ES2527272T3 - Plantas transgénicas modificadas para el transporte de cadmio reducido, productos derivados y métodos relacionados - Google Patents

Plantas transgénicas modificadas para el transporte de cadmio reducido, productos derivados y métodos relacionados Download PDF

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Abstract

Una construcción de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que correspondecomprendiendo o consistiendo la construcción en: una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con una parte de la SEQ ID NO: 3 o 47; una segunda secuencia; y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.

Description

Plantas transgénicas modificadas para el transporte de cadmio reducido, productos derivados y métodos relacionados.
CAMPO TÉCNICO
Composiciones, vectores de expresión, polinucleótidos, polipéptidos, plantas transgénicas, líneas celulares transgénicas y semillas transgénicas, y métodos para hacer y usar estas realizaciones para producir varias plantas que pueden reducir el transporte de metales pesados a partes aéreas.
ANTECEDENTES
Las plantas obtienen metales pesados esenciales, tales como Zn, Ni y Cu, absorbiendo sustratos de iones metálicos de su entorno por varios mecanismos de transporte mediados por los transportadores de transmembrana expresados en la superficie de las células de las raíces y otros tejidos vasculares. Los transportadores clasificados como ATPasas de tipo P, tales como las ATPasas de tipo P1B, son transportadores que translocan sustratos 15 positivamente cargados a través de las membranas plasmáticas usando energía liberada de reacciones de hidrólisis de ATP exergónicas. Las ATPasas de tipo P1B también se denominan ATPasas de metales pesados (“HMA”) o ATPasas de tipo CPx. Las HMA se han agrupado por especificidad de sustrato en dos clases, los grupos de Cu/Ag y Zn/Co/Cd/Pb. La primera ATPasa de tipo P1B en ser caracterizada en plantas es la AtHMA4, clonada de Arabidopsis. La selectividad de sustrato por las HMA no está estrictamente limitada al transporte de metales 20 esenciales en cuanto que pueden ser reconocidos varios metales no esenciales indiscriminadamente como sustratos, dando como resultado la acumulación de muchos metales no esenciales, tales como Cd, Ph As y Hg. Lugon-Moulin et al. (Advances in Agronomy 83:111-180, 2004) revisa procedimientos para reducir el contenido de cadmio de plantas del tabaco.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Varios aspectos de la invención se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas transgénicas incluyendo plantas del tabaco transgénicas, genéticamente modificadas para impedir el transporte de cadmio (Cd) desde el sistema radicular a la lámina foliar, reduciendo los niveles de expresión de transportadores de la familia de HMA. Se ha identificado un homólogo de la HMA (“NtHMA”) en el tabaco, que se puede usar para construir varias 30 construcciones de ARNi, que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, que pueden facilitar la degradación de transcritos de ARN de NtHMA endógenos. Las plantas transgénicas que pueden expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA según la invención, se pueden usar para reducir los niveles en estado de equilibrio de los transcritos de ARN de NtHMA, y por consiguiente, para reducir el número de transportadores de NtHMA funcionalmente activos disponibles para transportar metales a través de las membranas celulares. 35
Otros aspectos de la invención se dirigen a vectores de expresión recombinantes que comprenden varias construcciones de ARNi de NtHMA y productos consumibles que incorporan hojas derivadas de plantas transgénicas producidas según los métodos descritos.
Según la presente invención, se proporciona en un aspecto una construcción de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que corresponde, comprendiendo o consistiendo la construcción en:
una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con una parte de la SEQ ID NO: 3 o 47; 45
una segunda secuencia; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia,
en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia. 50
En la construcción de ARNi de NtHMA:
(a) la primera secuencia puede tener una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, un 55 fragmento del exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, un fragmento del exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, un fragmento del exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, un fragmento del exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, exón 5 como se define en la SEQ ID NO: 13, un fragmento del exón 5 como se define en la SEQ ID NO: 13, exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, un 60 fragmento del exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, un fragmento del exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, un fragmento del exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, un fragmento del exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, exón 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, un fragmento del exón 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25, y 65 un fragmento del exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25;
(b) la segunda secuencia puede tener una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, un fragmento del intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, intrón 2 como se define en la SEQ ID NO: 6, un fragmento del intrón 2 como se define en la SEQ ID NO: 6, intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, un fragmento del intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, un 5 fragmento del intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, un fragmento del intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, un fragmento del intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, intrón 7 como se define en la SEQ ID NO: 16, un fragmento del intrón 7 como se define en la SEQ ID NO: 16, intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, un fragmento del intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, un 10 fragmento del intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, un fragmento del intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, un fragmento del intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26, y un fragmento del intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26;
(c) la tercera secuencia puede tener una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia 15 seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, un fragmento de la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, un fragmento de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, un fragmento de la SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, un fragmento de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, un fragmento de la SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, un fragmento de la SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33, un fragmento de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, un fragmento de la SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, un fragmento de la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 20 un fragmento de la SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, y un fragmento de la SEQ ID NO: 37;
(d) la primera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 38, la segunda secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 39, y la tercera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 40;
(e) la primera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 42, la segunda secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 43, y la tercera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 44; o 25
(f) uno o dos o tres de (a), (b), (c), (d) y (e).
Además, en la construcción de ARNi de NtHMA, la primera y la segunda secuencia puede tener cada una, una longitud seleccionada del grupo que consiste en 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 30 nucleótidos y 600-700 nucleótidos.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende un promotor situado en la dirección 5’ y operativamente unido a la construcción de ARNi de NtHMA de la invención.
En el vector de expresión, el promotor se puede seleccionar del grupo que consiste en: un promotor específico de tejido, un promotor inducible y un promotor constitutivo.
Además según la presente invención, se proporciona una planta transgénica que comprende el ARNi de la invención y que tiene niveles de Cd reducidos en al menos una parte de la planta comparado con la parte en un homólogo no 40 transgénico.
La planta transgénica puede ser una planta de tabaco.
En otro aspecto, se proporciona un producto de tabaco consumible que incorpora hojas que comprenden el ARNi de 45 la presente invención y recogidas de la planta transgénica de la presente invención, de modo que las hojas tienen niveles reducidos de Cd comparado con hojas recogidas de un homólogo no transgénico cultivado en condiciones idénticas, en donde el producto tiene niveles reducidos de Cd comparado con un producto que incorpora hojas recogidas del homólogo no transgénico, y en donde el producto es un cigarro, un cigarrillo o un producto de tabaco sin humo. 50
En el producto de la invención, una reducción del % de Cd puede ser un valor de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
El contenido de Cd puede tener un valor en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
En un aspecto diferente de la presente invención, se proporciona un método para reducir los niveles de Cd en al 60 menos una parte de la planta, que comprende:
reducir niveles de un ARNm de NtHMA en la planta mediante la expresión de una construcción de ARNi, en donde la NtHMA se selecciona del grupo que consiste en:
un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de
al menos 70% con la SEQ ID NO: 1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B;
un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 3;
un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de 5 al menos 70% con la SEQ ID NO: 47;
un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido es un transportador NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B; y
un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene 10 una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B.
En el método de la invención, la construcción de ARNi puede comprender:
una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con una parte de la SEQ ID NO: 3 o 47;
una segunda secuencia; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia, 20
en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
Después de la expresión de la construcción de ARNi, la parte de la planta puede tener un contenido de Cd reducido en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 25 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
Adicional o alternativamente, después de la expresión de la construcción de ARNi, la parte de la planta tiene un contenido de Cd en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a 30 aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
Otros y varios aspectos (también referidos en la presente memoria como “realizaciones”) de la presente invención se describen más adelante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es una representación esquemática de un clon genómico de NtHMA que comprende 11 exones.
La figura 2A ilustra una estrategia de subclonación de ejemplo para construir un vector de expresión de ARNi de NtHMA que permite la expresión constitutiva de polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se describe en el ejemplo 2. 40
La figura 2B ilustra un dúpex de ARN bicatenario hipotético (como estructura de “tallo-bucle-tallo”) formado por interacciones de pares de bases intramoleculares en el polinucleótidos de ARNi de NtHMA producido como un producto transcrito de una construcción de ARNi de NtHMA de ejemplo.
La figura 3A muestra una secuencia de ARNi de ejemplo, NtHMA (660-915), para producir polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se describe en el ejemplo 2. 45
Las figuras 3B-3D muestran la reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de primera generación (TO) que representan 3 variedades, que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915), como se describe en el ejemplo 5.
La figura 4A muestra una secuencia de ARNi de ejemplo, NtHMA (1382-1584), para producir polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se describe en el ejemplo 3. 50
Las figuras 4B-4D muestran la reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de primera generación (TO) que representan 3 variedades, que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA (1382-1584), como se describe en el ejemplo 5.
Las figuras 5A-C muestran los niveles de transcrito de ARN de NtHMA normalizados en varias líneas transgénicas de primera generación (TO) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos 55 de ARNi de NtHMA de interés, determinado por análisis por PCR cuantitativo en tiempo real de extractos de lámina foliar, como se describe en el ejemplo 6.
La figura 6 muestra la distribución de Cd y Zn entre la lámina foliar y la raíz de varias líneas transgénicas de primera generación (TO) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la tabla 2 y se describe en el ejemplo 7. 60
La figura 7 muestra la distribución de Cd entre los tejidos de la corteza (“B”), lámina foliar (“L”), médula (“P”) y raíz (“R”) de varias líneas transgénicas de primera generación (TO) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la tabla 3 y se describe en el ejemplo 8.
La figura 8 muestra la distribución de Cd entre la lámina foliar (“L”) y la raíz (“R”) de varias líneas transgénicas 65 de segunda generación (T1) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de
NtHMA de interés, como se describe en el ejemplo 9.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. Aislamiento de genes de NtHMA del tabaco y productos génicos 5
La figura 1 es una representación esquemática de un clon genómico de NtHMA que comprende 11 exones que codifican un transportador de metales pesados relacionado con la familia de HMA de transportadores. El ejemplo 1 describe además la identificación del clon genómico de NtHMA (_HO-18-2) y 4 clones de ADNc de NtHMA. La tabla 1 más adelante, proporciona posiciones de nucleótidos que corresponden a subregiones de exones e intrones cartografiadas en el clon genómico de NtHMA (_HO-18-2). 10
A. Polinucleótidos de NtHMA
El término “polinucleótido” se refiere a un polímero de nucleótidos que comprende al menos 10 base de longitud. Los polinucleótidos pueden ser de ADN, ARN o un híbrido de ARN/ARN, que comprenden ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, combinaciones de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y combinaciones de bases y/o 15 modificaciones, que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina e isoguanina. El término incluye formas de ARN o ARN mono o bicatenarias. El término “ADN” incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintetizados químicamente, ADN amplificados por PCR, y combinaciones/equivalentes de los mismos. La expresión “polinucleótido aislado” se refiere a un polinucleótido no contiguo con ningún genoma de origen, o separado de un contexto natural. La expresión incluye cualquier molécula de polinucleótido recombinante tal como 20 construcciones de ARNi de NtHMA, vectores de expresión de ARNi de NtHMA, clones genómicos de NtHMA, y fragmentos y variantes de los mismos.
Como se muestra en la figura 1, el clon genómico de NtHMA, designado como SEQ ID NO: 1, comprende: intrón 1 (SEQ ID NO: 4), exón 1 (SEQ ID NO: 5), intrón 2 (SEQ ID NO: 6), exón 2 (SEQ ID NO: 7), intrón 3 (SEQ ID NO: 8), 25 exón 3 (SEQ ID NO: 9), intrón 4 (SEQ ID NO: 10), exón 4 (SEQ ID NO: 11), intrón 5 (SEQ ID NO: 12), exón 5 (SEQ ID NO: 13), intrón 6 (SEQ ID NO: 14), exón 6 (SEQ ID NO: 15), intrón 7 (SEQ ID NO: 16), exón 7 (SEQ ID NO: 17), intrón 8 (SEQ ID NO: 18), exón 8 (SEQ ID NO: 19), intrón 9 (SEQ ID NO: 20), exón 9 (SEQ ID NO: 21), intrón 10 (SEQ ID NO: 22), exón 10 (SEQ ID NO: 23), intrón 11 (SEQ ID NO: 24, exón 11 (SEQ ID NO: 25), e intrón 12 (SEQ ID NO: 26). Para las secuencias, véase la Lista de secuencias más adelante. Los ejemplos de referencia se dirigen a 30 aislar polinucleótidos que representan fragmentos genómico aislados en el locus de NtHMA, que comprenden la SEQ ID NO: 1, fragmentos de la SEQ ID NO: 1, o variantes de los mismos. Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes de polinucleótidos de NtHMA aislados que comprenden una identidad de secuencia de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 1, o fragmentos de la SEQ ID NO: 1. 35
Los ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados que tienen secuencias que complementan las de variantes de polinucleótidos de NtHMA que comprenden una identidad de secuencia de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 1, o fragmentos de la SEQ ID NO: 1. Los ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en 40 condiciones de moderadas a muy restrictivas, con polinucleótidos que comprenden la SEQ ID NO: 1, o fragmentos de la SEQ ID NO: 1.
Los ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados de ADNc de NtHMA (Clone P6663), que componen la SEQ ID NO: 3, fragmentos de la SEQ ID NO: 3, o sus variantes. Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes 45 de polinucleótidos de NtHMA que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3, o fragmentos de la SEQ ID NO: 3. Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes de polinucleótidos de NtHMA aisladas que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3, o fragmentos de la SEQ ID NO: 3 y en las que las T se han sustituido por U (p. ej. ARN). Los ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados 50 que pueden hibridar específicamente, en condiciones de moderadas a altamente restrictivas, con polinucleótidos que comprenden la SEQ ID NO: 3, o fragmentos de la SEQ ID NO: 3. Los ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados que tienen una secuencia que complementa la de las variantes de polinucleótido de NtHMA que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3, o fragmentos de la SEQ ID NO: 3. 55
Los ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados de ADNc de NtHMA (Clon P6643), que comprende la SEQ ID NO: 47, fragmentos de la SEQ ID NO: 47, o variantes de los mismos. Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes de polinucleótido de NtHMA aisladas que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 47, fragmentos de la SEQ ID NO: 47. 60 Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes de polinucleótido de NtHMA aisladas que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 47, fragmentos de la SEQ ID NO: 47, y en las que las T se han sustituido por U (p. ej. ARN). Los ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en condiciones de moderadas a muy restrictivas, con polinucleótidos que comprenden la SEQ ID NO: 47, fragmentos de la SEQ ID NO: 47. Los 65 ejemplos de referencia se dirigen a polinucleótidos aislados que tienen una secuencia que complementa la de las
variantes de polinucleótido de NtHMA que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% con la SEQ ID NO: 47, fragmentos de la SEQ ID NO: 47.
Los ejemplos de referencia se dirigen a biopolímeros que son homólogos con los polinucleótidos de NtHMA y polipéptidos de NtHMA (“homólogos de NtHMA”), que se pueden identificar de diferentes especies de plantas. Por 5 ejemplo, los homólogos de NtHMA se pueden aislar experimentalmente mediante cribado de bibliotecas adecuadas de ácidos nucleicos derivadas de diferentes especies de plantas de interés. Alternativamente, se pueden identificar homólogos de NtHMA mediante cribado de bases de datos genómicas que contienen secuencias de una o más especies que usan una secuencia derivada de polinucleótidos de NtHMA y/o polipéptidos de NtHMA. Dichas bases de datos genómicas están fácilmente disponibles para una serie de especies (p. ej., en la red (www) en tigr.org/tdb; 10 genetics.wisc.edu; stanford.edu/.about.ball; hiv-web.lan1.gov; ncbi.nlm.nig.gov; ebi.ac.uk; y pasteur.fr/other/biology). Por ejemplo, se pueden obtener secuencias de oligonucleótidos degeneradas por “retrotraducción” de fragmentos de polipéptido de NtHMA. Los polinucleótidos de NtHMA se pueden usar como sondas o cebadores para identificar/amplificar secuencias relacionadas, o para obtener secuencias de longitud completa para NtHMA relacionadas por PCR, por ejemplo, o por otras técnicas bien conocidas (p. ej., véase PCR Protocols: A Guide to 15 Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990)).
