JP2002541763A - 植物中のエチレン応答因子１（ｅｒｆ１） - Google Patents

植物中のエチレン応答因子１（ｅｒｆ１）

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ethylene
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ein3
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ジョセフ アール エッカー
ロベルト ジェイ ソラノ
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ザ トラスティーズ オヴ ザ ユニヴァーシティー オヴ ペンシルバニア
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、エチレン応答因子１（ＥＲＦ１）をコードする単離された核酸、即ち、植物のエチレンガスシグナル経路におけるＧＣＣ−ボックス結合タンパク質をコードする初期応答性遺伝子を提供する。更に、植物又は植物細胞におけるエチレン応答を調節するためのペプチドＥＲＦ１、ＥＲＦ１の使用方法又はその発現産物も提供され、かつ、特徴付けられる。更にＥＲＦ１はＥＩＮ３及び過去に同定されたシグナル経路の全メンバーの下流で働き、ＥＲＦ１の構成的発現は種々のエチレン応答遺伝子及び表現型の調節を引き起こすので、本発明はエチレンシグナル経路を調節する新規かつ有用な方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願に対する引照 本特許出願は、1998年11月25日付けのUS特許出願60/109,973号に関する優先権
を主張するものである。
【０００２】技術分野 本発明は、植物におけるエチレン-応答-因子1(ERF1)およびエチレンガスシグナ
ル経路におけるその機能に関するものである。生合成およびシグナル経路におけ
る酵素の階層の存在が、成長または成熟調節因子および/またはストレスまたは損
傷シグナルとしての、エチレンに対する複雑な植物の応答を、微妙に調節するため
の手段を与える。
【０００３】政府の権利 本発明は、認可番号MCB-95-07166の下で、ナショナルサイエンスファウンデーシ
ョン(National Science Foundation)により、部分的に支援されたものである。該
政府はこの発明における権利の幾分かを共有できる。
【０００４】背景技術 植物ホルモンであるエチレン(C2H4)は、植物における様々なストレス応答およ
び/または発育上の適応を調節する。このガス状の分子は、多様な果実熟成、老化、
器官脱離、発芽、細胞伸張、性別決定、病原体防御応答、創傷、結節形成および細胞余
命の決定等の生理的過程との関連について周知である(Abeles等, (1992) Ethyle
ne in Plant Biology, Academic Press, Inc. New York; Tanimoto等, Plant J.
1995, 8:943-948; Penninckx等, Plant Cell, 1996, 8:2309-2323; O'Donnell
等,Science, 1996, 274:1914-1917; Penmetsa等,Science, 1997, 275:527-530)。
植物応答のこのような多様性に導く、この分子の事象を理解することは、エチレン
がこのような機能をどのように調節しているかを解明する上で必須である。 多数の生物学的なストレスが、植物中におけるエチレン生産を誘発することが
知られており、そのようなストレスは、創傷、器官脱離、バクテリア、ウイルスまた
は真菌感染、およびエリシターによる処理、例えば真菌病原細胞からのグリコペプ
チドエリシターの調製等を包含する。器官脱離の場合、葉柄基部および茎間に位置
する領域(器官脱離領域)における細胞の特定の層が、これまでは十分に理解され
ていない過程によって、エチレンと他の内因性の植物成長調節因子との複雑な組
み合わせに対して応答する。しかし、この器官脱離の作用は、典型的には局在的な、
該植物の一部の制御された喪失であり、その結果は、葉または花の死として、ある
いは果実の軟化または「熟成」として可視化され、結果的に該分離点において植物
に傷を残す。
【０００５】 エチレンの合成経路は、十分に特徴付けされている(Kende, Plant Physiol. 19
89, 91:1-4)。ACCのエチレンへの転化は、エチレン形成酵素によって触媒される(
Spanu等, EMBO J 1991, 10:2007)。閉じた環状のエチレン合成経路において、S-ア
デニシル-1メチオニン(SAM)は、メチオニンから生成される。次いで、律速段階にお
いて、SAMは、ACCシンターゼによって1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(ACC)
に転化される。最終段階において、エチレンはACCオキシダーゼによってACCから製
造される。従って、この経路は多数のACCシンターゼおよびACCオキシダーゼを利用
し、該生合成経路における酵素のカスケードまたは階層を生成し、かつ複雑な植物
の応答を制御する手段を与える。 科学者は、分子レベルでの該エチレンシグナル導入経路を理解し始めている。こ
のエチレンシグナル発生メカニズムを扱うためには、アラビドプシスタリアナ(Ar
abidopsis thaliana)の苗の、エチレン-誘発性三重応答を利用して、分子/遺伝的
方法を適用する。アラビドプシス苗のエチレンに対する継続的な暴露によって誘
発される形態学的な変化は、この「三重応答(triple response)」として公知である
。該ホルモンに対するこの三重応答の認識は、該エチレン応答経路の多数の成分を
同定することを可能とする。
【０００６】 この三重応答に基づいて、12種のアラビドプシス変異体を、2つの組に分離した(
Ecker, Science, 1995, 268:667-675; Johnson & Ecker, Annu. Rev. Genetics,
1998, 32:227-254; 米国特許第5,367,065号、同第5,444,166号、同第5,602,322号
、同第5,650,553号および同第5,955,652号、これら各々を本発明の参考文献とする
)。該変異体の一つの組、即ちein(エチレン非感受性)変異体は、外因性のエチレン
に対して低いまたは完全な非感受性を示す。この非感受性群はetr1、etr2、ein2、ei
n3、ein4、ein5/ain1、ein6およびein7変異体を含む(Ecker, 1995; McGrath & Ecke
r, Plant Physiol. Biochem. 1998, 36:103-113; Sakai等, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1998, 95:5812-5817)。エピスタシス分析に基づいて、これら遺伝子の
作用に関する遺伝的なフレームワークを確立した(Roman等, Genetics, 1995, 13
9:1393-1409; Sakai等, 1998)。ETR1、ETR2およびEIN4遺伝子は、CTR1の上流側で作
用し、一方EIN2、EIN3、EIN5/AIN1、EIN6およびEIN7遺伝子は、CTR1の下流側で作用す
る。 変異体のもう一つの群(構成的ホルモン応答変異体)は、外因的に適用されるホ
ルモンの不在下で、構成的なエチレン応答表現型を示す。エチレン生合成および活
性のアンタゴニストを利用して、この群を更に、エチレンの過度の生成(eto1、eto2
およびeto3)(Guzman & Ecker, 1990; Kieber等, Cell, 1993, 72:427-441)また
は該経路の構成的活性化(ctr1;構成的三重応答)(Kieber等, 1993)の何れかの結
果として、「構成的な」三重応答表現型を示す。後者の変異体は、エチレン生合成ま
たはレセプタ結合の阻害剤が存在しても、「エチレン」表現型を示す。
【０００７】 エチレン構成的応答表現型を付与する、機能喪失変異に基づいて、CTR１は、該エ
チレン応答経路の負の調節因子として同定された。このCTR1遺伝子はタンパクキ
ナーゼのRaf-群に対して類似性を持つ、タンパクをコードし、該エチレン応答経路
におけるMAP-キナーゼカスケードと関連する(Kieber等, 1993)。酵母における浸
透圧検知経路における、「バクテリア」-型のレセプタと「Raf」-様タンパクキナーゼ
とのカップリングは、ホスホ-リレータンパクによって与えられる(Posas等, Cell
, 1996, 86:865-875)。応答調節因子と構造上および機能上の類似性両者をもつ幾
つかのタンパクが、アラビドプシスにおいて同定された(Imamura等, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1998, 95:2691-2696)が、該エチレンレセプタETR１およびERS
１(Chang, Trends Biochem. Sci. 1996, 21:129-133; Schaller等, Science, 19
95, 270:1809-1811)は、物理的にCTR１と相互作用して(Clark等, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 1998, 95:5401-5406)このような中間体に対する絶対要件を迂回
することができる。
【０００８】 該エチレンシグナル経路の下流側成分については、あまり知られていない。該EI
N3遺伝子のクローニングおよび特長付けは、核-局在化タンパクをコードすること
を明らかにした(Chao等, Cell, 1997, 89:1133-1144; Solano等, Genes Dev. 19
98, 12:3703-3714)。配列分析は、以前に記載されたタンパクとのアンカバー(unco
ver)相同性をもたないことを示したが、EIN3は、3種のEIN3-様(EIL)タンパクとの
アミノ酸配列類似性、保存された構造上の特徴および遺伝的な機能を持つ。遺伝子
に関する研究は、EIL1およびEIL2が該ein3変異を機能的に補完できることを明ら
かにしており、このことはこれらが該エチレンシグナル経路に関与していること
を示唆する。トランスジェニック野生型またはein2変異植物におけるEIN3またはE
IL1の高いレベルでの発現は、発育のあらゆる段階において、構成的なエチレン応
答表現型を付与し、このことはエチレンの存在しない状態で、該経路が十分に活性
化されることを示す。
【０００９】 様々な群のエチレン応答性遺伝子の中で、最も広範に研究されているものは、二
次的応答遺伝子であり、その発現は病原体による攻撃に応答する、エチレンにより
活性化される。これらは、基本的なキチナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ、デフェンシ
ンおよびその他の発病-関連(PR)タンパクを含む(Boller等, Planta, 1983, 157:
22-31; Felix等,Planta, 1986, 167:206- 211; Broglie等, Plant Cell, 1989,
1:599-607; Ohme-Takagi等, Plant Mol. Biol. 1990, 15: 941-946; Samac等,
Plant Physiol. 1990, 93:907-914; Eyal等, Plant J. 1993, 4:225-234; Penni
nckx等, 1996)。これら遺伝子数個のプロモータの分析は、GCCボックスと呼ばれる
共通のcis-作用性エチレン応答エレメントを明らかにした。このエレメントは、様
々な植物種におけるエチレン調節にとって必要かつ十分であることが示された(E
yal等, 1993; Meller等, Plant Mol. Biol. 1993, 23:453-463; Hart等, Plant
Mol. Biol. 1993, 21:121-131; Shinshi等, Plant Mol. Biol. 1995, 27:923-93
2; Sessa等, Plant Mol. Biol. 1995, 27:923- 932; Ohme-Takagi等, Plant Cel
l, 1995, 7:173-182; Sato等, Plant & Cell Physiology, 1996, 37:249-255)。
【００１０】 該GCCボックスと結合する、タバコにおけるtrans-作用因子を単離するための努
力は、エチレン-応答性-エレメント-結合-タンパク(Ethylene-Responsive-Elemen
t-Binding- Proteins; EREBP)と命名された一連のタンパクを同定した(Ohme-Ta
kagi等,1995)。これら新規なDNA-結合タンパクは、インビトロにて、花系ホメオチ
ックタンパクAPETALA2において以前に観測されたものと相同なドメインを介して
、該GCCボックスと相互作用する(Ecker, 1995; Weigel, Plant Cell, 1995, 7:38
8-389)。アラビドプシスにおいては、この群に属する30種を越える遺伝子が、数群
として同定されている(Wilson等, Plant Cell, 1996, 8:659-671; Buttner等, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:5961-5966; Okamuro等, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 1997, 94:7076-7081およびアラビドプシスゲノムイニシェイティ
ブ(Arabidopsis Genome Initiative) (Bevan等, Plant Cell, 1997, 9:476-478,
Ecker, Nature, 1998, 391:438-439)の結果として)。 該EREBP群に属する幾つかの構成員の発現が、エチレン放出性化合物であるエテ
