JP2000050877A

JP2000050877A - エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転写因子

Info

Publication number: JP2000050877A
Application number: JP10227448A
Authority: JP
Inventors: Shunichi Kosugi; 俊一小杉; Yuko Ohashi; 祐子大橋
Original assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2000-02-22
Also published as: WO2000009712A1; WO2000009712A8; AU3628699A

Abstract

(57)【要約】【課題】エチレン誘導性遺伝子を制御する転写因子、
当該転写因子をコードする遺伝子、当該遺伝子の導入に
より植物に環境ストレスに対する抵抗性を付与する方
法、および当該転写因子をスクリーニングする方法を提
供する。【解決手段】エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する
転写因子であって、コンセンサス配列A(T/c)G(A/T)A(C/
T)CTに対して配列特異的なDNA結合活性を有する、転写
因子。この転写因子は、以下の（ａ）または（ｂ）であ
り得る：（ａ）配列表の配列番号２の82位のGluから302位のArg
までのアミノ酸、および配列番号２の482位のValから61
5位のTyrまでのアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、
転写因子；または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１またはそれ以上
のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を有し、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転
写因子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エチレン誘導性遺
伝子群の発現を制御する転写因子に関する。本発明はま
た、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転写因子
の植物体内における発現レベルを調節することにより、
様々な環境ストレスに対して、植物に抵抗性を付与する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】気体の植物ホルモンであるエチレンは、
植物生長および発育における多くのプロセスに影響す
る。これらのプロセスとして、発芽、細胞伸張、毛根形
成、リゾビウム感染、果実の熟成、老化および器官脱離
が挙げられる（AbelesおよびSaltvel、1992）。エチレ
ン作用の別の局面として、Abeles（1973）は、環境およ
び生物学的ストレスへの耐性を媒介する「ストレスエチ
レン」を提唱している。機械的損傷または病原体攻撃を
含むいくつかのストレスは、植物におけるエチレン発生
を加速する（O'Donnellら、1996）。増加したエチレン
は、ストレス関連性遺伝子の発現を誘導して、おそらく
それにより土壌菌類およびいくつかのストレスに対する
耐性を植物に付与すると考えられる（MorganおよびDre
w、1997；Knoesterら、1998）。これらの効果は、エチ
レン生合成、およびエチレン応答（すなわち、エチレン
の認識によって生じる連続的なシグナル伝達の結果とし
ての、推定の転写因子により調節されるエチレン応答性
遺伝子の発現）の両方により制御される。

【０００３】近年の生化学的研究および分子学的研究に
より、エチレンがアミノシクロプロパンカルボン酸（AC
C）オキシダーゼによりACCから変換されること、および
ACCがACC合成酵素の作用によって生成されることが明ら
かになった（YangおよびHoffman、1984）。従って、エ
チレン合成は、ACC合成酵素およびACCオキシダーゼによ
り調節される。

【０００４】他方、植物のエチレン応答におけるシグナ
ル伝達機構を説明する多くの知見が、エチレン応答につ
いて欠陥を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis）変異
体を使用した遺伝学的アプローチから得られている（Ec
ker、1995；BleeckerおよびSchaller、1996；Chang、19
96）。多くのシロイヌナズナのエチレン不感受性の変異
体および恒常的エチレン応答性の変異体が単離されてき
た。これらの単離は、エチレンで処置した黄化芽生え
の、「トリプル応答」（下胚軸の肥大、下胚軸および根
の伸張の阻害、ならびに下胚軸および根の放射状の肥
大）として知られる形態学的変化に基づく。各変異に対
応するいくつかの遺伝子（例えば、ETR1、CTR1、EIN1〜
3、およびEIL1〜3）が同定されている。以下に説明する
ように、これらの遺伝子解析に基づいて、シロイヌナズ
ナにおけるエチレンシグナル伝達系のモデルが提唱され
ている（図１；ここで、ERSは、アラビドプシスのETR1
ホモログである）。

【０００５】ETR1（ethylene resistant 1）の４つの変
異対立遺伝子（etr-1〜etr-4）は全て、エチレン不感受
性を与え、そして野生型対立遺伝子に対して優性であ
る。ETR1遺伝子産物は、細菌二成分制御系の応答制御因
子と著しく類似性を有する配列を含む（Changら、199
3）。ETR1を発現するトランスジェニック酵母は、エチ
レンに結合することが示されており、このことは植物に
おけるエチレンレセプターとしてのETR1の機能を示唆す
る（SchallerおよびBleecler、1995）。

【０００６】etr1変異体とは対照的に、CTR1（constitu
tive triple response 1）遺伝子座における変異は、恒
常的なエチレン応答を導き、CTR-1がエチレンシグナル
伝達の負の制御因子であることを示す。CTR1遺伝子はET
R1遺伝子に対して上位であり、そしてRafキナーゼに相
同性を有するタンパク質をコードする（Kieberら、199
3）。最近、CTR1はETR1と直接的に相互作用することが
見出されている（Clarkら、1998）。これらの発見によ
り、エチレン応答を誘起する活性が、基底レベルで植物
中に通常存在し、ならびに活性は、CTR1を介してタンパ
ク質をリン酸化することにより抑制され、およびETR1に
対するエチレン結合により抑制が解除されるという構図
が考えられた。

【０００７】Chaoら（Chaoら、1997）によってクローニ
ングされた、第３の遺伝子であるEIN3（ethylene insen
sitive 3）は、ETR1およびCTR1に対して遺伝学的に上位
にあり、現時点で遺伝子経路の最も下流に存在する。et
r1と同様に、ein3変異体は、トリプル応答によって表さ
れるエチレン応答についての機能欠失（loss-of-functi
on）表現型を示す（Romanら、1995；Chaoら、1997）。E
IN3によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列
は、データーベースにおける他のアミノ酸配列に有意な
相同性を有さないことが示されている。

【０００８】Chaoらはまた、EIN3関連産物（EIL1〜EIL
3）をコードするcDNAを単離した。EIL（EIN-like）は、
EIN3のＮ末端側半分に有意な相同性を有し、そしてこれ
らのcDNA（すなわち、EIL1およびEIL2）の発現がEIN3と
同様にein3変異を相補し得る。従って、EILとEIN３と
は、互いに機能的に類似するようである（Chaoら、199
7）。EIN3およびEIL1は、シロイヌナズナのプロトプラ
ストにおいてGUSレポーターとの融合タンパク質として
発現させた場合、もっぱら核に局在した。このことは、
これらのタンパク質が転写因子である可能性を示唆する
（Chaoら、1997）が、未だその機能は明らかではない。
これらが実際に転写因子である場合、その標的遺伝子に
興味が持たれる。エチレンシグナル伝達がどのように種
々の結果に作用するのかを理解するためには、EIN3およ
びEILのさらなる特徴づけが必要とされる。

【０００９】上述のストレスエチレンの局面において、
エチレンは、サリチル酸（SA）およびジャスモン酸（J
A）と同様に、植物が病原体感染などのストレスを受け
た際に合成される二次シグナル物質として知られてい
る。これらの二次シグナル物質が合成されると、植物内
においてストレスを防御する機能を導くストレス抵抗性
遺伝子の発現が誘導される。ストレス抵抗性遺伝子の例
として、感染特異的（PR）遺伝子が挙げられる。

【００１０】PR遺伝子によりコードされるタンパク質
（PRタンパク質）は、種々の防御機能を有することが報
告されている。PRタンパク質は、一般に、等電点が酸性
側にある酸性PRタンパク質、および等電点が塩基性側に
ある塩基性PRタンパク質の２つのタイプに分類される。
酸性PRタンパク質は、サリチル酸により誘導されること
が知られており、植物の病原体感染に対する全身獲得抵
抗性（SAR）に関与すると考えられている。塩基性PRタ
ンパク質は、根および下位葉において恒常的に発現す
る。植物が病原体感染および傷ストレスのようなストレ
ス環境下にさらされる場合、塩基性PRタンパク質はま
た、エチレンおよびジャスモン酸により誘導される。

【００１１】エチレン応答のシグナル伝達経路に関与す
る因子は、上述のように、現在までにいくつか単離され
ている。しかし、これらの因子が、ストレス抵抗性遺伝
子（例えば、塩基性PR遺伝子）の発現に作用するのか否
かは明らかではない。

【００１２】エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する
転写因子が同定されれば、転写因子の植物体内における
発現レベルを調節して、標的遺伝子であるエチレン誘導
性遺伝子の発現を制御することが可能であると考えられ
る。また、標的遺伝子がストレス抵抗性遺伝子である場
合、この遺伝子の発現を調節することにより、植物に環
境ストレスに対する抵抗性を付与することが可能である
と考えられる。環境ストレスに対する抵抗性を有する植
物を作出することは、特に、農業の分野において重要な
課題である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の問題を
解決するためのものであり、その目的とするところは、
エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転写因子を提
供することにある。本発明のさらなる目的は、エチレン
誘導性遺伝子群の発現を制御する転写因子の植物体内に
おける発現レベルを調節することにより、環境ストレス
（例えば、病害体感染および傷ストレス）に対して抵抗
性が付与された植物を作出する方法を提供することにあ
る。本発明の他の目的は、エチレン誘導性遺伝子群の発
現を制御する転写因子をスクリーニングする方法を提供
することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、エチレン誘導
性遺伝子群の発現を制御する転写因子であって、コンセ
ンサス配列A(T/c)G(A/T)A(C/T)CTに対して特異的な結合
活性を有する、転写因子に関する。

【００１５】１つの実施態様において、上記の転写因子
は、以下の（ａ）または（ｂ）である：（ａ）配列表の配列番号２の82位のGluから302位のArg
までのアミノ酸、および配列番号２の482位のValから61
5位のTyrまでのアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、
転写因子；または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１またはそれ以上
のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を有し、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転
写因子。

【００１６】１つの実施態様において、上記の転写因子
は、以下の（ｃ）または（ｄ）である：（ｃ）配列表の配列番号２の１位のMetから615位のTyr
までのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する転写因
子；または（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、１またはそれ以上
のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を有し、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転
写因子。

【００１７】１つの実施態様において、上記の転写因子
は、傷誘導性遺伝子の発現を制御する。

【００１８】１つの実施態様において、上記のエチレン
誘導性遺伝子群は、塩基性PR遺伝子群を含む。

【００１９】１つの実施態様において、上記の塩基性PR
遺伝子群は、塩基性PR-2遺伝子および塩基性PR-5遺伝子
を含む。

【００２０】また、本発明は、上記の転写因子をコード
する遺伝子に関する。

【００２１】さらに、本発明は、以下の（i）または（i
i）のDNAからなる、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制
御する転写因子をコードする遺伝子に関する：（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するDN
A；または（ii）塩基配列（i）を有するDNAとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、エチレン誘導性遺伝子群の
発現を制御する転写因子をコードするDNA。