B. Polipéptidos de NtHMA
La expresión “polipéptido de NtHMA” se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID NO: 2; polipéptidos que tienen homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o 20 identidad sustancial con la SEQ ID NO: 2; fragmentos de la SEQ ID NO: 2; y variantes de los mismos. Los polipéptidos de NtHMA incluyen secuencias que tienen un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 2, y que pueden funcionar transportando metales pesados a través de membranas celulares.
Los polipéptidos de NtHMA incluyen variantes producidas introduciendo cualquier tipo de alteraciones (p. ej., 25 inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan al replegado o isomerizaciones, estructuras tridimensionales o estados de autoasociación), que se pueden diseñar deliberadamente o aislar de forma natural. Los polipéptidos de NtHMA pueden estar en forma lineal o ciclados usando métodos conocidos (p. ej., H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773 (1992); y R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9245 (1992), ambos incorporados por referencia en la presente memoria). Los 30 polipéptidos de NtHMA comprenden al menos de 8 a 10, al menos 20, al menos 30, o al menos 40 aminoácidos contiguos.
Los ejemplos de referencia se dirigen a polipéptidos de NtHMA aislados codificados por la secuencia del polinucleótido, SEQ ID NO: 1, que comprende la SEQ ID NO: 2, fragmentos de la SEQ ID NO: 2, o variantes de los 35 mismos. Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes de polipéptido de NtHMA aisladas que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 2, o fragmentos de la SEQ ID NO: 2.
Los ejemplos de referencia se dirigen a polipéptidos de NtHMA aislados (Clon P6663), que comprenden la SEQ ID 40 NO: 2, fragmentos de la SEQ ID NO: 2, o variantes de los mismos. Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes de polipéptido de NtHMA aisladas que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 2, o fragmentos de la SEQ ID NO: 2.
Los ejemplos de referencia se dirigen a polipéptidos de NtHMA aislados (Clon P6643), que comprenden la SEQ ID 45 NO: 49, fragmentos de la SEQ ID NO: 49, o variantes de los mismos. Los ejemplos de referencia se dirigen a variantes de polipéptido de NtHMA aisladas que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 49, o fragmentos de la SEQ ID NO: 49.
II. Composiciones y métodos relacionados para reducir la expresión génica de NtHMA y/o la actividad de 50 transportador mediada por NtHMA
Las composiciones antagonistas adecuadas que pueden regular por disminución la expresión y/o actividad de NtHMA y variantes de NtHMA, incluyen polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más genes de NtHMA endógenos; polinucleótidos específicos de secuencia que pueden 55 interferir con la traducción de transcritos de ARN de NtHMA (p. ej., ARNbc, ARNipi, ribozimas); polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de proteína de NtHMA, la actividad enzimática de NtHMA y/o la actividad de unión de NtHMA con respecto a sustratos y/o proteínas reguladoras; anticuerpos que presentan especificidad para NtHMA; y compuestos moléculas pequeñas que pueden interferir con la estabilidad de proteína de NtHMA, la actividad enzimática de NtHMA, y/o la actividad de unión de NtHMA. Un antagonista eficaz 60 puede reducir el transporte de metales pesados (p. ej., Cd) en las estructuras de la lámina foliar en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%.
A. Definiciones
A lo largo de esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, los términos “un/una” y “el/la” funcionan como 65 referencias en singular y plural salvo que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, una referencia a
un “polinucleótido de ARNi” incluye una pluralidad de dichos polinucleótidos de ARNi, y una referencia a “la planta” incluye la referencia a una o más de dichas plantas.
El término “orientación” se refiere a un orden particular en la colocación de un polinucleótido con respecto a la posición de un polinucleótido de referencia. Un ADN lineal tiene dos posibles orientaciones: la dirección de 5’ a 3’ y 5 la dirección de 3’ a 5’. Por ejemplo, si una secuencia de referencia se coloca en la dirección de 5’ a 3’ y una segunda secuencia se coloca en la dirección de 5’ a 3’ dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia están orientadas en la misma dirección, o tienen la misma orientación. Típicamente, una secuencia de promotor y un gen de interés bajo regulación del promotor dado, se coloran en la misma orientación. Sin embargo, con respecto a la secuencia de referencia colocada en la dirección de 10 5’ a 3’, si una segunda secuencia se coloca en la dirección de 3’ a 5’ dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia están orientadas en una dirección de sentido contrario, o tienen orientación de sentido contrario. Dos secuencias que tienen orientaciones de sentido contrario una con respecto a la otra, se pueden describir alternativamente como que tienen la misma orientación, si la secuencia de referencia (dirección de 5’ a 3’) y la secuencia complementaria inversa de la secuencia de referencia 15 (secuencia de referencia colocada de 5’ a 3’) están colocadas en la misma molécula/cadena de polinucleótido.
La expresión “vector de expresión de ARNi de NtHMA” se refiere a un vehículo de ácido nucleico que comprende una combinación de componentes de ADN para permitir el transporte y la expresión de construcciones de ARNi de NtHMA. Los vectores de expresión adecuados incluyen episomas capaces de replicación extracromosómica tales 20 como plásmidos de ADN bicatenarios, circulares; plásmidos de ADN bicatenarios linearizados; y otros vectores de expresión funcionalmente equivalentes de cualquier origen. Un vector de expresión de ARNi de NtHMA adecuado comprende al menos un promotor situado en la dirección 5’ y operativamente unido a una construcción de ARNi de NtHMA, como se define más adelante.
La “construcción de ARNi de NtHMA” se refiere a un fragmento de ADN recombinante bicatenario que codifica “polinucleótidos de ARNi de NtHMA” que tienen de interferencia de ARN. Una construcción de ARNi de NtHMA comprende una “cadena molde” con emparejamiento de bases con una “cadena codificante o del mismo sentido” complementaria. Una construcción de ARNi de NtHMA dada se puede insertar en un vector de expresión de ARNi de NtHMA en dos posibles orientaciones, sea en la misma orientación (o sentido) o en la orientación inversa (o 30 antisentido) con respecto a la orientación de un promotor situado en un vector de expresión de ARNi de NtHMA.
La expresión “polinucleótidos de ARNi de NtHMA” puede dirigirse a ARN de NtHMA para la degradación enzimática, que implica la formación de fragmentos más pequeños de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (“ARNip”) que se pueden unir a múltiples secuencias complementarias dentro del ARN de NtHMA objetivo. Los niveles de expresión 35 de uno o más genes de NtHMA se pueden reducir mediante la actividad de interferencia del ARN de polinucléotidos de ARNi de NtHMA.
La expresión “cadena molde” se refiere a la cadena que comprende una secuencia que complementa la de la cadena “del mismo sentido o codificante” de un dúplex de ADN, tal como fragmento genómico de NtHMA, ADNc de 40 NtHMA o construcción de ARNi de NtHMA, o cualquier fragmento de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico que puede ser transcrita por la ARN polimerasa. Durante la transcripción, la ARN polimerasa se puede translocar a lo largo de la cadena molde en la dirección de 3’ a 5’ durante la síntesis de ARN naciente.
Las expresiones “cadena del mismo sentido” o “cadena codificante” se refieren a la cadena que comprende una 45 secuencia que complementa la de la cadena molde en un dúplex de ADN. Por ejemplo, la secuencia de la cadena codificante (“secuencia del mismo sentido”) para el clon genómico de NtHMA identificado se designa como la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la secuencia codificante para el ADNc de NtHMA identificada como clon P6663, se designa como SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la secuencia codificante para el ADNc de NtHMA, identificada como clon P6643, se designa como SEQ ID NO: 46. Por ejemplo, si la cadena codificante comprende una secuencia hipotética 5’-50 TAATCCGGT-3’, entonces la secuencia correspondiente sustancialmente idéntica dentro de un ARNm objetivo hipotético es 5’-UAAUCCGGU-3’.
La expresión “secuencia complementaria inversa” se refiere a la secuencia que complementa la “secuencia codificante” de interés (p. ej., secuencia de exón) situada dentro de la misma cadena, en la misma orientación con 55 respecto a la secuencia codificante. Por ejemplo, si una cadena comprende una secuencia hipotética 5’-TAATCCGGT-3’, entonces la secuencia complementaria inversa 5’-ACCGGATTA-3’ puede estar operativamente unida a la secuencia codificante, separada por una secuencia espaciadora.
Las expresiones “transcrito de ARN de NtHMA” o “ARN de NtHMA”, en el contexto de la interferencia de ARN, se 60 refiere a moléculas de ácido polirribonucleótido producidas dentro de una célula de planta hospedante de interés, que resulta de la transcripción de genes endógenos de la familia de HMA, incluyendo el gen de NtHMA aislado (SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, estos términos incluyen cualquier especie de ARN o variantes de ARN producidas como productos de transcripción a partir de genes relacionados con la HMA que pueden ser distintos del gen de NtHMA aislado (SEQ ID NO: 1) pero que tienen similitud suficiente a nivel estructural y/o funcional para ser clasificados 65 dentro de la misma familia. Por ejemplo, si una célula de planta hospedantes seleccionada para modificación
genética según los métodos descritos es el tabaco, los transcritos de ARN de NtHMA objetivo incluyen: (1) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción del gen NtHMA aislado (SEQ ID NO: 1); (2) pre-ARN y ARNm producidos a partir de la transcripción de cualquier gen que tenga una identidad de secuencia de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la secuencia del gen de NtHMA aislada (SEQ ID NO: 1) (es decir, otros genes distintos sustancialmente idénticos al gen de NtHMA identificado y que 5 codifica isoformas relacionadas de los transportadores HMA); y (3) pre-ARN y ARNm producidos a partir de la transcripción de alelos del gen de NtHMA (SEQ ID NO: 1). Los transcritos de ARN de NtHMA incluyen variantes de ARN producidas como resultado de reacciones de corte y empalme de ARN alternativas de ARN heteronucleares (“ARNhn”) de un gen de NtHMA particular, variantes de ARNm que resultan de dichas reacciones de corte y empalme de ARN alternativas, y cualesquiera variantes de ARN intermedias. 10
Los términos “homología” o “identidad” o “similitud” se refieren al grado de similitud de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico comparados por alineamiento de secuencia. El grado de homología entre dos secuencias de ácido nucleico discretas que se comparan es una función del número de nucleótidos idénticos o que se corresponden en posiciones comparables. El porcentaje de identidad se puede 15 determinar por inspección visual y cálculo matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico se puede determinar comparando la información de las secuencias usando un programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible en la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto típicos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 20 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como describen Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3.0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalizaciones para huecos finales. Se pueden usar alternativamente varios programas de comparación de secuencias conocidos para los expertos en la 25 técnica.
La expresión “en la dirección 5’” se refiere a una dirección/posición relativa con respecto a un elemento de referencia a lo largo de una secuencia de polinucleótido lineal, que indica una dirección/posición hacia el extremo 5’ de la secuencia de polinucleótido. “En la dirección 5’” se puede usar de forma intercambiable con el “extremo 5’ de un 30 elemento de referencia”.
La expresión “operativamente unido” se refiere a la unión de distintos elementos de ADN, fragmentos o secuencias para producir una unidad de transcripción funcional o un vector de expresión funcional.
El término “promotor” se refiere a un elemento/secuencia de ácido nucleico, típicamente situado en la dirección 5’ y operativamente unido a un fragmento de ADN bicatenario, tal como una construcción de ARNi de NtHMA. Por ejemplo, un promotor adecuado permite la activación transcripcional de una construcción de ARNi de NtHMA por reclutamiento del complejo de transcripción, incluyendo la ARN polimerasa y varios factores, para iniciar la síntesis de ARN. Los “promotores” pueden derivar enteramente de regiones próximas a un gen natural de interés, o pueden 40 estar compuestos de varios elementos derivados de diferentes promotores naturales y/o segmentos de ADN sintéticos. Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejido reconocidos por factores específicos de tejido presentes en diferentes tejidos o tipos de células (p. ej., promotores específicos de raíz, promotores específicos de brote, promotores específicos del xilema), o presentes durante diferentes etapas del desarrollo, o presentes en respuesta a diferentes condiciones medioambientales. Dichos promotores adecuados 45 incluyen promotores constitutivos que pueden ser activados en la mayoría de los tipos de células sin requerir inductores específicos. Los ejemplos de promotores adecuados para controlar la producción del polipéptido de ARNi de NtHMA incluyen el virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o promotores de ubiquitina o faseolina. Los expertos en la técnica son capaces de generar múltiples variaciones de promotores recombinantes, como se describe en una serie de referencias, tales como Okamuro y Goldberg, 50 Biochemistry of Plants, Vol. 15: pág. 1-82 (1989).
Los promotores específicos de tejido son elementos de control transcripcional que son solo activos en células o tejidos particulares en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductivos. La expresión específica de tejido puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando se prefiere la 55 expresión de polinucleótidos en determinados tejidos. Los ejemplos de promotores específicos de tejido bajo el control del desarrollo incluyen promotores que pueden iniciar la transcripción solo (o principalmente solo) en determinados tejidos, tales como tejidos vegetativos, p. ej., raíces u hojas, o tejidos reproductivos, tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores o cualquier tejido embrionario. Los promotores específicos de tejido reproductivo pueden ser, p. ej., específicos de antera, específicos de óvulo, específicos embrionarios, específicos de 60 endosperma, específicos de tegumento, específico de semilla y recubrimiento de semilla, específico de polen, específico de pétalos, específico de sépalos, o combinaciones de los mismos.
Los promotores específicos de hoja adecuados incluyen promotor de la piruvato ortofosfato diquinasa (PPDK) de planta C4 (maíz), promotor de cab-m1Ca+2 del maíz, el promotor del gen relacionado con myb de Arabidopsis 65 thaliana (Atmyb5), los promotores de la ribulosa bifsosfato carboxilada (RBCS) (p. ej., los genes del tomate RBCS1,
RBCS2 y RBCS3A expresados en hojas y plantones de crecimiento con luz, RBCS1 y RBCS2 expresados en frutos del tomate en desarrollo, y/o promotor de la ribulosa bisfosfato carboxilasa expresada casi exclusivamente en células mesófilas en láminas foliares y vainas foliares en niveles altos).
Los promotores específicos de senescencia adecuados incluyen un promotor del tomate activo durante la 5 maduración del fruto, senescencia y abscisión de las hojas, un promotor del maíz del gen que codifica una cisteína proteasa. Se pueden usar promotores específicos de antera adecuados. Dichos promotores son conocidos en la técnica o se pueden descubrir por técnicas conocidas; véase, p. ej., Bhalla y Singh (1999) “Molecular control of male fertility in Brassica”, Proc. 10th Annual Rapeseed Congress, Canberra, Australia; van Tunen et al. (1990) “Pollen- and anther-specific chi promoters from petunia: tandem promoter regulation of the chiA gene”. Plant Cell 2:393-40; 10 Jeon et al. (1999), “Isolation and characterization of an anther-specific gene, RA8, from rice” (Oryza sativa L). Plant Molecular Biology 39:35-44; y Twell et al. (1993) “Activation and developmental regulation of an Arabidopsis anther-specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum”. Sex. Plant Reprod. 6:217-224.
