PL202462B1 - Wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2, para starterów, sposób wytwarzania kwasu nukleinowego, sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego, sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN2, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, sposób transformowania komórki gospodarza, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, część lub rozmnóżka rośliny, wyizolowany polipeptyd, sposób wytwarzania polipe - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy wyizolowanego kwasu nukleinowego, uzyskanego z locus VRN2 ro sliny, który koduje polipeptyd zdolny do zaburzania jednej lub wi ekszej liczby w la sciwo sci fizycznych ro sliny, do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, gdzie w lasciwo sci fizyczne ro sliny s a wyselekcjonowane spo sród takich, jak odpowied z na wernalizacj e, czas kwitnienia, wielko sc i/lub kszta lt li scia czy odpo- wied z unikania cienia, jego alleli, fragmentów i pochodnych, polipeptydów kodowanych przez takie kwasy nukleinowe, przeciwcia l do tych peptydów. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2, para starterów, sposób wytwarzania kwasu nukleinowego, sposób identyfikowania, klonowania lub określania w genetycznie zmienionej roślinie obecności kwasu nukleinowego, sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN2, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, sposób transformowania komórki gospodarza, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, część lub rozmnóżka rośliny, wyizolowany polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu oraz sposób zaburzania właściwości fizycznych rośliny.

Wynalazek odnosi się zasadniczo do modyfikacji właściwości roślin, w szczególności odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liści i/lub odpowiedzi unikania cienia i powstał na bazie klonowania genu VRN2 oraz zmutowanych alleli z Arabidopsis thaliana, a także dzięki identyfikacji homologów w innych gatunkach.

Wynalazek dostarcza możliwości manipulowania czasem kwitnienia i/lub innymi właściwościami roślin, np. dzięki zwiększonej i obniżonej regulacji ekspresji genu VRN2. Dostarcza także szerszego zakresu modyfikacji zmiany stosownej cechy rośliny dzięki zastosowaniu alleli genu, mutantów i wariantów.

Rośliny muszą odpowiadać w sposób zintegrowany na szeroki zakres sygnałów ze środowiska w celu maksymalizacji sukcesu reprodukcji. Część spośród sposobów integracji musi wymagać percepcji pór roku, zarówno dla zapewnienia powstawania kwiatów podczas prawidłowej pory (do której jest zaadoptowany) oraz dla synchronizowania swojego kwitnienia z innymi przedstawicielami swojego gatunku, w celu szansy zapłodnienia krzyżowego. Arabidopsis thaliana stanowi dobry model roślinny, ze względu na to, ze wykazuje odpowiedzi na szeroki zakres bodźców środowiskowych, które obserwuje się u wielu gatunków. Kwitnienie u naturalnie występujących szczepów (ekotypów) Arabidopsis może być wywoływane zarówno długim dniem (zwiększony fotoperiod) lub wernalizacją, długie działanie niskiej temperatury przypominające chłody zimy. Podczas gdy zrozumiałe są liczne aspekty odpowiedzi na fotoperiod stosunkowo mniej wiadomo o drogach wernalizacji. Twórcy wynalazku użyli mutanta Arabidopsis o późnym kwitnieniu i odpowiedzi na wernalizację, mutant fca, jako tła do izolowania mutantów wykazujących zredukowaną odpowiedź na wernalizację, mutantów VRN. Wernalizacją jest procesem pobudzania kwitnienia przez niską temperaturę. Może także być uważana w aspekcie zimna sezonu zimowego, który obejmuje także zredukowaną długość dnia. Wiele gatunków roślin, które rosną w niższej temperaturze lub chłodnych klimatach charakteryzują się obligatoryjnym wymaganiem wernalizacji w celu uzyskania kwiatów. Rośliny takie zazwyczaj kiełkują jesienią, przechodzą zimę jako wegetatywne rośliny i kwitną w łagodnych warunkach wiosny. Wernalizacją działa zatem jako sygnał pozwalający roślinom na rozpoznawanie sezonów i określenie czasu kwitnienia dla zmaksymalizowania szansy sukcesu reprodukcyjnego.

Gatunków, dla których kwitnienie jest istotne dla produkcji ziarna jest dużo, zasadniczo wszystkie zboża rosnące z nasion, wśród których ważnymi przykładami zbóż są jęczmień, ryż i kukurydza, prawdopodobnie bardziej ważna rolniczo w strefach o cieplejszym klimacie, oraz pszenica, jęczmień, owies czy żyto w większości klimatów. Ważnymi produktami pochodzącymi z nasion są rzepak z oleistymi nasionami, burak cukrowy, kukurydza, słonecznik, soja czy sorgo. Plony zbierane z uwagi na korzenie, oczywiście które rosną corocznie z nasion i wytwarzają nasiona, są wielu rodzajów i zależą od zdolności rośliny do kwitnienia, zapylania i wydawania nasion. Kontrola czasu kwitnienia jest ważna w ogrodnictwie. Rośliny ogrodnicze, których kwitnienie można kontrolować obejmują sałatę, endywię i warzywa z krzyżowych jak kapusta, brokuły czy kalafior oraz goździki i pelargonie.

Arabidopsis thaliana jest rośliną fakultatywnie długiego dnia, kwitnącą wcześnie przy długim dniu i późno przy krótkim dniu. Ze względu na to, że jest mała, ma dobrze scharakteryzowany genom, można ją z łatwością transformować i regenerować oraz posiada szybki cykl wzrostu, Arabidopsis jest idealną rośliną modelową do badania kwitnienia i jego kontroli.

Dodatkowo oprócz sklonowania genu VRN2, twórcy wynalazku niespodziewanie odkryli, że VRN2 jest czynnikiem transkrypcyjnym, co tym samym otwiera szereg emocjonujących dróg zastosowania niniejszego wynalazku. Bez związania z teorią lub jakimkolwiek ograniczeniem zasięgu niniejszego wynalazku, VRN2 może być wymagany dla prawidłowej odpowiedzi na wernalizację ponieważ działa on jako regulator genów, które ostatecznie prowadzą do przejścia od wzrostu wegetatywnego do stadium reprodukcji. W modelu takim, zimno, lub cząsteczki wymagane w odbieraniu zimna mogą regulować aktywność lub ekspresję białka VRN2, które z kolei może regulować ekspresję większej

PL 202 462 B1 liczby genów, co ostatecznie prowadzi do kwitnienia. Ponadto fenotyp odpowiedzi unikania cienia jaki wykazuje mutant vrn2-1, co zademonstrowano eksperymentalnie poniżej, dostarcza wskazówki, że VRN2 odgrywa także rolę w regulacji kształtu liścia, w szczególności w odpowiedzi na zwiększenie promieniowania w dalekiej podczerwieni. Razem te dwa procesy, na które ma wpływ niedobór lub ograniczenie aktywności VRN2, prowadzą do szeregu badań o aspekcie rolniczym.

Po pierwsze, wymuszona ekspresja VRN2 (przykładowo pod kontrolą silnego promotora, takiego jak promotor CaMV35S) w dzikim tle może być użyta do zmiany wymagań wernalizacji rośliny przez kwitnieniem. Ponieważ duża liczba handlowych kultywarów szeregu gatunków, włączając (diploidalne) pszenicę, jęczmień czy buraka cukrowego wymaga wernalizacji do kwitnienia, modyfikacja tego wymagania, poprzez zredukowanie czasu trwania wymaganej wernalizacji lub zmianę optymalnej temperatury czy zniesienie obu wymagań jest przydatne rolniczo. Przykładowo, ozimina, którą można zasiać i pozostawić w ziemi przez okres krótszy niż zwykle (tzn. zredukowany czas wernalizacji) korzystnie może mieć zmniejszone ryzyko uszkodzenia związanego z warunkami ostrej pogody zimowej jako, że zboże jest eksponowane na zimowe warunki przez krótszy czas.

Po drugie, można zastosować obniżenie regulacji ekspresji VRN2, przykładowo za pomocą użycia antysensownego cDNA VRN2 w celu szybkiego zajścia odpowiedzi unikania cienia obserwowanego w mutantach vrn2-1. Można to użyć w sytuacjach, gdzie problemem jest stłoczenie zboża. W oparciu o dowody doś wiadczalne tu dostarczane dla fenotypu mutantów vrn2, spodziewane jest, że rośliny takie wykazują niższą odpowiedź na takie warunki i wytwarzają zasadniczo normalne liście tzn. takie jakby nie rosły w zagęszczeniu lub warunkach stłoczenia. Prawidłowym fenotypem unikania cienia jest redukcja wielkości liścia, która redukuje cień w warunkach zatłoczenia; mutanty vrn2-1, defektywne w wytwarzaniu VRN2, wykazują mniejsze zredukowanie rozmiaru liścia w warunkach, które normalnie prowadziłyby do fenotypu unikania cienia. Efekt ten może być powielany przykładowo poprzez użycie antysensownego cDNA VRN2 dla obniżenia regulacji ekspresji VRN, uniemożliwiającej lub redukującej odpowiedź uchylania liści nawet w warunkach zatłoczenia.

Po trzecie, można wykorzystywać poszczególne wyizolowane domeny biała VRN2. Domenę wiążącą DNA z palca cynkowego VRN2 można użyć do bezpośredniej lub kontrolowanej ekspresji genu w precyzyjny sposób. Palec cynkowy VRN2 może rozpoznawać specyficzne sekwencje DNA, które reprezentują elementy w promotorach ich normalnych genów docelowych. Przez stworzenie fuzji białkowej, obejmującej domenę wiążącą DNA (palec cynkowy) z VRN2 oraz domenę aktywująca lub reprymującą z białka heterologicznego można kontrolować ekspresję genów docelowych dla VRN2. Pozwala to na precyzyjną kontrolę ekspresji tych genów, które są normalnymi genami docelowymi dla VRN2. Mając takie geny, pojedyncze lub w kombinacji, można zastosować ostateczną kontrolę przejścia do kwitnienia (zazwyczaj po wernalizacji), ich bezpośredniej ekspresji w innych warunkach w celu wywołania zmian w kwitnieniu i/lub w jednej lub większej liczbie innych cech rośliny. Ekspresja (normalnie w odpowiedzi na daleką podczerwień) genów docelowych jest także kontrolowana dzięki użyciu fuzji białkowych z VRN2 zawierających palec cynkowy z VRN2. Ponadto, użycie domeny palca cynkowego z VRN2 w tradycyjnych eksperymentach typu SELEX czy „one-hybrid można zastosować dla ujawnienia genów docelowych czy sekwencji DNA normalnie wiązanych przez VRN2.

Kwaśną domenę aktywującą z VRN2 można użyć do regulowania aktywności fuzji białkowej, obejmującej białko wiążące DNA o znanej specyficzności oraz domenę aktywującą z VRN2. Pozwala to na regulację genów docelowych dla innych białek wiążących DNA wymaganych do kwitnienia lub genów docelowych w całkowicie nie spokrewnionych procesach.

Twórcy wynalazku sklonowali, scharakteryzowali i zmienili genetycznie gen VRN2 z Arabidopsis thaliana, zarówno typu Columbia jak Landsberg erecta, a także zidentyfikowali alternatywne składanie RNA oraz znaleźli formy zmutowane jak również homologiczne w innych gatunkach.

Zgodnie z wynalazkiem wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2 jest to kwas nukleinowy o sekwencji, która ma co najmniej 70% sekwencji identycznej z pełnej długości sekwencją nukleotydową SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7 i która to sekwencja jest zdolna do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny, do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, przy czym właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia.

Korzystnie sekwencja jest w co najmniej 80% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID

NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7, korzystniej jest w co najmniej 90% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6

PL 202 462 B1 lub SEK ID NR: 7, a najkorzystniej sekwencja jest w co najmniej 95% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7.

Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku jest zdolny do redukcji wernalizacji rośliny wymaganej do kwitnienia i korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 2, która to sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 1.

Kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie obejmuje też sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 5, która to sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 4 oraz korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 8, która to sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 7.

Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie też obejmuje sekwencję nukleotydową z SEK ID NR: 3 lub SEK ID NR: 6, a ponadto obejmuje sekwencję posiadającą promotor i/lub funkcję regulacyjną.

Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie obejmuje wariant sekwencji homologiczny do wariantu sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7, przy czym wariant sekwencji jest sekwencją VRN2 uzyskaną z rośliny innego gatunku niż Arabidopsis thaliana. Korzystnie też obejmuje sekwencję komplementarną do sekwencji określonych powyżej.

Zgodna z wynalazkiem jest para starterów, z których każdy zawiera wyizolowany kwas nukleinowy mający jako sekwencję kodującą sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b, przy czym kwas nukleinowy ma długość 15 do 40 nukleotydów.

Zgodną z wynalazkiem jest również para starterów z których każdy zawiera wyizolowany kwas nukleinowy używany jako sonda lub starter, mający sekwencję, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych, przy czym kwas nukleinowy ma długość 15 do 40 nukleotydów.

Korzystnie każdy izolowany kwas nukleinowy w parze starterów według wynalazku ma długość 19 do 28 nukleotydów i korzystnie para starterów według wynalazku jest wybrana z sekwencji

ATA TCC CGA GGC AAC AGA GCT TG i AAG AAT AAG TTA CAA TCC GAT AAA TCG G;

TCT ACT GGG ATG TTT CGC AGC TTT C i AAG AGT GGG CTA TGG CTG G; oraz

GCC AAT CGG TGT TTT CGC AGC TTT C i AAG AAT AAG TTA CAA TCC GAT AAA TCG G.

Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że wytwarza się pochodną sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7 przez dokonanie jednej lub większej liczby addycji, insercji, delecji lub substytucji w sekwencji nukleotydowej i gdzie sekwencja pochodna jest albo zdolna do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, przy czym właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia lub odpowiedź unikania cienia albo posiada promotor i/lub funkcję regulacyjną, przy czym sposób zawiera etap modyfikacji każdej z sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7.

Zgodnie z wynalazkiem sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego zdefiniowanego powyżej, charakteryzuje się tym, że przeszukuje się bazę danych przy użyciu sekwencji nukleotydowej sondy lub startera lub wykorzystuje się sondę lub starter, przy czym sondą lub starterem jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych albo wykorzystuje się parę starterów według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Korzystnie sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego według wynalazku zdefiniowanego powyżej przeprowadza się następująco:

(a) dostarcza się preparat kwasu nukleinowego z komórki roślinnej,

PL 202 462 B1 (b) dostarcza się cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest sondą, lub dostarcza się parę starterów cząstek kwasu nukleinowego odpowiednich do PCR, przy czym sondą lub co najmniej jednym ze starterów w parze starterów jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych, (c) kontaktuje się kwas nukleinowy w preparacie z sondą w warunkach odpowiednich dla hybrydyzacji lub ze starterami w warunkach odpowiednich do przeprowadzenia reakcji PCR oraz (d) identyfikuje się kwas nukleinowy według wynalazku, o ile jest obecny, poprzez jego hybrydyzację z sondą kwasu nukleinowego lub przeprowadza się reakcję PCR i określa się obecność lub brak zamplifikowanego produktu PCR. W omówionym sposobie korzystnie stosuje się parę starterów kwasu nukleinowego według wynalazku, określoną powyżej.

Według wynalazku sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN, charakteryzuje się tym, że wykorzystuje się sondę lub starter, przy czym sondą lub starterem jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych lub wykorzystuje się parę starterów według wynalazku.

Zrekombinowany wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje kwas nukleinowy według wynalazku, określony powyżej. Korzystnie kwas nukleinowy objęty wektorem jest zdolny do regulowania jednym lub większą liczbą genów wymaganych w przejściu ze wzrostu wegetatywnego do stadium reprodukcji i/lub jest zdolny do regulowania jednym lub większą liczbą genów wymaganych w określaniu wielkości liścia i/lub kształtu. Korzystnie kwas nukleinowy w wektorze jest funkcjonalnie połączony z promotorem do transkrypcji w komórce gospodarza, przy czym promotor jest ewentualnie promotorem indukowanym, a zwłaszcza jest promotorem konstytutywnym. Wektor według wynalazku jest korzystnie wektorem roślinnym.

Komórka gospodarza według wynalazku jest to komórka, która jest stransformowana kwasem nukleinowym według wynalazku określonym powyżej, przy czym jest to kwas heterologiczny w komórce.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku jest komórką roślinną, ewentualnie obecną w roś linie.

