JP2002521005A

JP2002521005A - エチレンシグナル伝達経路における銅トランスポーター

Info

Publication number: JP2002521005A
Application number: JP2000560766A
Authority: JP
Inventors: ジョセフアールエッカー; タカシヒラヤマ; ジョセフジェイキーバー
Original assignee: ザトラスティーズオヴザユニヴァーシティーオヴペンシルバニア
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2002-07-16
Also published as: CA2336487A1; EP1100308A4; WO2000004760A1; EP1100308A1; IL140999A0; AU5222699A

Abstract

(57)【要約】本発明は、シロイヌナズナで同定され、エチレンガスシグナル伝達経路における初期作用制御因子をコードする新規な遺伝子（「ｒａｎ１」遺伝子）及び植物における銅輸送を制御するアンタゴニスト応答性変異体に関する。更に本発明は、ｒａｎ１又はそのタンパク質発現産物を操作し植物のエチレン応答を調節して、種々の植物における生育、細胞伸長、花及び葉の老化、器官脱離、果実の成熟及び昆虫耐性を含む生長及び発達過程の調節及び制御された改変を許容する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の参照本出願は、1998年7月22日に出願された米国仮出願60／093698の優先権を主張
する。

【０００２】政府支援この仕事は、ナショナル・サイエンス・ファウンデーション（認証番号MCB-95
-07166）、米国エネルギー省及びナショナル・インスティテュート・オブ・ヘル
ス（認証番号DE-FG02-93ER20104）の認証の下で一部支援された。政府は本発明
に対してある権利を有し得る。

【０００３】発明の背景単純なガス状ホルモンエチレン(C₂H₄)は、発生、細胞伸張、花及び葉の老化、
性の決定、並びに果実の熟成を含む、各種の植物の成長及び発生過程に関与して
いる（Abelesら、（1992）、「植物生物学におけるエチレン」、第2版、ニューヨ
ーク、ＮＹ、アカデミック・プレス）。多くの生物学的ストレスが、怪我、器官
脱離、細菌やウィルス、又は菌感染、病原菌細胞由来のグリコペプチドエリシタ
ー（elicitor）調製物のようなエリシターによる処理を含め、植物においてエチ
レン産生を誘導することが知られている。器官脱離の場合には、葉柄の基部と、
茎との間に位置する領域（器官脱離領域）における細胞の特定の層は、現在のと
ころ十分に理解されていない過程によって、エチレンと、他の内発的植物成長レ
ギュレーターとの複雑な組合せに応答する。しかしながら、器官脱離の効果は、
典型的には局在化した調節された、植物の部分の喪失である。その結果は、死ん
だ葉又は花として、又は果実の軟化又は「成熟」として、視認することができ、結
局、分離点で障害を受けた植物を残す。

【０００４】最近の研究によれば、エチレンは、根の表皮における細胞の運命の決定（Tani
motoら、Plant Ｊ. ８：943-948(1995)）や、病原体攻撃の際の防御遺伝子の全
身性の活性化（Penninckxら、Plant Cell 8:2309-2323(1996)）、トマトにお
ける障害応答(O'Donnell ら、Science 274:1914-1917（1996）)、及び共生的
窒素固定ノジュールの形成（Pennetsaら、Science 275:527-530（1997））にお
いても要求される。従って、植物の要求される組織における、制御されたエチレ
ン産生及びレセプターによるエチレンの認識、次いで信号導入は、植物病原体へ
の応答や、退緑、老化及び器官脱離を含めて、植物中で見られる複雑な発生系を
確立し、制御し、及び維持するのに必要である。

【０００５】エチレンの合成経路は、よく特徴付けられている（Kende, Plant Physiol., 91:1-4(1991)）。ＡＣＣからエチレンへの変換は、エチレン形成酵素により触
媒される(Spanuら、EMBO J 10:2007(1991))。閉鎖環状エチレン合成経路にお
いて、S−アデノシルメチオニン(SAM)は、メチオニンから産生される。次いで、
速度限定過程において、SAMは、ACCシンセターゼによって、1−アミノシクロプ
ロパン−１−カルボン酸(ACC)に変換される。最終過程では、エチレンは、ACCオ
キシダーゼによって、ACCから産生される。この経路は、従って、多重ACC合成及
びACCオキシダーゼを利用する。

【０００６】科学者は、分子レベルにおいて、エチレンシグナル伝達経路をようやく理解し
始めたところである。エチレンシグナル機構を理解するには、アラビドプシス・
チアリアナ(Arabidopsis thialiana)（シロイヌナズナ）の実生のエチレン誘導
三重応答(triple response)表現型を使用する、分子／遺伝子的アプローチが適
用されてきた。シロイヌナズナにおいては、「三重応答」には、根及び茎伸長の防
止や、茎の半径方向の肥大、及び通常の屈地性応答（横地性）が典型的に含まれ
る。植物の黄化(etiolated)モルホロジーは、エチレン産生を誘導するストレス
条件によって劇的に変化して、例えば、エチレン誘導三重応答は、圧縮された土
に浸透するに必要な追加の強度を実生に付与する。

【０００７】三重応答に基づいて、12種のシロイヌナズナ変異体が２つのクラスに単離され
た（Ecker, Science 268:667-675(1995); Johnson & Ecker, Annu. Rev. Genet
ics 32:227-254 (1998); 米国特許第5,367,065号;5,444,166号; 5,602,332号; 5
,650,553号明細書（これらのそれぞれを参考としてここに引用する））。変異体
の一つ、ein(エチレン非感受性;ethylene insensitive))変異体は、外発性エチ
レンに対して、低下した又は完全に非感受性である。この群は、etr1（Bleecker
ら、Science 241:1086-1089 (1988)）、etr2 (Sakai et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 95:5812-5817(1998))、ein2 (Guzman & Ecker, Plant Cell 2:513-5
23 (1990))、ein3 (Rosenberg & Ecker, Sem. Dev. Biol. Plant Dev. Genet.4:
3-13 (1993))、ein5/ain1 (Van der Straeten et al., Plant Physiol. 102:401
-408 (1993))、eti (Harpham et al., Ann. Bot. 68:55-62 (1991))、ein4 及び
ein6 (Roman et al., Genetics 139:1393-1409 (1995))を含む。他の群の変異体
（構成的応答変異体）は、外発的に適用されたホルモンの不存在下において、構
成的エチレン応答表現型を示す。エチレン生合成及び活性のアンタゴニストを使
用することによって、このクラスの変異体は、更に、ホルモン過剰生産変異体（
eto1、eto2、及びeto3）（Guzman及びEcker、1990(上記)；Kieberら、Cell 72:
427−441(1993)及び構成的シグナル変異体(ctr1;constructive triple response
)(Kieber ら、1993(上記))に分離される。後者の変異体は、エチレン生合成又は
レセプター結合のインヒビターの不存在の下においてさえも、「エチレン」表現型
を示す。

【０００８】遺伝子エピスタシスの研究によれば、ETR1及びEIN4は、CTR1の上流で作用し、
ＥＩＮ2、ＥＩＮ３、ＥＩＮ５、ＥＩＮ６及びＥＩＮ７は、CTR1の下流で作用す
る（Roman et al., 1995、上記；Saiki et al., 1998;Hua et. al., Plant Cell
10:1321-1332 (1998)）。CTR１遺伝子は、Raf様セリン／トレオニンタンパク質
キナーゼをコードする(Kieber et al., 1993, 上記)。Rafは、哺乳動物細胞にお
けるMAPキナーゼカスケードの成分として知られ、MAPキナーゼカスケードは、エ
チレンシグナル経路に関与していることを示す。この遺伝子の機能喪失変異が、
エチレン構成的応答表現型を付与するのであれば、CTR１は、エチレン応答経路
の負のレギュレイターであると考えられる。ＥＩＮ３及びその関連遺伝子（EIL1
、２及び３）は、クローン化され、特徴付けられてきた（Chao et.al., Cell 89
:1133-1144 (1997)）。EIN３タンパク質は、インビトロにおけるDNA結合活性に
特有のその配列によって示されるように、転写レギュレイターの新規なクラスで
あると想定される(Solano et al., Genes Dev. 12:3703-3714 (1998)。

【０００９】エチレン認識の機構は、はじめに、生化学的アプローチによって検討された(B
leecker et al., （１９９７）、Biology and Biotechnology of the Plant Hor
mone Ethylene、AK Kanellis, ed: Kluweer Acad. Publ, pp.63-70; Hua & Meye
rowitz, Cell 94:261-271 (1998))。[¹⁴C]エチレンとともに全体の植物組織又は
器官を使用するエチレン結合分析により、多くの植物種において、異なる解離速
度、即ち、早い解離(半減期:＜30分)及び遅い解離(半減期:＞6時間)を有する、
飽和し得る2種類のクラスの結合サイトが示された(Sisler、1990、The Plant Ho
rmone Ethylene、K. Mattoo & JC Suttle, eds. (Boca Raton, FL: CRC Press、
pp.81-100 (1990)により検討された)。エチレンアンタゴニストを使用する引き
続く競合結合分析によって、結合活性の生理学的関連性が支持された。しかしな
がら、エチレンレセプターを精製する試みは、成功裏には終わらなかった。

【００１０】興味深いことには、etr1(ethylene receptor)植物は、エチレン結合活性の低
下を示し(Bllecker et al. 1988、上記)、ETR1が、エチレンのレセプターをコー
ドすることを示す。この遺伝子における変異によって、エチレン応答の完全な喪
失が生じ得る。この結果、ETR1遺伝子が、エチレンのレセプターをコードするこ
とを結論付けることができる。マップを基礎とする染色体ウォーキングによって
単離されたETR１遺伝子は、膜結合ヒスチジンキナーゼをコードする（Chang et
al., Science 262:539-544 (1993); Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 92:4129-4133 (1995)）。このキナーゼは、出芽酵母のオスモセンサーを含む
、真核生物のヒスチジンキナーゼの新生ファミリーに類似し、また、原核生物の
2成分制御系におけるセンサー分子に類似している。

【００１１】出芽酵母細胞におけるこのタンパク質の発現は、植物材料に見出されるこれら
のタンパク質の特徴と類似する結合特性を有するエチレン結合能力を付与するこ
とが判明し、更に、etr1遺伝子が、エチレンレセプターをコードすることが確認
された(Schaller et al., Science 270:1809-1811 (1995))。更に、大腸菌から
発現されかつ部分的に精製されたETR1タンパク質が、ヒスチジンキナーゼ活性を
有することが示された(Gamble et al., Natl. Acad. Sci. USA 95:7825-7829 (1
998))。

【００１２】シロイヌナズナは、少なくとも4種類の他のETR様遺伝子、即ち、ERS1、ETR2、
ＥＩＮ4、及びERS2を有する(Hua et al., 1995、上記;Hua et al., 1998上記; S
akai et al., 1998上記)。ein4 及びetr2変異体は、etr1のものと同様の類似し
たエチレン非感受性表現型を示す。人工的な変異ERS又はERS2遺伝子を有するト
ランスジェニックシロイヌナズナ植物は、etr1-1と同一の変異を有し、エチレン
非感受性表現型を示す。これらの結果から、ETR1関連タンパク質が、エチレンシ
グナル経路に関与していることが分かる。全ての同定されたレセプター変異体は
優勢であるので、レセプター分子がエチレン応答の正又は負のレギュレータであ
ることは最近まで不明確であった。エチレンレギュレータ遺伝子の機能喪失変異
に関する最近の研究によって、エチレンレギュレータが、エチレン応答経路を負
に制御することが分かった(Hua et al., 1998、上記)。「ネバーライプ(Never r
ipe)」、即ち、エチレン非感受性変異トマト種は、ERS様遺伝子に変異を有する
ことが同定されており、エチレンシグナル経路は、少なくともこのホルモンの認
識において、植物世界において保存されていることを示す。

【００１３】銅は、もちろん、好気性生物にとって必須の金属である。銅は、酵素、例えば
、チトクロムcオキシダーゼや、銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ及びリシ
ルオキシダーゼの共因子として機能し、動物における、ニューロトランスミッタ
ー合成及び連結組織の成熟に必要である(Uauy et al., Am. J. Clin. Nutr. 67(
suppl) e:952S-959S (1998)を参照)。しかしながら、逆説的には、銅は非常に有
毒である。銅の細胞間濃度は、厳密に制御され、銅は、典型的には、非反応性形
態で隔離されている。それでも、銅輸送及び代謝の基本的な機構は、進化において硬度に保存されて
いるものと考えられる(Askwith et al., Trands Biochem. Sci. 23:135-138 (19
98))。酵母においては、例えば、原形質膜に局在する銅トランスポーターは、銅
イオンを細胞質に輸送し、そこで、それらは直ちに銅輸送タンパク質と結合する
。いくつかの異なる輸送タンパク質は、公知であり、Atx1p、Lys7p及びCox17を
含み、これらは、その細胞内標的が異なる。従って、充分な銅の供給がなければ
、レセプターは、適当なタンパク質形態を採ることはできないと考えられる。

【００１４】酵母の場合と同様に、後ゴルジ(post-Golgi)区画へのRAN1の局在化による低下
した銅の輸送は、共局在化したエチレンレセプターアポタンパク質に対して、異
常な量の銅を提供すると考えられる(Thompson et al., J. Am. Chem. Soc. 105:
3522-3527 (1983))。これによって、エチレン及びTCOの両方を認識してアゴニス
トとして機能することができるようにする、変化した(又は緩和した)リガンドの
特異性が生じ得る。最近の研究(Rodriguez et al., Science 283:396-398 (1999
))によれば、二量化エチレンレセプターは、正確な構造(及びリガンド特異性)を
とるためには、少なくとも2分子の銅が必要であると考えられる。銅輸送遺伝子
の変異によって多くの真核生物における生理的不規則性が生じることから、銅代
謝の適当な制御が重要であることの認識が支持される。Menkes/Wilson 病遺伝子
(酵母CCC2/シロイヌナズナRAN1)に加えて、ヒトCtr1遺伝子(酵母Ctr1の相同体(Z
hou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7481-7486 (1997))、ヒトHah1遺
伝子(酵母ATX1の相同体(Klomp et al., J. Biol. Chem. 272:9221-9226 (1997))
、ヒトCcs1 遺伝子(LYS7の相同体(Culotta et al., J. Biol. Chem. 272:23469-
23472 (1997))及びヒトCox17遺伝子(酵母COX17の相同体(Amarvadi et al., Hum.
Genetics 99:329-333 (1997))を含めかつこれらに限定されることはないが、酵
母サイトゾル銅代謝遺伝子のヒト相同体が見出されている。

