いで９０２ｂｐ断片を、"Concert Rapid Gel
Extraction System"キットの補助の下で１％アガロースゲル上で単離した。
【００７２】 ライゲーション反応を、かくして処理された１００ｎｇのベクターpGEM3Z/uid
A/term-nosと５０ｎｇの９０２ｂｐＢＳＴＢＩ／ＳｎａＢＩ断片を使用して、上
述のように"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラーでＴ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)
の存在下で実施した。事前にコンピーテントにされた大腸菌ＤＨ５ａ細菌を、全
てのライゲーション反応混合物でトランスフォームした。アンピシリン（５０ｍ
ｇ／ｌ）を補ったＬＢ培地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡ
を、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素切断で分析した。生じたプラスミドを
、ｐＭＲＴ１１４４と名付けた。
【００７３】 １．２．ポジティブコントロールｐＭＲＴ１２１８の構築 トウモロコシ胚乳ＳＮ ８７ １６５（Ｌ２）中でのプロモーターである参考配
列を有するために、Reina等(1990)によって記載されたプラスミドｐ６３中に含
まれるｇ−ゼインプロモーター（Ｐｒｇ−ゼイン）の全１．７ｋｂを、配列uidA
-IV2/term-nosの上流に配置した。
【００７４】 １．７ｋｂｇ−ゼインプロモーターを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ
で３７℃で１時間１５μｇのプラスミドｐ６３を切断することによって得た。か
くして放出された１．７ｋｂＰｒｇ−ゼイン断片を、"Concert Rapid Gel Extra
ction System"キットの補助の下で０．８％アガロースゲル上で単離した。
【００７５】 平行して１０μgのプラスミドｐＭＲＴ１１２６（実施例３のセクション３．
４に記載される）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで３７℃で１時間切
断した。次いでベクター断片を、"Concert Rapid Gel Extraction System"キッ
トの補助の下で０．８％アガロースゲル上で単離し、 緩衝液３（１Ｘ）の存在下で４０ウシ腸アルカリホスファターゼ(New England B
iolabs)で３７℃で１時間脱リン酸化した。
【００７６】 ライゲーション反応を、かくして処理された５０ｎｇのｇ−ゼインプロモータ
ー断片と１００ｎｇのプラスミドｐＭＲＴ１１２６を使用して、上述のように"G
eneAmp PCR System 9700"サーモサイクラーでＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１Ｘ
）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)の存在下で１
０μｌの反応混合物で実施した。事前にコンピーテントにされた大腸菌ＤＨ５ａ
細菌を、全てのライゲーション反応混合物でトランスフォームした。アンピシリ
ン（５０ｍｇ／ｌ）を補ったＬＢ培地で選択された、得られたクローンのプラス
ミドＤＮＡを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素切断で分析した。生じたプ
ラスミドを、ｐＭＲＴ１２１８と名付けた。
【００７７】 １．３．ポジティブコントロールｐＭＲＴ１０９２の構築 タバコ(Nicotiana Tabacum L., cultivar PBD6)の光合成組織中のプロモータ
ーである参考配列を有するために、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ
ＰｒＤ３５Ｓ）の二重３５Ｓプロモーターを、配列uidA-IV2/term-nosの上流に
配置した。
【００７８】 初めに、ジャガイモパタチン遺伝子の１９２ｂｐイントロンＩＶ２を、セクシ
ョン１．１に記載された＋３８３ｂｐ位置でｕｉｄＡコード配列内に挿入した。
これを実施するために、１μｇのプラスミドｐＢＩ２２１(Clontech, CA, USA)
を、ＳｎａＢＩで３７℃で１時間３０分、ＢｓｔＢＩで６５℃で１時間３０分切
断した。７１０ｂｐ断片を欠いたプラスミドを、０．８％アガロースゲル上で単
離し、次いでQiaquickアフィニティーカラムで精製した。２０ｎｇの量のＢｓｔ
ＢＩ／ＳｎａＢＩベクターと、８０ｎｇの上述のｐ３５Ｓ ＧＵＳ ＩＮＴから由
来する９０２ｂｐＢｓｔＢＩ／ＳｎａＢＩ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（
１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素(New England Biolabs)の存
在下で、１０μｌの反応混合物で１８℃で一晩ライゲートした。事前にコンピー
テントにされた大腸菌ＤＨ５ａ細菌を、ライゲーション反応混合物の半分でトラ
ンスフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補ったＬＢ培地で選択され
た、得られたクローンのＤＮＡを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素切断で
分析した。生じたプラスミドを、pBI221/uidA-IV2と名付けた。
【００７９】 第二に、プラスミドpBI221/uidA-IV2中に存在するＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ
ーの配列を、"CaMV PrD35S"の配列で置換した。プラスミドpBI221/uidA-IV2を、
ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃で１０時間３０分間切断し、次いで粘着末端をKlenow断
片(New England Biolabs)で３７℃で３０分使用して平滑末端にした。この本能
の生産物を、次いでＢａｍＨＩで３７℃で一晩切断した。８２８ｂｐＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター断片の欠失したベクターに対応するプラスミドＤＮＡ断片を
、０．８％アガロースゲル上で単離し、次いでQiaquickアフィニティーカラムで
精製した。
【００８０】 平行して、ＣａＭＶ Ｄ３５Ｓプロモーターを、プラスミドｐＪＩＴ１６３Ｄ
から得た。このプラスミドは、それ自体プラスミドｐＪＩＴ１６０(Guerineauと
Mullineaux, 1993)から由来する、プラスミドｐＪＩＴ１６３から由来する。プ
ラスミドｐＪＩＴ１６３は、ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩ部位の間
であＴＧコドンを有する。このＡＴＧコドンを欠失し、プラスミドｐＪＩＴ１６
３Ｄを得るために、ｐＪＩＴ１６３プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌ
Ｉで切断し、０．８％アガロースゲル上で精製し、電気溶出し、１／１０容量の
３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８と２．５容量の完全エタノールの存在下−８０
℃で３０分で沈殿させ、１２，０００ｇで３０分遠心分離し、７０％エタノール
で洗浄し、乾燥し、Klenow断片(New England Biolabs)の作用に３７℃３０分か
け、１容量のフェノール、次いで１容量のフェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール（２５／２４／１ｖ／ｖ／ｖ）、最後に１容量のクロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２４／１ｖ／ｖ）での抽出によって脱タンパク質化し、次
いで１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８と２．５容量の完全エタノ
ールの存在下で−８０℃で３０分沈降し、次いで１２，０００ｇで３０分遠心分
離し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、最後にＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（
１Ｘ）と２．５ユニットのＴ４リガーゼ(Amersham)の存在下で１４℃で１６時間
ライゲートした。事前にコンピーテントにされた大腸菌ＤＨ５ａ細菌をトランス
フォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補ったＬＢ培地で選択された、
得られたクローンのＤＮＡを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素切断で分析
した。次に、１０μｇのプラスミドｐＪＩＴ１６３Ｄを、ＫｐｎＩで３７℃で１
０時間３０分切断し（プロモーターの５’に位置する部位）、次いで粘着末端を
６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用して３７℃
で３０分平滑末端にした。この反応の生産物を、次いでＢａｍＨＩで３７℃で一
晩切断した。ＣａＭＶ Ｄ３５Ｓプロモーターに対応する、生成した７６１ｂｐ
のＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル上で単離し、次いでQiaquickアフィニティ
ーカラム上で精製した。１０ｎｇのプラスミドベクターと１００ｎｇの７６１ｂ
ｐ断片を使用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)の存在下で１８℃で一晩で、１０μｌの
反応混合物においてライゲーションを実施した。事前にコンピーテントにされた
大腸菌ＤＨ５ａ細菌を、ライゲーション反応混合物の半分でトランスフォームし
た。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補ったＬＢ培地で選択された、得られたク
ローンのＤＮＡを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素切断で分析した。生じ
たプラスミドを、ｐＭＲＴ１０９２と名付けた。
【００８１】 １．３．参考プラスミドｐＣａＭＶ３５Ｓｌｉｃの説明 一過的発現における内部参考として使用されるプラスミドは、ｐＣａＭＶ３５
Ｓｌｉｃ(Torrent等,1997)であり、それはＣａＭＶ ３５ＳプロモーターとＲＮ
Ａターミネーターの制御の下で、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター遺伝子の
発現のためのカセットを含む。
【００８２】 実施例２ 高分子量コムギグルテニン遺伝子の全プロモーター配列と、欠失又は複製され
たプロモーター配列を含むプラスミドの構築 制御配列が異なっている可能性がある、位置−３７８ｂｐから位置＋３９ｂｐ
までの範囲の４１７ｂｐの配列（登録番号No.X12928）に相当する六倍体のコム
ギTriticum aestivum L. cv Cheyenne （Andersonら、1989）のGluD1-1bとも呼
ばれる、Dxサブユニットをコードする高分子量グルテニン遺伝子の全プロモータ
ー（PrHMWG-DX5(配列番号０１)）を同定し、転写開始点＋１に対して５’側から
３’側で示した（図１）： −プロラミン”様”ボックス、位置−３５７から位置−３５０ｂｐまで伸びて
いる、 −２つのGATAボックス、位置−３０９から位置−３０６ｂｐまで、及び位置−
２９２から位置−２８９ｂｐまで伸びている、 −プロラミン”様”ボックス、位置−２５２から位置−２４６ｂｐまで伸びて
いる、 −８−ｂｐ”G”様ボックス、位置−２１８から位置−２１１ｂｐまで伸びて
いる、 −３８−ｂｐ活性エレメント、位置−１８６から位置−１４９ｂｐまで伸びて
おり、cis-活性モチーフのモザイクからなる： ・プロラミンボックス、位置−１８２から位置−１７６ｂｐまで伸びている、 ・不完全な対称の配列、位置−１７８から位置−１６１ｂｐまで伸びている、 ・位置−１７６と−１６３ｂｐの間の５ヌクレオチドGCTCCの直接反復、 ・”E”ボックス、位置−１７２から位置−１６７ｂｐまで伸びている、 ・位置−１６９と−１５８ｂｐの間の５ヌクレオチドTTGCTの直接反復、 −”TATA”ボックス、位置−３０から−２４ｂｐまでにコンセンサス TATAAA
Aを有する −＋１転写開始点（位置１） −位置＋１から位置＋３９ｂｐまでの範囲の非翻訳５’領域。
【００８３】 上記の種々の推定cis-活性エレメントの効果を調べるために、HMWG-Dx5プロモ
ーター（配列番号１）の詳しい機能分析を行なった。uidA-IV2レポーター遺伝子
を、全HMWG-Dx5 プロモーター（配列番号０１）の制御下、及び５’領域の増加
された欠失、内部の欠失、又は内部の部分の複製のいずれかを有する合成HMWG-D
x5 プロモーター（配列番号０１）制御下に配置した。
【００８４】 ２．１ プラスミドpMRT1125の構築 プラスミドpMRT1125は、uidA-IV2レポーター遺伝子の上流の高分子量グルテニ
ン遺伝子の全プロモーター（PrHMWG-DX5(配列番号０１)、図１）のクローニング
の結果得られたものであり、この特許に記載されているすべての合成HMWG-Dx5（
配列番号０１）プロモーターの対照構築物を構成している。
【００８５】 Andersonら（１９８９）により記載されたHMWG-Dx5 プロモーター（配列番号
０１）は、通常のクローニング技術に従って、pUC19プラスミド（Stratagene）
に導入された発現カセット”PrHMWG-DX5(配列番号０１)／uidA／term-nos”から
得られた。得られたプラスミド（pPUC19-HMWG）１０μｇをEcoRIで３７℃１時間
加水分解し、２０Uのクレノーフラグメント（New England Biolabs）を、dNTPs
を各６０nmol、１２μｌの５００ｍM トリス-HCl、pH7.5/５００ｍM MgCl2バ
ッファー、６μｌの１M ジチオスレイトール（DTT）の存在下で、３７℃３０分
間作用させた。DNAをついでBamHIで３７℃１時間消化し、こうして切り離された
HMWG-Dx5プロモーター断片（配列番号０１）を、”QIAquick Gel Extraction”
キットを用いて、１．５％アガロースゲル上で単離した。
【００８６】 平行して、ベクター断片をプラスミドpMRT1097（非公開仏国特許出願FR990363
5）から調製した。プラスミドpMRT1097２０μｇをSphIで３７℃１時間消化し、
こうして直鎖化されたベクターpMRT1097の粘着末端を、６UのT4 DNAポリメラー
ゼ酵素（New England Biolabs）を用いて３７℃３０分間で平滑末端にした。こ
の反応の産物をついで加水分解し、ベクター断片を”QIAquick Gel Extraction
”キットを用いて、０．８％アガロースゲル上で単離し、４０Uの子ウシ腸アル
カリホスファターゼ（New England Biolabs）で、バッファー３（１×）存在下
で、３７℃１時間で脱リン酸化した。得られたクローニングベクターをpGEM3Z-1
とした。
【００８７】 こうして処理された１００ngのHMWG-Dx5プロモーター断片（配列番号１）と５
０ngのプラスミドpGem3Z-1について、一晩１６℃で、１０μｌの反応混合液中、
T4 DNAリガーゼバッファー（１×）と４００単位のT4 DNAリガーゼ（New Englan
d Biolabs）の存在下で、ライゲーションを行なった。前もってコンピテントに
したEscherichia coli DH5a細菌を、すべてのライゲーション反応混合物で形質
転換した。アンピシリン（５０ｍｇ/ｌ）が添加されたLB培地上で選択された、
得られたクローンのプラスミドDNAは、アルカリ溶解法で抽出し、酵素消化で分
析した。
【００８８】 得られたプラスミドをpMRT1125とし、HMWG-Dx5プロモーター（配列番号０１）
（図１に図示されている）を配列決定により確認した。
【００８９】 ２．２． MPr1128プロモーターの構築 MPR1128プロモーター（配列番号０４）は、２つのプロラミン”様”ボックス
と２つのGATAボックスを含む配列である、ヌクレオチド−２３８の上流に位置す
る配列の欠失による、PrHMWG-DX5(配列番号０１)の誘導体である。プロモーター
断片をPCRで、５ngのpMRT1125マトリックスDNA（実施例２のセクション２．１に
記載されている）から、２つのオリゴデオキシヌクレオチド： EcoRI制限部位を含む、5'ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG3'、及び BamHI制限部位を含む、5'TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3' 各１００pmolを用い、50nmolの各dNTPs、Vent DNAポリメラーゼバッファー（１
×）、２UのVent DNAポリメラーゼ（New England Biolab）の存在下で、増幅し
た。ＰＣＲ増幅反応は、"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラーで行なっ
た。９４℃、５分間の変性の後、ＤＮＡは、９４℃、１分間の変性工程、５０℃
、１分間のハイブリダイゼーション、及び７２℃、１分３０秒間の伸長からなる
サイクルを、３０回を行なった。最終サイクルでは、伸長を７２℃、５分間延長
した。
【００９０】 増幅から得られたDNA断片を、”QIAquick Gel Extraction”キットを用いて、
１．５％アガロースゲル上で単離し、EcoRIで３７℃、１時間加水分解し、２０U
のクレノーフラグメント（New England Biolabs）を、dNTPsを各６０nmol、１２
μｌの５００ｍM トリス-HCl、pH7.5/５００ｍM MgCl2バッファー、６μｌの
１M DTTの存在下で、３７℃、３０分間作用させた。DNAをついでBamHIで３７℃
１時間消化した。
【００９１】 こうして処理された１００ngのMPR1128プロモーター断片（配列番号４）と５
０ngのプラスミドpGEM3Z-1（実施例２のセクション２．１に記載されている）に
ついて、一晩１６℃で、１０μｌの反応混合液中、T4 DNAリガーゼバッファー（
１×）と４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で、ラ
イゲーションを行なった。前もってコンピテントにしたEscherichia coli DH5a
細菌を、すべてのライゲーション反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５
０ｍｇ/ｌ）が添加されたLB培地上で選択された、得られたクローンのプラスミ
ドDNAは、アルカリ溶解法で抽出し、酵素消化で分析した。
【００９２】 得られたプラスミドをpMRT1128とし、図１に図示されているMPR1128プロモー
ター配列（配列番号０４）を配列決定により確認した。
【００９３】 ２．３． MPr1127プロモーター（配列番号０３）の構築 MPr1127プロモーター（配列番号０３）は、２つのプロラミン”様”ボックス
、２つのGATAボックス、及び”G”ボックスを含む配列である、ヌクレオチド−
２０５の上流に位置する配列の欠失による、HMWG-DX5プロモーター(配列番号０
１)の誘導体である。プロモーター断片を、２つのオリゴデオキシヌクレオチド
： EcoRI制限部位を含む、5'ATCGGGATTTCGCAGACTGTCCAAAAATC3'及び BamHI制限部位を含む、5'TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3' を用いた以外は、MPR1128プロモーター（配列番号０４）（実施例２のセクショ
ン２．２に記載されている）と同様に、ＰＣＲにより増幅し、処理した。
【００９４】 得られたプラスミドをpMRT1127とし、図１に図示されているMPr1127プロモー
ター配列（配列番号０３）を配列決定により確認した。
【００９５】 ２．４． MPr1126プロモーター（配列番号０２）の構築 MPr1126プロモーター（配列番号０２）は、２つのプロラミン”様”ボックス
、２つのGATAボックス、”G”ボックス、及び活性エレメントを含む配列である
、ヌクレオチド−１４２の上流に位置する配列の欠失による、HMWG-DX5プロモー
ター(配列番号０１)の誘導体である。プロモーター断片を、２つのオリゴデオキ
シヌクレオチド： EcoRI制限部位を含む、5'ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC3'、及び BamHI制限部位を含む、5'TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3' を用いた以外は、MPR1128プロモーター（配列番号０４）（実施例２のセクショ
ン２．２に記載されている）と同様に、ＰＣＲにより増幅し、処理した。 得られたプラスミドをpMRT1126とし、図１に図示されているMPr1126プロモー
ター配列（配列番号０２）を配列決定により確認した。
【００９６】 ２．５． MPr1183中間プロモーターの構築 MPr1183プロモーターは、MPR1128プロモーター（配列番号０４）（実施例２の
セクション２．２に記載されている）の上流のXbaI制限部位の挿入により得られ
る。プロモーター断片をPCRにより、５ngのpMRT1128マトリックスDNAから、２つ
のオリゴデオキシヌクレオチド： EcoRIとXbaI制限部位を含む、5'ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAg3'、及び
BamHI制限部位を含む、5'TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3' 各１００pmolを用い、50nmolの各dNTPs、Vent DNAポリメラーゼバッファー（１
×）、２UのVent DNAポリメラーゼ（New England Biolab）の存在下で、増幅し
た。ＰＣＲ増幅反応は、"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラーで行なっ
た。９４℃、５分間の変性の後、ＤＮＡについて、９４℃、１分間の変性工程、
５０℃１分間のハイブリダイゼーション、及び７２℃、１分３０秒間の伸長から
なるサイクルを、３０回を行なった。最終サイクルでは、伸長を７２℃５分間延
長した。
【００９７】 増幅から得られたDNA断片を、”Concert Rapid Gel Extraction System”キッ
トを用いて、１．５％アガロースゲル上で単離し、EcoRIで３７℃１時間加水分
解し、２０Uのクレノーフラグメント（New England Biolabs）を、dNTPsを各６
０nmol、１２μｌの５００ｍM トリス-HCl、pH7.5/５００ｍM MgCl2バッファ
ー、６μｌの１M DTTの存在下で、３７℃３０分間作用させ、ついでBamHIで３
７℃１時間消化した。
【００９８】 こうして処理された１００ngのMPR1128プロモーター断片（配列番号４）と５
０ngのプラスミドpGem3Z-1（実施例２のセクション２．１に記載されている）に
ついて、一晩１６℃で、１０μｌの反応混合液中、T4 DNAリガーゼバッファー（
１×）と４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で、ラ
イゲーションを行なった。
【００９９】 前もってコンピテントにしたEscherichia coli DH5a細菌を、すべてのライゲ
ーション反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ/ｌ）が添加され
たLB培地上で選択された、得られたクローンのプラスミドDNAは、 ２つのオリゴデオキシヌクレオチド： 5'ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC3'、及び 5'TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3' 各２５pmolを用い、15nmolの各dNTPs、Taq DNAポリメラーゼバッファー（１×）
、75nmolのMgCl2、１．２５UのTaq DNAポリメラーゼ（Promega 社）の存在下で
、50μｌ反応容量のＰＣＲにより分析した。増幅反応は、"GeneAmp PCR System
9700"サーモサイクラーで行なった。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡは、９
４℃、３０秒間の変性工程、５５℃１分間のハイブリダイゼーション、及び７２
℃、１分間の伸長からなるサイクルを、２５回を行なった。最終サイクルでは、
伸長を７２℃５分間延長した。
【０１００】 得られたプラスミドをpMRT1183とし、図１に図示されているMPr1183プロモー
ター配列を配列決定により確認した。
【０１０１】 ２．６． MPr1197プロモーター（配列番号１６）の構築 MPr1197プロモーター（配列番号１６）は、ヌクレオチド−５７の上流に位置
する配列の欠失による、MPr1183(実施例２のセクション２．５に記載されている
)の誘導体であり、この特許で調べられた最小HMWG-Dx5（配列番号１）を構成す
る。
【０１０２】 これを行なうために、５μｇのプラスミドpMRT1183を３７℃１時間XbaIとNcoI
で連続して消化した。こうしてMPr1183プロモーターのXbaI/NcoI断片を欠失した
ベクターpMRT1183を”Concert Rapid Gel Extraction System”キットを用いて
０．８％アガロースゲル上で単離し、２０Uのクレノーフラグメント（New Engla
nd Biolabs）を、dNTPsを各６０nmol、１２μｌの５５０ｍM トリス-HCl、pH7.
