CN1551921A

CN1551921A - 增强抗性并减少重金属吸收的植物遗传改良

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Publication number: CN1551921A
Application number: CNA028102894A
Authority: CN
Inventors: 李永叔; ��˹��ŵ��; 梁泳烈; 黄仁焕; 裵玹珠; 李周泫; 恩里克·马蒂诺亚
Original assignee: POHANG POLYTECHNIC SCHOOL; Posco Co Ltd
Current assignee: POHANG POLYTECHNIC SCHOOL; Posco Holdings Inc
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2002-04-04
Publication date: 2004-12-01
Also published as: WO2002081707A1; US20040098759A1; EP1373523B1; US7173163B2; JP2004533231A; EP1373523A1

Abstract

本发明涉及产生促进对重金属的抗性和减少重金属吸收的转化体的方法，以及用可将重金属从细胞中泵出的P型ATPase ZntA基因转化的植物。所述转化体在被重金属污染的环境中表现出比野生型植株更好的生长性能，并且重金属含量比野生型植物低。因此，用ZntA或具有生物活性的ZntA类重金属泵送ATPase转化植物的方法可以开发用于植物补救的植物和开发对重金属有抗性且重金属含量低的安全作物。

Description

增强抗性并减少重金属吸收的植物遗传改良

发明领域

本发明涉及一种产生具有促进对重金属抗性的转化体的方法。更具体地是，本发明涉及转基因植物，其在被重金属污染的环境中，具有能够改善生长但却有降低的重金属含量，因此该方法可以开发用于植物补救(phytoremediatim)的植物，也可开发安全作物。

背景技术

重金属是主要的对环境有毒的物质，可以导致活性氧种类的产生、DNA损伤和通过与细胞中酶的活性位点结合而使酶失活。

由于工业化导致了重金属污染环境越来越严重。在20世纪90年代早期，全球每年释放22000吨镉、954000吨铜、796000吨铅和1372000吨锌(Alloway BJ & Ayres DC(1993)Principles of environmental pollution.Chapmanand Hall，London)。重金属污染的土壤抑制植物的正常生长和引起食品污染。许多重金属对人类健康非常有害，低浓度即具有致癌性。因此，从环境中去除重金属是十分紧迫的问题。

从土壤中去除重金属的研究在全球也非常活跃。处理土壤污染传统的方法包括物理方法和化学方法，例如去除和埋葬污染的土壤、对污染区域进行隔离、固定(对土壤进行化学处理以固定金属)和用酸或碱溶解滤去(SaltDE，Blaylock M，Kumar NPBA，Viatcheslav D，Ensley BD，et al.(1995).Phytoremediation：a novel strategy for the removal of toxic metals from theemvironment using plants.Bio-Technology 13，468-74；Raskin 1，Smith RD，SaltDE.(1997)Phytoremediation of metals：using plants to remove pollutants fromthe environment.Curr.Opin.Biotechnol.8，221-6)。然而，这些方法成本非常高并需要消耗大量的能源。

植物补救法作为一种从污染土壤中去除重金属的低成本的、对环境有益的(environment-friendly)方法最近已被提出来，它是对污染土壤进行清洁的一种相对比较新的技术，这种技术使用普通植物，尤其是栽培植物(bredplant)或转基因植物来聚积、去除或解毒环境污染物。植物补救技术可分成植物提取法、根瘤过滤法(rhizofiltration)、和植物稳定法。

植物提取法是一种使用金属蓄积植物从土壤中吸收金属到植物的可收集(harvestable)部分的方法；根瘤过滤法是一种利用植物根从污染的水流(aqueous stream)中去除污染物的方法；而植物稳定法也是用植物对污染物例如土壤中的有毒金属进行保持固定，以防止它们进入地下水(Salt et al.，Biotechnology 13(5)：468-474，1995)。

植物补救法的例子是使用Larrea tridentate品种植物的方法，其专门用于脱污染包括铜、镍和镉的土壤(美国专利5,927,005)的方法，和一种利用十字花科(Brassicaceae)的植物的方法(Baker et al.，New Phytol.127：61-68，1994)。

另外，已经利用通过将对重金属有抗性活性的基因导入而产生的转基因植物的植物补救法进行了尝试。重金属抗性基因的例子有CAX2(镉交换器2)，细胞色素P450 2E1，NtCBP4(烟草(Nicotiana tabacum)镉结合蛋白)，GSHII(谷胱甘肽合成酶)，merB(有机汞制剂裂解酶(organomercurial lyase))和MRT多肽(金属调节转运多肽)。

CAX2(镉交换器2)，是从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离到的，可在植物中积累包括镉和锰的重金属(Hirschi et al.，PlantPhysiol，124：125-134，2000)。细胞色素P450 2E1可吸收和分解有机化合物例如三氯乙烯(Doty SL et al.Proc，Natl，Acad.Sci.USA，97：6287-6291，2000)。用NtCBP4转化的烟草(Nicotiana tabacum)具有对镍的抗性(Arazi et al.Plant J.20：171-182，1999)，GSHII可聚积镉(Liang et al.，Plant Physiol.119：73-80，1999)，merB可对有机汞进行解毒(Bizily et al.，Proc.Natl.Sci.USA96：6808-6813，1999)，和MRT多肽可从污染土壤中去除包括镉、锌和锰的重金属(美国专利5,846,821)。

然而，通过导入上述所提及的基因产生的转基因植物在受污染的土壤中生长时，由于积累了重金属其生长受到限制，并且它们产生污染的果实和作物。因此，需要寻找比野生型对重金属吸收少并能够甚至在受重金属污染的环境中保持健康生长的植物。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因，当它在植物中表达时，可以赋予对重金属的抗性并且能抑制重金属的积累。