【００２２】さらに、本発明は、上記の遺伝子を含むポ
リヌクレオチドで、植物細胞を形質転換する工程；およ
び、この形質転換した植物細胞を再分化させて、植物を
得る工程を包含する、植物に環境ストレスに対する抵抗
性を付与する方法に関する。

【００２３】１つの実施態様おいて、上記のポリヌクレ
オチドは配列番号１に記載の塩基配列を有するDNAを含
む。

【００２４】１つの実施態様において、上記の環境スト
レスは病原体感染を含む。

【００２５】１つの実施態様において、上記の環境スト
レスは傷ストレスを含む。

【００２６】さらに、本発明は、コンセンサス配列A(T/
c)G(A/T)A(C/T)CTに対して特異的な結合活性を有するタ
ンパク質を同定する工程を包含する、エチレン誘導性遺
伝子群の発現を制御する転写因子をスクリーニングする
方法に関する。

【００２７】

【発明の実施の形態】以下に、本発明をより具体的に説
明する。なお、本明細書中に言及した参考文献について
は、後段にその詳細を一覧して示す。

【００２８】本発明者らは、エチレン誘導性遺伝子群の
発現を制御する新規な転写因子を見出した。本発明者ら
は、この転写因子が、(１）植物がエチレンでの処理お
よび傷を受けた際に誘導性であること、および（２）配
列特異的なDNA結合活性を有する転写因子として機能し
て、エチレン誘導性遺伝子および傷誘導性遺伝子の発現
を調節し得ること、を解明した。本発明は、これらの知
見に基づいて完成された。

【００２９】（１）本発明の転写因子および転写因子を
コードする遺伝子本明細書において、「エチレン誘導性遺伝子群」とは、
植物体内でのエチレンの発生により、その発現が誘導さ
れる複数の遺伝子からなる一群をいう。エチレン誘導性
遺伝子に属する遺伝子としては、塩基性PR遺伝子などが
挙げられる。

【００３０】「塩基性感染特異的（PR）遺伝子群」と
は、植物が病原体感染および傷ストレスなどの環境スト
レス下に曝された場合に活性化される複数の遺伝子から
なる一群をいう。塩基性PR遺伝子の例としては、抗カビ
性機能を有するタンパク質をコードする塩基性PR-1遺伝
子、β-1,3-グルカナーゼをコードする塩基性PR-2遺伝
子（例えば、GLA、GLB、およびgn1）、クラスI、IIキチ
ナーゼをコードする塩基性PR-3遺伝子（例えば、CHN4
8、CHN50、CH5B、およびATHCHTB）、クラスVキチナーゼ
をコードする塩基性PR-4遺伝子、オスモチンをコードす
る塩基性PR-5遺伝子、プロテイナーゼインヒビター（P
I）をコードする塩基性PR-6遺伝子（例えば、NTPROTINH
およびSTP12G）などが挙げられる（例えば、Lc van Loo
nら、1994を参照）。

【００３１】遺伝子についての「発現」とは、DNAのmRN
Aへの転写をいう。mRNAへの転写の程度を発現レベルと
して示す。従って、転写が抑制される場合は発現レベル
が減少し、転写が促進される場合は発現レベルが増大す
る。

【００３２】「転写因子」とは、転写反応において、RN
Aポリメラーゼ以外に必要とされるタンパク質性因子で
ある。真核細胞においては、正しい転写反応が起こるた
めには、RNAポリメラーゼ以外に、転写因子が必要であ
る。転写因子としては、DNAに直接結合することにより
作用するもの、および因子間のタンパク質-タンパク質
相互作用を介して機能するものが挙げられる。

【００３３】本発明において意図される転写因子は、コ
ンセンサス配列A(T/c)G(A/T)A(C/T)CTに対して配列特異
的なDNA結合活性を有する転写因子である。ここで、括
弧は、括弧内の斜線により区分される２つの塩基のいず
れかが選択されることを意味する。ここで、斜線により
区分される２つの塩基がともに大文字で表される場合
は、使用され得る適切性が等しいことを意味する。ま
た、片方の塩基が小文字で表される場合、コンセンサス
配列において使用され得るものの、その適切性が他方の
塩基に比べて低いことを意味する。

【００３４】以下は、本発明において意図される転写因
子である：（ａ）配列表の配列番号２の82位のGluから302位のArg
までのアミノ酸、および配列番号２の482位のValから61
5位のTyrまでのアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、
転写因子（このアミノ酸配列は、好ましくは、１位のMe
tから302位のArg、または82位のGluから412位のSer、よ
り好ましくは、１位のMetから412位のSerまでを含
む）；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１またはそれ以上
のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を有し、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転
写因子（(ａ)の変異体）；（ｃ）配列表の配列番号２の１位のMetから615位のTyr
までのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する転写因
子；および（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、１またはそれ以上
のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を有し、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転
写因子（(ｃ)の変異体）。

【００３５】本発明の転写因子は、好ましくは、(ａ）
の転写因子またはその変異体であり、より好ましくは、
(ｃ）の転写因子またはその変異体であり、さらにより
好ましくは、（ｃ）の転写因子である。

【００３６】本明細書において、「１またはそれ以上の
アミノ酸の欠失、置換、または付加」とは、部位特異的
突然変異により導入できる程度の数の欠失、置換、また
は付加をいう。上記のような変異は、天然に生じるか、
または変異原物質の作用によって、もしくは人為的に部
位特異的突然変異の導入を用いて生じさせ得る。部位特
異的突然変異の手法は、当該分野では周知である。例え
ば、ZollerおよびSmith（1982）を参照。

【００３７】DNAに直接結合することにより作用するタ
イプの転写因子は、結合する標的遺伝子のプロモーター
上の、特定のDNA配列に対して高い選択性を有する。こ
の選択性と同一の、または同程度に高い選択性が認めら
れるとき、DNA配列への結合は「特異的」であるとい
う。従って、上記の転写因子と、対応する特定のDNA配
列との間の結合は特異的である。同様に、その転写因子
の変異体であって結合活性を維持しているものも、同じ
DNA配列に対して特異的に結合する。ある転写因子がDNA
配列に対して特異的な結合活性を有するか否かは、例え
ば、³²Pで標識したDNA配列と転写因子とを適切な時間イ
ンキュベートした後、常法に従って電気泳動度シフトア
ッセイ（EMSA）を行うことにより確認され得る。DNA-タ
ンパク質複合体の形成が観察される場合、転写因子は、
そのDNA配列に対して「特異的な結合活性を有する」と
いう。

【００３８】コンセンサス配列A(T/c)G(A/T)A(C/T)CTに
対して特異的な結合活性を有するタンパク質は、エチレ
ン誘導性遺伝子群の発現を制御する転写因子として使用
され得る。従って、コンセンサス配列を利用して、新規
な転写因子をスクリーニングする方法も、本発明の範囲
に含まれる。コンセンサス配列A(T/c)G(A/T)A(C/T)CTに
特異的な結合活性を有する転写因子を同定し単離する方
法としては、例えば、DNA結合アフィニティーカラムに
より植物細胞核分画物を精製する方法、酵母ワンハイブ
リッド系を用いる方法、および直接放射性標識した、コ
ンセンサス配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブと
して用いて、ライブラリー（例えば、λgt11ライブラリ
ーのような発現ライブラリー）をスクリーニングするサ
ウス-ウエスタン法などが挙げられる。

【００３９】本発明の転写因子をコードする遺伝子は、
本発明において意図される遺伝子である。新規な転写因
子が得られたとき、それをコードする天然由来の遺伝子
を単離する方法としては、例えば、上述のサウス-ウエ
スタン法を用いる、ライブラリーのスクリーニングが挙
げられる。この方法を用いることにより、直接cDNAを単
離することができる。目的の遺伝子を単離するための遺
伝子ライブラリーの作製法、プローブとのハイブリダイ
ゼーションに使用するストリンジェントな条件、および
遺伝子のクローニング法は当業者に周知である。例え
ば、Maniatisら（1989）を参照。

【００４０】本発明の転写因子をコードする遺伝子とし
ては、天然由来の遺伝子だけでなく、人工的に合成した
遺伝子も用い得る。

【００４１】配列表の配列番号１で示される塩基配列を
有するDNAからなる遺伝子、および配列表の配列番号１
で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、エチレン誘導性遺伝子群の
発現を制御する転写因子をコードするDNAからなる遺伝
子は、本発明において意図される遺伝子である。当業者
は、所望の本発明の転写因子をコードする遺伝子を容易
に選択することができる。

【００４２】本明細書中で使用する用語「ストリンジェ
ントな条件」とは、特異的な配列にはハイブリダイズす
るが、非特異的な配列にはハイブリダイズしない条件を
いう。ストリンジェントな条件の設定は、当業者に周知
であり、例えば、Maniatisら（1989）に記載される。

【００４３】得られた転写因子が、エチレン誘導性遺伝
子群の発現を制御するか否かは、この転写因子を恒常的
に発現する形質転換植物を作出し、植物におけるエチレ
ン誘導性遺伝子の発現について（例えば、ノザンブロッ
トによる）解析を行うことにより確認し得る。本発明に
おいて、エチレン誘導性遺伝子の発現が、非形質転換植
物における発現に比べて有意に増強される場合、その転
写因子はエチレン誘導性遺伝子群の「発現を制御する」
という。

【００４４】本発明において、特に好ましい転写因子
は、TEIL（Tobacco EIN3-like)である。このタンパク質
のアミノ酸配列（配列番号２）およびTEILをコードする
遺伝子のcDNA配列（配列番号１）を図２に示す。

【００４５】（２）TEILタンパク質の構造および機能本発明の転写因子である、TEILタンパク質のアミノ酸配
列は、EIN3およびEIL1アミノ酸配列の残基80〜300にわ
たるアミノ末端側半分と、92%の配列同一性を共有する
（実施例１）。この領域はまた、EIN3およびEILタンパ
ク質ファミリー（EIL1〜3）間で、60〜89%の同一性を共
有しており、高度に保存されている。このことは、Ｎ末
端領域の必要不可欠な機能を示唆する。保存された領域
は、本発明におけるDNA結合ドメインの局在分析におい
て示されるように、主にDNA結合活性を有するようであ
る。公知の転写因子のDNA結合ドメインは、それらのフ
ァミリー間および種間で保存されており、そして同一の
または類似のDNA配列を認識する。TEILとEIN3およびEIL
1〜3との間に見られる、DNA結合活性を有すると推定さ
れる領域における高い類似性は、EIN3またはEIL1〜3に
より認識されるDNA配列が、TEILにより認識されるDNA配
列に同一であるかまたは高度に類似することを示唆す
る。この示唆は、EIN3に対してTEILよりも低い類似性を
示すEIL2であっても、EIN3およびEIL1と同様にein3変異
を相補できる（Chaoら、1997）ことから支持される。