【００１５】エチレンはオレフィンであるので、エチレンが、遷移金属、例えば銅を有する
植物レセプターによって認識されるものと考えられている(Burg et al., Plant
Physiol. 42:144-152 (1967)。いくつかの観察によってこの考えは支持された。
例えば、銅イオン(Cu(I))と生化学的に類似する銀イオン(Ag(I))をインビトロで
植物細胞の培地に添加すると、エチレン応答が阻害される。更に、銅又は銀イオ
ンのいずれかを添加すると、ETR1タンパク質を発現する酵母細胞からの膜抽出物
のエチレン結合活性が低下する(Bleecker, 1997, 上記; Bleecker, Science 283
: 996-999 (1999))。いずれの公知の金属結合主題(モチーフ)も、本発明前にお
いて、ETR1の予測されるアミノ酸配列又はその関連タンパク質のいずれにおいて
も、報告されておらず、この問題は、本発明の開発までは未解決として残されて
いた。

【００１６】本発明は、従って、新規な単離核酸、その発現産物、及び分泌経路のおいて必
須の遷移金属イオン、特に銅イオンの送達を調整し、修正し、制御する方法を提
供するものである。エチレンシグナル経路に関するこのような進展する理解によ
って、病原因子に対する植物の耐性を改善し、かつ病原因子耐性植物を特定する
ためのより簡易でかつ効率的な方法を展開するための方法を開発することが可能
となった。更に、植物ホルモン及びその調節の機構に対する洞察を与えることに
よって、また、その機能を修正し、制御することによって、植物食品産物、例え
ば、果実や野菜並びにその他の非食品植物産物、例えば、商業的に価値のある穀
物、例えば、綿又はアマ、若しくは装飾用の緑色植物の品質や、量及び寿命(lon
gevity)を有意に改善することが可能であり、もって、発展又は非発展国の両方
における市場により多くのかつより良質の製品を提供することができる。

【００１７】発明の要約本発明は、銅トランスポーター活性を有する植物、植物細胞、組織、花、器官
又は他の植物部分をコードする単離された核酸、及び銅トランスポーター活性を
有する植物、植物細胞、組織、花、器官又はその他の植物部分をコードする変異
体、誘導体、相同体及び断片に関する。また、ran1 遺伝子及び、配列番号1及び
2を有するゲノム核酸配列及びcDNAが含まれる。更に、本発明の態様は、植物銅
トランスポーターをコードする核酸を有する植物、植物細胞、器官、花、組織、
種子又は子孫に関する。

【００１８】本発明は、また、銅トランスポーター活性を有する植物、植物細胞、組織、花
、器官又はその他の植物部分及びそのような活性を有するその類似体若しくは断
片中における、植物銅トランスポーターを含有するタンパク質の精製調製物に関
する。また、本発明は、RAN1及びアミノ酸配列番号3を有するポリペプチド、並
びに、銅トランスポーター活性がATP依存性である態様を含む。更に、本発明の態様には、植物銅トランスポーターを含有する組換え細胞、植
物銅トランスポーターをコードする単離された核酸を含有するベクター、及び植
物RAN1ポリペプチド、銅トランスポーター活性を有するそのアナログ、誘導体又
は断片に対する特異的な抗体が含まれる。

【００１９】本発明には、更に、植物銅トランスポーター配列をコードする核酸の全て又は
一部及び銅トランスポーター活性を有する植物、植物細胞、組織、花、器官又は
他の植物部分をコードするその変異体、誘導体、相同体又は断片とアンチセンス
配向において相補的である配列を含有する単離された核酸配列が含まれる。態様
としては、植物、植物細胞、器官、花又は組織を制御し、調整し、又は修正する
のに充分なレベルでアンチセンス活性を有するそのような相補的核酸が含まれる
。更に、本発明は、植物銅トランスポーターをコードする核酸に対してアンチセ
ンス配向で核酸を含有する植物、植物細胞、器官、花、組織、種子又は子孫にも
関する。本発明は、更に、植物銅トランスポーターをコードする核酸又は植物銅トラン
スポーターをコードする核酸を含有する組換え核酸を有するトランスジェニック
植物、その細胞,、器官、花、組織、種子、又は子孫に関する。また、本発明は
、植物銅トランスポーター活性を有するタンパク質を含有するトランスジェニッ
ク植物、その細胞、器官、花、組織、種子又は子孫を包含する。

【００２０】更に、本発明は、植物銅トランスポーターをコードする先行する単離された核
酸のいずれかに関し、更に、植物RAN1プロモーター配列又はプロモーター活性を
有するその断片を含有する。本発明には、更に、植物銅トランスポーターをコー
ドする先行する単離された核酸を含有するベクターが含まれる。更に、追加の態
様は、植物銅トランスポーターをコードする精巧する単離された核酸のいずれか
を含有し、更に、それに機能可能に融合されているリポーター遺伝子又はリポー
ター活性を有するその断片を含む。また、本発明は、RAN1プロモーター遺伝子を含有する単離された核酸を含有す
る導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物、その細胞、器官、花、組織、種
子又は子孫に関する。本発明は、更に、植物銅トランスポーターをコードする核酸を植物中で操作す
る方法に関し、この方法によって、発芽、細胞伸長、性決定、花又は葉の老化、
花成熟、果実成熟、昆虫や、除草剤又は病原因子抵抗、器官脱離、又は植物中の
ストレスに対する応答の制御、調整、又は修正が可能となる。1態様においては
、この方法は、発芽、細胞伸長、性決定、花又は葉の老化、花成熟、果実成熟、
除草剤又は病原因子抵抗、器官脱離、又は植物中のストレスに対する応答の開始
又は増大に関し、別の態様においては、植物、植物細胞、器官、花又は組織にお
ける掛かる応答の阻害又は防止に関する。

【００２１】更に、本発明は、植物におけるエチレンシグナル系での銅の輸送に影響するこ
とができる化を特定する方法であって、植物RAN1配列をコードする単離された核
酸を有しかつそれに動作可能に連結されたリポーター配列を有する細胞を提供す
る工程、被検化合物をその細胞に添加する工程、及びその細胞においてリポータ
ー遺伝子活性のレベルを測定する工程であって、かかる被検化合物が添加されて
いない別の細胞におけるリポーター活性のレベルに対する細胞中におけるリポー
ター遺伝子活性の高い又は低いレベルを、被検化合物が植物ran1遺伝子の発現に
影響することができる指標となる工程を含む方法に関する。

【００２２】更に、本発明は、1つの態様として、対応する野生型植物に対して向上した銅
輸送活性を有する修正された植物を産生する方法であって、その修正された植物
の細胞にRAN1をコードする単離された核酸を導入し、そのran1核酸が、その修正
された植物中で銅を輸送することができる方法に関する。別の態様は、対応する
野生型植物に対して減少した又は阻害された銅輸送活性を有する植物を産生する
方法であって、修正された植物の細胞内に、ran1の全部又は一部と相補的な核酸
をコードする単離された核酸を導入することによって、その細胞中で、銅輸送分
子と結合し又は阻害し、そのran1核酸は、修正植物の細胞内において、銅を輸送
できる方法に関する。

【００２３】更に、本発明は、植物細胞中のRAN1の発現を操作する方法であって、核酸ran1
又はその作用可能な部分を、植物細胞中で植物プロモーター配列に動作可能に融
合して、キメラＤＮＡを形成し、そしてトランスジェニック植物を産生し、その
細胞は、キメラＤＮＡを含有し、調整された植物プロモーターの活性によって、
RAN1の発現が操作される方法に関する。本発明は、また、変異対立遺伝子ran1-1及びran1-1のポリペプチド発現産物を
コードする核酸に関する。本発明の付加的な目的、利点及び新規な特徴は、以下で説明する詳細な説明、
実施例及び図面に一部記載されており、また、以下の記載を検討することによっ
て一部当業者には明らかであり、又は本発明の実施によって理解することができ
る。

【００２４】詳細な説明本発明は、シロイヌナズナのエチレンガスシグナル伝達経路において初期に作
用するネガティブ制御因子のアンタゴニスト応答性変異体についての新規スクリ
ーニングに続く同定に基づくものである。本発明により、エチレンシグナル伝達
経路に関連するメカニズムに対する見識が明らかになる。エチレン認識の基礎を
なすメカニズムをより理解するために、本発明者等はエチレン認識が変化した変
異体を単離した。単離することにより、本発明において、変異体を同定し、これ
がエチレンレセプターの変化したリガンド特異性を示すことを特徴付けた。エチレンアンタゴニストであるトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）は、本発
明の変異体のクラスにおいて、エチレンシグナル伝達経路を阻害又は遮断するの
ではなく活性化する。この変異体は、ｒａｎ１（アンタゴニスト１に対して応答
性の意）の対立遺伝子によりコードされる。本発明者等によるＲＡＮ１遺伝子の
クローニングに基づくマップは、ｒａｎ１が、ヒトメンケス／ウィルソン病遺伝
子及び酵母ＣＣＣ２遺伝子の相同体であることを明らかにした。ＲＡＮ１タンパ
ク質は、銅輸送活性を植物細胞に有利に提供することが見いだされた。同時に、
ヒトメンケスタンパク質、ウィルソンタンパク質及び酵母Ｃｃｃ２ｐの最近の研
究は、これらのタンパク質が銅トランスポーター機能だけでなく、銅イオンを分
泌経路へ送達することを示唆している。本発明にしたがい、ＲＡＮ１の遺伝子的、分子的及び生化学的研究により、植
物におけるエチレン認識／シグナル伝達に対する銅イオンの要求性のin vivoで
の証拠が初めて提供される。更に、ＲＡＮ１の機能性研究は、酵母及び植物細胞
において銅輸送を制御するメカニズムが保存されていることを実証する。機能性
ホルモンレセプターの組み立てに対するＲＡＮ１／銅の要求性は、植物における
エチレン認識メカニズムの理解を促進し、その他の生物における銅依存性シグナ
ル伝達過程についての有用なパラダイムを提供する。エチレンガスシグナル伝達経路の新規成分における変異体を同定するために、
強力なホルモンアンタゴニストに応答してエチレン様三重応答表現型を示すシロ
イヌナズナ（Arabidopsis thaliana）変異体についてスクリーニングを開始した
。シロイヌナズナにおける「三重応答」は、エチレンに曝露したときの暗生長苗
木における３つの異なる形態学的変化：１）胚軸及び根の伸長の阻害、２）茎の
放射状の肥大及び、３）頂端のフックの強調（exaggeration）により構成される
。構成的変異体であるｃｔｒのクラスは、エチレン生合成阻害剤の存在下で構成
的な三重応答を示し、レセプター又はその下流において最も影響を受けるだろう
。遺伝学的研究の結果に基づき、本発明者等は、トランスジェニック植物におけ
る制御遺伝子ｒａｎ１の正常又は切断バージョンの過剰発現を同定し、これを強
力なレセプターアンタゴニストに応答してエチレン三重応答表現型を示すエチレ
ン応答経路における初期作用遺伝子として特徴付けた。

【００２５】本発明は、本明細書に記載される提案されるモデル及びメカニズムにより限定
されるものではないことが理解されるべきである。したがって、エチレンシグナ
ル伝達経路において、銅イオンを送達して機能的エチレンレセプターを作成する
ＲＡＮ１の役割を示すワーキングモデル、例えば図１等に示されるモデルはすべ
て本発明の理解を促進することが理解されるべきである。ＲＡＮ１はポストゴル
ジ（post-Golgi）コンパートメントの膜に位置づけられるものとして示される。
ＲＡＮ１は、銅シャペロン、例えばＡｔｘ１様タンパク質等から銅イオンを受け
取り、これをポストゴルジコンパートメントへ輸送する。これが金属の膜標的化
エチレンレセプターへの送達である。銅イオンの取り込みの後、レセプターは原
形質膜上に位置づけられ、ここでエチレンを機能的に配位する。エチレンはオレフィンである。したがって、そのレセプターはホルモン結合活
性のための遷移金属の配位を要求すると推定される。本発明の好ましい態様にお
いて、遷移金属は銀イオン（Ａｇ（Ｉ））である。特に好ましい態様では、遷移
金属は銅イオン（Ｃｕ（Ｉ））である。これら又はその他の遷移金属のいずれか
がエチレンレセプターに組み込まれる。そうすると、遷移金属はエチレン結合又
は機能性レセプターの適切な折り畳みを阻害し、構成的に活性なレセプタータン
パク質が生じるだろう。銅輸送の減少はＲａｎ^-表現型を引き起こす。したがって、銅の十分な供給が
ないと、適切なタンパク質コンホメーションをとることが不可能であるらしい。野生型植物において、レセプターへのエチレンの結合は、エチレンレセプター
の活性を不活性化し（おそらくは、ヒスチジンキナーゼ活性の低下を引き起こす
）、続いてシグナル伝達経路の活性化（抑制解除）を通してエチレン応答を誘導
する。同時抑制されたトランスジェニック植物（クラス１）においてＲＡＮ１に
よる銅送達が存在しないと、エチレンレセプターは機能しない（キナーゼ活性の
不在）。結果として、エチレンが存在しなくとも、ホルモン応答経路は構成的に
活性化される。