フォン(ethephon)によって調節されることが報告され (Buttner等, 1997; Ohme-
Takagi等,1995)、このことはこれらが、該エチレンシグナル経路において、活性化
剤およびレセプタカスケードにおける媒介的な役割をもち得ることを示唆してい
る。しかし、アラビドプシス内の該エチレンシグナル経路における、EREBPの直接的
な関与に関る証拠は、本発明者等による本発明の発見までは、不十分なものであっ
た。従って、この発見は、エチレン生合成およびシグナル発生の科学および理解を
著しく進展させ、かつ植物の成熟および生育中のエチレン応答、開花、果実の熟成、
ストレス、傷、病原体に対する応答等を、制御し、変調しもしくは調節するための手
段を与える。
【００１１】 このように、該エチレンシグナル経路に関する理解を改善することによって、本
発明は、植物のストレス、傷、病原体に対する耐性を改善する方法の開発を促進し、
ストレス-、傷-または病原体-耐性植物を同定するための、より容易なかつより効
果的な方法の開発を促す。更に、植物ホルモンおよびその制御メカニズムに関する
洞察を与え、かつその機能を変調し、かつ調節することによって、植物食品製品、例
えば果実および野菜、花および花観賞植物、および他の食品以外の植物製品、例え
ば工業的に価値ある作物、例えば綿または亜麻、もしくは観葉植物の品位、量およ
び保存寿命を大幅に改善することが可能となり、結果として先進国および発展途
上国両者における市場にとってより良くかつ好ましい製品を供給できる。
【００１２】発明の開示 本発明は、GCC-ボックス結合タンパクをコードする、初期応答性遺伝子である、
エチレン応答性因子1(ERF1)のクローニングおよび特徴付けに関する。EIN3発現は
、ERF1の転写にとって必要かつ十分である。更に、トランスジェニック植物中のEIN
3過剰発現と同様に、ERF1の構成的発現は、種々のエチレン応答遺伝子および表現
型の調節をもたらす。更に、EIN3およびEILは、ERF1のプロモータ中の一次応答エレ
メントと結合する、新規な配列-特異的DNA-結合タンパクであることが明らかにさ
れる。これら生化学的な研究の発見と矛盾なしに、遺伝子解析は、ERF1がEIN3およ
び以前に同定されたエチレンガスシグナル経路の構成員全ての下流側で作用する
ことを明らかにした。 本発明は、植物のエチレン応答因子をコードする、単離された核酸を提供し、該
因子は該植物のエチレンシグナル経路において、EIN3またはEIN3-様(EIL)タンパ
クにより活性化され、該活性化された因子は、二次エチレン応答遺伝子内のターゲ
ットGCC-ボックスと結合する。本発明は、またERF1、並びにERF1の変異体、誘導体、
同族体またはフラグメントを含み、ERF1-活性をもつ発現生成物をコードする、単
離された核酸をも提供する。本発明は、更にSEQ ID NO:1を含む核酸をも提供する。
【００１３】 更に、本発明は、上記同定された核酸によりコードされる精製ポリペプチドを提
供する。また、ERF１並びにその類似体、同族体、誘導体またはフラグメントを含み、
ターゲット二次応答遺伝子内でGCC-ボックス結合活性をもつ、精製ポリペプチド
をも提供する。本発明は、更にSEQ ID NO:2を含むポリペプチド並びにERF1GCC-ボ
ックス結合活性が、EIN3-またはEIL-依存性である、該ポリペプチドをも提供する。 本発明は、また上記同定され、単離された核酸を含む、組換え細胞をも提供する。 本発明は、更に上記同定され、単離された核酸を含む、ベクターをも提供する。 本発明は、更にターゲット二次応答遺伝子においてGCC-ボックス結合活性をも
つ、植物ERF1ポリペプチドおよびその同族体、類似体、誘導体またはフラグメント
に対して特異的な抗体をも提供する。本発明は、更にターゲット二次応答遺伝子に
おいてGCC-ボックス結合性発現生成物をコードする、該ERF1核酸配列、およびその
変異体、誘導体、同族体またはフラグメント全体またはその一部に対して相同な配
列を含む、単離された核酸配列をも提供する。従って、本発明は、また植物、植物細
胞、器官、花またはこれらを含む組織の該二次エチレン応答活性を調節し、制御し、
もしくは変調するのに十分なレベルの、アンチセンス活性をもつ核酸をも提供す
る。
【００１４】 本発明は、ERF1を含む上記の同定された核酸のいずれかを含む、植物、植物細胞、
器官、花、組織、種子または子孫を提供し、ここで該植物細胞、器官、花、組織、種子ま
たは子孫は、トランスジェニック植物由来のものも含む。更に、本発明は上記の組
換え核酸またはポリペプチドを含む、トランスジェニック植物、植物細胞、器官、花
、組織、種子または子孫をも包含するものである。 更に、本発明は植物ERF1プロモータ配列、またはERF1プロモータ活性をもつその
フラグメントをも含有する単離された核酸、並びに該ERF1プロモータ配列を含有
する、導入遺伝子を含むトランスジェニック植物、その細胞、器官、花、組織、種子ま
たは子孫をも提供する。 更に、本発明は単離されたERF1核酸をも提供し、これは更にこれと機能可能に融
合されたレポーター遺伝子、またはレポーター活性をもつそのフラグメントをも
含む。
【００１５】 本発明は、また植物内で該ERF1核酸を操作して、該植物内のエチレン応答の調節
、制御または変調を可能とする方法をも提供する。本発明は、また上記方法におい
て、該調節、制御または変調が、発芽、細胞伸張、性別決定、花または葉の老化、花の
成熟、果実の熟成、昆虫、除草剤または病原体耐性、器官脱離、または該植物におけ
るストレス、傷または病原体に対する応答を開始または増強するような上記方法
を提供する。本発明の幾つかの態様において、ここに記載された調節、制御または
変調法は、発芽、細胞伸張、性別決定、花または葉の老化、花の成熟、果実の熟成、昆
虫、除草剤または病原体耐性、器官脱離、または該植物におけるストレス、傷または
病原体に対する応答を阻害または防止する。本発明による幾つかの他の態様にお
いては、該記載された調節、制御または変調法は、発芽、細胞伸張、性別決定、花また
は葉の老化、花の成熟、果実の熟成、昆虫、除草剤または病原体耐性、器官脱離、また
は該植物におけるストレス、傷または病原体に対する応答を活性化または増強す
る。
【００１６】 本発明は、また植物内で、該エチレンシグナルシステムにおける該エチレン応答
性に影響を与えることのできる、化合物を同定する方法をも提供し、該方法は機能
可能に結合したレポーター配列をもつ、植物ERF1配列をコードする、単離された核
酸を含む細胞を製造する工程、この細胞に、テストすべき化合物を添加する工程、
および該細胞内のレポーター遺伝子活性のレベルを測定する工程を含み、該テス
トすべき化合物が添加されていない第二の細胞内の、レポーター遺伝子活性のレ
ベルと比較して、該細胞内のより高いまたはより低いレベルのレポーター遺伝子
活性が、該テストすべき化合物が植物ERF1遺伝子の発現に影響を与え得ることを
示す指標であることを特徴とする。 更に、本発明は匹敵する野生型植物の値と比較して、高いエチレン応答活性をも
つ、改良された植物の製法をも提供し、該方法は該改良された植物の細胞内に、ERF
1をコードする単離された核酸を組み込む工程を含み、該ERF1核酸が該GCC-ボック
スと結合して、該改良された植物のターゲット二次エチレン応答遺伝子を活性化
することを特徴とする。本発明の幾つかの態様では、匹敵する野生型植物の値と比
較して、高いエチレン応答活性をもつ、改良された植物の製法が提供され、該方法
は該改良された細胞のEIN3-またはEIL-欠乏または欠失細胞に、EIN3またはEILを
コードする単離された核酸を組み込む工程を含み、該EIN3またはEIL核酸が、該ERF
1遺伝子を活性化して、該改良された植物のターゲット二次エチレン応答遺伝子の
活性化を可能とすることを特徴とする。
【００１７】 本発明は、更に匹敵する野生型植物の値と比較して、減じられたまたは阻害され
たエチレン応答活性を持つ、植物の製法を提供し、この方法は該改良された植物の
細胞内に、erf1の全体または一部に対して相補的な核酸をコードする、単離された
核酸を組み込むことによって、該細胞内の該ERF1分子を結合または阻害する工程
を含み、該erf1核酸は、また該GCC-ボックスと結合して、該改良された植物のター
ゲット二次エチレン応答遺伝子を活性化できることを特徴とする。本発明の幾つ
かの態様においては、匹敵する野生型植物の値と比較して、減じられまたは阻害さ
れたエチレン応答活性を持つ、植物の製法を提供し、この方法は該改良された植物
の細胞内に、ERF1全体またはその一部に対する抗体導入することによって、該細胞
内の該ERF1分子を結合または阻害する工程を含み、該ERF1ポリペプチドは、また該
GCC-ボックスと結合して、該改良された植物のターゲット二次エチレン応答遺伝
子を活性化できることを特徴とする。
【００１８】 本発明の幾つかの付随的な態様においては、匹敵する野生型植物の値と比較し
て、減じられまたは阻害されたエチレン応答活性を持つ、植物の製法を提供し、こ
の方法は改良された植物の細胞内に、EIN3またはEILの全体または一部に対する抗
体を導入することによって、該細胞内の該EIN3またはEIL分子を結合または阻害す
る工程を含み、該EIN3またはEILポリペプチドは、またERF1の発現を活性化して、該
改良された植物のターゲット二次エチレン応答遺伝子を活性化できることを特徴
とする。 本発明は、また植物細胞内のERF1発現を操作する方法をも提供し、この方法は、
該植物細胞内の植物プロモータ配列と、該核酸ERF1またはその機能可能な部分と
を機能可能に融合する工程と、トランスジェニック植物を生成する工程とを含み、
該トランスジェニック植物の細胞は該キメラDNAを含み、結果として該植物プロモ
ータを制御することによって、ERF1発現を操作することができることを特徴とす
る。
【００１９】発明を実施するための最良の形態 本発明は、以下の好ましい態様、図面および実施例に関する詳細な説明から、よ
り一層十分に理解されるであろう。これら全ては、例示の目的でのみ与えられ、本
発明を限定するものではない。 酵素のカスケードは、バクテリアからヒトに至る殆ど全ての生物に存在する、遺
伝子調節における共通のテーマであり、窒素固定、胚形成、細胞分裂、病原体、傷ま
たは細胞外シグナルに対する応答、またはサーカディアンリズム等の多様な過程
の調節に関与している。従って、エチレンに関するシグナル経路における、転写因
子および酵素の階層またはカスケードの存在は、このガス状植物成長調節/ストレ
スシグナルに対する、複雑な植物の応答を調節する手段を与える。 本発明は、GCC-ボックス結合タンパクをコードする、初期エチレン応答遺伝子で
ある、エチレン応答因子1(ERF1)のクローニングおよび特徴付けに関する。EIN3発
現は、ERF1の転写にとって必要かつ十分である。トランスジェニック植物中のEIN3
の過剰発現と同様に、ERF1の構成的発現は、種々のエチレン応答遺伝子および表現
型の活性化をもたらす。更に、EIN3およびEILは、ERF1のプロモータ中の一次エチレ
ン応答エレメントと結合する、新規な配列-特異的DNA-結合タンパクであることが
明らかにされている。これら生化学的な研究と矛盾なしに、遺伝子解析は、ERF1がE
IN3および以前に同定されたエチレンガスシグナル経路の成分全ての下流側で作
用することを明らかにした。
【００２０】 EIN３(またはEIL)およびERF１DNA結合タンパクのこの継続的な作用は、該エチ
レン-シグナル経路の調節階層に、新たなレベルの複雑さを付加する。図１に示し
たように、膜レセプタに対するエチレン(C2H4)の結合は、至るところに記載されて
いる(Chao等,1997)シグナルカスケードを介して、EIN３および見かけ上EIL１およ
びEIL２を活性化する。EIN3は、プロモータ中に存在する一次エチレン応答エレメ
ント(PERE)と、ダイマーとして直接結合することにより、ERF1および他の一次ター
ゲット遺伝子の発現を指示する。かくして、ERF1の該プロモータ中の配列は、EIN3
結合の直接のターゲットとして機能する。EIN3はERF1の発現にとって十分かつ必
要であるが、他の因子、例えばEIL活性は、完全なエチレン-依存性ERF1誘発にとっ
て必要となる可能性がある。この観測と矛盾なしに、プロモータ内にGCCエレメン
トを含む、HOOKLESS1は、ERF1トランスジェニック植物内では誘発されず、このこと
はERF1が該エチレン-応答性GCC-ボックス含有ターゲット遺伝子のサブセットの
活性化によるものであることを示す。本発明のERF1によって活性化または変調さ
れる、該エチレンシグナル経路の、GCC-ボックス含有二次応答遺伝子のサブセット
は、ここでは単純に「ターゲット遺伝子」または「ターゲット二次エチレン応答遺伝
子」あるいは「記載されたGCC-ボックス結合能」を有する遺伝子と呼ぶ。当業者は、
不当な実験を行うことなしに、このようなサブセットを容易に同定できる。
【００２１】 エチレンの誘発または構成的発現に引き続いて、ERF１は下流側ターゲット二次
エチレン応答遺伝子の転写を活性化する。ERF１は該GCCボックス(二次エチレン応
答エレメント：SERE)と結合して、幾つかの二次エチレン応答遺伝子、例えば塩基
性-キチナーゼおよびデフェンシン(PDF１.２)等の発現を活性化する。ここでは、
該二次エチレン応答遺伝子は、また該エチレンシグナル経路における、エチレン-
誘発性ターゲット遺伝子またはエフェクタ遺伝子とも呼ばれる。 DNA-結合タンパクの該EREBP群は、該GCC-ボックス、およびエレメントと結合す
る能力に基づいて同定されており、該エレメントは、Deikman, Physiol. Plantaru
m, 1997, 100: 561-566に概説されたように、病原体の攻撃に応答する、エチレン
誘発性にとって必要なものとして同定された。事実、EREBPとbZIP転写因子との間
の相互作用、並びにそのDNAターゲットサイト、該GCC-ボックスおよびGボックスの
相乗作用が、以前に記載されている(Hart等, 1993; Sessa等, 1995; Buttner等,
1997)。
【００２２】 しかし、ERF１は該エチレン応答カスケードの一員であるが、該EREBP群の既知の