Se pueden seleccionar promotores de raíz adecuados preferidos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, 15 por ejemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de glutamina sintasa específico de raíz de soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de control específico de raíz en el gen de GRP 1.8 de judía); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de raíz del gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica la glutamina sintasa citosólica (GS), que es expresada en raíces y nódulos de raíz de la soja. 20 Véase también Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641, donde se describen dos promotores específicos de raíz aislados de genes de hemoglobina de la no leguminosa fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no leguminosa no fijadora de nitrógeno Trema tomentosa relacionada.
Los promotores de semilla preferidos adecuados incluyen tanto los promotores específicos de semilla (aquellos 25 promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como los promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) como los promotores de germinación de semillas (aquellos promotores activos durante la germinación de semillas). Véase, p. ej., Thompson et al. (1989) BioEssays 10: 108, incorporado en la presente memoria por referencia. Dichos promotores de semilla preferidos incluyen, pero no se limitan a Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína del maíz de 19 kDa); milpa (mioinositol-1-fosfato sintasa); mZE40-2, también conocido 30 como Zm-40 (patente de EE.UU. nº 6.403.862); nuclc (patente de EE.UU. nº 6.407.315); y celA (celulosa sintasa) (véase el documento WO 00/11177). La gamma-zeína es un promotor específico de endosperma. La Glob-1 es un promotor específico embrionario. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a beta-faseolina de judía, napina, beta-conglicinina, lectina de soja, cruciferina y similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a un promotor de zeína del 35 maíz de 15 kDa, un promotor de zeína de 22 kDa, un promotor de zeína de 27 kDa, un promotor de g-zeína, un promotor de gamma-zeína de 27 kDa (tal como el promotor gzw64A, véase, número de acceso en Genbank S78780), un promotor céreo, un promotor de shrunken 1, un promotor de shrunken 2, un promotor de globulina 1 (véase, número de acceso en Genbank L22344), un promotor de Itp2 (Kalla, et al., Plant Journal 6:849-860 (1994); patente de EE.UU. nº 5.525.716), un promotor de cim1 (véase la patente de EE.UU. nº 6.225.529) promotores de 40 end1 y end2 del maíz (véase la patente de EE.UU. nº 6.528.704 y solicitud 10/310.191, presentada el 4 de diciembre, 2002); promotor de nuc1 (patente de EE.UU. nº 6.407.315); promotor de Zm40 (patente de EE.UU. nº 6.403.862); eep1 y eep2; lec1 (solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/718.754); promotor de tiorredoxina H (solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/514.123); promotor de mlip15 (patente de EE.UU. nº 6.479.734); promotor de PCNA2; y el promotor de shrunken-2. (Shaw et al., Plant Phys 98:1214-1216, 1992; Zhong Chen et al., 45 PNAS USA 100:3525-3530, 2003).
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores sensibles al ataque de patógenos, condiciones anaerobias, temperatura elevada, luz, sequía, temperatura fría, o concentración salina alta. Los promotores inducibles por patógenos incluyen los de proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR), que son inducidas 50 después de infección por un patógeno (p. ej., proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa). Véase, por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Véase también la solicitud titulada quot;Inducible Maize Promotersquot;, solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/257.583, presentada el 25 de febrero, 1999.
Además de los promotores de plantas, otros promotores adecuados pueden tener origen bacteriano (p. ej., el promotor de la octipino sintasa, el promotor de la nopalina sintasa y otros promotores derivados de plásmidos Ti), o se pueden obtener de promotores víricos (p. ej., promotores de ARN 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), promotores constitutivos del virus del mosaico del tabaco, promotores 19S y 35S virus del mosaico de la coliflor (CaMV), o promotor 35S del virus del mosaico de escrofularia). 60
El término “potenciador” se refiere a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, que puede reclutar proteínas reguladoras transcripcionales tales como activadores transcripcionales, para potenciar la activación transcripcional aumentando la actividad del promotor. Dichos potenciadores pueden derivarse de regiones próximas a un promotor natural de interés (fuentes homólogas) o pueden derivarse de contextos no naturales 65 (fuentes heterólogas) y operativamente unidos a cualquier promotor de interés dentro de los vectores de expresión
de ARNi de NtHMA para potenciar la actividad y/o especificidad de tejido de un promotor. Algunos potenciadores pueden operar en cualquier orientación con respecto a la orientación de una unidad de transcripción. Por ejemplo, se pueden situar potenciadores en la dirección 5’ o dirección 3’ de una unidad transcripcional que comprende un promotor y una construcción de ARNi de NtHMA. Los expertos en la técnica son capaces de unir operativamente potenciadores y promotores para optimizar los niveles de transcripción de las construcciones de ARNi de NtHMA. 5
B. Vectores de expresión de ARNi que comprenden construcciones de ARNi de NtHMA que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA
La interferencia de ARN (“ARNi”) o silenciamiento de ARN es un procedimiento conservado evolutivamente por el cual se pueden dirigir ARNm específicos para la degradación enzimática. Se debe introducir un ARN bicatenario 10 (ARNbc) o producir mediante una célula (p. ej., virus de ARNbc o polinucleótidos de ARNi de NtHMA) para iniciar la ruta del ARNi. El ARNbc se puede convertir en múltiples dúplex de ARNip de 21-23 pb de longitud (“ARNip” (ARN interferente pequeño)) mediante RNasas II, que son endonucleasas específicas de ARN (“Dicer”). Los ARNip posteriormente pueden ser reconocidos por complejos de silenciamiento inducidos por ARN (“RISC”) que promueven el desenrollado del ARNip a través de un procedimiento dependiente de ATP. La cadena de sentido 15 contrario desenrollada del ARNip guía el RISC activado al ARNm al que va dirigido (p. ej., variantes de ARN de NtHMA) que comprenden una secuencia complementaria de la cadena de sentido contrario del ARNip. El ARNm al que va dirigido y la cadena de sentido contrario pueden formar una hélice de forma A, y el surco mayor de la hélice de forma A puede ser reconocido por el RISC activado. El ARNm diana puede ser escindido por el RISC activado en un solo sitio definido por el sitio de unión del extremo 5’ de la cadena de ARNsi. El RISC activado se puede reciclar 20 para catalizar otro suceso de escisión.
La figura 2A ilustra la construcción de un vector de expresión de ARNi de NtHMA de ejemplo. En la figura 2A “S I” indica etapa I y “S II” indica etapa II del proceso de construcción. Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden construcciones de ARNi de NtHMA que codifican polinucleótidos de 25 ARNi de NtHMA que presentan actividad de interferencia de ARN reduciendo el nivel de expresión de los ARNm de NtHMA, pre-ARNm de NtHMA y variantes de ARN de NtHMA relacionadas. Los vectores de expresión comprenden un promotor situado en la dirección 5’ y operativamente unido a una construcción de ARNi de NtHMA, como se define más adelante. Los vectores de expresión de ARNi de NtHMA comprenden un promotor nuclear mínimo adecuado, una construcción de ARNi de NtHMA de interés, una región reguladora en dirección 5’ (5’), una región 30 reguladora en dirección 3’ (3’), incluyendo señales de terminación de la transcripción y poliadenilación, y otras secuencias conocidas para los expertos en la técnica, tales como varios marcadores de selección.
Los polinucleótidos de NtHMA se pueden producir en varios formas, incluyendo como estructuras bicatenarias de tipo horquilla (“ARNbc-i”). El ARNbc-i de NtHMA se puede convertir enzimáticamente en ARNip de NtHMA 35 bicatenarios. Una de las cadenas del dúplex de ARNip de NtHMA se puede asociar con una secuencia complementaria dentro del ARNm de NtHMA diana y variantes de ARN de NtHMA relacionadas. Los dúplex de ARNip/ARNm son reconocidos por RISC que puede escindir los ARN de NtHMA en múltiples sitios de una forma dependiente de la secuencia, dando como resultado la degradación del ARNm de NtHMA diana y variantes de ARN de NtHMA diana. 40
La figura 2B ilustra la formación de un dúplex de ARN bicatenario hipotético formado (como estructura de “tallo-bucle-tallo”) como un producto transcrito a partir de una construcción de ARNi de NtHMA de ejemplo. En la figura 2B, se muestra una construcción 10 de ARNi de NtHMA hipotética, que comprende 3 fragmentos de ADN bicatenarios, tal como los fragmentos 1-3. La flecha I indica la formación de la construcción de ARNi, la flecha II la 45 transcripción y la flecha III la formación de ARNbc. El fragmento 1 se sitúa en dirección 5’ y operativamente unido al fragmento 2, el cual se sitúa en dirección 5’ y operativamente unido al fragmento 3, para el cual las cadenas/secuencias de ADN 4, 6 y 8 están unidas entre sí en tándem para formar la cadena 11, como se muestra. Alternativamente, una construcción de ARNi de NtHMA comprende “una secuencia codificante” 5, que se sitúa en dirección 5’ y operativamente unida a “una secuencia espaciadora” 7, que se sitúa en dirección 5’ y operativamente 50 unida a “una secuencia complementaria inversa” 9. Las cadenas/secuencias 5, 7 y 9 pueden estar unidas entre sí en tándem, para formar la cadena/secuencia 12. Alternativamente, una construcción de ARNi de NtHMA comprende “una secuencia codificante” 8, que se sitúa en dirección 5’ y operativamente unida a “una secuencia espaciadora” 6, que se sitúa en dirección 5’ y operativamente unida a “una secuencia complementaria inversa” 4. Las cadenas/secuencias 8, 6 y 4 pueden estar unidas entre sí en tándem, para formar la cadena/secuencia 11. La 55 cadena 12 es complementaria de la cadena 11. La cadena 11 es una cadena molde que puede ser transcrita en un polinucleótido de ARNi de NtHMA 13. El polinucleótido de ARNi de NtHMA 13 forma una estructura de tipo horquilla (“tallo-bucle-tallo”), en la que el tallo 16 es una región complementaria que resulta de las interacciones de pares de bases intramoleculares del polinucleótido de ARNi de NtHMA 15 y el bucle 17 representa una región no complementaria codificada por una secuencia espaciadora, tal como cadenas/secuencias 6 o 7. 60
Cualquier polinucleótido de ARN de NtHMA de interés se puede producir seleccionando una composición de secuencia, tamaño de bucle y longitud de tallo adecuados para producir el dúplex de horquilla de NtHMA. Un intervalo adecuado para diseñar longitudes de tallo de un dúplex de horquilla incluye longitudes de tallo de 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 65 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 nucleótidos y 600-700 nucleótidos. Un intervalo adecuado para
diseñar longitudes de bucle de un dúplex de horquilla incluye longitudes de bucle de 4-25 nucleótidos, 25-50 nucleótidos, o más largas si la longitud del tallo del dúplex de horquilla es sustancial. En algunos contextos, las estructuras de horquilla con regiones en dúplex mayores de 21 nucleótidos pueden promover el silenciamiento dirigido por ARNip eficaz, independientemente de la secuencia y longitud del bucle.
Las construcciones de ARNi de NtHMA de ejemplo para la regulación por disminución del nivel de expresión del gen de NtHMA (SEQ ID NO: 1) y otros genes relacionados de NtHMA incluyen las siguientes:
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden una construcción de ARNi de NtHMA que comprende uno o más de: intrón 1 (SEQ ID NO: 4), exón 1 (SEQ ID NO: 5), intrón 2 (SEQ ID 10 NO: 6), exón 2 (SEQ ID NO: 7), intrón 3 (SEQ ID NO: 8), exón 3 (SEQ ID NO: 9), intrón 4 (SEQ ID NO: 10), exón 4 (SEQ ID NO: 11), intrón 5 (SEQ ID NO: 12), exón 5 (SEQ ID NO: 13), intrón 6 (SEQ ID NO: 14), exón 6 (SEQ ID NO: 15), intrón 7 (SEQ ID NO: 16), exón 7 (SEQ ID NO: 17), intrón 8 (SEQ ID NO: 18), exón 8 (SEQ ID NO: 19), intrón 9 (SEQ ID NO: 20), exón 9 (SEQ ID NO: 21), intrón 10 (SEQ ID NO: 22), exón 10 (SEQ ID NO: 23), intrón 11 (SEQ ID NO: 24, exón 11 (SEQ ID NO: 25), e intrón 12 (SEQ ID NO: 26), fragmentos de los mismos y variantes de los 15 mismos.
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: una construcción de ARNi de NtHMA que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: exón 1 (SEQ ID NO: 5), un fragmento del exón 1 (SEQ ID NO: 5), exón 2 20 (SEQ ID NO: 7), un fragmento del exón 2 (SEQ ID NO: 7), exón 3 (SEQ ID NO: 9), un fragmento del exón 3 (SEQ ID NO: 9), exón 4 (SEQ ID NO: 11), un fragmento del exón 4 (SEQ ID NO: 11), exón 5 (SEQ ID NO: 13), un fragmento del exón 5 (SEQ ID NO: 13), exón 6 (SEQ ID NO: 15), un fragmento del exón 6 (SEQ ID NO: 15), exón 7 (SEQ ID NO: 17), un fragmento del exón 7 (SEQ ID NO: 17), exón 8 (SEQ ID NO: 19), un fragmento del exón 8 (SEQ ID NO: 19), exón 9 (SEQ ID NO: 21), un fragmento del exón 9 (SEQ ID NO: 21), exón 10 (SEQ ID NO: 23), un fragmento del 25 exón 10 (SEQ ID NO: 23), exón 11 (SEQ ID NO: 25), y un fragmento del exón 11 (SEQ ID NO: 25).
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: una construcción de ARNi de NtHMA que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA capaces de auto-reasociación para formar una estructura de horquilla, en la que la construcción de ARNi comprende (a) una primera secuencia que tiene una 30 identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 47; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del polinucleótido de ARNi de NtHMA que forma un bucle de la estructura de horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a 35 la primera secuencia y a la tercera secuencia.
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: una construcción de ARNi de NtHMA que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA capaces de auto-reasociación para formar una estructura de horquilla, en la que la construcción de ARNi comprende (a) una primera secuencia que tiene una 40 identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 47; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del polinucleótido de ARNi de NtHMA que forma un bucle de la estructura de horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia (SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48), colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la 45 segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: una construcción de ARNi de NtHMA que comprende una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3 o partes de la SEQ ID NO: 3. Varias realizaciones se dirigen a vectores 50 de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden una construcción de ARNi de NtHMA que comprende una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 47 o partes de la SEQ ID NO: 47.
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: una construcción de 55 ARNi de NtHMA que comprende una segunda secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: intrón 1 (SEQ ID NO: 4), un fragmento del intrón 1 (SEQ ID NO: 4), intrón 2 (SEQ ID NO: 6), un fragmento del intrón 2 (SEQ ID NO: 6), intrón 3 (SEQ ID NO: 8), un fragmento del intrón 3 (SEQ ID NO: 8), intrón 4 (SEQ ID NO: 10), un fragmento del intrón 4 (SEQ ID NO: 10), intrón 5 (SEQ ID NO: 12), un fragmento del intrón 5 (SEQ ID NO: 12), intrón 6 (SEQ ID NO: 14), un 60 fragmento del intrón 6 (SEQ ID NO: 14), intrón 7 (SEQ ID NO: 16), un fragmento del intrón 7 (SEQ ID NO: 16), intrón 8 (SEQ ID NO: 18), un fragmento del intrón 8 (SEQ ID NO: 18), intrón 9 (SEQ ID NO: 20), un fragmento del intrón 9 (SEQ ID NO: 20), intrón 10 (SEQ ID NO: 22), un fragmento del intrón 10 (SEQ ID NO: 22), intrón 11 (SEQ ID NO: 24), un fragmento del intrón 11 (SEQ ID NO: 24), intrón 12 (SEQ ID NO: 26), y un fragmento del intrón 12 (SEQ ID NO: 26). Alternativamente, la segunda secuencia de la construcción de ARNi de NtHMA se puede generar de forma 65 aleatoria sin usar una secuencia de intrón derivada del gen de NtHMA (SEQ ID NO: 1).