本发明的另一目的是提供携带有重金属抗性基因的重组载体。

本发明另一目的是提供一种产生具有重金属抗性转化体并且比野生型植物累积较少重金属的方法。

本发明另一目的是提供一种具有重金属抗性并且比野生型植物积累较少重金属的转化体。

本发明另一目的是提供一种将污染的区域转化为环境良好空间的方法。

为达到上述目的，本发明提供了一种重组载体，它包含重金属转移P型ATPase的编码序列，其中该编码序列可操纵地连接植物表达的转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制。

本发明还提供一种用重组载体转化的转基因植物或其部分。

本发明还提供转基因植物细胞。

本发明还提供一种用重组载体稳定转化的转基因植物。

本发明还提供一种重组载体，其包括SEQ ID NO：1的编码重金属转移P型ATPase，ZntA序列；

其中该编码序列操纵地连接于并受可植物表达的转录和翻译调控序列调控；和

其中ZntA包含约100个氨基酸残基N端延伸区域、第一跨膜区、包含推定的阳离子通道基序CPX区的第二跨膜区、第三跨膜区，第一胞质区、第二胞质区和C末端区。

本发明还提供一种含有重金属转移P型ATPase，ZntA的编码序列的重组载体：其中该编码序列可操纵地连接于植物表达的转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制；

其中的ZntA包含约100个氨基酸残基的N端延伸区域、第一跨膜区、包含推定的阳离子通道基序CPX区的第二跨膜区、第三跨膜区，第一胞质区、第二胞质区和C末端区；和

其中所述编码序列的每个区与SEQ ID NO：1中相同区至少有50％的同源性。

本发明还提供一种产生对重金属具有促进抗性的转基因植物的方法，包括：

(a)制备包含重金属转移P型ATPase编码序列的表达构建体，该编码序列可操纵地连接于植物表达的转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制；

(b)制备携带有所述表达构建体的重组载体；和

(c)将重组载体的表达构建体导入到植物细胞或植物组织以产生转基因植物细胞或转基因植物组织。

附图简要说明

图1表示重组载体pEZG的图谱。

图2表示拟南芥中表达ZntA蛋白在细胞质膜上的定位。

图3是表示拟南芥原生质体中表达ZntA蛋白在膜上的定位的Western印迹图。

图4表示重组载体pBI121/zntA的图谱。

图5是Northern印迹图，表示在拟南芥中zntA mRNA的表达。

图6表示在含有铅的培养基中生长的zntA转基因植株比野生型植株的生长势要好(enhanced growth)。

图7表示在含有镉的培养基中生长的zntA转基因植株比野生型植株的生长势要好。

图8表示在含有重金属的培养基上培养用zntA转基因的植株的重量。

图9表示zntA转基因植株和野生型植株在含有重金属的培养基上生长的叶绿素含量。

图10表示zntA转基因植株和野生型植株在含有重金属的培养基上生长后，重金属含量。

优选实施方案的详细描述

在本发明中，术语“P型ATPase”是指通过利用自ATP水解的能量可运输特定物质并形成磷酸化中间体的转运蛋白。更具体地，P型ATPase是一种重金属运输ATPase。重金属是指比重超过4的金属元素，包括砷(As)、锑(Sb)、铅(Pb)、汞(Hg)、镉(Cd)、铬、锡(Sn)、锌、钡(Ba)、镍(Ni)、铋(Bi)、钴(Co)、锰(Mn)、铁(Fe)、铜(Cu)和钒(V)。

ZntA是大肠杆菌的一种P型ATPase(Rensing C，Mitra B，Rosen BP.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94，14326-31；Sharma，R.，Rensing，C.Rosen，B.P.，Mitra，B.(2000)J.Biol.Chem.275，3873-8)，可泵送Pb(II)/Cd(II)/Zn(II)通过质膜。

P型ATPase典型地含有2个大的细胞质结构域和6个跨膜结构域。ZntA具有类似的结构域，此外在N末端有2个以上(more)跨膜螺旋和包含CXXC基序的大约100个氨基酸的N末端延伸区。ZntA的第一个大的细胞质结构域约145个氨基酸长并参与磷酸中间体的水解，第二个大的细胞质结构域为280个氨基酸长并含有磷酸化基序。我们将N末端侧的4个跨膜螺旋区定名为第一跨膜区(transmembrane spanning domain)。在两个大的细胞质结构域之间的2个跨膜螺旋区命名为第二跨膜区。该区包含被推定为阳离子通道基序CPX结构域。在第二个大的细胞质结构域和C末端之间的跨膜螺旋区命名为第三跨膜区。第三跨膜区之后的细胞质结构域命名为ZntA的C末端区。

术语“同源性”是指两个DNA或蛋白分子之间的序列相似性。“具有生物学活性ZntA类的重金属泵送ATPase”是由与ZntA至少有50％同源性的DNA序列所编码，并具有重金属泵送活性。具有ZntA类生物学活性的重金属汞送ATPase包括锌转运ATPase(NC_000913)、锌转运ATPase(NC_002655)、重金属转运ATPase(NC_003198)、P型ATPase家族(NC_003197)、来源于麻风杆菌(Mycobacterium lepraed)的阳离子转运P型ATPase(GenBank#Z46257)及其它一些成员。

“重金属抗性蛋白”是指能够介导对至少一种重金属产生抗性的蛋白质，其中重金属包括但不限于铅、镉和锌。SEQ ID NO：1所示的ZntA蛋白是重金属抗性蛋白的一个例子。

术语“可植物表达的”(plant-expressible)意指编码序列可操纵地连接于植物表达的转录和翻译调控序列并受所述调控序列的调节控制，其能够通过植物细胞、组织、植物的部分或整株植物来有效的进行表达。