5/５００ｍM MgCl2バッファー、６μｌの１M DTTの存在下で、３７℃３０分間
作用させた。
【０１０３】 こうして修飾された１５０ngのプラスミドについて、１０μｌの反応混合液中
、T4 DNAリガーゼバッファー（１×）と４００単位のT4 DNAリガーゼ（New Engl
and Biolabs）の存在下で、"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラー中で上
述のごとくライゲーションを行なった。前もってコンピテントにしたEscherichi
a coli DH5a細菌を、すべてのライゲーション反応混合物で形質転換した。アン
ピシリン（５０ｍｇ/ｌ）が添加されたLB培地上で選択された、得られたクロー
ンのプラスミドDNAは、アルカリ溶解法で抽出し、酵素消化で分析した。
【０１０４】 得られたプラスミドをpMRT1197とし、MPr1197プロモーター配列（配列番号１
６）を図１に図示する。
【０１０５】 ２．７． MPr1198プロモーター（配列番号１７）の構築 MPr1198プロモーター（配列番号１７）は、上記cis-活性エレメントを欠いて
いる配列である、位置−５９から位置−１３５ｂｐまで伸びている内部プロモー
ター配列の欠失による、MPR1128プロモーター(配列番号０４)（実施例２のセク
ション２．２に記載されている）の誘導体である。
【０１０６】 それは、pMRT1183（実施例２のセクション２．５に記載されている）のNcoI制
限部位における、以下の２つのオリゴデオキシヌクレオチド： EcoRIとXbaI制限部位を含む 5'ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC3' NcoI制限部位を含む5'CATgCCATggCCAACACAAAAgAAgCTgg3' 各１００pmolを用い、50nmolの各dNTPs、Vent DNAポリメラーゼバッファー（１
×）、２UのVent DNAポリメラーゼ（New England Biolab）の存在下で行なったP
CRにより増幅された断片の融合により構築された。ＰＣＲ増幅反応は、"GeneAmp
PCR System 9700"サーモサイクラーで行なった。９４℃、１０分間の変性の後
、ＤＮＡは、９４℃、１分間の変性工程、５５℃１分間のハイブリダイゼーショ
ン、及び７２℃、１分３０秒間の伸長からなるサイクルを、２５回を行なった。
最終サイクルでは、伸長を７２℃５分間延長した。 増幅により得られたDNA断片を、”Concert Rapid Gel Extraction System”キッ
トを用いて１．５％アガロースゲル上で単離し、３７℃１時間NcoIとXbaIで連続
して消化した。
【０１０７】 平行して、ベクター断片をプラスミドpMRT1183から、NcoI制限部位の５’に位
置するMPr1183プロモーター領域を欠失させることにより調製した。これを行な
うために、５μｇのプラスミドpMRT1183を３７℃１時間XbaIとNcoIで連続して消
化し、pMRT1183のベクター断片を”Concert Rapid Gel Extraction System”キ
ットを用いて０．８％アガロースゲル上で単離し、４０Uの子ウシ腸アルカリホ
スファターゼ（New England Biolabs）で、バッファー３（１×）存在下で、３
７℃１時間で脱リン酸化した。
【０１０８】 ５０ngのプロモーター断片とこうして処理された１００ngのプラスミドについ
て、一晩１６℃で、１０μｌの反応混合液中、T4 DNAリガーゼバッファー（１×
）と４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で、"GeneAm
p PCR System 9700"サーモサイクラー中で上述のごとくライゲーションを行なっ
た。前もってコンピテントにしたEscherichia coli DH5a細菌を、すべてのライ
ゲーション反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ/ｌ）が添加さ
れたLB培地上で選択された、得られたクローンのプラスミドDNAは、アルカリ溶
解法で抽出し、酵素消化で分析した。
【０１０９】 得られたプラスミドをpMRT1198とし、MPr1198プロモーター配列（配列番号１
７）を図１に図示した。
【０１１０】 ２．８． MPr1216プロモーター（配列番号２１）の構築 MPr1216プロモーター（配列番号２１）は、”G”ボックスと活性エレメントを
含む配列である、位置−２２５から位置−１３６ｂｐまで伸びている配列を複製
することによる、MPR1128プロモーター(配列番号０４)（実施例２のセクション
２．２に記載されている）の誘導体である。
【０１１１】 それは、pGEM3Z-1（実施例２のセクション２．１に記載されている）へ以下の
２つのプロモーター断片をクローニングすることにより構築された： −「MPr1216（配列番号２１）５’断片」、PCRにより合成され、５ngのpMRT1128
マトリックスDNAから以下の２つのオリゴデオキシヌクレオチド： EcoRI制限部位を含む、5'ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC3'、及び XbaI制限部位を含む、5'gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg3' 各１００pmolを用い、50nmolの各dNTPs、Vent DNAポリメラーゼバッファー（１
×）、２UのVent DNAポリメラーゼ（New England Biolab）の存在下で増幅され
た。ＰＣＲ増幅反応は、"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラーで行なっ
た。９４℃、１０分間の変性の後、ＤＮＡは、９４℃、１分間の変性工程、５５
℃１分間のハイブリダイゼーション、及び７２℃、１分３０秒間の伸長からなる
サイクルを、２５回を行なった。最終サイクルでは、伸長を７２℃５分間延長し
た。PCR増幅により得られたDNA断片を、”Concert Rapid Gel Extraction Syste
m”キットを用いて１．５％アガロースゲル上で単離し、３７℃１時間EcoRIで加
水分解した。ついでDNA断片を、２０Uのクレノーフラグメント（New England Bi
olabs）を、dNTPsを各６０nmol、１２μｌの５００ｍM トリス-HCl、pH7.5/５
００ｍM MgCl2バッファー、６μｌの１M DTTの存在下で、３７℃３０分間作用
させ、XbaIで３７℃１時間消化した。 −「MPr1216（配列番号２１）３’断片」、5μｇのプラスミドpMRT1183の制限酵
素XbaIとBamHIでの加水分解により得られたもので、”Concert Rapid Gel Extra
ction System”キットを用いて１．５％アガロースゲル上で単離した。
【０１１２】 ５０ngの「MPr1216（配列番号２１）５’断片」とこうして処理された５０ng
の「MPr1216（配列番号２１）３’断片」、及び５０ngのプラスミドpGem3Z-1に
ついて、１０μｌの反応混合液中、T4 DNAリガーゼバッファー（１×）と４００
単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で、"GeneAmp PCR Syst
em 9700"サーモサイクラー中で上述のごとくライゲーションを行なった。前もっ
てコンピテントにしたEscherichia coli DH5a細菌を、すべてのライゲーション
反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ/ｌ）が添加されたLB培地
上で選択された、得られたクローンのプラスミドDNAは、 ２つのオリゴデオキシヌクレオチド： 5'ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC3'、及び 5'TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3' 各１０pmolを用い、上述のごとく"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラー
中のPCRで分析した。
【０１１３】 得られたプラスミドをpMRT1216とし、MPr1216プロモーター配列（配列番号２
１）を図１に図示した。
【０１１４】 ２．９． MPr1217プロモーター（配列番号２２）の構築 MPr1217プロモーター（配列番号２２）は、”G”ボックスと活性エレメントを
含む配列である、位置−２２５から位置−１３６ｂｐまで伸びている配列を直接
反復３倍に（トリプリケーション）することによる、MPR1128プロモーター(配列
番号０４)（実施例２のセクション２．２に記載されている）の誘導体である。
【０１１５】 MPr1217プロモーター（配列番号２２）は、 ５ngのマトリックスDNAから、２つのオリゴデオキシヌクレオチド： EcoRIとXbaI制限部位を含む、5'ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAg3'、及び
XbaI制限部位を含む、5'gCTCTAgACCAACACAAAAgAagCTgg3' 各１００pmolを用い、50nmolの各dNTPs、Vent DNAポリメラーゼバッファー（１
×）、２UのVent DNAポリメラーゼ（New England Biolab）の存在下で、PCRによ
り合成された、２つの同一のプロモーター断片の、pMRT1183（実施例２のセクシ
ョン２．５に記載されている）XbaI制限部位への挿入により構築された。ＰＣＲ
増幅反応は、"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラーで行なった。９４℃
、１０分間の変性の後、ＤＮＡは、９４℃、１分間の変性工程、５５℃１分間の
ハイブリダイゼーション、及び７２℃、１分３０秒間の伸長からなるサイクルを
、２５回を行なった。最終サイクルでは、伸長を７２℃５分間延長した。PCR増
幅から得られたDNA断片を、”Concert Rapid Gel Extraction System”キットを
用いて１．５％アガロースゲル上で単離し、３７℃１時間XbaIで加水分解した。
【０１１６】 平行して、ベクター断片を１０μｇのプラスミドpMRT1183から、MPr1183の５
’に位置するXbaI制限部位での３７℃１時間の酵素消化により調製した。こうし
て直鎖化されたベクター断片を、４０Uの子ウシ腸アルカリホスファターゼ（New
England Biolabs）で、バッファー３（１×）存在下で、３７℃１時間で脱リン
酸化した。
【０１１７】 ５０ngのプロモーター断片とこうして調製された１００ngのベクター断片につ
いて、１０μｌの反応混合液中、T4 DNAリガーゼバッファー（１×）と４００単
位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で、"GeneAmp PCR System
9700"サーモサイクラー中で上述のごとくライゲーションを行なった。前もって
コンピテントにしたEscherichia coli DH5a細菌を、すべてのライゲーション反
応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ/ｌ）が添加されたLB培地上
で選択された、得られたクローンのプラスミドDNAは、 ２つのオリゴデオキシヌクレオチド： 5'ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC3'、及び 5'TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3' 各１０pmolを用い、上述のごとく"GeneAmp PCR System 9700"サーモサイクラー
中のPCRで解析した。
【０１１８】 得られたプラスミドをpMRT1217とし、配列決定により確認したMPr1217プロモ
ーター配列（配列番号２２）を図１に図示した。”G”様ボックスの４ｂｐ上流
の位置−３１７ｂｐにCの欠失を有する。
【０１１９】 実施例３ キメラプロモーター配列を含むプラスミドの作製 ３．１．ＭＰｒ１１３０プロモーターの作製（配列番号０５） ＭＰｒ１１３０プロモーター（配列番号０５）は、ＰｒＨＭＷＧ−Ｄｘ５（配
列番号０１）の−６５ｂｐの位置に、ＣａＭＶ３５Ｓのａｓ−２モチーフ（Lam
とChua,1989）およびａｓ−１モチーフ（Lamら,1989）の重複に対応する５５ｂ
ｐの配列を挿入することによって得られる。これは、ＰＣＲによって合成された
、“ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）５’フラグメント”および“ＭＰｒ１１３
０（配列番号０５）３’フラグメント”の重複伸張によるスプライシングによっ
て作製された。
【０１２０】 “ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）５’フラグメント”を、５ｎｇのｐＵＣ１
９−ＨＭＷＧマトリックスＤＮＡ（実施例２のセクション２．１に記載）から、
それぞれ２０ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＣＡｇＣＴＴＴｇＡｇＴｇｇＣＣｇＴＡｇ３’（EcoR
I制限部位を含む）および、 ５’ＴｇＣｇＴＣＡＴＣＣＣＴＴＡＣｇＴＣＡｇＴｇｇＡｇＡＴＡＴＣＡＣＡＴ
ＣＡＡＴＣＴＴｇＡＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＡＣｇｇＴｇＡｇｇＴＴＴｇＴ
ＴＴＡｇＣＣＴＡＡｇ３’（ＣａＭＶ３５Ｓのａｓ−２モチーフ（LamとChua,19
89）およびａｓ−１モチーフ（Lamら,1989）の重複に対応する５５ｂｐの配列を
有する）を用いて、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮＡポリメラーゼバッ
ファー（１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs
）の存在下で、５０μｌの反応容量において、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増
幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて実施した。
９４℃で５分間変性した後、このＤＮＡを、各サイクルが、９４℃で１分間の変
性工程、５５℃で１分間のハイブリダイゼーション工程、そして、７２℃で１分
３０秒間の伸張工程からなる１５サイクルに処理した。最終サイクルでは、伸張
を７２℃で５分間続けた。４０μｌのＰＣＲ反応媒体を、３７℃で１０分間、そ
れぞれ２０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰの存在下において、１２．５Ｕのクレノウ断片
（New England Biolabs）の作用に処理した。かくして処理されたＰＣＲ産物を
、“QIAquick Gel Extraction”キットを用いて１．５％アガロースゲルで単離
した。
【０１２１】 “ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）３’フラグメント”は、使用した２つのオ
リゴデオキシヌクレオチドが、 ５’ＡＴＴｇＡＴｇＴｇＡＴＡＴＣＡＡｇＡＴＴｇＡＴｇＴｇＡＴＡＴＣＴＣＣ
ＡＣＴｇＡＣｇＴＡＡｇｇｇＡＴｇＡＣｇＣＡＣＡＣｇＣＡｇＣＣＡＴｇｇＴＣ
ＣＴｇＡＡＣＣＴＴＣ３’（ＣａＭＶ３５Ｓのａｓ−２モチーフ（LamとChua,19
89）およびａｓ−１モチーフ（Lamら,1989）の重複に対応する５５ｂｐの配列を
有する）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む）であることを除いて、“ＭＰｒ１１３０（配列番号
０５）５’フラグメント”と同様に合成および処理した。
【０１２２】 “ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）５’フラグメント”および“ＭＰｒ１１３
０（配列番号０５）３’フラグメント”を、重複伸張により合わせられて、“Ｍ
Ｐｒ１１３０フラグメント（配列番号０５）”を生じた。これを行うために、か
くして処理された二つのＰＣＲ産物のそれぞれ７．５μｌを用いて、 それぞれ２０ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＣＡｇＣＴＴＴｇＡｇＴｇｇＣＣｇＴＡｇ３’（EcoR
I制限部位を含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を有する）を用いて、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮ
Ａポリメラーゼバッファー（１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（N
ew England Biolabs）の存在下で、５０μｌの反応容量において、ＰＣＲにより
増幅した。ＰＣＲ増幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700”サーモサイクラー
において実施した。９４℃で５分間変性した後、このＤＮＡを、各サイクルが、
９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分間のハイブリダイゼーション工程、そ
して、７２℃で１分３０秒間の伸張工程からなる１５サイクルに処理した。最終
サイクルでは、伸張を７２℃で５分間続けた。かくして合成された“ＭＰｒ１１
３０フラグメント（配列番号０５）”を、“QIAquick Gel Extraction”キット
を用いて１．５％アガロースゲルで単離した。このフラグメントに、３７℃で１
時間EcoRIを用いて加水分解し、６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２μｌの５００
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーおよび
６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下で、３７℃で３０分間、２０Ｕのクレノウ断片（N
ew England Biolabs）を作用させた。最後に、ＭＰｒ１１３０フラグメント（配
列番号０５）を、３７℃で１時間BamHIで切断した。
【０１２３】 ライゲーションを、かくして処理された１００ｎｇの“ＭＰｒ１１３０フラグ
メント（配列番号０５）”と、５０ｎｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚ−１（実施例
２のセクション２．１に記載）とを用いて、１６℃で一晩、１μｌのＴ４ＤＮＡ
リガーゼバッファー（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（New Engl
and Biolabs）の存在下で、１０μｌの反応混合物中において行った。予め反応
性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反応混合物を用いてトラン
スフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地で選択され
た、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、上述したように、“GeneAmp PCR
System 9700”サーモサイクラーにおいて、それぞれ２５ｐｍｏｌの２つのオリ
ゴデオキシヌクレオチド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＣＡｇＣＴＴＴｇＡｇＴｇｇＣＣｇＴＡｇ３’ および ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’ を用いてＰＣＲにより分析した。