構成員によって予想も示唆もされていない。例えば、アラビドプシスAP2/EREBPの
一構成員であるAtEBPは、報告によればエチレンによって調節され(Buttner等, 19
97)、またERF1と同様に、AtEBPは、ctr1変異体内に構成的に発現される。しかし、AtE
BPは、EIN3の直接的なターゲットであるとは考えられない。というのは、エチレン
に応答するその発現は、シクロヘキシミド-依存性であって、このことは調節カス
ケードが該EREBP群の構成員中に存在し、AtEBPがERF1の下流側で作用するからで
ある。この考えと矛盾することなしに、幾つかのEREBP遺伝子は、そのプロモータ中
にGCCボックスエレメントを含むことが分かっており、このことはその発現が、自
己調節されるか、あるいは他のEREBPにより制御されることを示す。従って、転写調
節カスケードの存在は、エチレンシグナル発生に関与するEREBPに制限されない。
というのは、これが、明らかにエチレンに対する応答には関与していない(Okamuro
等, 1997)、RAP遺伝子(AP2/EREBP群の構成員)の場合にも推定されるからである。 本発明は、提案されたモデルおよびここに記載されたメカニズムに制限されな
いことを理解すべきである。更に、図1に示されたモデル等は、該エチレンシグナル
導入経路の相互作用成分の役割、およびそのERF1との関係、並びに該成分相互間の
関連性を、単に模式的に示すモデルであることをも認識すべきである。従って、該
モデルは、単に本発明の理解を容易にするためのものである。
【００２３】 エチレンはオレフィンの一種であり、従ってそのレセプタは、ホルモン結合活性
をもつためには、遷移金属の配位を必要とするものと推定される。野生型植物にお
いて、エチレンとそのレセプタとの結合は、エチレンレセプタの活性を不活化し(
恐らく、ヒスチジンキナーゼ活性の低下をもたらす)、また結果として該シグナル
経路の活性化(抑制解除)を介して、エチレン応答の誘発をもたらす。該エチレンガ
スシグナル導入経路の新規成分における変異を同定するために、有力なホルモン
アンタゴニストに応答する、エチレン-様の三重応答表現型を示す、アラビドプシ
スタリアナ変異体に付き、スクリーニングを開始した。アラビドプシスにおけるこ
の「三重応答」は、エチレンに暴露した際の暗所で成長した苗における、３つの異な
る形態学上の変化からなる。即ち、1) 胚軸および根の伸張の阻害；2) 茎の半径方
向の膨張および3) 頂部フック(鉤型の器官)の拡大である。一群の構成的変異体ct
rは、エチレン生合成阻害剤の存在下で、構成的な三重応答を示し、また該レセプタ
においてまたはその下流において影響を受ける。スクリーニングは、根または茎の
伸張に関するスクリーニングおよび高いエチレン生産性に関するスクリーニング
を含む。
【００２４】 本明細書で使用する「植物」とは、任意の植物およびこのような植物の任意の部
分を意味し、野生型、処理されたもの、遺伝的に操作されたものまたは組換え体で
あり得、トランスジェニック植物をも包含する。この用語は、広義には該植物の任
意のおよびあらゆる部分を意味し、植物細胞、組織、花、葉、根、器官などを包含し、
また種子、子孫等をも包含し、これら部分が具体的に命名されているか否かとは無
関係である。「改良された植物」とは、野生型の遺伝子またはタンパクの特徴が変更
されている植物である。表現型の変更は、該植物細胞におけるまたは該細胞による
、典型的な野生型応答を増強または阻害でき、あるいは如何なる表現型作用も存在
しない可能性もある。 当業者には理解されるであろうように、植物または植物細胞による内因性のエ
チレン生産の絶対的レベルは、生育条件により変化するであろう。しかし、野生型
の植物または該シグナルカスケードが完全な植物を含む、「エチレン感受性」植物
において、二次的エチレン応答は、ERF１によって活性化される。このような植物ま
たは植物細胞では、典型的に高濃度の外因性エチレンの存在下においては、内因性
ガス生産が遮断または減じられることは明らかである。
【００２５】 比較により、「エチレン不感受性」植物または植物細胞は、典型的に阻害作用を持
つ量の外因性エチレンの投与にも拘わらず、内因性のエチレン生産を続ける。エチ
レン不感受性植物は、より多くのエチレンを生産し、あるいは阻害作用を持つ量の
外因性エチレンを投与した際の、野生型植物の生産速度よりも高い速度でエチレ
ンを生産するであろう。本発明の目的にとって、エチレン不感受性とは、高いレベ
ルでの外因性エチレンの存在下で、該三重応答を全く示し得ないか、あるいは部分
的に示し得ないことを意味し、例えば該植物または植物細胞において、該エチレン
シグナル経路が停止された場合に予想される。このようなエチレン不感受性植物
において、該EIN3(またはEIL)もしくはERF1遺伝子の発現が遮断されもしくは阻害
された結果生じる、この悪化したレセプタ機能は、豊富な外因性のエチレンの存在
にも拘わらず、継続的な内因性エチレン生産として現れるであろう。 ERF1に対応する遺伝子を、以下に示すようにクローニングして、該cDNAクローン
の配列を、SEQ ID NO:1として与える。しかし、与えられた説明から、当業者は、他の
対立遺伝子および異種遺伝子を利用できることが理解されよう。従って、付随的な
変異体も、本発明において利用可能であり、該変異体は、GCC-ボックス結合活性が
発現されもしくは調節される限り、その保存されたタンパクモチーフ内に挿入、欠
失、変更または置換をもつものである。
【００２６】 本発明は、erf1またはその任意の変異体、誘導体、同族体またはフラグメントを
含む核酸を包含するものと理解すべきであり、但し該核酸は依然として初期エチ
レン応答遺伝子をコードすべきであり、該応答遺伝子は、該GCC-ボックスに対する
結合エレメントをコードし、かつ該エチレンシグナル経路における、ターゲット二
次エチレン応答遺伝子の発現を活性化または調節できる。本発明によれば、核酸配
列はDNA(cDNAおよびゲノムDNAを含むが、これらに制限されない)およびRNA(mRNA
およびtRNAを含むが、これらに制限されない)を含むが、これらに制限されず、また
キラルまたは混合分子をも含むことができる。 好ましい核酸配列は、例えばSEQ ID No:1に示した配列、並びにこの核酸配列の
修飾体、例えばその変更体、挿入体、欠失体、変異体、同族体およびフラグメントを
含み、該エチレン応答経路におけるERF1またはERF1-型の調節タンパクの活性領域
をコードし、ERF1-GCCボックス結合活性は、ターゲット二次エチレン応答遺伝子の
発現を調節することができる。
【００２７】 該二次エチレン応答遺伝子の発現は、ERF1によって調節される。ERF1による発現
の「調節」は、好ましくは発現の活性化を意味するが、本発明においてはこの用語は
、該ターゲット遺伝子の増強された発現をも意味する。しかし、条件によっては、該
ターゲット遺伝子発現の阻害または阻止をも含むものとする。 核酸の「フラグメント」とは、該フラグメントが、該単離された核酸と実質的に同
一の発現生成物をコードする場合、または該フラグメントが、記載されたGCC-ボッ
クス結合能を持つペプチドをコードする場合に、本発明の範囲内に含まれる。 また、本発明は該エチレンシグナル経路において、記載されたGCC-ボックス結合
能を持つ、ERF1またはその任意の変異体、誘導体、変種、類似体、同族体またはフラ
グメントを含む、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクをも包含するものと理解
すべきである。これら用語「タンパク」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパ
ク配列」は、本発明の範囲内において互換性あるものとして使用され、またSEQUENC
E ID NO:2に示した配列、核酸 SEQUENCE ID NO:1に対応する推定アミノ酸配列、並
びに該エチレン応答経路における記載されたGCC-ボックス結合能を持つ、その変
異体、誘導体、類似体または同族体もしくはフラグメントを表す配列を包含するが
、これらに限定されない。
【００２８】 本発明は、また対象とする遺伝子、好ましくはERF1によってコードされるタンパ
ク、ペプチドまたはポリペプチドの類似体または同族体をも提供する。「類似体」と
は、天然に産するタンパクまたはペプチドとは、保存性のアミノ酸配列の差異、ま
たは配列に影響しない修飾あるいはこれら両者により、区別できる。「同族体」とは
、同一の遺伝子座をもつ染色体DNAであり、これを二倍体細胞上に持つ場合には、各
親由来の該同族体のコピーが存在する。 例えば、保存性のアミノ酸変化を行うことができ、この場合該変化は該ペプチド
の一次配列を変えるが、通常はその機能を変更することはない。この型の保存性ア
ミノ酸置換は、当分野では公知であり、例えば以下のグループ内での変化を含む：
グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン
酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニ
ン；リジンおよびアルギニン；またはフェニルアラニンおよびチロシン。 修飾(通常は一次配列に影響しない)は、ペプチドのインビトロまたはインビボ
での化学的な誘導体化、例えばアセチル化または中性化を含む。また、グリコシル
化による修飾、例えばポリペプチドの合成もしくは処理中の、あるいは更にプロセ
ッシング中の、該ポリペプチドのグリコシル化パターンについて行われる修飾を
も含む。同様に、アミノ酸残基が、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレ
オニン等の、ホスホリル化された配列をも含む。
【００２９】 通常の分子生物学的技術によって修飾して、タンパク分解に対する耐性を改善
し、あるいは溶解度を最適化し、もしくは調節剤としてより効果的なものとされた
、ポリペプチドも本発明に含まれる。このようなペプチドの類似体は、天然に産す
るL-アミノ酸以外の、例えばD-アミノ酸の残基を含むもの、あるいは天然産ではな
い合成分子を包含する。しかし、本発明のポリペプチドは、ここに明記した如何な
る特定の方法による生成物にも限定されない。 「誘導体」とは、機能的および化学的誘導体両者を含むものとし、分子のフラグメ
ント、セグメント、変種または類似体を包含する。ある分子は、通常その一部ではな
い付随的な化学的部分を含む場合、他の分子の「化学的誘導体」である。このような
部分は、該分子の溶解度、吸収性、生物学的な半減期等を改善することを可能とし、
あるいはこれらは、例えば該分子の毒性を減じ、該分子のあらゆる望ましからぬ副
作用を軽減または排除することを可能とする。このような作用を媒介できる部分
は、Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)に記載されている。このような
部分を分子に結合する手順は、当分野において周知である。本発明において使用す
る用語「誘導体」の意味に含まれるのは、ヌクレオチドまたはペプチドもしくはポ
リペプチド等の「変更」、「挿入」および「削除」である。
【００３０】 ポリペプチドの「フラグメント」は、これが精製されたペプチドと実質的に同一
の活性を維持し、あるいはこれが記載されたGCC-ボックス結合能を持つ場合に、本
発明の範囲内に含まれる。このようなペプチドのフラグメントは、抗体のフラグメ
ントをも規定することを意味する。 タンパクの「変種」または「対立遺伝子または種の変種」とは、構造および生物学
的活性において、該タンパクと実質的に類似する分子を意味する。かくして、2つの
分子が共通の活性を有し、かつ相互に代用できる場合には、たとえこれら分子の組
成またはその一方の二級、三級または四級構造が、他方の分子に見出されるものと
同一でなくとも、あるいはそのアミノ酸またはヌクレオチド配列が、同一でなくと
も、これらは「変種」である。 本発明によれば、ここで使用する該ERF1ポリペプチドおよびERF1核酸配列は、外
因性の配列であっても良い。ここで使用する外因性または異種とは、形質転換され
ていない、形質転換すべき植物、細胞、器官、花または組織の、遺伝子構造の一部由
来のものではなく、しかも通常はその一部を形成しない、核酸配列を意味する。ERF
1またはerf1変異体の外因性核酸配列を含む植物は、SEQ ID No:1の核酸配列、その
変更、挿入、欠失、変異、同族体およびフラグメントによりコードされるが、これら
に制限されない。
【００３１】 ERF1またはerf1変異体の核酸配列、例えばSEQ ID No:1の核酸配列(これに限定
されない)を含む、形質転換された植物細胞、組織等は、本発明の範囲内にある。本
発明の形質転換された細胞は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory M
anual, 第２版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
.Y. (1989)に記載された、標準的な形質転換技術および手順を利用して調製でき
る。 本明細書において使用する、二次ターゲット細胞の発現が、GCC-ボックス結合に
よって調節されるような、該植物細胞などを「コードする核酸」なる用語は、ERF1に
より調節された二次エチレン応答遺伝子の発現を活性化または調節する、上記のG
CC-ボックス結合能力をもつポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。この用
語は、DNA、RNAなどを包含することを意味する。
【００３２】 以下の実施例において記載するように、ERF1遺伝子はタンパクをコードするが、
該タンパクはその内部に局在する特定のドメイン、例えば末端伸張、貫膜スパン(s
pan)、TM1およびTM2、ヌクレオチド結合フォールド(fold)推定上の調節ドメイン、
およびC-末端をもつ。この課題とする遺伝子の変異体、誘導体、同族体またはフラ
グメントは、従って関連タンパク中の選択されたドメインが、本発明の好ましい態
様における同一のドメインに対して、有意の相同性(少なくとも約40%の相同性)を