【００２６】エチレンレセプターが機能しない変異体は、シグナル伝達経路のネガティブ制
御因子として機能し、有意な機能的オーバーラップを示すすることが示された。
更に、エチレンのレセプターへの結合は、生化学的活性を阻害するだろう。ＲＡ
Ｎ１発現における更に厳しい変化は、エチレン応答性遺伝子の活性化及び表現型
を完全に又は部分的に停止させる。更に、ＲＡＮ１同時抑制植物において観察さ
れる表現型は、４倍（quadruple）エチレンレセプターノックアウト変異体につ
いて記載される表現型から区別することができなかった。得られた植物は生長が
激しく阻害され、完全に生殖不能であった（Hua 及び Meyerowitz, 1998, 前出
）。このことにより、銅は１つ以上のレセプターの機能に必要であることを確認
した。ＲＡＮ１活性は、少なくとも４以上のエチレンレセプターの機能に要求される
らしい。したがって、レセプター機能における単一の重要な制御因子の発現の喪
失は、全エチレン応答経路の抑制解除を引き起こす。銅はレセプター複合体の組
み立てに要求され、その不存在下では、これらのタンパク質は急速にターンオー
バーされる（すなわち、すべてのエチレンレセプターは機能しない）らしい。本明細書における用語「植物」とは、トランスジェニック植物を含む、野生型
、処理したもの、遺伝的に操作したもの又は組換えたものの全体及びその一部を
意味する。この用語は、たとえ特定の名称の有無にかかわらず、植物細胞、組織
、花、葉、茎、根、器官等を含み、更には種子、子孫などをも含む植物のあらゆ
る全ての部分を意味する。本明細書における用語「銅トランスポーター活性」又は「銅輸送活性」とは、
銅又はその他の遷移金属をポストゴルジ領域へ輸送するタンパク質又はポリペプ
チドを意味する。その後、金属は、エチレンシグナル伝達経路の膜標的化エチレ
ンレセプターに送達される。実施例では送達系における「銅」の例について言及
するが、この用語は、分泌経路に関連する全ての遷移金属を例示することを意味
する。本明細書における用語「生物学的活性」とは、銅輸送活性を意味し、これは本
発明のモデルに示されるエチレンシグナルシステムにおいて銅を輸送することが
できるポリペプチド又はその断片を意味する。

【００２７】分子、生物及び植物全体のレベル並びに苗木及び成体植物において、空気中で
生長したｒａｎ１変異体は、エチレン処理した野生型植物と同一であると思われ
る。ｒａｎ１の主な性質は、エチレン応答経路は普段はポジティブ制御下にあり
、ＴＣＯ処理によるＲＡＮ１抑制活性機能の喪失により構成的三重応答表現型の
活性化が起こることを示唆している。後述するように、ＲＡＮ１に対応する遺伝子がクローニングされ、そのｃＤＮ
Ａ配列が記載される。生理学的、生化学的及び遺伝的証拠は、ｒａｎ１遺伝子産
物は、暗中退色（etiolate）した苗木及び成体植物の両方におけるエチレンシグ
ナルの伝達に必要であることを示した。推定のｒａｎ１ポリペプチドは、エチレ
ンシグナル伝達鎖においてポジティブ制御因子として作用する。一方、エチレン
レセプターアンタゴニストであるトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）への曝露
は個の形態学的形質転換を妨げる。ｒａｎ１苗木におけるエチレン結合の競合阻
害剤として作用する代わりに、ＴＣＯ処理は三重応答の活性化を停止させた。こ
れはエチレンの作用を模倣していた。銅イオンのエチレンレセプターへの送達の減少は、銅：アポタンパク質の化学
量論的に最適以下の状態を生じるらしい。そのような変化したタンパク質コンホ
メーションはリガンド特異性の低下を引き起こし、これによりＴＣＯ及びエチレ
ンがアゴニストとして作用することが許容される。複数のレセプターノックアウ
ト変異体と類似して、ＲＡＮ１機能の激しい低下は全てのエチレンレセプターの
銅欠乏を引き起こし、シグナル伝達経路の抑制解除及び全ての既知のエチレン応
答表現型の活性化を引き起こす。ｒａｎ１−１及びｒａｎ１−２等に例示されるいくつかのｒａｎ１対立遺伝子
が同定されている。これらの変異体は劣性であり、エチレン認識を調節する。例
示のｒａｎ１変異体対立遺伝子の配列分析は、両方の変異が、保存されたタンパ
ク質モチーフ（金属結合及びＡＴＰアーゼドメイン）内に見いだされる残基のア
ミノ酸置換を引き起こしていることを明らかにした。これは機能の低下を示唆す
る。酵母ｃｃｃ２変異体における変異ｒａｎ１タンパク質の発現は、完全なＦｅ
ｔ３ｐ活性の回復には不十分であった。このことは、ｒａｎ１対立遺伝子は部分
的な機能喪失変異体であるとする理解を支持するものである。それにもかかわら
ず、与えられた記載の観点においては、その他の対立遺伝子又は変異が当業者に
利用可能であることが理解される。それゆえ、銅輸送活性が発現又は制御される
限り、挿入、欠失、変性（alteration）又は置換を行った追加の変異体が本発明
によって可能になる。

【００２８】エチレン認識／シグナル伝達に対する銅のin vivo要求についての更なる証拠
が、ｒａｎ１変異体の研究により提供される（実施例参照）。いくつかの証拠に
基づくと、ｒａｎ１変異体はハイポモルフであり、銅輸送活性に影響する。ｒａ
ｎ１−１及びｒａｎ１−２対立遺伝子は、それぞれホスフェート及び金属結合モ
チーフにミスセンス変異を含んでいる。したがって、銅トランスポーターの欠損
がエチレンレセプターの変化したリガンド特異性を引き起こすとする結論は、ｒ
ａｎ１−１及びｒａｎ１−２変異体における欠損が、トランスではなく、シス−
シクロオクテン（ＣＣＯ）又は１−メチルシクロプロペン（ＭＣＰ）（これらは
エチレン受容体結合の強力な競合阻害剤である）に対する応答を許容するという
知見により支持される。要約すると、本発明は、エチレンシグナル伝達経路の銅トランスポーターをコ
ードするｒａｎ１又は全ての変異体、誘導体、相同体又はこれらの断片を含む核
酸を含むのもとして解釈される。本発明にしたがうと、核酸にはＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ及びゲノムＤＮＡが含まれるがこれらに限定されるものではない）及びＲＮＡ
（ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡが含まれるがこれらに限定されるものではない）が含ま
れ、更にキラル又は混合した分子が含まれるが、これらに限定されるものではな
い。好ましい核酸配列には、エチレン応答経路の制御タンパク質をコードしてエチ
レン応答経路において銅輸送活性に作用する、例えば配列番号１及び２に示され
る配列並びに変性、挿入、欠失を含む配列、変異体、相同体並びにこれらの断片
が含まれる。核酸の「断片」が、単離された核酸と同一の発現産物を実質的にコードする場
合、又は銅トランスポーター能力を有するペプチドをコードする場合、これは本
発明に含まれる。本発明は、エチレンシグナル伝達経路において銅トランスポーター活性を有す
るペプチド、ＲＡＮ１を含むポリペプチド又はタンパク質、又はその変異体、誘
導体、変種（varient）、類似体、相同体又は断片を含むのもとして解釈される
。用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質配列
」は本発明の範囲において互換的に用いられる。本発明は、配列番号３に示され
る配列、配列番号１及び２に示される核酸に対応するアミノ酸配列、並びにエチ
レン応答経路において銅輸送活性を有するこれらの変異体、誘導体、類似体、相
同体又は断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００２９】本発明はまた、対象の遺伝子、好ましくはran1によりコードされたタンパク質
、ペプチド又はポリペプチドの類似体を提供する。“類似体”は、天然に発生す
るタンパク質又はペプチドとは、アミノ酸保存配列の違いにより又は配列に影響
を与えない修飾により、或いはそれらの両方により区別することができる。“相
同体”は、同じ遺伝子座を有する染色体ＤＮＡである；二倍体細胞上にあるとき
、それぞれの親からの相同体の複製が存在する。例えば、ペプチドの一次配列を変化させるが、その機能を通常は変化させない
、保存アミノ酸交換を行うことができる。この種の保存アミノ酸置換は、例えば
、以下のグループの交換が当業界において知られている；グリシンとアラニン；
バリン、イソロイシンとロイシン；アスパラギン酸とグルタミン酸；アスパラギ
ンとグルタミン；セリンとスレオニン；リジンとアルギニン；又はフェニルアラ
ニンとチロシン。

【００３０】修飾（通常は一次配列に影響を与えない）は、ペプチドのin vivo又はin vitr
oでの化学誘導体化、例えば、アセチル化又は炭酸塩化を含む。グリコシル化の
修飾、例えば、ポリペプチドの合成及び加工、又はさらなる処理工程中に、ポリ
ペプチドのグリコシル化パターンになされる修飾もまた含む。アミノ酸残基がリ
ン酸化されている配列、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホスレ
オニンもまた含む。タンパク質分解（proteolytic degradation）に対する耐性を向上させたか、
又は溶解性を最適化したか、又は治療剤としてより効果的にした、通常の分子生
物学的方法を使用して修飾したポリペプチドもまた本発明に含まれる。そのよう
なペプチドの類似体は、天然に発生するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−
アミノ酸又は天然には発生しない合成分子を含有するものである。しかしながら
、本発明のポリペプチドは、本明細書に規定した特定の例示的な方法による生成
物に限定されるものではない。

【００３１】 “誘導体”は、分子の断片、セグメント、変異体又は類似体を含む、機能的及
び化学的誘導体の両方を含む。分子が、通常はその分子の一部ではない化学基を
さらに含む場合、その分子は別の分子の“化学的誘導体”である。そのような基
により、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期等を向上させることができるか、
又は分子の毒性を減少させるか、分子の望ましくないあらゆる副作用等を除去す
るか又は弱めることができる。そのような効果を媒介することができる基は、Re
mington's Pharmaceutical Sciences (1980) に開示されている。そのような基
をカップリングして分子にする方法は、当業界において周知である。本発明にお
いて使用される用語“誘導体”の意味には、ヌクレオチド又はペプチド、ポリペ
プチド等の“変性”、“挿入”、“欠失”等が含まれる。

【００３２】タンパク質の“変異体”又は“対立遺伝子又は種変異体”は、そのタンパク質
の構造及び生物学的活性において実質的に類似する分子をいう。従って、二つの
分子が共通の活性を有しており、互いに取り換えることができる場合、その分子
のうちの一つの組成物又は、二次、三次又は四次構造が他のものに見られるもの
と同一でない場合でも、或いは、そのアミノ酸又はヌクレオチド配列が同一でな
くても、それらは“変異体”であることを意味する。ポリペプチドの“断片”は、精製したペプチドと同じ活性を実質的に保持する
場合、又は銅輸送活性を有する場合、本発明の範囲内に含まれる。そのようなペ
プチドの断片はまた、抗体の断片を意味する。

【００３３】本発明により、本発明で使用するRAN1及びran1核酸配列は、外来配列であり得
る。本明細書において使用されているように、外来又は非相同とは、形質転換さ
れる植物、細胞、器官、花又は組織からは得られず、かつこれらの遺伝構成（ge
netic makeup）の一部を通常は形成することのない、形質転換していない状態の
核酸配列を意味する。RAN1又はran1変異の外来核酸配列を含有する植物は、配列
番号１及び２の核酸配列、及びそれらの変性体、挿入体、欠失体、変異体、相同
体及び断片によりコードされるが、これらに限定されない。これらに限定されないが、配列番号１及び２の核酸配列等のRAN1又はran1変異
の核酸配列を含有する形質転換した植物細胞、組織等は、本発明の範囲内である
。本発明の形質転換した細胞は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1989) に記載の標準的な形質転換技術及び方法を使用して製造
することができる。

【００３４】本明細書において、銅輸送活性を有する植物細胞等を“コードする核酸”とい
う用語は、上述した銅を輸送することができるポリペプチドをコードする遺伝子
を意味する。その用語の意味は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含む。以下の実施例に記載したように、ran1遺伝子は、そこに位置する特定のドメイ
ンを有するタンパク質、例えば、末端伸長（terminal extension）、膜貫通スパ
ン、ＴＭ１及びＴＭ２、ヌクレオチド結合性ひだ（nucleotide binding fold）
、推定上の制御ドメイン及びＣ末端をコードする。それ故、対象の遺伝子の変異
体、誘導体、相同体又は断片は、関連するタンパク質において選択されたドメイ
ンが、本発明の好ましい態様における同じドメインと、十分な相同性（少なくと
も約４０％の相同性）を共有するものである。そのような核酸の定義は、そこに
含まれるドメインのいずれにおいても、少なくとも約４０％の相同性を有する遺
伝子を含むものと理解される。

【００３５】また、本明細書において、用語“相同性”が、これらのタンパク質のドメイン
を意味する場合、核酸とアミノ酸レベルの両方における相同性に適用されると解
釈されるべきである。そのような核酸又はそれらのタンパク質生成物における類
似のドメイン間の十分な相同性は、少なくとも約４０％と考えられ、好ましくは
、ドメイン間、又はそれらのタンパク質生成物の相同性は、少なくとも約５０％
、より好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％、
さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０
％、及び最も好ましくは、類似のドメイン間の相同性は約９９％である。

【００３６】本発明により、エチレンシグナル伝達系の生物学的に活性な銅輸送ポリペプチ
ド又はそれらの断片をコードする単離された核酸は、完全長であるか又は、制御
されているか若しくは活性な銅トランスポーターをコードするのに十分な長さを
有するのが好ましい。一態様において、核酸の長さは、少なくとも約２００ヌク
レオチドである。より好ましくは、少なくとも４００ヌクレオチドであり、さら
に好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドであり、さらにより好ましくは少な
くとも８００ヌクレオチドであり、さらにより好ましくは少なくとも１０００ヌ
クレオチドである。別の態様において、エチレンシグナル伝達系において銅トラ
ンスポーターポリペプチド活性を有する単離されたポリペプチドの精製物の長さ
は、少なくとも約６０アミノ酸である。より好ましくは、少なくとも１２０アミ
ノ酸であり、より好ましくは少なくとも３００アミノ酸であり、さらにより好ま
しくは少なくとも５００アミノ酸であり、さらにより好ましくは少なくとも７０
０アミノ酸である。さらなる態様において、ポリペプチドは、完全長RAN1タンパ
ク質又はその制御されたものをコードする。

