JP2003510044A

JP2003510044A - トウモロコシ由来の種子優先的プロモーター

Info

Publication number: JP2003510044A
Application number: JP2001525342A
Authority: JP
Inventors: シューピンジャオ，; ジェフリーイー．ハッベン，; シャオムゥニウ，
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナショナル，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-09-24
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2003-03-18
Also published as: US6403862B1; HUP0202608A3; BR0014220A; AU4017801A; US20050198702A1; EP1214435A2; WO2001021783A3; HUP0202608A2; MXPA02003098A; CA2384973A1; WO2001021783A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物における異種ヌクレオチド配列の発現を調節するための組成物および方法を提供する。この組成物は、種子優先的プロモーターのための新規な核酸配列である。このプロモーター配列を用いて、植物において異種ヌクレオチド配列を発現するための方法も提供する。この方法は、本発明の種子優先的プロモーターに操作可能に結合する異種ヌクレオチド配列を含むように植物細胞を形質転換する工程、および形質転換植物細胞から植物を安定に形質転換された植物を再生する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、植物分子生物学の分野、より詳細には植物における遺伝子発現の調
節に関する。

【０００２】（発明の背景）植物宿主における異種ＤＮＡ配列の発現は、植物宿主において機能的である作
動可能に連結されたプロモーターの存在に依存する。プロモーター配列の選択は
、いつそして植物内のどこでその異種ＤＮＡ配列が発現されるのかを決定する。
植物の細胞にわたって持続した発現が所望される場合、構成的なプロモーターが
使用される。対称的に、刺激に応答して遺伝子発現が所望される場合、誘導プロ
モーターが選り抜きの調節エレメントである。特定の組織または器官における発
現が所望される場合、組織優先的な（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロ
モーターが使用される。すなわち、これらのプロモーターは、特定の組織または
器官における発現を駆動し得る。コアプロモーター配列から上流および／または
下流のさらなる調節配列は、トランスジェニック植物における異種ヌクレオチド
配列の種々のレベルの発現を起こすために、形質転換ベクターの発現カセットに
含まれ得る。例えば、米国特許第５，８５０，０１８号を参照のこと。

【０００３】調節配列はまた、内在性ＤＮＡの時間的および／または空間的発現を制御する
際に有用であり得る。例えば、分化した組織は、受精および種子発生に関与する
。これらの種子組織において活性であるプロモーターの同定が目的である。

【０００４】穀類の農学的重要性においては、種子形成は、植物発生の最終目的である。種
子は、食品、飼料および産業製品における使用のために収穫される。それらの種
子におけるタンパク質成分、油成分およびデンプン成分の量および割合は、この
種子の有用性および価値を決定する。

【０００５】種子発生のタイミングは、重大である。受精の前から種子成熟の間の任意の点
での環境条件は、生成される種子の質および量に影響を与え得る。特に、受粉後
の初めの１０〜１２日（遅滞期）は、トウモロコシの種子発生において重大であ
る。遅滞期の間のいくつかの発生的事象は、引き続く種子の生長および発達の運
命の重要な決定因子である。（Ｃｈｅｉｋｈ，Ｎ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｙ１０６:４５〜５１（１９９４））。従って、植物の発生、特に生
長のこの期の間のストレスの応答する植物の発生に影響を与えるための手段が目
的である。非生物的なストレスに曝された発生しつつある種子において活性なプ
ロモーター配列の同定が有用である。

【０００６】分化した植物組織が種子発生の中心である。受精後、発生しつつある種子は、
光合成の部位から篩部を介して移動された炭素のシンク（ｓｉｎｋ）になる。し
かし、発生しつつある穀類種子は、植物との直接的な維管束接続を有さない；そ
の代わり、短距離輸送機構が作用して、維管束組織から内乳および胚へ同化産物
（ａｓｓｉｍｉｌａｔｅ）を運ぶ。例えば、トウモロコシにおいては、光合成産
物が小柄を介して種子に入り；コムギでは、珠心の突出（ｎｕｃｅｌｌａｒｐ
ｒｏｇｅｃｔｉｏｎ）およびアリューロン層を介して種子に入る。篩部と内乳と
の間のこの短距離同化経路が作用して、グレイン（ｇｒａｉｎ）へのスクロース
輸送の速度を調節し得ることが可能である。（Ｂｅｗｌｅｙ，Ｊ．Ｄ．およびＭ
．Ｂｌａｃｋ．Ｓｅｅｄｓ：ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｎｄＧｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎ．Ｙ．，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓ
ｓ，１９８５．３８〜３９頁）。従って、これらの分化した組織（例えば、小柄
）内での遺伝子発現において活性なプロモーターは、グレイン発生に対する有意
な効果を有し得る。

【０００７】急速な種子生長の間、スクロースは、篩部から小柄柔組織のアポプラストへ受
動的にアンローディングされ、そして細胞壁結合酸性インベルターゼにより六炭
糖へ転化される。アポプラストにおけるスクロースの加水分解は、篩部からの持
続したアンローディングに都合のよい勾配を維持し、そして内乳基底細胞により
取りこまれる六炭糖を提供する。発育不全となるように誘導された種子が、イン
ビトロで小柄における低レベルのインベルターゼ活性しか有さないことが示され
ている。（Ｈａｎｆｔ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８６）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．
８１：５０３〜５１０）。

【０００８】開花間近の植物への水ストレスは、しばしば、種子の発育不全または制限され
た発生を生じる。研究は、スクロースが、低い房子水ポテンシャルで篩部からア
ンロードし続けるが、低いインベルターゼ活性に起因して、小柄のシンプラズム
（ｓｙｍｐｌａｓｍ）およびアポプラズム（ａｐｏｐｌａｓｍ）において蓄積す
ることを示唆する。（Ｚｉｎｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｃ，ら（１９９５）Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７：３８５〜３９１）。この結論は、Ｍｉｌｌｅｒおよ
びＣｈｏｕｒｅｙ（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ４：２９７〜３０５（１９９２））
の知見により支持され、彼らは、トウモロコシのｍｉｎｉａｔｕｒｅ−１種子の
発生の失敗が、種子発生の初期段階の間の小柄におけるインベルターゼ活性の欠
損に連鎖したことを示した。

【０００９】他の分化した植物組織はまた、受精および種子発生の重大なプロセスに密接に
関与する。例えば、トウモロコシにおいては、房子壁を形成する心皮は、果皮（
頑強な種子の外側保護被覆）になる。内乳に沿った胚盤は、発生しつつある胚へ
の同化産物の移動に関与する。アリューロン（内乳細胞の表層）は、発芽におい
て必要とされる酵素の供給源として作用するために発生する。（Ｋｉｅｓｓｅｌ
ｂａｃｈ，Ｔ．Ａ．ＴｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＲｅｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎｏｆＣｏｒｎ．Ｎ．Ｙ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，１９９９）。

【００１０】適切な穀類発生へのこれらの分化した種子組織の重要な寄与を考慮して、これ
らの組織における遺伝子発現に影響するプロモーター配列の同定は、有用である
。さらに、適切で重大な時間にこれらの特定の組織において活性なプロモーター
配列を同定することは望ましい。植物に対する環境ストレスにより負に影響しな
い、適切で重大な時間にこれらの特定の組織において活性なプロモーター配列を
同定することは、なおさらに望ましい。