【００４６】DNA結合のために必要と推定されるTEILの
アミノ酸配列は、公知のDNA結合モチーフを含まない。
このアミノ酸配列はまた、コンピューター分析により、
α-螺旋構造に富む領域を含むことが予測される（図
２）。Chaoらによって推論されるように、この螺旋構造
は、EIN3およびEIL1〜3にもまた存在し、DNA結合に関与
するとともに、ホモダイマーまたはヘテロダイマー形成
を含むタンパク質-タンパク質相互作用に関与し得る。
転写因子GT-1およびGT-2は、２つの短いループによって
分けられる３つのα螺旋（これは、高等植物に特有であ
る）からなる三重螺旋DNA結合ドメインを有することが
報告されている（Deheshら、1992；Gilmartinら、199
2）。

【００４７】さらに、EIN3の塩基性ドメインIおよびII
に対応する、保存された塩基性アミノ酸の２つのクラス
ターが、TEILのＮ末端において見出される（TEILのアミ
ノ酸残基54〜67および90〜96）。これらのドメインを含
む領域の欠失は、DNA結合活性の完全な欠損を導くの
で、α螺旋および塩基性ドメインは新規なDNA結合ドメ
インを構成するようである。TEILのDNA結合ドメインの
別の顕著な特徴は、広範な領域がDNA結合の完全な活性
のために必要とされ得ることである。Ｃ末端からの203
個のアミノ酸残基の除去は、一定の結合活性の減少を生
じる（実施例２）。このことは、TEIL配列の残基１〜41
2から伸張される領域全体が、完全なDNA結合活性に必要
であり得ることを示す。あるいは、Ｃ末端領域に、Ｎ末
端側の結合ドメインの作用と協調して作用する第２のDN
A結合領域が存在するのかもしれない。

【００４８】TEILの至適化したDNA結合配列は、A(T/C)G
(A/T)A(C/T)CTである（実施例３）。この認識配列は、
公知の植物転写因子が認識する配列には見出されない独
特なものである。発生調節に関与する哺乳動物転写因子
である、Oct-1のコンセンサス結合配列（ATGCAAT）およ
びPit-1のコンセンサス結合配列（ATGNATAWWT；ここでN
は任意の塩基を、およびWはAもしくはTのいずれかを表
す）（HerrおよびCleary、1995）は、上記の認識配列に
類似性を有する。これらの哺乳動物転写因子は、POU特
異的ドメインおよびPOUホメオドメインの２つの構造的
に独立したセグメントからなるPOU DNA結合ドメインを
含む。POU特異的ドメインおよびPOUホメオドメインは、
それぞれ、４個のおよび３個のα螺旋からなる。POU DN
A結合ドメインとTEILとの間には、アミノ酸配列につい
ての類似性は見出されない。しかし、DNA結合活性を有
するTEILのＮ末端領域が、上述したようにいくつかの予
測されるα螺旋を形成することは注目するべきである。

【００４９】TEILは、EIN3に機能的に類似する。EIN3と
の配列同一性がわずか35%であるEIL2でさえ、EIL1と同
様に、ein3変異を相補できる。従って、EIN3に対してよ
り高い類似性を有するTEILもまた、ein3変異を相補でき
ると考えられる。

【００５０】EIN3またはEIL1 cDNAを過剰発現するシロ
イヌナズナの芽生えは、エチレン応答経路の活性化の指
標となる、恒常的なトリプル応答表現型を示す（Chao
ら、1997）。このことは、TEILがタバコプロトプラスト
における転写因子として機能するという本発明者らの観
察結果と整合する。トランス活性化は、TEIL結合配列に
対するTEILの直接的な結合を介して行われると考えられ
る。酵母において、TEILをGAL4 DNA結合ドメインとの融
合体として発現させた場合、レポーター遺伝子を活性化
し得た。このトランス活性化には、少なくともTEILアミ
ノ酸配列の残基482〜615の領域が必要とされた（実施例
７）。これらは、TEILが、配列特異的なDNA結合能力お
よび転写活性能力を有する転写因子であることを示す。

【００５１】TEILの転写活性化機能は、エチレン認識か
らのシグナル伝達により媒介されるようである。tebs
（TEIL結合部位）をプロモーターの上流に連結したレポ
ーター遺伝子は、おそらく内因的に活性化されたTEILま
たはその関連タンパク質により、プロトプラストにおい
て有意に活性化された（実施例６）。使用したプロトプ
ラストにおいて、ストレス誘導性遺伝子は、おそらくプ
ロトプラストを調製する間に、細胞壁から放出されるか
（DavisおよびHahlbrock、1987）または細胞壁消化酵素
溶液中のエリシター様因子により、および／またはエチ
レン放出を誘起する直接的な傷形成の影響（O'Donnell
ら、1996）により、活性化される。さらに、エチレン処
理した葉からの核抽出物は、TEILまたは関連タンパク質
に由来する、増強されたtebs結合活性を示した（実施例
４）。増強された活性は、健全な組織に元来存在する潜
在的な不活性TEILタンパク質のエチレン媒介性の転写後
活性化に依存するようである。Chaoら（1997）はまた、
EIN3タンパク質のレベルは、エチレン処理により変化さ
れないことを観察している。これらの観察から、TEIL標
的遺伝子（tebs含有遺伝子）のエチレン誘導性活性化
は、エチレンにより調節されるTEILのDNA結合活性の変
化に依存すると考えられる。

【００５２】（３）TEILタンパク質の標的遺伝子 ein3変異体において、トリプル応答以外に、グルタチオ
ンSトランスフェラーゼを含むエチレン誘導性タンパク
質のいくつかの遺伝子の発現の障害が観察されることが
報告されている（Chaoら、1997）。etr1変異体およびet
r1-1変異遺伝子を有するタバコ形質転換体において、い
くつかの塩基性PRタンパク質はほとんど産生されない
（Lawtonら、1994；Romanら、1995）。反対に、恒常的
なエチレン応答表現型を示すctr1変異体は、恒常的に塩
基性キチナーゼタンパク質（塩基性PR-3遺伝子の発現産
物）を産生する（Kieberら、1993）。これらの知見は、
EIN3の標的遺伝子が、塩基性PR遺伝子を包含すること、
ならびに、EIN3のホモログであるTEILの標的遺伝子もま
た、塩基性遺伝子を包含することを示唆する。従って、
塩基性PR遺伝子群を含むエチレン誘導性遺伝子のプロモ
ーター領域が、TEILに対する結合部位を含むことが期待
された。

【００５３】本発明者らは、塩基性PR遺伝子のプロモー
ター領域において、TEILのコンセンサス結合配列A(T/c)
G(A/T)A(C/T)CTと良好な一致を示す配列を見出した（８
ヌクレオチドあたり６ヌクレオチド以上が一致した）。
このうちのいくつかはエチレン応答性領域内に特定され
た（表１）。例えば、タバコ塩基性キチナーゼをコード
するCHN48遺伝子のエチレン誘導は、プロモーター領域
における-503〜-358にわたる領域を必要とする（Shinsh
iら、1995）。この領域において、隣接して位置する３
つの推定のtebs、およびエチレン誘導性発現に必要とさ
れる２つのGCCボックス（AGCCGCC）が存在する。CHN50
遺伝子の対応する相同領域も、同一または同種の推定の
tebs、およびGCCボックスを保存する（表１）。タバコ
オスモチンプロモーターのエチレン応答性領域は、-248
〜-108の間に位置する小領域に規定される（Raghothama
ら、1993）。この領域にも、１つのtebsおよび２つのGC
Cボックスが存在する。さらに、パセリPR2プロモーター
（van de Lochtら、1990）の-168〜-108の間のエリシタ
ー応答性領域内には、３つの推定のtebsが存在する。興
味深いことに、この60bp領域はGCCボックスおよび配列
(T)TGAC(C)を含まなかった。

【００５４】

【表１】

【００５５】TGACエレメントは、パセリPR1遺伝子（Des
presら、1995）、トウモロコシPRms遺伝子（Raventos
ら、1995）、およびジャガイモPR-10a遺伝子（Rushton
ら、1996）のエリシター応答性に必要であることが示唆
されている。一方、TGACエレメントは、ストレス応答性
遺伝子として知られるPAL（phenylalanine ammonia-lya
se）遺伝子ファミリーおよび4CL（4-coumarate:coenzym
eA ligase）遺伝子ファミリーのプロモーターにおける
エリシター応答性領域中には存在しない。このことは、
これらのストレス応答性遺伝子の調節においては、異な
るクラスのエリシター応答性エレメントおよび転写因子
が関与していることを示唆する。パセリPR2遺伝子のエ
リシター応答性は、エリシター処理により発生され得る
エチレンにより媒介され得、そしてエリシター応答性領
域において見出される推定のtebsにより付与され得る。
これらの観察により、TEILについての直接的な標的遺伝
子として、多くの塩基性PR遺伝子のメンバーが含まれる
ことが考えられる。この推定は、恒常的にTEILを産生す
る形質転換植物において塩基性PR-2およびPR-5遺伝子の
発現が観察された（実施例９）ことにより支持された。

【００５６】多くの塩基性PR遺伝子のプロモーター領域
は、エチレン誘導性発現に必要とされるGCCボックスを
含む（Ohme-TagakiおよびShinshi、1990；Eyalら、199
3；Hartら、1993）。GCCボックスに結合するタンパク質
である、エチレン応答性エレメント結合タンパク質（ER
EBP）は、エチレン誘導性塩基性PR遺伝子の潜在的な調
節因子であることが提唱されている（Ohme-Tagakiおよ
びShinshi、1995）。表１において示すように、GCCボッ
クスを含むほとんどの塩基性PRプロモーターにおいて、
GCCボックスの近くに本発明におけるtebs配列が存在す
る。特定の理論に束縛されるものではないが、TEILは、
EREBPと協調して、塩基性PR遺伝子の発現を調節し得る
と考えられる。従って、塩基性PR遺伝子におけるTEIL結
合部位を破壊すると、GCCボックスの機能欠失（loss-of
−function）実験における観察（Sessaら、1995）と同
様に、エチレン応答性のいくつかの欠損を導き得る。TE
ILがEREBPと直接相互作用して、協調性のトランス活性
化機能を達成する可能性もある。

【００５７】エチレンまたは傷形成によって効果的に誘
導される塩基性PR遺伝子とは対照的に、サリチル酸によ
り活性化される酸性PR遺伝子は、TEILの標的ではないか
もしれない。しかし、本発明者らは、以下の理由から、
TEILが酸性PR遺伝子発現のエチレン媒介性活性化に影響
し得るという可能性を、PR-1aプロモーターにおけるps1
の機能欠失分析により確認するまでは排除し得ない：
（１）TEILはタバコ酸性PR-1aプロモーターのps1部位に
結合するタンパク質として最初に単離されたこと；
（２）酸性PR遺伝子は、サリチル酸で誘導されるが、エ
チレンおよびサリチル酸、またはエチレンおよびジャス
モン酸での処理により、協調的に誘導されるという報告
があること；および（３）TEILのps1に対する結合親和
性は、至適な結合配列の結合親和性に比べて実質的に低
いが、多くの遺伝子において規定されたシス作用性エレ
メントは、それらの同起源の結合因子に対して必ずしも
強力な結合部位ではないこと。