もつようなものでもある。このような核酸の定義は、当業者によって理解されるで
あろう厳密な条件の下で、遺伝子内に含まれる上記ドメインの何れかにおいて、少
なくとも約40%の相同性をもつ遺伝子を含むことが理解されよう。 更に、ここにおいて使用する用語「相同性」が、これらタンパクの該ドメインを意
味する場合、これは該核酸およびアミノ酸両者のレベルにおいて、相同であること
を意味するものと理解すべきである。このような核酸内の同様なドメイン間の有
意な相同性は、少なくとも約40%であると考えられ、好ましくは核酸ドメイン間の
該相同性は、少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約60%、より一層好まし
くは少なくとも約70%、更に好ましくは少なくとも約80%、更に一層好ましくは少な
くとも約90%であり、および最も好ましくは類似する核酸ドメイン間の該相同性は
約99%である。
【００３３】 本発明によれば、好ましくは、生物学的に活性なERF１ポリペプチドまたはその
フラグメントをコードする、該単離された核酸は、該二次エチレン応答遺伝子の発
現を活性化または調節できる、調節されたまたは活性なGCC-ボックス結合タンパ
クをコードするのに、完全な長さまたは十分な長さのものである。一態様において
、該核酸は、その長さにおいて少なくとも約200ヌクレオチドを持つものである。
より好ましくは、該核酸は、その長さにおいて少なくとも400ヌクレオチド、より好
ましくは少なくとも600ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも800ヌクレ
オチド、更に一層好ましくは少なくとも1000ヌクレオチドを持つものである。もう
一つの態様において、好ましくは、該エチレンシグナルシステムにおいて、記載さ
れたGCC-ボックス結合活性を持つ、該単離されたポリペプチドの精製された調製
品は、その長さにおいて少なくとも60個のアミノ酸を含む。より好ましくは、該調
製品は、その長さにおいて少なくとも120個のアミノ酸、より一層好ましくは少な
くとも300個のアミノ酸、更に一層好ましくは少なくとも500個のアミノ酸、更に好
ましくは少なくとも700個のアミノ酸を含むものである。付随的な態様において、
該ポリペプチドは、完全な長さのERF1タンパクまたはその調節された型のものを
コードする。
【００３４】 本発明は、更にERF１をコードする遺伝子を含むベクターを含む。タンパク遺伝
子またはその一部で構成されるDNA分子を、機能可能に結合して発現ベクターとす
ることができ、また宿主細胞に組み込んで該細胞によりこれらタンパクを発現さ
せることが可能である。あるいはまた、プロモータと機能可能に結合したアハイブ
リッド(Ahybrid)遺伝子を、ウイルスゲノム内に組み込んで、タンパクを該ウイル
ス宿主内でクローニングすることができる。次いで、感受性の宿主内でこのような
組換えウイルスを複製することによって、このタンパクを発現させることが可能
である。タンパク分子をコードするDNA配列は、公知の技術によって、ベクターDNA
で組換えることができる。ウイルス内でタンパク分子を発現させる場合、該ハイブ
リッド遺伝子は、当分野において周知の技術に従って、該ウイルスゲノムに組み込
むことができる。かくして、本発明は原核または真核細胞何れかにおける、所定の
タンパクの発現、または原核または真核細胞内で複製するウイルスを包含する。
【００３５】 好ましくは、本発明のタンパクは、ウイルス内でクローニングされ、かつ発現さ
れる。本発明のタンパクを発現させるためのウイルス宿主は、原核宿主内で複製す
るウイルス粒子または真核宿主内で複製するウイルス粒子を含む。該単離された
核酸またはそのフラグメントを送達するためのベクターを生成する手順は、周知
であり、例えばSambrook等の上記文献に記載されている。適当なベクターは、カリ
フラワーモザイク(CaMV)35Sプロモータ(Lagrimini等, Plant Cell, 1990, 2:7-1
8)またはその内因性のプロモータ(Bevan, Nucl. Acids Res. 1984, 12:8711-872
1)等のベクターの制御下にあるターゲット遺伝子を含む、弱毒化(disarmed)アグ
ロバクテリウム(Agrobacterium)腫瘍誘発(Ti)プラスミド(例えば、pBIN19)、アデ
ノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルス、タバコモザイクウイル
ス等を含むが、これらに制限されない。
【００３６】 該構築体含有該ベクターまたはDNA配列を、発現のために調製した後に、該DNA構
築体を、適当な宿主に導入しあるいは該構築体で該宿主を形質転換することがで
きる。種々の技術を利用でき、例えばプロトプラストヒュージョン、燐酸カルシウ
ム沈殿、エレクトロポーレーション、またはその他の公知の技術を利用できる。周
知の如く、該アハイブリッドタンパク遺伝子を含むウイルス配列は、可能な宿主内
で直接形質転換処理でき、あるいはまずウイルス粒子内に収容し、次いで感染によ
り可能な宿主内に導入することもできる。該細胞が該組換えDNA(またはRNA)分子
で形質転換された後、あるいは該ウイルスまたはその遺伝子配列を、可能な宿主内
に導入した後、該細胞を媒地中で成育させ、適当な活性についてスクリーニングす
る。この配列の発現は、本発明のタンパクの生産をもたらす。
【００３７】 植物細胞、組織、花、器官またはそのフラグメントを生成するための手順は、当分
野において周知であり、例えばSambrook等の上記文献に記載されている。適当な細
胞は、酵母、バクテリア、哺乳動物、バキュロウイルス感染した昆虫、および植物由
来の細胞を含むが、これらに制限されず、これらはインビボまたは組織培養の何れ
かで利用する。また、記載されたGCC-ボックス結合能力を有し、結果として該ター
ゲット二次エチレン応答エレメントの発現を調節する細胞を生成し、かつ植物を
再生するために、対象とする該遺伝子で形質転換された植物細胞をも含む。 適当なベクターと植物との組み合わせは、当業者には容易に理解され、例えばMa
liga等, 1994, Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, C
old Spring Harbor, N.Y.に見出すことができる。 植物の形質転換は、Horsch等, 1988, Leaf Disc Transformation: Plant Molec
ular Biology Manual, A5:1に記載された、アグロバクテリウム-媒介リーフディ
スク形質転換法を利用して達成し得る。トランスジェニック植物が、所定のDNAを
含むか否かを評価するための様々な手順が、当分野において公知であり、繰り返し
述べる必要はない。
【００３８】 真核宿主における所定タンパクの発現は、真核調節領域の使用を必要とする。こ
のような領域は、一般的にRNA合成を指示するのに十分なプロモータ領域を含むで
あろう。好ましい真核プロモータは、SV40初期プロモータ(Benoist等, Nature (Lo
ndon), 1981, 290:304- 310)、酵母gal4遺伝子プロモータ(Johnston等, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 1982, 79:6971- 6975)および該例示されたpYES3 PGK1プロ
モータを含むが、これらに限定されない。広く知られているように、真核mRNAの翻
訳は、最初のメチオニンをコードするコドンにおいて開始される。そのため、真核
プロモータと該所定のタンパクをコードするDNA配列との結合が、メチオニンをコ
ードできる如何なる介在コドン(即ち、AUG)をも含まないことを保証することが好
ましい。 該所定のタンパクをコードする配列および機能可能に結合したプロモータは、
直鎖分子またはより好ましくは閉じかつ共有結合した環状分子の何れかであり得
る、非-複製DNA(またはRNA)として、レシピエント原核または真核細胞内に導入で
きる。このような分子は自律複製できないので、該所定タンパクの発現は、該導入
された配列の一時的な発現を介して起こり得る。あるいはまた、永続的な発現も、
該導入された配列の該宿主染色体への組み込みを通して、起きる可能性がある。ウ
イルス内で所定のタンパクを発現させるために、プロモータと機能可能に結合し
た該ハイブリッド遺伝子は、典型的には該ウイルスのゲノムに組み込まれ、それは
RNAまたはDNAであり得る。ウイルス内へのクローニングは、周知であり、従って当
業者はこのようなクローニングを実施するための多くの技術を知っているであろ
う。
【００３９】 該導入されたDNAを染色体内に安定に組み込んだ細胞は、該発現ベクターを含む
宿主細胞の選別を可能とする、１種以上のリポータ遺伝子またはマーカーをも組
み込むことによって、選別できる。該リポータ遺伝子またはマーカーは、該宿主内
に栄養要求性(例えば、一般的な酵母栄養要求マーカーである、leu2またはura3)、
殺生物剤耐性、例えば抗生物質耐性または銅等の重金属に対する耐性等を補充す
ることができる。該選別可能なマーカー遺伝子は、発現すべき該DNA遺伝子配列と
直接結合してもよく、あるいは同時トランスフェクションにより同一の細胞内に
組み込むことも可能である。 mRNAの最適合成のためには、付随的なエレメントも必要となる。これらエレメン
トは、スプライシングシグナル、並びに転写プロモータ、エンハンサーおよび終止
シグナルを含むことができる。このようなエレメントを組み込んだ該cDNA発現ベ
クターは、Okayama, H. Mol. Cell Biol. 1983, 3:280およびその他の文献に記載
されたものを包含する。 もう一つの態様において、該導入された配列は、該レシピエント宿主細胞中で自
律複製できるプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれるであろう。多岐
に渡るベクターの任意のものをこの目的のために使用できる。特定のプラスミド
またはウイルスベクターを選別する上で重要なファクターは、該ベクターを含む
レシピエント細胞を認識し、かつ該ベクターを含まないレシピエント細胞からこ
れらを選別することの容易性、特定の宿主内で望ましい、該ベクターのコピー数、
および異なる種の宿主細胞間で、該ベクターを「シャトル」できることが望ましい
か否か、を含む。
【００４０】 本発明は、更に植物中の核酸を操作して、該植物内での、発芽、器官脱離、細胞伸
張、性別の決定、花または葉の老化、花の成熟、果実の熟成、昆虫、除草剤または病原
体に対する耐性、またはストレスに対する応答を調節し、制御しまたは変調するこ
とを可能とする方法をも、ここに規定する。好ましい一態様において、この方法は
、上記応答を活性化または増強し、一方でもう一つの好ましい態様では、この方法
は、上記応答を阻害または阻止する。 かくして、本発明の方法は、該GCC-ボックス結合活性が、阻止または阻害される
態様を規定する。「阻止」なる用語は、該エチレンシグナル経路における、ターゲッ
ト二次応答タンパクに対する、GCC-ボックス結合の停止を意味する。「阻害」なる用
語は、該阻害剤または記載された阻害法の利用なしに生育した植物、植物細胞、器
官、花または組織と比較して、GCC-ボックスの結合量における、または該ターゲッ
トエチレン応答細胞の、あるいは検出可能なERF１タンパクの発現量における統計
的に有意な減少を意味する。好ましくは、ERF１を遮断または阻害することにより、
該ERF１阻害剤は、GCC-ボックス結合を減じ、結果として該二次エチレン応答遺伝
子の発現を、少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、およびより一層好ま
しくは80%またはそれ以上および同様に好ましくは用量依存様式で、阻害または低
減する。このような阻止または阻害の効果は、このようなDNAまたはタンパク発現
生成物を含む植物または植物細胞の、該エチレン応答を遮断(不感受性化)または
阻害するであろう。
【００４１】 本発明のもう一つの好ましい態様では、これら要件を満たす阻害剤を同定した
後、該GGC-ボックス結合またはターゲット遺伝子発現を阻害する様式を同定する
ための、アッセイ手順を利用することが特に有用である。 エチレン不感受性植物は、疾病および病原体に対して耐性である。本発明の目的
にとって、疾病耐性は、植物または植物細胞の、ストレス、感染または傷に対して、
最少の損傷または工業的製品の収穫量における最少の減少量で、生存し続ける能
力である。疾病耐性を持つ植物は、かなりのレベルの感染を受ける可能性があるが
、殆ど壊死せずかつほんの僅かな病巣を持つか、あるいは全く病巣をもたない可能
性がある。これら植物または植物細胞の壊死性は低く、また水浸漬応答およびクロ
ロフィルの喪失は見かけ上存在しない。これに対して、耐性植物は、一般的に該病
原体の生育を制限し、かつ多数の見かけ上有害な病巣内の局所的な領域まで感染
を含む。 同様に、本発明の方法においては、また該エンハンサーまたは記載された増強法
の利用なしに生育された、植物、植物細胞、器官、花または組織と比較して、検出さ
れるGCC-ボックス結合の量、あるいは該ターゲットエチレン応答細胞または検出
可能なERF１タンパクの発現量における、統計的に有意な増加が見られた場合には
、該GCC-ボックス結合活性が開始され、刺激されまたは増強される。好ましくは、該
ERF１エンハンサーは、少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、より一層好
ましくは80%以上、また同様に好ましくは用量依存的様式で、結合能を高める。これ
ら要件を満たすエンハンサーを同定した後、該GCC-ボックス結合が増強される様
式を同定するアッセイ手順を利用することが、特に有利である。
【００４２】 本発明の特徴は、更にERF１の一部または全体の配向に対してアンチセンスであ
る核酸または植物GCC-ボックス結合能を持つペプチドをコードする遺伝子の単離
された処方物にある。このアンチセンス核酸は、対象とするターゲット遺伝子の発
現を阻害するのに十分な長さを持つべきである。該核酸の実際の長さは、該ターゲ