【０１２４】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３０と称し、図IIIにおいて図式的に示さ
れているＭＰｒ１１３０プロモーター配列（配列番号０５）を配列決定により確
認した。
【０１２５】 ３．２．ＭＰｒ１１３１プロモーターの作製（配列番号０６） ＭＰｒ１１３１プロモーター（配列番号０６）は、ＰｒＨＭＷＧ−Ｄｘ５（配
列番号０１）の−６５ｂｐの位置に、ＣａＭＶ３５Ｓのａｓ−２モチーフ（Lam
とChua,1989）およびａｓ−１モチーフ（Lamら,1989）に対応する３８ｂｐの配
列を挿入することによって得られる。これは、ＰＣＲによって合成された、“Ｍ
Ｐｒ１１３１（配列番号０６）５’フラグメント”および“ＭＰｒ１１３１（配
列番号０６）３’フラグメント”の重複伸張によるスプライシングによって作製
された。
【０１２６】 “ＭＰｒ１１３１（配列番号０６）５’フラグメント”は、使用した２つのオ
リゴデオキシヌクレオチドが、 ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＣＡｇＣＴＴＴｇＡｇＴｇｇＣＣｇＴＡｇ３’（EcoR
I制限部位を含む）および、 ５’ＴｇＣｇＴＣＡＴＣＣＣＴＴＡＣｇＴＣＡｇＴｇｇＡｇＡＴＡＴＣＡＣＡＴ
ＣＡＡＴＣＡＣｇｇＴｇＡｇｇＴＴＴｇＴＴＴＡｇＣＣＴＡＡｇ３’（ＣａＭＶ
３５Ｓのａｓ−２モチーフ（LamとChua,1989）およびａｓ−１モチーフ（Lamら,
1989）に対応する３８ｂｐの配列を有する）であることを除いて、“ＭＰｒ１１
３０（配列番号０５）５’フラグメント”（実施例３のセクション３．１に記載
）と同様に合成および処理した。
【０１２７】 “ＭＰｒ１１３１（配列番号０６）３’フラグメント”は、使用した２つのオ
リゴデオキシヌクレオチドが、 ５’ＡＴＴｇＡＴｇＴｇＡＴＡＴＣＴＣＣＡＣＴｇＡＣｇＴＡＡｇｇｇＡＴｇＡ
ＣｇＣＡＣＡＣｇＣＡｇＣＣＡＴｇｇＴＣＣＴｇＡＡＣＣＴＴＣ３’（ＣａＭＶ
３５Ｓのａｓ−２モチーフ（LamとChua,1989）およびａｓ−１モチーフ（Lamら,
1989）に対応する３８ｂｐの配列を有する）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） であることを除いて、“ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）５’フラグメント”（
実施例３のセクション３．１に記載）と同様に合成および処理した。
【０１２８】 “ＭＰｒ１１３１（配列番号０６）５’フラグメント”および“ＭＰｒ１１３
１（配列番号０６）３’フラグメント”を、重複伸張により合わせられて、“Ｍ
Ｐｒ１１３１フラグメント（配列番号０６）”を生じた。これを行うために、か
くして処理された二つのＰＣＲ産物のそれぞれ７．５μｌを用いて、 それぞれ２０ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＣＡｇＣＴＴＴｇＡｇＴｇｇＣＣｇＴＡｇ３’（EcoR
I制限部位を含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を有する）を用いて、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮ
Ａポリメラーゼバッファー（１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（N
ew England Biolabs）の存在下で、５０μｌの反応容量において、ＰＣＲにより
増幅した。ＰＣＲ増幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700”サーモサイクラー
において実施した。９４℃で５分間変性した後、このＤＮＡを、各サイクルが、
９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分間のハイブリダイゼーション工程、そ
して、７２℃で１分３０秒間の伸張工程からなる１５サイクルに処理した。最終
サイクルでは、伸張を７２℃で５分間続けた。かくして合成された“ＭＰｒ１１
３１フラグメント（配列番号０６）”を、“QIAquick Gel Extraction”キット
を用いて１．５％アガロースゲルで単離した。このフラグメントに、３７℃で１
時間EcoRIを用いて加水分解し、６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２μｌの５００
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーおよび
６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下で、３７℃で３０分間、２０Ｕのクレノウ断片（N
ew England Biolabs）を作用させた。最後に、ＭＰｒ１１３１フラグメント（配
列番号０６）を、３７℃で１時間BamHIで切断した。
【０１２９】 ライゲーションを、かくして処理された１００ｎｇの“ＭＰｒ１１３０フラグ
メント（配列番号０５）”と、５０ｎｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚ−１（実施例
２のセクション２．１に記載）とを用いて、１６℃で一晩、１μｌのＴ４ＤＮＡ
リガーゼバッファー（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（New Engl
and Biolabs）の存在下で、１０μｌの反応混合物中において行った。予め反応
性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反応混合物を用いてトラン
スフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地で選択され
た、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、上述したように、“GeneAmp PCR
System 9700”サーモサイクラーにおいて、それぞれ２５ｐｍｏｌの２つのオリ
ゴデオキシヌクレオチド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＣＡｇＣＴＴＴｇＡｇＴｇｇＣＣｇＴＡｇ３’ および ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’ を用いてＰＣＲにより分析した。
【０１３０】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３１と称し、図IIにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１１３１プロモーター配列（配列番号０６）を配列決定により確認
した。
【０１３１】 ３．３．ＭＰｒ１１３５プロモーターの作製（配列番号０９） 二つのプロラミン様ボックスと二つのＧＡＴＡボックスとを含む、ヌクレオチ
ド−２９３の上流に位置する配列を欠失させることにより、ＭＰｒ１１３５プロ
モーター（配列番号０９）を、ＭＰｒ１１３０プロモーター（配列番号０５）（
実施例３のセクション３．１に記載）から誘導した。
【０１３２】 プロモーターフラグメントを、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３０マトリックスＤＮＡ
から、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧ３’（EcoR
I制限部位を含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて、５０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮＡポリメラーゼバッファー（
１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在
下で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700
”サーモサイクラーにおいて実施した。９４℃で５分間変性した後、このＤＮＡ
を、各サイクルが、９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分間のハイブリダイ
ゼーション工程、そして、７２℃で１分３０秒間の伸張工程からなる２５サイク
ルに処理した。最終サイクルでは、伸張を７２℃で１分間続けた。
【０１３３】 増幅から誘導されたＤＮＡフラグメントを、“QIAquick Gel Extraction”キ
ットを用いて２％アガロースゲルで単離し、３７℃で１時間EcoRIを用いて加水
分解し、次いで、３７℃で３０分間、それぞれ６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２
μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッ
ファーおよび６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下において、２０Ｕのクレノウ断片（N
ew England Biolabs）の作用に処理した。かくして処理されたＤＮＡフラグメン
トを、３７℃で１時間、BamHIで切断した。
【０１３４】 ライゲーションを、かくして処理された１００ｎｇのＭＰｒ１１３５プロモー
ターフラグメント（配列番号０９）と、５０ｎｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚ−１
（実施例２のセクション２．１に記載）とを用いて、１６℃で一晩、１μｌのＴ
４ＤＮＡリガーゼバッファー（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（
New England Biolabs）の存在下で、１０μｌの反応混合物中において行った。
予め反応性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反応混合物を用い
てトランスフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地で
選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、上述したように、“Gene
Amp PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、それぞれ２５ｐｍｏｌの２
つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＣ３’ および ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’ を用いてＰＣＲにより分析した。
【０１３５】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３５と称し、図IIにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１１３１プロモーター配列（配列番号０６）を配列決定により確認
した。
【０１３６】 ３．４．ＭＰｒ１１３８プロモーターの作製（配列番号１２） 二つのプロラミン様ボックスと二つのＧＡＴＡボックスとを含む、ヌクレオチ
ド−２７６の上流に位置する配列を欠失させることにより、ＭＰｒ１１３８プロ
モーター（配列番号１２）を、ＭＰｒ１１３１プロモーター（配列番号０６）（
実施例３のセクション３．２に記載）から誘導した。
【０１３７】 プロモーターフラグメントを、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３１マトリックスＤＮＡ
からＰＣＲによって増幅し、ＭＰｒ１１３５プロモーター（配列番号０９）（実
施例３のセクション３．３に記載）と同様に処理し、得た。
【０１３８】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３８と称し、図IIにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１１３８プロモーター配列（配列番号１２）を配列決定により確認
した。
【０１３９】 ３．５．ＭＰｒ１１３７プロモーターの作製（配列番号１１） 二つのプロラミン様ボックス、二つのＧＡＴＡボックスおよび“Ｇ”様ボック
スを含む、ヌクレオチド−２４３の上流に位置する配列を欠失させることにより
、ＭＰｒ１１３７プロモーター（配列番号１１）を、ＭＰｒ１１３１プロモータ
ー（配列番号０６）（実施例３のセクション３．２に記載）から誘導した。
【０１４０】 プロモーターフラグメントを、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３１マトリックスＤＮＡ
から、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＴＣ３’（EcoR
I制限部位を含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて増幅し、ＭＰｒ１１３５プロモーター（配列番号０９）（実施例３のセ
クション３．３に記載）と同様に処理し、得た。
【０１４１】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３７と称し、図IIにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１１３７プロモーター配列（配列番号１１）を配列決定により確認
した。
【０１４２】 ３．６．ＭＰｒ１１３４プロモーターの作製（配列番号０８） 二つのプロラミン様ボックス、二つのＧＡＴＡボックスおよび“Ｇ”様ボック
スを含む、ヌクレオチド−２６０の上流に位置する配列を欠失させることにより
、ＭＰｒ１１３４プロモーター（配列番号０８）を、ＭＰｒ１１３０プロモータ
ー（配列番号０５）（実施例３のセクション３．１に記載）から誘導した。
【０１４３】 プロモーターフラグメントを、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３０マトリックスＤＮＡ
から、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＴＣ３’（EcoR
I制限部位を含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて増幅し、ＭＰｒ１１３５プロモーター（配列番号０９）（実施例３のセ
クション３．３に記載）と同様に処理し、得た。
【０１４４】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３４と称し、図IIIにおいて図式的に示さ
れているＭＰｒ１１３４プロモーター配列（配列番号０８）を配列決定により確
認した。
【０１４５】 ３．７．ＭＰｒ１１３６プロモーターの作製（配列番号１０） 二つのプロラミン様ボックス、二つのＧＡＴＡボックス、“Ｇ”様ボックスお
よび活性化因子を含む、ヌクレオチド−１８０の上流に位置する配列を欠失させ
ることにより、ＭＰｒ１１３６プロモーター（配列番号１０）を、ＭＰｒ１１３
１プロモーター（配列番号０６）（実施例３のセクション３．２に記載）から誘
導した。
【０１４６】 プロモーターフラグメントを、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３１マトリックスＤＮＡ
から、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＣ３’（EcoRI制限部
位を含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて増幅し、ＭＰｒ１１３５プロモーター（配列番号０９）（実施例３のセ
クション３．３に記載）と同様に処理し、得た。
【０１４７】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３６と称し、図IIにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１１３６プロモーター配列（配列番号１０）を配列決定により確認
した。
【０１４８】 ３．８．ＭＰｒ１１３３プロモーターの作製（配列番号０７） 二つのプロラミン様ボックス、二つのＧＡＴＡボックス、“Ｇ”様ボックスお
よび活性化因子を含む、ヌクレオチド−１９７の上流に位置する配列を欠失させ
ることにより、ＭＰｒ１１３３プロモーター（配列番号０７）を、ＭＰｒ１１３
０プロモーター（配列番号０５）（実施例３のセクション３．２に記載）から誘
導した。
【０１４９】 プロモーターフラグメントを、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３０マトリックスＤＮＡ
から、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＣ３’（EcoRI制限部
位を含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて増幅し、ＭＰｒ１１３５プロモーター（配列番号０９）（実施例３のセ
クション３．３に記載）と同様に処理し、得た。
【０１５０】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３３と称し、図IIIにおいて図式的に示さ
れているＭＰｒ１１３３プロモーター配列（配列番号０７）を配列決定により確
認した。
【０１５１】 ３．９．ＭＰｒ１１３９プロモーターの作製（配列番号１３） ＭＰｒ１１３９プロモーター（配列番号１３）は、ＭＰｒ１１３１（配列番号
０６）（実施例３のセクション３．２に記載）の−４０５ｂｐの位置に、六倍体
小麦Triticum aestivum L. cv Cheyenne（Andersonら,1998）のＢｘ７サブユニ
ット（ＰｒＨＭＷＧ−Ｂｘ７）をコードする高分子量グルテニン遺伝子のプロモ
ーターの“シリアル(cereal)”ボックスの重複を含む６１ｂｐの配列を挿入する
ことによって得られる。
【０１５２】 ＭＰｒ１１３９プロモーター（配列番号１３）を、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３１
マトリックスＤＮＡから、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌク
レオチド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＴＣｇＡＣＡＴｇｇＴＴＡｇＡＡｇＴＴＴＴｇＡｇＴ
ｇＣＣｇＣＣＡＣＴＡＣＴＣｇＡＣＡＴｇｇＴＴＡｇＡＡｇＴＴＴＴｇＡｇＴｇ
ｇＣＣｇＴＡｇＡＴＴＴｇＣ３’（EcoRI制限部位と上記二つの“シリアル”ボ
ックスを含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて、５０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮＡポリメラーゼバッファー（
１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在
下で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700
”サーモサイクラーにおいて実施した。９４℃で５分間変性した後、このＤＮＡ
を、各サイクルが、９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分間のハイブリダイ
ゼーション工程、そして、７２℃で１分３０秒間の伸張工程からなる２５サイク
ルに処理した。最終サイクルでは、伸張を７２℃で１分間続けた。
【０１５３】 増幅から誘導されたＤＮＡフラグメントを、“QIAquick Gel Extraction”キ
ットを用いて２％アガロースゲルで単離し、３７℃で１時間EcoRIを用いて加水
分解し、次いで、３７℃で３０分間、それぞれ６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２
μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッ
ファーおよび６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下において、２０Ｕのクレノウ断片（N
ew England Biolabs）の作用に処理した。かくして処理されたＤＮＡフラグメン
トを、３７℃で１時間、BamHIで切断した。
【０１５４】 ライゲーションを、かくして処理された１００ｎｇのＭＰｒ１１３９プロモー
ターフラグメント（配列番号１３）と、５０ｎｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚ−１
（実施例２のセクション２．１に記載）とを用いて、１６℃で一晩、１μｌのＴ
４ＤＮＡリガーゼバッファー（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（
New England Biolabs）の存在下で、１０μｌの反応混合物中において行った。
予め反応性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反応混合物を用い
てトランスフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地で
選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、上述したように、“Gene
Amp PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、それぞれ２５ｐｍｏｌの２
つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧ３’ および ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’ を用いてＰＣＲにより分析した。
【０１５５】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１３９と称し、図IVにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１１３９プロモーター配列（配列番号１３）を配列決定により確認
した。
【０１５６】 ３．１０．ＭＰｒ１２００プロモーターの作製（配列番号１９） ＭＰｒ１２００プロモーター（配列番号１９）は、ＭＰｒ１１３８（配列番号
１２）（実施例３のセクション３．４に記載）の−２６３ｂｐの位置に、六倍体
小麦Triticum aestivum L. cv Cheyenne（Andersonら,1998）のＢｘ７サブユニ
ット（ＰｒＨＭＷＧ−Ｂｘ７）をコードする高分子量グルテニン遺伝子のプロモ
ーターの“シリアル(cereal)”ボックスの重複を含む７９ｂｐの配列を挿入する
ことによって得られる。
【０１５７】 ＭＰｒ１２００プロモーター（配列番号１９）は、ベクターｐＧＥＭ３Ｚ−１
（実施例２のセクション２．１に記載）に以下の二つのプロモーターフラグメン
トをクローニングすることによって作製された： −ＰＣＲにより合成された“ＭＰｒ１２００（配列番号１９）５’フラグメン
ト”は、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３９マトリックスＤＮＡ（実施例３のセクション
３．９に記載）から、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオ
チド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＴＣｇＡＣＡＴｇｇ３’（EcoRI制限部位を含む）お
よび、 ５’ｇＣＴＣＴＡｇＡｇＣＡＡＡＴＣＴＡＣｇｇＣＣＡＣＴＣ３’（XbaI制限部
位を含む） を用いて、５０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮＡポリメラーゼバッファー（
１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在
下で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700
”サーモサイクラーにおいて実施した。９４℃で１０分間変性した後、このＤＮ
Ａを、各サイクルが、９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分間のハイブリダ
イゼーション工程、そして、７２℃で１分３０秒間の伸張工程からなる２５サイ
クルに処理した。最終サイクルでは、伸張を７２℃で５分間続けた。ＰＣＲ増幅
から誘導されたＤＮＡフラグメントを、“Concert Rapid Gel Extraction Syste
m”キットを用いて１．５％アガロースゲルで単離し、３７℃で１時間EcoRIを用
いて加水分解した。次いで、ＤＮＡフラグメントを、３７℃で３０分間、それぞ
れ６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーおよび６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下
において、２０Ｕのクレノウ断片（New England Biolabs）の作用に処理した。
かくして処理されたＤＮＡフラグメントを、３７℃で１時間、XbaIで切断した。 −ＰＣＲにより合成された“ＭＰｒ１２００（配列番号１９）３’フラグメン
ト”は、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３８マトリックスＤＮＡから、それぞれ１００ｐ
ｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣｇｇＡＡＴＴＣＴＡｇＡＣｇＣＣｇＡＴＴＡＣｇＴｇｇＣＴＴＴＡｇ
Ｃ３’（EcoRI制限部位とXbaI制限部位とを含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて、５０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮＡポリメラーゼバッファー（
１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在
下で、“GeneAmp PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、“ＭＰｒ１２
００（配列番号１９）５’フラグメント”と同じ条件下で、増幅した。ＰＣＲ増
幅から誘導されたＤＮＡフラグメントを、“Concert Rapid Gel Extraction Sys
tem”キットを用いて１．５％アガロースゲルで単離し、３７℃で１時間BamHIと
XbaIを用いて連続的に加水分解した。
【０１５８】 ライゲーション反応を、かくして処理された５０ｎｇの“ＭＰｒ１２００（配
列番号１９）５’フラグメント”、５０ｎｇの“ＭＰｒ１２００（配列番号１９
）３’フラグメント”と、５０ｎｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚ−１とを用いて、
上述したように、“GeneAmp PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、１
０μｌの反応混合物において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー（１Ｘ）と４００
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で行った。予
め反応性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反応混合物を用いて
トランスフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地で選
択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、上述したように、“GeneAm
p PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、それぞれ１０ｐｍｏｌの２つ
のオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣｇｇＡＡＴＴＣｇＣＡｇＣＣＡＴｇｇＴＣＣＴｇＡＡＣＣ３’ および ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’ を用いてＰＣＲにより分析した。
【０１５９】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１２００と称し、図IVにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１２００プロモーター配列（配列番号１９）を配列決定により確認
した。
【０１６０】 ３．１１．ＭＰｒ１２１３プロモーターの作製（配列番号２０） ＭＰｒ１２１３プロモーター（配列番号２０）は、ＭＰＲ１１２８（配列番号
０４）（実施例２のセクション２．２に記載）の−２２５ｂｐの位置の上流に、
六倍体小麦Triticum aestivum L. cv Cheyenne（Andersonら,1998）のＢｘ７サ
ブユニット（ＰｒＨＭＷＧ−Ｂｘ７）をコードする高分子量グルテニン遺伝子の
プロモーターの“シリアル(cereal)”ボックスの重複を含む７９ｂｐの配列を挿
入することによって得られる。
【０１６１】 ＭＰｒ１２１３プロモーター（配列番号２０）は、ベクターｐＧＥＭ３Ｚ−１
（実施例２のセクション２．１に記載）に以下の二つのプロモーターフラグメン
トをクローニングすることによって作製された： −ＰＣＲにより合成された“ＭＰｒ１２１３（配列番号１９）５’フラグメン
ト”は、５ｎｇのｐＭＲＴ１１３９マトリックスＤＮＡ（実施例３のセクション
３．９に記載）から、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌクレオ
チド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＴＣｇＡＣＡＴｇｇ３’（EcoRI制限部位を含む）お
よび、 ５’ｇＣＴＣＴＡｇＡｇＣＡＡＡＴＣＴＡＣｇｇＣＣＡＣＴＣ３’（XbaI制限部
位を含む） を用いて、５０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮＡポリメラーゼバッファー（
１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在
下で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700
”サーモサイクラーにおいて実施した。９４℃で１０分間変性した後、このＤＮ
Ａを、各サイクルが、９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分間のハイブリダ
イゼーション工程、そして、７２℃で１分３０秒間の伸張工程からなる２５サイ
クルに処理した。最終サイクルでは、伸張を７２℃で５分間続けた。ＰＣＲ増幅
から誘導されたＤＮＡフラグメントを、“Concert Rapid Gel Extraction Syste
m”キットを用いて１．５％アガロースゲルで単離し、３７℃で１時間EcoRIを用
いて加水分解した。次いで、ＤＮＡフラグメントを、３７℃で３０分間、それぞ
れ６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーおよび６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下
において、２０Ｕのクレノウ断片（New England Biolabs）の作用に処理した。
かくして処理されたＤＮＡフラグメントを、３７℃で１時間、XbaIで切断した。 −XbaIおよびBamHI制限酵素を用いて５μｇのプラスミドｐＭＲＴ１１８３（
実施例２のセクション２．５に記載）を加水分解することにより得られた“ＭＰ
ｒ１２１３（配列番号２０）３’フラグメント”は、“Concert Rapid Gel Extr
action System”キットを用いて１．５％アガロースゲルで単離した。
【０１６２】 ライゲーション反応を、かくして処理された５０ｎｇの“ＭＰｒ１２１３（配
列番号２０）５’フラグメント”、５０ｎｇの“ＭＰｒ１２１３（配列番号２０
）３’フラグメント”と、５０ｎｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚ−１とを用いて、
上述したように、“GeneAmp PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、１
０μｌの反応混合物において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー（１Ｘ）と４００
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で行った。予
め反応性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反応混合物を用いて
トランスフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地で選
択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、上述したように、“GeneAm
p PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、それぞれ１０ｐｍｏｌの２つ
のオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＴＡＣｇＡＡＴＴＣＣＴＣｇＡＣＡＴｇｇ３’ および ５’ｇＣＴＣＴＡｇＡｇＣＡＡＡＴＣＴＡＣｇｇＣＣＡＣＴＣ３’ を用いてＰＣＲにより分析した。
【０１６３】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１２１３と称し、図IVにおいて図式的に示され
ているＭＰｒ１２１３プロモーター配列（配列番号２０）を配列決定により確認
した。
【０１６４】 ３．１２．ＭＰｒ１１９９プロモーターの作製（配列番号１８） ＭＰｒ１１９９プロモーター（配列番号１８）は、ＭＰＲ１１２８（配列番号
０４）（実施例２のセクション２．２に記載）の−２２４ｂｐの位置に、トウモ
ロコシ・ストリーク(streak)ウイルス（ＭＳＶ）の遺伝子間(intergenic)領域（
Fenollら,1990）の“ＧＣリッチ”因子を含む２７ｂｐの配列を挿入することに
よって得られる。
【０１６５】 ＭＰｒ１１９９プロモーター（配列番号１８）を、５ｎｇのｐＭＲＴ１１２８
マトリックスＤＮＡから、それぞれ１００ｐｍｏｌの２つのオリゴデオキシヌク
レオチド： ５’ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣ
ＡＧＣＧＣＣＧＡＴＴＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＡＧＣ３’（上記“ＧＣリッチ”因
子とEcoRIおよびXbaI制限部位とを含む）および、 ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’（BamHI制限部位を含む） を用いて、５０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、Vent ＤＮＡポリメラーゼバッファー（
１Ｘ）、および２ＵのVent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在
下で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応を、“GeneAmp PCR System 9700
”サーモサイクラーにおいて実施した。９４℃で５分間変性した後、このＤＮＡ
を、各サイクルが、９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分間のハイブリダイ
ゼーション工程、そして、７２℃で１分３０秒間の伸張工程からなる２５サイク
ルに処理した。最終サイクルでは、伸張を７２℃で１分間続けた。
【０１６６】 増幅から誘導されたＤＮＡフラグメントを、“Concert Rapid Gel Extraction
System”キットを用いて１．５％アガロースゲルで単離し、３７℃で１時間Eco
RIを用いて加水分解した。次いで、フラグメントを、３７℃で３０分間、それぞ
れ６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーおよび６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下
において、２０Ｕのクレノウ断片（New England Biolabs）の作用に処理した。
かくして処理されたＤＮＡフラグメントを、３７℃で１時間、BamHIで切断した
。
【０１６７】 ライゲーションを、かくして処理された１００ｎｇのＭＰｒ１１９９プロモー
ターフラグメント（配列番号１８）と、５０ｎｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚ−１
（実施例２のセクション２．１に記載）とを用いて、上記条件下で、“GeneAmp
PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、ＰＣＲサイクルにより実施した
。予め反応性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反応混合物を用
いてトランスフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地
で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、上述したように、“Ge
neAmp PCR System 9700”サーモサイクラーにおいて、それぞれ２５ｐｍｏｌの
２つのオリゴデオキシヌクレオチド： ５’ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧ３’ および ５’ＴＡＣｇｇＡＴＣＣＣＣｇｇｇｇＡＴＣＴＣＴＡｇＴＴＴｇＴｇｇＴｇＣ３
’ を用いてＰＣＲにより分析した。
【０１６８】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１９９ｍｕｔと称し、配列決定により確認さ
れた、対応するＭＰｒ１１９９（配列番号１８）ｍｕｔプロモーター配列は、＋
２７位における未翻訳リーダー配列に変異を有する。未変異のＭＰｒ１１９９配
列（配列番号１８）を回復するために、位置−２５１〜−５８ｂｐにわたる“Ｍ
Ｐｒ１１９９（配列番号１８）５’フラグメント”を、位置−２２５〜−５８ｂ
ｐにわたる“ＭＰｒ１１８３ ５’フラグメント”の場所にクローン化した。
【０１６９】 これを実施するために、１０μｇのプラスミドｐＭＲＴ１１９９ｍｕｔを、３
７℃で１時間、EcoRIを用いて切断し、３７℃で３０分間、それぞれ６０ｎｍｏ
ｌの各ｄＮＴＰ、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５０
０ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーおよび６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下において、２
０Ｕのクレノウ断片（New England Biolabs）の作用に処理した。NcoIを用いて
３７℃で１時間切断した後、“ＭＰｒ１１９９（配列番号１８）５’フラグメン
ト”を、“Concert Rapid Gel Extraction System”キットを用いて１．５％ア