【００３７】本発明はさらに、RAN1をコードする遺伝子を含有するベクターを含む。タンパ
ク質遺伝子又はそれらの一部から構成されるDNA分子は、発現ベクターに動作可
能に結合し、宿主細胞に導入されて、該細胞によりこれらのタンパク質の発現を
可能にすることができる。また、タンパク質は、プロモーターに動作可能に結合
した“ハイブリッド”遺伝子をウイルス性ゲノムに導入することにより、ウイル
ス性宿主においてクローン化することができる。次いで、該タンパク質を、感受
性宿主においてそのような組換えウイルスを複製することにより、発現させるこ
とができる。タンパク質分子をコードするＤＮＡ配列は、慣用の方法によりベク
ターＤＮＡにより組換えることができる。ウイルスにおいてタンパク質分子を発
現させるとき、当業界において周知の方法により、ハイブリッド遺伝子をウイル
ス性ゲノムに導入することができる。従って、本発明は、原核細胞若しくは真核
細胞、又は、原核細胞又は真核細胞において複製するウイルスのいずれかにおい
て所望のタンパク質を発現させることを含む。

【００３８】本発明のタンパク質は、ウイルスにおいてクローン化されているか又は発現さ
れているのが好ましい。本発明のタンパク質を発現するためのウイルス性宿主は
、原核生物宿主において複製するウイルス粒子又は真核生物宿主において感染す
るか又は複製するウイルス粒子を含む。単離した核酸又はその断片を送達するた
めのベクターを生成する方法は周知であり、例えば、上述のSambrookらの論文に
記載されている。適当なベクターとしては、ベクターの制御下において標的遺伝
子を含有する無力にした（disarmed）アグロバクテリウム属腫瘍誘発性（Ti）プ
ラスミド（例えば、pBIN19）、例えば、カリフラワーモザイク（CaMV）35Sプロ
モーター（Langrimini et al. Plant Cell 2:7-18 (1990)）又はその内因性プロ
モーター（Bevan, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721 (1984)）、アデノウイルス
、ウシパピローマウイルス、サルウイルス、タバコモザイクウイルス等があげら
れるが、これらに限定されない。

【００３９】いったん、発現のためのベクター又はＤＮＡ配列を含有する構築物が調製され
ると、ＤＮＡ構築物を適当な宿主に導入するか又は形質転換することができる。
プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、又は他の慣用の方法
等の種々の方法を使用することができる。周知ではあるが、“ハイブリッド”タ
ンパク質遺伝子を含有するウイルス配列は、感受性宿主に直接形質転換するか、
又は最初にウイルス性粒子に詰め込んで、次いで感染させることにより感受性宿
主に導入することができる。細胞を組換えＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子で形質転換
した後、又は、ウイルス又はその遺伝配列を感受性宿主に導入した後、該細胞を
培地中で成長させて適当な活性によりスクリーニングする。配列を発現させると
、本発明のタンパク質が得られる。

【００４０】植物細胞、組織、花、器官又はそれらの断片を製造する方法は当業界において
周知であり、例えば、上述のSambrook et al．に記載されている。適当な細胞と
しては、in vivo又は組織培養のいずれかで適用される、酵母、細菌、哺乳類、
バキュロウイルス−感染昆虫、及び植物由来の細胞があげられるが、これらに限
定されない。調節された銅輸送性能を有する細胞を製造し、植物を再生する目的
のために対象の遺伝子で形質転換した植物細胞もまた含まれる。適当なベクターと植物との組み合わせは、当業者には容易に理解されよう。ま
た、例えば、Maliga et al., 1994, Methods in Plant Molecular Biology: A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor, New Yorkにも記載されている。

【００４１】植物の形質転換は、Horsh te al., 1988, Leaf Disc Transformation: Plant
Molecular Biology Manual A5: 1 に記載されているアグロバクテリウム属媒介
リーフディスク（leaf disc）形質転換法を使用して達成することができる。ト
ランスジェニック植物が所望のＤＮＡを含有しているか評価し、反復する必要の
ない、数多くの方法が当業界において知られている。真核生物宿主における所望のタンパク質の発現は、真核生物制御領域を使用す
ることが必要である。そのような領域は、一般的に、ＲＮＡ合成を開始させるの
に十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターとしては、SV
40初期プロモータ（Benoist et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)）
；酵母ga14遺伝子プロモーター（Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U
SA) 79: 6971-6975 (1982)）及び例示されたpYES3 PGK 1プロモーターがあげら
れるがこれらに限定されない。広く知られているように、真核生物ｍＲＮＡの翻
訳は、最初のメチオニンをコードするコドンにおいて開始される。このため、真
核生物プロモーターと所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列との間の結合は
、メチオニンをコードすることのできるあらゆる介在性コドン（すなわちAUG）
を確実に含有しないのが好ましい。

【００４２】配列をコードする所望のタンパク質及び動作可能に結合したプロモーターを、
直鎖状分子であり得るか、又はより好ましくは、閉じた共有結合性環状分子であ
り得る、非複製性ＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子として、レシピエント原核又は真核
生物細胞に導入することができる。そのような分子は自律増殖ができないので、
所望のタンパク質の発現は、導入した配列の一過性発現により起こり得る。また
、導入した配列を宿主染色体に融合（integration）させることにより永久発現
がおこり得る。ウイルスにおいて所望のタンパク質を発現させるために、典型的
には、プロモーターに動作可能に結合したハイブリッド遺伝子をウイルス性ゲノ
ムに融合させて、ＲＮＡ又はＤＮＡとする。ウイルスへのクローニングは周知で
あり、従って、当業者はそのようなクローニングを達成するための数多くの方法
を知っている。発現ベクターを含有する宿主細胞の選択をすると思われる、一以上のレポータ
ー遺伝子又はマーカーに導入することにより、導入したＤＮＡをその染色体に安
定に融合させた細胞を選択することができる。レポーター遺伝子又はマーカーは
、宿主（通常の酵母栄養要求性マーカーであるleu2又はura3等）において栄養要
求性、殺生物耐性、例えば抗生物質、又は銅などの重金属に対する耐性等を補足
することができる。選択性マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直
接結合するか又は同時形質移入により同じ細胞に導入することができる。

【００４３】ｍＲＮＡの最適合成のためには、さらなる要素が必要であり得る。これらの要
素としては、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー及び
終止シグナルを含むことができる。そのような要素を導入するｃＤＮＡ発現ベク
ターとしては、Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983)等に記載されてい
るものがあげられる。別の態様において、導入した細胞は、レシピエント宿主細胞において自律増殖
できるプラスミド又はウイルス性ベクターに導入される。この目的のために、種
々のあらゆるベクターを使用することができる。特定のプラスミド又はウイルス
性ベクターを選択するのに重要な因子としては：ベクターを含有するレシピエン
ト細胞が認識されて、ベクターを含有しないレシピエント細胞から簡単に選択さ
れること；特定の宿主において所望されるベクターの複製の数；及び異なる種の
宿主細胞間でベクターを“シャトル”することができるのが望ましいか否か；が
あげられる。

【００４４】本発明はさらに、植物の核酸を操作して、発芽、器官脱離、細胞伸長、性決定
、花又は葉の老化、花の成熟、果実の成熟、昆虫、除草剤又は病原体耐性、又は
前記植物におけるストレスへの応答の制御、調節又は変更をさせることができる
方法を規定する。好ましい態様において、本発明の方法により、上述の応答を開
始させるか又は増強する一方、別の好ましい態様において本発明の方法により上
述の応答を阻害又は防げる。従って、本発明の方法により、銅輸送活性が防げられるか又は阻害される態様
を規定する。“防止（prevention）”により、エチレンシグナル経路における銅
輸送活性の休止を意味する。“阻害（inhibition）”により、銅輸送活性量、又
は、阻害剤なしで若しくは開示された阻害方法を適用せずに成長させた植物、植
物細胞、器官、花又は組織と比較して検出されるRAN1タンパク質量の統計学的に
有意な減少を意味する。阻害剤は、少なくとも２０％、より好ましくは少なくと
も５０％、さらに好ましくは少なくとも８０％銅輸送を減少させるのが好ましく
、また、投与量依存であるのが好ましい。いったんこれらの要求を満足する阻害
剤が確認されれば、銅輸送が阻害される方法を同定するためのアッセイ法を利用
するのが特に有用である。

【００４５】同様に、本発明の方法は、銅輸送活性量、又は、増強剤なしで若しくは開示さ
れた増強方法を適用せずに成長させた植物、植物細胞、器官、花又は組織と比較
して検出されるRAN1タンパク質量が統計学的に有意な増加を示す場合に、銅輸送
活性が開始され、刺激され、又は増強される方法も規定する。増強剤は、少なく
とも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも８
０％銅輸送を増加させるのが好ましく、また、投与量依存であるのが好ましい。
いったんこれらの要求を満足する増強剤が確認されれば、銅輸送が増強される方
法を同定するためのアッセイ法を利用するのが特に有用である。本発明はさらに、植物銅トランスポーター遺伝子のran1の一部又は全部に配向
するアンチセンスである核酸の単離物を特徴とする。アンチセンス核酸は、対象
の標的遺伝子の発現を阻害するよう、十分な長さであるべきである。その核酸の
実際の長さは、標的遺伝子及び該遺伝子内で標的化された領域に依存して変化す
ることができる。典型的には、そのような調製物の長さは、少なくとも約１５連
続ヌクレオチド、より典型的には、少なくとも５０又はそれ以上の連続ヌクレオ
チドである。

【００４６】本明細書において、核酸の配列は、発現される配列が、RAN1をコードしないが
、ran1遺伝子の非翻訳（non-coding）ＤＮＡ鎖に相補的であるか又は本質的に同
一であるとき、アンチセンスであると考えられる。“相補的”とは、２つの核酸
間、例えば２つのＤＮＡ分子間でのサブユニット相補性をいう。両分子における
ヌクレオチド部分が、通常は互いに塩基対形成できるヌクレオチドにより占めら
れているとき、核酸は、互いに相補的であるといわれる。従って、各分子の対応
する部分の相当数（少なくとも５０％）が、通常は互いに塩基対形成するヌクレ
オチド（例えば、Ａ：Ｔ及びＧ：Ｃヌクレオチド対）により占められているとき
、２つの核酸は相補的である。

【００４７】本発明のさらに別の観点において、エチレンシグナル伝達系の銅輸送ポリペプ
チドに対する抗体、好ましくは、その抗体が分子全体、Ｎ末端又はＣ末端、又は
その内部に特異的であるRAN1に対する抗体を提供する。そのような抗体を製造す
る方法は、当業界において周知である。抗体に機能的に等価な物を含む、植物RAN1ポリペプチドに特異的な抗体に対す
る態様において、用語“機能的等価物”は、抗体と同じ抗原決定基に特異的に結
合でき、それにより分子を中和することができるあらゆる分子、例えば、単鎖抗
原結合分子等の抗体様分子をいう。

【００４８】本発明はさらに、エチレンシグナル伝達系で銅を輸送することができる、単離
されたＤＮＡでコードされた植物銅トランスポーター又はそれらの活性断片を含
有するトランスジェニック植物を含む。例えば、発現するときに植物に能力を与
える、本発明の、ran1を添加することにより救出される酵母cccΔ導入遺伝子を
含有する遺伝子導入シロイヌナズナ植物がエチレンの存在を認識する場合、本来
の酵母遺伝子から検出される能力が少なくとも一つの例において提供される。本明細書において“トランスジェニック植物”は、種子、子孫等を含む、植物
、植物細胞、組織、花、器官等及びそこに導入された遺伝子を含み、その遺伝子
が操作されて組換えＤＮＡ技術により植物細胞に挿入された、植物のあらゆる部
分を意味する。操作された遺伝子は“導入遺伝子”と称する。本明細書において
、“非遺伝子導入”ではあるが、実質的に“野生型植物”にホモ接合性であるも
のは、そこからトランスジェニック植物が製造される非トランスジェニック植物
を意味する。遺伝子導入転写生成物はまた、上述したように、アンチセンス指向
にすることができる。

【００４９】エチレンシグナル経路の銅トランスポーターをコードするセンス又はアンチセ
ンスＤＮＡ、好ましくはRAN1を含有するトランスジェニック植物の生成は、植物
を、所望のＤＮＡ配列をコードするプラスミド、リポソーム又は他のベクターで
形質転換することにより達成することができる。上述したように、そのようなベ
クターとしては、強い構成プロモーター、例えば、35CaMV 35Sの調節下に置かれ
たか、又は誘導性プロモーターの下に置かれた、センス又はアンチセンス鎖を含
有する、無力にしたアグロバクテリア属腫瘍誘発（Ti）プロモーターがあげられ
るが、これに限定されない。そのような構成物、植物形質転換体の製法、及び植
物再生方法は、対象の遺伝子の配列が公知であるならば、当業界において周知で
あり、例えば、Ausubel et al., 1993, Current Protocols in Molecular Biolo
gy, Greene & Wiley, New York に記載されている。

【００５０】本発明により、本発明の範囲内に含まれる植物は、植物界の高等及び下等植物
のいずれも含む、ロゼット段階の植物を含む成熟した植物及び苗木は本発明の範
囲に含まれる。それ故、成熟した植物は、苗木以上のあらゆる成長段階にある植
物を含む。苗木は非常に若く、成長の初期の段階の未成熟の植物である。 RAN1遺伝子又はran1変異体を特徴とする表現型を有するトランスジェニック植
物はまた、本発明の範囲に含まれる。