Według wynalazku sposób transformowania komórki gospodarza, charakteryzuje się tym, że do komórki gospodarza wprowadza się wektor według wynalazku, określony powyżej.

Według wynalazku sposób wytwarzania rośliny transgenicznej polega na tym, że transformuje się komórkę gospodarza, poprzez wprowadzenie do tej komórki wektora według wynalazku, określonego powyżej i następnie ze stransformowanej komórki gospodarza regeneruje się roślinę. Roślina transgeniczna według wynalazku otrzymywana tym sposobem jest klonem lub skrzyżowaną wsobnie lub potomstwem hybrydowym lub innym potomkiem rośliny transgenicznej i w każdym przypadku zawiera komórkę roślinną według wynalazku. Roślina ta korzystnie jest rośliną rolniczą lub ogrodniczą i szczególnie korzystnie jest wyselekcjonowana z nastę pują cych roś lin: ryż , kukurydza, pszenica, ję czmień, owies, żyto, rzepak z oleistymi nasionami, burak cukrowy, słonecznik, soja, sorgo, sałata, endywia, kapusta, brokuły, kalafior, goździk, pelargonia, tytoń, bawełna, rzepak, pomidor, mango, brzoskwinia, jabłko, gruszka, truskawka, banan, melon, marchew, cebula, groch, seler, a zwłaszcza z następujących: tytoń, rzepak z oleistymi nasionami, ryż i pszenica.

Zgodna z wynalazkiem jest również część lub rozmnóżka rośliny, która zawiera komórkę roślinną według wynalazku.

Zgodny z wynalazkiem jest wyizolowany polipeptyd, charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 albo zawiera co najmniej 70% sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencją SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 5 lub SEK ID NR: 8, który to polipeptyd jest zdolny do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny do której kwas nukleinowy jest

PL 202 462 B1 wprowadzony, gdzie właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową składającą się z sekwencji SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 5 lub SEK ID NR: 8.

Sposób wytwarzania tego polipeptydu charakteryzuje się według wynalazku tym, że w odpowiedniej komórce gospodarza wywołuje się lub umożliwia się wytwarzanie kwasu nukleinowego według wynalazku, określonego powyżej.

Zgodnym z wynalazkiem jest sposób zaburzania właściwości fizycznych rośliny wyselekcjonowanych spośród takich cech jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia, charakteryzujący się tym, że (i) wywołuje się lub umożliwia się w roślinie transkrypcję z kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję komplementarną do sekwencji wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku lub (ii) wywołuje się lub umożliwia się transkrypcję z kwasu nukleinowego według wynalazku i korzystnie redukuje się ekspresję VRN2 poprzez kosupresję.

W wyniku prac eksperymentalnych twórców wynalazku otrzymano wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd obejmujący przedstawioną tu sekwencję aminokwasową (np. SEK ID NR: 2; SEK ID NR: 5) który zawiera sekwencję kodującą (np. SEK ID NR: 1; SEK ID NR: 4).

Zidentyfikowano formy alleliczne lub formy alternatywnego składania RNA genu. Wytworzono peptydy oraz kodujący kwas nukleinowy (np. jak SEK ID NR: 8, kodowana przez SEK ID NR: 7) oraz polipeptydy i kwas nukleinowy obejmujący zidentyfikowane mutacje.

Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może posiadać sekwencję geny VRN2 z Arabidopsis thaliana jak pokazano na SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3 (sekwencja genomowa Landsberg erecta), SEK ID NR: 4 czy SEK ID NR: 6 (sekwencja genomowa Columbia). Może być mutantem lub wariantem, pochodną czy allelem lub homologiem dostarczanej sekwencji. Korzystnymi mutantami, wariantami, pochodnymi czy allelami to takie, które kodują białko, które ma zachowane właściwości funkcjonalne białka kodowanego przez gen dzikiego typu, w szczególności zdolność do zmiany odpowiedzi na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia.

Mutant, wariant, pochodna, allel czy homolog wyizolowany kwasu nukleinowego według wynalazku może zatem wpływać na właściwości fizyczne rośliny w szczególności na odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia, jak omówiono.

Polinukleotydy, które nie są w 100% identyczne z przedstawionymi tu sekwencjami można uzyskać różnymi sposobami.

Warianty VRN2 (przykładowo formy alleliczne) genu można uzyskać przykładowo poprzez przeszukiwanie bibliotek cDNA czy genomowego DNA zrobionych z roślin Arabidopsis thaliana lub innych komórek.

Można też uzyskać homologi genu z innej rośliny jednoliściennej czy dwuliściennej, poprzez wytworzenie lub otrzymanie bibliotek cDNA zrobionych z dzielących się komórek lub tkanek czy bibliotek genomowych z innych gatunków roślin oraz poprzez przeszukiwanie takich bibliotek sondami obejmującymi cały lub część kwasu nukleinowego według wynalazku, w warunkach o średniej do wysokiej siły jonowej (przykładowo hybrydyzacja na stałym nośniku (filtr) z inkubacją w 42°C, w roztworze zawierającym 50% formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM cytrynian sodowy), 50 mM fosforan sodowy (pH 7,6), 5x roztwór Denhardfa, 10% siarczan dekstranu i 20 μg/ml DNA spermy łososia, a następnie płukanie 0,03 M chlorkiem sodowym i 0,03 M cytrynianem sodowym (tzn. 0,2 x SSC) w od około 50°C do około 60°C).

Wyizolowany kwas nukleinowy hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową przedstawioną na figurach, w określonych powyżej warunkach hybrydyzacji i płukania. Taki kwas nukleinowy jest dogodny do użycia jako sonda do wykrywania genu VRN2 przykładowo techniką typu Southern.

Alternatywnie polinukleotydy według wynalazku można uzyskać poprzez ukierunkowaną mutagenezę sekwencji przedstawionych na figurach lub ich allelicznych wariantów. Może to być przydatne tam gdzie przykładowo wymagane są ciche zmiany kodonu w sekwencjach dla uzyskania optymalnych kodonów dla określonej komórki gospodarza, w której sekwencja polinukleotydowa ulega ekspresji. Inne zmiany sekwencji mogą być pożądane w celu wprowadzenia miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne lub w celu zmienienia właściwości lub funkcji polipeptydów kodowanych przez polinukleotydy. Dalsze zmiany mogą być pożądane dla wprowadzenia szczególnych zmian w kodowaniu, które są wymagane dla dostarczenia, przykładowo, podstawień konserwatywnych.

PL 202 462 B1

W odniesieniu do klonowania może być konieczne ligowanie jednego lub wię cej fragmentów genu dla wytworzenia sekwencji kodującej o pełnej długości. Także, kiedy nie zostanie uzyskana cząsteczka kodującego kwasu nukleinowego o pełnej długości mniejsze cząsteczki reprezentujące część całej cząsteczki można użyć do uzyskania klonów o pełnej długości. Wstawki można wytwarzać z klonów częściowego cDNA i używać do przeszukiwania bibliotek cDNA. Wyizolowane klony pełnej długości można subklonować w wektorach ekspresyjnych a aktywność testować poprzez transfekcję do odpowiednich komórek gospodarza, np. z plazmidem reporterowym.

Kwas nukleinowy według wynalazku może zawierać sekwencje kontrolujące transkrypcję genu VRN2. Takie sekwencje kontrolne będą znajdowane na końcu 5' w stosunku do otwartej ramki odczytu genu i są uzyskiwane poprzez przeszukiwanie biblioteki genomowego DNA kwasem nukleinowym według wynalazku, selekcjonowanie klonu, który hybrydyzuje w warunkach średniej do wysokiej siły jonowej oraz sekwencjonowanie klonu 5' w stosunku do otwartej ramki odczytu genu. Wówczas gdy jedynie niewielka część sekwencji obecna jest w regionie 5', może być ona użyta do ponownego przeszukiwania biblioteki w genomowym spacerze po dalsze sekwencje leżące powyżej. Analiza regionu położonego powyżej dostarczy regionów kontrolnych dla ekspresji genu włączając regiony kontrolne wspólne dla wielu genów (tzn. TATA i CAAT box) oraz inne regiony kontrolne, zazwyczaj położone od 1 do 10000, jak 1 do 1000 lub 50 do 500 nukleotydów powyżej startu transkrypcji. W celu potwierdzenia, że regiony te są regionami kontrolnymi genu można je podłączyć do genu reporterowego (takiego jak (β-galaktozydaza) i testować jak korzystniej in vitro lub in vivo. Przykładowo konstrukt z regionem kontrolnym (np. obejmującym 50 do 500 nukleotydów powyżej startu transkrypcji) i genem reporterowym można użyć do wytworzenia rośliny transgenicznej, a wzór ekspresji, zarówno przestrzenny jak i rozwojowy, można porównać z tym dla genu VRN2. Znalezienie zasadniczo podobnych wzorów ekspresji pokazuje, że konstrukt obejmuje zasadniczo region kontrolny genu dzikiego typu.

SEK ID NR: 3 i SEK ID NR: 6 przedstawiają sekwencję nukleotydową genomowego regionu VRN2 obejmującego promotor, odpowiednio dla ekotypów Arabidopsis thaliana -Landsberg erecta i Columbia oraz elementów regulacyjnych z końca 3'.

Region kontrolny można zmutować w celu zidentyfikowania specyficznych subregionów odpowiedzialnych za kontrolę transkrypcji. Można to osiągnąć różnymi technikami dobrze znanymi specjalistom, takimi jak testy protekcji przed DNAzą (tzw. odcisk stopy), w których region kontrolny jest kontaktowany z ekstraktem z komórki aktywnie eksprymującej gen VRN2 i określane są obszary regionu kontrolnego wiążące czynniki z tego ekstraktu. Wyizolowany kwas nukleinowy może zatem dzięki takiej metodzie obejmować regiony kontrole.

Pomiędzy intronami genomowego DNA znaleziono sekwencje egzonowe, kodujące gen VRN2 w roślinie. Takie sekwencje egzonowe można uzyskać w sposób analogiczny do opisanego powyżej dla sekwencji kontrolujących transkrypcję, dzięki odpowiedniemu spacerowi po genomie prowadzonemu pomiędzy sekwencjami intronowymi. Położenie egzonów można określić poprzez porównanie sekwencji genomowych i cDNA genu i zaobserwowanie gdzie sekwencje są ustawione w rzędzie a gdzie się różnią oraz szukając miejsc konsensusowych dla składania sekwencji, które definiują granice intron/egzon.

Jak zauważono powyżej, zmiany sekwencji, w celu uzyskania mutanta, wariantu czy pochodnej mogą być jedną lub większą liczbą addycji, insercji, delecji czy substytucji jednego czy większej liczby nukleotydów w kwasie nukleinowym prowadzących do addycji, insercji, delecji czy substytucji jednego lub większej liczby aminokwasów w kodowanym polipeptydzie. Oczywiście włączone są zmiany w kwasie nukleinowym nie wprowadzające różnicy w kodowanej sekwencji aminokwasowej (zdegenerowany odpowiednik).

Korzystne sekwencje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku są tu przedstawione, przykładowo patrz SEK ID NR: 1 i SEK ID NR: 4, dla których odpowiednie przewidywane sekwencje kodujące aminokwasy peptydów według niniejszego wynalazku są przedstawione w SEK ID NR: 2 i SEK ID NR: 5.

Sekwencja aminokwasową mutanta, allelu, wariantu czy pochodnej według niniejszego wynalazku może zawierać w sekwencji tu przedstawionej pojedynczą zmianę aminokwasową w stosunku do sekwencji przedstawionej w odpowiedniej SEK ID NR: lub na odpowiedniej figurze lub 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 lub 9 zmian, około 10, 15, 20, 30, 40 czy 50 zmian lub więcej niż około 50, 60, 70, 80 czy 90 zmian. Dodatkowo do jednej lub większej liczby zmian w sekwencji aminokwasowej przedstawionej na odpowiedniej figurze sekwencja aminokwasową mutanta, allelu, wariantu czy pochodnej może zawierać dodatkowe aminokwasy na końcu C i/lub na końcu N.

PL 202 462 B1

Sekwencja pokrewna do sekwencji specyficznie tu ujawnianej ma homologię z tą sekwencją. Homologia ta może być na poziomie sekwencji nukleotydowej i/lub sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, sekwencja nukleotydową i/lub aminokwasową ma homologię z sekwencją kodującą lub sekwencją kodowaną przez przedstawioną tu sekwencję nukleotydową, przykładowo, SEK ID NR: 2 czy SEK ID NR: 5, korzystnie na poziomie co najmniej około 50% lub 60% lub 70% lub 80% homologii, bardziej korzystnie co najmniej około 90%, 95%, 96%, 97%, 98% czy 99% homologii.

Należy rozumieć, że homologia na poziomie aminokwasowym podawana jest zasadniczo w terminach podobieństwa lub identycznoś ci aminokwasów. Podobień stwo pozwala na „warianty konserwatywne, tzn. substytucję reszty hydrofobowej jak izoleucyny, waliny, leucyny czy metioniny na którąś z nich, lub substytucję polarnej reszty na inna polarną jak argininy za lizynę, kwas glutaminowy za asparaginowy czy glutaminę za asparaginę. Podobieństwo może być zdefiniowane i określone dzięki programowi TBLASTN według Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, który jest standardowo używany przez specjalistów lub, i to może być korzystne, dowolny ze standardowych programów BestFit czy GAP, które są częścią pakietu Wisconsin Package, Version 8, wrzesień 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711). Program BestFit tworzy optymalne przyrównania najbardziej podobnych segmentów pomiędzy dwiema sekwencjami. Optymalne przyrównania znajdowane są dzięki wprowadzaniu przerw dla zmaksymalizowania liczby dopasowań przy zastosowaniu algorytmu miejscowej homologii według Smith'a i Waterman'a (Advances in Applied Mathematics (1981) 2, pp. 482-489). Program GAP stosuje algorytm Needleman'a i Wunsch'a dla przyrównania dwóch pełnych sekwencji, który maksymalizuje liczbę dopasowań i minimalizuje liczbę przerw. Zasadniczo, stosowane są parametry: kary za wprowadzenie przerwy = 12 oraz kary za wydłużenie przerwy = 4.

Homologia rozciąga się zasadniczo na całej długości odpowiednio tu przedstawionej sekwencji, dopóki nie jest określone inaczej, lub może rozciągać się na ciągłej sekwencji od około lub powyżej niż około 20, 25, 30, 33, 40, 50, 67, 133, 167, 200, 233, 267, 300, 333, 400, 450, 500, 550, 600 lub na większej liczbie aminokwasów lub kodonów w porównaniu z odpowiednią sekwencją aminokwasową lub sekwencją nukleotydową, co może mieć miejsce.

W bardzo korzystnych wykonaniach, cał y procent homologii odnosi się do przedstawionego tu procentu identyczności sekwencji. W tym kontekście procent (%) identyczności sekwencji aminokwasowej z odpowiednią określoną sekwencją odniesienia jest zdefiniowany jako procent reszt aminokwasowych w kandydującej sekwencji, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w sekwencji odniesienia po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli to konieczne, dla uzyskania maksymalnego procentu identyczności sekwencji i bez rozpatrywania żadnych konserwatywnych substytucji jako części identyczności sekwencji.

Stosowany tu % identyczności można określić za pomocą WU-BLAST-2 według [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html]. WU-BLAST-2 stosuje szereg parametrów badających, z których większość ma wartości domyślne. Ustawione parametry są zadane z następującymi wartościami: rozpiętość zakładki = 1, frakcja zakładki = 0,125, próg słowa (T) = 11. HSPS i HSPS2 są wartościami dynamicznymi i są ustalane przez sam program w zależ noś ci od kompozycji danej sekwencji oraz kompozycji danej bazy danych wobec której bada się interesującą sekwencję; jakkolwiek wartości mogą być ustawione w celu zwiększenia czułości.

% identyczności sekwencji aminokwasowej jest określany na podstawie liczby pasujących identycznych reszt podzielonej przez całkowitą liczbę reszt z „najdłuższej sekwencji w przyrównywanym regionie. „Najdłuższą sekwencją jest ta, która posiada najbardziej istotne reszty w przyrównanym regionie (przerwy wprowadzone przez WU-Blast-2 w celu maksymalizacji przyrównania są ignorowane).