“可植物表达的转录和翻译调控序列”是指可以在植物、植物组织、植物的部分或植物细胞中起作用而影响与之相关的靶序列的转录和翻译表达。包括欲表达的靶序列的5｀端序列，可以定性控制基因的表达(控制基因对环境信号例如光的反应时是否表达或者组织特异性表达的模式)；和可有利于提高下游基因的表达水平的定量调控序列。核糖体结合位点序列是翻译调控序列基序的一个例子。聚腺苷酸信号是位于下游靶序列的转录调控序列的例子，以及其它在植物分子生物学本领域中非常熟知的一些。

“转基因植物”是指经过遗传修饰而不同于野生型的植物。转基因植物典型的是表达异源DNA序列，而赋予植物不同于野生型植株的一些特征。在本发明中作为具体的例子，转基因植物是通过遗传修饰而含有和表达至少一个可操纵地连接于转录调控序列并受其调控的异源DNA序列，其中所述调控序列可在植物细胞或组织、或整株植物中具有功能。

本发明提供一种可在植物表达的构建体，它包括一个重金属转运ATPase蛋白的编码序列。该编码序列可操纵地连接于植物表达的转录和翻译调控序列并受其调控。重金属包括砷(As)、锑(Sb)、铅(Pb)、汞(Hg)、镉(Cd)、铬、锡(Sn)、锌、钡(Ba)、镍(Ni)、铋(Bi)、钴(Co)、锰(Mn)、铁(Fe)、铜(Cu)和钒(V)。

表达构建体包括启动子、重金属转运ATPase基因和转录终止子。合适的植物表达启动子包括花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic rirus)的35S或19S启动子；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的nos(胭脂碱合成酶)、ocs(章鱼碱合成酶)、或mas(甘露氨酸合成酶)启动子以及其它本领域已知的一些例子。

本发明中重金属转运ATPase基因优选地编码ZntA(SEQ ID NO：1)或与ZntA至少有50％同源性并编码了具有重金属泵送活性的蛋白质的具有ZntA类生物活性的重金属泵ATPase基因。

本发明的重金属转运ATPase基因也优选地包含ZntA的约100个氨基酸残基的N末端延伸区、第一跨膜区、包含有推定的阳离子通道基序CPX区的第二跨膜区、第三跨膜区，第一胞质区、第二胞质区和C末端区的DNA序列、或者与生物活性的ZntA类重金属泵ATPase基因上述所提及的结构域至少50％同源性的DNA序列。

本发明的表达构建体可以进一步包括标记以用于在植物细胞中筛选转化体或显示靶蛋白的定位。标记的例子包括对抗生素如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素和博来霉素有抗性的基因；和编码了GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)、CAT(氯霉素乙酰转移酶)、荧光素酶和GFP(绿色荧光蛋白)的基因。这些标记可以成功的筛选在含有特定抗生素的培养基中生长的转化植物细胞，因为它们携带了针对该抗生素的抗性基因的表达构建体。

此外，本发明提供包含所述表达构建体的重组载体。所述重组载体包括了普通载体的骨架和表达构建体。普通载体优选自pROKII、pBI76、pET21、pSK(+)、pLSAGPT、pBI121和pGEM。本发明已制备的重组载体是PBI121/zntA和pEZG。PBI121/zntA包括PBI121的骨架、CMV的35S启动子、zntA基因、胭脂碱合成酶的终止子；pEZG包括pUC的骨架、CMV的35S启动子、zntA基因、绿色荧光蛋白和胭脂碱合成酶的终止子。

本发明还提供包含所述表达构建体的转化体。所述转化体包括编码重金属转运P型ATPase的DNA序列，其中DNA序列可操纵地连接于转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制。

所述转化体优选的是植物，更具体的是植物或其部分和植物细胞。植物部分包括种子。可以是草本植物和树木，包括开花植物、园艺植物、洋葱、胡萝卜、黄瓜、橄榄树、甘薯、马铃薯、甘蓝、萝卜、莴苣、嫩茎花椰菜、烟草(Nicotiana tabacum)、矫牵牛(Petunia hybrida)、向日葵、芥菜(Brassica juncea)、草皮草(turf)、拟南芥、大白菜(Brassica campestris)、白桦(Betula platyphylla)、白杨、杂交白杨和Betula schmidtii。

产生转化体技术是熟知的。实例为根癌农杆菌介导的DNA转化。优选的，可通过电激法、微粒子注射法或基因枪法联合使用生成重组根癌农杆菌。

此外，本发明提供一种产生促进对重金属抗性的转基因植物的方法，包括：

(a)制备包含编码重金属转移P型ATPase的可植物表达序列的表达构建体，其可操纵地连接于转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制；

(b)制备携带有所述表达构建体的重组载体；和

(c)将重组载体的表达构建体导入到植物细胞或植物组织中以产生转基因植物细胞或转基因植物组织。

产生转基因植物的方法进一步还包括如下步骤：

(d)从步骤(c)所述的转基因植物细胞或转基因植物组织再生转基因植物。

在本发明中，ZntA蛋白在细胞质膜中表达(图2和3)。而且，用ZntA转基因的拟南芥植株表现出对铅和镉的抗性，铅和镉的含量比野生型植株的要低。

因此，用zntA转基因的植物或用编码具有生物活性的ZntA类重金属泵ATPase的基因转化的植物可以在污染了重金属的环境中生长，而且该技术也可用于产生减少对有害重金属吸收的作物。由于有害重金属通过如黄沙现象或自然灾害而不经意地流入农田中，重金属泵送转基因的作物可以作为注重健康的消费者的安全选择。