ガロースゲルで単離した。
【０１７０】 同時に、５μｇのプラスミドｐＭＲＴ１１８３（実施例２のセクション２．５
に記載）を、３７℃で１時間、XbaIを用いて切断し、３７℃で３０分間、それぞ
れ６０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５／５００ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーおよび６μｌの１Ｍ ＤＴＴの存在下
において、２０Ｕのクレノウ断片（New England Biolabs）の作用に処理した。N
coIを用いて切断した後、かくして“ＭＰＲ１１８３ ５’フラグメント”を欠
くベクターＭＲＴ１１８３を、“Concert Rapid Gel Extraction System”キッ
トを用いて０．８％アガロースゲルで単離し、バッファー３（１Ｘ）の存在下で
４０Ｕのウシ腸アルカリホスファターゼ（New England Biolabs）を用いて３７
℃で１時間脱リン酸基化した。
【０１７１】 ライゲーション反応を、かくして処理された１００ｎｇの“ＭＰｒ１１９９（
配列番号１８）ｍｕｔ５’フラグメント”と５０ｎｇのプラスミドｐＭＲＴ１１
８３とを用いて、上述したように、“GeneAmp PCR System 9700”サーモサイク
ラーにおいて、１０μｌの反応混合物において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー
（１Ｘ）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）の存
在下で行った。予め反応性とされた大腸菌ＤＨ５ａを、全てのライゲーション反
応混合物を用いてトランスフォームした。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を添加
したＬＢ培地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ
溶解法に従って抽出し、酵素切断により分析した。
【０１７２】 得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１９９と称し、ＭＰｒ１１９９プロモーター
配列（配列番号１８）は図IVにおいて図式的に示されている。
【０１７３】 実施例４ タバコの安定な形質転換に用いられるプロモーターのMPr1130（配列番号０５
）、MPr1131（配列番号０６）、MPr1135（配列番号０９）、MPr1138（配列番号
１２）、MPr1139（配列番号１３）及びMPr1092を含むバイナリープラスミドの作
成。 ４．１．バイナリープラスミドpMRT1177の作成 バイナリープラスミドpMRT1177は、pMRT 1130（実施例３のセクション３．１
に記載）の発現カセット「MPr1130（配列番号０５）／uidA-IV2／term-nos」を
、バイナリープラスミドpMRT1118（未公表特許出願FR 9911112）のEcoRI部位に
挿入することによって得られた。
【０１７４】 これを行うために、１０μｇのプラスミドpMRT1130を、３７℃で１時間、EcoR
I及びXmnIを用いて連続的に消化した。それから、「Concert Rapid Gel Extract
ion System」キットを用いて、該発現カセットを０．８％アガロースゲルで単離
した。
【０１７５】 平行して、１０μｇのバイナリープラスミドpMRT1118を、３７℃で１時間、Ec
oRIを用いて消化した。それから、その直線化ベクター断片を、緩衝液３（１Ｘ
）の存在下で、３７℃で１時間、４０Ｕの子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ne
w England Biolabs）を用いて脱リン酸した。
【０１７６】 ライゲーションは、５０ngの発現カセットと１００ngのプラスミドpMRT1118を
用いて実施され、１０μｌの反応混合物中で、１６℃で一晩、T4 DNAリガーゼ緩
衝液（１Ｘ）と４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下
で処理した。Escherichia coli DH5a細菌は、予めコンピテントにされており、
該ライゲーション反応混合物の全てを用いて形質転換された。得られたクローン
のプラスミドDNAは、カナマイシン（５０mg/l)を補充したLB培地にて選択し、ア
ルカリ法に従って抽出して、酵素消化を用いて分析した。
【０１７７】 得られたプラスミドを、pMRT1177と命名し、Holstersら（1978）によって記載
された技術に従って、LBA4404 Agrobacterium tumefaciens株に移入した。得ら
れたクローンのプラスミドDNAを、リファンピシン（５０mg/l)及びカナマイシン
（５０mg/l）を補充した2YT培地（10 g/lバクトトリプトン、10 g/lイースト抽
出液、5 g/l NaCl、pH 7.2及び15 g/l 寒天−寒天）にて選択し、アルカリ法に
従って抽出し、その細胞再懸濁緩衝液にリゾチーム（25 mg/ml）を添加すること
によってそれを修飾した。該プラスミドDNAを、酵素消化を用いて分析し、得ら
れたアグロバクテリウム（agrobacterium）クローンをA1177と命名した。
【０１７８】 ４．２．バイナリープラスミドpMRT1178の作成 バイナリープラスミドpMRT1178は、その発現カセットがプラスミドpMRT1131（
実施例３のセクション３．２に記載）から単離されたことを除いては、実施例４
のセクション４．１に記載されるように、発現カセット「MPr1131（配列番号０
６）／uidA-IV2／term-nos」をバイナリープラスミドpMRT1118のEcoRI部位に挿
入することによって得られた。
【０１７９】 得られたプラスミドは、pMRT1178と命名し、上述の実施例４のセクション４．
１に記載されたプロトコルに従って、LBA4404 Agrobacterium tumefaciens株に
移入した。得られたアグロバクテリウムクローンをA1178と命名した。
【０１８０】 ４．３．バイナリープラスミドpMRT1179の作成 バイナリープラスミドpMRT1179は、その発現カセットがプラスミドpMRT1135（
実施例３のセクション３．３に記載）から単離されたことを除いては、実施例４
のセクション４．１に記載されるように、発現カセット「MPr1135（配列番号０
９）／uidA-IV2／term-nos」をバイナリープラスミドpMRT1118のEcoRI部位に挿
入することによって得られた。
【０１８１】 得られたプラスミドは、pMRT1179と命名し、上述の実施例４のセクション４．
１に記載されたプロトコルに従って、LBA4404 Agrobacterium tumefaciens株に
移入した。得られたアグロバクテリウムクローンをA1179と命名した。
【０１８２】 ４．４．バイナリープラスミドpMRT1180の作成 バイナリープラスミドpMRT1180は、その発現カセットがプラスミドpMRT1138（
実施例３のセクション３．４に記載）から単離されたことを除いては、実施例４
のセクション４．１に記載されるように、発現カセット「MPr1138（配列番号１
２）／uidA-IV2／term-nos」をバイナリープラスミドpMRT1138のEcoRI部位に挿
入することによって得られた。
【０１８３】 得られたプラスミドは、pMRT1180と命名し、上述の実施例４のセクション４．
１に記載されたプロトコルに従って、LBA4404 Agrobacterium tumefaciens株に
移入した。得られたアグロバクテリウムクローンをA1180と命名した。
【０１８４】 ４．５．バイナリープラスミドpMRT1181の作成 バイナリープラスミドpMRT1181は、その発現カセットがプラスミドpMRT1139（
実施例３のセクション３．９に記載）から単離されたことを除いては、実施例４
のセクション４．１に記載されるように、発現カセット「MPr1139（配列番号１
３）／uidA-IV2／term-nos」をバイナリープラスミドpMRT1118のEcoRI部位に挿
入することによって得られた。
【０１８５】 得られたプラスミドは、pMRT1181と命名し、上述の実施例４のセクション４．
１に記載されたプロトコルに従って、LBA4404 Agrobacterium tumefaciens株に
移入した。得られたアグロバクテリウムクローンをA1181と命名した。
【０１８６】 ４．６．バイナリープラスミドpMRT1182の作成 バイナリープラスミドpMRT1182は、CaMV PrD35Sプロモーター断片及び配列uid
A-IV2／term-nosをバイナリープラスミドpMRT1118に挿入することによって得ら
れた。
【０１８７】 CaMV PrD35Sは、１０μｇのプラスミドpJIT163Dを、３７℃で１時間、KpnI及
びHindIIIを用いて、連続的に消化することによって単離した。CaMV PrD35Sに対
応する743-bp断片は、０．８％アガロースゲルにて単離し、それから、「QIAqui
ck Gel Extraction」キットを用いて精製した。
【０１８８】 配列uidA-IV2／term-nosは、４μｇのプラスミドpMRT1092を、３７℃で１時間
、HindIII及びEcoRIを用いて、消化することによって得た。配列uidA-IV2／term
-nosに対応する2.2-kb断片は、０．８％アガロースゲルにて単離し、それから、
「QIAquick Gel Extraction」キットを用いて精製した。
【０１８９】 平行して、１０μｇのバイナリープラスミドpMRT1118を、３７℃で１時間、Kp
nI及びEcoRIを用いて、連続的に消化した。それから、その直線化ベクター断片
を、緩衝液３（１Ｘ）の存在下で、３７℃で１時間、４０Ｕの子ウシ腸アルカリ
ホスファターゼ（New England Biolabs）を用いて脱リン酸した。
【０１９０】 ライゲーションは、１００ngのバイナリープラスミド、５０ngのCaMV PrD35S
、及び配列uidA-IV2／term-nosに対応する断片５０ngの存在下で、２０μｌの反
応容量中で、T4 DNAリガーゼ緩衝液（１Ｘ）と４００単位の酵素T4 DNAリガーゼ
（New England Biolabs）の存在下で実施した。インキュベーションは、上述し
たような「GeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー内でのPCRサイクルを用
いて実施した。Escherichia coli DH5a細菌は、予めコンピテントにされており
、該ライゲーション反応媒体の半分を用いて形質転換された。得られたクローン
のプラスミドDNAは、カナマイシン（５０mg/l)を補充したLB培地にて選択し、ア
ルカリ法に従って抽出して、酵素消化を用いて分析した。
【０１９１】 得られたプラスミドは、pMRT1182と命名し、上述の実施例４のセクション４．
１に記載されたプロトコルに従って、LBA4404 Agrobacterium tumefaciens株に
移入した。得られたアグロバクテリウムクローンをA1182と命名した。
【０１９２】 実施例５ トウモロコシの安定な形質転換に用いられる、MPr1139プロモーター（配列番
号１３）を含むバイナリープラスミドの作成。 バイナリープラスミドpMRT1207は、pMRT 1139の発現カセット「MPr1139（配列
番号１３）／uidA-IV2／term-nos」を、バイナリープラスミドpMRT1195（未公表
特許出願FR 9911112）のHpaI部位に挿入することによって得られた。
【０１９３】 これを行うために、７μｇのプラスミドpMRT1139を、３７℃で１時間、EcoRI
及びXmnIを用いて、連続的に消化した。それから、該発現カセットを、「Concer
t Rapid Gel Extraction System」キットを用いて、０．7％アガロースゲルにて
単離して、各dNTPs６０nmol、MgCl2緩衝液（５００mM）１２μｌ及びDTT（１M）
６μｌの存在下で、３７℃で３０分間、２０ＵのKlenow断片（New England Biol
abs）を作用させた。
【０１９４】 平行して、５μｇのバイナリープラスミドpMRT1195を、３７℃で１時間、HpaI
を用いて消化した。それから、その直線化ベクター断片を、緩衝液３（１Ｘ）の
存在下で、３７℃で１時間、４０Ｕの子ウシ腸アルカリホスファターゼ（New En
gland Biolabs）を用いて脱リン酸した。
【０１９５】 ライゲーションは、１００ngの発現カセットと１０ngのプラスミドpMRT1195を
用いて実施され、上述したような「GeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラ
ー内でのPCRサイクルを用いて処理された。Escherichia coli DH5a細菌は、予め
コンピテントにされており、該ライゲーション反応混合物の全てを用いて形質転
換された。得られたクローンのプラスミドDNAは、カナマイシン（５０mg/l)を補
充したLB培地にて選択し、アルカリ法に従って抽出して、酵素消化を用いて分析
した。
【０１９６】 得られたプラスミド、いわゆるpMRT1207を、実施例４のセクション４．１に記
載するように、LBA4404-pSB1 Agrobacterium tumefaciens株に移入した。この系
統は、A1177の生成についての上述のプロトコルに従って、プラスミドpSB1（未
公表特許出願FR 9911112）の組込み後のLBA4404 Agrobacterium tumefaciens株
から誘導されている。得られたクローンのプラスミドDNAを、リファンピシン（
５０mg/l)及びカナマイシン（５０mg/l）を補充した2YT培地にて選択し、アルカ
リ法に従って抽出し、これを、その細胞再懸濁緩衝液にリゾチーム（25 mg/ml）
を添加することによって修飾した。該プラスミドDNAを、酵素消化を用いて分析
し、得られたアグロバクテリウムクローンをA1207と命名した。
【０１９７】 （実施例６：トウモロコシ及びタバコの一過性発現における、様々なプロモータ
ーの活性の測定及び比較） ６．１ 植物抽出物の調製 ６．１．１． トウモロコシ種子の製造及び調製 一過性発現実験を、２４℃、湿度６０％及び、光１６時間／暗闇８時間の光周
期で、ファイトトロン中にて培養したトウモロコシ胚乳ＳＮ８７ １６５（Ｌ２
）に行った。
【０１９８】 授粉後（ＤＡＰ）１２日間で、トウモロコシを取り出し、２０％ドメストスの
バス中、５分間攪拌して滅菌した。滅菌脱塩水中で連続的に濯ぎ、ドメストスを
除去したことに続き、果皮及びアリューロン細胞の層を、無菌条件下で注意深く
除去した。胚乳の接線部分を、こうして抽出し、調製し、最少量のmurashige an
d Skoog媒質（MS 5524, Sigma）に浸した濾紙上においた。
【０１９９】 ６．１．２． タバコのイン・ビトロ培養、葉の調製 一過性発現実験を、品種ＰＢＤ６のタバコ（Nicotiana tabacum L.）の、６週
齢の葉に行った。品種ＰＢＤ６の成熟した種子を、次亜塩素酸酸カルシウムの飽
和溶液（70g/l）中で１０分間滅菌した後、滅菌脱塩水中で３度に渡って５分間
濯いだ。滅菌種子をＭＳ２０媒質（Murashige and Skoog, 1962）中におき、培
養チャンバー（２４℃の一定温度、光１６時間／暗闇８時間の光周期）中で６週
間インキュベートした。
【０２００】 生物論によるトランスフォーメーションの間、葉状葉肉の細胞の破壊を最小限
にするために、６週齢のＰＢＤ６タバコ植物の二つの主要な葉を、トランスフォ
ーメーションの２４時間前に取り除き、葉の上側を上向きにしてＢＹ３緩性原形
質分離培地（4.4g/lのＭＳ−５５１９塩、100mg/lのミオイノシトール、1mg/lの
チアミン、200mg/lのＫＨ2ＰＯ4、30g/lのスクロース、45.5g/lのソルビトール
、1mg/lの２．４Ｄ、8g/lのアガー、ｐＨ５．８）上に置き、培養チャンバー（
２５℃の一定温度、光１６時間／暗闇８時間の光周期）に置いた。
【０２０１】 ６．２ タングステンまたは金の微粒子へのプラスミドＤＮＡの吸着 生物論によるトランスフォーメーションでは、無水エタノール（９９．９８％
、水の含量０．０２％未満）中で１０分間滅菌し、無菌脱塩水で４回洗浄し、最
高で４週間、５０％のグリセリンの溶液中に−２０℃にて保存した、タングステ
ン製または金製の球状微粒子に、ＤＮＡを予め付着させることが必要である。
【０２０２】 トランスフォーメーションの際に使用される全てのコントロール及び試験プラ
スミドの濃度は、1mg/mlに調整した。調査したプロモーターの活性が、蛍光分析
アッセイを用いて評価される、各トランスフォーメーション実験において、様々
な実験（Leckie et al., 1994）におけるＧＵＳ活性における多様性を標準化す
るために、内部標準コントロール（ｐＣａＭＶ３５Ｓｌｕｃ）をコトランスフォ
ームさせた。しかしながら、調査したプロモーターの活性を、組織化学的アッセ
イを利用して測定した場合、参照プラスミドは、コトランスフォームさせなかっ
た。
【０２０３】 こうして調製した粒子への、ＤＮＡの被覆は、無菌の層状フローチャンバー内
で行った。５０％グリセリン３０μl中の、無菌粒子懸濁液のアリコートフラク
ション1.8mgを、１分間渦動させることによって激しく攪拌し、次いで１０秒間
、試験しようとするプラスミドの一つを５μg及び参照プラスミドｐＣａＭＶ３
５Ｓｌｕｃを２μg含有するＤＮＡ懸濁液２０μlと混合した。その後、２０μl
の２．５M ＣａＣｌ2を添加し、１０秒間激しく攪拌した。次に、２０μlの０．
１Ｍ スペルミジンを該混合物に添加し、この全体をさらに３０秒間渦動させる
ことによって攪拌した。ビーズ表面へのＤＮＡの被覆を、該混合物を氷中で１５
分間インキュベートすることによって継続した後、被覆ビーズを低速で５秒間遠
心分離させ、無水エタノール中で二度洗浄した。こうして被覆された粒子を、３
２μlの無水エタノール中に再懸濁させ、１５秒間渦動させることによって混合
し、次いで、製造者（Bio-Rad, Hercule, USA）の勧告に従って調製されたPDS-1
000／He Biolistic systemの無菌“ミクロキャリア”ディスク上に、４つの別個
のアリコートフラクションとして即座に分けた。“ミクロキャリア支持体／粒子
被覆を備えたミクロキャリア”セットを、５分間乾燥させた。
【０２０４】 ６．３ 生物論による、植物抽出物の一過性トランスフォーメーション ６．３．１ トウモロコシ胚乳発射体処理及び一過性発現 トウモロコシ胚乳への発射体処理を、装置の様々な部品の取り扱い及び組立に
関する、供給者（Bio-Rad, Hercule, USA）の一般的勧告に従って調製されたPDS
-1000／He Biolistic systemを用いて行った。各胚乳に、直径０．６μmのタン
グステン粒子を、下記の発射特性に従って、連続的に二度衝突させた： ・粒子を加速するために選択されるヘリウム圧は６２００kPa（９００psi）とす
る、 ・植物試料を、ビーズ加速領域から６cmに配置することとする、 ・発射は、２７mmHgの減圧下で行うこととする。
【０２０５】 発射体処理の後、胚乳を同一条件下に残し、２６℃の培養チャンバー内で、暗
所にて２４時間インキュベートし、細胞中に導入されたトランスジーンの一過性
発現を起こさせた。
【０２０６】 ６．３．２． タバコ葉状組織への刺激付与及び一過性発現 タバコ葉の刺激付与を、二つの例外： ・試料に、直径１μmの金の粒子で刺激付与することとした、 ・試料を、ビーズ加速領域から９cmに配置することとした、 を伴うが、トウモロコシ胚乳の刺激付与と同様の方法で行った。
【０２０７】 刺激照射の後、葉を同一条件下に残し、培養チャンバー（２５℃の一定温度、
光１６時間／暗闇８時間の光周期）内で、４８時間インキュベートし、細胞中に
導入されたトランスジーンの一過性発現を起こさせた。
【０２０８】 ６．４． 組織化学的染色による様々なプロモーターの活性の暴露と評価 ６．４．１． β-グルクロニダーゼ発現の暴露 ｂ-グルコロニダーゼ発現の暴露を、Jeffersson et al.により記載の組織化学