W podobny sposób procent (%) identycznoś ci sekwencji kwasu nukleinowego w stosunku do sekwencji nukleotydowej odniesienia określany jest jako procent reszt nukleotydowych w badanej sekwencji, które są identyczne z resztami nukleotydowymi sekwencji odniesienia. Wartości identyczności można określać za pomocą modułu BLASTN z WU-BLAST-2 stosując domyślne parametry dla rozpiętości zakładki oraz frakcji zakładki, stosownie 1 oraz 0,125.

Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może składać się zasadniczo lub całkowicie z omawianej sekwencji kodującej. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może zawierać promotor lub inną sekwencję regulatorową jak omówiono dalej i taka sekwencja regulatorowa może być heterologiczna do sekwencji kodującej, co znaczy, że nie jest w sposób naturalny funkcjonalnie z nią połączona. Kwas nukleinowy wedł ug niniejszego wynalazku moż e być czą steczką cDNA lub może nie posiadać jednego lub większej liczby intronów, które występują naturalnie lub może być

PL 202 462 B1 w formie naturalnie nie występującej. Sekwencja kodująca według niniejszego wynalazku może być zawarta w większej cząsteczce kwasu nukleinowego mniejszej niż około 10000 nukleotydów, mniejszej niż około 5000 nukleotydów czy mniejszej niż około 2000 nukleotydów.

W jednym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczany jest takż e kwas nukleinowy zawierają cy lub składający się zasadniczo z sekwencji nukleotydów komplementarnych do sekwencji nukleotydowej, hybrydyzującej z dowolną dostarczaną tu sekwencją kodującą. Inaczej patrząc kwas nukleinowy według tego aspektu, hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową komplementarną do dowolnej dostarczanej tu sekwencji kodującej. Oczywiście DNA jest zasadniczo dwuniciowy i często stosowane są takie techniki przenoszenia DNA jak w hybrydyzacji typu Southern po rozdzieleniu nici od siebie bez rozróżniania, która nić hybrydyzuje. Korzystnie hybrydyzujący kwas nukleinowy lub do niego komplementarny koduje produkt wpływający na właściwości fizyczne rośliny, w szczególności na takie cechy jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liści i/lub odpowiedź unikania cienia, np. w Arabidopsis thaliana. Korzystne warunki hybrydyzacji są znane specjalistom i zasadniczo są wystarczająco ostre dla pozytywnej hybrydyzacji pomiędzy interesującymi sekwencjami z wyłączeniem innych sekwencji.

Kwas nukleinowy, który zawiera przykładowo DNA kodujący polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VRN2 lub inny ujawniony tu polipeptyd, w formie genomowej lub cDNA, może występować w formie zrekombinowanej i korzystnie jako replikujący się wektor, przykładowo wektor plazmidowy, kosmidowy, fagowy lub binarny wektor Agrobacterium. Kwas nukleinowy może znajdować się pod kontrolą odpowiedniego promotora lub innych elementów regulacyjnych do ekspresji w komórce gospodarza takiej jak komórka mikroorganizmu, np. bakteryjna czy komórka roślinna. W przypadku genomowego DNA, może on zawierać swój własny promotor lub inne elementy regulacyjne a w przypadku cDNA może znajdować się on pod kontrolą odpowiedniego promotora lub innych elementów regulacyjnych do ekspresji w komórce gospodarza.

Wektor obejmujący kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku nie musi zawierać promotora czy innych sekwencji regulacyjnych, w szczególności jeśli wektor jest używany do wprowadzania kwasu nukleinowego do komórek w celu rekombinacji z genomem.

Specjaliści potrafią skonstruować wektor i zaprojektować protokoły dla ekspresji zrekombinowanego genu. Odpowiednie wektory można wybrać lub skonstruować, tak aby zawierały odpowiednie sekwencje regulacyjne włączając sekwencje promotorowe, fragmenty terminatorowe, sekwencje poliadenylacji sekwencje wzmacniające, geny markerowe i inne odpowiednie sekwencje. Szczegóły patrz: Molecular Cloning: a Laboratory Manual: wyd. 2-gie, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Wiele technik i protokołów manipulacji kwasem nukleinowym, przykładowo do wytwarzania konstruktów kwasów nukleinowych, mutagenezy, sekwencjonowana, wprowadzania DNA do komórek i ekspresji genu oraz do analizy białek szczegółowo opisano w Current Protocols in Molecular Biology, wyd. 2-gie, Ausubel et al. wyd., John Wiley & Sons, 1992. Ujawnione tu pozycje Sambrook et al. i Ausubel et al. są tu włączone na drodze odniesienia. Specyficzne procedury oraz wektory stosowane wcześniej z dużym powodzeniem u roślin opisane są przez Bevan (Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721 (1984)) oraz Guerineau i Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, str. 121-148).

Można stosować selekcyjne markery genetyczne składające się z genów chimerowych, które nadają selekcyjny fenotyp taki jak oporność na antybiotyki takie jak kanamycyna, higromycyna, fosfinotricyna, chlorosulfuron, metotreksat, gentamycyna, spektynomycyna, imidazolinony oraz glifosaty.

Cząsteczki kwasów nukleinowych oraz wektory według niniejszego wynalazku mogą być dostarczone jako wyizolowane i/lub oczyszczone z ich naturalnego środowiska w formie zasadniczo czystej i homogennej lub jako wolny lub zasadniczo wolny kwas nukleinowy lub jako geny z innych interesujących gatunków czy być pochodzenia innego niż sekwencja kodująca polipeptyd z wymaganą funkcją. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może obejmować cDNA, RNA, genomowy DNA, i może być w całości lub częściowo syntetyczny. Termin „izolat obejmuje wszystkie te możliwości. Objęta jest określona sekwencja DNA, np. w odniesieniu do figury, dopóki kontekst nie wymaga odpowiednika RNA z U podstawionym za T.

Przy wprowadzaniu wybranego konstruktu z genem do komórki należy wziąć pod uwagę pewne okoliczności dobrze znane specjalistom. Kwas nukleinowy, który ma zostać wprowadzony powinien być połączony w konstrukt, który zawiera działające elementy regulacyjne, które będą kierowały transkrypcją. Musi istnieć dostępna metoda transportu konstruktu do komórki. Kiedy konstrukt znajduje się w błonie komórkowej, integracja z endogennym materiałem chromosomowym będzie się pojawiała lub

PL 202 462 B1 nie. Tak długo jak rozpatrywane są rośliny, typ komórki docelowej musi być taki, aby komórki te regenerowały w całą roślinę.

Komórki DNA transformowane segmentem DNA zawierającym sekwencję można wytwarzać znanymi obecnie standardowymi technikami genetycznej manipulacji roślin. DNA można transformować do komórek roślinnych przy użyciu dowolnej dogodnej technologii takiej jak metoda oparta na rozbrojonym wektorze z plazmidem Ti, przenoszonym przez Agrobacterium, która wykorzystuje jego naturalną zdolność przenoszenia genu (EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12(22) 8711-87215 1984), bombardowanie cząsteczkami lub mikropociskami (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616) mikroinjekcja (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), elektroporacja (EP 290395, WO 8706614), inne formy bezpośredniego pobierania DNA (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), pobieranie DNA za pośrednictwem liposomów (np. Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), czy metoda wytrząsania (np. Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d) Physical methods for the transformation of plant cells are reviewed in Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11.

Transformacja za pomocą Agrobacterium jest powszechnie stosowana przez specjalistów do transformacji gatunków dwuliściennych. Istnieją różne podejścia stosowane do rutynowego wytwarzania stabilnych, płodnych roślin transgenicznych prawie wszystkich roślin jednoliściennych posiadających znaczenie ekonomicznie (Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamol-to, et al. (1989) Nature 338, 274-276; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; WO92/14828). W szczególności, transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wyłania się obecnie także jako wydajna alternatywna metoda transformacji jednoliściennych (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6, 271-282).

Wytwarzanie płodnych roślin transgenicznych uzyskano dla zbóż takich jak ryż, kukurydza, pszenica, owies i jęczmień (praca przeglądowa Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 str. 702).

Bombardowanie mikropociskami, elektroporacja oraz bezpośrednie pobieranie DNA są korzystne wówczas gdy zastosowanie Agrobacterium nie jest wydajne czy skuteczne. Alternatywnie można wykorzystać kombinację różnych technik dla zwiększenia wydajności procesu transformacji np. bombardowanie Agrobacterium opłaszczonym mikrocząsteczkami (EP-A-486234) lub bombardowanie mikropociskami dla zaindukowania rany a następnie hodowanie Agrobacterium (EP-A-486233).

Po transformacji roślinę można regenerować np. z pojedynczych komórek, tkanki kallusa czy dysków liści według standardowych technik.

Prawie każdą dowolną roślinę można w całości zregenerować z komórek, tkanek czy organów roślinnych. Dostępne techniki opisano w Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II i III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, oraz Weissbach i Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.

Wybór danej technologii transformacji będzie podyktowany wydajnością transformacji danego gatunku rośliny w tej technologii a także doświadczeniem i preferencją określonej metody osoby wykonującej doświadczenie według wynalazku. Dla specjalisty będzie oczywiste, że wybór określonego systemu transformacji dla wprowadzenia kwasu nukleinowego do komórek roślinnych nie jest najważniejszy dla niniejszego wynalazku lub że jego nie ogranicza podobnie jak wybór techniki regeneracji rośliny.

Gen VRN2 oraz jego zmodyfikowane wersje (allele, mutanty, warianty i ich pochodne) dostarczany tu oraz kwas nukleinowy, włączając homologi różnych gatunków, można użyć do modyfikowania odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia w roś linach transgenicznych. Kwas nukleinowy tak jak wektor tu opisany można użyć do wytwarzania roślin transgenicznych. Rośliny takie mogą posiadać zmieniony fenotyp w szczególności jeśli chodzi o odpowiedź na wernalizację , czas kwitnienia, kształ t liś cia i/lub odpowiedź unikania cienia w porówPL 202 462 B1 naniu z dzikim typem (o którym mówi się, że jest rośliną dzikiego typu pod względem VRN2 czy odpowiedniego jego homologa).

Wynalazek dalej obejmuje komórkę gospodarza stransformowana kwasem nukleinowym lub wektorem według niniejszego wynalazku, w szczególności komórkę roślinną lub bakteryjną. Zatem, dostarczana jest komórka gospodarza, taka jak komórka roślinna, zawierająca heterologiczny kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku. Wewnątrz komórki kwas nukleinowy może być wprowadzony do chromosomu. Na haploidalny genom może występować więcej niż jedna heterologiczna sekwencja nukleotydową.

Także dostarczana jest komórka roślinna według niniejszego wynalazku posiadająca wprowadzony do genomu kwas nukleinowy, w szczególności heterologiczny kwas nukleinowy, jak wprowadzany według niniejszego wynalazku, znajdujący się pod kontrolą sekwencji regulacyjnych kontrolujących ekspresję. Sekwencja kodująca może być funkcjonalnie podłączona do jednej lub kilku sekwencji regulacyjnych, które mogą heterologiczne lub obce dla genu, jak te, które naturalnie nie są związane z genem, który ma być eksprymowany. Kwas nukleinowy według wynalazku może znajdować się pod kontrolą silnie indukowanego promotora genu co pozwala na kontrolowaną przez użytkownika ekspresję.

Korzystnym indukowanym promotorem jest promotor genu GST-II-27, dla którego wykazano indukcję pod wpływem określonych związków chemicznych podawanych rosnącym roślinom. Promotor jest funkcjonalny zarówno w roślinach jednoliściennych jak i dwuliściennych. Może zatem być stosowany do kontroli ekspresji genu w różnych genetycznie zmodyfikowanych roślinach włączając rośliny uprawne takie jak rzepak, słonecznik, tytoń, burak cukrowy, bawełna; zboża takie jak pszenica, jęczmień, ryż, kukurydza, sorgo; owoce jak pomidory, mango, brzoskwinie, jabłka, gruszki, truskawki, banany i melony; warzywa takie jak marchew, sałata, kapusta i cebula. Promotor GST-ll-27 jest także przydatny do użycia w wielu tkankach, włączając korzenie, liście, łodygi oraz tkanki rozrodcze.

Kolejny aspekt według niniejszego wynalazku dostarcza metodę wytwarzania komórki roślinnej do wprowadzania kwasu nukleinowego czy stosownego wektora zawierającego sekwencję nukleotydów dla komórki roślinnej i wywołującego czy pozwalającego na rekombinację pomiędzy wektorem a genomem komórki roślinnej celem wprowadzenia do genomu sekwencji nukleotydów. Wynalazek obejmuje komórki roślinne zawierające kwas nukleinowy według wynalazku w wyniku wprowadzenia kwasu nukleinowego do komórki przodka.

Termin „heterologiczny można stosować dla podkreślenia, że gen/sekwencja nukleotydów o której mowa została wprowadzona do omawianych komórek rośliny lub ich przodków przy użyciu technik inżynierii genetycznej, tzn. za pośrednictwem człowieka. Dostarczona może być transgeniczna komórka roślinna, tzn. transgeniczna pod względem omawianego kwasu nukleinowego. Transgen może być w postaci ekstra-genomowego wektora lub wprowadzony, korzystnie stabilnie do genomu. Heterologiczny gen może podmieniać równoważny gen endogenny tzn. ten, który normalnie pełni tę samą lub podobną funkcję lub wprowadzone sekwencje mogą być dodatkowymi do genu endogennego czy innych sekwencji. Korzystne jest wprowadzenie heterologicznego genu pod kontrolę wybranego promotora co umożliwia wpływanie na ekspresję sekwencji zgodnie z potrzebami. Ponadto, w miejsce endogennego genu można stosować mutanty, warianty oraz pochodne genu dzikiego typu, np. o wyższej lub niższej aktywności niż dzikiego typu. Heterologiczny kwas nukleinowy, czy egzogenny lub obcy, dla komórki roślinnej może nie występować naturalnie w komórkach tego typu, odmianie czy gatunku. Zatem kwas nukleinowy może obejmować sekwencję kodującą lub pochodzącą z komórki roślinnej określonego typu lub gatunku czy odmiany roślinnej, wprowadzoną do komórki roślinnej różnego typu czy gatunku czy odmiany rośliny. Dalszą możliwością jest, że sekwencja kwasu nukleinowego która jest wprowadzana do komórki, w której naturalnie występuje ona sama lub jej sekwencja homologiczna, z tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona i/lub przylega do kwasu nukleinowego, który nie występuje naturalnie w komórce czy komórkach tego typu czy gatunkach czy odmianach rośliny, jak funkcjonalnie połączona do jednej lub kilku sekwencji regulacyjnych takich jak sekwencja promotorowa kontrolująca ekspresję. Sekwencje w roślinie czy innych komórkach gospodarza można identyfikować jako heterologiczne, egzogenne lub obce.

Dostarczane są także rośliny obejmujące komórkę roślinną według wynalazku oraz dowolne ich części czy rozmnóżki, nasiona, potomstwo wsobne lub hybrydowe oraz dalsze potomstwo. Roślina według niniejszego wynalazku może nie dziedziczyć prawidłowo jednej lub kilku cech. Odmiany rośliny mogą być wyłączone, w szczególności odmiany roślin zarejestrowanych w Plant Breeders' Rights. Należy zauważyć, że roślina nie musi być uważana za „odmianę roślinną tylko dlatego, że zawiera transgen stabilny w genomie, wprowadzony do komórki roślinnej lub jego przodka.

PL 202 462 B1

Dodatkowo do rośliny, niniejszy wynalazek dostarcza dowolny klon takiej rośliny, nasiona, potomstwo wsobne lub hybrydowe oraz dalsze potomstwo ich dowolną część taką jak sadzonki, nasiona. Wynalazek dostarcza dowolne rozmnóżki roślinne, które są dowolną częścią rośliny służącą do reprodukcji i rozmnażania, seksualnego i aseksualnego, włączając sadzonki, nasiona itp. Wynalazek obejmuje także roślinę, która jest potomstwem uzyskanym na drodze seksualnej czy aseksualnej, klonem czy potomstwem takiej rośliny lub dowolną częścią czy rozmnóżka omawianej rośliny, potomstwem klonu czy potomstwa.

Wynalazek dalej dostarcza sposób wpływania lub zaburzania właściwości fizycznych rośliny w szczególności odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liści i/lub odpowiedzi unikania cienia włączając wywoływanie lub umożliwianie ekspresji sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego jak omówiono w komórkach roślin.