下面所提供的实施例用以说明的目的而不是对本发明所要求的保护范围的限制。本领域技术人员对本发明所提供例举的组合物和方法的进行任何改变都落于本发明的保护范围之内。

实施例1 zntA基因的分离

大肠杆菌K-12来源于韩国生物科学和生物技术研究所韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection of Type Cultures of the Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)，zntA基因被克隆。

zntA是通过用大肠杆菌K-12菌株的基因组DNA作模板经PCR分离的。用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3作引物组进行PCR，获得2.2kb的PCR产物，得到了SEQ ID NO：1所示的zntA。分析了PCR产物的序列并将PCR产物克隆到pGEM-T简易载体中以产生pGEM-T/zntA。

实施例2 ZntA蛋白的表达

将zntA基因导入到拟南芥的原生质体中，并研究所表达的ZntA蛋白的部位(localization)。

(2-1)拟南芥(Arabidopsis)原生质体的制备

拟南芥原生质体的制备按照所述的方法进行(Abel S，TheologisA(1994)Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts：a versatileexperimental system to study gene expression.Plant J.5，421-7)。

将拟南芥种子置于防腐(antiseptic)溶液(蒸馏水∶chlorox∶0.05％tritonX-100＝3∶2∶2)，摇动20-30秒，于室温下培养5-10分钟。种子再用蒸馏水冲洗5次。

将拟南芥种子在100ml液体溶液中培养((Murashige & Skoog)培养基；MSMO，pH5.7-5.8)，其包含有维生素，Duchefa4.4g/L，蔗糖20g/L，MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸，2-(N-Morpholino)Ethanesulfonic acid，Sigma)0.5g/L，并于22℃，120rpm搅拌，16/8小时(光照/黑暗)的光照周期下培养2-3周。

将2-3周龄的整个植株用刀切成5-10mm²的片状。将这些叶片转移入含酶溶液中(1％纤维素酶R-10，0.25％marcerozyme R-10，0.5M甘露醇，10mM MES，1mM CaCl₂，5mM β-巯基乙醇和0.1％BSA，pH5.8-5.9)，真空过滤10分钟，然后于黑暗中22℃培育5小时，同时以50-75rpm轻轻搅拌。释放出来的原生质体用100μm筛目(mesh，Sigma S0770，USA)过滤，再用21％蔗糖密度梯度以730rpm离心10分钟纯化，然后悬浮于20ml的W5溶液中(154mm NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，5mM葡萄糖，和1.5mM MES，pH5.6)，再用530rpm离心6分钟。沉淀的原生质体重悬浮于W5溶液中，并置于冰上保存。

(2-2)载体的制备

pGEM-T/zntA DNA用BamHI限制酶进行切割，提取zntA基因(QIAGENGel extraction试剂盒)。将zntA基因置于花椰菜花叶病毒35S启动子控制之下，并融合接着插入到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因和胭脂碱合成酶基因的终止子(NOS)的载体pUC-GFP中，而由此获得载体pEZG。

(2-3)制备含H⁺泵送基因载体

拟南芥的氢离子泵送基因AHA2 cDNA(GenBank：P19456)通过PCR进行扩增，PCR所用的引物是SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示多核苷酸。PCR反应的参数是：94℃，30s-＞45℃，30s-＞72℃，1min，反应50个循环。所得到的PCR产物就是AHA2 cDNA。

用BgIII/NotI限制酶处理DsRed载体(Clontech，Inc.)而得到DsRed。然后插入被BamHI/Ecl136II限制酶处理成开放型(open)的smGFP载体中而得到326RFP。进一步，AHA2 cDNA插入到326RFP载体的XmaI而制成326RFP/AHA2。

(2-4)将pEZG或326RFP/AHA2导入到原生质体

将pEZG和326RFP/AHA2导入到由实施例(2-1)的制备得到的原生质体，并进一步确定外源基因的表达。

原生质体在500rpm离心5分钟，将5×10⁶/ml原生质体悬浮到MaMg溶液(400mM甘露醇，15mM MgCl₂，5mM MES-KOH，pH5.6)中。300μl悬浮溶液分别与10μg的pEZG和326RFP/AHA2混合，然后加入300μl的PEG(400mM甘露醇，100mM Ca(NO₃)₂，40％PEG6000)，并于室温下保持30分钟。该混合物用5ml W5溶液洗涤，于500rpm离心3分钟，得到沉淀。用2ml W5溶液洗涤沉淀，于黑暗中22-25℃下培养。24小时后，鉴定GFP蛋白的表达，利用Zeiss Axioplan荧光显微镜的预冷的charge-coupled装置照像机拍其图像。用于GFP的过滤器是XF116(激发器(exciter)，474AF20；二色分光镜(dichraic)，500DRLP；发射器，510AF23)(Omega，Inc.，Brattleboro，VT)。获得的资料用Adobe(Mountain View，CA)Photoshop软件进行处理。

图2显示融合了GFP的ZntA蛋白在用pEZG和326RFP/AHA2分别转化的原生质体中的部位。“a”是对照；“b”是在326RFP/AHA2中表达的AHA2蛋白；“c”是pEZG中表达的ZntA蛋白；“d”是图“b”和“c”的重叠部分。与GFP融合的ZntA由于GFP的原故而呈现出绿色，与DsRED融合的AHA2由于DsRed的原故而呈现出红色。

在图2中，与GFP融合的ZntA在拟南芥原生质体的细胞质膜中的定位。

此外，细胞膜和细胞溶液成分也从拟南芥原生质体中分离出来，利用GFP抗体作为探针进行Western Blot。图3显示了Western Blot图，其中“WT-C”是野生型拟南芥原生质体的细胞溶胶，“WT-M”是野生型拟南芥原生质体的膜，“ZntA-C”是用pEZG转化的拟南芥原生质体的细胞溶胶，“ZmA-M”是用pEZG转化的拟南芥原生质体的膜。在图3中，GFP抗体只与从用pEZG转化的拟南芥原生质体中提取到的膜蛋白发生交叉反应，进一步确定了ZntA蛋白在膜中的表达。