【００５１】エチレンシグナル伝達系において銅トランスポーターにより影響される、本発
明の好ましい植物としては、栽培方法が既に完成している高収量の作物種（単子
葉植物及び双子葉植物、例えば、アルファルファ、カシュー、綿、ピーナツ、ソ
ラマメ、インゲンマメ、ヤエナリ、エンドウ、クルミ、トウモロコシ、ペチュニ
ア、ジャガイモ、テンサイ、タバコ、オート麦、小麦、大麦等を含む）、又は強
化固有（engineered endemic）種があげられるがこれらに限定されない。特に好
ましい植物としては以下のものがあげられる：セリ科植物、特にニンジン（Dauc
us）属（特にキャロッタ（carota）種、キャロット（carrot）種）及びエピウム
（Apium）属（特に強い臭いを放つドルチェ（graveolens dulce）種、セロリ種
）等；ナス科植物、特にトマト属、特にトマト（esculentum）種（トマト；toma
to）及びナス属、特にジャガイモ（ポテト）種及びナス（melongena）種等、及
びトウガラシ属、特にピーマン（コショウ）等；及びマメ科植物、特にダイズ属
、特にマックス（max）（ダイズ；soybean）種等；及びアブラナ（Cruciferae）
科植物、特にアブラナ属、特に、ハクサイ種（カブラ）、キャベツ栽培変種テイ
スタイ（Tastie）（キャベツ；cabbage）、キャベツ栽培変種スノーボールＹ（
カリフラワー）及びキャベツ栽培変種エンペラー（Emperor）（ブロッコリー）
等；キク（Compositae）科植物、特にラクチュカ（Lactuca）属、サティラ（sat
ira）種（レタス）、及びシロイヌナズナ属、特にサリアナ（thaliana）（シロ
イヌナズナ）等。これらの科の中で、より好ましいのは、葉状の野菜、例えば、
アブラナ科植物、特にシロイナズナ属、最も好ましくはサリアナ種である。

【００５２】特に好ましい植物としては、茎上での花の寿命（遅延器官脱離）が特に適切で
ある、バラ、カーネーション、キク等の花を咲かせる植物、特に、ゼラニウム等
の観葉顕花植物があげられる。さらなる好ましい植物としては、植物の葉柄の寿
命（遅延器官脱離）が特に適切である、フィクス、ヤシ等の緑の観葉植物があげ
られる。そのような植物の遅延開花はまた有利であり得る。同様に、他の好まし
い植物としては、ペクチン溶解性酵素が器官脱離過程に含まれる、バナナ及びオ
レンジ等の果実植物があげられる。本発明は、ストレスに供される植物に利益を与える。ストレスとしては、細菌
、ウイルス、真菌等の病原体の結果としての感染、及び加齢を含む状態、創傷治
癒及び土壌浸透があげられるが、これらに限定されない。細菌性感染としては、
Clavibacter michiganense（前Coynebacterium michiganense）、Pseudomonas s
olanacearum及びErwinia stewrtii、及び特に、Xanthomonas campestris（特に
病気のキャンペストリス（pathovars canpestris）及びベシカトリア（vesicato
ria））、Pseudomonas syringae（特に病気のトマト、マーキュリコーラ（macul
icola））があげられるが、これらに限定されない。

【００５３】細菌性感染に加えて、本発明の範囲内に含まれる植物ウイルス性及び真菌性病
原体の他の例としては、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイル
ス；Phytophthora infestans、Peronospora parasitica、Rhizoctonia solani、
Botrytis cinerea、Phoma lingam (Leptosphaeria maculans)及びAlbugo candid
aを含む真菌があげられるがこれらに限定されない。シロイナズナ科において、細胞内銅イオン輸送における他の工程がまた植物界
において保存され得ることを示す、酵母Atx1pの機能的等価体に十分に類似する
数種の発現された配列タグが確認されている（Himelblau et al., Plant Physio
l. 117: 1227-1234 (1998)）。これらの遺伝子のいずれでも変異は確認されてい
ないが、一以上のこれらのタンパク質はまた機能的エチレンレセプターを製造す
るのに役割を果たすことが期待されており、本発明の知見から当業者にはそのよ
うに理解されるであろう。本発明のRan^-/Ctr^-スクリーンを使用する変異体の連
続した単離により（特に、科を分離して致死変異の回復を可能にする）、本発明
に従って、機能的エチレンレセプターの構築に必要とされるさらなる遺伝子を同
定することが可能であろう。

【００５４】本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は添付の請求の
範囲を制限するように解釈すべきではない。実施例実施例１：強力なエチレンレセプターアンタゴニストに応答する変異体のスクリ
ーニング変異体単離用の親株として、シロイナズナ（Arabidopsis thaliana）生態型 C
olumbia（Col-0）を使用した。上述のGuzman and Ecker, 1990に記載されている
ようにして、種子のEMS（エチルメタンスルホネート）変異原性を行った。炭化
水素を含有しない空気、エチレン及びTCOにおける植物成長を、上述のKieber et
al., 1993に記載されているようにして行った。

【００５５】エチレン認識／シグナル伝達に必要な新規成分を同定するために、エチレン作
用のアンタゴニストへの曝露においてホルモン応答性表現型を示した変異体をス
クリーニングした。トランス−シクロオクテン（TCO）環状オレフィンは、in vi
tro及びin vivoでそのレセプターに結合するエチレンの強力な競争的阻害剤とし
て作用するため（上述のSisler, 1990；上述のSchaller et al.）、スクリーニ
ング用のエチレンアンタゴニストとしてトランス−シクロオクテンを選んだ。 EMSで変異誘発させた20の非依存性ロットの種子から選択した、30,000 M2-変
異誘発種子群をスクリーニングすることにより、TCOによる処理に応答して特徴
的な“エチレン”三重応答表現型を示したアンタゴニスト１に対する２つの非依
存性応答性（responsible-to-antagonist, ran1）変異体を得た。相補的な試験
により、これらの２つの変異体（ran1-1 及び ran1-2）は対立形質であることが
分かった（表１参照）。

【００５６】表１ ran1変異体の遺伝的解析 a: Ran^-はTCOで処理した場合にエチレン応答表現型を示す植物を指す。 B: Ein^-はエチレン応答表現型を示さない植物を指す。

【００５７】交雑はGuzman及びEcker, 1990(上述)に記載されるように行った。野生型植物
とran1-1またはran1-2との間のF1子孫は、TCO存在下で三重応答（triple respon
se）表現型を示さなかったが、自己受精F1植物からのF2子孫は1:3のran：野生型
植物を示した（表１参照）。これはran1が単一ローカス劣性変異体であることを
示した。

【００５８】実施例２： ran1変異体中におけるエチレンアンタゴニストによるエチレン応答
経路活性化既に示したように、TCO処理はエチレンを過剰生産する変異体であるeto1の三
重応答表現型の復帰を起こすが、しかしレセプターの下流のエチレンシグナル伝
達経路が本質的に活性化されている変異体のcnt1では起こさない。ran1変異体の
苗木はTCO存在下において三重応答様表現型を示すが、同じ応答は苗木を炭化水
素フリーの空気中で生育させた場合には見られない（図2A）

【００５９】苗木におけるエチレンアゴニスト存在下における突然変異効果 ran1-1及びran1-2において、TCOへの暴露は野生型苗木をエチレンにより処理
した場合と同様に苗木の生育において効果を示した（図2A）。胚軸及び根の長さ
の測定によりこれらの観察が確認された。TCO存在下において、ran1-1及びran1-
2の苗木における胚軸の長さは、それぞれ3.8±0.7mm及び4.3±0.5mmであった。
エチレン処理野生型苗木において、胚軸の長さは、4.2±0.4mmであった。同様に
TCO-処理によりran1苗木の根の生育が阻害された。しかし、ran1変異体における
長さ（ran1-1; 1.9±0.6mm, ran1-2; 2.4±0.4mm）はエチレン中の野生型(1.2±
0.2mm)のものより若干長かった。胚軸のフック(hook)の曲率もまた野生型及び変異体の苗木で測定した。エチレ
ン中では、野生型苗木の胚軸のフックの角度（250±49.2）は、TCO処理ran1変異
体において観察されたもの（ran1-1; 250±23.7, ran1-2; 253±23.8）と区別が
つかず、さらにTCOがran1におけるエチレンシグナル伝達経路を活性化すること
を示している。

【００６０】 ran1変異体における効果に対し、野生型苗木のTCO処理は、炭化水素フリー空
気中における生育と比較して胚軸及び根の生育における増進を起こした(図2A)。
これらの結果は、基底レベルのエチレン生合成／認知（perception）の阻害は苗
木の最大の伸長を起こすという以前の知見と一致する（Guzman及びEcker, 1990,
上述）。エチレン活性を阻害する他の化合物（例えば銀イオンまたは1-メチルシクロプ
ロパン(MCP)(Sisler et al., Plant Growth Regul. 18:79-86(1996))は、ran1変
異体の三重応答を誘導しない。野生型植物におけるように、これらの化合物はra
n1変異体のエチレンへの応答性を阻害したが、これはran1表現型がTCO特異性で
あったことを示している。ran1変異体における苗木の三重応答の誘導は立体特異
的であった。シスではなくトランスのシクロオクテンがこの形態学的な形質転換
の誘起において効果的であった。さらに、Arabidopsisの苗木の生合成における
強力なエチレン阻害剤であるAVG（アミノエトキシビニルグリシン）存在下にお
けるran1苗木のTCOによる処理はran1変異体表現型には影響が無かった（Guzman
and Ecker, 1990，上述）(図2A)。これは苗木表現型がTCOエチレンアンタゴニス
トへの応答の特質であることを示しており、かつエチレン生合成における増進に
よるものではないことを示している。三重応答の誘導はran1植物において異なるエチレン投与量で試験された。しか
し、変異体と野生型植物の間に重大な差異はなく、これはran1変異体が正常なエ
チレンの認知を変化したものではないことを示している。炭化水素フリー空気中
で生育させた場合、ran1-2苗木の表現型は野生型の表現型と同じであった（図2A
）。しかし、ran1-1の根の長さは野生型苗木において観察されたものより若干短
かった。これらの系統は広範囲に戻し交配を行ったが、ran1-1の短い根の表現型
はRAN1ローカスの近くでの突然変異により起こされたものであることが可能であ
る。しかし、ran1-2はこの表現型を示さなかったので、この効果は対立遺伝子特
異的であったと結論付けられた。ran1-1またはran1-2の苗木または成熟植物にお
いて他の重大な生育表現型は見られなかった。

【００６１】成熟植物におけるエチレンアゴニスト存在下における突然変異効果成熟植物の分析のために、苗木をMS媒体（Mirashugi及びSkoog媒体）を含む寒
天プレートから土壌へ移すか、またはこれらは土壌から直接発芽させて、若いロ
ゼット病の植物（第二の真正の葉が出てきた後）を５リットル容器中の炭化水素
フリー空気またはTCOに12日間暴露した。容器には毎日炭化水素フリー空気と新
鮮なTCOを供給し、エチレン活性の阻害剤であるCO₂の蓄積を低減させた。 TCOの植物性生育における効果を試験するために、若いロゼット病の植物をTCO
に暴露させた。ran1-1及びran1-2の変異体の葉のサイズは野生型のものと比較し
て非常に小さいことが観察された（図2Aと図2Bとを比較）。TCO処理ran1変異体
における観察された葉の形及び葉柄の長さは、crt1-1の形態を表現型模写し、植
物生育におけるエチレン効果の特徴を示していた（Chao et al., 1997, 上述）
。野生型植物の葉のサイズはまたTCOの処理により若干縮小していた(図2B)。し
かし、この効果は高レベルのTCOの処理により引き起こされる毒性によるものと
考えられた。というのは同様なサイズ縮小がまた構成的エチレンシグナル伝達変
異体ctr1-1植物においても観察されたからである。野生型及びran1植物の葉の表
皮細胞の顕微鏡的観察は、TCO処理ran1の葉のサイズにおける全ての縮小が細胞
伸長における減少に依るものであることを示した。従って、ran1変異体及びRAN
１遺伝子発現生成物は、苗木の生育のみではなく、成熟植物の生育においても影
響することが示された。そしてran1変異体においてエチレンレセプターが変化し
たかまたはリガンド特異性が弛緩したことが結論付られた。

【００６２】エチレン誘導遺伝子におけるエチレンアゴニストの効果エチレンアンタゴニストのran1植物への分子レベルにおける効果を測定するた
めに、幾つかの周知のエチレン誘導可能な遺伝子をTCO処理し、試験した。EI305
(Chao et al., 1997, 上述)及びGST2(Itzhaki et al., Plant Mol. Biol. 22:43
-58 (1993))の発現をノーザンブロット解析により、エチレンまたはTCOにより処
理した苗木の全RNAを用いて試験した(図3A)。野生型植物において予想されたよ
うに、これらの二種のホルモン応答遺伝子に対するmRNAレベルの定常状態は、エ
チレンの処理により上昇し、TCO処理により基底レベルより低下した。TCOに対す
る暴露はeto1-5におけるEI305及びGST2の発現を顕著に低下させたが、一方ctr1-
1変異体におけるその発現は影響を受けなかった(図3A)。これはTCOがエチレン活
性の阻害剤として作用することを確認するものである。野生型苗木において観察されたのと同様に、ran1変異体において、EI305及びG
ST2mRNAの定常状態はTCOにより阻害されなかった。事実、ran1植物における苗木
の形態へのアゴニスト様効果と一致して、TCOは二つの遺伝子の定常状態mRNAレ
ベルの若干の（しかし再現可能）上昇を起こした(図3A)。

【００６３】後期発達におけるアゴニスト応答への突然変異効果後期発達におけるran1突然変異のTCO応答性への効果もまた測定した。塩基性
キチナーゼ（CHIB）遺伝子発現は、成熟Arabidopsis植物においてエチレンによ
り上方制御し（Samac et al., Plant Physiol. 93; 907-914 (1990)）、無処置
エチレンシグナル伝達経路依存性（Chen and Bleecker, Plant Physiol. 108: 5
97-607(1995)）であることが知られている。ノーザンブロット解析は、ran1変異体においてロゼット病の植物のTCOへの暴
露によりCHIB遺伝子発現が誘導されることを示した(図3B)。これらの結果を総合
すると、ran1苗木及び成熟植物においてTCOは、応答の形態学的及び分子的観点
の両方においてエチレンを模倣していることが示された。エチレン誘導可能な遺伝子の発現をさらにロゼット病植物において試験した。
塩基性キチナーゼ遺伝子（CHIB）及びデフェンシン遺伝子(PDF1.2)の一つはエチ
レン処理により誘導されることが知られている（Samac et al., 1990, 上述; Pe
nninckx et al., 1996, 上述）。しかし、ノーザンブロット解析はこれらの遺伝
子の発現がran1ロゼット病植物においてTCO処理により1日で誘導されたことを示
した(図3B)。これはさらに、TCOがran1変異体の苗木及び成熟植物の双方におい
てエチレンシグナル伝達経路を活性化することを確認するものである。