Po wcześniejszym etapie wprowadzenia kwasu nukleinowego do komórki rośliny lub jej przodka następuje indukcja ekspresji kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd VRN2, czy mutanta, wariantu, allelu lub pochodnej czy homologa tej sekwencji w komórkach rośliny (zatem wytwarzających kodowany peptyd). Może to wpływać lub zaburzać właściwości fizyczne rośliny w szczególności odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liści i/lub odpowiedź unikania cienia. Może to być zastosowane w kombinacji z dowolnym innym genem, takim jak transgeny wymagane do kwitnienia (np. FCA) czy do innych cech fenotypowych lub pożądanych cech.

Poprzez ekspresję kodującego kwasu nukleinowego w dogodnych warunkach, które mogą stwarzać odpowiednie komórki gospodarza są wytwarzane oczekiwane produkty. Po ekspresji produkt można wyizolować z systemu ekspresyjnego i można go użyć jeśli jest to pożądane, przykładowo w preparatach zawierających ewentualnie dodatkowe składniki.

Można także stosować fragmenty polipeptydów, ujawnionych tu w pełnej długości, a w szczególności ich aktywnych części. Aktywna część polipeptydu oznacza peptyd krótszy od omawianego polipeptydu o pełnej długości, który zachowuje zasadniczą aktywność biologiczną. W szczególności, aktywna część zachowuje zdolność do zmiany odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia w roślinie takiej jak Arabidopsis thaliana.

Fragment polipeptydu oznacza odcinek reszt aminokwasowych co najmniej około pięciu do siedmiu ciągłych aminokwasów, często co najmniej około siedem do dziewięciu ciągłych aminokwasów, zazwyczaj co najmniej około dziewięciu do 13 ciągłych aminokwasów oraz najbardziej korzystnie co najmniej około 20 do 30 lub więcej ciągłych aminokwasów. Fragmenty polipeptydów mogą zawierać jeden lub kilka epitopów przydatnych do uzyskiwania przeciwciał do części dowolnej z ujawnianych tu sekwencji aminokwasowych. Korzystnymi epitopami są te do których wiążą się specyficznie przeciwciała, gdzie powinowactwo wiązania polipeptydu lub jego fragmentu według wynalazku wynosi co najmniej około 1000 x mniej niż dla innych białek.

Pośród korzystnych fragmentów VRN2 znajduje się domena palca cynkowego, domena wiążąca DNA oraz inne domeny tu ujawniane.

Do wytwarzania przeciwciał przy zastosowaniu technik znanych specjalistom można użyć oczyszczone białko lub jego fragment, mutanta, pochodną czy wariant, np. wytworzony na drodze rekombinacji poprzez ekspresję kodującego kwasu nukleinowego. Przeciwciała oraz polipeptydy obejmujące fragmenty przeciwciał wiążące antygen można zastosować do identyfikacji homologów z innych gatunków jak omówiono dalej, także do identyfikacji kompleksów zawierających białko VRN2.

Sposoby wytwarzania przeciwciał obejmują immunizację ssaka (np. człowieka, mysz, szczura, królika, konia, kozę, owcę czy małpę) białkiem lub jego fragmentem. Przeciwciała można uzyskiwać z zaimmunizowanych zwierząt przy użyciu dowolnego wariantu technik znanych specjalistom i można przeszukiwać korzystnie przy użyciu wiązania przeciwciała z interesującym antygenem. Przykładowo, można zastosować techniki typu Western blotting czy immunoprecypitacji (Armitage et al, 1992, Nature 357: 80-82). Przeciwciała mogą być poliklonalne lub monoklonalne.

Przeciwciała przeciwko polipeptydowi czy peptydowi można zastosować przy identyfikowaniu i/lub izolowaniu polipeptydów homologicznych a następnie kodujących genów. Sposób identyfikowania i izolowania polipeptydu o żądanej funkcji (według wykonań tu ujawnianych), obejmować będzie poszukiwanie odpowiednich polipeptydów przy użyciu polipeptydu z przeciwciała obejmującego domenę wiążącą antygen (przykładowo całe przeciwciało lub jego dogodny fragment np. scFv, Fab), który jest zdolny związać polipeptyd lub fragment, wariant lub jego pochodną według niniejszego wynalazku lub korzystnie specyficznie wiąże taki polipeptyd. Specyficznie wiążący tacy przedstawiciele jak przeciwciała oraz polipeptydy z przeciwciał obejmujące domeny wiążącą antygen, które wiążą i są

PL 202 462 B1 swoiste dla polipeptydu czy mutanta, wariantu czy jego pochodnej są stosowani w szczególności w postaci wyizolowanej i/lub oczyszczonej.

Polipeptydy przeznaczone do przeszukiwania mogą przykładowo być produktami bibliotek ekspresyjnych stworzonych przy użyciu kwasu nukleinowego pochodzącego z interesującej rośliny lub mogą być produktami uzyskanymi w procesie oczyszczania z naturalnego źródła. Polipeptyd, który wiąże się z przeciwciałem można wyizolować a następnie poddać sekwencjonowaniu aminokwasów. Można zastosować dowolną dogodną technikę sekwencjonowania całego lub części polipeptydu (przykładowo można zsekwencjonować fragment polipeptydu). Informacja o sekwencji aminokwasowej może być użyta do uzyskania kwasu nukleiniowego kodującego polipeptyd, przykładowo poprzez zaprojektowanie jednego lub kilku oligonukleotydów (np. puli zdegenerowanych oligonukleotydów), które można zastosować jako sondy czy startery w hybrydyzacji z potencjalnym kandydatem kwasu nukleinowego lub przy przeszukiwaniu komputerowej bazy danych, jak opisano poniżej.

Dalszy aspekt niniejszego wynalazku dostarcza sposób identyfikowania i klonowania homologów VRN2 z gatunków roślin innych niż Arabidopsis thaliana, który to sposób wykorzystuje sekwencję nukleotydową pochodzącą z tu przedstawionych. Jak omówiono powyżej, sekwencje z nich pochodzące mogą same być użyte do identyfikowania i klonowania innych sekwencji. Informacja o sekwencji nukleotydowej tu dostarczonej lub o jej dowolnej części może być użyta do przeszukiwania bazy danych w celu znalezienia sekwencji homologicznych, których produkty ekspresji można testować pod kątem wpływania na właściwości rośliny. Mogą one obejmować zdolność do zmiany odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia przez roślinę. Alternatywnie można przeszukiwać biblioteki kwasów nukleinowych przy użyciu technik dobrze znanych specjalistom i identyfikować sekwencje homologiczne a następnie je testować.

Niniejszy wynalazek obejmuje także na kwas nukleinowy kodujący homolog VRN2 uzyskany przy użyciu sekwencji nukleotydowej pochodzącej z dowolnej tu przedstawionej sekwencji.

W pewnych wykonaniach, kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku koduje polipeptyd, który posiada homologię z całą lub częścią przedstawionej tu sekwencji aminokwasowej VRN2, w omówionym już znaczeniu (np. dla długoś ci), gdzie homologia jest większa na długość stosownej części (np. fragmentu) niż homologia pomiędzy odpowiednią częścią sekwencji aminokwasowej VRN2 z Arabidopsis thaliana i inną sekwencją przedstawioną na fig. 8a czy fig.8b, i może być większa niż około 5%, bardziej korzystnie większa niż około 10%, bardziej korzystnie większa niż około 20% oraz bardziej korzystnie większa niż około 30%. Zatem dla zilustrowania tego wykonania, może być dostarczony kwas nukleinowy kodujący mutanta aminokwasowego, wariant czy pochodną sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK ID NR: 2, gdzie kodująca sekwencja aminokwasową zawiera ciągłą sekwencję około 100 aminokwasów, która ma większą homologię z ciągłą sekwencją 100 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej SEK ID NR: 2 niż z jakakolwiek ciągłą sekwencją 100 aminokwasową w innej sekwencji przedstawionej na fig. 8a czy 8b, korzystnie większą niż około 5% większej homologii i tak dalej.

Podobnie, kwas nukleinowy z pewnych wykonań według niniejszego wynalazku może mieć homologię z całą lub częścią przedstawionej tu sekwencji nukleotydowej, w znaczeniu dyskutowanym powyżej (np. dla długości), gdzie homologia jest większa na długość stosownej części (np. fragmentu) niż homologia pomiędzy odpowiednią częścią naturalnie kodującej sekwencji nukleotydowej dla innych sekwencji aminokwasowych przedstawionych na fig. 8a czy fig.8b oraz będących odniesieniem, i może być większa niż około 5%, bardziej korzystnie większa niż około 10%, bardziej korzystnie większa niż około 20% oraz bardziej korzystnie większa niż około 30%.

Informacja o sekwencji genu VRN2 z Arabidopsis thaliana umożliwia uzyskanie sekwencji homologicznych z innych gatunków roślin. W szczególności homologi mogą być łatwe do wyizolowania z pokrewnych, handlowo waż nych gatunków wymagających wernalizacji lub wykazujących odpowiedź na wernalizację. Będą one obejmowały gatunki należące do Brassicaceae oraz inne dwuliścienne włączając tytoń, buraka cukrowego, groszek i seler. Roślinami jednoliściennymi objętymi tą kategorią są zboża jak ryż, pszenica i jęczmień.

Zatem zasięgiem niniejszego wynalazku objęte są cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują sekwencje aminokwasowe homologiczne do VRN2 z Arabidopsis thaliana. Jak to już omówiono homologia może być na poziomie sekwencji nukleotydowej i/lub sekwencji aminokwasowej. Homolog z gatunku innego niż Arabidopsis thaliana koduje produkt nadają cy fenotyp podobny do nadawanego przez gen VRN2, zasadniczo obejmujący zdolność do zmiany odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liścia czy odpowiedzi unikania cienia przez roślinę, tak jak w Arabidopsis thaliana.

PL 202 462 B1

Dodatkowo można zmieniać mutanty, pochodne czy allele tych genów np. podnosząc lub obniżając aktywność czy zdolność w porównaniu z dzikim typem.

Homologi VRN2 można także identyfikować w zbożowych roślinach jednoliściennych ważnych ekonomicznie, włączając zboża jak ryż, pszenica i jęczmień. Chociaż geny kodujące to samo białko w roś linach jednoliściennych i dwuliś ciennych wykazują stosunkowo niską homologię na poziomie nukleotydowym, to sekwencje aminokwasowe są konserwowane. Jest zatem możliwe użycie publicznie dostępnej bazy danych do zidentyfikowania klonów sekwencji cDNA z Arabidopsis, ryżu czy kukurydzy, które są dostępne z programów losowego sekwencjonowania i niosą homologię do interesującego genu, jak to było w przypadku innych genów izolowanych z Arabidopsis (np. CO; WO 96/14414). Oczywiście mutanty, pochodne oraz allele tych sekwencji są także objęte zakresem niniejszego w takim samym znaczeniu jak omówione powyż ej dla genu VRN z Arabidopsis thaliana.

Zgodnie z dalszym aspektem według niniejszego wynalazku dostarczany jest sposób identyfikowania oraz sposób klonowania homologa VRN2, np. z gatunku innego niż Arabidopsis thaliana, sposób który wykorzystuje sekwencję nukleotydową pochodzącą tu przedstawianych. Przykładowo, sposób taki może wykorzystywać w celu znalezienia homologów oligonukleotyd lub oligonukleotydy, które obejmują lub składają się z jednej lub kilku sekwencji konserwowanych pomiędzy sekwencjami SEK ID NR: 2 i SEK ID NR: 5 czy sekwencjami kodującymi SEK ID NR: 1 i SEK ID NR: 4. Zatem dostarczany jest sposób uzyskiwania kwasu nukleinowego, obejmujący hybrydyzację nukleotydu lub cząsteczki kwasu nukleinowego obejmującej ten nukleotyd z docelowym/kandydującym kwasem nukleinowym. Docelowy lub kandydujący kwas nukleinowy może, przykładowo, obejmować bibliotekę genomowa lub cDNA uzyskaną z organizmu, zarówno jednoliściennego jak dwuliściennego, o którym wiadomo, że zawiera lub u którego spodziewana jest obecność takiego kwasu nukleinowego. Można zidentyfikować udaną hybrydyzację i docelowy/kandydujący kwas nukleinowy można wyizolować dla dalszych badań i/lub zastosowania.

Hybrydyzacja może wymagać przeszukiwania sondą z kwasu nukleinowego oraz identyfikowania pozytywnej hybrydyzacji w warunkach o dogodnej sile (zgodnie ze znanymi technikami) i/lub może wymagać użycia oligonukleotydów jako starterów w sposobie amplifikowania kwasu nukleinowego jakim jest PCR. Do przeszukiwania sondą, korzystnymi warunkami są takie, w których siła jonowa jest wystarczająca do uzyskania prostego wzoru z małą liczbą hybrydyzacji zidentyfikowanych jako pozytywne, które będą dalej badane. Specjaliści wiedzą, że można podnosić siłę jonową hybrydyzacji stopniowo do uzyskania tylko kilku pozytywnych klonów.

Przykładowo, przeszukiwanie można wyjściowo prowadzić w warunkach o temp. 37°C lub wyższej, ze stężeniem formamidu poniżej około 50% i umiarkowanym do niskiego stężeniem soli (np. „SSC (ang. Standard Saline Citrate) = 0,15 M chlorek sodowy; 0,15 M cytrynian sodowy; pH 7).

Alternatywnie temperatura około 50°C lub wyższa oraz wysokie stężenie soli (np. „SSPE = 0,180 M chlorek sodowy; 9 mM kwaśny fosforan dwusodowy; 9 mM fosforan sodu dwuwodorowy; 1 mM EDTA sodowa; pH 7,4). Korzystne jest przeszukiwanie w temp. około 37°C, przy stężeniu formamidu około 20% i stężeniu soli około 5 x SSC lub w temp. około 50°C i stężeniu soli około 2 x SSPE. Warunki te pozwolą na zidentyfikowanie sekwencji posiadających zasadniczy stopień homologii (podobieństwa, identyczności) z sekwencją sondy, bez wymagania dokładnej homologii dla zidentyfikowania stabilnych hybryd.

Dogodne warunki obejmują np. do wykrywania sekwencji, które są w około 80-90% identyczne, hybrydyzację przez noc w 42°C w 0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% siarczanie dekstranu i koń cowe pł ukanie w 55°C w 0,1x SSC, 0,1% SDS. Do wykrywania sekwencji, które są w identyczne powyżej około 90%, dogodne warunki obejmują hybrydyzację przez noc w 65°C w 0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% siarczanie dekstranu i końcowe płukanie w 60°C w 0,1 x SSC, 0,1% SDS.

Alternatywą jest roztwór 5 x SSPE (końcowe stężenie 0,9 M NaCI, 0.05M fosforan sodowy, 0,005 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 7,7), 5 x roztwór Denhardfa, 0,5% SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu) w 65°C przez noc (dla wysokiej siły jonowej, sekwencje o wysokim podobieństwie) lub 50°C (dla niskiej siły jonowej, sekwencje o niższym podobieństwie). Płukania w 0,2 x SSC/0,1% SDS w 65°C dla wysokiej siły jonowej, alternatywnie w 50 - 60°C w 1 x SSC/0,1% SDS dla niskiej siły jonowej.

Niniejszy wynalazek obejmuje także na kwas nukleinowy selektywnie hybrydyzujący z warunkach wysokiej siły jonowej ze zidentyfikowanym tu kwasem nukleinowym.

Alternatywnym sposobem przeszukiwania, chociaż stale wykorzystującym hybrydyzację kwasu nukleinowego, jest użycie oligonukleotydów zaprojektowanych do powielania sekwencji DNA w reakcji

PL 202 462 B1

PCR czy w innych sposobach wymagających powielania kwasu nukleinowego, przy użyciu rutynowych procedur. Patrz przykładowo: „PCR protocols; A Guide to Methods and Applications, Wyd. Innis et al, 1990, Academic Press, New York.

Korzystnymi sekwencjami aminokwasowymi dogodnymi do zastosowania w projektowaniu sond lub starterów do PCR do niektórych celów są sekwencje konserwowane (całkowicie, zasadniczo lub częściowo) pomiędzy sekwencją VRN2 i co najmniej jedną inną z sekwencji przedstawionych na fig. 8a czy 8b.