实施例3表达ZntA蛋白的转基因植物的制备

(3-1)拟南芥

拟南芥植株于4℃生长2天，然后在16/8hr(光照/黑暗)的光周期、22/18℃的温度下生长3-4周直到花茎(stalk)分化为止。将第1轮花茎去掉，而第2轮花茎用于转化。

(3-2)pBI121/zntA载体

zntA基因插入到适合于植物表达的载体中，制备pBI121和pBI121/zntA。

通过用SmaI和Ecl136II限制酶消化而去掉pBI121的GUS基因，将从pGEM/zntA中制备得到的zntA基因插入到pBI121中而得到pBI121/zntA载体(图4)。

(3-3)转基因植物的制备

用制备试剂盒(Qiagen)分离pBI121/zntA载体DNA，然后通过电穿孔导入到农杆菌(agrobacterium)中。农杆菌(KCTC 10207BP)在YEP培养基(酵母抽提物10g，NaCl5g，蛋白胨10g，pH7.5)中培养，直到OD值达到0.8-1.0。培养液进行离心，收集细胞并重悬浮于含5％蔗糖的MS培养基(Morashige &Skoog培养，4.3g/L Duchefa)中，并在即将转化之前加入Silwet L-77(LehleSeeds，USA)至终浓度为0.01％。为了植物转化，将pBI121/zntA导入到农杆菌LBA4404菌株中，以用于浸渍(dipping)法(Clough SJ，and BentAF(1998)，Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16，735-743)转化拟南芥。

实施例4转化体的筛选

选择zntA基因转化的植物，将其在含有卡那霉素(50mg/l)的固体Morashige & Skoog(MS)培养基上生长。检测T2或T3代种子。此外，用pBI121载体导入拟南芥，并选择出其转化体(称为pBI121植株)。分别收获野生型拟南芥、pBI121植株和pBI121/zntA植株的种子。

为了检测ZntA的表达水平，从卡那霉素筛选出的T2代植株中分离总RNA用于Northern印迹分析。从在1/2MS(Morashige & Skoog，2.15g/L，Duchefa)琼脂培养基上生长3周的拟南芥植株中提取总RNA。后面的RNA的制备和Northem印迹方法均根据已确定的《分子克隆：实验手册》(Sambrook et al.2001，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Pres，ColdSpring Harbor，NY)方法进行，稍作改进。

植物材料用液氮进行冷冻后，用研钵和研杵磨成粉末匀质化。每100mg组织样品中加入1ml TRIzol试剂(Life technology，USA)，于室温下温育5min，再按每1ml TRIzol试剂中加入0.2ml的氯仿。于4℃，10,000g下离心10min，取水相，再按每1ml TRIzol试剂中加入0.5ml异丙醇进行沉淀，用UV光谱学进行定量。总RNA在含甲醛的琼脂糖凝胶上进行分离，然后转移到尼龙膜上。经UV交联后，杂交在改进的Church缓冲液(7％(W/V)SDS，0.5M磷酸钠缓冲液(pH7.2)，1mM EDTA(pH7.0))中于68℃过夜杂交，使用32P标记的zntA探针。膜用含1×SSC，0.1％SDS于室温下洗1次，时间为10min，再用含0.5×SSC，0.1％SDS于68℃下洗2次，时间为10min。再将膜暴露于phosphorimanger screen(Fuji胶卷)或X-射线薄膜(Kodak)。用Mac-BAS图像处理系统来分析mRNA的表达水平。图5显示了拟南芥中zntA mRNA表达的Northern Blot图。在野生型拟南芥和pBI121植株中没有观察到zntARNA的转录，而在pBI121/zntA植株中可以观察到。EF1-a在植株中是组成型表达的并且水平一致，表明不同样品中使用了相同量的RNA。

实施例5 zntA基因的转化植株对重金属的抗性

野生型和pBI121/zntA植株在1/2MS琼脂培养基上生长2周，然后转移到含有70μm镉或0.7mM铅的1/2MS液体培养基中。2周后测定植株的生长状况、重量和重金属含量。

(5-1)植株的生长状况

图6显示野生型和pBI121/zntA拟南芥植株在含铅的培养基上的生长。图7显示野生型和pBI121/zntA拟南芥植株在含镉的培养基上的生长。“WT”表示野生型拟南芥，“1”到“4”表示pBI121/zntA植株。在图6和7中，pBI121/zntA植株比野生型植株生长要好；它们的叶片更宽、更绿、叶片的鲜重也比野生型要高。这些结果表明ZntA的表达使转基因植株对Pb(II)和Cd(II)具有了抗性。

(5-2)生物量的测定

野生型和pBI121/zntA拟南芥植株在1/2 MS琼脂培养基上生长2周然后转移到用含有或不含有Pb(II)或Cd(II)的小砂砾(gravel)为支撑的1/2MS液体培养基中。再生长2周后，收获植株。用冰预冷的1mM酒石酸(tartarate)溶液冲洗，并印干(blot-dried)。检测野生型和pBI121/zntA拟南芥植株的重量。

图8a图示野生型和pBI121/zntA拟南芥植株在含有铅的培养基中生长的重量，图8b图示野生型和pBI121/zntA拟南芥植株在含有镉的培养基中生长后的重量。pBI121/zntA植株比野生型拟南芥的重量要高。这些结果表明表达ZntA蛋白的植株比野生型植株在重金属污染的土壤中生长要好。

(5-3)叶绿素含量的测定

为了确定叶绿素的含量，将收获的叶片于80℃用95％乙醇抽提20min。在664nm和648nm吸光度下测定其光吸收值，用所述的方法来计算出叶绿素A和B的含量(Oh SA，Park JH，Lee GI，Paek KH，Park SK，NamHG(1997)Identification of three genetic loci controlling leaf senescence inArabidopsis thaliana.Plant J.12，527-535)。