【００６４】実施例３：RAN1のエチレンガスシグナル伝達経路における早期作用 RAN1がエチレンシグナル伝達経路のどの部分において作用するかを測定するた
めに、上位性分析をran1及びエチレン非感受性変異体etr1及びein2を用いて行っ
た。TCO存在下において、自己受精etr1-1/+、ran1-1/+またはein2-12/+、ran1-1
/+のF1植物からのF2子孫は1Ran^-：15野生型植物の比の表現型分離を示した。一
方、エチレン中においてein:野生型に分離したF2子孫は、3Ein^-：1野生型植物の
比を示した。etr1-1は優性（Bleecker et al., 1988, 上述）でありein2-12は半
優性（J.M. Alonzo and J.R. Ecker, 未発表の結果）であることから、etr1-1及
びein2-12がran1変異体表現型をマスクしたことが明らかになった。 ran1-1のPCRベースの対立遺伝子アッセイを用いて、ホモ接合体ran1変異体を
、ran1-1のetr1-1及びein2-12への交配由来のF2子孫から単離した。Ran1-1、etr
1-1及びran1-1 ein2-12二重変異体の両方の表現型は、Ein^-、Ran⁺であり、これ
はetr1及びein2がran1に対して上位にあることを確認するものである。ETR1はエ
チレンレセプターをコードするものであるから、これらの遺伝子的知見はRAN1機
能がホルモンシグナル伝達経路の非常に早期において必要とされるものであるこ
とを示した。さらに、etr1-1及びein2-12は明らかにエチレン非感受性であり、これはさら
にTCO処理がran1変異体のエチレンシグナル伝達経路を活性化するという結論を
支持する。ran1-1の突然変異部位を決定した後、ran1-1×etr1-1及びran1-1×ei
n2-12の交配の双方からのF2子孫におけるein苗木において、幾つかのran1-1ホモ
接合体を見出すことにより分子レベルでこれらの結果を確認することができる。

【００６５】実施例４：RAN1遺伝子は銅輸送p-型ATPアーゼをコードする ran1-1変異体遺伝子は、W13及びW100系統（Arabidopsis Biological Resource
Center、オハイオ州立大学）と交配することにより可視マーカーを遺伝子上に
位置づけ、ran1及びttg、yi、tt3マーカーの分離を試験した。SSLPマーカー類で
ある、Ath109及びnga129を用いた（Bell and Ecker, Genomics 19:137-144(1994
)）。新規に合成したSSLP類、（単純な配列長の多形の）smMLN1及びsmMCL19、切
断−増幅した多形配列（CAPS）CIC4E12R及び誘導された切断-増幅多形配列（dCA
PS）CIC2A12Lをran1-1のマッピングに使用した。マーカー分析ベースのPCR（ポリメラーゼ鎖反応）のためのDNA試料を、CTAB(c
etrimethyl-amonimumbromide)法により単離した。簡単に述べると、各F2子孫か
らの3〜4の若い葉を液体窒素中で凍結させ、Capimix（ESPE, America,Inc., USA
）中でガラスビーズを用いて強力に振とうしながらすりつぶした。500リットル
のCTAB溶液（100mMトリス−HCl、pH8.0、20mM EDTA、ｐH8.0、1.4M NaCl、3%w/v
CTAB）を添加し、次に65℃で30分間加熱した。フェノール／クロロホルム抽出を
した後、核酸を等容量のイソプロパノールを加えて沈殿させ、100μLのTEバッフ
ァー（10mMトリス-HCl、1mM EDTA、pH8.0）中に再懸濁した。Rnaseを10g/Lの濃
度まで添加し、試料を37℃で30分間インキュベートし、フェノール／クロロホル
ム抽出とエタノールにより沈殿させた。沈殿した核酸を50μLのTEバッファーに
再懸濁した。PCR反応(10mMトリス-HCl pH9.0、50mM KCl、2.5mM MgCl₂、0.2mM d
NTPs、5pM各プライマー、0.1%トリトンX-100、1μLの核酸試料、Taqポリメラー
ゼ、全容量15μL)を94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で30秒間を35サイクル通
して行った。野生型及びran1変異体のRAN1遺伝子の核酸配列を決定するために、プライマー
ウォーキングにより全遺伝子の配列決定が可能な合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを作製した（20-25bp、＞50% GC）。ゲノムDNAを、野生型植物、ran1-1及び
ran1-2変異体の葉から調製した。合成プライマーを使用して、４つのオーバーラ
ップするDNA断片をPCRにより増幅して、アガロースゲル電気泳動による精製後、
配列決定した。PCRによる誤りを避けるために、４より多い独立PCR試料を混合し
、バッチ配列決定した。遺伝子マーカー生成に用いた合成オリゴヌクレオチド（5'-3'方向）を以下に
示す：

【００６６】

【化１】

【００６７】 CAPSプライマーを用いて生成させた増幅DNAを、MboII消化を行った。一方、dC
APSプライマーを用いて生成させた増幅DNAはXmn1消化を行った。上位性分析のために、ran1変異体をetr1-1及びein2-12と交配し、各F1植物の
子孫を集めた。F2の種はACC(1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸)またはTCO
存在下において出芽させ、次にACC存在下のEin-苗木及びTCO中のRan^-苗木を計測
した。ran1-1対立遺伝子は、PCR断片をBsrIにより消化することにより野生型か
ら区別される（ran1-1突然変異はBsrI制限部位を脱離させるからである)。ran1-
1、etr1-1及びran1-1、ein2-12二重変異体は、ran1-1多形を用いて、ran1-1×et
r1-1及びran1-1×ein2-12の交配の両方からのF2子孫のEin^-苗木におけるran1-1
ホモ接合体を単離することにより、分子レベルにおいて確認された。

【００６８】ran1の染色体の精細マッピング ran1-1変異体はクロモソーム5上のtt3遺伝子に近接して位置づけられ、次に精
細なマッピングをSSLPマーカーを用いて行った。ran1-1及びランズベルグ株(Lan
dsberg Strain)(Ler)の交配から誘導される2018組換え染色体の分析をベースと
して、ran1の位置をCRA1ローカスに近い範囲に狭めた(図4)。LerはArabidopsis
Biological Resource Center（オハイオ州立大学）から入手した。さらなるPCR-ベースの遺伝子マーカー(smMLN1及びsmMCP)の開発及びこれらのB
ACコンティグのアセンブリにおけるその使用により、ran1をsmMLN1から1.8cMとs
mMCP19から2.6cMの間隔に位置づけた(図4)。さらにran1の位置を詳細にするため
に、CAPSマーカーであるCIC2A12(Konieczny et al., Plant J.4:403-410(1993))
をYAC(酵母人工染色体)CIC4E12の右末端から発生させ、dCAPS配列である、CIC2A
12(Michaels et al., Plant J. 14:381-385(1998); Neff et al., Plant J. 14:
387-392(1998))をYACCIC2Aの左末端から発生させた。二つの遺伝子マーカーを用
いて、幾つかの付随のBACクローンを単離し、RAN1遺伝子を含む、約160kdの橋か
けをしているBACコンティグを構築した（図4）。 BAC中で、染色体位置が未決定の一つのクローン（T19K24; GenBank受託番号AC
002342）を完全に配列決定し、及び遺伝子モデルの数を予測した。BAC末端に近
い配列から誘導された二つのSSLPマーカー(T19K24-1及びT19K24-4)を使用して組
換え事象を同定することにより、BACクローン上のRAN1の位置を確認した（図4）
。BAC T19K24のRAN1領域における多数の予測オープンリーディングフレームから
選択することにより、銅輸送p-型ATPアーゼに類似の予測タンパク質がまた同定
された。エチレンのレセプターへの結合は遷移金属の存在が必要であることが予
想されていたため、この遺伝子はRAN1の候補として選択された。

【００６９】ran1のゲノム配列 ran1-1及びran1-2並びに親株（Col）におけるゲノムDNAの配列決定を行った。
単一塩基変化は両方のran1対立遺伝子において同定され（下記参照）、これは個
の遺伝子が実際にRAN1であることを確かにした(図5)。RAN1のゲノム配列をGenBa
nkに、受託番号#AF091112として記録し、本明細書において配列番号1(SEQ ID NO
:1)として記載する。

【００７０】ran1のcDNA配列及び推定アミノ酸配列上述したPCR断片を用いて、cDNAライブラリーをスクリーニングし、幾つかのc
DNAを単離した。完全RAN1コード領域を含む一つのcDNA(pNH633)を、配列分析に
かけた。第二のRAN1cDNAの5'から3'末端の配列決定を行い、開始及び停止コドン
の位置を確認した。全RNA抽出及びノーザン分析を記載されているように行った
（Kieber et al., 1993, 上述）。幾つかのcDNAクローンを、エチレン処理黄化(etiolated)苗木ライブラリーか
ら単離した。最も長いcDNAのヌクレオチド配列の決定及びゲノム配列との比較か
ら、候補RAN1遺伝子が9のエクソン及び8のイントロンを有することが明らかとな
り（図5）、これはコンピューター予測遺伝子モデルとは異なっていた。RAN1のc
DNA配列はGenBankに受託番号#AF082565として記録し、本明細書において配列番
号2(SEQ ID NO:2)として記載する。RAN1cDNAの発現配列(エクソン)から推定され
たRAN1のアミノ酸配列は1001アミノ酸残基からなるポリペプチドであり、これは
本明細書において配列番号3(SEQ ID NO:3)として記載する。

【００７１】RAN1のアミノ酸配列と他の既知銅トランスポーターとの比較 RAN１のアミノ酸配列を、ヒト（受託番号#Menkes Q04656; Wilson P35670）、
C.elegans(受託番号#D83665)及び出芽酵母（受託番号#P38995）由来の、他の銅
輸送p-型ATPアーゼと整列させた。これらのタンパク質は後ゴルジコンパートメ
ント(post-Golgi compartment)に位置し、ここでこれらは分泌経路へ銅イオンを
輸送し、機能性のために金属を必要とする分泌または膜結合タンパク質に銅を運
ぶ機能を果たしている(Petris et al., EMBO J. 15:6084-6095(1996); Yamaguch
i et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14030-14035(1996); Yuan et al.,
J. Biol. Chem. 272:25787-25793(1997))。

【００７２】ポリペプチドの重要な部分が、推定金属結合モチーフ及び予測機能ドメインが
決定される程度にまで同一かつ保存変化を有することが見出された；特に、ヒト
メンケス病（Menkes disease）遺伝子生成物、ATP7A（Chelly et al., Nature G
enetics 3: 14-19(1993)）; Mercer et al., Natuer Genetics 3: 20-25(1993);
Vulpe et al., Nature Genetics 3: 7-13(1993))、ヒトウィルソン病（Wilson
disease）遺伝子生成物、ATP7B(Bull et al., Natuer Genetics 5: 327-337(199
3); Chelly and Monaco, Natuer Genetics 5: 317-319(1993); Petrukhin et al
., Natuer Genetics 5: 338-343(1993)、線虫銅トランスポーター（Sambongi et
al., J. of Biochem. (Tokyo) 121:1169-1175(1997)）及び酵母Ccc2p(Fu et al
., Yeast 11:283-292(1995); Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:26
32-2636(1995))。これらのタンパク質は以下の幾つかの構造的特徴を同じにする
;1)アミノ末端金属結合モチーフ、2)ホスファターゼドメイン、3)形質導入ドメ
イン、4)リン酸化ドメイン、及び5)ATP結合ドメイン。RAN1タンパク質は、RAN1
及び他の銅トランスポーターの間の高い類似性の領域に、全てのこれらの特徴を
有している。

【００７３】興味深いことに、RAN1及びCcc2pは、そのN末端領域に推定金属結合モチーフを
２つののみしか有していないが、メンケス及びウィルソンタンパク質は、６つ有
しており、また予想された線虫遺伝子は３つのモチーフを有する。これらの遺伝
子のように、候補RAN1タンパク質は８つの推定膜−橋かけ領域を有している。 ran1-1変異体対立遺伝子において、CからTへの移行がヌクレオチド1880（最初
のATGコドンのA(番号1)を有するゲノム配列に相当）においてみられた。この塩
基変化は、アミノ酸のThr497からIleへの変化を起こした。スレオニン497はホス
ファターゼ領域に位置し、この残基は全ての銅トランスポーターにおいて保存さ
れている（図5A）。これはran1-1においてみられるアミノ酸変化がRAN1機能を低
下させることを示唆している。

【００７４】 ran1-2において、GからAへの塩基変化はヌクレオチド637においてみられ、Gly
173をGluに変化させた。グリシン173は銅トランスポーター間では高度に保存さ
れていないが、銅トランスポーターの金属結合の反復中の相当する残基はアミノ
酸残基を変更しない（not charged）(図5B)。メンケスタンパク質の第4の金属結
合反復の最近の三次元分析により、RAN1のGly173に相当する残基が、金属結合ル
ープの正しい位置付けに必要な疎水性核に寄与することが示された（Gitschier
et al., Nature Structural Biology 5:47-54(1998)）。このように、GlyからGl
uへの変化は電荷及び疎水性において劇的な変化を与え、恐らく、銅トランスポ
ーター機能に必要な金属結合ドメインの構造を妨害している（Payne et al., J.
Biol. Chem. 273:3765-3770(1998)）。しかし、２つの突然変異のいずれも、RAN1遺伝子の発現に、少なくとも転写レ
ベルでの影響は与えない。なぜなら、RAN1のmRNAは両方の変位株において、野生
型での検出と同程度に検出されているからである。