Korzystne startery do amplifikacji konserwowanych regionów z VRN2, które można użyć jako sondy do uzyskania klonów genomowych lub cDNA mogą obejmować następujące:

Startery VRN2-AI i VRN2-AJ, które w reakcji RT-PCR powielają fragment 1583 bp zawierający całą otwartą ramkę odczytu VRN2 oraz część lub całe sekwencje nie ulegające translacji na końcu 5' i 3';

Startery VRN2-AP i VRN2-AJ, które w RT-PCR, powielają fragment 781 bp, który zawiera konserwowany kwaśny region;

Startery VRN2-AO i VRN2-AS, które w RT-PCR, powielają fragment 493 bp, który zawiera motyw palca cynkowego i drugi sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) oraz

Startery VRN2-AI i VRN2-AJ z genomowego DNA, które powielają produkt 3605 bp, który zawiera większość genu VRN2, z wyjątkiem promotora i regionów 3' (tzn. obejmuje te same regiony co para powyżej VRN2-AI/AJ, lecz z intronami, przydatne do hybrydyzacji z genomowym DNA, ale mniej przydatne do cDNA).

Na podstawie informacji z sekwencji aminokwasowej można projektować sondy oligonukleotydowe czy startery, biorąc pod uwagę zdegenerowanie kodu genetycznego oraz odpowiednie użycie kodonów z organizmu z którego pochodzi kandydujący kwas nukleinowy.

Korzystny oligonukleotyd zgodnie z pewnymi wykonaniami według wynalazku np. do użycia przy amplifikacji kwasu nukleinowego ma długość do około 50 nukleotydów lub około 40 nukleotydów lub około 30 lub mniej nukleotydów (np. 18, 21 lub 24).

Oszacowanie czy produkt PCR odpowiada czy nie homologicznemu genowi można przeprowadzić różnymi sposobami. Prążek PCR uzyskiwany po reakcji może zawierać mieszaninę produktów. Poszczególne produkty można klonować i każdy indywidualnie analizować. Można to robić poprzez transformację dla oszacowania funkcji wstawki wprowadzanej do rośliny.

Jak zauważono, kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku można uzyskać stosując jako sondy czy startery oligonukleotydy, zaprojektowane na podstawie dostarczanej tu informacji o sekwencji. Kwas nukleinowy wyizolowany i/lub oczyszczony z jednej większej liczby komórek roślinnych (patrz powyżej) czy bibliotekę kwasu nukleinowego pochodzącego z kwasu nukleinowego wyizolowanego i/lub oczyszczonego z rośliny (np. biblioteka cDNA pochodząca z mRNA wyizolowanego z rośliny) można przeszukiwać sondą w warunkach dla selektywnej hybrydyzacji i/lub poddać reakcji specyficznej amplifikacji kwasu nukleinowego jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Kwas nukleinowy przeszukiwany sondą lub używany jako matryca w reakcji amplifikacji może być genomowym DNA, cDNA lub RNA. Jeśli jest to konieczne można ligować jeden lub kilka fragmentów dla wytworzenia sekwencji kodującej o pełnej długości.

Startery pochodzące z sekwencji VRN2 tu ujawnianych można z łatwością testować pod kątem ich specyficzności amplifikacji kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, przy użyciu zarówno genomowego DNA jak matryc RT-PCT. Klonowanie a następnie sekwencjonowanie produktów PCR można zastosować w celu wykazania powielenia spodziewanej pochodnej fragmentu genu. Pełnej długości klony cDNA można uzyskać przy pomocy technik 5' i 3' RACE, jeśli jako matryce używa się produkty RT-PCR.

Różne aspekty niniejszego wynalazku dotyczą sposobów przeszukiwania materiału np. lizatu komórkowego, preparatu kwasu nukleinowego pod kątem obecności interesującego kwasu nukleinowego, sposobów uzyskiwania kwasu nukleinowego oraz dogodnych starterów i kombinacji starterów.

Dostarczana tu informacja o sekwencji pozwala także na zaprojektowanie testów diagnostycznych dla określania obecności specyficznego genu czy jego allelu w danej roślinie, kultywarze, odmianie, populacji, rasie lądowej, części rodziny czy do innej selekcji w programie hodowlanym czy selekcji innego genotypu. Test diagnostyczny może być oparty na określaniu obecności lub braku określonego allelu sposobami określającymi kwas nukleinowy czy polipeptyd.

Na poziomie kwasu nukleinowego, może być wymagana hybrydyzacja odpowiedniego oligo- lub poli-nukleotydu, takiego jak fragment genu lub jego homolog, włączając dowolny homolog tu ujawniony, czy szczególny allel, taki jak allel dający pożądany fenotyp jak dowolny allel tu ujawniany. Hybry16

PL 202 462 B1 dyzacja może wymagać zaprojektowania reakcji PCR do powielenia produktu z danej wersji allelu genu a następnie detekcji produktu amplifikacji dowolnym z wielu sposobów włączając między innymi elektroforezę w żelu, elektroforezę kapilarną, bezpośrednią hybrydyzację sond sekwencji nukleotydowej i tak dalej. Test diagnostyczny może bazować na reakcji PCR zaprojektowanej do powielania różnych alleli czy dowolnego allelu ze stosownego locus, z testem różnicującym różne możliwe allele za pomocą dowolnej z wielu możliwych sposobów, włączając wielkość fragmentów DNA, różnice w miejscach restrykcyjnych (np. CAPS, ang. cleaved ampified polymorphic sites) i tak dalej. Test diagnostyczny może także być oparty na większej liczbie możliwych wariantów analizy kwasu nukleinowego oczywistych dla specjalistów takich jak użycie sekwencji syntetycznej jako sondy do hybrydyzacji.

Szerzej, sposoby dzielą się na te, które przeszukują pod kątem obecności sekwencji nukleotydowych oraz tych, które polegają na wykrywaniu obecności lub braku polipeptydu. Sposoby mogą wykorzystywać próbki biologiczne z jednej lub większej liczby roślin lub komórek, podejrzanych o to, że zawierają sekwencje kwasu nukleinowego lub polipeptyd.

Ilustracja badania wykrywania kwasu nukleinowego lub polipeptydu obejmuje analizowanie próbki z rośliny lub komórki roślinnej przez:

(a) porównanie sekwencji kwasu nukleinowego w próbce z całą lub częścią przedstawionej tu sekwencji nukleotydowej w celu określenia czy próbka zawiera mutację;

(b) ustalenie obecności w próbce polipeptydu zawierającego przedstawioną tu sekwencję aminokwasową VRN2 lub jej fragment, a jeśli jest obecny określenie czy polipeptyd jest pełnej długości i/lub czy jest zmutowany i/lub czy jest wytwarzany na normalnym poziomie;

(c) przeprowadzenie reakcji typu „odcisk palca DNA dla porównania wzoru restrykcyjnego wytwarzanego kiedy enzym restrykcyjny tnie kwas nukleinowy w próbce z wzorem restrykcyjnym uzyskanym dla przedstawionej tu sekwencji nukleotydowej lub dla znanego mutanta, allelu czyjej wariantu;

(d) kontaktowanie próbki ze specyficznie wiążącym czynnikiem zdolnym do wiązania do kwasu nukleinowego włączając sekwencję nukleotydową jak tu przedstawiono czy jej fragment, mutanta, allel czy jej wariant, specyficznie wiążący czynnik obejmuje kwas nukleinowy hybrydyzujący z przedstawioną tu sekwencją genu VRN2 lub polipeptyd zawierający domenę wiążącą się specyficznie do kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję VRN2 lub do polipeptydu przez nią kodowanego lub jej formy zmutowanej oraz określenie wiązania specyficznie wiążącego czynnika;

(e) przeprowadzenie reakcji PCR wymagającej jednego lub kilku starterów opartych na przedstawionej tu sekwencji nukleotydowej w celu przeszukania próbki pod kątem kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję nukleotydową SEK ID NR: 1 lub SEK ID NR: 4, mutanta, allelu czy jej wariantu.

Kiedy przeprowadzane jest przeszukiwanie kwasu nukleinowego pod kątem allelu VRN, kwas nukleinowy w próbce jest najpierw amplifikowany, np. przy użyciu PCR w celu zwiększenia ilości analitu w porównaniu z innymi sekwencjami obecnymi w próbce. Pozwala to na wykrycie sekwencji docelowych z wysokim stopniem czułości o ile są one obecne w próbce. Ten etap wstępny ominięty poprzez użycie bardzo czułego zestawu technik, które stają się coraz istotniejsze w omawianej dziedzinie.

Różne formy genu mogą zawierać jedną lub kilka insercji, delecji, substytucji i/lub addycji jednego lub większej liczby nukleotydów, w porównaniu z sekwencją dzikiego typu, które mogą uszkadzać lub zmieniać funkcję genu. Różnice na poziomie kwasu nukleinowego nie koniecznie muszą być odzwierciedlane przez różnice w sekwencji aminokwasowej kodującej polipeptyd. Jednakże, mutacja czy inna różnica w genie może prowadzić do zmiany ramki odczytu czy powstania kodonu stop, które mogą poważnie zaburzyć naturę wytwarzanego białka (jeśli jest produkowane), lub do mutacji punktowej czy większej zmiany mutacyjnej w kodowanym peptydzie, włączając insercję, delecję, substytucję i/lub addycję jednego lub kilku aminokwasów czy regionów w polipeptydzie. Mutacja w sekwencji promotora czy w innym regionie regulacyjnym może uniemożliwić lub zredukować ekspresję genu, zaburzyć procesowanie czy stabilność transkryptu mRNA.

Testy można przeprowadzać na preparatach zawierających genomowy DNA, cDNA i/lub mRNA. Testowanie cDNA czy mRNA posiada przewagę nad złożonym kwasem nukleinowym dzięki brakowi sekwencji intronowych lecz możliwą niedogodnością jest wymagana konieczność dodatkowego czasu i wysił ku do wytworzenia preparatów. RNA jest trudniejszy do manipulowania niż DNA ze wzglę du na powszechnie występujące RNazy.

Kwas nukleinowy w testowanej próbce można sekwencjonować, a sekwencję porównywać z przedstawioną tu sekwencją w celu okreś lenia czy obecna jest czy nie różnica między nimi. Jeś li tak, różnicę można porównać ze znanymi allelami w celu określenia czy testowany kwas nukleinowy zawiera jedną czy więcej różnic lub różnicę można wykryć za dzięki towarzyszącemu żądanemu fenotypowi.

PL 202 462 B1

Zamplifikowany kwas nukleinowy można następnie sekwencjonować jak powyżej i/lub testować innym sposobem w celu zbadania obecności lub braku określonej cechy. Kwas nukleinowy przeznaczony do badania można wytworzyć z kwasu nukleinowego usuniętego z komórek lub w bibliotece przy użyciu innych technik jak trawienie enzymem restrykcyjnym i elektroforeza.

Kwas nukleinowy można przeszukiwać przy użyciu sondy specyficznej do wariantu czy allelu. Sonda taka odpowiada swoją sekwencją regionowi genu, lub jest komplementarna, zawierającego zmianę w sekwencji o której wiadomo, że jest związana ze zdolnością do zaburzenia odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia. W stosownych warunkach siły jonowej specyficzna hybrydyzacja takiej sondy z testowanym kwasem nukleinowym jest wskaźnikiem na obecność zmiany w sekwencji w testowanego kwasu nukleinowego. W celu wydajnego przeszukiwania można zastosować więcej niż jedną sondę w jednej testowanej próbce.

Nukleotydy specyficzne do allelu czy wariantu mogą podobnie być użyte w reakcji PCR dla specyficznego powielenia określonych sekwencji o ile są obecne w próbce. Oszacowanie czy prążek z PCR zawiera wariant genu można przeprowadzić na wiele sposobów znanych specjalistom. Produkt PCR można przykładowo można analizować na drodze, która umożliwia pokazanie mutacji czy polimorfizmu w sekwencjonującym poliakryloamidowym żelu denaturującym DNA ze specyficznymi prążkami sprzężonymi z wyselekcjonowanymi wariantami genu.

Alternatywnym lub uzupełniającym poszukiwaniem obecności wariantów sekwencji w testowanej próbce jest szukanie obecności prawidłowej sekwencji np. przy użyciu sondy lub startera ze stosownego oligonukleotydu.

Można zastosować badania polegające na hybrydyzacji pomiędzy sondą a testowanym kwasem nukleinowym a następnie na wykrywaniu niedopasowania. W stosownych warunkach (temperatura, pH itd.) sonda oligonukleotydowa będzie hybrydyzowała z sekwencją nie jest całkowicie komplementarna. Stopień parowania pomiędzy dwiema cząsteczkami będzie wystarczający do łączenia się pomimo niedopasowań. Specjalistom znane są różne podejścia określające obecność niedopasowań pomiędzy dwiema hybrydyzującymi cząsteczkami kwasu nukleinowego.

Przykładowo, RNaza A tnie w miejscu niedopasowania. Cięcie można wykryć badając elektroforetycznie czy testowany kwas nukleinowy, do którego stosowna sonda lub sonda hybrydyzuje i daje mniejsze cząsteczki (tzn. cząsteczki o większej ruchliwości elektroforetycznej) niż pełnej długości sonda/testowana hybryda. Inne podejścia polegają na użyciu enzymów takich jak resolwazy czy nukleazy.

Zatem sondę oligonukleotydowa, która posiada sekwencję regionu normalnego genu (zarówno nić sensowna jak antysensowna), w którym znane są mutacje związane z określonymi fenotypami, można hybrydyzować z testowanym kwasem nukleinowym i określać obecność lub brak niedopasowania. Wykrycie obecności niedopasowania może wskazywać na obecność mutacji w testowanym kwasie nukleinowym. Z drugiej strony, sondę oligonukleotydowa, która posiada sekwencję regionu genu obejmującego mutację można hybrydyzować z testowanym kwasem nukleinowym i określać obecność lub brak niedopasowania. Wykrycie obecności niedopasowania może wskazywać, że kwas nukleinowy w testowanej próbce ma normalną sekwencję. W innym przypadku można wykorzystać zestaw sond do różnych regionów genu.

Obecność różnic w sekwencjach cząsteczek kwasów nukleinowych można określić przy pomocy trawienia enzymem restrykcyjnym, tak jak w metodzie typu „odcisk palca DNA, gdzie wzór restrykcyjny wytwarzany dzięki użyciu jednego lub kilku enzymów restrykcyjnych do cięcia próbki kwasu nukleinowego porównuje się ze wzorem uzyskanym wówczas gdy próbka, która zawiera normalny gen czy wariant czy allel trawiona jest tym samym enzymem lub enzymami.

Obecność lub brak uszkodzenia w promotorze czy innej sekwencji regulacyjnej można badać poprzez określenie poziomu produkcji mRNA w procesie transkrypcji lub poziomu wytwarzania polipeptydu w procesie translacji mRNA.

Kwas nukleinowy wyizolowany i/lub oczyszczony z jednej lub większej liczby komórek roślinnych lub bibliotekę kwasu nukleinowego pochodzącego z kwasu nukleinowego wyizolowanego i/lub oczyszczonego z komórek (np. biblioteka cDNA pochodząca z mRNA wyizolowanego z komórek) można przeszukiwać sondą w warunkach selektywnej hybrydyzacji i/lub poddawać reakcji specyficznej amplifikacji kwasu nukleinowego takiej jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).

Sposób może obejmować hybrydyzację jednego lub kilku (np. dwóch) sond lub starterów z docelowym kwasem nukleinowym. Kiedy kwas nukleinowy jest dwuniciowym DNA, hybrydyzacja zasadniczo będzie poprzedzona denaturacją dającą jednoniciowy DNA. Hybrydyzacja może być częścią procedury PCR lub częścią procedury przeszukiwania sondą nie wymagającą PCR. Przykładową

PL 202 462 B1 procedurą byłaby kombinacja PCR i hybrydyzacja w niskiej sile jonowej. Procedura przeszukiwania, wybrana przez specjalistę spośród wielu, jest stosowana do identyfikowania pomyślnej hybrydyzacji i izolowania zhybrydyzowanego kwasu nukleinowego.