的染色によって実行した。培養チャンバー中でのインキュベート期間に続き、植
物抽出物を、β-グルクロニダーゼ基質Ｘ-Ｇｌｕｃ（500mg/lの５-ブロモ-４-ク
ロロ-３-インドリルグルクロニド）の存在下で、０．１Ｍリン酸緩衝液、０．０
５％のTriton X100中、ｐＨ７．０において、３７℃にて２４時間インキュベー
トした。
【０２０９】 染色の後、トウモロコシ胚乳を、直接分析するか、または、数週間４℃にて滅
菌状態に保持した。その一方で、タバコ葉を、９５％エタノール浴をそれぞれ３
時間と１２時間行う、連続的な二工程によって脱色した後、蒸留水中で濯ぎ、二
枚のセロファンシートの間で平らに乾燥させた。
【０２１０】 様々な恒星物のプロモーター活性を、各植物抽出物上に現れる青色斑の数及び
濃さを概算することによって評価した。
【０２１１】 ６．４．２． トウモロコシ胚乳中のプロモーターの活性の質的評価 ｂ-グルクロニダーゼ発現の組織化学的暴露により、三つのカテゴリーのプロ
モーターを同定することが可能になった。 ・ｐＭＲＴ１１９７、ｐＭＲＴ１１２６、ｐＭＲＴ１１２７及びｐＭＲＴ１１９
９構築物を撃ち込んだ胚乳は、呈示した青色斑の数が、系統的に１０未満であっ
た。ｐＭＲＴ１１９７構築物で形質転換した胚乳における青色斑の存在は、ＭＰ
ｒ１１９７（配列番号１６）の９６−ｂｐ配列が、ＨＭＷＧ-Ｄｘ５プロモータ
ー（配列番号０１）の最小プロモーター配列を構成し、これがトウモロコシ胚乳
における塩基性転写活性を導き得ることを示している。プロモーター配列のない
（ネガティブコントロール）、ｐＭＲＴ１１４４構築物を撃ち込んだ胚乳に青色
斑がないことにより、このカテゴリーにまとめたプロモーターの機能性が確認さ
れる。 ・ｐＭＲＴ１１２８、ｐＭＲＴ１２１３、ｐＭＲＴ１２１６、ｐＭＲＴ１２１７
、ｐＭＲＴ１１３６，ｐＭＲＴ１１３７、ｐＭＲＴ１１３５及びｐＭＲＴ１１３
８構築物を撃ち込んだ胚乳は、平均的に、ｐＭＲＴ１１２５（ＰｒＨＭＷＧ−Ｄ
ｘ５（配列番号０１））及びｐＭＲＴ１２１８（Ｐｒｇ−ｚｅｉｎ、ポジティブ
コントロール）構築物で形質転換された胚乳と同等の数の青色斑を呈した。 ・最後に、ｐＭＲＴ１１３０、ｐＭＲＴ１１３１、ｐＭＲＴ１１３９及びｐＭＲ
Ｔ１２００構築物を撃ち込んだ胚乳は、濃く、放散した青い染色を呈して、青色
斑の計数が困難であるが、これにより、ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）、ＭＰ
ｒ１１３１（配列番号０６）、ＭＰｒ１１３９（配列番号１３）及びＭＰｒ１２
００（配列番号１９）プロモーターが、授粉１２日間後のトウモロコシ胚乳中で
、非常に高度に活性であることが示唆される。
【０２１２】 ６．４．３． タバコ葉におけるプロモーターの活性の量的評価 ｐＭＲＴ１１２５（ＰｒＨＭＷＧ−Ｄｘ５（配列番号０１））、ｐＭＲＴ１１
３０、ｐＭＲＴ１１３１、ｐＭＲＴ１１３３、ｐＭＲＴ１１３４、ｐＭＲＴ１１
３５、ｐＭＲＴ１１３６、ｐＭＲＴ１１３７、ｐＭＲＴ１１３８及びｐＭＲＴ１
０９２（ＣａＭＶ ＰｒＤ３５Ｓ、ポジティブコントロール）構築物で形質変換
されたタバコ葉に行われた、図５に示される組織化学的アッセイの結果により、
四つのカテゴリーにおいて調査されたプロモーターを分類することが可能となっ
た。ｐＭＲＴ１１２５（ＰｒＨＭＷＧ−Ｄｘ５（配列番号０１））構築物を撃ち
込んだ葉には、青色斑は観察されなかった。ｐＭＲＴ１１３３、ｐＭＲＴ１１３
４、ｐＭＲＴ１１３６及びｐＭＲＴ１１３７構築物を撃ち込んだ葉は、平均的な
数として５０乃至１００の青色斑を示した。ｐＭＲＴ１１３５、ｐＭＲＴ１１３
８及びｐＭＲＴ１１３９構築物で形質転換した（結果は提示なし）葉は、参照構
築物ｐＭＲＴ１０９２（ＣａＭＶ ＰｒＤ３５Ｓ）を撃ち込んだ葉に観察される
のと同等の、かなりの数の青色斑を示した。最後に、ｐＭＲＴ１１３０及びｐＭ
ＲＴ１１３１構築物を撃ち込んだ葉は、参照構築物ｐＭＲＴ１０９２（ＣａＭＶ
ＰｒＤ３５Ｓ）を撃ち込んだ葉よりも格段に多数の、放散した、濃い青色斑を
呈した。
【０２１３】 これらの結果に鑑みて、幾つかの重要な情報を引き出すことができる： ・ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−１及びａｓ−２活性化配列は、タバコ葉中のＨＭＷ
Ｇ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）の活性を失わせる。 ・ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−１及びａｓ−２活性化配列は、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プ
ロモーター（配列番号０１）中に存在するcis−制御モチーフと相助的に作用す
る。「Ｇ」様ボックスが、この組み合わせコントロールの主要な要素の一つであ
ることがわかる。ＧＡＴＡボックスは、「Ｇ」”様ボックス及びＣａＭＶ ３５
Ｓ ａｓ−１及びａｓ−２活性化配列と共に、おそらくは、ＭＰｒ１１３０（配
列番号０５）及びＭＰｒ１１３１（配列番号０６）の非常に高い活性の原因であ
る。 ・ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−２活性化配列を複製することでは、顕著な正の、更
なる効果は確認されない。 ・「シリアルボックス」は、ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−１及びａｓ−２活性化配
列と共に、タバコ葉中での負の転写効果を裏付けることが判る。
【０２１４】 結論として、ＣａＭＶ Ｄ３５Ｓプロモーターは、文献中には一般的に、Ｃａ
ＭＶ Ｄ３５Ｓプロモーターによって与えられるよりも、ＧＵＳレポーター遺伝
子のプロモーター活性を約８乃至１２倍増大させる、キメラプロモーターである
と報告されている（Kay et al., 1987）ため、ＭＰｒ１１３５（配列番号０９）
、ＭＰｒ１１３８（配列番号１２）、ＭＰｒ１１３９（配列番号１３）、ＭＰｒ
１１３０（配列番号０５）及びＭＰｒ１１３１（配列番号０６）プロモーターは
、当然ながら、タバコ葉中で活性な、今日までに記載されたものとして最強のキ
メラプロモーターである。
【０２１５】 ＭＰｒ１１３３（配列番号０７）、ＭＰｒ１１３４（配列番号０８）、ＭＰｒ
１１３６（配列番号１０）及びＭＰｒ１１３７（配列番号１１）プロモーターは
、タバコ葉における活性がより弱いものであるが、耐性遺伝子の発現を導いて、
例えば“nos”タイプのプロモーターと同様の方法で形質転換植物を選択するこ
とができるため、これもまた有利である。
【０２１６】 ６．５ β-グルクロニダーゼ発現の蛍光分析アッセイによる、トウモロ
コシ胚乳中の様々なプロモーターの活性の定量化 予め生物論によりトランスフォームさせた胚乳を液体窒素中で冷凍し、ドリル
を取り付けたガラスロッドの補助を得て粉砕した。該粉末は、抽出バッファー（
２５mMのトリスホスフェート、ｐＨ７．８、２mMのジチオトレイトール、２mMの
１，２-ジアミノシクロヘキサン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-四酢酸、１０％グリセリ
ン、１％Triton X100）中に、２５０mgの組織につき1mlのバッファーという割合
で解凍された。該混合物をホモジェナイズし、その後、１６０６０gにて５分間
遠心分離によって分類する前に、４℃にて１時間インキュベートした。
【０２１７】 ＧＵＳ活性を、製造者の勧告に従って“GUS光化学発光レポーター遺伝子アッ
セイ”検出キット（Tropix Inc., Bedford, USA）を利用して、１０μlの清澄化
させた粗製の抽出物について測定した。光放出の測定を、Lumat LB 9507 lumino
meter (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Germany)を使用して行った。
【０２１８】 同時に、ルシフェラーゼ活性を、製造者の勧告に従って“ルシフェラーゼアッ
セイシステム”検出キット（Promega Corp., Madison, USA）を利用して、１０
μlの清澄化させた粗製の抽出物について測定した。光放出の測定を、４℃の冷
温室に置いたLumat LB 9507 luminometerを使用して行った。
【０２１９】 結果を図６及び７にまとめた。各アッセイ（３ハーフ胚乳＝１粗製抽出物）に
ついて、β-グルコニダーゼ活性と、ルミノメーターで測定したルシフェラーゼ
活性との間の比率を算出した。構築物当たり、少なくとも５の個々のアッセイの
平均及び、平均の標準誤差を決定した。
【０２２０】 本特許に記載した各プロモーターに至る様々な修飾の効果を分析するために、
前記プロモーターを二つの別個の群に分けた。Ｉ群（図６）は、ＨＭＷＧ-Ｄｘ
５プロモーター（配列番号０１）の精密な官能性開裂を実行することが可能なプ
ロモーターからなり、II群（図７）は、本特許において調査した多様なcis-活性
化成分の作用を決定することのできるプロモーターを、ＨＭＷＧ-Ｄｘ５プロモ
ーター（配列番号０１）と共に含む。
【０２２１】 Ｉ群は、ＭＰｒ１１２８、ＭＰｒ１１２７（配列番号０３）、ＭＰｒ１１２６
（配列番号０２）、ＭＰｒ１１９７（配列番号１６）、ＭＰｒ１１９８（配列番
号１７）、ＭＰｒ１２１６（配列番号２１）及びＭＰｒ１２１７（配列番号２２
）プロモーター、ＨＭＷＧ-Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）及び参照構築
物ｐＭＲＴ１１４４（ネガティブコントロール）を含み、この構築物はプロモー
ター配列（図６）を欠いている。蛍光分析アッセイの結果により、幾つかの情報
を導き出すことができる： ・ＨＭＷＧ-Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）の５’領域の段階的欠失によ
り、これらのプロモーターにより与えられる平均相対活性において、段階的減少
が起こる。したがって、全４１７−ｂｐ ＰｒＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター配
列（配列番号０１）が、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）の最大
活性を得るために必要とされていることが判る。 ・ＭＰＲ１１２８（配列番号０４）とＰｒＨＭＷＧ−Ｄｘ５（配列番号０１）プ
ロモーターとの間に記録された、活性の僅かな相違は、ヌクレオチド−２３８の
上流に位置する配列は、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）の活性
の原因である主要なcis-活性化成分を含まないことを示す。 ・ＭＰＲ１１２８（配列番号０４）及びＭＰｒ１１２７（配列番号０３）プロモ
ーターの間の活性における著しい減少により、ヌクレオチド−２０５の上流に位
置する配列が、これは「Ｇ」様ボックスを含むものであるが、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５
プロモーター（配列番号０１）の活性のために主要な役割を果たすことが示唆さ
れる。 ・ＭＰｒ１１２７（配列番号０３）及びＭＰｒ１１２６（配列番号０２）プロモ
ーターの間に記録された、活性の僅かな相違のため、エンハンサー成分の真の役
割に関して結論が出ない。 ・ＭＰｒ１１９７（配列番号１６）プロモーターの活性は、非常に弱いが、プロ
モーターを含まないｐＭＲＴ１１４４構築物によって得られるよりも強く、９６
−ｂｐ最小ＰｒＨＭＷＧ−Ｄｘ５（配列番号０１）が基本的転写レベルを与える
ことを示す。 ・ＭＰｒ１１２８（配列番号０４）と比較して、ＭＰｒ１１９８（配列番号１７
）の弱い活性は、ヌクレオチド−５９乃至ヌクレオチド−１３５に渡るＰｒＨＭ
ＷＧ−Ｄｘ５（配列番号０１）配列が、推定されるcis-活性化成分を欠いている
にも関わらず、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）の活性において
主たる役割を果たすことを示す。この結果は、「Ｇ」ボックス上及び活性化成分
上のtrans-活性化因子がＴＡＴＡボックスから離れている距離によって、これら
の機能性、ひいてはアクセシビリティを示唆する。 ・これには「Ｇ」ボックス及び活性化成分が含まれるが、ヌクレオチド−１３６
乃至ヌクレオチド−２２５に渡るＭＰＲ１１２８（配列番号０４）を複製するこ
とにより、ＭＰｒ１２１６プロモーター（配列番号２１）に、少なくともＰｒＨ
ＭＷＧ−Ｄｘ５（配列番号０１）に導かれるものと同等に高いｂ-グルクロニダ
ーゼ活性を与える。
【０２２２】 II群は、ＭＰｒ１１２８、ＭＰｒ１２１３（配列番号２０）、ＭＰｒ１１９９
（配列番号１８）、ＭＰｒ１１３６（配列番号１０）、ＭＰｒ１１３７（配列番
号１１）、ＭＰｒ１１３８（配列番号１２）、ＭＰｒ１１３１（配列番号０６）
、ＭＰｒ１１３５（配列番号０９）、ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）、ＭＰｒ
１１３９（配列番号１３）及びＭＰｒ１２００（配列番号１９）プロモーター、
ＨＭＷＧ−Ｄｘ５参照プロモーター（配列番号０１）並びに、ポジティブコント
ロールとして使用されるｇ−ｚｅｉｎプロモーター（図７）を含む。Ｉ群のプロ
モーターと同様の方法で、蛍光分析アッセイの結果により、幾つかの情報が導か
れる： ・ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−２（Lam and Chua, 1989）及びａｓ−１（Lam et al.
, 1989）活性化配列を、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）及びＨ
ＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）誘導体の−６５ｂｐ位で融合させ
ることにより、生成するＭＰｒ１１３０（配列番号０５）、ＭＰｒ１１３１（配
列番号０６）、ＭＰｒ１１３６（配列番号１０）、ＭＰｒ１１３７（配列番号１
１）、ＭＰｒ１１３５（配列番号０９）及びＭＰｒ１１３８（配列番号１２）プ
ロモーターの活性を、非常に大幅に高められる。目安として、ＭＰｒ１１３１（
配列番号０６）及びＭＰｒ１１３０（配列番号０５）プロモーターは、それぞれ
、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）に比べて３．２及び３．８倍
活性である。 ・ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−２及びａｓ−１活性化配列は、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロ
モーター（配列番号０１）のcis−活性化成分と相助的に作用する。ＭＰｒ１１
３１（配列番号０６）、ＭＰｒ１１３８（配列番号１２）、ＭＰｒ１１３７（配
列番号１１）及びＭＰｒ１１３６（配列番号１０）プロモーターの活性における
段階的な減少は、それぞれ、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番号０１）の
段階的な５’欠失と同時に起こるものであるが、これを保証している。 ・ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）及びＭＰｒ１１３５（配列番号０９）プロモ
ーターと、ＭＰｒ１１３１（配列番号０６）及びＭＰｒ１１３８（配列番号１２
）プロモーターとの比較は、それぞれ、ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−２活性化配列
の複製が著しい付加的な活性化効果は引き起こさないことを示す。 ・六倍体小麦Triticum aestivum L.cv Cheyenne (Anderson et al., 1998)のＢ
ｘ７サブユニットをコード化する、高分子量グルテニン遺伝子のプロモーターの
「シリアルボックス」を融合させると、ＭＰｒ１１３１（配列番号０６）及びＭ
Ｐｒ１１３８（配列番号１２）プロモーターの上流が、得られるＭＰｒ１１３９
（配列番号１３）及びＭＰｒ１２００（配列番号１９）プロモーターの活性を非
常に大幅に向上させる。目安として、ＭＰｒ１１３９（配列番号１３）及びＭＰ
ｒ１２００（配列番号１９）の活性は、ＨＭＷＧ−Ｄｘ５プロモーター（配列番
号０１）の場合よりもおよそ５．５倍高い。 ・ＭＰｒ１１２８プロモーターの「シリアルボックス」上流の融合に相当するも
のであるが、ＭＰｒ１２１３プロモーター（配列番号２０）の弱い活性は、「シ
リアルボックス」が、ＣａＭＶ ３５Ｓ ａｓ−２及びａｓ−１活性化配列と相
助的に作用して、ＭＰｒ１１３９（配列番号１３）及びＭＰｒ１２００（配列番
号１９）プロモーターの活性を強化することを示唆する。 ・最後に、ＭＰｒ１１２８（配列番号０４）プロモーターのトウモロコシ洗浄ウ
ィルス（ＭＳＶ）上流の遺伝子間領域の“Ｇｃ−ｒｉｃｈ”成分の融合は、得ら
れるＭＰｒ１１９９プロモーター（配列番号１８）の活性の増大には貢献しない
。逆に、“Ｇｃ−ｒｉｃｈ”成分は僅かに抑制作用を与えるようである。
【０２２３】 結論として、ＭＰｒ１１３９プロモーター（配列番号１３）及び ＭＰｒ１２
００（配列番号１９）プロモーターは、高レベルでの蛋白質発現を導くために植
物バイオテクノロジーにおいて通常使用されるＰｒｇ−ｚｅｉｎプロモーターよ
りも、それぞれ４及び３．９倍活性であるため、疑問の余地なく、トウモロコシ
胚乳における異種蛋白質の発現のレベルを向上させることのできる、強力なツー
ルである。さらにまた、ＭＰｒ１１３０（配列番号０５）、ＭＰｒ１１３１（配
列番号０６）、ＭＰｒ１１３５（配列番号０９）、ＭＰｒ１１３８（配列番号１
２）、ＭＰｒ１１３７（配列番号１１）及びＭＰｒ１１３６（配列番号１０）プ
ロモーターが、少なくともＰｒｇ−ｚｅｉｎプロモーターで得られるのと同等に
高い、トウモロコシ胚乳におけるｂ−グルクロニダーゼ活性を与えることに注目
に値する。最後に、より効果の低いプロモーターもまた、耐性遺伝子または酵素
の蛋白質をコード化する遺伝子の発現の制御をするために使用可能であるため、
非常に価値がある。
【０２２４】 実施例７ トウモロコシ及びタバコでの安定発現における種々のプロモーターの発現、及
びその活性の評価 7.1.アグロバクテリウム・ツメファシエンスでの、トウモロコシの安定な遺伝
子形質転換 用いたこの技術は、Ishida et al.(1996)により記載されている。長さが1.0乃
至1.2mmの未成熟胚(受粉後9乃至14日)を、LS-inf培地で洗浄し、次に、Ishida e
t al. (1996)の記載するようにしてアグロバクテリアの懸濁液に浸し、30秒間ボ
ルテックスにかけ、そして室温で５分間インキュベーションした。このようにし
て処置した未成熟な胚を、LS-AS培地で、暗所にて25°Ｃで3日間培養し、次に５
mg/lのホスフィノトリシン及び250 mg/lのセフォタキシムで補充したLSD1.5培地
へと移し、暗所で二週間、25°Ｃに置き、そして最後に10mg/lのホスフィノトリ
シン及び250mg/1のセフォタキシムで補充したLSD1.5培地で、暗所で３週間、25
°Ｃにおいた。このようにして得られたタイプIのカルスを単離し、断片化し、
そして10mg/lホスフィノトリシン及び250mg/1のセフォタキシムで補充したLSD1.
5培地へと移し、25°Ｃで3週間暗所に置いた。次に、タイプIカルスで、増殖し
たものを単離し、そしてホスフィノトリシン5mg/lとセフォタキシム250mg/1で補
充したLSZ培地に置き、光源下16時間/暗所8時間の光期間に、25°Ｃで2-3週間置
いた。再生した小植物を次に、光源下16時間/暗所8時間の光期間に、25°Ｃで1-
2週間、LSF1/2培地に置き、そして次にファイトトロン及び温室においた。
【０２２５】 7.2.アグロバクテリウム・ツメファシアエンスによる、タバコの安定な遺伝子
形質転換 タバコの形質転換(PBD6培養株のニコチアナ・タバカムL.)は、Horsch et al.