ット遺伝子および該遺伝子内のターゲットとなる領域に応じて変えることができ
る。典型的には、このような処方物は、その長さにおいて、少なくとも約15の連続す
るヌクレオチド、より典型的には少なくとも50、または50を越える連続するヌクレ
オチドに相当するものであろう。 本明細書で使用するように、核酸の配列は、発現される該配列が、該ERF１遺伝子
の非-コード性DNAストランドと相補的であり、かつ本質的に同一であるが、ERF１
をコードしない場合には、アンチセンスであると考えられる。「相補的」とは、２つ
の核酸、例えば２つのDNA分子間のサブユニット相補性を意味する。両分子中のあ
るヌクレオチド位置が、通常は相互に塩基対を形成できるヌクレオチドによって
占有されている場合、これら核酸は、互いに相補的であるといわれる。従って、２つ
の核酸は、該分子各々における対応する位置のかなりの数(少なくとも40%または
少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、もしくはより好ましくは少なくとも70
%または80%、またはより一層好ましくは少なくとも90%、または少なくとも99%)が、
通常は相互に塩基対を形成できるヌクレオチドによって占有されている場合には
相補的である。
【００４３】 本発明のさらに別の局面では、ERF1のようなGCC-ボックス結合性ペプチド又は
ポリペプチドに向けられる抗体提供され、エチレンシグナル経路の二次応答タン
パク質のGCC-ボックスを結合し、それによって、それらの発現を遮断又は調節す
ることができる。このような抗体は、全分子、そのＮ−若しくはＣ−末端、又は
内部に特異的である。このような抗体を生成する方法は技術的に周知である。 機能的に同等の抗体を含む、植物ERF1ポリペプチドに特異的な抗体に関する実
施形態では、用語「機能的に同等の」とは、抗体として同一の抗原決定基に特異
的に結合し、それによって分子、例えば単鎖抗原結合性分子のような抗体様の分
子を中和できるいずれの分子をも意味する。
【００４４】 さらに、本発明は、遺伝子導入植物であって、ERF1がコードされた単離DNA又
は該植物のエチレンシグナル経路内の二次エチレン応答遺伝子の発現を活性化で
きるGCC-ボックス結合性タンパク質を包含する遺伝子導入植物を含む。例えば、
本発明の少なくとも１つの実施例では、ERF1の添加によってレスキューされた酵
母菌cccΔ導入遺伝子を包含する遺伝子導入Arabidopsis植物が提供され、その遺
伝子は発現されると、該植物に、本来の酵母菌遺伝子から欠失されていた能力、
すなわちエチレンの存在を認識する能力を与える。 ここで用いられる「遺伝子導入植物」は、種子、子孫等を含む植物、植物細胞
、組織、花、器官、又は植物のいずれかの部分であって、その中に挿入された遺
伝子を含み、該遺伝子は組換えDNA技術によって操作されて該植物細胞中に挿入
されたものを意味する。操作された遺伝子は「導入遺伝子」と言われる。ここで
、「非遺伝子導入」であるが、実質的にホモ接合性の「野生型植物」は、遺伝子
導入植物が生成された植物の遺伝子導入されていない植物を意味する。遺伝子導
入転写生成物は、上述のように、アンチセンス方向にも配向されうる。
【００４５】 ERF1のようなエチレン誘発性標的遺伝子の発現を活性化、遮断又は調節可能な
GCC-ボックス結合性分子をコードするセンス又はアンチセンスDNAを包含する遺
伝子導入植物は、所望のDNA配列をコードするプラスミド、リポソーム、又は他
のベクターを有する植物を形質転換することによって達成されうる。このような
ベクターとしては、上述したように、限定するものではないが、CaMV 35Sプロモ
ーターのような強い構成性プロモーター又は誘発性プロモーターの制御下に置か
れたセンス又はアンチセンス鎖を含む非武装のアグロバクテリウム腫瘍誘発（Ti
）プラスミドが挙げられる。このような構成物の生成方法、植物の形質転換及び
植物の再生方法は、問題の遺伝子の配列が分かれば、例えば、Ausubelら,1993,C
urrent Protocols in Molecular Biology,Greene & Wilkey,New Yorkに記載され
ているように、技術的に周知である。
【００４６】 本発明により、本発明の範囲に包含される植物は、植物界の高等植物及び低級
植物の両方を含む。ロゼット段階植物を含む成熟植物、及び実生が本発明の範囲
に包含される。従って、成熟植物は、実生を過ぎた発生のいずれの段階の植物を
も包含する。実生は非常に若く、発生の初期段階の未成熟植物である。 RTF3の活性化、又は発現に影響するERF1遺伝子若しくはerf1変異体、又はEIN3
遺伝子若しくはein3変異体（eil変異体を含む）で特徴付けられた表現型を有す
る遺伝子導入植物も本発明の範囲に包含される。
【００４７】 ERF1又はGCC-ボックス結合性に影響されて、エチレンシグナル系の二次エチレ
ン応答遺伝子の発現を調節する本発明の好ましい植物としては、限定するもので
はないが、栽培プラクティスが既に完成されている高収率の作物種（モノコット
(monocots)及びジコット(dicots)、例えばアルファルファ、カシュー、綿、ピー
ナツ、ファバマメ(faba bean)、フレンチマメ(french bean)、リョクトウ、エン
ドウマメ、クルミ、トウモロコシ、ペチュニア、ジャガイモ、テンサイ、タバコ
、オートムギ、コムギ、オオムギ等を含む）、又は加工特産種が挙げられる。特
に好ましい植物は以下に由来する植物である：Umbelliferae科、特にDaucus属(
特にcarota種、ニンジン)及びApium(特にgraveolens dulce種、セロリ)等；Sola
nacea科、特にLycopersicon属、特にesculentum種(トマト)及びSolanum属、特に
tuberosum種(ジャガイモ)及びmelongena(ナス)等、及びCapsicum属、特にannum
種(ペッパー)等；及びLeguminosae科、特にGlycine属、特にmax種(ダイズ)等；
及びCruciferae科、特にBrassica属、特にcampestris種(チューリップ)、olerac
ea cv Tastie（キャベツ）、oleracea cv Snowball Y（カリフラワー）及びoler
acea cv Emperor（ブロッコリ）等；Compositae科、特にLactuca属、かつsatira
種（レタス）、及びArabidopsis属、特にthaliana種（Thale cress）等。これら
系統の中で、より好ましくは、葉の多い野菜、例えば、Cruciferae科、特にArab
idopsis属、最も好ましくはthaliana種である。
【００４８】 特に好ましい植物としては、幹上の花の寿命（器官脱離遅延）が特に妥当なバ
ラ、カーネーション、キク、ゼラニウム等のような顕花植物が挙げられ、かつ特
にゼラニウムのような装飾顕花植物が挙げられる。加えて、好ましい植物として
は、植物の葉柄の寿命（器官脱離遅延）が特に妥当なイチジク、ヤシ等のような
緑の観葉植物が挙げられる。このような植物の遅延開花も有利である。同様に、
他の好ましい植物としては、ペクチン分解酵素が器官脱離プロセスで関与するバ
ナナやオレンジのような果実植物が挙げられる。
【００４９】 本発明は、ストレスを受けた植物に利益がある。ストレスは、限定するもので
はないが、細菌、ウィルス、カビのような病原体の結果としての感染、及び老化
、創傷治癒及び土壌浸透に伴う状態を含む。細菌感染としては、限定するもので
はないが、Clavibacter michiganense(正式にはCoynebacterium michiganense)
、Pseudomonas solanacearum及びErwinia Stewartii、さらに詳細にはXanthomon
as campestris（特にpathovars campestris及びvesicatoria）、Pseudomonas sy
ringae（特にpathovarsトマト、maculicola）が挙げられる。
【００５０】 細菌感染に加え、本発明の範囲内の植物ウィルス性及び真菌性病原体としては
、限定するものではないが、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウ
イルス、カブクリンクルウイルス、カブイエローモザイクウイルス、Phytohthor
a indestans、Peronospora parasirica、Rhizoctonia solani、Botrytis Cinere
a、Phoma lingam（Leptoshaeria maculans）、及びAlbugo candidaを含むカビが
挙げられる。 植物エチレンシグナル経路内の酵素のカスケードの変異体の連続的な単離によ
って、本発明に従い、機能的なエチレンリポーターのアセンブリ、及びこのガス
状ホルモンの成熟、ストレス又は病原体制御因子に応答する植物の制御メカニズ
ムとしての使用に必要な付加的遺伝子を同定できる。 以下の実施例で、発明をさらに説明する。これら実施例は、特許請求の範囲を
制限するものと解釈すべきではない。
【００５１】実施例 系統及び成長条件 以下の実施例で用いたすべての変異体及び遺伝子導入植物に、Arabidopsis生
態型Columbia（Col-0）が存在した。三重応答スクリーンは、Guzman及びEcker,P
lant Cell 2:513-523(1990)に以前に記載されているように行った。空気及びエ
チレン中での植物の成長は、Kieberら,1993に以前に記載されているように行っ
た。
【００５２】核酸分析 全RNA抽出及びノーザン分析は、Reuberら,Plant Cell 8:241-249(1996)及びCh
aoら,1997に記載されているように行った。β−グルクロニダーゼ活性は、18時
間、リン酸ナトリウム緩衝液中の該酵素の基質（Gluc.,１mg/ml）と共に植物を
インキュベーションして分析した。ERF1に対応するｃDNAクローンは、λZAPII（
Keiberら,1993）の任意の大きさのｃDNAライブラリのハイブリダイゼーションに
よって単離した。タバコEREBP1遺伝子のフラグメントに対応するプローブは、以
下のプライマーを用いてPCR増幅によって得た。 EREBP1f：5' CACGCCATAGACATAATAC3'（配列番号：３）及び EREBP1r：5' GCTACGATTCCTGTTCCTTCAG 3'（配列番号：４）。
【００５３】 ERF1ゲノム配列は、２つのBACゲノムライブラリ（TAMUとIGF）（Choiら,Weeds
World 2:17-20(1995)）のハイブリダイゼーションで単離した。ERF1の地図位置
は、特異的なプライマーを用いてYACプールのPCR増幅によって得た。PCRは、両
方ともABI3コンティグに位置する２つのYACクローン（CIC12H5とCIC12H6）を強
調した。
【００５４】 実施例１：ERF1遺伝子の特徴付け及びその発現生成物タンパク質合成及びDNA分析 全長ERF1、EIN3及びEIN3欠失誘導体は、Solanoら,J.Biol.Chem.272:2889-2895
(1997)に記載のフレキシ−ラビット網状赤血球ライセート系（PromegaTM）を用
いて、インビトロ翻訳（又は二量体化実験で共翻訳）によって生成した。プロモ
ーターフラグメント及びオリゴヌクレオチドのPCR及びクレノウ標識化、DNA結合
反応及び電子泳動モビリティシフト分析は、Solanoら，EMBO J. 14:1773-1784(1
995)に記載されているように行った。Arabidopsisのプロモーターフラグメント
及びGCC-ボックスを含有するマメ塩基性−キチナーゼ（CHI）遺伝子は、以下の
オーバーラッププライマーのクレノウ充填によって得た： b-CHI前進：5' GTTGATCACGAACCCGCCGCCTCATATTCATAATTA3'（配列番号：5）; b-CHI変異体：5' GTTGATCACGAACCCGTTGTTTCATATTCATAATTA3'（配列番号：6）; b-CHI復帰：5' TTTAACTTTAATTATGAATATGA3'（配列番号：7）; CH5B前進：5' CTTCACGCTTGGGAAGCCGCCGGGGTGGGCCCGCAG3'（配列番号：8）; CH5B変異体：5' CTTCACGCTTGGGAAGTTGTTGGGGTGGGCCCGCAG3'（配列番号：9）;
及び CH5B復帰：5' AAACCTTTCTGCGGGCCCACCCC3'（配列番号：10）。 競合実験で使用するEBSの変異体バージョンの配列は、以下の通りである： EBSm1：5' GTTGTTTGGGATTCTTCGGGCATGTATCTTGAATCC3'（配列番号：11）;及び EBSm2：5' GTTGTTTGGGATTCAAGCCCCATGTATCTTGAATCC3'（配列番号：12）。
【００５５】植物形質転換 ERF1 cDNAの0.8kb BamHI-KpnIフラグメントを、BamHI-KpnI-消化pROK2にクロ
ーン化した（Baulcombe,Nature 321:446-449(1983)）。上記構成物を含有するAg
robacterium tumefaciensを用いてArabidopsis生態型Col-0及びエチレン非感受
性変異体ein2-5、ein2-17、ein2-26、ein3-1、ein3-3及びein5-1を、インプラン
タ(in planta)真空浸潤によって形質転換した（Bechtoldら,C.R.Acad.Sci.Paris
Life Sci. 316:1194-1199(1993)。カナマイシン耐性（kanR）T1植物は、100μg
/mlカナマイシンを補充したMS培地上に種子をプレートし、かつkanR実生を土壌
に移行することによって選択した。
【００５６】酵母菌形質転換及び「２−ハイブリッド」スクリーニング 酵母菌株Y190は、Gietzら,Nucleic Acid.Res. 20:1425(1992)に記載のように
、PEG/リチウムアセテート法で形質転換した。成長条件、スクリーニング手順及
びβ-ガラクトシダーゼ活性のフィルタ−リフト分析は、Kimら,Proc.Natl.Acad.