Wiązanie sondy z docelowym kwasem nukleinowym (np. DNA) można mierzyć przy użyciu różnorodnych technik jakimi dysponują specjaliści. Przykładowo, sondy mogą być wyznakowane radioaktywnie, fluorescencyjnie lub enzymatycznie. Inne sposoby nie wykorzystujące wyznakowanej sondy obejmują badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych, amplifikację przy użyciu PCR, cięcie RNazą oraz przeszukiwanie nukleotydem specyficznym do allelu.

Przeszukiwanie sondą może wykorzystywać standardową technikę typu Southern. Przykładowo DNA można izolować z komórek i trawić różnymi enzymami restrykcyjnymi. Fragmenty restrykcyjne można następnie rozdzielać elektroforetycznie w żelu agarozowym przed denaturacją i przeniesieniem na filtr nitrocelulozowy. Wyznakowana sonda może hybrydyzować z fragmentami DNA na filtrze a wiązanie można określić. Przeszukiwany DNA można wytworzyć z preparatów RNA z komórek.

Wstępne doświadczenia można prowadzić hybrydyzując różne sondy w warunkach niskiej siły jonowej do filtrów typu Southern z DNA trawionym enzymami restrykcyjnymi. Stosowne warunki będą uzyskane wówczas gdy uzyskana zostanie duża liczba hybrydyzujących fragmentów przy niskim tle hybrydyzacji. Przy użyciu takich warunków można badać biblioteki kwasów nukleinowych np. biblioteki cDNA reprezentujące sekwencje, które ulegają ekspresji.

Jak podkreślono, specjaliści potrafią dobrać odpowiednie warunki o żądanej selektywności hybrydyzacji biorąc pod uwagę takie czynniki jak długość i kompozycja zasad oligonukleotydu, temperatura i tak dalej.

W niektórych korzystnych wykonaniach testów diagnostycznych według niniejszego wynalazku oligonukleotydy według niniejszego wynalazku, które są fragmentami dowolnej przedstawionej tu sekwencji lub allele związane z żądanym fenotypem mają długość co najmniej około 10 nukleotydów, bardziej korzystnie mają długość co najmniej około 15 nukleotydów, bardziej korzystnie mają długość co najmniej około 20 nukleotydów, bardziej korzystnie mają długość około 30 nukleotydów. Fragmenty takie indywidualnie stanowią aspekty według niniejszego wynalazku. Fragmenty i inne oligonukleotydy można użyć jako startery lub sondy jak omówiono ale także mogą być wytwarzane (np. przez PCR) w sposobach określania obecności w testowanej próbce sekwencji wskazujących na żądany fenotyp.

Istnieją różne sposoby określania w testowanej próbce obecności lub braku określonego polipeptydu, takiego jak polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK ID NR: 2 i SEK ID NR: 5 lub aminokwasową sekwencję jej mutanta, wariantu czy allelu.

Próbkę można testować pod kątem obecności partnera wiążącego się do specyficznego czynnika wiążącego takiego jak przeciwciało (lub mieszanina przeciwciał), specyficznego do jednego lub kilku określonych wariantów przedstawionego tu polipeptydu.

W takich przypadkach, próbkę można testować poprzez kontaktowanie jej ze specyficznym czynnikiem wiążącym takim jak przeciwciało w odpowiednich warunkach dla specyficznego wiązania, zanim wiązanie zostanie określone, przykładowo przy użyciu systemu reporterowego jak omówiono. Kiedy stosowany jest panel z przeciwciałami można wykorzystać różne znaczniki reporterowe dla każdego przeciwciała tak że określone może być wiązanie każdego z nich.

Specyficzny czynnik wiążący taki jak przeciwciało można użyć do izolowania i/lub oczyszczania jego polipeptydowego partnera wiążącego z testowanej próbki, co pozwala na sekwencjonowanie i/lub analizę biochemiczną polipeptydu w celu określenia ma on czy sekwencję i/lub właściwości polipeptydu dzikiego typu czy jego określonego mutanta, wariantu czy allelu. Sekwencja aminokwasową jest rutynowo badana przez specjalistów przy użyciu maszyn do automatycznego sekwencjonowania.

Użycie testów diagnostycznych dla alleli pozwala badaczom lub hodowcom roślin na określenie z całą pewnością oraz niezależnie od czasochłonnych testów czy żądany allel jest obecny czy nie w interesującej roślinie (lub jej komórce), czy roślina reprezentuje zbiór innych, genetycznie identycznych roślin (np. hodowanych wsobnie odmian czy kultywarów) czy jest pojedynczym osobnikiem w próbce spokrewnionych (np. wyselekcjonowanych przez hodowców) lub nie spokrewnionych roślin.

W schemacie hodowlanym opartym na selekcji i wsobnym krzyżowaniu żądanych osobników, można uzyskać wysokowydajną diagnozę kwasu nukleinowego czy polipeptydu pod kątem żądanego allelu czy alleli przy niskim koszcie testów jak te dostarczane według wynalazku, niezawodnej selekcji we wczesnych pokoleniach i na większej ilości materiału niż było to możliwe. Ulepsza to niezawodność selekcjonowania i oszczędza czas dzięki możliwości testowania materiału wcześniej oraz bez kosztownego poszukiwania fenotypu co ma istotne znaczenie w hodowaniu roślin.

PL 202 462 B1

Oparte na kwasie nukleinowym określanie obecności lub braku jednego lub większej liczby żądanych alleli można łączyć z określaniem genotypu flankującego sprzężonego genomowego DNA oraz innego nie sprzężonego genomowego DNA przy użyciu ustalonych zestawów markerów takich jak RFLP, mikrosatelity czy SSR, AFLP, RAPD itp. Umożliwia to badaczom i hodowcom roślin selekcję nie tylko na obecność żądanego allelu ale również selekcję pojedynczego osobnika czy rodzin roślin, które posiadają najbardziej pożądane kombinacje sprzężonego i nie sprzężonego tła genetycznego. Takie rekombinanty o pożądanym materiale mogą pojawiać się rzadko przy segregacji populacji hodowlanej czy w potomstwie z krzyżówki wstecznej. Bezpośredni test badający locus jak dostarczony według niniejszego wynalazku pozwala badaczom na stopniowe utrwalanie (wytwarzanie homozygot) pożądanej kombinacji markerów flankujących i alleli, poprzez identyfikowanie osobników z utrwalonym pierwszym markerem flankującym a następnie identyfikowanie potomstwa z utrwaloną drugą stroną locus wiedząc przez cały czas, że pożądany allel jest ciągle obecny.

Niniejsze ujawnienie dostarcza specjalistom wystarczającej informacji do uzyskania genomowej sekwencji DNA dla jakiegokolwiek danego nowego lub istniejącego już allelu oraz dostarcza stosowny test diagnostyczny oparty na kwasie nukleinowym i/lub polipeptydzie. Przy projektowaniu testu z kwasem nukleinowym wzięta jest pod uwagę różnicująca zmienność sekwencji charakteryzująca dany wariant allelu.

Kwas nukleinowy według wynalazku może zawierać sekwencję kodującą produkt wymagany w odpowiedzi na wernalizację , czasie kwitnienia, kształ cie liś cia i/lub odpowiedzi unikania cienia. Zredukowanie lub podniesienie poziomu ekspresji można użyć do manipulowania tymi właściwościami rośliny. Może to wymagać użycia antysensownej lub sensownej regulacji omówionej poniżej.

Kwas nukleinowy według wynalazku, taki jak gen VRN2 czy homolog, można umieścić pod kontrolą zewnętrznie indukowanego promotora genu aby umożliwić kontrolowanie ekspresji przez użytkownika. Korzyścią z wprowadzenia heterologicznego genu do komórki roślinnej, w szczególności kiedy komórka znajduje się w roślinie, jest możliwość kontrolowania ekspresji genu przez wybrany promotor w celu wpływania na ekspresję genu a tym samym na odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia, odpowiedź unikania cienia i/lub inne właściwości zgodnie z preferencjami. Ponadto mutanty i pochodne genu dzikiego typu np. o wyższej lub niższej aktywności niż dzikiego typu można zastosować w miejsce genu endogennego.

Dzięki wprowadzeniu sekwencji nukleotydowej w sensownej orientacji można osiągnąć nadekspresję. Można zatem wpływać na cechy fizyczne rośliny, wywoływać lub wytwarzać w komórkach rośliny produkt (polipeptyd czy transkrypt kwasu nukleinowego) kodowany przez heterologiczny kwas nukleinowy według wynalazku.

Obniżenie regulacji ekspresji docelowego genu można osiągnąć przy użyciu technik z wykorzystaniem sekwencji antysensownych lub sensownej regulacji (kosupresja).

W użyciu antysensownych genów lub częściowych sekwencji genu dla obniżenia regulacji ekspresji genu, sekwencja nukleotydową umieszczona jest pod kontrolę promotora w odwróconej orientacji tak, że powstaje transkrypt, który jest komplementarny do normalnego mRNA transkrybowanego z sensownej nici docelowego genu. Patrz przykładowo Rothstein et al, 1987; Smith et al, (1988) Nature 334, 724-726; Zhang et al, (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188. Techniki antysensowne opisano również w Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149 oraz Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496.

Alternatywą jest użycie kopii całego lub części genu docelowego wprowadzonej w sensownej, to znaczy w takiej samej orientacji jak docelowy gen w celu uzyskania redukcji ekspresji docelowego genu poprzez ko-supresję. Patrz przykładowo van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588 oraz US-A-5231020.

Kompletna sekwencja odpowiadająca sekwencji kodującej (w odwrotnej orientacji do antysensu) nie może być użyta. Przykładowo mogą być użyte fragmenty o wystarczającej długości. Dla specjalistów rutynową sprawą jest szukanie fragmentów o różnej wielkości pochodzących z różnych części sekwencji kodującej w celu zoptymalizowania poziomu hamowania przez antysens. Korzystne może być włączenie kodonu ATG inicjacyjnej metioniny oraz jednego lub kilku nukleotydów powyżej kodonu inicjacyjnego. Dalszą możliwością jest celowanie w konserwowaną sekwencję genu, np. sekwencję charakterystyczną dla jednego lub kilku genów taką jak sekwencja regulacyjna.

Wykorzystywana sekwencja może mieć około 500 nukleotydów lub mniej, możliwie około 400 nukleotydów, około 300 nukleotydów, około 200 nukleotydów czy około 100 nukleotydów. Możliwe jest

PL 202 462 B1 użycie oligonukleotydów o wiele krótszych, 14-23 nukleotydowych, chociaż korzystne są dłuższe fragmenty, zazwyczaj tam gdzie możliwe nawet dłuższe niż około 500 nukleotydów, dłuższe niż około 600 nukleotydów, niż około 700 nukleotydów, niż około 800 nukleotydów, niż około 1000 nukleotydów i wię cej.

Może być korzystne jeśli istnieje całkowita identyczność sekwencji w sekwencji stosowanej do obniżenia regulacji ekspresji sekwencji docelowej, i sekwencji docelowej, chociaż całkowita komplementarność czy podobieństwo sekwencji nie jest konieczne. Może istnieć różnica jednego czy kilku nukleotydów pomiędzy używaną sekwencją a docelowym genem. Zatem sekwencja wykorzystywana do obniżenia regulacji ekspresji genu według niniejszego wynalazku może być sekwencja dzikiego typu (np. genu) wyselekcjonowaną z dostępnych lub mutanta, pochodnej, wariantu czy allelu uzyskanych na drodze insercji, addycji, delecji lub substytucji jednego lub kilku nukleotydów takiej sekwencji. Sekwencja nie musi zawierać otwartej ramki odczytu lub określać RNA, które ulegałoby translacji. Może być korzystne aby posiadała wystarczającą homologię do odpowiednich cząsteczek antysensownego i sensownego RNA tak aby możliwa była hybrydyzacja miedzy nimi. Obniżenie regulacji ekspresji genu może zachodzić nawet wówczas gdy istnieje 5%, 10%, 15% lub 20% i więcej niedopasowań pomiędzy używaną sekwencją, a docelowym genem.

Zasadniczo, transkrybowany kwas nukleinowy może reprezentować fragment genu lub fragment do niego komplementarny, czy też może być jego mutantem, pochodną wariantem w znaczeniu podobnym jak opisano powyżej w odniesieniu do zmian wprowadzanych w sekwencji kodującej i homologii zmienionej sekwencji. Homologia może być wystarczająca do transkrypcji antysensownego RNA hybrydyzującego z kwasem nukleinowym w komórkach rośliny, chociaż niezależnie od tego czy hybrydyzacja ma miejsce żądanym skutkiem jest obniżenie regulacji ekspresji genu.

Zatem niniejszy wynalazek dostarcza także sposób modyfikowania, wpływania, zmieniania czy modulowania właściwościami rośliny jak np. odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedź unikania cienia, sposób obejmuje wywołanie czy umożliwienie transkrypcji antysensu z heterologicznego kwasu nukleinowego wedł ug wynalazku w komórkach roś liny.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej sposób użycia sekwencji nukleotydowej VRN2, lub fragmentu, mutanta, pochodnej, allelu, wariantu czyjego homologa do obniżenia regulacji ekspresji genu, w szczególności obniż enia regulacji ekspresji genu VRN2 lub jego homologa, korzystnie w celu wpłynięcia na fizyczne właściwości rośliny w szczególności na odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedź unikania cienia.

Kiedy wprowadzane są dodatkowe kopie genu docelowego w sensownej, to znaczy w takiej samej orientacji jak docelowy gen wytwarzany jest szereg fenotypów, które obejmują osobniki w których pojawia się nadprodukcja oraz takie w których występuje obniżona produkcja białka z genu docelowego. Jeśli wprowadzany gen jest jedynie częścią genu endogennego w populacji transgenicznej wzrasta ilość osobników o obniżonej produkcji. Mechanizm pojawienia się regulacji sensownej, w szczególnoś ci obniż onej regulacji, nie jest znany. Jednakż e technika ta jest dobrze opisana w literaturze naukowej i w patentach i jest rutynowo stosowana do kontroli ekspresji genów. Patrz przykładowo van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-229; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang et al, 1992 The Plant Cell 4, 1575-1588.

Fragmenty, mutanty i podobne można użyć w znaczeniu podobnym jak opisano powyżej przy użyciu w regulacji antysensownej.

Zatem niniejszy wynalazek dostarcza także sposób wpływania na cechy rośliny np. na odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedź unikania cienia, sposób obejmuje wywołanie czy umożliwienie ekspresji kwasu nukleinowego według wynalazku w komórkach rośliny. Może być on użyty do hamowania aktywności produktu mającego zdolność wpływania na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedź unikania cienia. Aktywność produktu jest korzystnie hamowana w wyniku obniżenia regulacji w komórkach roślinnych.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia całkowitą liczbę liści (Rosette plus Cauline) z roślin Ler (kwadraty), roślin fca-1 (romby) oraz roślin vrn2-1 fca-1 (kółka) w różnym okresie czasu po wernalizacji (mierzone w dniach).

Figura 2 ilustruje fenotyp rośliny Red Far-Red Light:

Figura 2A przedstawia powierzchnię największego liścia z roślin Ler, fca-1 i vrn2-1 fca-1 hodowanych w świetle białym (W) (puste słupki) lub w świetle białym uzupełnianym światłem FR (W + FR) (zakreskowane słupki).

PL 202 462 B1

Figura 2B przedstawia liczbę rozetek liścia w wiązkach roślin traktowanych jak w doświadczeniu, którego wyniki przedstawiono na fig. 2A.

Figura 3 przedstawia wyniki mapowania genetycznego i fizycznego VRN2 w Arabidopsis thaliana.

Figura 4 przedstawia kosmidy i geny w pobliżu VRN2 w genomie Arabidopsis.

Figura 5 przedstawia strukturę genu VRN2 z Arabidopsis, zaburzenie składania RNA 5K cDNA oraz pozycję i naturę mutacji vrn2-1. Egzony przedstawiono jako puste prostokąty. Regiony nie ulegające translacji przedstawiono jako czarne prostokąty. Introny przedstawiono jako linie.

Figura 6 przedstawia sekwencję cDNA VRN2, włączając sekwencję kodującą i przewidywaną sekwencję aminokwasową kodowanego białka. Przypuszczalne sekwencje NLS są prostokątach, przypuszczalna kwaśna domena aktywująca jest podkreślona. Przypuszczalny motyw palca cynkowego jest podkreślony podwójnie. Pozycje intronów są zaznaczone strzałkami. Pozycja mutacji vrn2-1 jest w kółku.