【００５８】本発明のTEILが、エチレン誘導性転写の活
性化を媒介する配列特異的DNA結合タンパク質として機
能し得るという知見は、そのホモログであるEIN3および
EIL1〜3もまた、TEILと同様にエチレン誘導性転写活性
化を媒介する配列特異的DNA結合タンパク質として機能
し得ることを示す。各メンバーは、EREBPを含む他のタ
ンパク質との直接的または間接的な相互作用を介して、
重複して異なる遺伝子を標的し得る。エチレンは多様な
生理学的現象に関与する遺伝子の活性化および抑制を媒
介する。しかし、ein3変異体が全てのエチレン媒介性効
果において障害されないという観察（Romanら、1995）
により示唆されるように、いくつかのエチレン応答性遺
伝子は、まだ同定されていない転写因子（おそらく、EI
N5、EIN6、およびEIN7を含む）により調節されているの
かもしれない。

【００５９】（４）形質転換植物の作成本発明の転写因子をコードする遺伝子は、それを含むポ
リヌクレオチドとして植物に導入され得る。ポリヌクレ
オチドは、通常、遺伝子が作動可能に組み込まれた適切
な植物発現ベクターの形態である。導入された遺伝子の
植物内での発現により、外因的に本発明の転写因子が産
生され得る。

【００６０】以下に詳細に述べるように、植物に遺伝子
を導入して形質転換植物を作製する方法は、当該分野に
おける常法に従って実施され得る。

【００６１】本願発明の方法が適用される「植物」は、
単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。特に好ま
しい植物としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、
トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、
ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、イ
ネ、ジャガイモ、オオムギ、コムギおよびリンゴが挙げ
られる。また、特に他で示さない限り、植物は、植物
体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいず
れをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、
および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カ
ルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。

【００６２】本発明の方法において、転写因子をコード
する遺伝子が、対象となる植物と同一種または近縁の種
（例えば、同一の属、または同一の科に分類される種）
に由来することは、好ましい態様であり得るが、必ずし
も必要ではない。

【００６３】本発明の方法に用いられる「ポリヌクレオ
チド」は、本発明の転写因子をコードする遺伝子、およ
び所望の形質転換を達成するために必要な任意の付加的
配列を有する。上述のように、このポリヌクレオチド
は、代表的には植物発現ベクターである。

【００６４】「植物発現ベクター」とは、目的の遺伝子
の発現レベルを調節するプロモーターなどの種々の調節
エレメントが、宿主植物細胞中で作動し得る状態で連結
されている核酸配列の組換え構築物をいう。好適には、
植物プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子な
どのマーカー遺伝子、およびエンハンサーを含み得る。
より好適には、複製起点を含み得る。植物発現ベクター
のタイプおよび使用される調節エレメントの好適な種類
が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知
の事項である。当業者は、本発明の実施にあたって、プ
ロモーター、エンハンサーなどの調節エレメントを適宜
選択することにより、導入される遺伝子の発現の程度を
調節し得る。

【００６５】本発明に用いる植物発現ベクターはさらに
Ｔ−DNA領域を有し得る。Ｔ−DNA領域は、特にアグロバ
クテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の
導入の効率を高める。

【００６６】「植物プロモーター」とは、植物細胞にお
いて機能し得るプロモーターをいう。例えば、タバコの
感染特異的タンパク質PR-1のプロモーター（以下、タバ
コPR-1プロモーターという）、熱ショックにより誘導さ
れるプロモーターなどの、ある種のストレスにより発現
が誘導されるプロモーター、カリフラワーモザイクウイ
ルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリン合成酵素のプロ
モーター（Ｐnos）のような恒常的なプロモーターなど
が挙げられるが、これらに限定されない。

【００６７】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、DNAがmRNAに転写
される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配
列である。ターミネーターは、mRNAの安定性に関与して
遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすことが知られてい
る。ターミネーターの例としては、CaMV35Sターミネー
ター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔno
s）、タバコPR-1遺伝子のターミネーターが挙げられる
が、これに限定されない。

【００６８】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にする遺伝子であることが望ましい。カナマイ
シン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラ
ンスフェレースII（NPTII)遺伝子、およびハイグロマイ
シン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォ
トランスフェレース遺伝子などが好適に用いられ得る。
薬剤耐性遺伝子を発現させるプロモーターの例として
は、上記植物プロモーター、例えば、タバコPR-1プロモ
ーター、CaMV35Sプロモーター、ノパリン合成酵素プロ
モーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【００６９】「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエン
ハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの目
的遺伝子について複数個用いられ得る。

【００７０】植物発現ベクターの構築に用いるベクター
としては、pBI系のベクター、pUC系のベクターあるいは
pTRA系のベクターが好適に用いられ得る。pBI系およびp
TRA系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物
に目的の遺伝子を導入し得る。pBI系のバイナリーベク
ターまたは中間ベクター系が好適に用いられ得る。例え
ば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3などが挙げら
れる。これらのベクターは、植物に導入され得る領域(T
-DNA領域)の遺伝子と、マーカー遺伝子として植物プロ
モーターの支配下で発現されるNPTII遺伝子（カナマイ
シン耐性を付与する）とを含む。pUC系のベクターは、
植物に遺伝子を直接導入し得る。例えば、pUC18、pUC1
9、pUC9などが挙げられる。

【００７１】本発明の植物発現ベクターは、当業者に周
知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。好適に
は、上記ベクターのプロモーター下流に本発明の転写因
子をコードする遺伝子が組み込まれる。

【００７２】植物細胞への植物発現ベクターの導入に
は、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウム
を介する方法および直接細胞に導入する方法が用いられ
得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例え
ば、Nagelら（1990）の方法が用いられ得る。この方法
では、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレ
ーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次
いで、形質転換されたアグロバクテリウムを植物細胞に
導入する。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法
としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法の
他、リン酸カルシウム法およびポリエチレングリコール
（PEG）法などがある。これらの方法は、当該分野にお
いて周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当
業者により適宜選択され得る。

【００７３】植物発現ベクターを導入することにより形
質転換した細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐
性、または他の適切な表現型を指標として選択される。
次いで、常法により、植物組織、植物器官および／また
は植物体に再分化され得る。さらに、再生された植物体
から種子が取得され得る。このようにして、本発明の転
写因子をコードする遺伝子を細胞内に有する形質転換植
物が得られる。

【００７４】得られた植物において、本発明の転写因子
が産生されることにより、エチレン誘導性遺伝子群およ
び／または傷誘導性遺伝子群の発現が促進され得、その
結果、環境ストレスに対する抵抗性が付与され得る。

【００７５】本明細書において、「環境ストレス」と
は、自然界で植物が受け得る、その生育を妨げる任意の
ストレスをいう。環境ストレスの例としては、病原体感
染、傷ストレス、強光、低温、凍結、乾燥、高温、高塩
濃度、UV照射、オゾン、虫害および除草剤などが挙げら
れる。「病原体感染」とは、植物の病原因子による感染
をいい、ウイルス、ウイロイド、糸状菌および細菌によ
る感染を含む。「傷ストレス」とは、植物が外的に受け
る機械的損傷をいう。

【００７６】環境ストレスに対しての「抵抗性の付与」
とは、植物に新たな抵抗性を付与すること、または既に
抵抗性を有する植物のその抵抗性を増強することをい
う。環境ストレスに対して植物に抵抗性を付与する遺伝
子を「ストレス抵抗性遺伝子」という。その例として
は、エチレン誘導性遺伝子、酸性PR遺伝子を含むサリチ
ル酸誘導性遺伝子、および傷誘導性遺伝子が挙げられる
が、これらに限定されない。

【００７７】「傷誘導性遺伝子」とは、植物が傷ストレ
ス下に曝露された際に、その発現が誘導される遺伝子で
ある。傷誘導性遺伝子の例としては、プロテイナーゼイ
ンヒビター（PI）群、タンパク質分解酵素群（例えば、
ポリフェノールオキシダーゼおよびリポキシゲナーゼな
ど）、傷誘導性MAPキナーゼ、および塩基性PRタンパク
質（例えば、PR-1〜PR-5）などをコードする種々の遺伝
子が挙げられるが、これらに限定されない。

【００７８】環境ストレスに対する抵抗性の有無は、植
物がある環境ストレス下におかれた場合の、形質転換植
物とコントロール植物との間に観察され得る差異を評価
することにより、確認できる。

【００７９】例えば、病原体感染に対する形質転換植物
の病害抵抗性は、病原体感染における、形質転換植物と
コントロール植物との間の形態学的変化の差異として評
価される。例えば、病原体感染後の形質転換植物におい
て観察され得る病斑の程度が、コントロール植物に比べ
て有意に抑制されている場合は、その形質転換植物には
抵抗性が付与されている。

【００８０】植物は、傷をつけられると、傷害抵抗性応
答機構（例えば、虫害耐性および病害抵抗性）が活性化
されることが知られている（Ryanら、1992）。従って、
例えば、傷ストレスに対する形質転換植物の抵抗性は、
植物が傷害を受けた後の形質転換植物における病害抵抗
性を、上述のように調べることにより確認される。形質
転換植物の病斑の程度が、コントロール植物に比べて有
意に抑制されている場合は、その形質転換植物には傷ス
トレスに対する抵抗性が付与されている。本発明におい
て、「傷ストレス抵抗性」とは、植物が傷害を受けた
後、虫害耐性および病原体抵抗性の少なくとも１つに対
して示される抵抗性をいう。

【００８１】以下の実施例は、本発明の例示のみを目的
として記載されるものであり、本発明をいかなる点から
も制限することを意図しない。

【００８２】

【実施例】実施例において使用した制限酵素、プラスミ
ドなどの材料は、いずれも商業的な供給源から入手可能
である。

【００８３】（実施例１：TEILはEIN3のホモログであ
る）本発明者らのグループは、以前にタバコPR1aプロモ
ーターにおける隣接部位（ps1部位）は、Nicotiana tab
acum cv Samsun NNの健全な葉に存在する核因子により
結合されるが、酸性PR1タンパク質を恒常的に産生す
る、Nicotiana glutinosaとNicotiana debneyiとの雑種
ハイブリッドにおいては、ps1部位はこのような核因子
により結合されないことを見出した（Hagiwaraら、199
3）。