USA 94:11786-11791(1997)に記載のように行った。GenBank受入れ番号 本発明で同定されたERF1 cDNA及びゲノム配列のGenBank受入れ番号は、それぞ
れAF076277及びAF076278である。
【００５７】ERF1のクローニング及び特徴付け EIN3/EILタンパク質の標的を同定し、かつエチレンシグナル経路内でのEREBPs
の役割を調査するため、PCRに基づいたアプローチを用いてArabidopsis内のEREB
P系のメンバーを単離した。タバコEREBP1配列に相補的なオリゴヌクレオチドを
用いて(Ohme-Takagiら,1995)、597bpフラグメントをタバコゲノムDNAから増幅し
、このフラグメントを用い、低厳密性下、Arabidopsis cDNAライブラリをスクリ
ーニングした。 生成したポジティブクローンの中で、２分類のcDNAsがタバコEREBP1/2及びERE
BP3/4遺伝子に高い相同性を示した。全RNAは、空気中で成長させて種々の時間（
０〜48時間）エチレンガスにさらして４週間経ったCol-0(Ｗ)又はein3-1(Ｍ)植
物から単離した。図２Ａ及び２Ｃのレーン毎に30μgの全RNAを装填し、図２Ｂで
は、60μg/レーンを装填した。
【００５８】 エチレン−応答−因子１（ERF1）と呼ばれる１つの遺伝子が、エチレンに対す
る応答で迅速な誘発を示した。さらに重要なことに、植物のホルモン処理の15分
後、ERF1 mRNAが蓄積し始めた。図２Ａに示されるように、ERF1 mRNAの誘発は、
機能性EIN3の存在にも依存した。 ERF1誘発の速度論と公知のエチレン誘発性遺伝子の速度論を比較するため、同
一ブロットをデフェンシン遺伝子系のメンバー、PDF1.2でハイブリダイズした（
Penninckxら,1996）。予想どおりに、ERF1がこれら遺伝子の制御因子の場合、最
大のERF1発現はPDF1.2より早く生じた（図２Ａ）。
【００５９】 エチレン経路遺伝子EIN3、EIL1又はEIL2の過剰発現が、すべての公知のエチレ
ン応答遺伝子及び表現型の活性化を引き起こすので、ERF1の発現を調査した。そ
のレベルは、外因性エチレン処理によって達成されるレベルよりいくらか低かっ
たが、ERF1 mRNAは、35S::EIN3-発現遺伝子導入植物で構成的な高レベルの発現
を示し（図２Ｂ）、当該EIN3がERF1発現に十分であることを表している。まとめ
ると、結果は、EIN3が初期のエチレン応答遺伝子ERF1、新規なAP2/EREBP−型DNA
結合性タンパク質の発現に必要かつ十分であることを実証している。
【００６０】 ERF1が一次エチレン応答遺伝子であることを確認するため、Lamら,EMBO J. 8:
2777-2783(1989)及びAbelら,J.Mol.Biol. 251:533-549(1995)に記載のように、
シクロヘキシミドを用いてタンパク質合成にＳ依存のホルモンによる誘発を試験
した。シクロヘキシミド処理が、エチレン誘発性をマスクするエチレン処理によ
って観察された発現よりも、少なくとも20〜50倍、ERF1の発現を誘発することが
分かった（図２Ｃ）。 ERF1は、ERF1特異性プライマーを用いたYACプールのPCR増幅によって、ABI3コ
ンティグ内の染色体IIIにマッピングされた。EIN3以外は、この領域にマッピン
グされた公知のエチレンシグナル変異体はなかった。
【００６１】実施例２：ERF1は、エチレンガスシグナル経路の下流成分である 数種の植物系におけるエチレン制御遺伝子のホルモン制御を理解するための以
前の努力が、２種類のエチレン応答エレメント（EREs）の同定を導いた。EREの
１つのタイプは、老化の際に誘発される遺伝子のエチレン制御発現の原因である
ことがわかった（Itzhakiら,1994）。第２エレメント、「GCCボックス」は、病
原体の攻撃への応答でエチレン誘発性に必要とされることが確認された（Deikma
n,1997によるレビュー）。該GCCエレメントに対する結合能力に基づき、DNA結合
性タンパク質の系統（EREBPs）がタバコ中で同定された（Ohme-Takagiら,1995）
。これら遺伝子が、エチレンによる処理で、それ自体転写的に活性化されるとい
う事実は、それらがEIN3/EILタンパク質と塩基性キチナーゼのような下流エフェ
クター遺伝子との間の中間段階として作用することを示唆した。
【００６２】 EIN3の標的を同定するため、Arabidopsis EREBP系統のメンバーをクローン化
して特徴付けした。ERF1は、エチレンガスに応じて迅速に誘発され、かつエチレ
ン経路変異体ctr1の存在で構成的に発現された。ein3-1変異体では何も発現が検
出されなかったので、ERF1のエチレン誘発は、完全に機能性EIN3タンパク質に依
存する。さらに、EIN3を過剰発現する遺伝子導入植物は、ERF1 mRNAの高レベル
発現を示した。 この結果は、EIN3がERF1発現に必要かつ十分であることを示しており、ERF1が
EIN3の直接的な標的であるという結論と一致する。EIN3過剰発現植物におけるER
F1 mRNA発現のレベルは、ctr1変異体又はエチレン処理された野生型植物におけ
るレベルよりもいくらか低かった。これは、EIN3がERF1発現には十分であるが、
完全なエチレン依存性ERF1誘発には他の因子が必要であることを示している。
【００６３】 「２−ハイブリッド」スクリーンで、EIN3を「おとり」として用いて、EIN3と
相互作用するDNA結合性タンパク質を同定した。このタンパク質は、配列特異的
様式でERF1プロモーターにも結合し、EIN3のパートナーとしてその役割を示して
おり、かつエチレンに応じた完全なERF1発現に対するその重要性を示唆している
。
【００６４】 EREBP系統のいずれのメンバーについても、機能損失突然変異は報告されてい
なかった。この発見は、これら遺伝子の30以上がArabidopsis中で同定されたと
いう事実と共に、EREBP系統のメンバー中の機能的重複性を示唆している。機能
的に重複した遺伝子の場合、機能損失対立遺伝子は表現型を示さない。このこと
の明白な例は、Arabidopsis中のエチレンリポーターの研究で提供されている（H
ua及びMeyerowitz,Cell(1998)）。５個のETR1関連遺伝子の各エチレンシグナル
経路の密接な関係は、主要な変異体の同定（又は部位特異性変異誘発による創製
）によって作られた（Changら,Science 262,539-544(1993)；Huaら,1995；Huaら
,Plant Cell,1998；Sakaiら,1998）。これら遺伝子中の単一の機能損失変異は、
エチレン応答の欠損を示さないが、三重及び四重変異体は構成的なエチレン応答
表現型を示し、エチレン応答が該レセプターによってネガティブに制御されてい
ることを明らかにしている（Hua及びMeyerwitz,Cell,1998）。
【００６５】 この理由のため、機能増加戦略を使用して、ERF1のインビボ機能に焦点を当て
た。T-DNA又はCaMV 35Sプロモーターを保有するトランスポゾンエレメントによ
って得られた機能増加変異体は、遺伝子のインビボ機能を判断するための強力な
ツールであることが判明した。構成的なERF1発現の結果、機能損失ctr1変異体、
EIN3若しくはEIL1を過剰発現する植物又はエチレン中で成長した植物によって提
示されたものに非常に類似した実生及び成熟表現型が生じた。
【００６６】 しかし、いくつかの重要な相違が、EIN3過剰発現植物とERF1過剰発現植物との
間に観察された。ERF1過剰発現は、胚軸及び根細胞の伸長の阻害を引き起こすが
、実生は誇張された根端フックを欠乏している。この観察と一致して、ERF1遺伝
子導入植物ではHOOKLESS1が誘発されなかった。他のEREBP系統のメンバーは、こ
れら標的遺伝子の活性化の原因となると考えられる。 実際に、構成的にEREBPを発現するトランスポゾン誘発型の機能増加変異体（t
iny）は、部分的なエチレン応答を想起する実生表現型を提示し（Wilsonら,1996
）、TINYがエチレンシグナルでERF1のパートナーであることを示唆している。代
わりに、ERF1は、いくつかのプロモーターの活性化において他の酵素と呼応して
作用しうる。
【００６７】 実施例３：ERF1のプロモーター内のEIN3の配列特異的結合 核タンパク質EIN3がDNA結合できるかどうかを調べるため、インビトロ翻訳EIN
3タンパク質及びERF1遺伝子の5'プロモーター領域を用いて、電気泳動モビリテ
ィシフト分析（EMSA）を行った。ERF1プロモーターを含む６kbフラグメントは、
ゲノム配列（BACF11F14）から単離して、pBluescriptTMにサブクローン化した。
ERF1翻訳開始部位の約1.4kb下流を覆う５個のオーバーラップフラグメントを、P
CRで増幅して放射能標識した。図３Ａに示されるように、フラグメント（-1238
〜-950）の１つを、EIN3含有網状赤血球ライセートと共にインキュベートした場
合、より遅い移動バンドが観察された。-1238〜-950フラグメントへのEIN3の結
合性は、500倍過剰のポリ-(dIdC)又は-(dAdT)に匹敵せず、EIN3-DNA相互作用の
特異性を示している。その特異的に遅延されたバンドは、dIdCと競合されたレー
ンよりも dAdTと競合されたレーンでより強いことが再現され、EIN3標的配列がG
Cリッチであることを示唆している。
【００６８】 さらにEIN3標的部位の境界を定めるため、このフラグメントを再分割し、かつ
各サブフラグメントを結合性実験に供した。サブフラグメントの１つだけ（-121
3〜-1179）がEIN3によって特異的に認識され、さらにその配列特異性を確証した
（図３Ｂ）。 EIN3が実際にモビリティシフトバンド内に存在するタンパク質であることを実
証するため、一連の先端を切り取ったEIN3誘導体を生成し、36bp EIN3結合性フ
ラグメントを用いて結合性及びEMSAに供した。先端を切り取ったタンパク質のそ
れぞれの分子量に相関するモビリティシフトが観察され、タンパク質-DNA複合体
中のEIN3の存在を確認した（図３Ｂ）。DNA-結合能力を保持する最小のタンパク
質は、EIN3Δ269であり、アミノ酸１〜359に対するEIN3-DNA-結合ドメインの境
界を定めている。
【００６９】 さらに、ein3-3対立遺伝子（Lys245〜Asn）によってコードされたアミノ酸置
換を含むEIN3の変異体バージョンは、対応mRNAのインビトロ翻訳によって生成さ
れた。ein3-3変異体におけるアミノ酸置換は、EIN3タンパク質の塩基性ドメイン
III内に位置した。興味深いことに、変異体EIN3-3タンパク質は、36bp標的部位
を認識できなかった（図３Ｂ）。 EIN3がDNAとの複合体中のタンパク質であるというさらなる証拠は、抗-EIN3抗
体を用いたEIN3-DNA-結合の競合によって得られた。抗-EIN3抗体を含む結合反応
混合物では、モビリティシフトが観察されなかった。対照的に、免疫前血清を添
加してもゲルシフト分析に何ら影響しなかった（図３Ｃ）。さらに、抗-EIN3抗
体によるバンドシフトゲルのイムノブロットにより、該抗体がその低速移動複合
体と同一のモビリティのバンドを強調したので、EIN3が関連バンド内のタンパク
質であることを確認した。
【００７０】 短いDNA分子を用いたEMSA実験では、全長EIN3タンパク質は、２つのモビリテ
ィシフトバンドを生成したのに対し、その欠失誘導体は、１つのバンドだけを遅
延させた。EIN3インビトロ翻訳反応ではいくつかの副生成物が得られたので、上
流バンドは、明らかに全長EIN3に対応し、かつ下流バンドは先端を切り取られた
EIN3誘導体に対応していた。 その上、さらなる実験により、EIN3タンパク質のソースは、そのDNAを結合す
る能力に影響しないことが実証された。インビトロ翻訳タンパク質についてのよ
うに、バキュロウィルス発現EIN3も標的配列を含む36bpフラグメントを認識した
。さらに、この場合、１つの主要なモビリティシフトバンドのみがEMSAで観察さ
れた。
【００７１】 EIN3結合の配列要求をさらに正確に定義するため、36bpフラグメントの走査突
然変異誘発を行った。図４Ａ及び４Ｂに示されるように、その標的部位に対して
EIN3のアフィニティを及ぼすすべての変異は、中心のコア配列によって分離され
た２つのパリンドロームリピートを含む28bp配列内に存在する。コア配列内の単
一の変異が、結合を完全に破壊しており、この配列がEIN3認識に必要であること
を示している。両パリンドロームリピートに影響する変異が、大きくEIN3結合を
減らしており、それらも相互作用の重要な決定因子であることを確証している
【００７２】 興味深いことに、EIN3結合部位は、トマトE4（Montgomeryら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 90:5939-5943(1993)）、及びLEACO1遺伝子（Blumeら,Plant J.12:731-7
46(1994)）、及びカーネーションGST1遺伝子（Itzhakiら,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 91:8925-8929(1994)）、（図４Ｂ）におけるエチレン応答性に必要なプロモ
ーター領域内にある配列に対して有意な類似性を示す。GST1では、この配列を含
む197bpプロモーターフラグメントも、過渡応答分析で最小のCaMV 35Sプロモー
ターに、エチレン応答性を与えるのに十分だった（Itzhakiら,1994）。
【００７３】 さらにその標的部位への結合の特異性を調べるため、過剰の未標識のEIN3結合
部位(EBS)、又はEIN3によって認識されない２つの変異バージョン（EBSmlとEBSm
2）を用いて競合実験を行った。図５Ａ及び５Ｂを参照せよ。各レーンは、１ナ
ノグラムの標識化EBSを含む。図５Ａに示されるように、EIN3-EBS複合体の形成
は、EBS変異体バージョンのいずれによるよりも過剰の未標識化EBSによって、よ
り十分に競合しており、EIN3-EBS相互作用が配列特異的であるという知見をさら
に支持している。図５Ｂは、Chaoら,1997から適応されているように、EIN3構造
図とEMSA実験で用いた変異体の概要を示す。
【００７４】 実施例４：EIN3は、ERF1の発現を制御する新規なDNA結合性タンパク質である EIN3及びEILタンパク質は、いずれの公知のタンパク質との類似点も共有しな
いが、それらの核配置、結合に適する保存塩基性ドメインや酸性領域及び活性化
ドメインの存在は、それぞれそれらの転写因子としての役割を特徴付ける（Chao
ら,1997）。インビトロ翻訳及びバキュロウィルス発現EIN3タンパク質によるDNA
-結合性分析は、EIN3が、ERF1プロモーターの特異的配列に結合することを示し
た。先端が切り取られた形態の該タンパク質又はEIN3に対する抗体によるEMSA実
験により、DNAタンパク質複合体中のEIN3の存在を確認した。他方、EIN3のein3-
3対立遺伝子に対応する変異体タンパク質は、その標的配列を認識できなかった
。この変異体は、塩基性ドメインIIIのLysのAsnへの置換から成り、DNA結合モチ
ーフの一部を形成しうる。
【００７５】 EIN3/EIL系統に属する２つの付加的タンパク質、EIL1及びEIL2も、ERF1のプロ
モーター中のEIN3標的を特異的に認識できた。この結果と一致して、これら遺伝
子のいずれかが遺伝子導入植物内で過剰発現するとein3-1変異を補完できるので
（Chaoら,1997）、EIN3は、EIL1又はEIL2によって機能的に置換できる。EIN3の