Figura 7 przedstawia marker dCAPS dla mutacji vrn2-1. Diagnostyczną pochodną markera CAPS (dCAPS) zaprojektowano dla mutacji vrn2-1. Wykorzystuje ona starter (VRN2-AZ) obejmujący połowę miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny Xmnl, drugą połowę dostarcza, specyficznie, sekwencja mutacji vrn2-1. Trawienie enzymem pojawia się tylko wówczas, kiedy w reakcji amplifikowania PCR jako matryca służy genomowy DNA z mutantów vrn2-1.

Figura 8 przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowej VRN2 z Arabidopsis z podobnymi białkami.

Figura 8A przyrównuje białko VRN2 pełnej długości do czterech innych białek, przy użyciu metody Clustal z tablica ważoną reszt PAM250, przeprowadzone 17 stycznia 1999 o 19:19 GMT.

Figura 8B przyrównuje region palca cynkowego, przy użyciu metody Clustal z tablica ważoną reszt PAM250, przeprowadzone 17 stycznia 1999 o 19:19 GMT.

Skróty:

At Arabidopsis thaliana, Sc Saccharomyces cerevisiae, Sp Schizosaccharomyces pombe, Ce Caenorhabditis elegans, Dm Drosophila melanogaster, Hs Homo sapiens, Mm Mus musculus, Rn Rattus norvegicus, Xm Xiphophorus maculatus Lista sekwencji

SEK ID NR:\\sekwencja 1 N2 cDNA

Landsberg erecta VRN2 aminokwasowa 3 Landsberg erecta VRN2 genomowa 4 Columbia VRN2 cDNA

Columbia VRN2 aminokwasowa 6 Columbia VRN2 genomowa 7 5K (Columbia, zaburzenie składania) cDNA 8 5K (Columbia, zaburzenie składania) aminokwasowa 9 C72616 EST (zmodyfikowana) cDNA

C72616 EST (zmodyfikowana) aminokwasowa

Al 163743 EST (zmodyfikowana) cDNA

Al 163743 EST (zmodyfikowana) aminokwasowa

At Hyp 2245035 (ATFCA7_4)(zmodyfikowana) cDNA

At Hyp 2245035 (ATFCA7_4)(zmodyfikowana) aminokwasowa

KIAA0160cDNA

KIAA0160 aminokwasowa

Dodatkowe sekwencje znajdujące się na rysunkach:

Landsberg erecta VRN2 palec cynkowy aminokwasowa

At Di 19 S51478 1 palec cynkowy aminokwasową

At Di19 S54178 2 palec cynkowy aminokwasowa

At SUP U38946 palec cynkowy aminokwasowa

At Hyp 2191171 palec cynkowy aminokwasowa

At Hyp 3377806 palec cynkowy aminokwasowa

Sc Pep7 91500 palec cynkowy aminokwasowa

Sc TFIIIA 730931 palec cynkowy aminokwasowa

Sp Hyp 1351713 palec cynkowy aminokwasowa

Ce Hyp 255942 palec cynkowy aminokwasowa

Ce Hyp 2854197 palec cynkowy aminokwasowa

PL 202 462 B1

Ce Hyp 304459 palec cynkowy aminokwasowa

Dm BRCORE-NS-Z3 palec cynkowy aminokwasowa

Dm GAGA 729556 palec cynkowy aminokwasowa

Dm ken 3550814 palec cynkowy aminokwasowa

Hs ATBF-1 976347 palec cynkowy aminokwasowa

Hs KIAA0160 palec cynkowy aminokwasowa

Hs ZNF142 3123312 palec cynkowy aminokwasowa

Mm FOG 2252814 palec cynkowy aminokwasowa

Mm Spalt 1296845 palec cynkowy aminokwasowa

Rn Roaz 2149792 palec cynkowy aminokwasowa

Xm ZF1 532083 palec cynkowy aminokwasowa

P r z y k ł a d 1

Charakterystyka i klonowanie VRN z Arabidopsis thaliana oraz alleli jego mutanta

Izolowanie mutantów vrn2

Dwa allele mutanta vrn2 (vrn2-1 and vrn2-2) wyizolowano poprzez mutagenizację nasion fca-1 przy użyciu EMS jak opisano w Chandler et al. (Plant J (1996) 10: 637-644). WO96/38560 (PCT/GB96/01332) ujawnia sekwencję fca i alleli mutanta oraz ich klonowanie i charakterystykę. Używana tu linia vrn2-1 fca-1 była wstecznie krzyżowana z fca-1 cztery razy. Dla celów mapowania użyto allel vrn2-1 (w 2 krzyżówce wstecznej).

Charakterystyka fenotypowa

Wernalizacja

Odpowiedź na wernalizację roślin mutantów vrn2 badano poprzez testowanie ich czasu kwitnienia w odpowiedzi na wzrastający czas trwania wernalizacji.

-2 -1

Stosowano standardowe warunki wernalizacji, tzn. niska intensywność światła 5 μmol nm^- s^- , 8 godz. fotoperiod, 5+1 stopni C, przez różne okresy czasu (pomiędzy 1 a 42 dni). Podobne wyniki można obserwować w warunkach bez światła, gdzie ważniejsza jest temperatura.

Przy braku wernalizacji, rośliny mutanta vrn2-1 fca-1 wykazują niewielkie lecz spójne opóźnienie kwitnienia w porównaniu z rodzicielskimi (dzikiego typu) kontrolami fca-1 (fig. 1: vrn2-1 ma większą liczbę liści niż fca-1, zredukowana liczba liści pozostaje w korelacji z przechodzeniem z formy wegetatywnej do stanu reprodukcyjnego (tzn. kwitnienia)). Jednakże, po wernalizacji, te różnice były znacznie większe (fig. 1). Odpowiedzią prezentowaną przez rośliny vrn2-1 fca-1 była zazwyczaj 35% redukcja liczby liści po 6 tygodniach od wernalizacji w porównaniu z 67% redukcją w kontrolach fca-1. Obserwowano także opóźnienie kwitnienia, zarówno przy wernalizacji jak i bez niej, co mierzono wzrostem liczby liści, jeśli stosowano dzień kwitnienia tzn. dzień w którym zauważalny były pierwszy pąk kwiatowy.

Percepcja światła czerwień/daleka podczerwień

Odpowiedź na wernalizację u Arabidopsis pozostaje w pozytywnej korelacji z odpowiedzią na różne stosunki światła czerwonego (R) do dalekiej podczerwieni (FR); mutanty i ekotypy, które silnie odpowiadają mają tendencję do silnej odpowiedzi na warunki niskiego R:FR (Bagnall, Ann Bot (1993) 71: 75-83; Martinez-Zapater et al., Plant Physiol (1990) 92: 770-776). Odpowiedź ta zazwyczaj objawia się na dwa różne sposoby - przyspieszonym czasem kwitnienia (prowadzącym do efektu, który naśladuje efekt wernalizacji) oraz redukcją powierzchni liścia (lub unikaniem cienia). Uważa się, że odpowiedź ta umożliwia roślinom adaptację do dostępnego światła pozwalającą osobnikom na szukanie światła w warunkach konkurencji z ich sąsiadami.

Przebadano zdolność mutantów vrn2-1 fca-1 do odpowiedzi na warunki przypominające takie środowisko.

W tych warunkach rośliny vrn2-1 fca-1 wykazywały widoczną redukcję odpowiedzi unikania cienia, ze średnią powierzchnią największego liścia obniżoną tylko o 26% w porównaniu z 74% redukcją dla kontroli fca-1 (fig. 2A). Jednakże, mutacja vrn2-1 nie zaburzała wszystkich aspektów związanych z odpowiedzią na światło FR, jako, że rośliny vrn2-1 fca-1 wykazywały podobne przyspieszenie kwitnienia w odpowiedzi na dodatkowe światło FR jak rośliny kontrolne fca-1 (fig. 2B).

Wyniki te wskazują, że VRN2 odgrywa rolę w regulacji odpowiedzi na światło FR i może pośredniczyć w zmianach specyficznych dla wielości liścia (podczas gdy czas kwitnienia jest zaburzony jedynie w niewielkim stopniu) w warunkach niskiego stosunku R:FR.

Mapowanie genetyczne

Gen VRN2 mapowano w populacji F2 pochodzącej z krzyżówki vrn2-1 fca-1 x fca-10, po procedurze mapowania genu VRN1 (Chandler et al. supra.). Stosując populację 70 osobników pokolenia F2

PL 202 462 B1 gen VRN2 wstępnie umiejscowiono pomiędzy markerami RFLP g13683 i mi112 (Schmidt et al., Plant J (1996) 9: 755-765) na dł ugim ramieniu chromosomu IV (lub D), przy zastosowaniu klasycznych technik. Pozycja mapowa została następnie dokładnie przeanalizowana poprzez sprawdzenie dodatkowych 429 roślin pokolenia F2 za pomocą SSLP dla markera g19247 (Schmidt et al., (1996) Plant J 9: 755-765) i CAPS dla markera g4539 (Parker et al., Plant Cell (1998) 9: 1-17). 12 osobników pokolenia F2, które były rekombinantami pomiędzy g19247 i g4539 analizowano dalej stosując RFLP z markerami g13683 i CC36F6 (Bancroft et al., Weeds World 4ii: (1997)) oraz CAPS z markerem C18 (Parket et al., supra.) oraz z dwoma dodatkowymi markerami CAPS (VRN2RS, VRN2CD) wytworzonymi przy użyciu opublikowanej sekwencji z Columbia (Bevan et al., Nature (1998) 391: 485-488) (numery dostępu Z97341 i Z97342) jako matrycy. Gen VRN2 zlokalizowano w regionie 245 kb zdefiniowanym na centromerowym (północnym) końcu za pomocą RFLP z kosmidem CC36F6 i na telomerowym (południowym) końcu za pomocą CAPS z markerem g4539. Odległość ta jest zdefiniowany przez 3 zrekombinowane osobniki roślin pokolenia F2; 1 rekombinant pomiędzy VRN2 i CC36F6 oraz 2 rekombinanty pomiędzy g4539 i VRN2 (fig. 3).

Mapowanie fizyczne

Genetyczna odległość zdefiniowana poprzez CC36F6 i g4539 prawie w całości pokrywa się z 3 klonami BAC - T1C7, I5D3 i T5O15. Kosmidy pochodzące z subklonów YAC EW16B10 w binarnym wektorze 04541 (Bancroft et al., supra.) (w skrócie IB) pozycjonowano poprzez sekwencjonowanie końców i ustawiano w odniesieniu do opublikowanej sekwencji ekotypu Columbia tego regionu (Genbank numery dostępu Z97341 i Z97342). Wyselekcjonowano klony kosmidowe pokrywające złożony locus RPP5 na zewnątrz od CC36F6 i g4539, co wykazało, że VRN2 nie leży w locus RPP5, który obejmuje wielokrotne powtórzenia genów typu RPP5 zarówno w ekotypie Columbia jak i Landsberg (Bevan et al., supra.).

Zidentyfikowano dodatkowe kosmidy Landsberg na binarnym wektorze 04541, które pokrywają region nie pokryty przez subklony YAC Columbia za pomocą hybrydyzacji wstawek z BAC T1C7 i T5O15, przyrównano w oparciu o sekwencje koń ców i porównano z opublikowana sekwencją Columbia (Bevan et al., supra.) i sekwencja ekotypu Landsberg w tym regionie. Stworzono prawie pełny kontig tego regionu.

Równocześnie z izolacją kosmidów, uporządkowane kosmidy, z tymi z centromerowego końca kontigu transformowano do roślin vrn2-1 fca-1 za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens metodą infiltracji w próżni (Bechtold et al., C R Acad Sci Paris (1993) 316: 1194-1199) (fig. 3). Obecność kosmidu w każdej transgenicznej linii (rośliny T1) potwierdzano poprzez diagnostykę PCR specyficzną dla kosmidu, wykorzystującą starter specyficzny do wstawki (odpowiadającej części genomowego DNA Columbia) i starter obecny na wektorze kosmidowym.

Kompementacja kosmidem

Kosmidy wprowadzane do roślin vrn2-1 fca-1 testowano pod kątem ich zdolności do komplementacji fenotypu vrn2. Nasiona T2, pochodzące z roślin T1 segregowujących oporność na kanamycynę w stosunku 3:1 siano w ziemi i poddawano wernalizacji po dwóch (w niektórych doświadczeniach trzech) tygodniach. Rośliny przenoszono do szklarni i po dziesięciu dniach przenoszono do indywidualnych przedziałów w podzielonych tackach. Określano całkowita liczbę liści i uważano za komplementujące jeśli stosunek segregacji od młodych do starych roślin (w porównaniu z roślinami kontrolnymi fca-1 i vrn2-1 fca-1) wynosił w przybliżeniu 3:1.

Dwa kosmidy Columbia (4A23, 2 z 2 T1s; 6N1, 1 z 1 T1) w sposób oczywisty komplementowały fenotyp mutantów vrn2-1 fca-1, gdzie najwcześniejsze rośliny kwitły w przybliżeniu w tym samym czasie co rośliny fca-1 poddane wernalizacji.

Analiza sekwencji i przewidywanie ORF

Wcześniej odnotowano, że sekwencja wspólna dla dwóch kosmidów, IB4A23 i IB6N1, zawiera 2 pełne przewidywane geny (ATDL4445W i ATDL4450W) oraz (przypuszczalnie niefunkcjonalne) części dwóch innych genów - koniec 3' z ATDL4440W oraz koniec 3' z genu typu RPP5, CHPR (ATDL4460W) (Bevan et al., supra.), numer dostępu Gen-bank Z97342. Dodatkowo w regionie tym obecny jest pokrewny cDNA (5K), o którym nie wspominano wcześniej a który wydaje się, że łączy dwa przewidywane geny (ATDL4445W i ATDL4450W) (Bevan et al., supra.). Ponieważ dwa kosmidy w tym regionie (po 1 niezależnej linii T1 z każdym z kosmidów IB4N6 i IB6C5) nie komplementują fenotypu mutanta (fig. 4) wykluczony zostaje przewidywany gen ATDL4445W. Jako kandydat na VRN2 pozostawał zatem nie wspominany wcześniej cDNA 5K oraz przewidywany gen ATDL4450W. Jednak obecność po24

PL 202 462 B1 krewnego cDNA 5K z ekotypu Columbia, który zachodził zarówno na ATDL4445W jak i ATDL4450W zmusiła do ponownego zbadania przewidywanego genu ATDL4450W.

W celu określenia struktury tych genów, uż yliśmy programu przewidywania NetGene2 (Hebsgaard et al., Nucl Acids Res (1998) 24: 3439-3452), stosując „Arabidopsis jako opcję organizmu Gedyny parametr zadany manualnie). Zastosowano programy BLAST, PSI-BLAST, PSORT oraz PROSITE do zidentyfikowania potencjalnych funkcjonalnych domen oraz podobieństw (Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997) 25: 3389-3402; Bairoch et al., Nucl Acids Res (1997) 25: 217-221; Nakai et al., Genomics (1992) 14: 897-911). Stosowano parametry domyślne TBLASTN, PSI-BLAST oraz BLASTP (oczekiwany = 10, tablicy BLOSUM62, kary za przerwę = 11, kary na przerwę 1, stosunek lambda 0,85). Stosowano bazę danych NCBI/GenBank. Stosowano algorytm PSORT (Nakai), używając opcji „roślina dla organizmu źródłowego (jedyny parametr, który można zmienić). Stosowano The Profile Scan program z PROSITE (Bairoch) do poszukiwania motywów w VRN2, z parametrami domyślnymi (nie ma parametrów, które użytkownik może zadać, wynik jest „trafiony lub „nietrafiony).

W wyniku analizy uzyskano dwa przewidywane geny, 5K, biał ko przypuszczalnie lokalizują ce się w jądrze, które jest składane po transkrypcji (15 egzonów), reprezentowane przez pokrewne cDNA z Columbia oraz zmodyfikowane przewidywania dla 4450, z 6 przypuszczalnymi domenami transbł onowymi, reprezentowane przez koniec 3' sekwencji EST z Arabidopsis (numer dostępu T22412).

Określenie mutacji vrn2-1 oraz identyfikacja genu VRN2

W celu okreś lenia, który z genów (5K czy 4450) jest genem VRN2, zaprojektowano startery do PCR w celu uzyskania produktów amplifikacji pokrywających całe przewidywane otwarte ramki odczytu obu genów.