【００７５】実施例５：RAN1 cDNAの発現による、酵母ccc2破壊変異体のFet3p欠乏性表現型か
らの復帰（resucue）既知銅トランスポーターへの広範囲の類似性のため、RAN1は銅輸送活性を有す
ることが予測された。この仮説を確認するため、酵母相補性分析を、出芽酵母cc
c2破壊（ccc2Δ）変異体を用いて行った。出芽酵母において、ccc2pは分泌経路のルーメンからサイトゾルへ銅イオンを
運ぶ（Yuan et al., 1995, 上述）。複数−銅オキシダーゼ、Fet3pの銅結合ドメ
インを、（Fet3pオキシダーゼ活性に必要である）銅により荷重した。従って、F
et3pのオキシダーゼ活性はインビボアッセイにおいて銅トランスポーター活性の
ベースを提供する。しかし、ccc2^-欠損は他の種由来の相同性の銅トランスポー
ターにより回復することができる（Hung et al., J. Biol. Chem. 272:21461-21
466(1977); Payne et al., 1998, 上述; Sambongi et al., 1997, 上述）。従っ
て、RAN1がFet3pオキシダーゼのccc2欠損を阻害することができることを確認す
るために、組換えプラスミドを構築し、RAN1cDNAを構成的PGK1プロモーターのコ
ントロール下に置いた。以下のものを酵母相補性分析に使用した：2908(株 7)[MAT(α), his3-200, Le
u2, trp1-101, ura3-52, ade5]及びccc2(Δ)（株8）[MAT(α), his3-200, trp1-
101, ura3-52, ade5, ccc2::LEU2]。Ran1-1突然変異を含むプラスミドの構築の
ため、二種類のプライマーをデザインした：

【００７６】

【化２】

【００７７】下線を施したTはran1-1突然変異に相当する。イタリック体は導入されたNcoI
制限部位を意味する。これらの二つのプライマー及びヌクレオチド2632-2608(#20)及びヌクレオチド
934-958(#7)に相当する二つのプライマーを用いて、二つの断片をクローン化し
たRAN1のcDNAをテンプレートとして用いてPCRにより増幅した。ran1-1a-#20 PCR
断片をNcoI及びBspEIで消化し、一方、ran1-1b-#7 PCR断片をNcoI及びStuIで消
化した。StuIからBspEI部位のcDNA領域を、ran1-1a-#20及びran1-1b-#7 PCR断片
と交換した。 Ran1-2突然変異を含むプラスミドを構築するために、二つのプライマーをデザ
インした。

【００７８】

【化３】

【００７９】下線を施したAはran1-2突然変異に相当する。イタリック体は導入されたSalI
制限部位を意味する。これらの二つのプライマー並びにヌクレオチド1439-1416(#18)に相当する他の
プライマー及びpBluescriptの配列のためのT7プライマーを用いて、二つの断片
をクローン化したRAN1のcDNAをテンプレートとして用いてPCRにより増幅した。r
an1-2a-#18 PCR断片をSalI及びStuIで消化し、一方、ran1-1b-T7 PCR断片をSalI
及びClaIで消化した。ClaIからStuI領域を、ran1-2a-#18及びran1-2b-T7 PCR断
片と交換した。野生型及び変異体RAN1のcDNAはpYES3（PGKプロモーター）中に導
入した。酵母の様々なプラスミドによる形質転換を酢酸リチウム法（Ito et al.
, J. Bacteriol. 153: 163-168(1983)）を用いて行った。

【００８０】酵母細胞をYPD（酵母、ペプトン及びデキストロース）媒体中で30℃にて、0.3
OD600の密度になるまで生育させた。細胞を遠心分離により収穫し、氷冷抽出バ
ッファー(25 mMトリスpH7.5, 100 mM NaCl, 1 mMフェニルメチルスルホニルフル
オリド, 10 mMロイペプチン, 10 mMアンチパイン)により洗浄した。酵母細胞を
抽出バッファー中でガラスビーズと混合することによりホモジナイズした。大き
な粒子を除去した後、ホモジネートを4℃で20分間遠心分離（20,000×g）した。
ペレットを抽出バッファーで洗浄し、1%トリトンX-100を含む同じバッファー中
に再懸濁し、再び遠心分離を行って不溶物質を沈殿させた。タンパク質試料(25
mg)を同容量のSDS pageバッファー（100 mM燐酸ナトリウム、pH7.2; 0.5% SDS;
10%(w/v)グリセロール）と混合し、前加熱をすること無くSDS/PAGEにより分離し
た。

【００８１】電気泳動後、ゲルを10%グリセロール中0.005%トリトンX-100により平衡化し、
3 mM p-フェニレンジアミン二塩酸塩（シグマ）、100 mM酢酸ナトリウム、pH5.8
, 1 mM NaN₃中に浸漬した。ゲルを暗所中室温で風乾した。酵母中のRAN1タンパ
ク質を検出するために、HA-tag配列の三重応答をRAN1、ran1-1及びran1-2cDNA中
に、停止コドンのすぐ前に導入した。ウェスターンブロット分析をモノクローナ
ル抗-HA抗体を用いて行った。Ccc2Δ株の形質転換体（プラスミドDNAがRAN1cDNA
を含む）は、検出可能なFet3pオキシダーゼ活性を有することが見出されたが、
活性は野生型のものに比べて若干低かった。比較すると、ベクタープラスミドDN
Aのみにより形質転換された同じ株はそのような活性を有していなかった（図6A
）。

【００８２】加えて、銅トランスポーター活性は酵母細胞の鉄取り込みをモニターすること
により測定することができる。というのはFet3pは出芽酵母において高親和性鉄
取り込みの中枢的役割を有しているからである（Stearman et al., Science 271
:1552-1557(1996)）。鉄取り込みアッセイは、Dancis et al., J. Biol. Chem.
259:25660-25667(1994)に記載される方法のように行った。形質転換酵母株から
の細胞は、マイクロタイタープレートのウェル中の100μLのYPD中へ接種し、30
℃で生育させた。14時間インキュベーションした後、細胞を新鮮な50μL容量のY
PD媒体中へ1:5の割合で希釈した。さらに2時間インキュベートした後、⁵⁵Fe放射
性核種(Amersham 37-50 mCi/mg 鉄)を50μLのクエン酸バッファー中へ添加した
。取り込みを2時間行い、その時点の細胞数を混濁度（OD720）を測定することに
より決定した。細胞を次にガラスファイバーフィルター上に集め、水で洗浄した
。フィルターをベックマンシンチレーションカウンターで計測し、細胞関連放射
活性を計算した。放射性核種の製造のため、⁵⁵Feをアスコルビン酸ナトリウムに
より還元し、クエン酸バッファー（50mMクエン酸ナトリウム、pH6.5、グルコー
ス5%）中2μMの濃度まで希釈した。鉄調製品は次にマイクロタイターウェルへ添
加した。

【００８３】 Ccc2機能無しで、酵母細胞の鉄取り込みは減少することが見出された。RAN1cD
NAを発現するccc2Δ細胞において、高親和性鉄取り込みは、空のベクターのみを
含む負コントロール細胞に比して回復した(図6B)。これはRAN1が銅輸送活性を有
することを示している。 Ran1変異体遺伝子生成物が低下した活性を有することを確認するために、ran1
-1突然変異及びran1-2突然変異をそれぞれ野生型RAN1cDNA中に導入した。次に、
ccc2Δをこれらの変異体cDNAを含むプラスミドにより形質転換した。ran1変異体
cDNAをを含むccc2Δ形質転換体はFet3pオキシダーゼ活性及び高親和性鉄取り込
み活性を、RAN1と比較して顕著に低下させたが、ran1-1及びran1-2の両方の欠損
は銅輸送活性を損うことが見出された。ran1-2cDNAを含む形質転換体がまた低下
した活性を示すのに対し、Fet3pオキシダーゼ活性及び鉄取り込み活性のレベル
が、ran1-1を発現する形質転換において観察されるものより高かった。ウェスタ
ーンブロット分析から、RAN1、ran1-2及びran1-2タンパク質が酵母に同レベルま
で蓄積したことが分かった。

【００８４】ｒａｎ１−２のやや大きな活性についての１つの説明は、唯一の単一機能性金
属結合モチーフを含むＲＡＮ１において、十分な銅輸送活性が酵母には存在する
が、植物細胞には存在しないということであろう。既に示したように、単一の結
合モチーフのみを含むウィルソンタンパク質の発現は、酵母ｃｃｃ２欠失変異体
の機能的補完にとって十分であった（Iida等, FEBS Letts 428:281-285）。

【００８５】実施例６：銅イオンの存在はｒａｎ１植物のエチレン表現形を抑制する銅イオンの培地への添加は、ｃｃｃ２破壊変異体のＦｅｔ３ｐ活性の欠損を抑
制する（Fu等, 1995, 前出, Yuan等, 1995, 前出）。ＲＡＮ１はＣｃｃ２相同体
をコードするので、酵母ｃｃｃ２変異体への影響と類似して、銅イオンの植物の
培養培地への添加によりｒａｎ１表現型を抑制することができるか否かを決定す
ることは重要であった。結果として、種々の濃度のＣｕＳＯ₄（０．１μＭ〜１
００μＭ）を培養培地に添加してシロイヌナズナの苗木の生育（germination）
及び生長（growth）に対する影響を評価した。１μＭ以下の濃度において、Ｃｕ
ＳＯ₄は明らかな影響を有しなかった。しかしながら、対照的に、５０〜１００
μＭのＣｕＳＯ₄は生育を有意に阻害した。興味深いことに、１０〜１５μＭという中間的な濃度のＣｕＳＯ₄は生育及び
苗木の生長に対し明らかな影響を及ぼさなかったが、ｒａｎ１−１及びｒａｎ１
−２の両方のｒａｎ１表現型を部分的に抑制した（図７）。詳細には、三重応答
表現型の不足により明らかにされるように、銅補充培地はｒａｎ１苗木がＴＣＯ
に応答することを妨げた。しかしながら、この濃度のＣｕＳＯ₄は、ｅｔｏ１−
５又はｃｔｒ１−１の三重応答表現型のＴＣＯ媒介阻害に干渉しなかった（図７
）。したがって、ＣｕＳＯ₄自体は三重応答表現型又は下流のエチレンシグナル
伝達経路に影響しないらしい。Ｆｅｔ３ｐも高親和性鉄取り込みに関連する。ヒトＦｅｔ３ｐ相同体であるセ
ルロプラスミンは、ヒト細胞において鉄代謝に関連しており、その活性はメンケ
ス／ウィルソンタンパク質の適切な機能に依存している。したがって、ｒａｎ１
表現型がシロイヌナズナの高親和性鉄取り込みの欠失により引き起こされる可能
性を評価するために、鉄を植物培地に添加して、ｒａｎ１表現型がＴＣＯにおい
て抑制されるか否かを決定した。いくつかの濃度の鉄硫酸アンモニウム（３０μ
Ｍ〜１ｍＭ）及びＦｅＥＤＴＡ（１μＭ〜１ｍＭ）を苗木の培地に添加した。Ｔ
ＣＯの存在下ではｒａｎ１に対する影響は検出することができなかった。それゆ
え、ｒａｎ１変異体は銅代謝の欠損により引き起こされるが、その表現型は鉄代
謝における類似の欠損とは関連しないと結論づけた。

【００８６】実施例７：ＲＡＮ１トランスジェニック植物におけるエチレン応答の構成的活性
化ＲＡＮ１の機能を更に探求するために、異所性遺伝子発現の苗木の発達／ホル
モン応答性に対する影響を試験した。植物を形質転換するために、ＲＡＮ１のｃ
ＤＮＡを、ｐＲＯＫ２ベクタープラスミド（Baulocombe等, Nature 321:446-449
(1986)）のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ター
ミネーター配列との間に挿入して、プラスミドｐＮＨ６３４を得た。次いで、完
全長のＲＡＮ１ｃＤＮＡを含むｐＮＨ６３４をアグロバクテリウムＣ５８株に
導入し、得られた株を使用して、減圧浸潤（vacuum infiltration）法により、
ｒａｎ１−１、ｒａｎ１−２及び野生型植物を形質転換した（Bechtold等, CR A
cad. Science (Paris) 316:1194-1199 (1993)）。興味深いことに、異なる遺伝的バックグラウンドからは独立した、２つの異な
る表現型クラスを有する形質転換体が観察された。全Ｔ１世代のトランスジェニ
ック系の約半分が構成的エチレン応答を示した（クラス１、Ｃｔｒ^-）が、他の
半分の形質転換体は明らかな生長表現型を示さなかった（クラス２、Ｃｔｒ⁺）
（図８Ａ）。ＴＣＯで処理したとき、クラス２形質転換体はもはやアンタゴニス
トに応答することができなかった。このことは、導入した３５Ｓ：ＲＡＮ１導入
遺伝子はｒａｎ１変異を補完したことを示している。ノーザンブロット分析は、
クラス２トランスジェニック植物は高レベルのＲＡＮ１ｍＲＮＡを発現してい
ることを明らかにした（図８Ｂ、上部パネル）。対照的に、強力な構成的エチレ
ン応答（Ｃｔｒ^-）表現型を示す植物において見いだされるＲＡＮ１ｍＲＮＡ
レベルは非常に減少した（図８Ｂ、上部パネル）。内在性ＲＡＮ１遺伝子の同時
抑制による効果であろう。ＲＡＮ１トランスジェニック植物において観察される激しいＣｔｒ^-表現型は
、エチレンシグナル伝達経路の活性化が起こっていることを示唆した。この仮説
を検討するために、エチレン応答性の塩基性キチナーゼ（ＣＨＩＢ）遺伝子の発
現を、３５Ｓ：：ＲＡＮ１形質転換植物（クラス１及びクラス２）において調べ
た。Ｃｔｒ^-表現型（クラス１）を示した植物由来のｍＲＮＡのノーザンブロッ
ト分析は、塩基性キチナーゼの発現レベルが未形質転換植物における発現と比較
して有意に上昇したことを明らかにした（図７Ｂ、下部パネル）。比較すると、
表現型的に野生型の植物（クラス２）は、塩基性キチナーゼｍＲＮＡの基底レベ
ルの発現のみを示した。これらの結果により、クラス１ＣａＭＶ３５Ｓ：ＲＡ
Ｎ１トランスジェニック系において、減少したＲＡＮ１発現、Ｃｔｒ^-表現型及
びエチレン応答性遺伝子発現の活性化の関連性を確認した。