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: una construcción de ARNi de NtHMA que comprende una tercera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 46 o partes de la SEQ ID NO: 46. Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden una construcción de ARNi de NtHMA que comprende 5 una tercera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 48 o partes de la SEQ ID NO: 48.
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: una construcción de ARNi de NtHMA que comprende una tercera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 10 96%, 97%, 98% y 99% con una secuencia complementaria inversa seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27 (exón 1), un fragmento de la SEQ ID NO: 27 (exón 1), SEQ ID NO: 28 (exón 2), un fragmento de la SEQ ID NO: 28 (exón 2), SEQ ID NO: 29 (exón 3), un fragmento de la SEQ ID NO: 29 (exón 3), SEQ ID NO: 30 (exón 4), un fragmento de la SEQ ID NO: 30 (exón 4), SEQ ID NO: 31 (exón 5), un fragmento de la SEQ ID NO: 31 (exón 5), SEQ ID NO: 32 (exón 6), un fragmento de la SEQ ID NO: 32 (exón 6), SEQ ID NO: 33 (exón 7), un fragmento de la 15 SEQ ID NO: 33 (exón 7), SEQ ID NO: 34 (exón 8), un fragmento de la SEQ ID NO: 34 (exón 8), SEQ ID NO: 35 (exón 9), un fragmento de la SEQ ID NO: 35 (exón 9), SEQ ID NO: 36 (exón 10), un fragmento de la SEQ ID NO: 36 (exón 10), SEQ ID NO: 37 (exón 11), y un fragmento de la SEQ ID NO: 37 (exón 11).
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden una construcción de 20 ARNi de NtHMA que comprende: la SEQ ID NO: 38 (quot;secuencia/fragmento codificantequot;), la segunda secuencia comprende la SEQ ID NO: 39 (quot;secuencia/fragmento espaciadorquot;) y la tercera secuencia comprende la SEQ ID NO: 40 (quot;secuencia/fragmento de sentido contrarioquot;).
Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden una construcción de 25 ARNi de NtHMA que comprende: la SEQ ID NO: 42 (quot;secuencia/fragmento codificantequot;), la segunda secuencia comprende la SEQ ID NO: 43 (quot;secuencia/fragmento espaciadorquot;) y la tercera secuencia comprende la SEQ ID NO: 44 (quot;secuencia/fragmento de sentido contrarioquot;).
Alternativamente, las secuencias descritas se pueden usar para construir varios polinucleótidos de NtHMA que no 30 forman estructuras de horquilla. Por ejemplo, se puede formar un ARN bicatenario largo de NtHMA por (1) transcripción de una primera cadena del ADNc de NtHMA por unión operativa a un primer promotor, y (2) transcripción de la secuencia complementaria inversa de la primera cadena del fragmento de ADNc de NtHMA por unión operativa a un segundo promotor. Cada cadena del polinucleótido de NtHMA se puede transcribir desde el mismo vector de expresión o de diferentes vectores de expresión. El dúplex de ARN de NtHMA que tiene actividad 35 de interferencia de ARN se puede convertir enzimáticamente en ARNip para reducir los niveles de ARN de NtHMA.
C. Vectores de expresión para reducir la expresión génica de NtHMA por cosupresión.
Se proporcionan varias composiciones y métodos para reducir los niveles de expresión endógenos de miembros de la familia de genes de NtHMA mediante la promoción de la cosupresión de la expresión del gen de NtHMA. El 40 fenómeno de la cosupresión se produce como resultado de introducir múltiples copias de un transgén en una célula de planta hospedante. La integración de múltiples copias de un transgén puede dar como resultado la expresión reducida del transgén y el gen endógeno al que va dirigido. El grado de cosupresión depende del grado de identidad de secuencia entre el transgén y el gen endógeno al que va dirigido. El silenciamiento tanto del gen endógeno como del transgén se puede producir por la metilación extensiva de los locus silenciados (es decir, el promotor endógeno y 45 el gen endógeno de interés) que puede evitar la transcripción. Alternativamente, en algunos casos, la cosupresión del gen endógeno y el transgén se puede producir por silenciamiento génico postranscripcional (“PTGS”), en el que se pueden producir transcritos pero las tasas potenciadas de degradación evitan la acumulación de transcritos. El mecanismo para la cosupresión por PTGS se cree que se parece a la interferencia de ARN, en cuanto que parece que el ARN es tanto un iniciador importante como una diana en estos procesos, y puede ser mediado, al menos en 50 parte, por la misma maquinaria molecular, posiblemente a través de la degradación guiada por ARN de los ARNm.
La cosupresión de miembros de la familia de genes de NtHMA se puede conseguir por integración de múltiples copias del ADNc de NtHMA o fragmentos del mismo, como transgenes, en el genoma de una planta de interés. La planta hospedante se puede transformar con un vector de expresión que comprende un promotor operativamente 55 unido al ADNc de NtHMA o fragmentos del mismo. Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión para promover la cosupresión de genes endógenos de la familia de NtHMA que comprenden: un promotor operativamente unido al ADNc de NtHMA identificado como clon P6663 (SEQ ID NO: 3), o un fragmento del mismo, o ADNc de NtHMA identificado como clon P6643 (SEQ ID NO: 47) o un fragmento del mismo. Varias realizaciones se dirigen a vectores de expresión para promover la cosupresión de genes endógenos de la familia de NtHMA que 60 comprenden: un promotor operativamente unido a ADNc de NtHMA o un fragmento del mismo, que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 47.
Varias realizaciones se dirigen a métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de 65 NtHMA integrando múltiples copias de ADNc de NtHMA o un fragmento del mismo en un genoma de planta, que
comprende: transformar una célula de planta hospedante con un vector de expresión que comprende un promotor operativamente unido a la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma; o SEQ ID NO: 47 o un fragmento de la misma. Varias realizaciones se dirigen a métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de NtHMA integrando múltiples copias de ADNc de NtHMA o un fragmento del mismo, en el genoma de planta, que comprende: transformar una célula de planta hospedante con un vector de expresión que comprende un promotor 5 operativamente unido a ADNc de NtHMA o un fragmento del mismo, que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 47.
D. Vectores de expresión para reducir la expresión génica de NtHMA por inhibición de la traducción mediante agentes de sentido contrario 10
Se proporcionan varias composiciones y métodos para reducir el nivel de expresión endógeno de la familia de genes de NtHMA por inhibición de la traducción de ARNm de NtHMA. Una célula de planta hospedante se puede transformar con un vector de expresión que comprende: un promotor operativamente unido a ADNc de NtHMA o un fragmento del mismo, situado en una orientación de sentido contrario con respecto al promotor que permite la expresión de polinucleótidos de ARN que tiene una secuencia complementaria con una parte del ARNm de NtHMA. 15 Varios vectores de expresión para inhibir la traducción del ARNm de NtHMA comprenden: un promotor operativamente unido a ADNc de NtHMA identificado como clon P6663 (SEQ ID NO: 3), o un fragmento del mismo; o ADNc de NtHMA identificado como clon P6643 (SEQ ID NO: 47) o un fragmento del mismo, en el que el ADNc de NtHMA o el fragmento del mismo, se sitúa en orientación de sentido contrario con respecto al promotor. Varios vectores de expresión para inhibir la traducción del ARNm de HMA comprenden: un promotor operativamente unido 20 a un ADNc de NtHMA o un fragmento del mismo, que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 47, en el que el ADNc de NtHMA o el fragmento del mismo, se sitúa en orientación de sentido contrario con respecto al promotor. Las longitudes de los polinucleótidos de ARN de NtHMA de sentido contrario pueden variar, incluyendo 15-20 nucleótidos, 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-75 nucleótidos, 75-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-25 200 nucleótidos, y 200-300 nucleótidos.
Varias realizaciones se dirigen a métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de NtHMA por inhibición de la traducción del ARNm de NtHMA, que comprenden: transformar una célula de planta hospedante con un vector de expresión que comprende un promotor operativamente unido a ADNc de NtHMA 30 identificado como clon P6663 (SEQ ID NO: 3), o un fragmento del mismo; o ADNc de NtHMA identificado como clon P6643 (SEQ ID NO: 47) o un fragmento del mismo, en el que el ADNc de NtHMA o el fragmento del mismo, se sitúa en orientación de sentido contrario con respecto al promotor. Varias realizaciones se dirigen a métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de NtHMA por inhibición de la traducción de ARNm de NtHMA, que comprende: transformar una célula de planta hospedante con un vector de expresión que comprende 35 un promotor operativamente unido a un ADNc de NtHMA o un fragmento del mismo, que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 47, en el que el ADNc de NtHMA o el fragmento del mismo, se sitúa en orientación de sentido contrario con respecto al promotor.
E. Otras composiciones y métodos para reducir la expresión del gen de NtHMA
Los expertos en la técnica conocen métodos para obtener variantes conservativas y variantes más divergentes de polinucleótidos y polipéptidos de NtHMA. Cualquier planta de interés se puede modificar genéricamente mediante varios métodos conocidos para inducir mutagénesis, incluyendo mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis inducida químicamente, mutagénesis inducida por irradiación, y otros métodos 45 equivalentes. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio se describe en, p. ej., Smith (1985) quot;In vitro mutagenesis,quot; Ann. Rev. Genet. 19:423-462, y referencias en la misma tales como Botstein y Shortle (1985) quot;Strategies and Applications of in vitro Mutagenesis,quot; Science 229:1193-1201; y en Carter (1986) quot;Site-directed mutagenesis,quot; Biochem. J. 237:1-7. La mutagénesis dirigida por oligonucleótido se describe, p. ej., en Zoller y Smith (1982) quot;Oligonucleotide-directed Mutagenesis using M13-derived Vectors: an Efficient and General Procedure for the 50 Production of Point mutations in any DNA Fragment,quot; Nucleic Acids Res. 10:6487-6500. La mutagénesis usando bases modificadas se describe, p. ej., en Kunkel (1985) quot;Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesis without Phenotypic Selection,quot; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, y en Taylor et al. (1985) quot;The Rapid Generation of Oligonucleotide-directed Mutations at High Frequency using Phosphorothioate-modified DNA,quot; Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787. La mutagénesis usando ADN dúplex discontinuo se describe, p. ej., en Kramer et al. (1984) quot;The 55 Gapped Duplex DNA Approach to Oligonucleotide-directed Mutation Construction,quot; Nucl. Acids Res. 12: 9441-9460). La mutagénesis de apareamiento erróneo puntual se describe, p. ej., en Kramer et al. (1984) quot;Point Mismatch Repair,quot; Cell 38:879-887). La mutagénesis por rotura de doble cadena se describe, p. ej., en Mandecki (1986) quot;Oligonucleotide-directed Double-strand Break Repair in Plasmids of Escherichia coli: A Method for Site-specific Mutagenesis,quot; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181, y en Arnold (1993) quot;Protein Engineering for Unusual 60 Environments,quot; Current Opinion in Biotechnology 4:450-455). La mutagénesis usando cepas del hospedante deficientes en reparación se describe, p. ej., en Carter et al. (1985) quot;Improved Oligonucleotide Site-directed Mutagenesis using M13 Vectors,quot; Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443. La mutagénesis por síntesis génica total se describe, p. ej., en Nambiar et al. (1984) “Total Synthesis and Cloning of a Gene Coding for the Ribonuclease S Proteinquot;, Science 223: 1299-1301. El barajado de ADN se describe, p. ej., en Stemmer (1994) quot;Rapid Evolution of a 65 Protein in vitro by DNA Shuffling,quot; Nature 370:389-391, y en Stemmer (1994) quot;DNA shuffling by random
fragmentation and reassembly: In Vitro Recombination for Molecular Evolution,quot; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
Alternativamente, los genes de NtHMA pueden ser dirigidos para la inactivación mediante introducción de transposones (y elementos IS) en los genomas de plantas de interés. Estos elementos genéticos móviles se pueden 5 introducir por fertilización cruzada sexual y se pueden cribar los mutantes de inserción por la pérdida de actividad de NtHMA, tal como el transporte reducido de Cd. El gen de NtHMA alterado en una planta original se puede introducir en otras plantas mediante cruzamiento de la planta original con plantas no sometidas a mutagénesis inducida por transposones, p. ej., por fertilización cruzada sexual. Se puede usar cualquier técnica de reproducción conocida por los expertos en la técnica. En una realización, se pueden inactivar uno o más genes relacionados con NtHMA por 10 inserción de uno o más transposones. Las mutaciones pueden dar como resultado la alteración homocigótica de uno o más genes de NtHMA, la alteración heterocigótica de uno o más genes de NtHMA, o una combinación de alteraciones tanto homocigóticas como heterocigóticas si se altera más de un gen de NtHMA. Los elementos transponibles adecuados se pueden seleccionar de dos amplias clases, designadas como clase I y clase II. Los elementos transponibles de clase I adecuados incluyen retrotransposones, retroposones y elementos similares a 15 SINE. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la técnica, como se describen en Kumar y Bennetzen (1999), Plant Retrotransposons in Annual Review of Genetics 33:479.
Alternativamente, los genes de NtHMA pueden ser dirigidos para la inactivación por un método denominado lesiones locales dirigidas inducidas en el genoma (“TILLING”), que combina mutaciones puntuales de alta densidad con 20 detección sensible rápida de mutaciones. Típicamente, las semillas de plantas se exponen a mutágenos, tales como metanosulfonato de etilo (EMS) o alquilatos de EMS guanina, que típicamente conduce al apareamiento erróneo. Los agentes y métodos adecuados son conocidos para los expertos en la técnica como describen McCallum et al., (2000), “Targeting Induced Local Lesions IN Genomics (TILLING) for Plant Functional Genomicsquot;, Plant Physiology 123:439-442; McCallum et al., (2000) quot;Targeted screening for induced mutationsquot;, Nature Biotechnology 18:455-457; 25 y Colbert et al., (2001) quot;High-Throughput Screening for Induced Point Mutationsquot;, Plant Physiology 126:480-484.
Alternativamente, los genes de NtHMA pueden ser dirigidos para la inactivación por introducción de ribozimas derivados de una serie de ARN circulares pequeños que son capaces de autoescisión y replicación en plantas. Estos ARN se pueden replicar solos (ARN viroides) o con un virus auxiliar (ARN satélite). Los ejemplos de ARN 30 adecuados incluyen los derivados del viroide del aguacate sunblotch y ARN satélites derivados del virus de la mancha anular del tabaco, virus del rayado transitorio de la alfalfa, virus del moteado de terciopelo del tabaco, virus del moteado de solanum nodiflorum, virus del moteado del trébol subterráneo. Los expertos en la técnica conocen varios ribozimas específicos de ARN diana como se describe en Haseloff et al. (1988) Nature, 334:585-591.
III. Plantas transgénicas, líneas celulares y semillas que comprenden polinucleótidos de ARNi de NtHMA y métodos relacionados
Varias realizaciones se dirigen a plantas transgénicas genéticamente modificadas para reducir el nivel de expresión del gen de NtHMA por varios métodos que se pueden usar para el silenciamiento de la expresión del gen de NtHMA, y de esta forma, producir plantas transgénicas en las que el nivel de expresión de los transportadores NtHMA se 40 puede reducir dentro del tejido de la planta de interés. Se pueden alterar las tasas de transporte de metales pesados y patrones de distribución de transporte de metales pesados, en particular, transporte de cadmio, en plantas transgénicas producidas de acuerdo con los métodos y composiciones descritos. Las plantas adecuadas para modificación genética incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas.