【００１１】トウモロコシＧｌｂ１遺伝子は、グロブリン１（主要な胚所蔵タンパク質）を
コードする。（Ｋｒｉｚ，Ａ．Ｌ．ら（１９８６）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ
．８２：１０６９〜１０７５）。Ｇｌｂ１は、胚の発生の間に、発生しつつある
トウモロコシの種子において発現される。（Ｂｅｌａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら（１
９８９）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：６３６〜６４３）。Ｇｌｂ１のプ
ロモーター領域は、同定され、クローニングされ、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ媒介性形質転換によりタバコ植物へ導入された。（Ｌｉｕ，Ｓ．ら（１９
９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１６：１５８〜１６２）。形質
転換された植物は、Ｇｌｂ１プロモーターが所望の時間的特異性および組織特異
性を有することを示す。しかし、Ｇｌｂ１プロモーターは、アブシシン酸（ＡＢ
Ａ）により正に調節される。（Ｋｒｉｚ，Ａ．Ｌ．ら（１９９０）Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：５３８〜５４２；Ｐａｉｖａ，Ｒ．ら（１９９４）Ｐｌ
ａｎｔａ１９２：３３２〜３３９）。植物ホルモンＡＢＡのレベルは、冷気お
よび乾燥の条件下で変動することが公知である。（Ｈｉｍｍｅｌｂａｃｈ，Ａ．
ら（１９９８）Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．３５３：１４３
９〜１４４４）。従って、Ｇｌｂ１プロモーターの活性は、環境ストレスにより
示差的に影響され得る。種子の発生における重要な時間での特定の種子関連組織
におけるプロモーター配列活性についての必要性が存在し、そしてこれは、植物
への環境ストレスにより負に影響されない。特に、プロモーター活性が環境スト
レスにより下方制御されないことが望ましい。

【００１２】（発明の要旨）植物における遺伝子発現を調節するための新規ヌクレオチド配列を提供するこ
とは、本発明の目的である。

【００１３】種子優先的（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）な様式で転写を駆動し得る単離
されたプロモーターを提供することは、本発明のさらなる目的である。

【００１４】形質転換された植物の種子における外因性産物または内在性産物の改良された
制御の方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。

【００１５】形質転換された植物の種子の表現型における有用な変化を達成するための方法
を提供することは、本発明のさらなる目的である。

【００１６】形質転換された植物の種子における新規産物を産生するための方法を提供する
ことは、本発明のさらなる目的である。

【００１７】形質転換された植物の種子における新規機能を生成するための方法を提供する
ことは、本発明のさらなる目的である。

【００１８】形質転換された植物の種子の発生のタイミングまたは速度を調節するための方
法を提供することは、本発明のさらなる目的である。

【００１９】形質転換された植物の種子の発生しつつある種子における光合成産物の蓄積を
調節するための方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。

【００２０】種子の発生に関与する植物ホルモンの産生を調節するための方法を提供するこ
とは、本発明のさらなる目的である。

【００２１】種子の発生の間の種子の細胞周期機構を調節するための方法を提供することは
、本発明のさらなる目的である。

【００２２】従って、１つの局面では、本発明は以下：ａ）発生しつつある種子の、心皮、胚盤、小柄、果皮、アリューロン、または
小柄形成領域における発現を駆動し得る核酸；ｂ）種子発生の重大な期間の間に、発生しつつある種子の、心皮、胚盤、小柄
、果皮、アリューロン、または小柄形成領域における発現を駆動し得る核酸；ｃ）都合のよいかまたは都合の悪い生長条件の間に発生しつつある種子の、心
皮、胚盤、小柄、果皮、アリューロン、または小柄形成領域における発現を駆動
し得る核酸；ｄ）配列番号１に記載される配列の少なくとも２０連続したヌクレオチドの機
能的改変体またはフラグメントを含む核酸；ｅ）配列番号１に記載される核酸フラグメント；ｆ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１
つにハイブリダイズする核酸（ここで、ストリンジェントな条件は以下を含む：
０．５％ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣで６５℃にて３０分間洗浄され、そしてこ
れが繰り返された、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤ
Ｓ、１００ｕｇ／ｍｌサケ精子の溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション）
；ｇ）配列番号１に対して少なくとも６５％配列同一性を有する核酸（ここで％
配列同一性は、配列全体に基づき、そしてこれは、デフォルトパラメーターの下
でＢＥＳＴＦＩＴ分析により決定されるが、但し、このような相同配列はオオム
ギに由来しない）、からなる群より選択されるメンバーを含む単離された核酸に関する。

【００２３】他の局面では、本発明は、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモー
ターを含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、および少なくとも
１つの発現カセットをで安定に形質転換された植物に関する。

【００２４】さらなる局面では、本発明は、以下の工程を包含する、安定に形質転換された
植物の種子における発現を調節するための方法に関する：（ａ）少なくとも１つ
のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明のプロモーターを含む発現カ
セットで植物細胞を形質転換する工程；（ｂ）植物生長条件下で植物細胞を増殖
させる工程、および（ｃ）植物細胞から安定に形質転換された植物を再生する工
程（ここで上記連結されたヌクレオチド配列は、種子において発現される）。

【００２５】（発明の詳細な説明）本発明に従って、ヌクレオチド配列は、種子における転写の阻害を可能にする
ことを条件とする。本発明の配列は、種子形成および種子組織と関連する転写阻
害領域を含む。従って、本発明の組成物は、植物プロモーター、より具体的には
種子優先的プロモーターについての新規ヌクレオチド配列を含む。

【００２６】「種子」または「仁（ｋｅｒｎｅｌ）」は、植物のグレインまたは成熟した胚
珠、より広域には繁殖性植物構造体を含むことを意図する。用語「種子」および
「仁」は、本明細書中で互換可能に使用される。

【００２７】「種子優先的」は、胚、種子または仁、果皮、胚乳、珠心、アリューロン、小
柄などのうち少なくとも１つを含む、種子における有利な発現を意図する。

【００２８】「異種ヌクレオチド配列」は、プロモーター配列と共に天然に存在しない配列
を意図する。このヌクレオチド配列は、プロモーター配列に対して非相同である
が、これは、植物宿主に対して相同（ネイティブ）または非相同（外来）であり
得る。

【００２９】「プロモーター」は、特定のコード配列に関する適切な転写阻害部位における
ＲＮＡ合成を阻害するために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに指向し得るＴＡＴＡボ
ックスを通常含むＤＮＡの調節領域を意図する。プロモーターは、一般に上流ま
たはＴＡＴＡボックスの５’に位置する他の認識配列をさらに含み得、これは、
転写阻害速度に影響する上流のプロモーターエレメントをいう。本明細書中に開
示されるプロモーター領域に関する同定されたヌクレオチド配列を考慮すると、
本明細書中で同定される特定のプロモーター領域から上流の５’非転写領域にお
いてさらなる調節エレメントを単離および同定することが当該分野の１つの状態
の範囲内であることは理解される。従って、本明細書中に開示されるプロモータ
ー領域は、一般に、上流の調節エレメント（例えば、コード配列の組織発現およ
び時間的発現を担う調節エレメント、エンハンサーなど）を含むことによりさら
に規定される。同じ様式で、所望の組織（例えば、種子）における発現を可能に
するプロモーターエレメントが、同定され得、単離され得、そして種子優先的発
現を確実にするために他のコアプロモーターと共に使用され得る。

【００３０】本発明の単離されたプロモーター配列は、改変され、異種ヌクレオチド配列の
発現レベルの範囲を規定し得る。プロモーター領域全体より短い領域が、利用さ
れ得、そして種子優先的発現を駆動する能力は維持される。しかし、ｍＲＮＡの
発現レベルがプロモーター配列の部分の欠失で減少され得ることは理解される。
従って、このプロモーターは、弱いかまたは強力なプロモーターであるように改
変され得る。一般に、「弱いプロモーター」は、コード配列の発現を低レベルで
駆動するプロモーターを意図する。「低レベル」は、約１／１０，０００転写物
〜約１／１００，０００転写物〜約１／５００，０００転写物のレベルを意図す
る。逆に、強力なプロモーターは、コード配列の発現を高レベルで、または約１
／１０転写物〜約１／１００転写物〜約１／１，０００転写物にて駆動する。一
般に、単離されたプロモーター配列の少なくとも約２０ヌクレオチドは、ヌクレ
オチド配列の発現を駆動するために使用される。

【００３１】エンハンサーが転写レベルを増加させるために本発明のプロモーター領域と組
み合わせて使用され得ることは理解される。エンハンサーは、プロモーター領域
の発現を増加させるように作用するヌクレオチド配列である。エンハンサーは当
該分野で公知であり、これらとしては、ＳＶ４０エンハンサー領域、３５Ｓエン
ハンサーエレメントなどが挙げられる。