欠失分析により、そのDNA-結合ドメインが該タンパク質のＮ-末端の半分内であ
ることを確証できた。この領域は、該系統の全４メンバーの中で最も保存され、
かついずれの従来公知のDNA-結合モチーフも含まない。EIN3/EIL DNA-結合ドメ
インは、タンパク質の構造解析によってさらに特徴付けられるだろう。それにも
かかわらず、これら４つのタンパク質（EIN3、EIL1、EIL2及びEIL3）は、最近同
定された第５の相同体（EIL4）と共に、いくつかの予想されたα-ヘリックスを
所有し、その２つは、DNA相互作用表面を提供する塩基性アミノ酸に富んでいる
。
【００７６】 標的部位を含むDNAフラグメントの走査突然変異誘発は、EIN3/EIL相互作用に
必要な配列の決定を可能にした。定義された標的部位は２つの反転リピートを含
んでおり、ダイマーとして該タンパク質によって認識される。興味深いことに、
EIN3結合部位は、エチレン応答性に必要かつ十分であると定義されたカーネーシ
ョンGST1遺伝子のプロモーター領域内の配列との有意な同一性を共有する。その
保存配列は、トマトE4及びLEACO1遺伝子のエチレン応答性に必要なプロモーター
領域内にも存在する。このことは、EIN3標的部位が、EIN3のオルトログ(ortholo
gs)もあるいろいろな種に保存されている一次エチレン応答エレメント（PERE）
を意味することを示す。
【００７７】 この決定と一致して、このエレメント（E4）を含む遺伝子の１つは、以前に一
次エチレン応答遺伝子として同定された（Lincolnら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4:2793-2797(1987)）。GCCエレメントは、EREBP系統の亜群のタンパク質によっ
て制御されるエチレン制御遺伝子（例えば、病原関連遺伝子、HOOKLESS1及びい
くつかのEREBPs）のサブセット中にのみ存在する二次エチレン応答エレメント（
SERE）であると考えられる。
【００７８】 実施例５：EIN3は、その標的をホモダイマーとして認識する EIN3標的部位内のパリンドロームリピートの存在は、EIN3がダイマーとしてそ
の標的と相互作用することを示唆した。この問題を取り扱うため、Hopeら,EMBO
J. 6:2781-2784(1987)のアプローチを利用して、全長EIN3及びいくつかのカルボ
キシル末端欠失誘導体を、単独で又は対方向に組み合わせてインビトロ翻訳した
。その結果の翻訳又は共−翻訳生成物を、EBSへのDNA結合性について試験した。
図６Ａに示されるように、全長EIN3及びDNAに結合された欠失誘導体に対応する
バンドに加え、その共−翻訳生成物が使用されると、中間モビリティのバンドが
現れた。この中間バンドは、ヘテロダイマーのモビリティシフトに対応しており
、これらタンパク質がダイマーとしてEBSに結合することを確証している。
【００７９】 EIN3がダイマーを形成する能力を有するというさらなる証拠は、酵母菌「２−
ハイブリッド」系を用いてEIN3−相互作用タンパク質をスクリーニングすること
によった（Fieldら,Nature 340:245-246(1989)；Durfeeら,Genes Dev. 7:555-56
9(1993)）。EIN3が転写活性化因子であることと一致して、全長タンパク質のGAL
4 DNA-結合ドメイン（BD）との融合が、LacZリポーター遺伝子の転写を活性化し
、EIN3が酵母菌内で機能的である活性化ドメインを所有することを示している。
このリポーター遺伝子の活性化を回避するため、GAL4-BDに融合されたアミノ酸5
3〜257を含有するEIN3誘導体を「おとり」として使用した。「エサ」として、GA
L4-活性化ドメインを、暗中退色された実生由来のmRNAによって構成されたArabi
dopsis cDNAライブラリに融合した（Kimら,1997）。「おとり」構成物によって
形質転換された酵母菌株 Y190は、引き続き「エサ」で形質転換され、かつKimら
(1997)に記載されているように、400万の独立的な形質転換体が、ポジティブ相
互作用についてスクリーニングされた。
【００８０】 26個の独立したポジティブクローンを得た。プラスミドを回収し、それらのcD
NAを配列決定した。それらの中で、６個の異なるクローンがEIN3に対応していた
。すべてのポジティブは、最初の「おとり」と回収された「エサ」の両方で直接
酵母菌を形質転換することによって再試験した。図６Ｂは、EIN3のアミノ酸113
〜628を含むこれらポジティブの１つとの相互作用の例を示す。「おとり」はEIN
3残基53〜257を含むので、その二量化ドメインは、アミノ酸113と257の間に存在
するように局在化された。これら結果は、EIN3-結合ドメインとDNAとの相互作用
がタンパク質の二量化に必要ないことを確認した。
【００８１】 EIN3/EIL系統の他のメンバーもDNAを結合できるかどうか調べるため、インビ
トロ翻訳されたEIL1、EIL2及びEIL3タンパク質、及びEBS又は変異体バージョン
を含有するDNAフラグメントを用いてEMSA実験を行った。EIL1とEIL2の遺伝子導
入植物内でのein3-1変異を補完する能力は一致したが、EIL3は一致せず、EIL1と
EIL2の両方が特異的にEBSエレメントを認識できたが、EIL3はできなかった（図
６Ｃ）。 EIN3及びEILsがヘテロダイマーを形成できるかどうかを試験するため、共−翻
訳されたEIN3/EILsタンパク質のすべての組合せを用いて、DNA結合性実験を行っ
た。EIN3、EIL1及びEIL2のホモダイマー形態の位置に対応するモビリティシフト
バンドが観察されたが、中間モビリティを有するDNA-タンパク質複合体は見られ
ず、これらタンパク質がヘテロダイマーを形成しないことを示している。
【００８２】 実施例６：ERF1はGCC-ボックス結合性タンパク質である 前記実施例は、EIN3がERF1発現に必要かつ十分な転写活性化因子であることを
例証した。従って、ERF1はGCCエレメント含有標的遺伝子の発現を方向づける役
割を演じると予想された。しかし、冷却応答及び乾燥応答の制御に関与する少な
くとも１つのEREBPは、GCCエレメント（すなわち、Ｃ-ボックス/DREエレメント
：Stockingerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:1035-1040(1997)）に無関係のDNA
配列を結合することが知られている。
【００８３】 ERF1が、配列特異的方法でGCCエレメントと相互作用可能な機能性DNA結合ドメ
インを含むかどうかを決定するため、インビトロ翻訳されたERF1タンパク質で、
DNA-結合性実験を行った。エチレン制御Arabidopsisの塩基性キチナーゼ（Samac
ら,1990）及びマメキチナーゼ5B遺伝子（Broglieら,1989）の放射能標識化プロ
モーターフラグメントを、ERF1と共にインキュベートし、EMSAで分析した。この
相互作用の特異性を調べるため、GCCボックスエレメントのシトシンがチミンで
置換された、プロモーターフラグメントの変異バージョンをも使用した。
【００８４】 図７に示されるように、ERF1は、GCCエレメントを含有するプロモーターフラ
グメントを特異的に結合できたのに対し、変異体配列では何らの結合も観察され
なかった。ERF1及び野生型エレメントを含有する各レーンの下流バンドは、２つ
の主要バンドがERF1 mRNAのインビトロ翻訳の生成物として得られたので、明ら
かにERF1の先端が切り取られた形態に対応している。
【００８５】 実施例７：ERFによるエチレン応答の下流活性化 エチレンシグナル経路におけるERF1の役割をさらに評価するため、CaMV 35Sプ
ロモーターの制御下で構成的にERF1 mRNAを発現する遺伝子導入植物を構成した
。これら遺伝子導入系統のT2分離個体を、エチレン応答表現型について調べた。 全26の独立した系統から、９系統由来の植物は、構成的なエチレン応答変異体
ctr1、又はEIN3-若しくはEIL1-過剰発現植物で観察されたのと同様の表現型を提
示した。ハイドロカーボンのない空気中で成長した暗中退色された35S::ERF1実
生は、エチレン処理に対する典型的な応答である根及び胚軸の伸長の阻害を示し
た（図８Ａ〜Ｈ）。しかし、根端フックは典型的なエチレン応答である誇張され
た弯曲を提示しなかった。ERF1発現実生の子葉は未熟であり、かつ多くはまだ種
皮に包まれていた。
【００８６】 この表現型と一致して、HOOKLESS1、根端フック湾曲に必要なエチレン応答遺
伝子（Lehmanら,Cell 85:183-194(1996)）は、ERF1-過剰発現植物では発現され
なかった。これら系統内における部分的な実生の三重応答表現型のみの発現は、
エチレン応答のサブセットの媒介におけるERF1の役割と一致する。ERF1は、他の
遺伝子、例えばEREBPs等と共に作用して、種々の実生のエチレンに対する応答を
完全に媒介できる。 成体として、35S::ERF1遺伝子導入植物は、構成的なエチレン応答変異体ctr1
及びEIN3/EIL1-過剰発現植物と同様の極端に萎縮した表現型を示した（図９Ａ〜
Ｇ）。四重エチレンレセプターノックアウト変異体の場合のように（Hua及びMey
erowitz,Cell,1998）、数種のERF1-発現系統由来の植物は、細胞伸長の極端な阻
害を示し、かつ最終的にはふるい分け前にしおれて死んでしまった。
【００８７】 これら植物によって提示される「エチレン」形態学が、エチレンの過剰生産の
結果なのか、又はシグナル経路の構成的な活性化に起因するのかを決定するため
、35S::ERF1遺伝子を、エチレンの過剰生産の結果生じる表現型を抑制するいく
つかの変異体バックグラウンド（ein2-5、ein2-17、ein2-26、ein3-1、ein3-3及
びein5-1）中にも導入した。すべての場合、遺伝子導入植物は、35S::ERF1-発現
野生型植物と区別がつかない形態学を提示した（図９及び１０）。このように、
されたERF1の発現によって惹起された形態学は、エチレン生産の結果ではなく；
むしろCaMV 35S::EIN3発現のように、その形態学は応答経路の構成的な活性化の
結果だった。さらに、構成的な活性化表現型に対して機能的なEIN2、EIN3又はEI
N5タンパク質の必要性は存在しないので、その形態学の結果は、ERF1の下流配置
の強い証拠を提供した。
【００８８】 35S::ERF1系統で観察された形態学が、エチレン応答の活性化に起因すること
を確認するため、数種のエチレン制御遺伝子の発現を調べた。予想通り、２つの
エチレン応答遺伝子、塩基性キチナーゼとPDF1.2についてのmRNAsのエチレン誘
発蓄積は、強い変異体（ein2）内では完全に遮断され、又は弱いエチレン非感受
性変異体（ein3又はein5）ではかなり減少された（図１０Ａ）。５つの独立的に
誘導された遺伝子導入ERF1-過剰発現、５週間空気中成長された植物のそれぞれ
について、塩基性キチナーゼ及びPDF1.2に対するmRNAの高レベルの構成的な発現
が観察された（図１０Ａ）。図１０Ａの中間及び右パネル中のレーン毎に全RNA
（５μg）が装填され、左パネルに50μgが装填された。さらに、35S::ERF1遺伝
子を３種のエチレン非感受性変異体バックグラウンド中に導入した場合、キチナ
ーゼ及びPDF1.2 mRNAの構成的な発現が観察された。ein2；35S::ERF1、ein3；35
S::ERF1及びein5；35S::ERF1遺伝子導入系統は、すべてこれら遺伝子について高
レベルのmRNAの発現を示した。ein5-1の場合、この２つの遺伝子導入系統の１つ
におけるERF1の低発現は、PDF1.2の低発現と塩基性キチナーゼ、及び弱い構成的
なエチレン応答表現型に関連していた。
【００８９】 キチナーゼプロモーター遺伝子融合、CH5B::GUSに及ぼす35S::ERF1発現の効果
も調べた。この良く特徴付けられたエチレン応答リポーター遺伝子は、マメ（Br
oglieら,1989）、及びArabidopsis（Chenら,Plant Physiol. 108:597-607(1995)
）中のエチレン誘起転写用の確実なマーカーであることが立証された。CH5B::GU
Sリポーター遺伝子を保有する植物と、ERF1-過剰発現系統又は野生型植物との交
雑由来の３週間経過したF1植物を、寒天プレート上で栽培し、GUS活性用に染色
した。
【００９０】 実生中での強い染色によって示されるように、35S::ERF1の存在下では高レベ
ルのGUS活性が観察されたのに対し、対照植物（35S::ERF1なし）では染色が検出
されなかった（図１０Ｂ）。さらに、35S::ERF1構成物のエチレン抑制エンハン
サートラップリポーター系中への導入も、エチレンの不在下でGUS発現の阻害と
いう結果となり、ERF1発現によってエチレン制御遺伝子の転写が抑制されること
が確証された。 これら結果は、ERF1発現が、種々の植物組織内でエチレン制御標的遺伝子の転
写を促進（又は抑制）するのに十分であることを確証している。
【００９１】 要するに、エチレンに応じたERF1発現の迅速なEIN3-依存性誘発、EIN3のERF1
プロモーターへの結合性、及びEIN3-過剰発現植物におけるERF1の構成的な発現
は、ERF1がEIN3の即時標的であるという結論を支持する。ERF1の機能増加実験に
おける、暗中退色された実生と成熟植物の両方でエチレン制御遺伝子のプロモー
ター中のGCCエレメントに対するERF1の結合性、及びエチレン応答遺伝子や表現
型の構成的な活性化が、さらにERF1を下流エチレンシグナル経路遺伝子として定
義する。EIN3（又はEILs）及びERF1 DNA結合タンパク質の経時的作用は、エチレ
ンシグナル経路の制御階層の新しいレベルの複雑さを加える。エチレンのシグナ
ル経路における酵素のこの階層の存在が、このガス状植物成長制御因子／ストレ
スシグナルに応答する複雑な植物をはっきりと制御する手段を与える。
【００９２】 本明細書で引用又は記載された各特許、特許出願及び出版物の開示は、参照に
よって、その全体が本明細書に取り込まれる。 本明細書に示され、かつ記載されたことに加え、本発明の種々の変形が、上述
の記載から当業者には明かだろう。このような変形も、特許請求の範囲内に含ま
れるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、該エチレンガスシグナル経路における核事象を示す。ここには、エチレ
ン応答を媒介する、転写制御カスケードのモデルが示されている。
【図２】 図２は、ERF１のクローニングおよびエチレン誘発性に関する結果を示す。図２A
は、エチレンガスの存在下で誘発された、ERF１mRNA発現のノーザンブロット解析
結果およびPDF1.2の誘発された発現との比較を示す。図2Bは、EIN3-過剰発現植物
内での、ERF１mRNA発現のノーザンブロット解析結果を示す。図2Cは、シクロヘキシ
ミドによるERF1発現誘発のノーザンブロット解析結果を示す。レーン上方の数値
は、シクロヘキシミド(cx)のμM単位の濃度を示す。
【図３】 図３は、EIN３が配列特異的DNA-結合タンパクであることを示す、データを示し
たものである。図３Aは、インビトロで翻訳され、該ERF１プロモータの-1238〜-950
フラグメントに結合した、EIN３の電気泳動移動度のシフトアッセイ(EMSA)を示す
。コントロールタンパク(コントロール)またはmock翻訳網状赤血球溶解物(RL)を、
指定したレーンで使用した。図３Bは、該ERF１プロモータのフラグメント-1238〜-