【００８４】本発明者らは、酵母ワンハイブリッド系を
用いて、ps1配列に配列特異的な結合を示すNicotiana t
abacum cv Samsun NN由来のcDNAを、pGAD424ベクター中
で単離した（pGAD-TEILと命名）。簡潔には、ps1部位を
上流に有するHIS3レポーター遺伝子（（ps1)₄-CYC-HIS
3）を活性化したが、ps1を有さないレポーター遺伝子
（CYC1-HIS3）を活性化しない、（pGAD424ベクター中
の）cDNAクローン（pGAD-TEIL）を単離した。

【００８５】配列解析により、pGAD424におけるcDNAのO
RFは、GAL4活性化ドメインとインフレームであり、そし
て534アミノ酸残基をコードすることが示された。PCRベ
ースのクローニング戦略により単離されたN末端伸張領
域は、81アミノ酸残基をコードした。従って、完全長の
cDNAは615アミノ酸残基をコードすることが示された
（図２）。推定のアミノ酸配列において、bZIP（basic-
leucine-zipper）、ジンクフィンガーおよびbHLH（basi
c-herix-loop-herix）のような、DNA結合タンパク質に
特徴的なモチーフは存在しなかった。しかし、このアミ
ノ酸配列をSWISS-PROTデーターベースについての照会配
列として使用したところ、EIN3（ethyleneinsensitive
３）のアミノ酸配列と有意な相同性を有することが見出
された。本発明者らは、このアミノ酸配列からなるタン
パク質を、TEIL（tobocco EIN-like）と命名した。

【００８６】EIN3は、シロイヌナズナ遺伝子によりコー
ドされ、そしてエチレンシグナル伝達経路においてETR1
（ethylene resistant 1）、CTR1（constitutive tripl
e response 1）、およびEIN2（ethylene insensitive
2）の下流で作用する（Chaoら、1997）。EIN3の変異に
より、エチレン不感受性変異体（ein3）が生じる。TEIL
のアミノ酸配列は、EIN3のアミノ酸配列と、全体で60%
の配列同一性を共有する。両者のアミノ酸配列の80〜30
0位にわたるＮ末端側半分においては、92%の配列同一性
が認められる（図３）。TEILのアミノ酸配列はまた、EI
N3に関連するタンパク質として単離された、シロイヌナ
ズナ由来のEIL1〜3のアミノ酸配列に対しても高い相同
性（58%〜35%の配列同一性）を示す。TEILに対する関連
性は、EIL1が最も密接であり、EIL2およびEIL3について
は、より低かった。全体の類似性の程度、およびEIL2以
外のこれらのタンパク質に特徴的な塩基性ドメインIV
（TEILにおけるアミノ酸267〜276位に相当するドメイ
ン）の存在を考慮すると、TEILは、シロイヌナズナEIN3
ファミリー中で、EIN3およびEIL1に最も近いようであ
る。

【００８７】（実施例２：DNA結合ドメインは、Ｎ末端
領域に局在する）TEILのDNA結合活性を有するドメイン
を決定するために、TEILのいくつかの欠失変異を作製し
て、それらのDNA結合能力について試験した。完全長のT
EIL、またはＮ末端欠失変異体もしくはＣ末端欠失変異
体とTrx（チオレドキシン）との組換え融合体を作製し
た。次いでアフィニティーカラムを用いて、これらの融
合体を精製した（図４Ａ）。精製物を、obs1を用いて電
気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）に供した（図４
Ｂ）。obs1は、以下に示すようにTEIL結合について高い
親和性を有するプローブDNAである（obs1の配列につい
ては、図６Ａを参照）。なお、EMSAにおいて用いたプロ
ーブは、全て相補鎖と結合させた二本鎖オリゴヌクレオ
チドである。いくつかの組換えタンパク質、特に、Ｎ末
端領域を含む組換えタンパク質は、E.coliにおいて十分
多量に発現させることが困難であったので、部分的に精
製した状態で使用した。サンプル中の目的のタンパク質
を、Ｓタンパク質を用いるウエスタンブロット分析によ
り定量した（データ示さず）。

【００８８】Trx-ΔN1は、TEILアミノ酸配列の残基１〜
81にわたるＮ末端領域が欠失した変異体である。 Trx-
ΔN1は、プローブDNAに結合する能力を保持したが、親
和性は、完全長のTEIL（WT）の場合に比べて約30%減少
した（図４Ｂ；レーン１と比較したレーン２）。残基9
3、132、および160までのＮ末端領域のさらなる欠失
（それぞれ、ΔN2、ΔN3およびΔN4に対応する）は、DN
A結合能力における完全な欠損をもたらした（図４Ｂ；
レーン３〜５）。また、残基413〜615および残基303〜6
15にわたるＣ末端領域をそれぞれ欠失した、ΔC1および
ΔC2は、完全長のTEIL（WT）に比べて、10〜15%のDNA結
合活性を有した（図４Ｂ；レーン１と比較したレーン６
および７）。アミノ酸配列の、残基226〜615にわたるさ
らなる欠失（ΔC3に対応する）は、結合活性における完
全な欠損をもたらした（図４Ｂ；レーン８）。Ｃ末端欠
失変異体をまた、(ps1)₄-CYC1-HIS3レポーターを用いる
酵母ワンハイブリッドアッセイを使用したインビボ実験
により試験した。pGBT9（Clontech）にクローン化した
ΔC3構築物は、レポーター遺伝子を活性化しなかった。
一方、同様にクローン化したΔC2構築物は、完全長のTE
IL（WT）に比べて活性化の能力は弱かったものの、レポ
ーター遺伝子を活性化した（データ示さず）。これらの
結果は、TEILのDNA結合活性には少なくともアミノ酸配
列の残基82〜302にわたる領域が必要であること、およ
びより高いDNA結合活性のためには、Ｎ末端およびＣ末
端に向かってさらに伸張する領域（例えば、アミノ酸配
列の残基82〜412にわたる領域）が必要であることを示
す。

【００８９】（実施例３：TEILの至適な結合配列は８bp
を含む）TEILは、タバコPR1aプロモーターにおけるps1
に結合するが、TEILとの結合についてps1よりも好まし
い配列が存在すると考えられる。TEILについての至適な
結合配列を決定するために、本発明者らは、精製組換え
Trx（チオレドキシン)-TEIL融合タンパク質を用いるラ
ンダム結合部位選択分析を行った。PCRプライマーのた
めのアニーリング部位が両端に結合したランダムな18マ
ーからなる、二本鎖オリゴヌクレオチドとともに、融合
タンパク質をインキュベートした。DNAタンパク質複合
体をポリアクリルアミド電気泳動により分離した後、Tr
x-TEILが結合したオリゴヌクレオチドのバンドをPCR増
幅した。４サイクルの選択後、選択されたオリゴヌクレ
オチドをプラスミド（PGEM-3Zf(+)、Promega Corporati
on）中にクローン化した。個々のクローンから、全部で
87個のオリゴヌクレオチドを配列決定した（図５Ａ）。
これらの配列の比較から、TEILについてのコンセンサス
配列は、A(T/c)G(A/T)A(C/T)CT（図５Ｂ）であることが
示された。このコンセンサス配列は、ps1（ATGAATAA）
の配列と６bp一致する。

【００９０】本発明者らはさらに、これらの87個の配列
からランダムに選択した39個のフラグメントの相対的な
親和性を、この39個のフラグメントをTEILに対するプロ
ーブDNAとして使用するEMSAにより決定した（データ示
さず）。これらの配列のTEILに対する親和性は、かなり
広い範囲にわたり、親和性の最大値は最小値の20倍であ
った。TEILに対して相対的に高い親和性を示すほとんど
の配列は、コンセンサス配列と相関した。コンセンサス
配列A(T/c)G(A/T)A(C/T)CTにおいて、下線を付したヌク
レオチドは、選択された配列において特に高い保存性を
有していた。

【００９１】コンセンサス配列の重要性を確認するため
に、本発明者らは、さらに、下線を付したヌクレオチド
を変異したオリゴヌクレオチドプローブ（図６Ａ）を用
いて、TEILとの結合について、EMSA分析を行った。至適
な結合配列を有するプローブとして、コンセンサス配列
ATGTACCTを含む配列37（図５Ａ）を使用した（obs1と命
名する、図６Ａを参照）。

【００９２】まず、TEIL結合に対する、obs1におけるコ
ンセンサス配列に隣接する配列の影響を試験するため
に、隣接配列の11ヌクレオチドを、タバコPR-1aプロモ
ーター中のps1部位の隣接配列に交換してobs2を作製し
た（図６Ａ）。obs2配列は、TEIL結合についてobs1とほ
とんど同じ活性を有した（図６Ｂ；レーン２）。この結
果は、結合に対するobs1における隣接配列の影響はほと
んどないことを示す。

【００９３】コンセンサス配列の１番目のオリゴヌクレ
オチドをＡからＣへ変換した変異体（obsm1）は、obs2
に比べて約半分の結合親和性を有した（図６Ｂ；レーン
３）。３番目または５番目のヌクレオチドの変異体（ob
sm2またはobsm3）は、TEIL結合の相当な減少を生じた
（図６Ｂ；レーン４または５に対応）。このことは、３
番目および５番目のヌクレオチドは結合に絶対的に必要
であり得ることを示す。一方、８番目のヌクレオチドを
ＴからＧへ変換した変異体（obsm4）は、結合親和性に
影響しなかった。９番目のオリゴヌクレオチドのGからT
への変異（obsm5）もまた、結合選択において影響しな
かった（図６Ｂ；レーン７）。これらの結果は、コンセ
ンサス配列における１番目のＡおよび８番目のＴの、TE
IL結合への寄与は、それぞれ、中程度およびわずかであ
ることを示唆する。なお、obs1配列は、ps1よりもTEIL
について非常に高い親和性を有した（図６Ｂ、レーン
８）。

【００９４】（実施例４：エチレン処理した葉からの核
抽出物は、TEIL結合部位（tebs）に対する増強された結
合活性を有する）組換えTEILタンパク質は、 TEIL結合
部位（tebs）の高親和性配列であるobs1に対して強力な
結合を示した。タバコ核抽出物におけるtebs結合活性を
有するタンパク質の存在を確認するために、本発明者ら
は、４コピーのobs1を含む標識DNAプローブを用いて、
電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を行った。未処
理のタバコ葉からの核抽出物は、プローブに対する結合
活性をほとんど含まなかった（図７；レーン１）。これ
に対して、エチレン処理した葉については、十分な活性
が示されて明らかにバンドがシフトした（図７；レーン
２）。この標識DNA-タンパク質複合体形成は、過剰なob
s1拮抗オリゴヌクレオチドとして添加することにより、
阻害された（図７；レーン３および４）。一方、非常に
弱いTEIL結合活性しか有さなかったobsm2またはobsm3オ
リゴヌクレオチドの過剰量を拮抗オリゴヌクレオチドと
して使用した場合は、DNAプローブへの結合に対してほ
とんど影響はなかった（図７；レーン５〜８）。このこ
とは、エチレン処理したタバコ葉からの核抽出物に、te
bsに対して配列特異的なDNA結合活性を有するタンパク
質が存在したことを示す。エチレン処理により刺激され
るこのtebsのDNA結合活性は、配列優先性が類似するの
で、TEILまたはTEIL関連タンパク質に由来するようであ
る。