【００３２】用語「単離された」は、核酸またはタンパク質のような材料をいい、これらは
：（１）実質的にまたは必然的に、その天然環境において見出されるような材料
に通常付随するかまたは相互作用する成分を含まない。この単離された材料は、
必要に応じてその天然環境における材料と共に見出されない材料を含むか、また
は（２）その材料がその天然環境に存在する場合、この材料は、故意の人の介入
および／または細胞内の異なる位置に配置されることにより、合成的に変更され
るかまたは合成的に生成されている。この材料の合成的な変更または作成は、そ
の天然の状態にあるかまたはそれとは異なる材料に対して行われ得る。例えば、
天然に存在する核酸が非天然の合成法により変更または生成される場合、または
これが非天然の合成法により変更または生成されたＤＮＡから転写される場合、
この天然に存在する核酸は、単離された核酸になる。この単離された核酸はまた
、目的の遺伝子の１以上の対立遺伝子遺伝子形態の１部の合成的再配列（「シャ
ッフリング」）により生成され得る。同様に、天然に存在する核酸（例えば、プ
ロモーター）は、ゲノムの異なる遺伝子座に導入される場合、単離された状態に
なり得る。本明細書中で規定される場合、「単離された」核酸はまた、「異種」
核酸をもいう。

【００３３】プロモーター領域の単離のための方法は、当該分野で公知である。１つの方法
は、米国特許出願番号０６／０９８，６９０（１９９８年８月３１日出願）（本
明細書中で参考として援用される）に記載される。

【００３４】本発明のプロモーター領域についての配列は、配列番号１に記載される。

【００３５】本発明のプロモーター領域は、任意の植物から単離され得、これらの植物とし
ては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：トウモロコシ（Ｚｅａｍａ
ｙｓ）、カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ，Ｂｒａｓｓｉｄａｒａｐ
ａｓｓｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）、イネ（
Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）、モ
ロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍｖｕｌｇａｒｅ）
、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕ
ｍａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏ
ｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓ
ｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（ｌｐｏｍｏｅａｂａｔａｔｕ
ｓ）、カサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ
ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（
Ａｎａｎａｓｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類植物（Ｃｉｔｒｕｓｓｐｐ．）、カ
カオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅ
ｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａｓｐｐ．）、アボカドノキ（Ｐｅｒｓｅａａ
ｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓｃａｓｉｃａ）、バンジロウ（Ｐ
ｓｉｄｉｕｍｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃ
ａ）、オリーブ（Ｏｌｅａｅｕｒｏｐａｅａ）、オートムギ（Ａｖｅｎａｓ
ａｔｉｖａ）、野菜、鑑賞植物および針葉樹。好ましくは、植物は、トウモロコ
シ、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、カノーラ、コムギ、ライムギ、アルファルフ
ァおよびモロコシを含む。

【００３６】他の植物由来のプロモーター配列は、本明細書中に記載されるプロモーター配
列に対するそれらの配列相同性に基づいて周知の技術に従って単離され得る。こ
れらの技術においては、公知のプロモーター配列の全てまたは部分が、選択され
た生物由来の、クローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントの集団（すなわちゲ
ノムライブラリー）中に存在する他の配列に選択的にハイブリダイズするプロー
ブとして使用される。方法は、核酸配列のハイダイゼーションに関する分野にお
いて容易に利用可能である。

【００３７】プロモーター配列全体またはそれらの部分は、対応するプロモーター配列に特
異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下での特
異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、独特
である配列を含み、そして好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド長、そし
て最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である。このようなプローブ
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の周知のプロセスにより、選択された生物
由来の対応するプロモーター配列を増幅するために使用され得る。この技術は、
所望の生物由来のさらなるプロモーター配列を単離するために、または生物にお
けるプロモーター配列の存在を決定するための診断アッセイとして、使用され得
る。例としては、プレーティングされたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼー
ションスクリーニングが挙げられる（プラークまたはコロニーのいずれか：例え
ば、Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡＧｕｉｄｅ
ｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃＰｒｅｓｓを参照のこと）。

【００３８】用語「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件」は、他の配列よりも検出可能に大きな程度まで（例えば、バックグ
ラウンドの少なくとも２倍）、プローブがその標的配列にハイブリダイズする条
件を参照することを含む。ストリンジェントな条件は標的配列依存性であり、そ
してポリヌクレオチドの配列に依存して異なる。ハイブリダイゼーションのスト
リンジェンシーおよび／または洗浄条件を制御することにより、標的配列は、同
定され得、これは、プローブに対して１００％相補的である（相同性プロービン
グ）。あるいは、相同性のより低い程度を検出するために、ストリンジェンシー
条が適用されて、配列中のいくつかのミスマッチを可能にし得る（非相同性プロ
ービング）。一般に、このタイプのプローブは、約１０００ヌクレオチド長〜約
２５０ヌクレオチド長の範囲である。

【００３９】核酸のハイブリダイゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔ
ｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ，第１部，第２章「Ｏｖｅｒｖｉ
ｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎ
ｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅ
ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）；および
ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ，第２章，Ａｕｓｂｅｌら編，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎ
ｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）お
いて見出される。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。

【００４０】一般に、本発明のプロモーター配列に対応し、そして本明細書中に開示される
プロモーター配列にハイブリダイズする配列は、開示された配列と、少なくとも
５０％相同、７０％相同、そしてさらに８５％以上相同である。すなわち、プロ
ーブと標的との間の配列相同性は変化し得、少なくとも約５０％、約７０％そし
てさらに約８５％の配列類似性を共有する。

【００４１】特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重大
な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。一般に、ストリンジェ
ントな洗浄温度条件は、既定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列につい
ての融点（Ｔ_m）より約５℃〜約２℃低く選択される。ＤＮＡのこの融点すなわ
ち変性は、狭い温度範囲にしかわたらず、そして二重ヘリックスのその相補的な
一本鎖への崩壊を示す。このプロセスは、遷移の中間点の温度（Ｔ_m）により示
され、これはまた、融解温度と呼ばれる。式は、融解温度の決定について当該分
野で利用可能である。

【００４２】本発明のプロモーター配列のための好ましいハイブリダイゼーション条件は、
５０％（ｗ／ｖ）のホルムアミド、６×ＳＳＣ、０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、
１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中での、４２℃でのハイブリダイゼーション
を含む。典型的に低ストリンジェンシーの洗浄条件は、２×ＳＳＣ、０．５％（
ｗ／ｖ）のＳＤＳの溶液中で、４２℃、３０分でののハイブリダイゼーションお
よび反復を含む。典型的な中程度のストリンジェンシー条件は、２×ＳＳＣ、０
．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ中での、５０℃で３０分の洗浄および反復を含む。典
型的な高ストリンジェンシー条件は、２×ＳＳＣ、０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ
中での、６５℃で３０分の洗浄および反復を含む。本発明のプロモーターに対応
する配列は、上記全ての条件を用いて得られ得る。本発明を規定するために、高
ストリンジェンシー条件が使用される。

【００４３】比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の
最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔ
ｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅ
ｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）
の相同性整列アルゴリズムによって；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索
方法によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔ
ａｉｎＶｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラムにお
けるＣＬＵＳＴＡＬ；ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒ
ｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣ
Ｇ），５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
，ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴ
ＦＡＳＴＡ）によって実行され得；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎ
ｓおよびＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇ
ｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃ
ｏｒｐｅｔら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１６：１０８
８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら、ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓｉｎｔｈｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ８：１５５−６５（１９９
２）、およびＰｅａｒｓｏｎら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ２４：３０７−３１１（１９９４）によって十分に記載される
。ＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇ
ｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｌ））は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（
１９９３）Ｊ．ＭＯｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される；ｗｗ
ｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照のこと。

【００４４】本発明の配列に対する同一性は、少なくとも６５％配列同一性、より好ましく
は少なくとも７０％配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％配列同一性、
より好ましくは少なくとも８０％同一性、より好ましくは少なくとも８５％配列
同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、そして最も好ましくは少
なくとも９５％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を意味し、ここで、配
列同一性の割合はプロモーター領域全体に基づく。