Varias realizaciones se dirigen a plantas transgénicas del tabaco genéticamente modificadas para reducir la expresión génica de NtHMA por varios métodos, conocidos para los expertos en la técnica, que se pueden usar para la regulación por disminución de la expresión génica de NtHMA, y por lo tanto, producir plantas de tabaco transgénicas en las que el nivel de expresión de los transportadores NtHMA se puede reducir dentro de los tejidos de la planta de interés. Se han proporcionado varios vectores de expresión para producir líneas transgénicas de 50 tabaco de cualquier variedad, que presentan niveles reducidos de expresión génica de NtHMA. Las composiciones y métodos descritos se pueden aplicar a cualquier especie de planta de interés, incluyendo plantas del género Nicotiana, varias especies de Nicotiana, incluyendo N. rustica y N. tabacum (p. ej., LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, y Petico). Otras especies incluyen N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. 55 bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, 60 N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulafa, N. velutina, N. wigandioides, y N. x sanderae. Las plantas adecuadas para la transformación incluyen cualquier tejido de planta capaz de transformación por diferentes métodos de transformación de plantas conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo electroporación, bombardeo con microproyectiles, una transferencia mediada por Agrobacterium 65 como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.459.355 que describe un método para la
transformación de plantas susceptibles, incluyendo dicotiledóneas, con una cepa de Agrobacterium que contiene un plásmido Ti; patente de EE.UU. nº 4.795.855 que describe la transformación de plantas leñosas con un vector de Agrobacterium; patente de EE.UU. nº 4.940.838 que describe un vector de Agrobacterium binario; patente de EE.UU. nº 4.945.050; y patente de EE.UU. nº 5.015.580.
Varias realizaciones se dirigen a plantas de tabaco transgénicas genéticamente modificadas para expresar de forma exógena una construcción de ARNi que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA que facilitan la degradación de transcritos de ARN de NtHMA, y por consiguiente, que reducen el número de transcritos de ARN disponibles para la traducción en transportadores NtHMA. Los ejemplos de referencia se dirigen a plantas transgénicas que comprenden un vector de expresión que permite la expresión de polinucleótidos de NtHMA producidos según los 10 métodos descritos. Los ejemplos de referencia se dirigen a líneas celulares derivadas de plantas transgénicas producidas según los métodos descritos. Los ejemplos de referencia se dirigen a semillas transgénicas derivadas de plantas transgénicas producidas según los métodos descritos.
Varias realizaciones se dirigen a métodos para reducir los niveles de expresión génica de NtHMA en plantas, 15 comprendiendo el método reducir el nivel de expresión de un gen de NtHMA, lo cual se puede llevar a cabo por varios métodos conocidos por los expertos en la técnica. Como ejemplos, esta descripción describe: (1) método de interferencia de ARN para reducir el nivel en equilibrio de variantes de ARN de NtHMA endógenas disponibles para la traducción por expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA; (2) método de cosupresión para reducir la transcripción del gen o genes de NtHMA por integración de múltiples copias del ADNc de NtHMA o fragmentos del 20 mismo, como transgenes, en un genoma de planta; (3) método de sentido contrario para reducir la traducción de NtHMA por la expresión de polinucleótidos de sentido contrario que se pueden dirigir al ARN de NtHMA; y (4) varios métodos para la inducción de mutagénesis.
Varias realizaciones se dirigen a plantas de tabaco transgénicas genéticamente modificadas para reducir el nivel de 25 expresión génico de NtHMA por varios métodos, conocidos por los expertos en la técnica, y modificadas además para reducir la expresión de un segundo gen endógeno de interés (es decir, no relacionado con NtHMA) o para potenciar la expresión de un gen exógeno de interés (es decir, no relacionado con NtHMA). Por ejemplo, puede ser conveniente la regulación por disminución de un segundo gen endógeno de interés que codifica una enzima implicada en la biosíntesis de alcaloides. En otras situaciones, puede ser conveniente la potenciación en el nivel de 30 expresión de un transgén que codifica una proteína de interés, tal como una hormona humana para uso terapéutico. Los expertos en la técnica son capaces de producir diferentes plantas transgénicas que se pueden modificar, por ejemplo, para que expresen de forma exógena polinucleótidos de ARNi de NtHMA y al menos un producto génico recombinante de interés, tal como un factor de crecimiento humano recombinante o polinucleótidos de ARNi que se dirigen a un segundo gen de interés no relacionado con la familia de NtHMA. 35
La producción de plantas transgénicas según los métodos descritos proporciona una serie de ventajas. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas del tabaco transgénicas, se pueden cultivar en suelos que contienen concentraciones de Cd variables, o en suelos que contienen concentraciones de Cd menores de las deseables. Estas plantas transgénicas y semillas derivadas pueden proporcionar más opciones para cultivarlas en una variedad 40 más amplia de entornos de suelo, lo que pueden aumentar la cantidad de suelos cultivables disponibles por el profesional (p. ej. agricultor). Además, estas plantas transgénicas, que presentan un contenido reducido de Cd, comparado con los homólogos no transgénicos, se pueden consumir directamente como productos comestibles. El consumo de partes comestibles de estas plantas transgénicas puede ser una opción más saludable comparado con el consumo de los homólogos no transgénicos. Las plantas adecuadas que pueden ser genéticamente modificadas 45 según los métodos descritos, incluyen plantas cultivables para uso agrícola, incluyendo arroz, maíz, calabaza, soja, lechuga, patatas, remolachas, hierbas, trigo, cebada, zanahorias, etc. El % de reducción de Cd en estas plantas transgénicas, incluyendo la parte de la lámina foliar, puede ser aproximadamente al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99%, cuando se compara con homólogos no transgénicos. El contenido de Cd de estas plantas transgénicas, incluyendo 50 la parte de lámina foliar, es un valor en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, and de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
IV. Productos consumibles que incorporan hojas de tabaco genéticamente modificadas para contener un contenido 55 reducido de Cd
Varias realizaciones proporcionan plantas transgénicas, en las que el nivel de expresión de miembros de la familia de genes de NtHMA está sustancialmente reducido para reducir o impedir el transporte de Cd en la lámina foliar. La lámina foliar derivada de plantas de tabaco transgénicas, producidas según los métodos descritos, se puede incorporar en varios productos consumibles que contienen Cd en un nivel sustancialmente inferior al de productos 60 consumibles hechos incorporando hojas de tabaco derivadas de plantas del mismo genotipo que se cultivaron en condiciones idénticas, pero no modificadas genéticamente con respecto al nivel de expresión reducido de miembros de la familia de genes de NtHMA (“homólogos no transgénicos”).
En algunas realizaciones, estas plantas transgénicas que presentan contenido de Cd reducido comparado con 65 homólogos no transgénicos, se pueden incorporar en productos consumibles, incluyendo diferentes artículos
fumables, tales como cigarros, cigarrillos y productos de tabaco sin humo (es decir, no combustible). Los artículos fumables y productos de tabaco sin humo, producidos incorporando hojas de tabaco derivadas de plantas de tabaco genéticamente modificadas para contener niveles de Cd reducidos según los métodos descritos, pueden proporcionar opciones más saludables comparados con los homólogos no transgénicos.
Los productos de tabaco sin humo que incorporan plantas de tabaco genéticamente modificadas según los métodos descritos se pueden fabricar en cualquier formato adecuado para la comodidad en una cavidad oral del consumidor. Los productos de tabaco sin humo contienen tabaco en cualquier forma, incluyendo como partículas secas, trozos, gránulos, polvos o una suspensión (es decir, extracto de tabaco), depositado sobre, mezclado en, rodeado por, o combinado de otra forma, con otros ingredientes en cualquier formato, tales como escamas, películas, tiras, 10 espumas o perlas. Los productos de tabaco sin humo pueden estar envueltos con un material, que puede ser comestible (es decir, disgregables por vía oral) o no comestibles. El contenido de líquido de los productos de tabaco sin humo puede estar encerrado en una forma tal como perlas, para evitar la interacción con una envoltura soluble en agua. La envoltura puede tener forma como una bolsa para encerrar parcial o completamente las composiciones que incorporan tabaco, o para funcionar como un adhesivo para mantener juntos una pluralidad de tiras, perlas o 15 escamas de tabaco. Una envoltura también puede encerrar una composición de tabaco moldeable que se acomoda a la forma de la boca de un consumidor. Una envoltura disgregable por vía oral puede encerrar tabaco sin humo, p. ej., como tabaco seco o tabaco soluble, y se puede formar en un equipo de termoconformado continuo o de conformado/llenado/sellado horizontal u otro equipamiento de envasado adecuado, usando películas comestibles (que pueden contener o no tabaco). Los materiales de ejemplo para construir una envoltura incluyen composiciones 20 en película que comprenden HPMC, CMC, pectina, alginatos, pululano y otros polímeros formadores de película comestibles, comercialmente viables. Otros materiales de envoltorio pueden incluir cápsulas preformadas producidas de gelatina, HPMC, almidón/carragenano, u otros materiales disponibles en el comercio. Dichos materiales de envoltorio pueden incluir tabaco como ingrediente. Los envoltorios que no son disgregables por vía oral pueden estar compuestos de tejidos o telas no tejidas, de papel revestido o no revestido, o de películas de 25 plástico perforadas o porosas de otra forma. Los envoltorios pueden incorporar agentes de sabor y/o color. Los productos sin humo se pueden montar junto con un envoltorio usando cualquier método conocido para expertos en la técnica del envasado comercial, incluyendo métodos tales como envasado blíster y envasado en barras, en los que se puede formar un pequeño envase mediante una máquina de envasado de conformación/llenado/sellado vertical. 30
El % de reducción de Cd en estos artículos fumables y productos sin humo, producidos incorporando hojas de tabaco derivadas de plantas de tabaco genéticamente modificadas para contener niveles de Cd reducidos, es un valor de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y 100%, cuando se compara con productos consumibles 35 derivados de homólogos no transgénicos. En algunas realizaciones, el contenido de Cd de estos artículos fumables y productos sin humo, producidos incorporando hojas de tabaco derivadas de plantas de tabaco genéticamente modificadas para contener niveles de Cd reducidos, es un valor en un intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, and de aproximadamente 0,01 40 a aproximadamente 5 ppm.
El grado de acumulación de Cd en plantas puede ser sustancialmente variable dependiendo de varios parámetros atribuidos a la complejidad del genotipo y el entorno de crecimiento. Por ejemplo, las concentraciones de Cd en hojas de tabaco cultivadas en el campo pueden ser extremadamente variable dependiendo de factores tales como la 45 agroclimatología, parámetros del suelo y variedad cultivada. Además, los patrones de distribución de Cd relativos dentro de diferentes partes de una planta de tabaco pueden variar según la especie, el órgano/tejido y condiciones de cultivo (es decir, cultivado en el campo frente a cultivo hidropónico). Como promedio, las concentraciones de Cd medidas en hojas de tabaco (incluyendo nervio medio y venas) cultivadas en el campo, puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 5 ppm (partes por millón, o ug/g de peso seco de hojas de tabaco). Sin embargo, muchos 50 niveles de Cd publicados típicamente no definen el estado de madurez del tabaco, la variedad del tabaco, o las partes de la hoja particulares (es decir, posición del tallo de retirada de la hoja) recogida para el análisis. En algunas variedades, las hojas inferiores pueden acumular niveles de Cd mayores que las hojas medias o superiores. A nivel intracelular, el Cd se puede encontrar en diferentes componentes celulares de una célula vegetal, incluyendo la pared celular, citoplasma, cloroplasto, núcleo y vacuolas. 55
Además, el contenido de Cd medido en las hojas de tabaco puede variar sustancialmente dependiendo de los niveles de Cd en el entorno del suelo donde se cultivan las plantas de tabaco. Las hojas de tabaco cultivadas en áreas contaminadas con Cd pueden acumular Cd desde aproximadamente 35 ppm o mayor, comparado con las hojas de homólogos genéticamente idénticos cultivados en áreas no contaminadas, que pueden acumular Cd en un 60 intervalo de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 8 ppm Las vacuolas dentro de las hojas de las plantas cultivadas en áreas contaminadas con Cd pueden acumular concentraciones muy altas de Cd. Los expertos en la técnica conocen métodos para modificar las composiciones descritas para que sean adecuadas para una especie dada de planta de interés.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Clonación y cartografía de exones de un clon genómico de NtHMA de Nicotiana de longitud entera
Se identificaron independientemente dos clones genómicos parciales que representaban diferentes partes de un gen 5 de NtHMA endógeno, denominados “CHO_OF96xf01.ab1quot; y quot;CHO_OF261xo09c1.ab1.quot; Basándose en la información de secuencia obtenida de los clones genómicos parciales, posteriormente se identificaron un clon genómico de longitud entera (_HO-18-2) y 4 ADNc de NtHMA de longitud entera, que incluían el clon P6663 (SEQ ID NO: 3) y el clon P6643 (SEQ ID NO: 47). Se cartografiaron las regiones de exones e intrones del clon genómico de longitud entera (_HO-18-2) (17.921 pb). Como se muestra en la figura 1, el gen de NtHMA endógeno de longitud 10 entera clonado a partir de Nicotiana comprende 11 exones que consisten en 3392 nucleótidos en total.
EJEMPLO 2
Construcción del vector de expresión de ARNi de NtHMA PBI121-NtHMA (660-915) que codifica polinucleótidos de ARNi 15
La tabla 1 proporciona una lista de posiciones de nucleótidos cartografiadas de cada exón en el clon genómico de NtHMA (SEQ ID NO: 1).