【００９５】（実施例５：TEIL遺伝子転写産物は組織特
異的蓄積および傷誘導性蓄積を示す）TEIL遺伝子転写産
物について、その蓄積の組織特異性およびストレス応答
性を試験するために、ノザンブロット分析を行った。転
写産物を検出するためのDNAプローブとして、TEILのＣ
末端領域に相当するcDNAを用いた。エチジウムブロミド
（EtBr）でゲルを染色することにより、RNAが等量ずつ
ゲルにロードされていることを確認した。転写産物は、
タバコの茎、根、および一部老化した下位葉において豊
富に見出され、そして健全な成熟葉および未成熟の葉、
花芽、ならびに懸濁培養したBY2細胞においてはほとん
ど見出されなかった（図８Ａ）。成熟タバコ葉を小片に
切断してインキュベートした場合、０時間に存在する低
レベルの転写産物は、傷処理の30分後は検出不可能にな
り、そして２時間後、再び増加して24時間まで増加を継
続した（図８Ｂ）。切り出した葉をサリチル酸またはジ
ャスモン酸を含む水とともにインキュベートした場合、
転写産物の誘導のタイミングおよびレベルは、水単独の
場合と同じであった（データは示さず）。さらに、無傷
の芽生えにエチレンまたはジャスモン酸を適用した場
合、実質的な変化は観察されなかった（データは示さ
ず）。これらの観結果察は、TEIL転写産物が、組織特異
的様式で茎および根に豊富に蓄積し、そしてサリチル
酸、ジャスモン酸、およびエチレンとは独立して、傷を
生じた際に誘導性であることを示す。

【００９６】（実施例６：タバコプロトプラストにおい
てobs1レポーター遺伝子は内因的に活性化され、さらに
TEILによりトランス活性化される）次いで、本発明者ら
はタバコ葉肉プロトプラストにおいて、転写調節エレメ
ントとしてのtebs配列の活性をobs1レポーター遺伝子を
使用して試験した。obs1レポーター構築物（obs1-GUS）
は、obs1の４つの反復配列を上流に有するCaMV 35S(-5
4)プロモーター（CaMV minimal promoter）と細菌性β-
グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子との融合物である。コ
ントロールレポーター構築物（obsm2-Gus）において
は、obs1-GUSにおけるobs-1の４つの反復配列を、obsm2
の４つの反復配列で置換した。これらの構築物を、それ
ぞれ、タバコ葉肉プロトプラストにトランスフェクトし
た。obs1-GUSでは、obsm2-GUSに比べて、７〜10倍高いG
US活性が観察された（データは示さず）。この観察結果
は、TEILまたは関連タンパク質の活性な形態がタバコ葉
肉プロトプラストに内因的に存在し、そしてobs1配列へ
の配列特異的な結合を介してレポーター遺伝子を活性化
したことを示唆する。

【００９７】さらに、obs1-GUSと、エフェクタープラス
ミド（35S-TEIL）またはコントロールエフェクタープラ
スミド（35S-NPTII）とを、タバコ葉肉プロトプラスト
に同時トランスフェクトした。35S-TEILおよび35S-NPTI
Iは、それぞれ、CaMV 35S RNAプロモーターに作動可能
に連結されたTEIL cDNAおよびネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を含む構築物である。obs1-GUSと
35S-TEILとの組み合わせにおいて、35S-NPTIIとの組み
合せに比べて、さらに約２〜３倍、レポーター遺伝子の
発現によるGUS活性の増強が観察された（図９の右半
分）。対照的に、obsm2-GUSと35S-TEILとの同時トラン
スフェクションは、obsm-2GUS単独でのトランスフェク
ションに比べてレポーター遺伝子のわずかなレベルの活
性化を生じただけであった（図９の左半分）。これらの
結果により、TEILが転写活性化機能を有し、そしてtebs
に対する配列特異的な結合を介して標的遺伝子に作用す
ることが示される。

【００９８】（実施例７：転写活性化ドメインは、Ｃ末
端領域に局在する）タバコプロトプラストにおいて、TE
ILの過剰発現が、レポーター遺伝子の転写を活性化した
ので、TEILタンパク質はそれ自身に転写活性化ドメイン
を含む可能性がある。この転写活性化ドメインを同定す
るために、本発明者らは酵母ワンハイブリッド系を利用
した。酵母系は、レポーター遺伝子のより低い基底発現
が可能であり、そして植物系に比べて再現性が高いとい
う点で有利だからである。この系において、TEILとの融
合のためのGAL4 DNA結合ドメイン（GAL4bd）と、レポー
ター遺伝子としてGAL1-LacZまたはGAL1-HIS3とを利用す
る（Clontech）。従って、TEILとGAL4bdとの融合物は、
GAL4に由来する（GAL1への）DNA結合活性とTEILに由来
する転写活性とを有することにより、これらのレポータ
ー遺伝子を活性化すると考えられる。表２に示すよう
に、pGBT-TEIL（GAL4dbとTEILタンパク質との融合物を
産生するプラスミド）は、酵母においてレポーター遺伝
子（lacZまたはHIS3）を活性化した。活性化のレベル
は、コントロールとして使用したpCL1（完全長のGAL4タ
ンパク質を産生するプラスミド）の場合ほど高くはなか
った。なお、表２において、pGBT9は、GAL4 DNA結合ド
メインのみを有するコントロール構築物を示す。

【００９９】

【表２】

【０１００】DNA結合領域がＮ末端領域に存在すること
を考慮して、GAL4bdとの融合パートナーとして、TEILの
一連のＣ末端欠失変異体を作製した。pGBTーC556（アミ
ノ酸配列の残基557〜615にわたる領域を欠損するTEIL変
異体を産生するプラスミド）は、野生型TEILの約半分の
活性を保持した。一方、pGBT-C481およびpGBT-C412（そ
れぞれ、残基482〜523および残基413〜523にわたる領域
を欠損するTEIL変異体を産生する）は、完全に活性を欠
損した。このことは、TEILの転写活性化領域が、アミノ
酸配列の残基482〜615にわたる領域（特に、残基482〜5
56にわたる領域）に位置することを示す。しかし、残基
482〜615にわたる領域において、公知の転写活性化ドメ
イン（グルタミンリッチ配列、プロリンリッチ配列、ま
たは酸アミノ酸リッチ配列）は見出されなかった。

【０１０１】（実施例８：TEIL高発現ベクターによる形
質転換植物は、恒常的にTEIL遺伝子を発現する）市販の
pBI121（Clontech）を、出発物質として用いて、TEILを
高発現するベクターを構築した。 pBI121は、NOSプロモ
ーター（Pnos）およびターミネーター（Tnos）で制御さ
れるNPTII遺伝子、マルチクローニング部位、および35S
CaMVプロモーターの制御下にあり、Tnosを有する大腸
菌由来のβ-GUS遺伝子を含むプラスミドである。

【０１０２】pBI121をまず、XbaIおよびBamHIで切断
し、大きな断片を回収した。この断片に、プラスミド(p
BSK-TEIL）を制限酵素（SpeIおよびBglII）で消化して
切り出したTEIL cDNAの断片を連結した後、大腸菌JM109
に導入した。カナマイシン耐性株を回収して、目的とす
る高発現ベクター（pBI-35S-TEIL）を得た。制限酵素解
析により、正しい方向にTEIL遺伝子が導入されたことを
確認した。

【０１０３】得られた発現構築物を、Agrobacterium tu
mefaciens LBA4404（Oomsら、1981)）に、エレクトロポ
レーション（Wen-JunおよびForde、1989）により導入し
た。Nicotiana tabacum cv. Samsun NNの形質転換を、
葉片共存培養法（Horschら、1985）により行った。葉片
を、細菌溶液中に浸し、次いで、これを、インキュベー
ション培地（３%スクロースおよびB5ビタミンを有するM
urashige-Skoog（MS）基本培地）に移した。２日間、25
℃、白色蛍光灯の連続的な照射下、120μE/m²/sの強度
でおいて、共存培養した。次いで、この葉片を、80μg/
mlのカナマイシンを含む培地に移して、上記細菌を除去
した。３週間ごとに選択培地で継代し、カナマイシンを
含有する培地中で形成されたシュートを、ホルモンを減
少させた選択培地に移した。根形成後、植物を土の入っ
たポットに移した。14個体の独立した形質転換タバコ個
体（35S-TEIL-1〜14）を得た。

【０１０４】得られた形質転換体におけるTEIL遺伝子の
発現を、以下のように確認した。得られた形質転換体の
うち３個体（35S-TEIL-2、35S-TEIL-10および35S-TEIL-
14系統）の葉から、常法によって、 mRNAを抽出した
後、TEIL cDNAをプローブとして、ノザンブロット解析
を行った。コントロールとして、非形質転換植物（Nico
tiana tabacum cv. Samsun NN）の無傷の葉（SNN）およ
び傷をつけた１日後の葉（SNN-wound）を使用した。結
果を、図１０に示す。

【０１０５】無傷のコントロール植物の葉（SNN）にお
いて、TEIL遺伝子の発現は認められなかった（レーン
１）。傷をつけた１日後のコントロール植物の葉（SNN-
wound）においては、低レベルのTEIL遺伝子の発現が認
められた（レーン５）。一方、形質転換植物において
は、恒常的にTEILが高発現していることが確認された
（レーン２〜４）。

【０１０６】（実施例９：TEIL高発現形質転換タバコ
は、塩基性PR遺伝子をも恒常的に発現する）恒常的にTE
ILを産生する形質転換植物（35S-TEIL-2、35S-TEIL-10
および35S-TEIL-14系統）における、塩基性PR遺伝子の
発現を調べた。塩基性PR-5（オスモチン）遺伝子または
塩基性PR-2（β-1,3-グルカナーゼ）遺伝子のcDNAをプ
ローブとして用いて、実施例８に記載の方法と同様にし
てノザンブロット解析を行った。結果を図１０に示す。

【０１０７】形質転換植物の葉においては、傷をつけな
くても（つまり、ストレスの不在下であっても）、これ
らの塩基性PR遺伝子が恒常的に発現されていることが確
認された。

【０１０８】

【発明の効果】本発明により、エチレン誘導性遺伝子群
の発現を制御する転写因子が提供される。また、エチレ
ン誘導性遺伝子群の発現を制御する転写因子の植物体内
における発現レベルを調節することにより、環境ストレ
ス（例えば、病害体感染および傷ストレス）に対して抵
抗性が付与された植物を作出する方法が提供される。さ
らに、本発明により、エチレン誘導性遺伝子群の発現を
制御する転写因子をスクリーニングする方法が提供され
る。