【００４５】本発明の配列に高い割合の同一性を有する配列フラグメントはまた、作動可能
に連結された異種ヌクレオチド配列の種子優先的発現を促進するために操作され
た、本明細書中で開示される特定のプロモーターヌクレオチド配列のフラグメン
トをいう。これらのフラグメントは、本明細書中で開示される特定プロモーター
ヌクレオチド配列の少なくとも約２０個連続したヌクレオチド、好ましくは少な
くとも約５０個連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個連続
したヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約１００個連続したヌクレオ
チドを含む。このようなフラグメントのヌクレオチドは、通常、特定のプロモー
ター配列のＴＡＴＡ認識配列を含む。このようなフラグメントは、本明細書中で
開示される天然に存在するプロモーターヌクレオチド配列を切断するための制限
酵素の使用によって；天然に存在するプロモーターＤＮＡ配列からヌクレオチド
配列を合成することによって得られ得るか、またはＰＣＲ技術の使用を介して得
られ得る。詳細には、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍ
ｏｌ．１５５：３３５−３５０、およびＥｒｌｉｃｈ編（１９８９）ＰＣＲＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参
照のこと。かさねて、これらのプロモーターフラグメントの改変体（例えば、部
位特異的変異誘発から生じる改変体）は、本発明の組成物によって含まれる。

【００４６】配列番号１に記載される配列のうち少なくとも約２０個連続した配列を含むヌ
クレオチド配列が含まれる。これらの配列は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ
などによって単離され得る。このような配列は、種子優先的発現を駆動し得るフ
ラグメント、同様の配列を同定するためのプローブとして有用なフラグメント、
ならびに時間的特異性（ｔｅｍｐｏｒａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）または組
織特異性の原因であるエレメントを含む。

【００４７】このプロモーター配列の生物学的に活性な改変体はまた、本発明の組成物に含
まれる。調節「改変体」は、１つ以上の塩基が改変、除去または追加された調節
配列の改変形態である。例えば、ＤＮＡ配列の部分を除去するための慣用的な方
法は、二本鎖ＤＮＡクローンの非方向性のネスト化した欠失を生じるために、Ｄ
ＮＡ増幅と組み合わせてエキソヌクレアーゼを使用することである。この目的の
ための市販のキットが、Ｅｘｏ−Ｓｉｚｅ^TM（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ）の商品名で市販されている。手短に言う
と、この手順は、ＤＮＡテンプレートの５’オーバーハング、平滑末端、または
ニックで、３’から５’方向へとヌクレオチドを進行的に除去するために、エキ
ソヌクレアーゼＩＩＩをＤＮＡとインキュベートすることを伴う。しかし、エキ
ソヌクレアーゼＩＩＩは、３’、４−塩基のオーバーハングでヌクレオチドを除
去できない。この酵素を用いるクローンの時間を合わせた消化（ｔｉｍｅｄｄ
ｉｇｅｓｔｉｏｎ）は、非方向性ネスト化欠失を生じる。

【００４８】調節配列改変体の１つの例は、より大きなプロモーターからの１つ以上の欠失
によって形成されたプロモーターである。この転写開始部位の近くのＴＡＴＡボ
ックスまでの、プロモーターの５’位は、Ｚｈｕら，ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌ７：１６８１−８９（１９９５）に記載されるように、プロモーター活性
を無効にすることなく欠失され得る。このような改変体は、プロモーター活性（
特に、種子または種子組織における発現を駆動する能力）を保持すべきである。
生物学的に活性な改変体は、例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、ま
たは挿入を有する本発明のネイティブなプロモーター配列を含む。プロモーター
活性は、ノーザンブロット分析、転写性融合物を使用する場合のレポーター活性
測定などによって測定され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（
第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（これは、本明細書中に参考と
して援用される）を参照のこと。

【００４９】本発明のプロモーターについてのヌクレオチド配列、ならびにそのフラグメン
トおよび改変体は、目的の植物（より詳細には、植物の種子）における発現のた
めの異種ヌクレオチド配列と一緒に、発現カセットにおいて提供され得る。この
ような発現カセットは、このプロモーターの転写調節下であるべきヌクレオチド
配列の挿入のための複数の制限部位を伴って提供される。これらの発現カセット
は、所望の表現型応答を達成するための、任意の植物の遺伝子操作において有用
である。

【００５０】本発明のプロモーターによって発現される目的の遺伝子は、種子の種々の表現
型のために使用され得る。これは、種子における内因性産物または外因性産物の
増加した発現によって達成され得る。あるいは、この結果は、１つ以上の内因性
産物（特に、種子における酵素または補因子）の発現の減少の提供によって達成
され得る。これらの改変は、形質転換された種子の表現型における変化を生じる
。

【００５１】本発明の目的のための目的の遺伝子の一般的カテゴリーは、例えば、情報に関
与する遺伝子（例えば、Ｚｎフィンガー）、伝達に関与する遺伝子（例えば、キ
ナーゼ）、およびハウスキーピングに関与する遺伝子（例えば、熱ショックタン
パク質）を含む。導入遺伝子のより詳細なカテゴリーは、農学的品質、昆虫耐性
、疾患耐性、除草剤耐性、およびグレイン特性に関する重要な特色をコードする
遺伝子を含む。導入遺伝子のなお他のカテゴリーは、外因性産物（例えば、植物
および他の真核生物ならびに原核生物由来の酵素、補因子、およびホルモン）の
発現を誘導するための遺伝子を含む。任意の目的の遺伝子（ネイティブのコード
配列を含む）が、本発明のプロモーターに作動可能に連結され得、そしてこの種
子において発現されることが認識される。

【００５２】グレイン特性に影響する改変は、飽和および不飽和の脂肪酸のレベルの変更を
含む。同様に、リジン含有アミノ酸および硫黄含有アミノ酸のレベルの増加、な
らびに種子に含まれるデンプンの量および／または型の改変が所望され得る。ホ
ルドチオニン（ｈｏｒｄｏｔｈｉｏｎｉｎ）タンパク質改変の例は、１９９７年
４月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ９４／３８２；１９９７年３月２６日出願のＰＣ
Ｔ／ＵＳ９６／０８２１９；１９９７年３月２６日出願のＰＣＴ／ＵＳ９６／０
８２２０、および１９９７年１２月３０日発行の米国特許第５，７０３，４０９
号に記載され、これらの開示は本明細書中に参考として援用される。さらなる例
は、１９９６年３月２０日出願のＰＣＴ／ＵＳ９７／０４４０９に記載されるダ
イズ２Ｓアルブミンによって、およびオオムギ由来のキモトリプシンインヒビタ
ー（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５
：９９−１０６）によってコードされるリジンリッチおよび／または硫黄リッチ
な種子タンパク質であり、これらの開示は参考として援用される。

【００５３】より好ましい実施形態において、本発明のプロモーターは、他の組織優先的プ
ロモーターを有するタバコおよびカノーラにおいて示されるように、細胞周期の
レギュレーターとして作用するか、または炭水化物の代謝または植物ホルモンレ
ベルを制御するタンパク質をコードする遺伝子を調節する（Ｍａ，Ｑ．Ｈ．ら（
１９９８）ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙ
ｓｉｏｌｏｇｙ２５（１）：５３−５９；Ｒｏｅｃｋｅｌ，Ｐ．ら（１９９７
）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ６（２）：１３３−１４１）。プ
ロモーターの指導下での外因性ヌクレオチドまたは異種ヌクレオチドの発現は、
有害な環境条件下で他に変更され得る所望の種子表現型の維持を生じ得る。

【００５４】以下の遺伝子の誘導体は、コードされたポリペプチドにおける予め選択された
アミノ酸のレベルを増加するための部位特異的変異誘発によって作製され得る。
例えば、オオムギの高リジンポリペプチド（ＢＨＬ）をコードする遺伝子は、オ
オムギキモトリプシンインヒビターから誘導される（１９９６年１１月１日出願
のＰＣＴ／ＵＳ９７／２０４４１、および１９９７年１０月３１日出願のＰＣＴ
／ＵＳ９７／２０４４１；各開示は、本明細書中に参考として援用される）。他
のタンパク質は、メチオニンリッチな植物タンパク質（例えば、ヒマワリの種子
（Ｌｉｌｌｅｙら（１９８９）ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＷｏｒ
ｌｄＣｏｎｇｒｅｓｓｏｎＶｅｇｅｔａｂｌｅＰｒｏｔｅｉｎＵｔｉ
ｌｉｚａｔｉｏｎｉｎＨｕｍａｎＦｏｏｄｓａｎｄＡｎｉｍａｌＦ
ｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ，Ｈ．（編）；Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＯｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓＳｏｃ．，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＬ：４９７−５
０２（本明細書中に参考として援用される））；穀草（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１
９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａら（１
９８８）Ｇｅｎｅ７１：３５９（この両方は本明細書中に参考として援用され
る））；およびイネ（Ｍｕｓｕｍｕｒａら（１９８９）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１２：１２３（本明細書中に参考として援用される））由来）を含む。
他の重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ２、増殖因子、種子貯蔵因子
、および転写因子をコードする。