图9a图示在含有铅的培养基中生长的野生型和pBI121/zntA拟南芥植株的叶绿素含量，图9b图示野生型和pBI121/zntA拟南芥植株在含有镉的培养基中生长后的叶绿素含量。用zntA-转基因的植株比野生型拟南芥中的叶绿素含量高。

(5-4)重金属含量的测定

对照植株和ZntA过量表达的植株在含有重金属的培养基中生长后，测定其Pb和Cd的含量。收集pBI121/zntA植株、称重后用65％HNO₃于200℃下消化过夜。消化样品用0.5N的HNO₃稀释，后用原子吸收光谱仪(AAS；SpectrAA-800，Varian)进行分析。

图10图示野生型和ZntA-转基因植株在含有重金属的培养基中生长后所显示重金属含量。图10a表示的是铅含量，10b是镉含量。PBI121/zntA植株的铅含量在不同的株系之间有一定的变化，但总是低于野生型植株中的铅含量。转基因株系1和3中的Cd含量比对照植株要低。

因此，用zntA或其它具有生物活性的ZntA类重金属泵ATPase转化的植株可以在重金属污染的土壤中生长，且对重金属的吸收要低于野生型植株。因此种植这种植物可以保持固定污染土壤而减少土壤的腐蚀，而且zntA的转基因植株在重金属污染的土壤中生长要好于野生型植株，因而可以减少污染区域中污染物的转移进而减少污染物对地下水的污染。本发明也可以用于产生低重金属含量的安全作物。

序列表

<110> POSCO公司(POSCO & POSTECH FOUNDATION)