【０１０９】（参考文献）１．Abeles (1973) Ethylene in Plant Biology（New Y
ork: Acadmic Press, Inc.）。２．AbelesおよびSaltvelt (1992) Ethylene in Plant
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rch, 17, 8385。４０．ZollerおよびSmith（1982） Nucl. Acid Researc
h, 10, 6487-6500。

【０１１０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Resources, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Japan Science and Technology Corporation <120> Transcriptional factor controlling expression of a group of ethylene inducible genes <130> J1-98412316 <140> JP <141> 1998-08-11 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2479 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum cv Samsun NN <220> <221> CDS <222> (244)..(2091) <400> 1 tttttctccc ttctctttct gtctctctct ctctctctct ctctctcttt tcccttgtgt 60 agtctgaagg gtcaattatt tctcatagag aagaagtgtt gaacgacttt ttgaaccaaa 120 aaaagaaaag gaaaaaaaac tcttttgagg agggaagtca tcaatttgag gattagctgt 180 ttaatcccat ttggtttctt gaaaggttgt tactttttta accgttaatt cgggcctgcc 240 aag atg atg atg ttt gaa gaa atg ggg ttc tgt ggc gat ctt gat ttc 288 Met Met Met Phe Glu Glu Met Gly Phe Cys Gly Asp Leu Asp Phe 1 5 10 15 ttc cct gct ccg cta aag gaa gtg gaa aca gct gct tcg cag att gag 336 Phe Pro Ala Pro Leu Lys Glu Val Glu Thr Ala Ala Ser Gln Ile Glu 20 25 30 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240 245 250 255 gcg gtg ata aag cac atg tcc cct gat atc gct aag att cgt aag ctg 1056 Ala Val Ile Lys His Met Ser Pro Asp Ile Ala Lys Ile Arg Lys Leu 260 265 270 gta agg caa tca aag tgt ttg cag gat aag atg acg gcc aag gaa agt 1104 Val Arg Gln Ser Lys Cys Leu Gln Asp Lys Met Thr Ala Lys Glu Ser 275 280 285 gca act tgg ctt gcc att atc aat cag gag gaa gtt ttg gct cga gaa 1152 Ala Thr Trp Leu Ala Ile Ile Asn Gln Glu Glu Val Leu Ala Arg Glu 290 295 300 ctt tat cct gat cgt tgt cca cct ttg tcc tca gct ggt ggt agt gga 1200 Leu Tyr Pro Asp Arg Cys Pro Pro Leu Ser Ser Ala Gly Gly Ser Gly 305 310 315 act ttt act atg aat tac agc agt gaa tac gac gtt gac ggt gtt gta 1248 Thr Phe Thr Met Asn Tyr Ser Ser Glu Tyr Asp Val Asp Gly Val Val 320 325 330 335 gat gag cct aac ttt gat gtt caa gag caa aaa cca aac cat ctc ggc 1296 Asp Glu Pro Asn Phe Asp Val Gln Glu Gln Lys Pro Asn His Leu Gly 340 345 350 ttg ctg atg tat gtt gat cgc ttc aag gag agg ctg cct atg caa caa 1344 Leu Leu Met Tyr Val Asp Arg Phe Lys Glu Arg Leu Pro Met Gln Gln 355 360 365 caa tct ctt cca atc aag gat gaa att atg att gcc aac tta gat ttc 1392 Gln Ser Leu Pro Ile Lys Asp Glu Ile Met Ile Ala Asn Leu Asp Phe 370 375 380 act cgg aag agg aag cca gcg gat gag ctg act ttc ttg atg gat cag 1440 Thr Arg Lys Arg Lys Pro Ala Asp Glu Leu Thr Phe Leu Met Asp Gln 385 390 395 aag ata tat act tgt gag tgt ctt caa tgt ccg cac agc gag ctc cgc 1488 Lys Ile Tyr Thr Cys Glu Cys Leu Gln Cys Pro His Ser Glu Leu Arg 400 405 410 415 aat ggt ttt cag gac aga tcc tcc aga gac aat cat caa tta act tgt 1536 Asn Gly Phe Gln Asp Arg Ser Ser Arg Asp Asn His Gln Leu Thr Cys 420 425 430 cct ttc aga aac tct ccg caa ttt gga gtt tca aat ttt cat gtt gat 1584 Pro Phe Arg Asn Ser Pro Gln Phe Gly Val Ser Asn Phe His Val Asp 435 440 445 gaa gtc aag ccg gtt gtc ttt cct caa caa tat gtc cag cca aag cca 1632 Glu Val Lys Pro Val Val Phe Pro Gln Gln Tyr Val Gln Pro Lys Pro 450 455 460 gct tct ctg ccg att aac caa gct ccg cct tcc ttt gat ctg tca gga 1680 Ala Ser Leu Pro Ile Asn Gln Ala Pro Pro Ser Phe Asp Leu Ser Gly 465 470 475 atc ggg gtt cct gaa gac ggg cag agg atg atc aat gag ctt atg tcg 1728 Ile Gly Val Pro Glu Asp Gly Gln Arg Met Ile Asn Glu Leu Met Ser 480 485 490 495 ttc tac gat aat aat ata caa gga aat aaa agc tca atg gcg gcg aac 1776 Phe Tyr Asp Asn Asn Ile Gln Gly Asn Lys Ser Ser Met Ala Ala Asn 500 505 510 gtt gtg atg tca aaa gag cag cct cgt caa caa cct agt att caa cag 1824 Val Val Met Ser Lys Glu Gln Pro Arg Gln Gln Pro Ser Ile Gln Gln 515 520 525 aac aat tac cta cac aac caa ggg att ata ttg gat gga aat atc ttt 1872 Asn Asn Tyr Leu His Asn Gln Gly Ile Ile Leu Asp Gly Asn Ile Phe 530 535 540 ggg gac acc aac att tct gct aac cat tcc atg ttc cca caa ggt gat 1920 Gly Asp Thr Asn Ile Ser Ala Asn His Ser Met Phe Pro Gln Gly Asp 545 550 555 cgg ttt gat cag tcc aag gtt tta act tca cca ttc aat gca ggc tct 1968 Arg Phe Asp Gln Ser Lys Val Leu Thr Ser Pro Phe Asn Ala Gly Ser 560 565 570 575 aac gac aat ttc cat ttc atg ttc ggg tct cca ttc aat tta cag tcc 2016 Asn Asp Asn Phe His Phe Met Phe Gly Ser Pro Phe Asn Leu Gln Ser 580 585 590 act gat tac act gaa gct ctt tct ggg att aca cag gat aac atg ccg 2064 Thr Asp Tyr Thr Glu Ala Leu Ser Gly Ile Thr Gln Asp Asn Met Pro 595 600 605 aag caa gat gtt ccg gtt tgg tat tag caaaggatgt gtgctcaaat 2111 Lys Gln Asp Val Pro Val Trp Tyr 610 615 gtatatcaag taccacgact ttgtgcacat ggatatcact tgtttccaag agggaagatc 2171 tacacattat cgagtggatt tgaatcgcct acagttctct cggtttggtg tttctgttac 2231 tacgtagttg tagaggttgg aggattctgc atggtgtaat gaaaaaggtg taagagacgt 2291 cctcggatat tcgccatgct ggttagaaag aacttataga tgtttttaaa taaggtagtc 2351 gtcgttttgt ttttacataa ttctgtatag gttagcttta tttgagattt caatctgttt 2411 aagtttctta aataactgta cttcgtcgat gattcgtgga attgtgaact cttttgtgcc 2471 aaaaaaaa 2479 <210> 2 <211> 615 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum cv Samsun NN <400> 2 Met Met Met Phe Glu Glu Met Gly Phe Cys Gly Asp Leu Asp Phe Phe 1 5 10 15 Pro Ala Pro Leu Lys Glu Val Glu Thr Ala Ala Ser Gln Ile Glu Gln 20 25 30 Glu Ser Glu Pro Val Met Asp Asp Asp Tyr Ser Asp Glu Glu Ile Asp 35 40 45 Val Asp Glu Leu Glu Arg Arg Met Trp Arg Asp Lys Met Lys Leu Lys 50 55 60 Arg Leu Lys Glu Met Thr Lys Gly Gly Lys Glu Gly Val Asp Ala Val 65 70 75 80 Lys Gln Arg Gln Ser Gln Glu Gln Ala Arg Arg Lys Lys Met Ser Arg 85 90 95 Ala Gln Asp Gly Ile Leu Lys Tyr Met Leu Lys Met Met Glu Val Cys 100 105 110 Lys Ala Gln Gly Phe Val Tyr Gly Ile Ile Pro Glu Lys Gly Lys Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Asp Asn Leu Arg Glu Trp Trp Lys Asp Lys Val 130 135 140 Arg Phe Asp Arg Asn Gly Pro Ala Ala Ile Ala Lys Tyr Gln Ala Asp 145 150 155 160 Asn Ala Ile Pro Gly Lys Asn Glu Gly Ser Asn Pro Ile Gly Pro Thr 165 170 175 Pro His Thr Leu Gln Glu Leu Gln Asp Thr Thr Leu Gly Ser Leu Leu 180 185 190 Ser Ala Leu Met Gln His Cys Asp Pro Pro Gln Arg Arg Phe Pro Leu 195 200 205 Glu Lys Gly Val Pro Pro Pro Trp Trp Pro Thr Gly Gln Glu Asp Trp 210 215 220 Trp Pro Gln Leu Gly Leu Ser Lys Asp Gln Gly Pro Pro Pro Tyr Lys 225 230 235 240 Lys Pro His Asp Leu Lys Lys Ala Trp Lys Val Gly Val Leu Thr Ala 245 250 255 Val Ile Lys His Met Ser Pro Asp Ile Ala Lys Ile Arg Lys Leu Val 260 265 270 Arg Gln Ser Lys Cys Leu Gln Asp Lys Met Thr Ala Lys Glu Ser Ala 275 280 285 Thr Trp Leu Ala Ile Ile Asn Gln Glu Glu Val Leu Ala Arg Glu Leu 290 295 300 Tyr Pro Asp Arg Cys Pro Pro Leu Ser Ser Ala Gly Gly Ser Gly Thr 305 310 315 320 Phe Thr Met Asn Tyr Ser Ser Glu Tyr Asp Val Asp Gly Val Val Asp 325 330 335 Glu Pro Asn Phe Asp Val Gln Glu Gln Lys Pro Asn His Leu Gly Leu 340 345 350 Leu Met Tyr Val Asp Arg Phe Lys Glu Arg Leu Pro Met Gln Gln Gln 355 360 365 Ser Leu Pro Ile Lys Asp Glu Ile Met Ile Ala Asn Leu Asp Phe Thr 370 375 380 Arg Lys Arg Lys Pro Ala Asp Glu Leu Thr Phe Leu Met Asp Gln Lys 385 390 395 400 Ile Tyr Thr Cys Glu Cys Leu Gln Cys Pro His Ser Glu Leu Arg Asn 405 410 415 Gly Phe Gln Asp Arg Ser Ser Arg Asp Asn His Gln Leu Thr Cys Pro 420 425 430 Phe Arg Asn Ser Pro Gln Phe Gly Val Ser Asn Phe His Val Asp Glu 435 440 445 Val Lys Pro Val Val Phe Pro Gln Gln Tyr Val Gln Pro Lys Pro Ala 450 455 460 Ser Leu Pro Ile Asn Gln Ala Pro Pro Ser Phe Asp Leu Ser Gly Ile 465 470 475 480 Gly Val Pro Glu Asp Gly Gln Arg Met Ile Asn Glu Leu Met Ser Phe 485 490 495 Tyr Asp Asn Asn Ile Gln Gly Asn Lys Ser Ser Met Ala Ala Asn Val 500 505 510 Val Met Ser Lys Glu Gln Pro Arg Gln Gln Pro Ser Ile Gln Gln Asn 515 520 525 Asn Tyr Leu His Asn Gln Gly Ile Ile Leu Asp Gly Asn Ile Phe Gly 530 535 540 Asp Thr Asn Ile Ser Ala Asn His Ser Met Phe Pro Gln Gly Asp Arg 545 550 555 560 Phe Asp Gln Ser Lys Val Leu Thr Ser Pro Phe Asn Ala Gly Ser Asn 565 570 575 Asp Asn Phe His Phe Met Phe Gly Ser Pro Phe Asn Leu Gln Ser Thr 580 585 590 Asp Tyr Thr Glu Ala Leu Ser Gly Ile Thr Gln Asp Asn Met Pro Lys 595 600 605 Gln Asp Val Pro Val Trp Tyr 610 615