【００５５】種子における農学的特色は、環境ストレスの間の種子の成長および発達の応答
に影響する遺伝子（Ｃｈｅｉｋｈ−Ｎら（１９９４）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏ
ｌ．１０６（１）：４５−５１）、およびトウモロコシにおける種子の発育不全
を減少するために炭水化物の代謝を制御する遺伝子（Ｚｉｎｓｅｌｍｅｉｅｒら
（１９９５）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０７（２）：３８５−３９１）の
発現の変化によって改善され得る。

【００５６】昆虫耐性遺伝子は、ルートワーム（ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、ネキリムシ、Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎＣｏｒｎＢｏｒｅｒなどのような高い効力の障害（ｇｒｅａｔ
ｙｉｅｌｄｄｒａｇ）を有する害虫に対する耐性をコードし得る。このような
遺伝子は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ内毒素遺伝
子（米国特許第５，３６６，８９２号；同第５，７４７，４５０号；同第５，７
３７，５１４号；同第５，７２３，７５６号；同第５，５９３，８８１号；Ｇｅ
ｉｓｅｒら（１９８６）Ｇｅｎｅ４８：１０９）；レクチン（ＶａｎＤａｍ
ｍｅら（１９９４）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８２５）などを含む
。

【００５７】疾患耐性特性をコードする遺伝子は、解毒遺伝子（例えば、フモノシン（ｆｕ
ｍｏｎｏｓｉｎ）（１９９５年６月７日出願のＰＣＴ／ＵＳ９５／１０２８４）
に対する解毒因子）；無発病性（ａｖｒ）および疾患耐性（Ｒ）の遺伝子（Ｊｏ
ｎｅｓら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎら（１９
９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４３２；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓら（１９９４）
Ｃｅｌｌ７８：１０８９；など）を含む。

【００５８】遺伝子発現における変化はまた、商業的な目的の産物の型または量に影響し得
る；例えば、紙、織物およびエタノールの作製のためのデンプン。形質転換され
た植物の別の重要な商業的用途は、１９９７年２月１１日公開の米国特許第５，
６０２，３２１号に記載されるようなポリマーおよびバイオプラスチックの生成
である。Ｂ−ケトチオラーゼ（Ｂ−Ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ）、ＰＨＢａｓｅ
（ポリヒドロキシブチレートシンターゼ）およびアセトアセチル−ＣｏＡレダク
ターゼのような遺伝子（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ１７０（１２）：５８３７−５８４７を参照のこと）は、ポリヒドロキシア
ルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する。

【００５９】本明細書中で開示されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配
列は、標的化遺伝子についてのアンチセンス配列であり得る。「アンチセンスＤ
ＮＡヌクレオチド配列」によって、ヌクレオチド配列の５’から３’への正常な
配向に対して逆の配向である配列が意図される。植物細胞に送達される場合、ア
ンチセンスＤＮＡ配列の発現は、標的化された遺伝子に対するＤＮＡヌクレオチ
ド配列の正常な発現を防止する。このアンチセンスヌクレオチド配列は、標的化
された遺伝子に対するＤＮＡヌクレオチド配列の転写によって生成された内因性
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的であり、かつこのメッセンジャーＲ
ＮＡにハイブリダイズし得るＲＮＡ転写物をコードする。この場合、標的化され
た遺伝子によってコードされるネイティブなタンパク質の産生は阻害され、所望
の表現型応答が達成される。従って、本明細書中で開示されるプロモーター配列
は、アンチセンスＤＮＡ配列に作動可能に連結され得、植物の種子におけるネイ
ティブなタンパク質の発現を減少または阻害する。

【００６０】この発現カセットはまた、目的の異種ヌクレオチド配列の３’末端に、植物に
おいて機能的な転写終結領域および翻訳終結領域を含む。この終結領域は、本発
明のプロモーターヌクレオチド配列を伴ってネイティブであり得るか、目的のＤ
ＮＡ配列を伴ってネイティブであり得るか、または別の供給源由来であり得る。
好都合な終結領域は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミド（例えば
、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域）から入手可能であ
る。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：
１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ６４：６７１−６
７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５：１４１−１４
９；Ｍｏｇｅｎら（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１２６１−１２７２
；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ
ら（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：７８９１−７９０
３；Ｊｏｓｈｉら（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１５：９６
２７−９６３９もまた参照のこと。

【００６１】この発現カセットは、さらに５’リーダー配列を含み得る。このようなリーダ
ー配列は、翻訳を増大するために作用し得る。翻訳リーダーは当該分野で公知で
あり、そして以下が挙げられる：ピコルナウイルスリーダー（例えば、ＥＭＣＶ
リーダー（脳心筋炎５’非コード領域）、Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら（１９８９
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６１２６−６１３０）
；ポチウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）リーダー（例えば、ＴＥＶリーダー（タ
バコ食刻ウイルス（ＴｏｂａｃｃｏＥｔｃｈＶｉｒｕｓ））、Ａｌｌｉｓｏ
ｎら（１９８６））；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（
ＭａｉｚｅＤｗａｒｆＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１５４：９−２０；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ），Ｍａｃ
ｅｊａｋら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５３：９０−９４；アルファルファモ
ザイクウイルス（ＡＭＶＲＮＡ４）のコートプロテインｍＲＮＡ由来の非翻
訳リーダー，Ｊｏｂｌｉｎｇら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２５：６２２−６
２５；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ），Ｇａｌｌｉｅら（１９８９
）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲＮＡ，２３７−２５６頁；お
よびトウモロコシ萎黄病モトルウイルス（ｍａｉｚｅｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍ
ｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ）リーダー（ＭＣＭＶ），Ｌｏｍｍｅｌら（１９９１）
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８１：３８２−３８５。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９
８７）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ８４：９６５−９６８もまた参照の
こと。このカセットはまた、イントロンのような翻訳および／またはｍＲＮＡの
安定性を増大する配列を含み得る。

【００６２】特定の細胞小器官（特にプラスチド、アミロプラスト）、または内質細網に対
する異種ヌクレオチド配列の発現された産物を有することが所望されるか、また
は細胞表面または細胞外で分泌される場合、この発現カセットは、移行ペプチド
についてのコード配列をさらに含み得る。このような移行ペプチドは当該分野で
周知であり、そして以下が挙げられるがこれらに限定されない：アシルキャリア
タンパク質についての移行タンパク質、ＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニット、
植物ＥＰＳＰシンターゼなど。

【００６３】発現カセットの調製において、種々のＤＮＡフラグメントは、適切な配向で、
そして適切な場合、適したリーディングフレームでＤＮＡ配列を提供するために
操作され得る。この目的に関して、ＤＮＡフラグメントを結合するためにアダプ
ターまたはリンカーが使用され得るか、または他の操作が、好都合な制限部位の
提供、必要以上のＤＮＡの除去、制限部位の除去などに関与し得る。この目的の
ために、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限消化、アニーリング、およ
び再置換（例えば、転位および塩基転換）が関係し得る。

【００６４】本明細書中で記載するように、本発明は、プロモーターの制御下で目的の遺伝
子を発現し得るベクターを提供する。一般に、このベクターは、植物細胞におい
て機能的であるべきである。時々、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的（例えば、抗体
を産生するためのタンパク質の産生、ＤＮＡ配列の分析、挿入物の構築、核酸の
量の獲得）なベクターを有することが好ましくあり得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
クローニングおよび発現のためのベクターおよび手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
前出）において議論される。

【００６５】発現カセット中の異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明のプロモ
ーター配列を含む形質転換ベクターはまた、生物体内に同時形質転換されるべき
遺伝子についての、少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列を含み得る。あ
るいは、さらなる配列は、別の形質転換ベクターに提供され得る。