Tabla 1
Exón
Nucleótidos Posición
Exón 1
1-303 724-1026
Exón 2
304-561 3245-3502
Exón 3
562-659 7364-7461
Exón 4
660-915 11525-11780
Exón 5
916-1056 11866-12007
Exón 6
1057-1381 12317-12644
Exón 7
1382-1584 13108-13310
Exón 8
1585-1787 13456-13658
Exón 9
1788-3285 14278-15775
Exón 10
3286-3618 16097-16429
Exón 11
3619-4392 16650-17423
El clon genómico parcial CHO_OF96xf01.ab1 incluye una parte del intrón 4, exón 4, intrón 5, exón 5, intrón 6, y una parte del exón 6, como se muestra en la figura 1 y está listado en la tabla 1. El clon genómico parcial CHO_OF261xo09c1 incluye una parte del intrón 7, exón 7, intrón 8, exón 8, e incluye una parte del exón 9, como se 25 muestra en la figura 1. Para producir plantas transgénicas que puedan producir establemente polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés que puedan facilitar la degradación de transcritos de ARN endógenos que codifican polipéptidos de NtHMA, dos conjuntos de vectores de expresión de ARNi de NtHMA, el vector de expresión de ARNi PBI121-NtHMA (660-915) como se describe con más detalle más adelante, y el vector de expresión de ARNi PBI121-NtHMA (1382-1584) como se describe con más detalle en el ejemplo 3. 30
La figura 2 ilustra una estrategia de subclonación de ejemplo para construir un vector de expresión de ARNi de NtHMA que permite la expresión constitutiva de polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés. Basándose en la cartografía de exones y análisis de secuencia del clon genómico CHO_OF96xf01.ab1, se diseñaron construcciones de ARNi. 35
La figura 3A muestra una secuencia de ARNi de ejemplo, NtHMA (660-915), para producir polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés. En la figura 3A, la construcción de ARNi de ARNi de NtHMA (SEQ ID NO: 41) comprende un fragmento codificante (272 pb) (SEQ ID NO: 38) compuesto del exón 4 (272 pb), que está situado en la dirección 5’ y operativamente unido a un fragmento espaciador (80 pb) (SEQ ID NO: 39) compuesto del intrón 5, que está situado 40 en la dirección 5’ y operativamente unido a un fragmento complementario inverso (272 pb) (SEQ ID NO: 40) compuesto del exón 4 situado en una orientación de sentido contrario. Las construcciones de ARNi que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés se insertaron en el vector de clonación PBKCMV, y se situaron en la dirección 3’ y operativamente unidos a un promotor de citomegalovirus (CMV). Se incorporaron sitios XbaI y HindIII en los extremos 5’ y 3’ del fragmento codificante de NtHMA de 352 pb, que incluía el fragmento de intrón de 80 pb 45 usando cebadores de PCR modificados para incorporar estos sitios de enzimas de restricción (PMG783F: ATTCTAGACTGCTGCTATGTCATCACTGG [SEQ ID NO: 50] y PMG783R: ATAAGCTTAGCCTGAAGAATTGAGCAAA [SEQ ID NO: 51]). Igualmente, se incorporaron sitios SpeI y SacI en los extremos 5’ y 3’ del correspondiente fragmento complementario inverso de NtHMA usando cebadores de PCR (PMG 785F: ATGAGCTCTGGTTATGTAGGCTACTGCTGCT [SEQ ID NO: 52] y PMG 786R: 50 ATACTAGTATTTGTAGTGCCAGCCCAGA [SEQ ID NO: 53]) para producir el plásmido de ARNi PBKCMV-NtHMA. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA se construyeron mediante (a) escisión del ORF de β-glucuronidasa del vector de expresión binario (quot;pBI121quot; de CLONTECH), y (b) sustitución con la construcción de ARNi de NtHMA, escindida del plásmido de ARNi PBKCMV-NtHMA, en sitios XbaI/SacI del plásmido PBI121 en
lugar del ORF de β-glucuronidasa eliminado. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA comprenden: (i) fragmento codificante de 352 pb XbaI-HindIII NtHMA que incluye (ii) fragmento de intrón de 80 pb, operativamente unido al (iii) fragmento complementario inverso de 272 pb SpeII-SacI NtHMA.
EJEMPLO 3 5
Construcción del vector de expresión de ARNi de NtHMA PBI121-NtHMA (1382-1584) que codifica polipéptidos de ARNi
La figura 4A muestra una secuencia de ARNi de ejemplo, NtHMA (1382-1584), para producir polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés. Basándose en la cartografía de exones y análisis de secuencia del clon genómico CHO_OF261xo09c1, se diseñó una construcción de ARNi (SEQ ID NO: 41) que incluye un fragmento codificante 10 (191 pb) (SEQ ID NO: 42) que comprende secuencias del exón 7, que está situado en la dirección 5’ y operativamente unido a un fragmento de ADN espaciador (139 pb) (SEQ ID NO: 43) que comprende secuencias del intrón 8, que está situado en la dirección 5’ y operativamente unido a un fragmento complementario inverso (196 pb) (SEQ ID NO: 44) que comprende secuencias del exón 7 situado en una orientación de sentido contrario. Estas construcciones de ARNi que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés se insertaron en el vector de 15 clonación PBKCMV, y se situaron en la dirección 3’ y operativamente unidos a un promotor de citomegalovirus (CMV). Se incorporaron sitios XbaI y HindIII en los extremos 5’ y 3’ del fragmento codificante de 330 pb de NtHMA, que incluía el fragmento de intrón de 139 pb usando cebadores de la PCR modificados para incorporar estos sitios de enzimas de restricción (PMG754F: ATTCTAGATGAGAGCAAGTCAGGTCATCC [SEQ ID NO: 54] y PMG754R: ATAAGCTTTTCAAACATCCACCGCATTA [SEQ ID NO: 55]). Igualmente, se incorporaron los sitios PstI y SacI en 20 los extremos 5’ y 3’ del correspondiente fragmento complementario inverso de NtHMA usando los cebadores de PCR, PMG757F: ATGAGCTCGCATTGAGAGCAAGTCAGGTC [SEQ ID NO: 56] y PMG757R: ATCTGCAGCCTGTGGTACATCCAGCTCTT [SEQ ID NO: 57]) para producir el vector de expresión de ARNi PBKCMV-NtHMA.
Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA se construyeron mediante (a) escisión del ORF de β-glucuronidasa del vector de expresión binario (quot;pBI121quot; de CLONTECH), y (b) sustitución con la construcción de ARNi de NtHMA, escindida del plásmido de ARNi PBKCMV-NtHMA, en sitios XbaI/SacI del plásmido PBI121 en lugar del ORF de β-glucuronidasa eliminado. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA comprenden: (i) fragmento codificante de 330 pb XbaI-HindIII de NtHMA que incluye (ii) el fragmento de intrón de 139 pb, 30 operativamente unido al (iii) fragmento complementario inverso de 169 pb SpeII-SacI de NtHMA. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA, tales como los descritos en los ejemplos 2 y 3, se pueden introducir en cualquier célula de planta hospedante de interés por varios métodos conocidos por los expertos en la técnica.
EJEMPLO 4 35
Transformación de las variedades de tabaco of Burley (TN90), curado al humo (K326) y negro (VA359) con vectores de expresión de ARNi de NtHMA
Semillas de tabaco de 3 variedades diferentes, Burley (TN90), curado al humo (K326) y negro (VA359), se esterilizaron y germinaron en una placa petri que contenía medio basal MS complementado con mezcla conservante de planta 5 ml/l (PPM). Los plantones, aproximadamente a los 7 a 10 días después de germinación, se 40 seleccionaron para la transformación con varios vectores de expresión de ARNi de NtHMA. Se inoculó una sola colonia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 en un medio LB líquido que contenía kanamicina 50 mg.l-1 (monosulfato de kanamicina), y se incubaron durante 48 h a 28ºC con agitación recíproca (150 ciclos.min-1). Las células bacterianas cultivadas se recogieron por centrifugación (6000xg, 10 min) y se suspendieron hasta una densidad final DO600 de 0,4-0,7, con 20 ml de medio MS líquido que contenía sacarosa 20 g-1. El día 7-10 los 45 explantes de plantones se sumergieron en una suspensión bacteriana durante 5 min y se transfirieron a papeles de filtro estéril. Se pusieron 50 explantes sobre partes alícuotas de 40 ml de medio agar REG (medio basal MS complementado con NAA 0,1 mg.l-1 y BAP 1 mg.l-1) en placas petri de 10 mm x 20 mm. Los explantes se cocultivaron con Agrobacterium a 25ºC. Después de 3 días de cocultivo, los explantes se lavaron y se transfirieron a medio RCPK (medio REG con kanamicina 100 mg.l-1, carbenicilina 500 mg.l-1 y 5 ml de PPM) para seleccionar los 50 transformantes. Los explantes se subcultivaron cada 2 semanas. Después de 8-12 semanas de crecimiento en condiciones selectivas, las plantas que sobrevivieron, que representaban los transformantes que han integrado las construcciones de expresión de ARNi de NtHMA en sus genomas, se transfirieron a medio de enraizamiento (medio basal MS complementado con kanamicina 100 mg.l-1). Las plantas enraizadas se transfirieron a macetas para promover el crecimiento posterior. 55
EJEMPLO 5
Reducción de Cd en la lámina foliar de la primera generación de transgénicos genéticamente modificados para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA en el transporte de Cd desda la raíz 60 a las partes aéreas de las plantas transgénicas, se determinaron los niveles de Cd para varias líneas transgénicas que se habían modificado genéticamente para expresar los polinucleótidos de ARNi NtHMA (660-915) o (1382-1584).
Se transformaron aproximadamente 40 plantas transgénicas independientes, que representaban tres variedades de 65 tabaco, con vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA. Inicialmente, los transformantes se cultivaron en
bandejas que flotan que contenían medio Hoagland durante 4 semanas. Las plantas positivas por PCR para NPTII se seleccionaron y se pusieron en macetas de 25,4 cm (10”) con un sistema hidropónico que contenía medio Hoagland que contenía CdCl2 5 µM. Después de 4-8 semanas, se recogieron dos muestras de hojas centrales y se liofilizaron para el análisis de metales o se congelaron en nitrógeno líquido para el análisis de la expresión génica. Se pesaron aproximadamente 500 mg de tabaco y se digirieron en 10 ml de HNO3 concentrado por sistema de 5 digestión 5 por sistema de reacción acelerado por microondas (CEM corporation, Mathews, NC). Las concentraciones de metales pesados se analizaron usando espectrofotometría de masas de emisión de plasma acoplado inductivamente (quot;ICP-MS,quot; Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como control de tabaco no transgénico, se preparó una muestra certificada que consistía en hojas de tabaco de Virginia, CTA-VTL-2, en condiciones comparables (Dybczynski et al., 1997). 10
Las figuras 3B-3D muestran la reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de primera generación (TO), que representan tres variedades, que se han modificado genéticamente para expresar los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). En cada gráfica las unidades del eje y son µg/mg de tejido.
Las figuras 4B-4D muestran la reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de primera generación (TO), que representan tres variedades, que se han modificado genéticamente para expresar los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (1382-1584). En cada gráfica las unidades del eje y son µg/mg de tejido.
EJEMPLO 6 20
Reducción en transcritos de ARN de NtHMA en hojas de tabaco transgénico por la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA en los niveles en estado estacionario de transcritos de ARN de NtHMA endógenos, se midió el cambio relativo de transcritos de ARN de NtHMA aislando el ARN celular total de partes de la lámina foliar de varias líneas transgénicas, que representan tres 25 variedades de tabaco.
El ARN total se aisló de hojas centrales de plantas T0 usando el reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, el ARN purificado se trató con DNasa exenta de RNasa (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera cadena de ADNc, se llevó a cabo la transcripción inversa de aproximadamente 30 10 µg de ARN total usando el kit High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcritos de NtHMA en las muestras, se llevó a cabo una RT-PCR de 2 etapas cuantitativa de acuerdo con la técnica química basada en la sonda de Taqman MGB. La mezcla de RT contenía mezcla de dNTP 4 mM, 1X cebadores aleatorios, 1X tampón de RT, 10 g de ADNc, 50 U de transcriptasa inversa Multiscribe (Applied Biosystems), 2 U de inhibidor de RNasa Superase-In (Ambion), y agua exenta de nucleasa. La mezcla de PCR 35 contenía 1X mezcla Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), cebador directo 400 nM, cebador inverso 400 nM, sonda Taqman MGB 250 nM, 2 ng de ADNc, y agua exenta de nucleasas. La RT-PCR se llevó a cabo usando un sistema ABI 7500 Real-Time System (Applied Biosystems, Foster City, CA) y en las condiciones de amplificación: 50°C durante 2 min; 95°C durante 10 min; 40 ciclos de 95°C durante 15 s; y 60°C durante 1 min. Para normalizar los niveles de transcritos de ARN de NtHMA medidos, se seleccionó la 40 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) como un control de transcrito de ARN endógeno, cuyo nivel de expresión no es sensible a la actividad de interferencia del ARN específico de secuencia de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA que se analizan. El número de veces de cambio del nivel de transcritos de ARN de NtHMA causado por la expresión del polinucleótidos de ARNi de NtHMA se calculó determinando la relación de (a)/(b), en la que (a) representa el valor normalizado del nivel de transcritos de ARN de NtHMA determinado para muestras derivadas de 45 plantas transgénicas con un vector de expresión de ARNi de NtHMA, y (b) representa el valor normalizado del nivel de transcrito de ARN de NtHMA determinado para muestras derivadas de plantas transgénicas transformadas con un vector de expresión de control deficiente en la construcción de ARNi de ARNi de NtHMA.
Las figuras 5A-C muestran los niveles de transcritos de ARN de NtHMA normalizados en diferentes líneas 50 transgénicas de primera generación (TO) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, determinado por análisis de PCR cuantitativo en tiempo real de extractos de lámina foliar. La figura 5A muestra que para múltiples líneas transgénicas de K326 derivadas de forma independiente, los niveles de transcritos de ARN se redujeron mediante la actividad de interferencia de ARN de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). La figura 5B muestra que para múltiples líneas transgénicas de TN90 derivadas de 55 forma independiente los niveles de transcritos de ARN se redujeron mediante la actividad de interferencia de ARN de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). La figura 5C muestra que para múltiples líneas transgénicas de VA359 derivadas de forma independiente, los niveles de transcritos de ARN se redujeron mediante la actividad de interferencia de ARN de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). La reducción del nivel de transcritos de ARN de NtHMA está de acuerdo con la reducción del contenido de Cd medido en las hojas centrales para las 60 mismas líneas transgénicas ensayadas. “PBI121” representa un vector de expresión deficiente en la construcción de ARNi que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915).
EJEMPLO 7
Distribución de Cd y Zn en líneas transgénicas genéticamente modificadas para expresar los polinucleótidos de 65 ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915) en la distribución de Cd y Zn en la lámina foliar y la raíz, se analizó el contenido de metales de las plantas transgénicas de tres variedades. Se seleccionaron 5 líneas transgénicas de cada variedad, es decir, curado al humo (K326), Burley (TN90) y negro (VA359), por presentar contenido de Cd en el intervalo más bajo en la lámina foliar. Se recogieron hojas centrales y raíces de estas plantas transgénicas y de plantas de control para el análisis de metales por ICP-5 MS. Después de 8 semanas, todas las plantas se cultivaron en medio Hoagland complementado con CdCl2 5 µM antes de la recolección.
La tabla 2 lista los niveles de Cd y Zn medidos en la lámina foliar y la raíz de varias líneas transgénicas, que representan tres variedades de tabaco, como se proporciona más adelante. En la tabla 2, la distribución de Cd entre 10 la lámina foliar y la raíz se modificaron sustancialmente por la expresión de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915) para las tres variedades, curado al humo (K326), Burley (TN90) y negro (VA359). Para las líneas transgénicas de K326, el % de reducción de Cd estaba en el intervalo de 97,16-98,54% comparado con los niveles de Cd observados en las plantas de control de K326. Para las líneas transgénicas de TN90, el % de reducción de Cd estaba en el intervalo de 85,12-90,96% comparado con los niveles de Cd observados en las plantas de control de 15 TN90. Para las líneas transgénicas de VA359, el % de reducción de Cd estaba en el intervalo de 93,24-99,07% comparado con los niveles de Cd observados en las plantas de control de VA359. La línea transgénica de VA359 NtHMA-11 presentaba el nivel más bajo de Cd (1,62 µg/g) y el mayor % de reducción de Cd (99,07%), cuando se comparaba frente a dos líneas de control deficientes en el transgén de ARNi de NtHMA (quot;VA359 PBI121quot;) que presentaban niveles de Cd de 158,3 - 205,96 mg/g. Análisis de la raíz comparables de las líneas transgénicas 20 mostraron que se podía acumular una cantidad sustancial de Cd en la raíz, dando como resultado un número de veces de aumento de los niveles de Cd en la raíz en el intervalo de 6,90 - 15,38, con respecto a los niveles de Cd observados en los controles respectivos.
En contraste con la significativa reducción de Cd en la lámina foliar de las líneas transgénicas, el contenido de Zn de 25 la lámina foliar no se redujo sustancialmente, aunque se observó cierta reducción en la mayoría de las líneas transgénicas, causada por la expresión de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). El contenido de Zn en la raíz (última columna de la tabla 3) aumentó en todas las líneas transgénicas, dando como resultado un aumento de 4-6 veces en las líneas transgénicas de las variedades K326 y VA359, y un aumento de 3-5 veces en la variedad de TN90. 30
La figura 6 muestra la distribución de Cd y Zn entre la lámina foliar y la raíz de varias líneas transgénicas de primera generación que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la tabla 2. En cada gráfica de la figura 6, las unidades del eje y son µg/mg de tejido.