<120> 增强抗性并减少重金属吸收的植物遗传改良

<130> DPP011615

<150> KR 10-2001-17837

<151> 2001-04-04

<150> KR 10-2002-18369

<151> 2002-04-04

<160> 6

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 2199

<212> DNA

<213> 大肠杆菌的ZntA基因

<400> 1

atgtcgactc ctgacaatca cggcaagaaa gcccctcaat ttgctgcgtt caaaccgcta 60

accacggtac agaacgccaa cgactgttgc tgcgacggcg catgttccag cacgccaact 120

ctctctgaaa acgtctccgg cacccgctat agctggaaag tcagcggcat ggactgcgcc 180

gcctgtgcgc gcaaggtaga aaatgccgtg cgccagcttg caggcgtgaa tcaggtgcag 240

gtgttgttcg ccaccgaaaa actggtggtc gatgccgaca atgacattcg tgcacaagtt 300

gaatctgcgc tgcaaaaagc aggctattcc ctgcgcgatg aacaggccgc cgaagaaccg 360

caagcatcac gcctgaaaga gaatctgccg ctgattacgc taatcgtgat gatggcaatc 420

agctggggtc tggagcagtt caatcatccg ttcgggcaac tggcgtttat cgcgaccacg 480

ctggttgggc tgtacccgat tgctcgtcag gcattacggt tgatcaaatc cggcagctac 540

ttcgccattg aaaccttaat gagcgtagcc gctattggtg cactgtttat tggcgcaacg 600

gctgaagctg cgatggtgtt gctgctgttt ttgattggtg aacgactgga aggctgggcc 660

gccagccgcg cgcgtcaggg cgttagcgcg ttaatggcgc tgaaaccaga aaccgccacg 720

cgcctgcgta agggtgagcg ggaagaggtg gcgattaaca gcctgcgccc tggcgatgtg 780

attgaagtcg ccgcaggtgg gcgtttgcct gccgacggta aactgctctc accgtttgcc 840

agttttgatg aaagcgccct gaccggcgaa tccattccgg tggagcgcgc aacgggcgat 900

aaagtccctg ctggtgccac cagcgtagac cgtctggtga cgttggaagt gctgtcagaa 960

ccgggagcca gcgccattga ccggattctg aaactgatcg aagaagccga agagcgtcgc 1020

gctcccattg agcggtttat cgaccgtttc agccgtatct atacgcccgc gattatggcc 1080

gtcgctctgc tggtgacgct ggtgccaccg ctgctgtttg ccgccagctg gcaggagtgg 1140

atttataaag ggctgacgct gctgctgatt ggctgcccgt gtgcgttagt tatctcaacg 1200

cctgcggcga ttacctccgg gctggcggcg gcagcgcgtc gtggggcgtt gattaaaggc 1260

ggagcggcgc tggaacagct gggtcgtgtt actcaggtgg cgtttgataa aaccggtacg 1320

ctgaccgtcg gtaaaccgcg cgttaccgcg attcatccgg caacgggtat tagtgaatct 1380

gaactgctga cactggcggc ggcggtcgag caaggcgcga cgcatccact ggcgcaagcc 1440

atcgtacgcg aagcacaggt tgctgaactc gccattccca ccgccgaatc acagcgggcg 1500

ctggtcgggt ctggcattga agcgcaggtt aacggtgagc gcgtattgat ttgcgctgcc 1560

gggaaacatc ccgctgatgc atttactggt ttaattaacg aactggaaag cgccgggcaa 1620

acggtagtgc tggtagtacg taacgatgac gtgcttggtg tcattgcgtt acaggatacc 1680

ctgcgcgccg atgctgcaac tgccatcagt gaactgaacg cgctgggcgt caaaggggtg 1740

atcctcaccg gcgataatcc acgcgcagcg gcggcaattg ccggggagct ggggctggag 1800

tttaaagcgg gcctgttgcc ggaagataaa gtcaaagcgg tgaccgagct gaatcaacat 1860

gcgccgctgg cgatggtcgg tgacggtatt aacgacgcgc cagcgatgaa agctgccgcc 1920

atcgggattg caatgggtag cggcacagac gtggcgctgg aaaccgccga cgcagcatta 1980

acccataacc acctgcgcgg cctggtgcaa atgattgaac tggcacgcgc cactcacgcc 2040

aatatccgcc agaacatcac tattgcgctg gggctgaaag ggatcttcct cgtcaccacg 2100

ctgttaggga tgaccgggtt gtggctggca gtgctggcag atacgggggc gacggtgctg 2160

gtgacagcga atgcgttaag attgttgcgc aggagataa 2199

<210> 2

<211> 732

<212> PRT

<213> 大肠杆菌的ZntA蛋白

<400> 2

Met Ser Thr Pro Asp Asn His Gly Lys Lys Ala Pro Gln Phe Ala Ala

1 5 10 15

Phe Lys Pro Leu Thr Thr Val Gln Asn Ala Asn Asp Cys Cys Cys Asp

20 25 30

Gly Ala Cys Ser Ser Thr Pro Thr Leu Ser Glu Asn Val Ser Gly Thr

35 40 45

Arg Tyr Ser Trp Lys Val Ser Gly Met Asp Cys Ala Ala Cys Ala Arg

50 55 60

Lys Val Glu Asn Ala Val Arg Gln Leu Ala Gly Val Asn Gln Val Gln

65 70 75 80

Val Leu Phe Ala Thr Glu Lys Leu Val Val Asp Ala Asp Asn Asp Ile

85 90 95

Arg Ala Gln Val Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ala Gly Tyr Ser Leu Arg

100 105 110

Asp Glu Gln Ala Ala Glu Glu Pro Gln Ala Ser Arg Leu Lys Glu Asn

115 120 125

Leu Pro Leu Ile Thr Leu Ile Val Met Met Ala Ile Ser Trp Gly Leu

130 135 140

Glu Gln Phe Asn His Pro Phe Gly Gln Leu Ala Phe Ile Ala Thr Thr

145 150 155 160

Leu Val Gly Leu Tyr Pro Ile Ala Arg Gln Ala Leu Arg Leu Ile Lys

165 170 175

Ser Gly Ser Tyr Phe Ala Ile Glu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Phe Ile Gly Ala Thr Ala Glu Ala Ala Met Val Leu Leu

195 200 205

Leu Phe Leu Ile Gly Glu Arg Leu Glu Gly Trp Ala Ala Ser Arg Ala

210 215 220

Arg Gln Gly Val Ser Ala Leu Met Ala Leu Lys Pro Glu Thr Ala Thr

225 230 235 240

Arg Leu Arg Lys Gly Glu Arg Glu Glu Val Ala Ile Asn Ser Leu Arg

245 250 255

Pro Gly Asp Val Ile Glu Val Ala Ala Gly Gly Arg Leu Pro Ala Asp

260 265 270

Gly Lys Leu Leu Ser Pro Phe Ala Ser Phe Asp Glu Ser Ala Leu Thr

275 280 285

Gly Glu Ser Ile Pro Val Glu Arg Ala Thr Gly Asp Lys Val Pro Ala

290 295 300

Gly Ala Thr Ser Val Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Val Leu Ser Glu

305 310 315 320

Pro Gly Ala Ser Ala Ile Asp Arg Ile Leu Lys Leu Ile Glu Glu Ala

325 330 335

Glu Glu Arg Arg Ala Pro Ile Glu Arg Phe Ile Asp Arg Phe Ser Arg

340 345 350

Ile Tyr Thr Pro Ala Ile Met Ala Val Ala Leu Leu Val Thr Leu Val

355 360 365

Pro Pro Leu Leu Phe Ala Ala Ser Trp Gln Glu Trp Ile Tyr Lys Gly

370 375 380

Leu Thr Leu Leu Leu Ile Gly Cys Pro Cys Ala Leu Val Ile Ser Thr

385 390 395 400

Pro Ala Ala Ile Thr Ser Gly Leu Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly Ala

405 410 415

Leu Ile Lys Gly Gly Ala Ala Leu Glu Gln Leu Gly Arg Val Thr Gln

420 425 430

Val Ala Phe Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Val Gly Lys Pro Arg Val