【００６６】植物において機能的なベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の二元性
プラスミドであり得る。このようなベクターは、植物細胞を形質転換し得る。こ
れらのベクターは、宿主（植物）の染色体への組み込みに必要な左および右の境
界配列を含む。最小限で、これらの境界配列の間は、プロモーターの制御下で発
現される遺伝子である。好ましい実施形態において、選択マーカーおよびレポー
ター遺伝子がまた、含まれる。十分な量のベクターの獲得の容易さのために、Ｅ
．ｃｏｌｉにおける複製を可能にする細菌起源が好ましい。

【００６７】レポーター遺伝子は、形質転換ベクターに含まれ得る。当該分野で公知の適切
なレポーター遺伝子の例は、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９９１）、Ｐｌ
ａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ，Ｇｅｌｖｉｎら
編（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ｐｐ．１−３
３；ＤｅＷｅｔら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３
７；Ｇｏｆｆら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９：２５１７−２５２２；Ｋａｉｎ
ら（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９：６５０−６５５；およびＣ
ｈｉｕら（１９９６）ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ６：３２５−３３０に
おいて見出され得る。

【００６８】形質転換された細胞または組織の選択のための選択マーカー遺伝子は、形質転
換ベクターに含まれ得る。これらは、抗菌耐性または除草剤に対する耐性を付与
する遺伝子を含み得る。適切な選択マーカー遺伝子の例としては、以下に対する
耐性をコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない：クロラムフェニ
コール（ＨｅｒｒｅｒａＥｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）ＥＭＢＯＪ．２：
９８７−９９２）；メトトレキセート（ＨｅｒｒｅｒａＥｓｔｒｅｌｌａら（
１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０３：２０９−２１３；Ｍｅｉｊｅｒら（１９９１
）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７−８２０）；ハイグロマイシン
（Ｗａｌｄｒｏｎら（１９８５）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３−
１０８；Ｚｈｉｊｉａｎら（１９９５）ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ１０８：
２１９−２２７）；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６−９１）；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇ
ｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄら（１９９６）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．５：１３
１−１３７）；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅら（１９９０）ＰｌａｎｔＭｏｌ
．Ｂｉｏｌ．７：１７１−１７６）；スルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（
１９９０）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７−１３６）；ブロモキ
シニル（Ｓｔａｌｋｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４１９−４２
３）；グリフォセート（Ｓｈａｗら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４７
８−４８１）；ホスフィノスリシン（ＤｅＢｌｏｃｋら（１９８７）ＥＭＢＯ
Ｊ．６：２５１３−２５１８）。

【００６９】トランスジェニック事象の回復における有用性を供給するが、最終産物におい
ては必要とされなくてもよい他の遺伝子としては、以下が挙げられるがこれらに
限定されない：ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８
７）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７）；ＧＦＰ（緑色蛍光
タンパク質）（Ｃｈａｌｆｉｅら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：８０２
）；ルシフェラーゼ（Ｔｅｅｒｉら（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：３４３）；
およびアントシアニン産物をコードするトウモロコシ遺伝子（Ｌｕｄｗｉｇら（
１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：４４９）のような例。

【００７０】発現カセット中の目的の異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明の
特定のプロモーター配列を含む形質転換ベクターは、任意の植物を形質転換する
ために使用され得る。この様式において、遺伝学的に改変された植物、植物細胞
、植物組織、種子などが得られ得る。形質転換プロトコルは、形質転換について
標的化された植物または植物細胞の型（すなわち、単子葉植物または双子葉植物
）に依存して変化し得る。植物細胞の形質転換の適切な方法としては、以下が挙
げられる：マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：３２０−３３４）；エレクトロポレーション（Ｒｉ
ｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：
５６０２−５６０６）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（例えば、Ｔ
ｏｗｎｓｅｎｄら、米国特許第５，５６３，０５５号を参照のこと）；直接遺伝
子転移（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：２７１７−２
７２２）；および衝撃粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅａｃ
ｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，
０５０号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，
ａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ：ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＭｅｔｈｏ
ｄｓ，ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ならびにＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６を参照のこと）。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１
９８８）ＡｎｎｕａｌＲｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆ
ｏｒｄら（１９８７）ＰａｒｔｉｃｕｌａｔｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８
８）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａ
ｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６（ダイ
ズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：７３６−７
４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９
８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｋ
ｌｅｉｎら（１９８８）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（
トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：
８３３−８３９；Ｈｏｏｙｄａａｓ−ＶａｎＳｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４
）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら
（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：５３４５
−５３４９（ユリ科）；ＤｅＷｅｔら（１９８５）、ＴｈｅＥｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＯｖｕｌｅＴｉｓｓｕｅ，Ｇ
．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎら編（Ｌｏｎｇｍａｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ），ｐｐ．１９
７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
Ｒｅｐｏｒｔｓ９：４１５−４１８；およびＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２）
Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（髭結晶（ｗｈｉｓ
ｋｅｒ）媒介形質転換）；Ｄ．Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）ＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３
）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２：２５０−２５５ならびにＣｈ
ｒｉｓｔｏｕら（１９９５）ＡｎｎａｌｓｏｆＢｏｔａｎｙ７５：４０７
−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ１４：７４５−７５０（アグロバクテリウムチュメファシエンス
を介するトウモロコシ）もまた参照のこと；これらの全ては本明細書中で参考と
して援用される。

【００７１】形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物中に増殖され得る。例えば、
ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ５
：８１−８４を参照のこと。次いで、これらの植物は増殖され得、そして同じ形
質転換系統または異なる系統を用いて受粉される。次いで、所望の表現型特性の
種子優先的な発現を有する得られたハイブリッドが、同定され得る。２つ以上の
世代は、所望の表現型特性の種子優先的な発現が安定に維持され、そして遺伝す
ることを確実にするために、増殖され得る。

【００７２】以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。

【００７３】（実施例）オオムギのｐＺＥ４０遺伝子に相同なトウモロコシ遺伝子に対するプロモータ
ー領域を単離し、そしてクローニングし、そして以下に記載するように、その発
現を試験した。

【００７４】（実施例１：ｍＺＥ４０−２プロモーターの単離：）オオムギのｐＺＥ４０遺伝子（Ｓｍｉｔｈ、Ｌ．Ｍ．ら；ＰｌａｎｔＭｏｌ
．Ｂｉｏｌ．２０：２５５−２６６（１９９２））に対するトウモロコシのオル
トログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を、ＰｉｏｎｅｅｒＨｉ−Ｂｒｅｄ国際所有デー
タベースにおいて同定した。３つのプライマーを、オルトログ配列に基づいて設
計した。

【００７５】配列番号２：ＧＣＣＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣ；配列番号３：ＧＣＧＧＴＣＴＣＣＡＣＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＴ；配列番号４：ＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＴＴ。このプライマーおよびＢ７３トウモロコシ遺伝子ＤＮＡを、ＧｅｎｏｍｅＷａｌ
ｋｅｒＫｉｔ^TM（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と組み合わせて使用し、プロモーターを
単離した。製造者のプロトコルに従い、そして約２．９Ｋｂの５’配列を得た。
上流配列の分析は、明らかなコントロール要素モチーフを全く示さなかった。次
いで、オオムギの配列に基づいて、第１のメチオニンで開始し、５’上流配列の
約１．６Ｋｂのフラグメントを単離した。制限部位を有する２つのプライマー（
配列番号５：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＡＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＡＣＣＴＡＴ
ＣＡＴＣＴＡＧおよび配列番号６：ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡ
ＧＴＣＧＡＡＧＧＡＡ）を設計し、そしてＰＣＲを使用して、当業者に公知の技
術を用いて、プロモーターフラグメントを単離した。次いで、プロモーターフラ
グメントを、形質転換ベクター内に挿入した（以下の実施例２を参照）。この構
築物をトウモロコシに形質転換し、そしてこの植物を使用して、プロモーター活
性を評価した。このフラグメントは、１６２６ｂｐ長（配列番号１）であり、そ
して設計されたｍＺＥ４０−２であった。

【００７６】（実施例２：ｍＺＥ４０−２プロモーターの発現：）この実施例で利用されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を、ｍＺＥ４０−２プ
ロモーターおよびＧＵＳレセプター遺伝子をコードする核酸を含むように改変し
、形質転換された細胞において発現させた。形質転換されるべき核酸を、Ｔ−領
域へと取り込み、そして少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列に隣接させる。