Tabla 2
Variedad transgénica
Hoja Raíz
Cd Zn Cd Zn
K326 06T458
7,09 22,2
K326 06T459
4,97 24,1
K326 06T473
3,7
K326 06T480
3,93 38,6
K326 06T482
2,55 36,3
K326 Control
174,7 36,3 64,3 35,7
TN90 06T428
26,3 48,6
TN90 06T430
16,08 37,2
TN90 06T444
15,98 28,1
TN90 06T445
20,72 32,6
TN90 06T455
17,87 24,4
TN90 PB1121
181,2 35,5 62,6 44,3
TN90 Control
172,4 32,3 72,9 46,6
VA359 06T493
7,59 23,1
VA359 06T498
1,62 26,2
VA359 06T506
5,72 28,8
VA359 06T542
7,03 27,1
VA359 06T543
11,78 29,3
VA359 PBI121
47,5 35,3 27,6
VA359 Control
158,5 32,6 37,6 26,2
EJEMPLO 8
Distribución de Cd en varios tejidos de líneas transgénicas genéticamente modificadas para expresar polinucleótidos 40 de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (1382-1584) en la distribución de Cd en diferentes tejidos (es decir, la corteza, lámina, médula y raíz), se analizó el contenido de metales de varias líneas transgénicas que representan dos variedades Burley (TN90) y curado al humo (K326). Se recogieron plantas
transgénicas completamente maduras para el análisis de metales por ICP-MS. Después de 8 semanas, todas las plantas se cultivaron en CdCl2 5 µM en medio Hoagland antes de la recolección.
La tabla 3 lista el contenido de Cd en los tejidos de la corteza, lámina, médula y raíz de varias líneas transgénicas, como se proporciona más adelante. En la tabla 3, los niveles de Cd se redujeron sustancialmente en los tejidos de la 5 corteza, lámina, médula y raíz de todas las líneas transgénicas ensayadas cuando se comparaban con las plantas de control. El “control” representa las plantas no transgénicas. El “PBI121” representa plantas transgénicas transformadas con un vector de expresión deficiente en la construcción de ARNi de ARNi de NtHMA. La extensión de la reducción de Cd en la corteza, médula y lámina foliar de las líneas transgénicas de K326 era significativamente mayor que la observada en las líneas transgénicas de YN90. La expresión de los polinucleótidos de ARNi (1382-10 1584) en plantas transgénicas de K326 dio como resultado una reducción de Cd de 9-11 veces en la corteza, una reducción de Cd de 6-13 veces en la médula y una reducción de Cd de 31-32 veces en la lámina foliar. La expresión de los polinucleótidos de ARNi (1382-1584) en plantas transgénicas de TN90 dio como resultado una reducción de Cd de 4-7 veces en la corteza, una reducción de Cd de 5-8 veces en la médula y una reducción de Cd de 6-20 veces en la lámina foliar. En cambio, se observaron aumentos modestos (5-6 veces) del contenido de Cd en la raíz de 15 estas líneas transgénicas cuando se comparaban con las plantas de control.
La figura 7 muestra la distribución de Cd entre la corteza (“B”), lámina foliar (“L”), médula (“P”) y raíz (“R”) de varias líneas transgénicas de primera generación que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la tabla 3. En cada gráfica de la figura 7, las unidades del eje y son 20 µg/mg de tejido.
Tabla 3
Variedad de semilla transgénica
Cd en corteza Cd en lámina Cd en médula Cd en raíz
TN90 06T619
7,36 31,1 4,67
TN90 06T658
3,76 8,89 2,89
TN90 Control
30,9 25,3
TN90 PBI121
23,1
K326 06T682
2,02 4,32 1,97
K326 06T696
2,53 4,48 4,25
K326 Control
19,5 25,3
K326 PBI121
25,5 26,2
EJEMPLO 9
Reducción de Cd en la lámina foliar de líneas transgénicas de segunda generación genéticamente modificadas para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915) en el contenido de Cd en la lámina foliar, se determinó el contenido de metal de dos líneas transgénicas (T1) de la variedad VA359 cultivadas 30 en suelo que contenía concentraciones variables de Cd durante 4 semanas. Se seleccionaron dos líneas transgénicas 06T498 y 06T506, como positivas para kanamicina por PCR. Varias macetas de 25,4 cm (10”) llenas con mezcla de arena:suelo se saturaron con CdCl2 0, 0,1, 0,5, o 5 µM. Se cultivaron tres plantas por tratamiento por línea transgénica durante 4 semanas añadiendo medio Hoagland al platillo de la maceta. Se observaron el número total de hojas, índice del área foliar, peso foliar, peso del tallo y peso de la raíz. Dos muestras de hojas centrales y 35 raíces se liofilizaron y se sometieron a análisis de metales pesados.
La figura 8 muestra la distribución de Cd entre la lámina foliar (“L”) y la raíz (“R”) de varias líneas transgénicas de segunda generación (T1) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés. En cada gráfica de la figura 8, las unidades del eje y son µg/mg de tejido. A partir de la figura 8 se puede 40 ver que el contenido de Cd de las plantas transgénicas era sistemáticamente menor que el de las plantas de control en todas las concentraciones de Cd ensayadas (0, 0,1, 0,5, o 5 µM). Se observó una reducción del contenido de Cd de la lámina foliar (2-4,7 veces) en varias líneas transgénicas ensayadas. El nivel de Cd para la línea 06T498 era solo ∼20% de las plantas de control con CdCl2 5 µM. Se observó un aumento del contenido de Cd en la raíz (4-16 veces) en varias líneas transgénicas ensayadas. El mayor contenido de Cd en la raíz (un aumento de 16 veces) se 45 observó para la línea 06T498 con CdCl2 5 µM. Por lo tanto, el contenido reducido de metales pesados en la lámina foliar/brotes en las líneas transgénicas que expresaban polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915), sugería la que traslocación de una cantidad sustancial de metales pesados desde la raíz a la lámina foliar/brotes se podía interrumpir por la interferencia de ARNi. Los resultados están de acuerdo con la reducción de Cd observada en la lámina foliar de las líneas transgénicas de primera generación, en cuanto que las líneas transgénicas de segunda 50 generación también demostraban (a) niveles de Cd reducidos en la lámina foliar, y (b) Cd aumentado en las raíces. Las líneas transgénicas no demostraron diferencias fenotípicas en el aspecto general, crecimiento y desarrollo relativo al de las plantas de control.
EJEMPLO 10 55
Polinucleótidos de NtHMA
Un polinucleótido de NtHMA en general contendrá enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, están incluidos
análogos de ácidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternas, que comprenden, p. ej., enlaces fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato o O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleótidos and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); y cadenas principales y enlaces de ácidos nucleicos peptídicos. Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con cadenas principales positivas; cadenas principales no iónicas y cadenas principales sin ribosa, incluyendo las descritas en las patentes de EE.UU. nº 5 5.235.033 y 5.034.506, y los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds. También están incluidos los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos, en una definición de ácidos nucleicos. Las modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato se pueden hacer por una variedad de razones, p. ej., para aumentar la estabilidad y la semivida de dichas moléculas en entornos fisiológicos o como sondas en un biochip. Se pueden hacer mezclas de ácidos nucleicos naturales y 10 análogos; alternativamente, se pueden hacer mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos naturales y análogos.
Una variedad de referencias describen dichos análogos de ácidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo, fosforamidato (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993) y referencias citadas en el mismo; Letsinger, J. Org. Chem. 15 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); y patente de EE.UU. nº 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989), enlaces de O-metilfoforoamidita (véase, Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), y cadenas principales y 20 enlaces de ácidos nucleicos peptídicos (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996), todos los cuales se incorporan por referencia). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los que tienen cadenas principales positivas (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); cadenas principales no iónicas (patentes de EE.UU. nº 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 25 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, quot;Carbohydrate Modifications in Antisense Researchquot;, Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y cadenas principales sin ribosa, incluyendo las descritas en las patentes de EE.UU. nº 5.235.033 y 5.034.506, y capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, 30 quot;Carbohydrate Modifications in Antisense Researchquot;, Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook. También están incluidos los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos, en una definición de ácidos nucleicos (véase, Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176). Se describen varios análogos de ácidos nucleicos en Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 página 35. Estas referencias se incorporan en la presente memoria expresamente por referencia. 35
Otros análogos incluyen ácidos nucleicos peptídicos (PNA) que son análogos de ácidos nucleicos peptídicos. Estas cadenas principales son sustancialmente no iónicas en condiciones neutras, a diferencia de la cadena principal de fosfodiéster muy cargada de ácidos nucleicos naturales. Esto da como resultados dos ventajas. Primero, la cadena principal de PNA presenta cinéticas de hibridación mejoradas. Los PNA tienen cambios mayores de temperaturas de 40 fusión (Tm) para las pares de bases con apareamiento erróneo frente a las apareadas perfectamente. El ADN y ARN típicamente presenta una caída en la Tm de 2-4ºC para un apareamiento erróneo interno. Con la cadena principal de PNA no iónica, la caída está cerca de 7-9ºC. Igualmente, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases unidas a estas cadenas principales es relativamente insensible a la concentración salina. Además, los PNA no son degradados por enzimas celulares, y por lo tanto pueden ser más estables. 45
Entre los usos de los polinucleótidos de NtHMA descritos, y combinaciones de fragmentos de los mismos, está el uso de fragmentos como sondas o cebadores o en el desarrollo de moléculas de ARNi. Dichos fragmentos en general comprenden al menos aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras realizaciones, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o al menos 60 nucleótidos contiguos de una secuencia 50 de ADN. Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y guía para diseñar condiciones adecuadas se exponen en Sambrook et al. 1989, y se describen con detalle antes. Usando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos expuestas antes, se pueden preparar conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, p. ej., en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), en las que fragmentos de ADN se aíslan y amplifican. En algunas 55 realizaciones, se pueden usar cebadores degenerados como sondas para genotecas no humanas. Dichas genotecas incluirían, pero no se limitan a bibliotecas de ADNc, genotecas e incluso EST electrónico (marcador de secuencia expresada) o bibliotecas de ADN. Por lo tanto, se usarían secuencias homólogas identificadas por este método como sondas para identificar homólogos no humanos de la secuencia de NtHMA identificada en la presente memoria. 60
Los ejemplos de referencia también incluyen polinucleótidos y oligonucleótidos que hibridan en condiciones restrictivas reducidas, típicamente condiciones moderadamente restrictivas y habitualmente condiciones muy restrictivas (también denominadas “altamente restrictivas”), con un polinucleótido de NtHMA descrito en la presente memoria. Los parámetros básicos que afecta a la elección de las condiciones de hibridación y la guía para diseñar 65 condiciones adecuadas se exponen en Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4, incorporados en la presente memoria por referencia), y las pueden determinar fácilmente los expertos en la técnica, basándose, por ejemplo, en la longitud y/o composición de bases del polinucleótido. Un modo de conseguir condiciones moderadamente restrictivas implica el uso de una solución de prelavado que contiene 5xSSC, SDS al 5 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, 6xSSC, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55ºC (u otras soluciones de hibridación similares, tales como las que contienen aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42ºC), y condiciones de lavado de aproximadamente 60ºC en 0,5xSSC, SDS al 0,1%. En general, las condiciones altamente restrictivas se definen como condiciones de hibridación como antes, pero con lavado a aproximadamente 10 68ºC, 0,2xSSC, SDS al 0,1%. SSPE (1x SSPE es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) se puede sustituir por SSC (1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; se llevan a cabo lavados durante 15 min después de completarse la hibridación. Debe entenderse que la temperatura de lavado y la concentración salina de lavado se pueden ajustar según sea necesario para lograr el grado deseado de restricción aplicando los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y 15 estabilidad de dúplex, como conocen los expertos en la técnica y se describe con más detalle más adelante (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989). Cuando se hibrida un ácido nucleico con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, la longitud del híbrido se supone que es la del ácido nucleico de hibridación. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido se puede determinar alineando las secuencias de ácidos nucleicos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencias óptima. La temperatura 20 de hibridación para los híbridos que se prevé que sean menores de 50 pares de bases de longitud debe ser de 5 a 10ºC menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde la Tm se determina según las siguientes ecuaciones. Para los híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm (ºC)=2(nº de bases A+T)+4(nº de bases G+C). Para híbridos de más de 18 pares de bases de longitud, Tm (ºC)=81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41 (% G+C)-(600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en el 25 tampón de hibridación ([Na+] para 1x SSC=0,165 M). Típicamente, cada uno de dichos ácidos nucleicos de hibridación tiene una longitud que es al menos 25% (habitualmente al menos 50%, 60%, o 70%, y lo más habitualmente 80%) de la longitud de un polinucleótido de la descripción con el que hibrida, y tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, o al menos 99%) con un polinucleótido de la descripción con el que hibrida. 30
EJEMPLO 11
Polipéptidos de NtHMA
Un polipéptido de la descripción se pude preparar cultivando células hospedante transformadas o recombinantes en condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido de la descripción. El polipéptido expresado resultante 35 después se puede purificar de dicho cultivo usando procedimientos de purificación conocidos. La purificación del polipéptido también puede incluir una columna de afinidad que contiene agentes que se unirán al polipéptido; una o más etapas de la columna sobre resinas de afinidad tales como concanavalina A-agarosa, heparin-toyopearl® o Cibacrom blue 3GA Sepharose®; una o más etapas que implican cromatografía por interacción hidrófoba usando resinas tales como de éter fenílico, éter butílico o éter propílico; o cromatografía de inmunoafinidad. 40 Alternativamente, el polipéptido de la descripción también se puede expresar en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, se puede expresar como un polipéptido de fusión, tal como los del polipéptido de unión a maltosa (MBP), glutatión-5-transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX). Están disponibles en el comercio kits para la expresión y purificación de dichos polipéptidos de fusión, en New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.), e InVitrogen, respectivamente. El polipéptido también se puede marcar con un epítopo y purificar 45 posteriormente usando un anticuerpo específico dirigido a dicho epítopo. Finalmente, se puede usar una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que usa medio de RP-HPLC hidrófobo, p. ej., gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes, para purificar más el polipéptido. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diferentes combinaciones, también se pueden usar para proporcionar un polipéptido recombinante sustancialmente homogéneo. Por lo tanto, el polipéptido así 50 purificado carece sustancialmente de otros polipéptidos de mamífero y se define, de acuerdo con la invención, como un “polipéptido sustancialmente purificado”, dichos polipéptidos purificados incluyen polipéptido de NtHMA, fragmento, variante y similares. La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la descripción se pueden llevar a cabo por cualquier técnica, incluyendo pero sin limitar los métodos descritos en la presente memoria. 55
También se puede usar una columna de afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos de la descripción, para purificar por afinidad polipéptidos expresados. Estos polipéptidos se pueden separar de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, p. ej., en un tampón de elución muy salino y después dializar en un tampón de menor salinidad para usar o cambiando el pH u otros componentes dependiente de la matriz de 60 afinidad usada, o separarlos de forma competitiva usando el sustrato natural del resto de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la descripción.
Un polipéptido de la descripción también se puede producir por síntesis química convencional. Los métodos para construir los polipéptidos de la descripción o fragmentos de los mismos por medios sintéticos son conocidos para los 65 expertos en la técnica. Las secuencias de polipéptido construidas de forma sintética, por compartir características
conformaciones y/o estructurales primarias, secundarias o terciarias con los polipéptidos naturales, puede tener propiedades biológicas en común con los mismos, incluyendo la actividad biológica.