435 440 445

Thr Ala Ile His Pro Ala Thr Gly Ile Ser Glu Ser Glu Leu Leu Thr

450 455 460

Leu Ala Ala Ala Val Glu Gln Gly Ala Thr His Pro Leu Ala Gln Ala

465 470 475 480

Ile Val Arg Glu Ala Gln Val Ala Glu Leu Ala Ile Pro Thr Ala Glu

485 490 495

Ser Gln Arg Ala Leu Val Gly Ser Gly Ile Glu Ala Gln Val Asn Gly

500 505 5l0

Glu Arg Val Leu Ile Cys Ala Ala Gly Lys His Pro Ala Asp Ala Phe

515 520 525

Thr Gly Leu Ile Asn Glu Leu Glu Ser Ala Gly Gln Thr Val Val Leu

530 535 540

Val Val Arg Asn Asp Asp Val Leu Gly Val Ile Ala Leu Gln Asp Thr

545 550 555 560

Leu Arg Ala Asp Ala Ala Thr Ala Ile Ser Glu Leu Asn Ala Leu Gly

565 570 575

Val Lys Gly Val Ile Leu Thr Gly Asp Asn Pro Arg Ala Ala Ala Ala

580 585 590

Ile Ala Gly Glu Leu Gly Leu Glu Phe Lys Ala Gly Leu Leu Pro Glu

595 600 605

Asp Lys Val Lys Ala Val Thr Glu Leu Asn Gln His Ala Pro Leu Ala

610 615 620

Met Val Gly Asp Gly Ile Asn Asp Ala Pro Ala Met Lys Ala Ala Ala

625 630 635 640

Ile Gly Ile Ala Met Gly Ser Gly Thr Asp Val Ala Leu Glu Thr Ala

645 650 655

Asp Ala Ala Leu Thr His Asn His Leu Arg Gly Leu Val Gln Met Ile

660 665 670

Glu Leu Ala Arg Ala Thr His Ala Asn Ile Arg Gln Asn Ile Thr Ile

675 680 685

Ala Leu Gly Leu Lys Gly Ile Phe Leu Val Thr Thr Leu Leu Gly Met

690 695 700

Thr Gly Leu Trp Leu Ala Val Leu Ala Asp Thr Gly Ala Thr Val Leu

705 710 715 720

Val Thr Ala Asn Ala Leu Arg Leu Leu Arg Arg Arg

725 730

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 3

ggatccaaag agtaaagaag aacaatgtcg actcctgaca at 42

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 4

ggatccctct cctgcgcaac aatct 25

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gagatgtcga gtctcgaa 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ctcgagcaca gtgtagtgac tgg 23

PCT/RO/134表

申请人或代理人档案号 OPP020276KR

国际申请号

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

A.对说明书第 11 页，第 5 行所述的微生物的说明。
A.对说明书第 11 页，第 5 行所述的微生物的说明。		B.保藏事项其它保藏在补充页中□
韩国典型培养物保藏中心保藏单位名称 Korea Collection for Type Cultures		B.保藏事项其它保藏在补充页中□
韩国典型培养物保藏中心保藏单位名称 Korea Collection for Type Cultures		保藏单位地址(包括邮政编码和国名)#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic of Korea
保藏日期 29.3月2002(29.03.02)	保藏编号 KCTC 10207 BP
保藏日期 29.3月2002(29.03.02)	保藏编号 KCTC 10207 BP	c.补充说明(必要时) 本栏内容有补充页□
		c.补充说明(必要时) 本栏内容有补充页□
		D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
		D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
		E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)		E.补充说明(必要时)

PCT/RO/134表(1998年7月)

Claims

1.一种重组载体，包括重金属转移P型ATPase的编码序列，其中该编码序列可操纵地连接于可植物表达的转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

3.根据权利要求1所述的重组载体，其中P型ATPase是ZntA。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其中ZntA具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的重组载体，其中编码序列是类ZntA重金属泵ATPase基因，其包括与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的ZntA有至少50％同源性的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的重组载体，其中重组载体是PBI121/zntA或pEZG。

7.一种用权利要求1所述重组载体转化的转基因植物或其部分。

8.根据权利要求7所述的转基因植物或其部分，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

9.一种用权利要求1所述重组载体转化的转基因植物细胞。

10.根据权利要求9的转基因植物细胞，其中重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

11.一种由权利要求1所述的重组载体稳定转化的转基因植物。

12.根据权利要求11的转基因植物，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

13.一种用权利要求5所述重组载体转化的转基因植物或其部分。

14.根据权利要求13的转基因植物或其部分，其中重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

15.一种由权利要求5所述的重组载体转化的转基因植物细胞。

16.根据权利要求15的转基因植物细胞，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

17.一种由权利要求5所述的重组载体稳定转化的转基因植物。

18.根据权利要求17的转基因植物，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

19.一种包括SEQ ID NO：1的编码重金属转移P型ATPase，ZntA序列的重组载体：

其中该编码序列可操纵地连接于可植物表达的转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制；和

其中ZntA包含大约100个氨基酸残基的N末端延伸区、第一跨膜区、包含推定的阳离子通道基序CPX区的第二跨膜区、第三跨膜区，第一胞质区、第二胞质区和C末端区。

20.一种用权利要求19所述重组载体转化的转基因植物或其部分。

21.根据权利要求20的转基因植物或其部分，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

22.一种用权利要求19所述重组载体转化的转基因植物细胞。

23.根据权利要求22的转基因植物细胞，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

24.一种由权利要求19所述的重组载体稳定转化的转基因植物。

25.根据权利要求24的转基因植物，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

26.一种包括编码重金属转移P型ATPase，ZntA序列的重组载体：

其中该编码序列可操纵地连接于可植物表达的转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制；

其中ZntA包含大约100个氨基酸残基的N末端延伸区、第一跨膜区、包含推定的阳离子通道基序CPX区的第二跨膜区、第三跨膜区，第一胞质区、第二胞质区和C末端区；和

其中编码序列每个区与SEQ ID NO：1的相同区至少约有50％的同源性。

27.一种用权利要求26所述重组载体转化的转基因植物或其部分。

28.根据权利要求27的转基因植物或其部分，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

29.一种用权利要求26所述重组载体转化的转基因植物细胞。

30.根据权利要求29的转基因植物细胞或其部分，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

31.一种由权利要求30所述的重组载体稳定转化的转基因植物。

32.根据权利要求31的转基因植物，其中所述重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

33.一种产生增强对重金属抗性的转基因植物的方法，包括：

(a)制备包含重金属转移P型ATPase的编码序列的表达构建体，该编码序列可操纵地连接于可植物表达转录和翻译调控序列，并受所述调控序列的调节控制；

(b)制备携带有所述表达构建体的重组载体；和

(c)将重组载体的表达构建体导入植物细胞或植物组织以产生转基因植物细胞或转基因植物组织。

34.根据权利要求33所述产生转基因植物方法，其中的重金属至少一种选自砷、锑、铅、汞、镉、铬、锡、锌、钡、镍、铋、钴、锰、铁、铜、钒。

35.根据权利要求33所述产生转基因植物方法，进一步包括如下步骤：从步骤(c)所述的转基因植物细胞或转基因植物组织再生转基因植物。