1204(1)および-1213〜-1178(2)と結合した、EIN3-3変異タンパク、EIN3および幾つ
かの欠失誘導体に関する、EMSAを示す。図3Cは、抗-EIN3抗体(Ab-EIN3)の添加によ
る、EIN3とそのターゲットサイト、該EIN3結合サイト(EBS)との相互作用の競合を
示す。PIは予備免疫血清を表す。
【図４】 図４は、該EBSを特徴付けするためのデータを示した図である。図４Aは、該EBSの
突然変異誘発の走査を示す。野生型のEBSは、矢印で示されたパリンドローム反復
単位を持つことが分かる。テストした変異体における基本的な変化が示される。点
は、該野生型EBS (WtEBS)におけるものと類似の塩基を表す。図４Bは、該EBS、およ
びE4並びにGST１遺伝子(EREを含む)プロモータのフラグメントの配列を、並べて
示したものである。
【図５】 図５は、該EBSを特徴付けするためのデータを示す。図５Aは、未標識のEBSまたは
２つの変異型、EBSm１およびEBSm２を過剰に添加することによる、該EIN３-EBS錯
体形成の競合を示す。0で示したレーンでは、競合物質を添加しなかった。黒塗りの
三角は、競合物質の増大量(20、60および200ng)を表す。図５Bは、EMSA実験で使用し
た変異体およびEIN3の構造上の特徴をまとめたものである。
【図６】 図６は、EIN3のホモダイマー化を示す。図６Aは、EBSと結合する、完全サイズのEI
N３および欠失誘導体のEMSAの結果を示す。図６Bは、酵母「2-ハイブリッド」システ
ムによりアッセイした、EIN3-EIN3相互作用を示す。左上に示したように、指定した
構築体で形質転換した酵母を、ヒスチジンを含む(+HIS)合成完全(SC)培地または
ヒスチジンを含まず(-HIS)、his3リポータ遺伝子の基本的な活性を抑制するため
に、50mMの3-アミノトリアゾール(3-AT；Sigma社)を含むSC倍地中で生育させた。-
HIS (lacZ)中で生育したコロニーのβ-gal活性を、フィルタ-リフトアッセイで測
定した。SNF４/SNF１を正のコントロールとして使用した。２つの独立の形質転換
実験から得たコロニーを図示した(BD-EIN3aおよびBD-EIN3b)。図6Cは、EILタンパ
クの、該ERF1プロモータ中の該EIN3ターゲットサイトに対する結合を示す。EMSAを
、インビトロで翻訳したEIN3、EIL1、EIL2およびEIL3タンパクおよび野生型EBS(W)
または変異(M)型を使用して実施した。ここで、該変異体は、図4に示すように、17位
における、GからCへの変異を示す。
【図７】 図7は、GCCボックスDNA結合タンパクとしてのERF1を支持するデータを示す。イ
ンビトロで翻訳したERF1タンパクおよびアラビドプシスの塩基性-キチナーゼ(b-
CHI)由来のプロモータフラグメントおよび大豆キチナーゼ5B(CH5B)遺伝子を使用
して、電気泳動移動度シフトアッセイを実施した。該GCCボックスまたはこれら同
一のエレメントの突然変異型(b-CH1mおよびCH5Bm)を含むDNAフラグメントを、コ
ントロール、mock-翻訳ウサギ網状赤血球溶解物またはEIN3タンパクを含むこれら
のものと共にインキュベートした。
【図８】 35S::ERF1-発現苗における、エチレン応答表現型の構成的活性を示す図である。
野生型(Col-0)およびein3変異体バックグラウンドにおける、ERF1を過剰発現する
トランスジェニック苗を、連続流動式チャンバー内で、炭化水素を含まない空気を
使用して、10μMのACCの存在下または不在下で、寒天中で生育させた。形質転換さ
れなかった野生型およびein3変異植物をも、比較のために示した。
【図９】 図9は、該エチレンシグナル経路において、ERF1がEIN2およびEIN3の下流側で作
用することを示す。野生型(Col-0)、ein2、ein3-1およびein3-3変異体バックグラウ
ンドにおける、ERF1を過剰発現するトランスジェニック苗を、5週間にわたり、連続
流動式チャンバー内で、炭化水素を含まない空気を使用して、生育させた。形質転
換されなかった野生型ctr1-1およびEIN3-過剰発現植物をも、比較のために示した
。
【図１０】 図１０は、ERF１による、エチレン応答遺伝子の、転写活性化を示す。図１０Aは、W
t(Col-０)およびエチレン不感受性変異体バックグラウンドにおける、ERF１を過
剰発現するトランスジェニック系内の、エチレン誘発遺伝子の発現の、ノーザンブ
ロット解析(全RNA)を示す。Col-0における５種の独立したトランスジェニック系
および該変異体各々における２種の独立した系を示す。同一のブロットを、エチレ
ン誘発遺伝子PDF1.2および塩基性-キチナーゼERF１および負荷を与えたコントロ
ールプローブ(tDNA)により精査した。図１０Bは、ERF1-過剰発現トランスジェニッ
ク植物における、エチレン-誘発CH5B-GUSリポータ遺伝子の、構成的活性化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソラノ ロベルト ジェイ スペイン イー28049 マドリッド コル メナー カエメ 15．５ クトラ セント ロ ナシオナル デ バイオテクノロジア セエセイセ カンパス カントブランコ Ｆターム(参考） 2B030 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA42 BA47 CA06 DA01 FA02 GA11 GA17 4B063 QA01 QQ20 QQ61 QR78 QS24 QX01 4B065 AA88X AA89Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA25 CA53 4H045 AA30 BA10 CA30 DA75 EA05 FA74

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物エチレンシグナル経路内で、EIN3又はEIN3様（EIL）ペ
    プチドによって活性化される植物エチレン応答因子をコードする単離核酸であっ
    て、前記活性化因子が、二次エチレン応答遺伝子中の標的GCC-ボックスに結合す
    る、単離核酸。
  2. 【請求項２】 ERF1を包含する請求項１に記載の核酸。
  3. 【請求項３】 さらに、ERF1-活性を有する発現生成物をコードする、ERF1
    の変異体、誘導体、相同体又はフラグメントを包含する請求項２に記載の核酸。
  4. 【請求項４】 配列番号：１を包含する請求項２に記載の核酸。
  5. 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸でコードされたポ
    リペプチドの精製標品。
  6. 【請求項６】 標的二次応答遺伝子中のGCC-ボックス結合活性を有する、ER
    F1及びERF1の相同体、類似体、誘導体又はフラグメントを包含する請求項５に記
    載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 配列番号：２を包含する請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 ERF1 GCC-ボックス結合活性が、EIN3−又はEIL−依存性であ
    る請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離核酸を包含する組
    換え細胞。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離核酸を包含する
    ベクター。
  11. 【請求項１１】 標的二次応答遺伝子中のGCC-ボックス結合活性を有する、
    植物ERF1ポリペプチド、及びその相同体、類似体、誘導体又はフラグメントに特
    異的な抗体。
  12. 【請求項１２】 標的二次応答遺伝子中のGCC-ボックス結合性発現生成物を
    コードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸配列の全部又は一部、及
    びその変異体、誘導体、相同体又はフラグメントに相補的な配列を包含する単離
    核酸配列。
  13. 【請求項１３】 植物、植物細胞、器官、花又はそれらを含む組織の二次エ
    チレン応答活性を制御、コントロール、又は調節するのに十分なレベルのアンチ
    センス活性を有する請求項１２に記載の核酸。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜４及び１２、１３のいずれか１項に記載の核酸
    を包含する植物、植物細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜４及び１２、１３のいずれか１項に記載の核酸
    を包含する遺伝子導入植物、その細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
  16. 【請求項１６】 請求項９に記載の組換え核酸を包含する遺伝子導入植物、
    その細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
  17. 【請求項１７】 請求項５〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを包含
    する遺伝子導入植物、その細胞、器官、花、組織、種子又は子孫。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜４及び１２、１３のいずれか１項に記載の単離
    核酸であって、さらに、植物ERF1プロモーター配列、又は植物ERF1プロモーター
    配列の、ERF1プロモーター活性を有するフラグメントを包含する単離核酸。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜４及び１２、１３、１８のいずれか１項に記載
    の単離核酸を包含するベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１８に記載の単離核酸であって、さらに、作用可能
    に前記核酸に融合されたリポーター遺伝子、又はリポーター遺伝子の、リポータ
    ー活性を有するフラグメントを包含する単離核酸。
  21. 【請求項２１】 ERF1プロモーター配列を含む単離核酸を含んでなる導入遺
    伝子を包含する遺伝子導入植物、その細胞、器官、花、組織、種子、又は子孫。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜４及び１２、１３のいずれか１項に記載の核酸
    を植物内で操作して、前記植物内のエチレン応答の制御、コントロール又は調節
    を可能にする方法。
  23. 【請求項２３】 前記制御、コントロール又は調節が、前記植物内の発芽、
    細胞伸長、性決定、花若しくは葉の老化、花の成熟、果実の成熟、昆虫、除草剤
    若しくは病原体耐性、器官脱離、又はストレス、損傷若しくは病原体に対する応
    答を開始又は増強する、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記制御、コントロール又は調節が、前記植物内の発芽、
    細胞伸長、性決定、花若しくは葉の老化、花の成熟、果実の成熟、昆虫、除草剤
    若しくは病原体耐性、器官脱離、又はストレス、損傷若しくは病原体に対する応
    答を阻害又は防止する、請求項２２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 植物内のエチレンシグナル系におけるエチレン応答に影響
    しうる化合物を同定する方法であって、以下の工程を包含する方法： 作用可能に連結されたリポーター配列を有する、植物ERF1配列をコードする単
    離核酸を包含する細胞を供給する工程； 前記細胞に、試験化合物を添加する工程；及び 前記細胞中のリポーター遺伝子活性のレベルを測定する工程であって、前記試
    験化合物が添加されなかった第２細胞内のリポーター遺伝子活性のレベルと比較
    した前記細胞内のリポーター遺伝子活性の高低レベルが、前記試験化合物が植物
    ERF1遺伝子の発現に影響しうる指標である、工程。
  26. 【請求項２６】 比較しうる野生型植物のエチレン応答活性に比し、増強さ
    れたエチレン応答活性を有する改良植物の生成方法であって、ERF1をコードする
    単離核酸を前記改良植物の細胞中に導入する工程において、前記ERF1核酸がGCC-
    ボックスに結合し、それによって前記改良植物の標的二次エチレン応答遺伝子を
    活性化する工程を包含する方法。
  27. 【請求項２７】 比較しうる野生型植物のエチレン応答活性に比し、増強さ
    れたエチレン応答活性を有する改良植物の生成方法であって、EIN3又はEILをコ
    ードする単離核酸を、前記改良植物のEIN3-又はEIL-欠失又は欠乏性細胞中に導
    入する工程において、前記EIN3又はEIL核酸がERF1遺伝子を活性化し、それによ
    って前記改良植物の標的二次エチレン応答遺伝子の活性化を可能にする工程を包
    含する方法。
  28. 【請求項２８】 比較しうる野生型植物のエチレン応答活性に比し、減少ま
    たは阻害されたエチレン応答活性を有する植物の生成方法であって、erf1のすべ
    て又は一部に相補的な核酸をコードする単離核酸を改良植物の細胞中に導入する
    ことによって、前記細胞内のERF1分子を結合又は阻害する工程において、そうで
    なければ前記erf1核酸がGCC-ボックスに結合し、それによって前記改良植物の標
    的二次エチレン応答遺伝子を活性化するであろう工程を包含する方法。
  29. 【請求項２９】 比較しうる野生型植物のエチレン応答活性に比し、減少ま
    たは阻害されたエチレン応答活性を有する植物の生成方法であって、ERF1のすべ
    て又は一部に対する抗体を改良植物の細胞中に導入することによって、前記細胞
    内のERF1分子を結合又は阻害する工程において、そうでなければ前記ERF1ポリペ
    プチドがGCC-ボックスに結合し、それによって前記改良植物の標的二次エチレン
    応答遺伝子を活性化するであろう工程を包含する方法。
  30. 【請求項３０】 比較しうる野生型植物のエチレン応答活性に比し、減少ま
    たは阻害されたエチレン応答活性を有する植物の生成方法であって、EIN3又はEI
    Lのすべて又は一部に対する抗体を改良植物の細胞中に導入することによって、
    前記細胞内のEIN3又はEIL分子を結合又は阻害する工程において、そうでなけれ
    ば前記EIN3又はEILポリペプチドがERF1の発現を活性化し、それによって前記改
    良植物の標的二次エチレン応答遺伝子の活性化させるであろう工程を包含する方
    法。
  31. 【請求項３１】 植物細胞内のERF1の発現を操作する方法であって、以下の
    工程を包含する方法： 前記植物細胞内の植物プロモーター配列に、核酸ERF1又はその作用可能な部分
    を作用可能に融合して、キメラDNAを生成する工程、及び その細胞が前記キメラDNAを含む遺伝子導入植物を生成し、前記植物プロモー
    ターの活性化をコントロールして、ERF1の発現を操作する工程。
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