(1985)に記載されるようにして、6週齢のタバコ小植物由来の葉盤（foliar disc
）をin vitroで、組換えアグロバクテリアに感染させて行った。
【０２２６】 in vitroの培養物は全て、空調された領域であって、光強度が200μE.m-2.s-1
であり、光期間が、光源下16時間/暗所8時間であり、そして温度が25°Ｃである
領域において調製した。
【０２２７】 初期の共培養工程を除き、再生工程、増殖工程、及び発根工程は、多様な選択
性培地であって静菌剤、即ち400mg/lのオーグメンチン（augmentin）、及び選択
剤、即ち200又は100mg/lのカナマイシンで補充されたもので行った。
【０２２８】 使用した種々の工程及び培地は、以下の通りである： -アグロバクテリアを、5mlの2YT培地(10g/lバクトトリプトーン、5g/l酵母抽出
物、5g/l NaCI、pH7.2)であって最終濃度が6 mMのCaCl2、及び抗生物質で補充さ
れたもので、28°Ｃ48時間前培養し、CaC12及び抗生物質で補充した10mlの2YT培
地中の培養物を、28°Ｃで一晩調製した。この培養物を次に3000gで10分間遠心
し、そして細菌を10mlの液体のMS30(4.4g/lのM0404、SIGMA販売、30g/lのスクロ
ースで補充、pH5.7)に再懸濁する。 -共培養は、ほぼ1cm2の葉の外植片であって、in vitro小植物の葉から切り出し
たものを、ＭＳ30で１０倍に希釈したアグロバクテリアの懸濁液に20分間接触し
て行う。次に、このように処理した外植片を濾紙上ですぐに乾かし、そして固形
の共培養培地(CM)(MS30、ベンジルアミノプリン(BAP)1mg/l、インドール-3-酢酸
(IAA)0.1mg/l、寒天8g/l)で、48時間、空調された領域に置く。 -処置済みの外植片は次に、固形の再生培地(固形CM、オーグメンチン400mg/l、
カナマイシン200mg/l)に置く。2週間後に、外植片を同じ培地で継代培養（subcu
lture）する。 -2週間後、芽を固形の増殖培地(4.4g/lのM0404、SIGMA販売、20g/1スクロース補
充、pH5.7(液体MS20)、オーグメンチン400mg/l、カナマイシン100mg/l、寒天8g/
l)上で継代培養する。 -2週間後、形質転換した小植物を、固形の発根培地であって、増殖培地と同じも
のの上で継代培養する。発根は、2-3週間続き、その最後に当該小植物をジフィ
ーポット（jiffy pot）でファイトトロンへ取出し、10日間、光源下16時間/暗所
8時間の光期間、23°Ｃ、70%湿度に置き、そして次に温室に移す。
【０２２９】 7.3.トウモロコシ及びタバコの植物における、β-グルクロニダーゼ活性の測
定 β-グルクロニダーゼ活性を測定するため、トランスジェニック植物から取出
した試料を、液体窒素で凍結し、ドリルにマウントされたガラス製ロッドを使用
して粉砕した。この粉末を次に、抽出緩衝液(25mMトリスリン酸塩、pH7.8、2mM
ジチオスレイトール、2mM 1, 2-ジアミンシクロヘキサン、N,N,N’,N’-四酢酸
、10%グリセロール、1%Triton Ｘ100)に、250mgの組織当たり1ｍｌの緩衝液の比
率で再懸濁した。この混合物をホモジナイズし、次に4°Ｃで1時間インキュベー
ションしてから、16060ｇで5分間遠心して浄化した。
【０２３０】 GUS活性は、10μｌの清浄化済粗抽出物について、「GUS-光化学発光受容体遺
伝子アッセイ」検出キット（Tropix Inc., Bedford, USA)を、製造者の指示通り
に使用して測定した。光の放出の測定は、Lumat LB 9507光度計（luminometer）
(EGG-Berthold、Bad Wildbad、Germany)を使用して行った。
【０２３１】 粗抽出物中の全タンパク質量は、ブラッドフォード法(1976)により、「Bio-Ra
d タンパク質アッセイ」試薬(Bio-Rad、Munich、Germany)を使用して行った。
【０２３２】 7.4.トウモロコシの内胚乳及び葉における安定な発現、及びキメラプロモータ
ー活性 7.4.1.種子内での発現 トウモロコシの内胚乳での安定発現において、キメラのHMWGプロモーターで制
御されたβ-グルクロニダーゼ活性を、参照プロモーター512ガンマ-ゼインによ
り制御されるもの（これはトウモロコシの胚乳において活性が高いことが知られ
ている(Marzabal et al.1998)と比較した。穂軸（cob）当たり６つの種子を調査
したが、穂軸の頂点から始めて、基底部へと進み、異なる成長段階においておこ
なった。指標としては、３０ＤＡＰ段階が、受粉後30日のトウモロコシの種子に
対応する。β-グルクロニダーゼ活性の光量を、実施例７のセクション7.3に記載
の方法によりそれぞれの種子について測定した。
【０２３３】 図８には、30DAPで回収された未成熟なトウモロコシ中の安定発現中における
、キメラのHMWG-Dx5誘導プロモーター(MPrll39、MPrl200、及びMPrll3l)、及び
参照プロモーター512ガンマ-ゼインの制御下にあるβ-グルクロニダーゼ活性を
まとめた。植物のそれぞれのポピュレーションの活性の比較は、異なるプロモー
ターのそれぞれの強さを示すよい指標となる。プロモーターMPr1139、MPr1200、
及びMPr1131の制御下にあるβ-グルクロニダーゼ活性は、参照プロモーター512
ガンマ-ゼインの制御下のものの、平均で1.5乃至2倍大きいものである。しかし
ながら植物302.A3及び347.HIの種子は、それぞれGUSタンパク質をMPr1139及びMP
r1131プロモーター制御下に発現するものであるが、これらは参照プロモーター5
12ガンマ-ゼインの制御下での活性のそれぞれ7及び14倍のβ-グルクロニダーゼ
活性を示した。MPrll39,MPrl200、及びMPrll31のプロモーターの制御下でGUSタ
ンパク質を発現する植物においては、β-グルクロニダーゼ活性には顕著な差異
はなかった。しかしながら、β-グルクロニダーゼ活性は、植物のそれぞれのポ
ピュレーション中においてはかなり変動する。この現象は、植物に導入された大
部分の遺伝子においてすでに観察されているものであるが、これはトランス遺伝
子のポジショニング、及びコピー数によって説明することができる。発達におけ
る第13及び第18のDAP段階において行った、発光の測定（結果は示さない）は、
β-グルクロニダーゼ活性は時間とともに変動するが、第30DAP段階における最高
のβ-グルクロニダーゼ活性の原因であるプロモーターはまた、第13及び第18のD
AP段階のそれぞれにおける最強のプロモーターでもあることを示した。従って、
プロモーターの格付けは、発達中において維持された。図9のヒストグラムは、
プロモーターMPrll39制御下にあるβ-グルクロニダーゼ活性における一時的な変
動を示す。これらの結果は、GUS活性は、10DAPから検出可能であり、16から28DA
Pの間においてプラトーに達し、そしてその後30DAPまで下降することを示す。夏
の間に採取された植物において得られたGUS活性のプラトーはまた、発達の12及
び20DAPの間においても観察された(結果は示さず)。第13DAP(図10a)、第18DAP(
図10b）にあるトウモロコシの種子の縦断面、又は切開したトウモロコシ種子（
図10c）について行った組織化学的試験は、プロモーターMPrll39は、トウモロコ
シ種子中においては、胚乳（albumen）において特異的に発現していて、胚(embr
yo)、アリューロン、果皮のいずれにおいても染色は一切見られなかったことを
示した。更に、図１１に示されるヒストグラムは、MPr1139の発現は、安定であ
り、第二世代(T2)においてはさらに大きいことを示している。
【０２３４】 前出のデータより、以下の情報が集約される： -CaMV 35Sプロモーターの活性化配列as-l及びas-2を、プロモーター配列HMWG-Dx
5に融合すると、トウモロコシの胚乳おいて非常に強力なシス作動性配列となる
； -CaMV 35Sプロモーターの活性化配列as-1及びas-2は、トウモロコシの種子にお
いては、HMWG-Dx5プロモーターの活性を脱制御化（deregulate）しない（図１０
）； -シリアルボックス（cereal boxes）は、トウモロコシの種子での安定発現にお
いては、顕著なシス作動性を有せず、プロモーターMPr1131は、少なくともプロ
モーターMPr1139と同程度の活性を有する； -「G」ボックス上流に位置する、プロモーター配列HMWG-Dx5は、ヌクレオチドの
-238から-378pbまで伸長しているが、これはHMWG由来のキメラプロモーター内に
おいては、中心的な役割を演ずるものではなく、プロモーターMPr1200は、トウ
モロコシの種子での安定な発現においては、プロモーターMPr1139と同程度の活
性を有する。
【０２３５】 まとめると、HMWG由来のキメラプロモーター(MPr1139, MPr1131、及び MPr120
0)は、参照プロモーター512ガンマ-ゼインとしては最高の発現体（expressor）
である302.A3347.H1と比較して、平均すると1.5乃至2倍、またはそれ以上活性が
高いが、これはトウモロコシの胚乳において異種タンパク質を発現させることを
改善できる非常に有益なツールであることが明白である。本発明による、このHM
WG由来のキメラプロモーターはまた、単子葉植物の種子における内在性のタンパ
ク質の過剰発現においても利用でき、これにより、農業、例えばデンプンの産生
との関係においてイネやコムギの産生に対する興味を起させることとなる。
【０２３６】 7.4.2 葉における安定な発現 プロモーターMPr1139、MPr1131及びMPr1200の制御下のβ-グルクロニダーゼの
活性は、トウモロコシの葉における安定発現により決定した。β-グルクロニダ
ーゼ活性の発光測定は、実施例７のセクション7.3に記載の方法により行ったが
、それぞれの直径が２センチメートルの二つの葉盤（leaf disks）であって、ト
ウモロコシを温室で気候順応させた後３週間たったものからのものを使用した。
【０２３７】 植物のそれぞれのポピュレーションの活性を比較すると、キメラプロモーター
MPr1139, MPr1200、及びMPr1131の制御下にあるβ-グルクロニダーゼ活性は、51
2ガンマ-ゼインプロモーターの制御下でGUSタンパク質を発現している植物にお
いて測定したバックグラウンドのノイズよりも、最大で30倍大きく(図12)、更に
プロモーターMPr1139、MPr1200、及びMPr1131は、温室における気候順応後３週
間の発達段階におけるトウモロコシの葉においてはかすかに活性であるか、又は
全く活性がなかった。しかしながら、HMWG由来のキメラプロモーターの制御下で
GUSタンパク質を発現している、初代の形質転換体（小植物）の葉において、in
vitroの栽培の発根中にシステマティックに行った組織化学的試験は、青色の染
色を示した(結果は示さない）。
【０２３８】 これらの結果は、プロモーターMPr1139、MPr1200、及びMPr1131の活性は、低
いものの、トランスジェニックなトウモロコシの葉において早期の試験を行うに
は十分であり、毒性についての大きな危険性を一切有しないという点において、
非常に興味深い。
【０２３９】 7.5.タバコの葉及び種子におけるキメラプロモーターの安定な発現活性 7.5.1.葉における安定な発現 タバコにおいて、プロモーターMPr1130、MPr113l、MPr1135、MPr1138、及びMP
r1139の制御下にあるβ-グルクロニダーゼ活性の安定な発現を、CaMV D35Sプロ
モーターにより制御されるものと比較した。β-グルクロニダーゼ活性の発光測
定は、実施例７のセクション7.3に記載の方法により行ったが、直径がそれぞれ
２センチメートルの二つの葉盤であって、初代形質転換体の上から３番目（the
upper third）の基底部に位置するものを、温室への気候順応後、２、５、８、
及び１１週間の発達段階において行った。主としてランダムな組み込みにより導
入された受容体遺伝子の発現の程度と、発現カセットのコピー数とによる、変動
を制限するために、１０乃至３０の独立した形質転換体をそれぞれの構築物に対
して使用した。
【０２４０】 図１３に示される結果は、温室に気候順応して１１週のタバコの葉における、
HMWG由来のキメラプロモーター、及び参照プロモーターHMWG-Dx5及びCaMV D35S
の制御下にあるβ-グルクロニダーゼ活性の安定な発現を反映している。それぞ
れの植物のポピュレーションの活性の比較により、異なるプロモーターの個々の
強度がよくわかる。HMWG由来の、本発明のキメラプロモーターにより制御される
β-グルクロニダーゼ活性は、HMWG-Dx5プロモーターの制御下で測定されるもの
よりも、顕著に大きいが、CaMV D35S プロモーターの制御下にあるものよりもほ
ぼ5乃至10倍低い。異なるHMWGキメラプロモーターの中では、活性における顕著
な差異が観察されたが、プロモーターMPr1139は例外であり、これはわずかに活
性が低かった。温室に気候順応した後2、5、及び8週の発達段階における発光測
定(結果は示さない)は、β-グルクロニダーゼ活性は何れの植物においても経時
の増加は起さず、これは使用するプロモーターに関係しなかった。しかしながら
、１１週の発達段階で最強のプロモーターはまた、発達のより初期(温室での気
候順応後2、5、及び8週)におけるβ-グルクロニダーゼ活性においても最も高い
ものを付与した。従って、１１週の段階におけるプロモーターの格付けはまた、
タバコにおける他の段階にも適用される。
【０２４１】 このデータから、HMWG由来のキメラプロモーターは機能性であるが、タバコの
葉における安定な発現においては弱い活性しか示さないことが明らかである。本
発明者らは、活性化配列as-l及びas-2は、タバコの葉においてHMWG-Dx5プロモー
ターの活性を脱制御するが、HMWG-Dx5プロモーター配列に存在するシス作動性の
配列と、共同では強力な活性作用を付与しないと結論付ける。
【０２４２】 これらの結果と、一過性の発現実験において得られたものとの間の明らかな矛
盾を説明するため、二つの仮説を提案する： -HMWG由来のキメラプロモーターは、タバコの葉のバイオリスティック（biolist
ic）形質転換中における傷害及び／又はストレスにより誘導される； -安定なタバコ発現においては、HMWG由来のキメラプロモーターは、本質的に、
発達の何れの初期段階においても発現している。タバコのin vitroでの初代形質
転換体(小植物)について、再生段階において行った組織化学的試験は、HMWG由来
のキメラプロモーターのβ-グルクロニダーゼ活性が高いことを示した(結果は示
さない)。
【０２４３】 HMWG由来のキメラプロモーター、即ちMPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138、
及びMPr1139は、タバコの葉での安定発現においては活性が弱いものの、例えば
植物の代謝における生合成の経路において関与する酵素の発現を制御するのに使
用できる。これらはまた、植物に抵抗性、例えば抗生物質や除草剤に対する抵抗
性を付与する遺伝子であって、選択剤として有益なものとして使用できる。
【０２４４】 7.5.2.タバコの種子における安定な発現 β-グルクロニダーゼ活性は、それぞれの構築物に対して独立に得られた初代
形質転換体の１０乃至３０個より取った、成熟したＴ１タバコの種子(形質転換
体当たり100mg)における発光測定により決定した。構築物についての活性は、植
物ごとに変動したが(図14参照)、これはポジショニング効果、及びゲノム中のト
ランス遺伝子のコピー数により説明がつく。
【０２４５】 この結果は、HMWG由来のキメラプロモーターは、β-グルクロニダーゼ活性を
タバコの種子において、少なくともCaMV D35Sプロモーターと同程度に促進する
ことを示している。実際に、このプロモーターは、以下のように分類できる： -プロモーターMPr1130、MPr1131、及びMPr11391（これらはβ-グルクロニダーゼ
活性を、CaMV D35Sプロモーターと同程度にまで促進する）; -プロモーターMPr1135、及びMPr1138（これらは、CaMV D35Sプロモーターと比較
してタバコの種子において２倍活性である）。
【０２４６】 得られた結果は、以下のことを示している： -CaMV 35Sプロモーターの活性化配列as-l、及びas-2は、プロモーターMPr1135及
びMPr1138に見られる、「G様」ボックス及び「エンハンサ」配列のみを含むHMWG
由来のプロモーター配列において、重要なシス-活性化作用を付与する。従って
、CaMV35Sプロモーターの活性化配列as-l及びas-2は、HMWG-Dx5プロモーターに
存在するシス-作動性配列と共同で作用する。「G-様」ボックス及び「エンハン
サ」は、タバコの種子におけるこの組合せ制御において中心的な役割を演ずるも
のと考えられる。 -「Ｇ」ボックスの上流に位置するHMWG-Dx5プロモーターは、ヌクレオチド-378
から-238まで伸長するが、これはタバコの種子において、ネガティブなシス作動
性制御作用を、プロモーターMPr1130、MPr1131、及びMPr1139に付与する。 -CaMVプロモーターの活性化配列as-2の複製は、タバコの種子おいては、ポジテ
ィブな新規の付加効果を付与しない。実際に、MPr1131に対してのMPr1130におい
ても、MPr1138に対してのMPr1135においても、活性は一切異なっていない。 -「シリアル」ボックスは、タバコの種子において一切、新規の付加的シス作動
性作用を付与しないが、それは、プロモーターMPr1131及びMPr1139に対して得ら
れた結果が同じであるからである。
【０２４７】 プロモーターMPr1135及びMPr1138は、タバコの種子における安定発現において
は活性が高いが、これは双子葉植物、例えば農業経営的に興味有る植物等におけ
る異種タンパク質の発現を制御するのに強力なツールである。
【０２４８】 実施例８ EMWG-Dx5プロモーター(配列番号０１)を含む、バイナリプラスミドpMRT1231で
あって、タバコの安定な形質転換に使用するものの構築 バイナリプラスミドpMRT1231は、pMRT1125由来の発現カセット「HMWG-Dx5(配
列番号01)/uidA-IV2/term-nos」を、バイナリプラスミドpMRT1195のHpaI制限部
位に挿入することにより得た。これは、仏国特許出願FR9911112（公開予定）に
記載されるが、この関連する節を参照することにより本願に組み込む。
【０２４９】 これを行うために、7μｇのプラスミドpMRT1125を、連続してEcoRI及びXmnIで
1h、37°Ｃで消化した。次に「Concert Rapid Gel Extraction System」キット
を使用して発現カセットを0.7%アガロースゲルで分離し、そしてそれぞれ60ナノ
モルのdNTP、12μlのMgCl2 (500 mM)、及び6μlのDTT(1M)の存在下に、20単位の
クレノー断片(New England Biolabs)に30分間、37°Ｃで処理した。
【０２５０】 平行して、5μgのバイナリープラスミドpMRT1195を、HpaIで1h、37°Ｃで消化
した。線形化したベクター断片を、3バッファーの存在下に、40単位のウシ腸ア
ルカリホスファターゼ(New England Biolabs)に、37°Ｃで1時間処理した。
【０２５１】 ライゲーションは、100ngの発現カセット及び上記で得られた10ngのpMRT1195
プラスミドを、上述の「GeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラーにおいて
、連続してＰＣＲサイクルにかけて行った。予め調製しておいたコンピテント大
腸菌DH5αを、ライゲーション反応混合物の全てでもって形質転換した。得られ
たクローンのプラスミドDNAを、カナマイシン(50mg/l)で補充したLB培地上で選
択し、アルカリ法により抽出し、酵素消化により分析した。
【０２５２】 得られたプラスミドは、pMRT1231と命名したが、これを次に実施例４のセクシ
ョン4.1に記載されるようにして、アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA44
04-pSB1株にツランスファーしたが、この株は、A1177株を得るために最近文献に
公表されたプロトコールにより、プラスミドpSB1を組み込んだ後のアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスLBA4404に由来するものである。これは、仏国特許出
願FR9911112（公開予定）に記載されているが、この文献の関連する節を参照す
ることにより本願に組み込む。得られたクローンのプラスミドDNAは、リファン
ピシリン（50mg/l）、カナマイシン（50mg/l）、及びテトラサイクリン（5mg/l
）で補充した2YT培地上で選択し、アルカリ法（リゾチーム(25mg/ml)を細胞再懸
濁緩衝液に添加することで改変されたもの）により抽出した。得られたプラスミ
ドDNAを酵素消化で分析し、そして得られたアグロバクテリアをA1231と命名した
。
【０２５３】 タバコの安定な遺伝的形質転換は、実施例７のセクション7.2に記載してある
ようにして実施したが、但し、再生及び発達用の培地に使用した選択剤は、グル
フォシナート（それぞれ0，5、及び2mg/l）であった。
【０２５４】 実施例９ プロモーターMPr1131、MPr1200、及び512ガンマ-ゼインを含み、トウモロコシ
の安定な遺伝的形質転換に使用されるバイナリプラスミドの構築 9.1.バイナリプラスミドpMRT1263の構築 バイナリプラスミドpMRT1263は、発現カセット「MPr1131(配列番号06)/uidA-I