【００７７】Ｔｉプラスミドにおいて、Ｔ−領域は、ｖｉｒ領域と区別され、ｖｉｒ領域
の機能は、転移および組込みの原因となる。バイナリーベクターシステムは、外
来ＤＮＡを有する、操作された無害化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）されたＴ−ＤＮＡ、
およびｖｉｒ機能が別々のプラスミド上に存在するところで、発達した。このよ
うな形式で、外来ＤＮＡ（転移されるべき核酸）を含む改変Ｔ−ＤＮＡ領域を、
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製される小さなプラスミドに構築する。このプラスミド
を、三親（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ）接合において、適合し得るプラスミド運
搬ビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）遺伝子を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
へと、接合的に転移させる。ｖｉｒ機能が、ｔｒａｎｓに供され、Ｔ−ＤＮＡを
植物ゲノム内へ転移させる。好ましいベクターは、スーパー−バイナリーベクターである。例えば、米国特許
第５，５９１，６１６号およびＥＰＡ０６０４６６２Ａ１を参照のこと（本明
細書中で参考として援用される）。このようなスーパー−バイナリーベクターは
、極端に高い形質転換効率を示すスーパー−ビルレントＡｇｒｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＡ２８１内に含まれる、ＴｉプラスミドｐＴ
ｉＢｏ５４２（Ｊｉｎら（１９８７）Ｊ．ＧＢａｃｔｅｒｉｏｌ１６９：４４
１７−４４２５）のビルレンス領域から生じたＤＮＡ領域を含んで構築された（
Ｈｏｏｄら（１９８４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：７０２−７０９；Ｈｏｏｄ
ら（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２８３−１２９０；Ｋｏｍ
ａｒｉら（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：８８−９４；Ｊｉｎら
（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４４１７−４４２５；Ｋｏｍａ
ｒｉＴ．（１９８９）ＰｌａｎｔＳｉｅｎｃｅ６０：２２３−２２９；Ａ
ＴＣＣ寄託番号３７３９４）。

【００７８】スーパー−バイナリーベクターは、当該分野において公知であり、そしてｐＴ
ＯＫ１６２（日本国特許出願（公開）番号４−２２２５２７号、ＥＰ−Ａ−５０
４，８６７、ＥＰ−Ａ−６０４，６６２、および米国特許第５，５９１，６１６
号（本明細書中で参考として援用される））ならびにｐＴＯＫ２３３（Ｋｏｍａ
ｒｉ、Ｔ．（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ９：３０３−
３０６；およびＩｓｈｉｄａら（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ１４：７４５；本明細書中で参考として援用される）を含む。他のス
ーパー−バイナリーベクターは、上記の参考で述べられる方法によって、構築さ
れ得る。例えば、スーパー−バイナリーベクターｐＴＯＫ１６２は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉおよびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの両方において複製が可能である。さらに
、このベクターは、ｐＴｉＢｏ５４２のビルレンス領域由来のｖｉｒＢ、ｖｉｒ
ＣおよびｖｉｒＧ遺伝子を含む。このプラスミドはまた、抗生物質耐性遺伝子、
選択可能なマーカー遺伝子、および植物に形質転換されるべき、目的の核酸を含
む。

【００７９】スーパー−バイナリーベクターのＴ−領域および遺伝子発現の際の使用のため
の他のベクターを、伝達すべき遺伝子の挿入のために、制限部位を有するように
構築する。あるいは、形質転換すべきＤＮＡを、インビボの相同組換えを用いる
ことによって、ベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入し得る。Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓ
ｔｅｒｅｌｌａら（１９８３）ＥＭＢＯＪ．２：９８７−９９５；Ｈｏｒｃｈ
ら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：４９６−４９８）を参照のこと。この
ような相同組換えは、スーパー−バイナリーベクターがｐＢＲ３２２または他の
類似なプラスミドの領域と相同な領域を有するという事実に依存する。従って、
２つのプラスミドを一緒に挿入する場合、所望の遺伝子を、相同領域を介して遺
伝子組換えによって、スーパー−バイナリーベクターへ挿入する。

【００８０】この実施例のベクターを、当業者に公知の標準の分子生物学的技術を用いて構
築した。リポーター遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を、スーパー−バイ
ナリーベクターのＴ−ＤＮＡ境界間に挿入した。リポーター遺伝子は、β−グル
クロニダーゼ（ＧＳＧ）遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ．Ａ．ら、１９８６、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：８４４７−８４５１
）であり、このコード領域内に、ポテトのＳＴ−ＬＳ１遺伝子由来の第２のイン
トロンを挿入し（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２
０：２４５−２５０，１９９０）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける遺伝子
の発現を避けるために、イントロン−ＧＵＳを産生した（Ｏｈｔａ、Ｓ．ら、１
９９０、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３１（６）：８０５−８１３
）。ポテトのプロテアーゼインヒビター（ｐｉｎＩＩ）遺伝子のターミネーター
由来の塩基２〜３１０を含むフラグメント（Ａｎら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：
１１５−１２２、１９８９）を、下流でＧＵＳコード配列の平滑末端結合し、Ｇ
ＵＳ発現カセットを作製した。

【００８１】選択可能なマーカーのために、複製したエンハンサー領域を有するカリフラワ
ーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（２Ｘ３５Ｓ；Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｎｕ
ｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：２８７１−２８８８、１９８１からの塩基−４
２１位〜−９０位、および−４２１位〜＋２位）を作製した。ω−プライムリー
ダー配列（Ｇａｌｌｉｅ、Ｄ．Ｒ．ら、１９８７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５（８）：３２５７−３２７３）を含むフラグメントを
３５Ｓプロモーターの下流に挿入し、続いて、トウモロコシアルコール脱水素酵
素遺伝子ＡＤＨ１−Ｓ（Ｄｅｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２
：３９８３−３９９０、１９８４）の第１のイントロンを含むフラグメントを挿
入した。ＢＡＲコード配列（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ．６：２５１９
−２５２３、１９８７）を、リーダー配列の下流で、ＢＡＲのｐｉｎＩＩターミ
ネーター結合下流を用いて、クローニングし、ＢＡＲ発現カセットを作製した。

【００８２】要約すると、プラスミドを、ｐＳＢ１１上の右Ｔ−ＤＮＡと左Ｔ−ＤＮＡの境
界間に、ＧＵＳ発現カセットおｙびＢＡＲ発現カセットを挿入することによって
構築した。ＧＵＳカセットを、右Ｔ−ＤＮＡ境界の近位に挿入する。ｍＺＥ４０
−２プロモーターフラグメントを、イントロン−ＧＵＳ遺伝子の前で、ベクター
に挿入した。プラスミドｐＳＢ１１を、ＪａｐａｎＴａｂａｃｃｏＩｎｃ．
（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）から得た。ｐＳＢ２１からのｐＳＢ１１の構築、お
よび開始ベクターからのｐＳＢ２１の構築は、Ｋｏｍａｒｉらによって記載され
る（１９９６、ＰｌａｎｔＪ．１０：１６５−１７４）。このプラスミドのＴ
−ＤＮＡを、この２つのプラスミド間の相同組換えによって、スーパーバイナリ
ープラスミドｐＳＢ１（Ｓａｉｔｏら、ＥＰ６７２７５２Ａ１）へ組込ん
だ。プラスミドｐＳＢ１もまた、ＪａｐａｎＴａｂａｃｃｏＩｎｃ．から得
た。ｍＺＥ４０−２プロモーターを含むプラスミドを包むＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１
０１を、ｐＳＢ１１を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＬＢＡ４４０４と
接合し、Ｄｉｔｔａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７
：７３４７−７３５１、１９８０）の方法を用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４上に、融合体プラスミドを作製し
た。（米国特許出願第０８／７８８，０１８号、ＷＯ出願番号９８／３２３２６
（これらは、本明細書中で参考として援用される）も、さらなるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍによる形質転換の考察のために、参照のこと。）生じた同時組込みプラスミド（上記の三親接合由来の産物）を、遺伝子型（１
）Ｈｉ−ＩＩおよび（２）Ｈｉ−ＩＩ×ＰＨＮ４６へと形質転換した。（ＰＨＮ
４６についてのさらなる情報のために、米国特許第５，５６７，８６１号を参照
のこと。）Ｔ０植物を生成し、そして両方の遺伝子型由来のＴ１種子上で、プロ
モーター分析を行った。