【図面の簡単な説明】

【図１】シロイヌナズナにおけるエチレン応答経路を
模式的に示す図である。

【図２】 TEILのヌクレオチド配列および推定のアミノ
酸配列を示す図である。推定されるアミノ酸配列を、TE
IL cDNAのヌクレオチド配列の下に示す。三角は、酵母
ワンハイブリッドスクリーニングにより単離された元の
クローンの５'末端の位置を示す。予測されるα-螺旋構
造に下線を付す。

【図３】 TEIL、EIN3、およびEIL1ポリペプチドの間の
アミノ酸配列の比較を示す図である。黒のボックスで囲
った白字部分は、TEIL、EIN3、およびEIL1の全てにおい
てアミノ酸が同一であることを示す。

【図４】 TEILのDNA結合領域の解析を示す図および写
真である。図４Ａは、TEILタンパク質の欠失変異体を模
式的に示す。一連のＮ末端欠失変異タンパク質（ΔN1〜
ΔN4）、またはＣ末端欠失変異タンパク質（ΔC1〜ΔC
3）および完全長のTEIL（WT）をTrx（チオレドキシン）
との融合体として作製した。図４Ｂは、TEIL欠失変異体
を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）の結果
を示す。約50ngのTrxとTEIL欠失変異体との融合タンパ
ク質を、³²P標識したobs1プローブとともにインキュベ
ートした。

【図５】 TEILタンパク質の結合配列の至適化を示す図
である。TEILのコンセンサス結合配列を、random bindi
ng site selection法により決定した。Trx-TEILタンパ
ク質を、ランダムな18マーの配列を含む二本鎖オリゴヌ
クレオチドとともにインキュベートした。DNA/タンパク
質複合体をアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、
そして回収したDNAを、次の回の選択のためにPCRにより
増幅した。４回の選択後、増幅したDNAをプラスミド中
にクローン化し、そして配列決定した。図５Ａは配列決
定され、至適化された結合配列を与えるようにアライン
された87個のTEIL結合部位を示す。ランダムに選択した
39個の配列のTEIL結合親和性を、はじめの39個の配列の
右側に相対値で示した。最も高い値を100として示し、
親和性の強度の順に並べた。図５Ｂは、TEILのコンセン
サス配列の推定の結果を示す。

【図６】至適化されたTEIL結合配列の変異解析を示す
図および写真である。図６Ａは、最も高い結合親和性を
有するobs1の配列、ならびにその変異配列であるobs2お
よびobsm1〜5の配列を示す。太字は、TEILのコンセンサ
ス配列を示す。下線は、変異されたヌクレオチドを示
す。小文字は隣接領域を示す。図６Ｂは、変異オリゴヌ
クレオチドプローブを用いる電気泳動移動度シフトアッ
セイ（EMSA）の結果を示す。図６Ａにおいて示される配
列を有するオリゴヌクレオチドを、³²Pで標識し、そし
て組換えTrx-TEILタンパク質とともにインキュベートし
た。ps1は、タバコPR1aのプロモーターにおける結合配
列である。

【図７】エチレン処理したタバコの葉における増加し
たtebs結合活性を示す、電気泳動写真である。エチレン
処理したタバコの葉（レーン２〜８）または、未処理の
タバコの葉（レーン１）から調製した核抽出物（３μ
g）を、³²P標識した４コピーのobs1配列を含むDNAプロ
ーブとともに混合した。続いて、25倍モル過剰および12
5倍モル過剰の、obs1の二本鎖オリゴヌクレオチド（レ
ーン３および４）、obsm2の二本鎖オリゴヌクレオチド
（レーン５および６）、およびobsm3の二本鎖オリゴヌ
クレオチド（レーン７および８）を、TEIL-プローブDNA
結合反応に対する拮抗DNAとして添加した。

【図８】 TEIL遺伝子の転写産物の組織特異的蓄積およ
び傷誘導性蓄積を示すノザンブロット解析の結果を示
す、電気泳動写真である。図８Ａは、上欄に示す組織ま
たは細胞から単離したRNAについての結果を示す。図８
Ｂは、小片に切断して、示した期間、水とともにインキ
ュベートした成熟葉から単離したRNAについての結果を
示す。全RNA（20μg）をロードし、TEILのＣ末端領域に
相当するcDNA断片（pGAD-TEILクローンをDraIおよびBam
HIで切断して得られる断片）をプローブとして転写産物
を検出した。各レーンのRNAが等量ずつゲルにロードさ
れていることを、エチジウムブロミド（EtBr）により確
認した。

【図９】 tebs-レポーター遺伝子のタバコプロトプラ
ストにおける活性化およびTEIL過剰発現によるトランス
活性化を示すグラフである。一過性発現アッセイを、タ
バコ葉肉細胞プロトプラストを用いて行った。レポータ
ープラスミドは、CaMV 35S RNA minimalプロモーターと
GUS遺伝子との融合遺伝子からなり、４コピーのobs1（o
bs1-GUS）または４コピーのobsm2(obsm2-GUS)を含ん
だ。エフェクタープラスミド（35S-TEIL）は、CaMV35S
プロモーターの制御下にTEILcDNAを含んだ。コントロー
ルエフェクター（35S-NPTII）は、TEIL cDNAの代わりに
NPTIIコード配列を含んだ。５μgずつのレポータープラ
スミドとコントロールエフェクタープラスミド（35S-NP
TII）とを(白いカラム）、またはレポータープラスミド
とエフェクタープラスミド（35S-TEIL）（黒いカラム）
とを、エレクトロポレーションによりトランスフェクト
した。48時間培養した後、GUS活性を測定した。グラフ
は、それぞれ、６回測定した平均値およびその標準偏差
を示す。

【図１０】 TEILを過剰生産する３個体の形質転換タバ
コ植物（35S-TEIL-2、35S-TEIL-10および35S-TEIL-14系
統）において、TEIL遺伝子（teil）の発現および塩基性
PR遺伝子（PR-5およびPR-2）の発現が活性化されている
ことを示す、ノザンブロット解析の結果を示す電気泳動
写真である。コントロールとして用いた、非形質転換タ
バコの無傷の葉（SNN）および傷をつけた１日後の葉（S
NN-wound）についての結果も併せて示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者大橋祐子茨城県つくば市観音台２丁目１−２農林水産省農業生物資源研究所内Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD21 4B024 AA08 AA20 BA80 CA04 CA09 CA12 CA20 DA01 DA05 DA06 EA04 FA20 GA11 GA14 GA17 GA21 HA13 HA14 4B064 AG01 CA11 CA19 CC01 CC24 DA11 4B065 AA11X AA26X AA88X AA88Y AB01 AC14 AC16 BA01 BA03 BA10 BA30 BB01 BC01 BC31 BD50 CA24 CA53 4H045 AA10 CA30 EA50 EA60 FA74 GA25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御す
る転写因子であって、コンセンサス配列A(T/c)G(A/T)A
(C/T)CTに対して特異的な結合活性を有する、転写因
子。
【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）である、請求
項１に記載の転写因子：（ａ）配列表の配列番号２の82位のGluから302位のArg
までのアミノ酸、および配列番号２の482位のValから61
5位のTyrまでのアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、
転写因子；または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１またはそれ以上
のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を有し、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転
写因子。
【請求項３】以下の（ｃ）または（ｄ）である、請求
項２に記載の転写因子：（ｃ）配列表の配列番号２の１位のMetから615位のTyr
までのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する転写因
子；または（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、１またはそれ以上
のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を有し、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転
写因子。
【請求項４】傷誘導性遺伝子の発現を制御する、請求
項１〜３のいずれかに記載の転写因子。
【請求項５】前記エチレン誘導性遺伝子群が、塩基性
PR遺伝子群を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の転
写因子。
【請求項６】前記塩基性PR遺伝子群が、塩基性PR-2遺
伝子および塩基性PR-5遺伝子を含む、請求項５に記載の
転写因子。
【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の転写因
子をコードする遺伝子。
【請求項８】以下の（i）または（ii）のDNAからな
る、エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御する転写因子
をコードする遺伝子：（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するDN
A；または（ii）塩基配列（i）を有するDNAとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、エチレン誘導性遺伝子群の
発現を制御する転写因子をコードするDNA。
【請求項９】植物に環境ストレスに対する抵抗性を付
与する方法であって、請求項７または８に記載の遺伝子
を含むポリヌクレオチドで、植物細胞を形質転換する工
程；および、該形質転換した植物細胞を再分化させて、
植物を得る工程、を包含する、方法。
【請求項１０】前記ポリヌクレオチドが配列番号１に
記載の塩基配列を有するDNAを含む、請求項９に記載の
方法。
【請求項１１】前記環境ストレスが病原体感染を含
む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】前記環境ストレスが傷ストレスを含
む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】エチレン誘導性遺伝子群の発現を制御
する転写因子をスクリーニングする方法であって、コン
センサス配列A(T/c)G(A/T)A(C/T)CTに対して特異的な結
合活性を有するタンパク質を同定する工程を包含する、
方法。