V2/term-nos」を、バイナリプラスミドpMRT1195のHpaI制限部位に挿入すること
により得た。これは、仏国特許出願FR9911112（未公開）に記載されるが、この
関連する節を参照することにより本願に組み込む。挿入は、実施例5と同様にし
たが、但し発現カセットは、プラスミドｐMRT1131より単離したものであり、こ
れは実施例３のセクションに記載されている。
【０２５５】 得られるプラスミドをpMRT1263と命名し、実施例５のセクション5.1に記載さ
れるプロトコールにより、これをアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA440
4-pSB1へトランスファーした。得られたアグロバクテリアクローンは、A1263と
命名した。
【０２５６】 9.2バイナリープラスミドpMRT1266の構築 バイナリプラスミドpMRT1266は、発現カセット「MPr1200(配列番号19)/uidA-I
V2/term-nos」を、バイナリプラスミドpMRT1195のHpaI制限部位へ挿入して得た
。これは仏国特許出願FR9911112（未公開）に記載されていて、この関連する節
のテキストを参照することにより本願に組み込む。挿入は、実施例5に記載して
あるようにして行ったが、但し、発現カセットはプラスミドpMRT1200（実施例３
のセクション3.10に記載）であった。
【０２５７】 得られたプラスミドをpMRT1266と命名し、そしてアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスLBA4404-pSB1株へ、実施例５のセクション5.1に記載のプロトコール
に準じてトランスファーした。得られたこのアグロバクテリアクローンをA1266
と命名した。
【０２５８】 9.3バイナリプラスミドpMRT1209の構築 トウモロコシの胚乳SN87165(L2)における安定発現の参照プロモーター配列を
得るため、プロモーター512ガンマ-ゼイン及びnosターミネータ（Marzabal et a
l.(1998)に記載の、526ガンマ-ゼインプラスミドに含まれる）の制御下にあるui
dA遺伝子を、バイナリプラスミドpMRT1195へ、実施例５に記載されるようにして
挿入したが、但し、発現カセットは、526ガンマ-ゼインプラスミドから単離した
ものとした。
【０２５９】 得られたプラスミドpMRT1209を、実施例５のセクション5.1のプロトコールに
準じてアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404-pSB1株へトランスファー
した。得られたこのアグロバクテリアのクローンは、A1209と命名した。
【０２６０】 [参考文献]
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従った合成的且つキメラプロモーター構築物を模
式的に表す図である。図１において、それらはコムギから由来し高分子量コムギ
グルテニンをコードする、Ｄｘ５遺伝子から由来するプロモーター全体から開始
する一連の欠失を含む構築物、並びに「Ｇ様」ボックスと組み合わせた「エンハ
ンサー」ボックスを含むエレメントの繰り返しを含む一連の構築物である。
【図２】 図２は、組み合わせた「ａｓ２／ａｓ１」ボックスを含む調節及び
／または機能的エレメントの挿入を含む、本発明に従った他の合成的且つキメラ
プロモーターの構築物を模式的に表す図である。
【図３】 図３は、組み合わせた「ａｓ２／ａｓ２／ａｓ１」ボックスを含む
調節及び／または機能的エレメントの挿入を含む、本発明に従った他の合成的且
つキメラプロモーターの構築物を模式的に表す図である。
【図４】 図４は、高分子量コムギグルテニンをコードするＢｘ７遺伝子から
由来する組み合わせた「シリアル」ボックス単独、若しくは「ａｓ２／ａｓ１」
ボックスと組み合わせたものを含む調節及び／または機能的エレメントの挿入を
含み、「ＧＣリッチ」ボックスを含む、本発明に従った他の合成的且つキメラプ
ロモーターの構築物を模式的に表す図である。
【図５】 図５は、ＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ）をコードする遺伝子
に機能的に連結した上述のプロモーター若しくはプロモーター核酸配列を含むベ
クターでトランスフォームされ、組織化学的検出の後、上記構築物でトランスフ
ォームされた細胞の存在、つまり該プロモーターの化成を示す青色のドットを含
む、タバコの葉の写真を表す。
【図６】 図６は、トウモロクシ胚乳での一過的発現の後の各種の構築物につ
いてのプロモーター活性を比較するグラフである。遺伝子銃処理の３日後、胚乳
をすりつぶし、粗抽出物を遠心分離によって透明にする。β−グルクロニダーゼ
活性及びルシフェラーゼ活性を、等量の粗抽出物に対して蛍光計によって測定し
、次いでＧＵＳ活性／ＬＵＣ活性比を測定する。棒グラフは、同じ構築物につい
ての比の平均＋／−平均の標準誤差（ＳＥＭ）に対応する。
【図７】 図７は、図６の続きであり、トウモロクシ胚乳での一過的発現の後
の各種の構築物についてのプロモーター活性を比較するグラフである。
【図８】 図８は、授粉後３０日（３０ＤＡＰ）での、トウモロコシ胚乳中で
の安定な発現における５１２ガンマ−ゼインプロモーターの活性に対する、ＭＰ
ｒ１１３９、ＭＰｒ１２００及びＭＰｒ１１３１のプロモーター活性を比較する
グラフを表す。β−グルクロニダーゼ活性及びタンパク質の全量を、蛍光計及び
分光計によってそれぞれ測定した。棒グラフは、各植物の種子毎に測定されたＧ
ＵＳ活性／全タンパク質の平均の比＋／−標準誤差に対応する。各トランスフォ
ーマントの名前が示されている。
【図９】 図９は、トウモロコシ胚乳において安定に発現するプロモーターＭ
Ｐｒ１１３９によって制御された一過的β−グルクロニダーゼ活性を表す。β−
グルクロニダーゼ活性及び全タンパク質の量を、蛍光計及び分光計によって測定
した。棒グラフは、異なる段階の発達で植物１５１．Ｃｌについての種子毎で測
定されたＧＵＳ活性／全タンパク質の平均比＋／−標準誤差に対応する。
【図１０】 図１０は、トウモロコシ胚乳の写真を表す。図１０ａは、１３Ｄ
ＡＰでのトウモロコシ種子の縦軸切片を表し、図１０ｂは、２０ＤＡＰでのトウ
モロコシ種子の縦軸切片を表し、図１０ｃは、切断されたトウモロコシ種子の先
端面である。全て、組織化学的染色によって顕視化された、トウモロコシ種子に
おいて安定に発現するプロモーターＭＰｒ１１３９の制御の下にあるβ−グルク
ロニダーゼ活性を表し、記号は以下のものを示す：Ｅ（胚）；Ｅｍ（胚乳）；Ａ
Ｃ（アリューロン細胞）；Ｐ（果皮）。
【図１１】 図１１は、授粉後１８日（１８ＤＡＰ）での、第二世代トランス
ジェニックトウモロコシ種子（Ｔ２）の活性に対して、第一世代トウモロコシ種
子（Ｔ１）におけるＭＰｒ１１３９のプロモーター活性を比較したグラフを表す
。β−グルクロニダーゼ活性及び全タンパク質の量を、それぞれ蛍光計及び分光
計で測定した。棒グラフは、各植物についての種子毎で測定されたＧＵＳ活性／
全タンパク質の平均比＋／−標準誤差に対応する。各トランスフォーマントの名
前が示されている。
【図１２】 図１２は、グリーンハウスにおける順応の３週間後の、トウモロ
コシ葉の安定に発現している５１２ガンマ−ゼインプロモーターの活性に対して
、ＭＰｒ１１３９、ＭＰｒ１２００及びＭＰｒ１１３１のプロモーター活性を比
較するグラフを表す。β−グルクロニダーゼ活性及び全タンパク質の量を、それ
ぞれ蛍光計及び分光計で測定した。棒グラフは、異なるトウモロコシ葉の葉にお
いて測定されたＧＵＳ活性／全タンパク質の比に対応する。各トランスフォーマ
ントの名前が示されている。
【図１３】 図１３は、グリーンハウスにおける順応の１１週間の段階での、
タバコ葉の安定に発現している参考プロモーターＣａＭＶＤ３５Ｓ及びＨＭＷＧ
−Ｄｘ５の活性に対して、ＭＰｒ１１３０、ＭＰｒ１１３１、ＭＰｒ１１３５及
びＭＰｒ１１３８のプロモーター活性を比較するグラフを表す。β−グルクロニ
ダーゼ活性及び全タンパク質の量を、それぞれ蛍光計及び分光計で測定した。棒
グラフは、異なるタバコ植物の葉において測定されたＧＵＳ活性／全タンパク質
の比に対応する。
【図１４】 図１４は、成熟第一世代タバコ種子において安定に発現する、参
考プロモーターＣａＭＶＤ３５Ｓの活性に対して、ＭＰｒ１１３０、ＭＰｒ１１
３１、ＭＰｒ１１３５、ＭＰｒ１１３８及びＭＰｒ１１３９のプロモーター活性
を比較するグラフを表す。β−グルクロニダーゼ活性及び全タンパク質の量を、
それぞれ蛍光計及び分光計で測定した。棒グラフは、異なるタバコ植物の種子に
おいて測定されたＧＵＳ活性／全タンパク質の比に対応する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マンフレット・テイセン フランス・Ｆ−63400・シャマリエール・ リュ・デ・ローゼラエ・１ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA79 CA01 DA01 FA02 FA06 FA07 4B065 AA88X AA88Y AB01 AB03 CA24 CA41 CA53

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来する
    少なくとも一つの核酸配列を含む発現のキメラプロモーター。
  2. 【請求項２】 高分子量コムギグルテニンをコードするコムギＤｘ５もしく
    はＢｘ７から由来する少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする、請求
    項１記載のキメラプロモーター。
  3. 【請求項３】 高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来する
    少なくとも一つの核酸配列を含み、該配列が配列番号０１のナンバーの下で同定
    されることを特徴とする、請求項１記載のキメラプロモーター。
  4. 【請求項４】 高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来する
    核酸配列が、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列
    番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番
    号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号
    １８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２のナンバー
    の下で同定される配列よりなる群から選択される配列より成ることを特徴とする
    、請求項１記載のキメラプロモーター。
  5. 【請求項５】 高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来する
    核酸配列を含み、該配列が３’位置で「ＴＡＴＡ」ボックスと転写開始部位（＋
    １）を含むことを特徴とする発現のキメラプロモーター。
  6. 【請求項６】 「ＴＡＴＡ」ボックスと転写開始部位（＋１）の上流の５’
    位置で機能的に連結した少なくとも一つの「エンハンサー」ボックスを含むこと
    を特徴とする、請求項５記載の発現のキメラプロモーター。
  7. 【請求項７】 「エンハンサー」ボックスの上流の５’位置で機能的に連結
    した少なくとも一つの「Ｇ様」ボックスを含むことを特徴とする、請求項６記載
    の発現のキメラプロモーター。
  8. 【請求項８】 「エンハンサー」ボックスの上流の５’位置で機能的に連結
    した少なくとも一つの「Ｐ様」ボックスを含むことを特徴とする、請求項６また
    は７記載の発現のキメラプロモーター。
  9. 【請求項９】 少なくとも「エンハンサー」ボックスの上流の５’位置で機
    能的に連結した少なくとも一つの「ＧＡＴＡ」ボックスを含むことを特徴とする
    、請求項６から８のいずれか一項記載の発現のキメラプロモーター。
  10. 【請求項１０】 「エンハンサー」ボックスの上流の５’位置で機能的に連
    結した少なくとも一つのシリアルボックスを含むことを特徴とする、請求項６か
    ら９のいずれか一項記載の発現のキメラプロモーター。
  11. 【請求項１１】 「エンハンサー」ボックスの上流の５’位置で機能的に連
    結した二つの連続的な「シリアル」ボックスを含むことを特徴とする、請求項６
    記載のキメラプロモーター。
  12. 【請求項１２】 転写開始部位の上流の５’位置で機能的に連結した、少な
    くとも一つの「ａｓ１」ボックス、もしくは少なくとも一つの「ａｓ２」ボック
    ス、またはボックスの組み合わせである「ａｓ１／ａｓ２」もしくは「ａｓ２／
    ａｓ１」、またはこれらの繰り返し順列を含むことを特徴とする、請求項５記載
    のキメラプロモーター。
  13. 【請求項１３】 「ａｓ１」、「ａｓ２」、「ａｓ１／ａｓ２」もしくは「
    ａｓ２／ａｓ１」ボックス、またはこれらの繰り返し順列が、エンハンサーボッ
    クスの下流の３’位置で機能的に連結していることを特徴とする、請求項１２記
    載のキメラプロモーター。
  14. 【請求項１４】 「エンハンサー」ボックスの上流に機能的に連結した二つ
    の「シリアル」ボックスを含むことを特徴とする、請求項６から１４のいずれか
    一項記載のキメラプロモーター。
  15. 【請求項１５】 「エンハンサー」ボックスの上流の５’位置で機能的に連
    結した二つの「シリアル」ボックスを含み、「エンハンサー」ボックス自体は「
    ａｓ２／ａｓ１」ボックスの上流の５’位置で機能的に連結していることを特徴
    とする、請求項６から１４のいずれか一項記載のキメラプロモーター。
  16. 【請求項１６】 逆の配向及び／または転写開始部位の３’位置での下流で
    機能的に連結した、「エンハンサー」ボックス、「Ｇ様」ボックス、「Ｐ様」ボ
    ックス、「ＧＡＴＡ」ボックス、「シリアル」ボックス、「ａｓ１」ボックス、
    「ａｓ２」ボックス、及び／または「ａｓ１／ａｓ２」ボックス若しくは「ａｓ
    ２／ａｓ１」ボックスといった任意に繰り返されるボックスの組み合わせ、並び
    に「ＧＣリッチ」ボックスより成る群から選択される少なくとも一つのエレメン
    トを含むことを特徴とする、請求項５から１５のいずれか一項記載のキメラプロ
    モーター。
  17. 【請求項１７】 配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０
    ５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０
    、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、
    配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２よ
    り成る群から選択される少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする、請
    求項６から１６のいずれか一項記載のキメラプロモーター。
  18. 【請求項１８】 高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来し
    、それ自体転写終結核酸配列に連結した生産されるポリペプチドをコードする発
    現される核酸配列に機能的な態様で連結している、少なくとも一つの核酸配列を
    含む発現カセット。
  19. 【請求項１９】 高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来す
    る少なくとも一つのプロモーター核酸配列を含み、該配列は配列番号０１のナン
    バーの下で同定されることを特徴とする、請求項１８記載の発現カセット。
  20. 【請求項２０】 高分子量コムギグルテニンをコードする遺伝子から由来す
    る核酸配列が、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配
    列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列
    番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、配列番
    号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２のナンバ
    ーの下で同定される配列よりなる群から選択される少なくとも一つの核酸配列よ
    り成ることを特徴とする、請求項１８記載の発現カセット。
  21. 【請求項２１】 配列番号０１のナンバーの下で同定される配列から由来す
    る配列に相当することを特徴とする、単離されたプロモーター核酸配列。
  22. 【請求項２２】 配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０
    ５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０
    、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、
    配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の
    ナンバーの下で同定される配列よりなる群から選択される配列に相当することを
    特徴とする、単離されたプロモーター核酸配列。
  23. 【請求項２３】 プロモーターもしくはプロモーター核酸配列が、請求項１
    から１７または２１または２２のいずれか一項記載のプロモーターもしくはプロ
    モーター核酸配列に対応することを特徴とする、生産されるポリペプチドをコー
    ドする核酸配列の転写を開始可能である、プロモーターもしくはプロモーター核
    酸配列を含むベクター。
  24. 【請求項２４】 ｐＭＲＴ１２０７，ｐＭＲＴ１１７７，ｐＭＲＴ１１７８
    ，ｐＭＲＴ１１７９，ｐＭＲＴ１１８０及びｐＭＲＴ１１８１のナンバーの下で
    同定されるバイナリーベクターよりなる群から選択されることを特徴とする、請
    求項２３記載のベクター。
  25. 【請求項２５】 ゲノム内に、請求項１から１７または２１または２２のい
    ずれか一項記載の少なくとも一つのプロモーターもしくは少なくとも一つのプロ
    モーター核酸配列を安定に挿入している、トランスジェニック植物。
  26. 【請求項２６】 ジャガイモ、タバコ、綿花、レタス、トマト、メロン、キ
    ュウリ、マメ、アブラナ、ビートの食用根、若しくはヒマワリのような双子葉植
    物種、またはコムギ、オオムギ、オートムギ、コメ、若しくはトウモロコシのよ
    うな単子葉植物種から選択される、請求項２５記載のトランスジェニック植物。
  27. 【請求項２７】 請求項２５または２６記載のトランスジェニク植物の繁殖
    体。
  28. 【請求項２８】 種子であることを特徴とする、請求項２７記載のトランス
    ジェニック植物の繁殖体。
  29. 【請求項２９】 請求項１から１７もしくは２１もしくは２２のいずれか一
    項記載のプロモーターもしくはプロモーター核酸配列のそれぞれを含む細胞。
  30. 【請求項３０】 植物細胞であることを特徴とする、請求項２９記載の細胞
    。
  31. 【請求項３１】 以下の工程： − 請求項１から１７または２１及び２２のいずれか一項記載の少なくとも一つ
    のプロモーター若しくは少なくとも一つのプロモーター核酸配列を含むベクター
    で細胞をトランスフォームする工程； − ポリペプチドをコードする核酸配列若しくは遺伝子の発現を許容する条件下
    で該細胞の培養物を調製する工程； を含むことを特徴とする、細胞中で生産されるポリペプチドをコードする核酸配
    列若しくは遺伝子を発現するための方法
  32. 【請求項３２】 該細胞が原核生物若しくは真核生物細胞であることを特徴
    とする、請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 該細胞が、微生物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、
    及び植物細胞よりなる群から選択される細胞であることを特徴とする、請求項３
    １または３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 該細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項３１か
    ら３３のいずれか一項記載の方法。
  35. 【請求項３５】 以下の工程： − 請求項１から１７または２１または２２のいずれか一項記載の少なくとも一
    つのプロモーター若しくは少なくとも一つのプロモーター核酸配列を含むベクタ
    ーで植物細胞をトランスフォームする工程； − 該プロモーター若しくはプロモーター核酸配列を挿入した植物細胞を選択す
    る工程； − 培養物中で、またはキメラ若しくはトランスジェニック植物全体を再生する
    ことによってのいずれかで、トランスフォームされ選択された植物細胞を増殖す
    る工程； を含むことを特徴とする、請求項３１から３３のいずれか一項記載の方法
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