【００８３】２６のトランスジェニック事象由来の未熟な種子を、受粉後、一定の間隔で収
集し、受粉後日数（ＤＡＰ）２日目に開始し、そして生理学的成熟度まで及んだ
。各種子を、毛瘢痕から小柄へと垂直に切り裂き、そして組織化学的染色によっ
て調べた。具体的には、各切片を、０．５％Ｘ−ｇｌｕｅ（まずＤＭＳＯに溶
解した、５−ブロモー４−クロロー３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸、ナ
トリウム塩）および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、０，１Ｍのリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液内でインキュベートした。切片を、
一晩３７℃でインキュベートしたが、いくらかの場合、切片を大規模に２〜３時
間以内で染色した。

【００８４】ほとんどの事象は、１０ＤＡＰ前に、心皮または果皮および小柄において大変
強くＧＵＳを発現した。１０と１５ＤＡＰの間、発現はアリューロンにほとんど
局在し、次いでおおよそ１５〜２０ＤＡＰには、ＧＵＳ染色も胚の胚盤側で観察
された。アリューロンおよび胚盤発現は、オオムギで観察された発現と一致し、
オオムギの遺伝子と一致する。取り入れに加えて、発達している種子、毛、殻、
葉、房および根も収集した。いくらかの事象の葉および根において、種々の発現
が観察された。組織およびプロモーターの時間的特異性は、Ｔ２世代において確
認された。

【００８５】本明細書中で述べられる出版物および特許出願は全て、本発明が関する、当業
者のレベルを示す。個々の出版物または特許出願の各々が、参考として援用され
ることを特別および個別に示されるのと同じ程度に、出版物および特許出願は全
て、ある程度、本明細書中で参考として援用される。

【００８６】前述の発明が、理解の明瞭さの目的のために、例示および例の方法で、いくら
か詳細に記載されるが、ある変化および改変が、添付される特許請求の範囲の範
囲内でなされ得ることは明らかである。

【００８７】（寄託）本発明のポリヌクレオチド配列を含むプラスミドは、２０００年６月１３日に
、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
ＣＣ）、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓ
ｓａｓ、ＶｉｒｇｉｎｉａＵＳＡ、２０１１０−２２０９によって寄託され、
そして寄託番号ＰＴＡ−２０２２を割り当てられた。この寄託は、Ｂｕｄａｐｅ
ｓｔＴｒｅａｔｙｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅＤｅｐｏｓｉｔｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓｆｏｒｔｈｅＰｕｒｐｏｓｅｏｆＰａｔｅｎｔＰｒｏｃｅｄ
ｕｒｅの条件のもと保持される。さらに、本特許出願の係属中に、寄託された培
養物へのアクセスは、ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒｏｆＰａｔｅｎｔｓａｎ
ｄＴｒａｄｅｍａｒｋｓにとって、および３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１１４条および３
５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２条のもと、それにタイトルを付けるべきＣｏｍｍｉｓｓｉ
ｏｎｅｒによって決められた人にとって、可能である。

【００８８】この寄託は、当業者のための便宜としてのみなされ、そして３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．
１１２条のもと寄託が必要とされるということを承認するものではない。寄託さ
れた材料の公に対する入手可能性に、寄託者によって課される制限の全ては、特
許の付与する場合、取り消されることなく除かれる。しかし、寄託の入手可能性
は、政府の行為によって付与される特許権を損なう際に、本発明を実施するため
にためのライセンスを構成しないことを理解すべきである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ハッベン，ジェフリーイー．アメリカ合衆国アイオワ 50322，アーバンデイル，サンフラワーサークル 8813 (72)発明者ニウ，シャオムゥアメリカ合衆国アイオワ 50131，ジョンストン，エヌ．ウィンウッドドライブ 6473 Ｆターム(参考） 2B030 AA00 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 CA04 DA01 EA04 FA02 FA06 GA11 4B065 AA88X AA88Y AA89X AB01 BA02 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】種子優先的な様式で転写を駆動し得る単離されたプロモータ
ーであって、該プロモーターは、以下：ａ）配列番号１に示される配列の、少なくとも２０個連続したヌクレオチドの
機能的改変体またはフラグメントを含む、ポリヌクレオチド；ｂ）配列番号１によって特徴付けられる、ポリヌクレオチド；ｃ）配列番号１に対して少なくとも６５％配列同一性を有するポリヌクレオチ
ドであって、該％配列同一性は、配列全体に基づいており、かつデフォルトパラ
メーター下でＢＥＳＴＦＩＴ分析によって決定され、そして該ポリヌクレオチド
は、オオムギ以外の植物由来である、ポリヌクレオチド；ならびにｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、またはｃ）のいずれか１つに
ハイブリダイズする核酸であって、ここで、該ストリンジェントな条件は、５０
％（ｗ／ｖ）のホルムアミド、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍ
ｌのサケの精子の溶液中における４２℃でのハイブリダイゼーション、６５℃で
の３０分間の０．５％のＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣによる洗浄、ならびに繰り
返しを包含する、核酸、からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離されたプロモーター。
【請求項２】トウモロコシから単離された、請求項１に記載のポリヌクレ
オチド。
【請求項３】請求項１に記載のプロモーターおよび該プロモーターに作動
可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該プロモータ
ーは、該発現カセットによって形質転換された植物の種子中において、該ヌクレ
オチド配列の転写および発現を開始し得る、発現カセット。
【請求項４】請求項３に記載の発現カセットを含む、形質転換ベクター。
【請求項５】請求項３に記載の発現カセットによって、安定に形質転換さ
れた、植物、またはその部分。
【請求項６】前期植物部分が、以下：細胞、プロトプラスト、細胞組織培
養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、種子、花、仁、雌穂、穂軸、葉、殻皮
、茎、根、根端、葯、および絹毛、からなる群から選択される、請求項５に記載
の植物部分。
【請求項７】前記植物が単子葉植物である、請求項５に記載の植物。
【請求項８】前記単子葉植物が、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、オー
トムギ、ライムギ、モロコシ、またはイネである、請求項７に記載の植物。
【請求項９】前記植物が双子葉植物である、請求項５に記載の植物。
【請求項１０】前記双子葉植物が、ダイズ、アルファルファ、ベニバナ、
タバコ、ヒマワリ、ワタ、またはカノーラである、請求項９に記載の植物。
【請求項１１】請求項５に記載の植物の種子。
【請求項１２】植物の種子において、第１のヌクレオチド配列を選択的に
発現するための方法であって、該方法は、発現カセットを含む形質転換ベクター
によって植物を形質転換する工程を包含し、該発現カセットは、プロモーター、
および該プロモーターに作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列を含み、
ここで、該プロモーターは、植物の種子において、該第１のヌクレオチド配列の
転写および発現を開始し得、ここで該プロモーターは、以下：ａ）配列番号１に示される配列の、少なくとも２０個連続したヌクレオチドの
機能的改変体またはフラグメントを含む、ポリヌクレオチド；ｂ）配列番号１によって特徴付けられる、核酸；ｃ）配列番号１に対して少なくとも６５％配列同一性を有するポリヌクレオチ
ドであって、ここで、該％配列同一性は、配列全体に基づいており、かつデフォ
ルトパラメーター下でＢＥＳＴＦＩＴ分析によって決定され、そして該ポリヌク
レオチドは、オオムギ以外の植物由来である、ポリヌクレオチド；およびｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、またはｃ）のいずれか１つに
ハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群から選択される第２のヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項１３】前記第１のヌクレオチド配列が、脂肪酸代謝に関与するポ
リペプチドをコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記第１のヌクレオチド配列が、タンパク質代謝に関与す
るポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】前記第１のヌクレオチド配列が、炭水化物代謝に関与する
ポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】前記第１のヌクレオチド配列が、植物ホルモン生合成に関
与するポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】前記第１のヌクレオチド配列が、細胞周期調節に関与する
ポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の方法。