EJEMPLO DE REFERENCIA 1
Anticuerpos anti-NtHMA 5
En un ejemplo de referencia, se proporcionan en la presente memoria anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos de la descripción. Los polipéptidos de NtHMA, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión y similares, como se exponen en la presente memoria, se pueden usar como “inmunógenos” en la producción de anticuerpos inmunorreactivos con estos. Dichos anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos por los sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos que se unen específicamente son aquellos que reconocerán 10 específicamente y se unirán con los polipéptidos de la familia de NtHMA, homólogos, y variantes, pero no con otras moléculas. En una realización, los anticuerpos son específicos para polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de NtHMA de la descripción, como se expone en la SEQ ID NO: 2 y no tienen reacciones cruzadas con otros polipéptidos.
Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, contienen determinantes o epítopos antigénicos que desencadenan la formación de anticuerpos. Estos determinantes o epítopos antigénicos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos de una sola sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena de polipéptido que se ponen 20 próximos tras el plegamiento del polipéptido. Se pueden identificar epítopos por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Además, los epítopos de los polipéptidos de la descripción se pueden usar como reactivos de investigación en ensayos, y para purificar anticuerpos de unión específica de sustancias tales como sueros policlonales o líquidos sobrenadantes de hibridomas cultivados. Dichos epítopos o variantes de los mismos se pueden producir usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como la síntesis en fase sólida, escisión 25 química o enzimática de un polipéptido, o usando tecnología de ADN recombinante.
Se pueden preparar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales contra los polipéptidos de la descripción mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, 30 Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Kohler y Milstein, (patente de EE.UU. nº 4.376.110); la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kosbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026, 1983); y la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). También están contempladas en la presente memoria las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los 35 polipéptidos de la descripción. Dichos hibridomas se pueden producir e identificar por técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar varios animales hospedantes mediante inyección con un polipéptido de NtHMA, fragmento, variante o mutantes de los mismos. Dichos animales hospedantes pueden incluir, pero no se limitan a conejos, ratones y ratas, por nombrar algunos. Se pueden usar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dependiendo de las especies hospedantes, dichos adyuvantes incluyen, pero 40 no se limitan a Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales se pueden recuperar por técnicas convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo 45 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de las mismas.
Los anticuerpos de la descripción también se pueden usar en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la descripción, in vitro o in vivo. Los anticuerpos también se pueden usar en la purificación de polipéptidos o fragmentos de la descripción por cromatografía de inmunoafinidad. 50
EJEMPLO 12
ARN bicatenarios
En una realización, la descripción proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenarias (ARNbc) para inhibir la expresión del gen de NtHMA en una célula (p. ej., una célula de planta), en donde el ARNbc comprende una cadena 55 de sentido contrario que comprende una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión del gen de NtHMA, y en donde la región de complementariedad es de menos de 30 nucleótidos de longitud, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa el gen de NtHMA, inhibe la expresión de dicho gen de NtHMA en al menos 20%. El ARNbc comprende dos cadenas de ARN que son suficientemente complementarias para la hibridación para formar una estructura de dúplex. Una cadena del 60 ARNbc (la cadena de sentido contrario) comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y típicamente completamente complementaria, con una secuencia diana, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión del gen de NtHMA, la otra cadena (la cadena codificante) comprende una región que es complementaria de la cadena de sentido contrario, de modo que dos cadenas hibridan y forman una estructura de dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. La estructura de dúplex es de entre 65 aproximadamente 15 y 30 (p. ej., entre aproximadamente 18 y 25), típicamente entre aproximadamente 19 y 24 (p.
ej., entre 21 y 23) pares de bases de longitud. Igualmente, la región de complementariedad de la secuencia diana es de entre 15 y 30 (p. ej., entre aproximadamente 18 y 25), típicamente entre aproximadamente 19 y 24 (p. ej., entre 21 y 23) pares de bases de longitud. El ARNbc de la descripción puede comprender además uno o más extremos salientes de nucleótidos monocatenarios. El ARNbc se puede sintetizar por métodos convencionales conocidos en la técnica como se describe con más detalle más adelante, p. ej., usando un sintetizador de ADN automático, tal como 5 los disponibles en el comercio, por ejemplo, de Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En otro aspecto, se puede usar un vector de expresión para expresar una molécula de ARNi in vivo.
El ARNbc de la descripción puede contener uno o más apareamientos erróneos con la secuencia diana. En una realización el ARNbc de la descripción contiene más de 3 apareamientos erróneos. Si la cadena de sentido contrario 10 del ARNbc contiene apareamientos erróneos con una secuencia diana, es típico que la zona de apareamientos erróneos no esté situada en el centro de la región de complementariedad. Si la cadena de sentido contrario del ARNbc contiene apareamientos erróneos con la secuencia diana, es típico que el apareamiento erróneo esté restringido a 5 nucleótidos desde cualquiera de los extremos, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido desde cualquiera del extremo 5’ o 3’ de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una cadena de ARNbc de 23 nucleótidos 15 que es complementaria con una región del gen de NtHMA, el ARNbc preferiblemente no contiene ningún apareamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en la descripción se pueden usar para determinar si un ARNbc contiene un apareamiento erróneo con una secuencia diana que se eficaz para inhibir la expresión del gen de NtHMA.
En una realización, al menos un extremo del ARNbc tiene un extremo saliente de nucleótidos monocatenario de 1 a 4 (p. ej., 1 o 2 nucleótidos). Los ARNbc que tienen extremo saliente de al menos un nucleótido tienen propiedades inhibidoras. El ARNbc también puede tener un extremo romo, típicamente situado en el extremo 5’ de la cadena de sentido contrario.
En otra realización más, el ARNbc se modifica químicamente para potenciar la estabilidad. Los ácidos nucleicos de la descripción se pueden sintetizar y/o modificar por métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en quot;Current protocols in nucleic acid chemistryquot;, Beaucage, S. L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA, que se incorpora en la presente memoria por referencia. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones en 2’, introducción de bases no naturales, unión covalente a un ligando, y 30 sustitución de enlaces fosfato con enlaces tiofosfato. En esta realización, la integridad de la estructura de dúplex se refuerza por al menos uno, y típicamente dos uniones químicas. Las uniones químicas se pueden lograr por cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo introduciendo enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrófobas, interacciones de van der Waals o de apilado; mediante coordinación de metal-ion, o mediante el uso de análogos de purina. 35
En otra realización más, los nucleótidos en una o ambas de las dos cadenas individuales se pueden modificar para prevenir o inhibir la activación de enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, determinadas nucleasas. Las técnicas para inhibir la activación de enzimas celulares son conocidas en la materia, incluyendo, pero no limitadas a modificaciones 2’-amino, modificaciones 2’-fluoro, modificaciones 2’-aqluilo, modificaciones de la 40 cadena principal no cargada, modificaciones de morfolino, modificaciones de 2’-O-metilo y fosforoamidato (véase, p. ej., Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8). Por lo tanto, al menos un grupo 2’-hidroxilo de los nucleótidos en un ARNbc es sustituido por un grupo químico. Además, al menos un nucleótido puede ser modificado para formar un nucleótido cerrado. Dicho nucleótido cerrado contiene un puente de metileno o etileno que conecta el oxígeno 2’ de la ribosa con el carbono 4’ de la ribosa. Los oligonucleótidos que contienen el nucleótido cerrado se describen en Koshkin, A. 45 A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) y Obika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404). La introducción de un nucleótido cerrado en un oligonucleótido mejora la afinidad para las secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fusión en varios grados (Braasch, D. A. y D. R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).
La conjugación de un ligando a un ARNbc puede potenciar su absorción celular. En algunos casos, se conjuga un 50 ligando hidrófobo con el ARNbc para facilitar la permeación directa de la membrana celular. Alternativamente, un ligando conjugado con el ARNbc es un sustrato para la endocitosis mediada por receptor. Estos procedimientos se han usado para facilitar la permeación celular de oligonucleótidos de sentido contrario. En algunos casos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos a menudo da como resultado resistencia mejorada a las nucleasas. Los ejemplos representativos de ligados catiónicos son propilamonio y dimetilpropilamonio. Es 55 interesante que se ha descrito que los oligonucleótidos de sentido contrario retenían su alta afinidad de unión con el ARNm cuando se dispersaba el ligando catiónico por el oligonucleótido. Véase, M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103, y referencias citadas en el mismo.
EJEMPLO DE REFERENCIA 2 60
Métodos para identificar agentes moduladores de NtHMA
La descripción proporciona métodos para identificar agentes que pueden modular el nivel de expresión y/o actividad de NtHMA. Los candidatos (“un agente de ensayo”) que se puede seleccionar para identificar la actividad moduladora específica de NtHMA incluyen moléculas pequeñas, compuestos químicos, peptidomiméticos, anticuerpos, péptidos, polinucleótidos (p. ej., ARNi, ARNip, moléculas de sentido contrario o ribozimas), y agentes 65 desarrollados por diseño basado en ordenador. La modulación de NtHMA incluye un aumento o disminución de la
actividad o expresión. Por ejemplo, un método para identificar candidatos que pueden modular la expresión y/o actividad de NtHMA, comprende: poner en contacto una muestra que contiene un polipéptido o polinucleótido de NtHMA con un agente de ensayo en condiciones que permitan que el agente de ensayo y el polipéptido o polinucleótido de NtHMA interaccionen, y medir la expresión y/o actividad del polipéptido de NtHMA en presencia o ausencia del agente de ensayo. 5
En un ejemplo de referencia, una célula que contiene un polinucleótidos de NtHMA se pone en contacto con un agente de ensayo en condiciones tales que la célula y el agente de ensayo se dejan interaccionar. Dichas condiciones típicamente incluyen las condiciones de cultivo celular normales de acuerdo con el tipo de célula particular que se está usando, conocidas en la técnica. Puede ser conveniente permitir que el agente de ensayo y la 10 célula interaccionen en condiciones asociadas con mayor temperatura o en presencia de reaccionantes que facilitan la absorción del agente de ensayo por la célula. Un control se trata de forma similar pero en ausencia del agente de ensayo. Alternativamente, la actividad o expresión de NtHMA se puede medir antes de poner en contacto con el agente de ensayo (p. ej., la medición estándar o de control) y después otra vez tras el contacto con el agente de ensayo. Después la célula tratada se compara con el control y una diferencia en la expresión o actividad de NtHMA 15 comparado con el control, es indicativa de un agente que modula la actividad o expresión de NtHMA.
Cuando se mide la expresión de NtHMA, la detección de la cantidad de ARNm que codifica el polipéptido de NtHMA en la célula se puede cuantificar, por ejemplo, por PCR o transferencia Northern. Cuando se mide un cambio en la cantidad de polipéptido de NtHMA en la célula, se puede usar la detección de NtHMA mediante anticuerpos anti-20 NtHMA para cuantificar la cantidad de polipéptido de NtHMA en la célula usando técnicas conocidas. Alternativamente, la actividad biológica (p. ej., transporte de metales pesados) se puede medir antes y después del contacto con el agente de ensayo.
LISTA DE SECUENCIAS 25

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.- Una construcción de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que corresponde, comprendiendo o consistiendo la construcción en:
    una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con una parte de la SEQ ID 5 NO: 3 o 47;
    una segunda secuencia; y
    una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia,
    en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda 10 secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
  2. 2.- La construcción de ARNi de NtHMA de la reivindicación 1, en donde:
    (a) la primera secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada 15 de uno o más del grupo que consiste en: exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, un fragmento del exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, un fragmento del exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, un fragmento del exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, un fragmento del exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, exón 5 como se define en la SEQ ID NO: 13, un fragmento del exón 5 20 como se define en la SEQ ID NO: 13, exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, un fragmento del exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, un fragmento del exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, un fragmento del exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, un fragmento del exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, exón 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, un fragmento del exón 25 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25, y un fragmento del exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25;
    (b) la segunda secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, un fragmento del intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, intrón 2 como se define en la SEQ ID NO: 6, un fragmento del intrón 2 30 como se define en la SEQ ID NO: 6, intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, un fragmento del intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, un fragmento del intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, un fragmento del intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, un fragmento del intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, intrón 7 como se define en la SEQ ID NO: 16, un fragmento del intrón 7 35 como se define en la SEQ ID NO: 16, intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, un fragmento del intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, un fragmento del intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, un fragmento del intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, un fragmento del intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26, y un fragmento 40 del intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26;
    (c) la tercera secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, un fragmento de la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, un fragmento de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, un fragmento de la SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, un fragmento de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, un fragmento de la SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, un 45 fragmento de la SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33, un fragmento de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, un fragmento de la SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, un fragmento de la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, un fragmento de la SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, y un fragmento de la SEQ ID NO: 37;
    (d) la primera secuencia comprende la SEQ ID NO: 38, la segunda secuencia comprende la SEQ ID NO: 39, y la tercera secuencia comprende la SEQ ID NO: 40; 50
    (e) la primera secuencia comprende la SEQ ID NO: 42, la segunda secuencia comprende la SEQ ID NO: 43, y la tercera secuencia comprende la SEQ ID NO: 44; o
    (f) uno o dos o tres de (a), (b), (c), (d) y (e).
  3. 3.- La construcción de ARNi de NtHMA de la reivindicación 1, en donde la primera y la segunda secuencia tienen 55 cada una, una longitud seleccionada del grupo que consiste en 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 nucleótidos, y 600-700 nucleótidos.
  4. 4.- Un vector de expresión que comprende un promotor situado en la dirección 5’ y operativamente unido a la 60 construcción de ARNi de NtHMA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  5. 5.- El vector de expresión de la reivindicación 4, en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en: un promotor específico de tejido, un promotor inducible y un promotor constitutivo.
  6. 6.- Una planta transgénica que comprende el ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene niveles de
    Cd reducidos en al menos una parte de la planta comparado con la parte en un homólogo no transgénico.
  7. 7.- La planta transgénica según la reivindicación 6, en donde la planta transgénica es una planta de tabaco.
  8. 8.- Un producto de tabaco consumible que incorpora hojas que comprenden el ARNi de cualquiera de las 5 reivindicaciones 1-3 y recogidas de la planta transgénica de la reivindicación 6, de modo que las hojas tienen niveles reducidos de Cd comparado con hojas recogidas de un homólogo no transgénico cultivado en condiciones idénticas, en donde el producto tiene niveles reducidos de Cd comparado con un producto que incorpora hojas recogidas del homólogo no transgénico, y en donde el producto es un cigarro, un cigarrillo o un producto de tabaco sin humo.
  9. 9.- El producto de la reivindicación 8, en donde el % de reducción de Cd puede ser un valor de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%.
  10. 10.- El producto de la reivindicación 8 o reivindicación 9, en donde el contenido de Cd es un valor en el intervalo de 15 aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
  11. 11.- Un método para reducir los niveles de Cd en al menos una parte de la planta, que comprende: 20
    reducir niveles de un ARNm de NtHMA en la planta produciendo la expresión de una construcción de ARNi, en donde la NtHMA se selecciona del grupo que consiste en:
    un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de 25 al menos 70% con la SEQ ID NO: 1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B;
    un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 3;
    un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de 30 al menos 50% con la SEQ ID NO: 47;
    un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B; y
    un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene 35 una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B.
  12. 12.- El método de la reivindicación 11, en donde la construcción de ARNi comprende:
    una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con una parte de la SEQ ID NO: 3 o 47;
    una segunda secuencia; y
    una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia, 45
    en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
  13. 13.- El método de la reivindicación 11 o reivindicación 12, en donde después de la expresión de la construcción de ARNi, la parte de la planta tiene un contenido de Cd reducido en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 50 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%.
  14. 14.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde después de la expresión de la construcción de ARNi, la parte de la planta tiene un contenido de Cd en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a 55 aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
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