【００８７】すべての系が完全に不妊性であることにより更なる遺伝的特徴付けを行うこと
ができなかったので、３５Ｓ：：ＲＡＮ１導入遺伝子について分離したクラス２
植物の次世代を研究した。２４の独立した形質転換体に由来するＴ２世代植物を
自己繁殖させ、子孫をエチレン表現型について調べた。２つの３５Ｓ：：ＲＡＮ
１系に由来する苗木（Ｌ３及びＬ６）は、炭化水素を含まない空気中で生長した
とき、ｃｔｒ１変異体と同一の構成的三重応答表現型を示した（図８Ｃ）。更に、Ｌ３及びＬ６苗木のエチレン作用阻害剤である銀イオン又はＭＣＰ（１
−メチルシクロプロパン）での処理は、三重応答表現型に影響を及ぼさなかった
。このことは、これらの系におけるエチレン応答の活性化はホルモンの過剰生産
によるものではないことを示している。更に、生長数週間後、得られた植物は、
ＲＡＮ１同時抑制植物（クラス１）において観察されたのと同一の成体の形態へ
と発達した。これらの研究は、ＲＡＮ１発現の減少が、苗木及び成体植物の両方
におけるエチレン形態の構成的活性化を引き起こすことを明らかにした。前記の記載は特定の好ましい態様に関して述べ、多数の詳細な例が説明を目的
として示されている。しかし、本発明は種々の修飾及び追加の態様に付されるこ
と並びに本明細書に詳述した特定の例を本発明の本質から離れることなしに改変
することができることは、当業者に明らかであろう。そのような修飾及び追加の
態様も請求項に記載の範囲に含まれることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】エチレンシグナル伝達経路におけるRAN1の機能を示すモデル。
満たされた又は満たされていない形態は、それぞれ、シグナル経路の活性又は非
活性状態を示す。

【図２】図２A及び2Bは、ran1変異体の表現型を説明する。図2Aは、空
気中、エチレン(C₂H₄)中及びTCO中での、野生型の植物(Col)、ran1-1及びran1-2
、及びエチレン過剰産生変異体(eto1-5)、及び構成的三重応答変異体(ctr1-1)の
実生表現型を示す。図2Bは、空気中及びTCOにおけるロゼット植物表現型を示す
。

【図３】図3A及び3Bは、エチレン誘導性遺伝子が、TCO処理によって、r
an1変異体中で上方制御されることを説明する。図3Aでは、炭化水素のない空気
、エチレン又はTCOで処理した実生から調製した全ＲＮＡのノーザンブロットが
示される。シロイヌナズナα-チューブリン(tublin)3(TUB3)をコントロールとし
て使用した。同一のブロットは、3種のハイブリダイゼーションで使用した。図3
Bでは、TCO処理成体植物における塩基性キチナーゼ遺伝子(CHIB)の発現に関する
分析が示されている。ノーザンブロット分析は、炭化水素のない空気又はTCOに3
日間暴露したロゼット葉から調製した全ＲＮＡを使用して行った。

【図４】単純な配列長多形性(SSLP)マーカーCIC2AT2L及びCIC4ET2Rを使
用して、3種類の各組換え染色体を特定することによって、染色体5の基部の160k
b領域までのRAN1遺伝子の詳細なマッピングを示す。この領域をカバーする組み
立てたBACコンティグを示す。更に、T19K24の配列から開発された新規なマーカ
ーは、単純なBAC(bacterial artificial chromosome)上のRAN1遺伝子の局在化を
可能とした。BAC挿入物の予測される遺伝子組織が、T19K24(GenBank AC002342)
の注釈に従って記載される。灰色又は黒色のボックスは、予測された遺伝子を示
す。RAN1遺伝子のイントロン及びエクソンの機構が、基部に示されている。矢印
の頭は、ran1-1及びran2-1変異体の位置を示す。

【図５】 RAN1遺伝子のゲノムヌクレオチド配列、配列番号:1(GenBank N
o. AF002342)を示す。予測されるアミノ酸配列、配列番号:3が、ヌクレオチド配
列の下にある。大文字及び小文字の文字は、それぞれエクソン及びイントロンの
配列を示す。エクソン-イントロンの境界は、ヌクレオチド-275からヌクレオチ
ド4201に延びるcDNA配列、配列番号:2(GenBank No. AF082565)と比較することに
よって決定された。ヌクレオチドの番号は、左側に示されており、初めのATGコ
ドンのAは、番号1とされている。アミノ酸番号も示されている。アステリスクは
、フレーム中の停止コドンを示す。

【図６】図6Aは、Fet3pオキシダーゼ分析を示し、パネルAに示されてい
る種々の酵母細胞からの膜フラクションのオキシダーゼ活性が、ゲル中分析系を
使用して測定された。下のパネルは、抗HAタグ抗体を使用するオキシダーゼ分析
で使用した膜フラクション試料のウェスターンブロットである。図6Bは、高親和
性鉄取込み分析を示し、種々のタンパク質を発現する野生型又はccc2-破壊酵母
細胞の鉄取込み活性を測定した。これには、酵母野生型CCC2、RAN1:HA-タグ、ra
n1-1:HA-タグ、又はran1-2:HA-タグが含まれる。3種類の独立の実験からの平均
を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。

【図７】銅が、ran1表現型を部分的に阻害することを示す。種々の株の
種子を、銅イオンを添加していないMS培地(-CuSO₄)又は12.5μM CuSO₄ (+CuSO₄)
を含有する同一の培地において、発芽させた。両方の種子を炭化水素のない空気
又はTCOに暴露した。インキュベーションの3日後、実生の写真をとった。CuSO₄
の適用濃度は、炭化水素のない空気中で成長させたeto1-5又はctr1-1の三重応答
に対して又はeto1-5実生のTCO処理の成長促進活性に対して、全く影響しなかっ
た。

【図８】図8A〜８Cは、３５Ｓ：：RAN1トランスジェニック植物におけ
る構成的エチレン応答表現型を示す。図８Ａは、３５Ｓ：：RAN1トランスジェニ
ック植物、特に、３周令のトランスジェニック植物の表現型を示す。トランスジ
ェニック植物の約半分が、ctr-1様表現型(クラス1)を示し、残りの半分は、通常
のモルフォロジーを示した(クラス2)。写真は、同一の倍率で写したものである
。図８Bは、トランスジェニック植物における、RAN1(上方パネル)オキシダーゼ
エチレン誘導性塩基性キチナーゼ(CHIB)遺伝子(下方パネル)の発現を示す。ノー
ザンブロットは、成体植物から、レーン当り20μgの全ＲＮＡを使用して行った
。クラス1トランスジェニック植物において、ＲＮＡは、5種類の独立のT1-世代
の植物から調製し、1つのレーンに装填した。図８Cは、トランスジェニック実生
における、エチレン応答表現型を示す。代表的な暗成長(dark-grown)させたT2-
世代の実生は、TCOで3日間処理したran1-2及びL1(３５Ｓ：：RAN1)トランスジェ
ニック植物から示される。３５Ｓ：：RAN1含有植物(L6及びL3)からの代表的な暗
成長させたT2-世代実生及び炭化水素のない空気で3日間処理したctr1-1変異体か
らの実生も示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヒラヤマタカシ茨城県つくば市高野台３−11−２モアリッシェル１−406 (72)発明者キーバージョセフジェイアメリカ合衆国イリノイ州 60526 ラグランジュパークノースブレイナードアベニュー 305

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】銅トランスポーター活性を有する植物、植物細胞、組織、花
又は器官をコードする単離された核酸、その変異体、誘導体、相同体及び断片。
【請求項２】ｒａｎ１を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】配列番号１に示される配列を含む、請求項１又は２に記載の
核酸。
【請求項４】配列番号２に示される配列を含む、請求項１又は２に記載の
核酸。
【請求項５】銅輸送活性を有する植物、植物細胞、組織、花又は器官をコ
ードする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸、その類似体、相同体、誘導体、
変異体及び断片によりコードされるポリペプチドの精製した調製物。
【請求項６】ＲＡＮ１を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】配列番号３に示される配列を含む、請求項６に記載のポリペ
プチド。
【請求項８】ＲＡＮ１銅トランスポーター活性がＡＴＰ依存性である、請
求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】請求項１〜４のいずれかに記載の単離された核酸を含む組換
え細胞。
【請求項１０】請求項１〜４のいずれかに記載の単離された核酸を含むベ
クター。
【請求項１１】銅トランスポーター活性を有する植物ＲＡＮ１ポリペプチ
ド、その相同体、類似体、誘導体又は断片に特異的な抗体。
【請求項１２】請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列のすべて又は一
部並びに銅トランスポーター活性を有する植物、植物細胞、組織、花又は器官を
コードする該核酸配列の変異体、誘導体、相同体又は断片に相補的な配列を含む
、単離された核酸配列。
【請求項１３】植物、植物細胞、器官、花又は組織の銅輸送活性を調節又
は制御するのに十分なレベルのアンチセンス活性を有する、請求項１２に記載の
核酸。
【請求項１４】請求項１〜４、１２及び１３のいずれかに記載の核酸を含
む、植物、植物細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
【請求項１５】請求項１〜４、１２及び１３のいずれかに記載の核酸を含
む、トランスジェニック植物、細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
【請求項１６】請求項９に記載の組換え核酸を含む、トランスジェニック
植物、細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
【請求項１７】請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチドを含む、ト
ランスジェニック植物、細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
【請求項１８】植物ＲＡＮ１プロモーター配列又はプロモーター活性を有
するその断片を更に含む、請求項１〜４、１２及び１３のいずれかに記載の単離
された核酸。
【請求項１９】請求項１〜４、１２、１３及び１８のいずれかに記載の単
離された核酸を含むベクター。
【請求項２０】更にリポーター遺伝子又はリポーター活性を有するその断
片が動作可能に融合している、請求項１８に記載の単離された核酸。
【請求項２１】ＲＡＮ１プロモーター配列を含む単離された核酸を含む導
入遺伝子を含む、トランスジェニック植物、細胞、器官、花、組織、種子又は子
孫。
【請求項２２】植物中に請求項１〜４、１２又は１３のいずれかに記載の
核酸を操作して、該植物の生長、細胞伸長、性決定、花又は葉の老化、花の成熟
、果実の成熟、昆虫耐性、除草剤耐性、病原体耐性、器官脱離又はストレス応答
を調節又は制御する方法。
【請求項２３】前記調節又は制御が、前記植物の生長、細胞伸長、性決定
、花又は葉の老化、花の成熟、果実の成熟、昆虫耐性、除草剤耐性、病原体耐性
、器官脱離又はストレス応答を開始又は増強する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記調節又は制御が、前記植物の生長、細胞伸長、性決定
、花又は葉の老化、花の成熟、果実の成熟、昆虫耐性、除草剤耐性、病原体耐性
、器官脱離又はストレス応答を阻害又は予防する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】植物中のエチレンシグナル伝達系における銅の輸送に作用
することができる化合物を同定する方法であって、植物ＲＡＮ１配列動作可能に連結したリポーター配列を有する該植物ＲＡＮ１
配列をコードする単離された核酸を含む細胞を提供する工程、該細胞に試験化合物を添加する工程、及び、該細胞におけるリポーター遺伝子活性レベルを測定する工程、を含み、該細胞におけるリポーター遺伝子活性レベルが、該試験化合物を添加し
ない第二細胞におけるリポーター遺伝子活性レベルと比較して高い又は低いこと
が、該試験化合物が植物ｒａｎ１遺伝子の発現に作用することができる指標であ
ることを特徴とする方法。
【請求項２６】野生型植物と比較して増強された銅輸送活性を有する修飾
された植物を作成する方法であって、該修飾植物の細胞にＲＡＮ１をコードする
単離された核酸を導入する工程を含み、該ｒａｎ１核酸が該修飾植物の細胞内で
銅を輸送することができることを特徴とする方法。
【請求項２７】野生型植物と比較して減少又は抑制された銅輸送活性を有
する修飾された植物を作成する方法であって、該細胞にｒａｎ１の全体又は一部
に相補的な核酸をコードする単離された核酸を導入することにより、該植物の細
胞内の銅輸送分子を結合又は阻害する工程を含み、該ｒａｎ１核酸が該修飾植物
の細胞内で銅を輸送することができることを特徴とする方法。
【請求項２８】野生型植物と比較して減少又は抑制された銅輸送活性を有
する修飾された植物を作成する方法であって、該細胞にＲＡＮ１の全体又は一部
に対する抗体を導入することにより、該植物の細胞内の銅輸送分子を結合又は阻
害する工程を含み、該ＲＡＮ１ポリペプチドが該修飾植物の細胞内で銅を輸送す
ることができることを特徴とする方法。
【請求項２９】植物細胞でＲＡＮ１の発現を操作する方法であって、該植物細胞において核酸ｒａｎ１又は動作可能なその部分を植物プロモーター
配列に動作可能に融合してキメラｃＤＮＡを形成する工程、及び、トランスジェニック植物を生成する工程、を含み、該トランスジェニック植物の細胞が該キメラｃＤＮＡを含み、該植物プ
ロモーターが制御された活性化を受けるときに、ＲＡＮ１の発現を操作すること
を特徴とする方法。
【請求項３０】ｒａｎ１のｃＤＮＡのヌクレオチド１８８０においてＣが
Ｔに転移しており、ＲＡＮ１のアミノ酸配列においてヌクレオチドＴｈｒ４９７
がＩｌｅに変化していることを特徴とする、ＲＡＮ１を発現することができる変
異対立遺伝子ｒａｎ１−１。
【請求項３１】ｒａｎ１のｃＤＮＡのヌクレオチド６３７においてＧがＡ
に転移しており、ＲＡＮ１のアミノ酸配列においてヌクレオチドＧｌｙ１７３が
Ｇｌｕに変化していることを特徴とする、ＲＡＮ１を発現することができる変異
対立遺伝子ｒａｎ１−２。