Przeprowadzono trzy niezależne reakcje RT-PCR przy użyciu całkowitego RNA przygotowanego z 14 dniowych rozsadów fca-1, vrn2-1 fca-1 i vrn2-2 fca-1 hodowanych na szalkach z GM w ciągłym świetle, dla każdego przewidywanego genu przy użyciu mieszaniny enzymów o wysokiej wierności syntezy (Boehringer Mannheim, HiFi System). Produkty PCR sekwencjonowano przy użyciu starterów stosowanych do reakcji PCR i serii starterów wewnętrznych, przy użyciu zestawu BIGDYE kit (PE Applied Biosystems). Reakcje puszczano na urządzeniu ABI377 a sekwencje składano stosując program SeqMan (DNAStar, Lasergene).

Sekwencje produktów PCR potwierdziły nasze przewidywania dla obu genów i wykazały, że zgodnie z oczekiwaniem powieliliśmy całe otwarte ramki odczytu dla 5K i ATDL4450W.

Wykryto szereg drobnych różnic polimorficznych pomiędzy opublikowana sekwencją Columbia a sekwencją Landsberg erecta, którą powieliliśmy za pomocą PCR. Róż nice te był y zgodne z sekwencją genomowa Landsberg erecta w tym regionie. Ponadto wydaje się, że Columbia cDNA dla 5K wykorzystuje inne miejsce donorowe składania od tego, które używane jest przez Landsberg ecotype i mogłoby wytwarzać ucięte białko, przypuszczalnie nie funkcjonalne (fig. 5). Jednakże, także zsekwencjonowaliśmy niezależnie uzyskany poprzez RT-PCR produkt Columbia 5K i ten wskazuje na użycie tego samego miejsca składnia co Landsberg a zatem powinien kodować funkcjonalne białko. W produkcie 5K PCR wykazano obecność zgodnych różnic pomiędzy mutantami vrn2 i fca-1, zmiana G w A w pozycji 1201 przewidywanego cDNA w vrn2-1 fca-1 (fig. 5). Ostatnio określiliśmy naturę mutacji w allelu vrn2-2. Ten typ mutacji, zmiana pojedynczej pary zasad jest powszechnie obserwowany po mutagenezie EMS. Mutacja ta zmienia kodon TGG (tryptofan) w kodon stop (TGA) i w jej wyniku może powstawać w mutancie vrn2-1 ucięte białko o długości 322 aminokwasów w porównaniu z 443 aminokwasowym białkiem dzikiego typu VRN2 (fig. 6). Obecność mutacji wskazuje, iż należy się spodziewać że 5K jest VRN2. Obecność mutacji vrn2-1 w genomie mutanta vrn2-1 fca-1 potwierdzono poprzez CAPS (dCAPS) (Michaels et al., Plant J (1998) 14: 381-385; Neff et al., Plant J (1998) 14: 387-392) ze specyficznym markerem dla mutacji vrn2-1 (fig. 7). Ten test diagnostyczny jest specyficzny dla mutacji vrn2-1 mutacji, jako, że wykrywa VRN2 dzikiego typu w obu mutantach fca-1 i vrn2-2 fca-1.

Analiza genu VRN2

Dla poznania możliwej funkcji genu VRN2 oraz w jaki sposób mutacja vrn2-1 może zaburzać funkcje białka VRN2, porównaliśmy sekwencję aminokwasową białka dla VRN2 z wieloma bazami danych białek i przepisanych na aminokwasy sekwencji kwasów nukleinowych przy użyciu programów BLASTP i TBLASTN w NCBI, stosując parametry domyślne jak podano powyżej.

Zidentyfikowano szereg białek znaczącym stopniu podobieństwa (tablica 1 i tablica 2).

Jeden z takich genów, reprezentowany przez ludzki cDNA (KIAA0160) posiada homologię z VRN2 na krótkim obszarze blisko aminowego koń ca z VRN2 (aminokwasy 63 do 132) oraz na dłuż szym, lecz słabiej konserwowanym obszarze homologii na końcu karboksylowym (aminokwasy 263-366)

PL 202 462 B1 (fig. 8a). Bliższe zbadanie konserwowanego regionu na końcu aminowym ujawniło, podobieństwo do motywu palca cynkowego. Motywy takie mogą przyjmować różne formy, lecz wszystkie maja skoordynowane atomy cynku poprzez dwie reszty cysteinowe oraz dwie reszty cysteiny lub histydyny. VRN2 należy do drugiej klasy, posiada motyw C2H2 obejmujący dwie cysteiny rozdzielone przez 2 aminokwasy i dwie histydyny rozdzielone przez dwa aminokwasy (Mackay et aL.TIBS (1998) 23: 1-4).

Wiadomo, że motywy palca cynkowego pośredniczą w oddziaływaniach typu białko-DNA i białko-białko. Motyw palca cynkowego z VRN2 nie jest podobny do palców cynkowych typu C2H2 z dużej rodziny EPF z Arabidopsis, które mają silnie konserwowany motyw QALGG w środku palca cynkowego (Kubo et al., Nucl Acids Res (1998) 26: 608-615) (fig. 8b). Dodatkowo VRN2 różni się od białek typu EPF tym, że VRN2 pojedynczy motyw palca cynkowego, podczas gdy większość członków rodziny EPF (z wyjątkiem SUP i AtZFP1) posiada pomiędzy dwa a cztery palce cynkowe (Kubo et al., supra.). Zatem region na końcu aminowym (aminokwasy 63-132) a w szczególności motyw palca cynkowego (aminokwasy 90-111) mogą stanowić domenę pośredniczącą w oddziaływaniach typu białko-białko lub białko-DNA.

Koniec karboksylowy z VRN2 (aminokwasy 263 do 366) jest podobny do szeregu innych kandydujących genów (tablica 1 i tablica 2). Jak wspomniano powyżej, istnieje ograniczona homologia do przewidywanego ludzkiego białka KIAA0160. Cząsteczką wykazującą największą homologię do VRN2 jest sekwencja EST z topoli (Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx (numer dostępu AI163743) (Sterky et al., PNAS USA (1998) 95: 13330-13335), która posiada 52,8% identyczności na obszarze 127 aminokwasów (Tabela 1), jak obliczono przy użyciu algorytmu BLASTP stosując parametry domyślne jak podano powyżej). VRN2 wykazuje także znaczące podobieństwo do przewidywanego białka Arabidopsis (ATFCA7_4, numer dostępu 2245035) (Bevan et al., supra.), które leży całkiem blisko VRN2 na chromosomie 4, tylko 30 kb od centromeru. Bliższe zbadanie sekwencji w pobliżu tego genu pokazało, że przewidywanie może być nieprawidłowe, używając innego miejsca składania uzyskuje się inny koniec karboksylowy białka, co podnosi stopień homologii z VRN2. Podobieństwo tych dwóch genów z Arabidopsis zwiększa prawdopodobieństwo tego, że VRN2 może być członkiem rodziny genów w Arabidopsis a ich bliskie położenie sugeruje, że geny mogły powstać w wyniku duplikacji. Argumentem przeciwko takiemu zapatrywaniu jest fakt, że oba geny, VRN2 i ATFCA7_4, ulegają transkrypcji w przeciwnych kierunkach. Sekwencja EST z ryżu (C72616) posiada także znaczące podobieństwo do karboksylowego regionu z VRN2, co sugeruje, że region ten może tworzyć domenę konserwowaną ewolucyjnie obecną w roślinach jednoliściennych i dwuliściennych.

Przewiduje się, ze konserwowany region karboksylowy niesie silny ładunek ponieważ składa się z duż ej liczby kwaś nych reszt (D i E). Ten silnie nał adowany region jest wysoce podobny do sekwencji EST z topoli i ryżu (Tabela 2). Takie regiony występują w wielu eukariotycznych czynnikach transkrypcyjnych i często funkcjonują jako domeny aktywujące (Hahn, Cell (1993) 72: 481-483). Jest zatem możliwe, że VRN2 funkcjonuje jako czynnik transkrypcyjny, który posiada motyw wiążący DNA (lub wiążący białko) (aminokwasy 63-132) oraz przypuszczalną domenę aktywującą (aminokwasy 263-328). Ponadto, aminowa część VRN2 zawiera dwa przewidywane sygnały lokalizacji jądrowej (NLS) (fig. 6). Pierwszy jest prostym sygnałem złożonym z 4 reszt zasadowych, podczas gdy drugi jest dwuczęściowym sygnałem pasującym do sekwencji najwyższej zgodności (R/K)(R/K)N10(R/K)4 (Dingwall et al., TIBS (1991) 16: 478-481).

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie i charakterystyka roślin Arabidopsis transgenicznych pod względem VRN2 cDNA dla VRN2 sklonowano w sensownej orientacji w roślinnych wektorach ekspresyjnych

SLJ4D4 i SLJ4K1 (Jones et al., (1992) Transg. Res. 1, str. 285-297) według zaleceń Sambrook J et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. cDNA dla VRN2 znajduje się w wektorze SLJ4D4 i SLJ4K1 pod kontrolą promotora Ca MV 35S i sekwencji terminatorów, odpowiednio, genów syntazy oktopiny (ocs) oraz syntazy nopaliny (nos).

Konstrukty antysensowne są wytwarzane w ten sam sposób z wyjątkiem tego, ze cDNA dla VRN2 jest wprowadzony do wektorów ekspresyjnych w odwrotnej orientacji.

Kasety ekspresyjne VRN2 są następnie subklonowane oddzielnie w binarnym wektorze

SLJ1714 (Jones et al., supra) i przenoszone do szczepów Agrobacterium poprzez trój-rodzicielskie krzyżowanie według techniki Hoekema et al., (1983) Nature 303, str. 179-180. Rośliny Arabidopsis są transformowane szczepami Agrobacterium niosącymi konstrukty ekspresyjne z VRN2 (w sensownej albo antysensownej orientacji) według Bechtold et al., (1993) C R Acad. Sci. Paris 316, str. 1194-1199.

PL 202 462 B1

Rośliny Arabidopsis są testowane pod kątem zmian w ich odpowiedzi na zmiany światła dalekiej podczerwieni, zasadniczo jak opisano w Halliday et al., (1997) Plant J. 12, str. 1079-1090.

Wyniki

Różnice w wymaganiu wernalizacji oraz w odpowiedzi obserwuje się u roślin Arabidopsis transgenicznych pod względem VRN2 (orientacja sensowna i antysensowna) w porównaniu z roślinami Arabidopsis transformowanymi pustym wektorem i nie transformowanymi roślinami Arabidopsis.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie i charakterystyka roślin tytoniu transgenicznych pod względem VRN2 cDNA dla VRN2 sklonowano w sensownej orientacji w roślinnych wektorach ekspresyjnych

SLJ4D4 i SLJ4K1 jak opisano w przykładzie 2.

Konstrukty antysensowne są wytwarzane w ten sam sposób z wyjątkiem tego, ze cDNA dla VRN2 jest wprowadzony do wektorów ekspresyjnych w odwrotnej orientacji.

Kasety ekspresyjne VRN2 są następnie subklonowane oddzielnie w binarnym wektorze SLJ1714 (Jones et al., supra), przenoszone do szczepów Agrobacterium poprzez trój-rodzicielskie krzyżowanie jak w przykładzie 2 i rośliny tytoniu są transformowane przy użyciu szczepów Agrobacterium niosących konstrukty ekspresyjne z VRN2 (w sensownej lub antysensownej orientacji) według Horsch et al., (1985) Science 227, str. 1229-1231.

Rośliny tytoniu są testowane pod kątem zmian w ich odpowiedzi na zmiany światła dalekiej podczerwieni, zasadniczo jak opisano w Halliday et al., (1997) Plant J. 12, str. 1079-1090.

Wyniki

Różnice w wymaganiu wernalizacji oraz w odpowiedzi obserwuje się u roślin tytoniu transgenicznych pod względem VRN2 (orientacja sensowna lub antysensowna) w porównaniu z roślinami tytoniu transformowanymi pustym wektorem i nie transformowanymi roślinami tytoniu.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie i charakterystyka roślin Brassica (rzepak z oleistymi nasionami, odmiana zimowa) transgenicznych pod względem VRN2.

Konstrukty sensowne i antysensowne użyto do wytworzenia szczepów Agrobacterium niosących konstrukty ekspresyjne z VRN2 (w sensownej lub antysensownej orientacji) jak opisano w przykładzie 2 i Przykładzie 3 i użyto do transformacji rzepaku z oleistymi nasionami według Moloney et al., (1989) Plant Cell Rep. 8, str. 238-242.

Wyniki

Różnice w wymaganiu wernalizacji oraz w odpowiedzi obserwuje się u roślin rzepaku z oleistymi nasionami transgenicznych pod względem VRN2 (orientacja sensowna i antysensowna) w porównaniu z roślinami rzepaku z oleistymi nasionami transformowanymi pustym wektorem i nie transformowanymi roślinami rzepaku z oleistymi nasionami.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie i charakterystyka roślin ryżu transgenicznych pod względem VRN2 cDNA dla VRN2 sklonowano w sensownej i antysensownej orientacji w konstruktach i użyto do wytworzenia odpowiednich szczepów Agrobacterium. Szczepy Agrobacterium niosące konstrukty ekspresyjne z VRN2 (w sensownej lub antysensownej orientacji) użyto do transformacji ryżu według Kohll A et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, str. 7203-7208.

Wyniki

Różnice w wymaganiu wernalizacji oraz w odpowiedzi obserwuje się u roślin ryżu transgenicznych pod względem VRN2 (orientacja sensowna i antysensowna) w porównaniu z roślinami ryżu transformowanymi pustym wektorem i nie transformowanymi roślinami ryżu.

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie i charakterystyka roślin pszenicy transgenicznych pod względem VRN2

Szczepy Agrobacterium niosące konstrukty ekspresyjne z VRN2 (w sensownej lub antysensownej orientacji) wytwarzano jak w poprzednich Przykładach i używano do transformacji pszenicy według Becker D et al., (1994) Plant J. 5, str. 299-307.

Wyniki

Różnice w wymaganiu wernalizacji oraz w odpowiedzi obserwuje się u roślin pszenicy transgenicznych pod względem VRN2 (orientacja sensowna i antysensowna) w porównaniu z roślinami pszenicy transformowanymi pustym wektorem i nie transformowanymi roślinami pszenicy.

Metody i materiały

Hodowanie rośliny

PL 202 462 B1

W celu wernalizacji nasiona wysiewano w wilgotnej warstwie drobnego żwir (Levington's M3) na mokrej ziemi w osobnych doniczkach i wernalizowano przy wydłużonym czasie w 4°C, 8 godz. światła: 16 godz. ciemności, przy intensywności światła 5 μmol m^-2 sec^-1. Wysiane nasiona wyjmowano, wszystkie rośliny usuwano jednocześnie z warunków wernalizacji. Po wernalizacji rośliny przenoszono do komory zkontrolowanymi warunkami środowiska (Gallenkamp), 20°C, 16 godz. światła: 8 godz. ciemności, intensywność światła 90 μ^^ m^-2 sec^-1. Rośliny, których nie poddawano wernalizacji były stratyfikowane przez 2 dni w warunkach wernalizacji i hodowano je przez okres dwóch dni przed przeniesieniem do komory wzrostowej. Rośliny hodowano przez 10 dni i następnie przenoszono do osobnych przedziałów w tackach P40. Czas kwitnienia, mierzony za pomocą całkowitej liczby liści (tzn. liście w rozetkach i łodygowe) określano kiedy pierwszy kwiatostan wystarczająco się wydłużył.

Fenotyp roślin vrn2-1 fca-1 badano przy różnych stosunkach światła czerwonego do dalekiej podczerwieni (R:FR). Rośliny stratyfikowano przez 2 dni, następnie hodowano przez 10 dni w warunkach ze światłem a następnie [przenoszono do osobnych komór z białym światłem (W), stosunek R:FR 5,8 z lub bez uzupełniającego światła FR (W+FR), stosunek R:FR 0,08. Określano liczbę liści w rozetkach dla pomiaru czasu kwitnienia a powierzchnię największego liścia używano jako wskaźnik odpowiedzi unikania cienia.

Mapowanie

Pozycję mapową VRN2 ustalono na długim ramieniu chromosomu 4 (lub D) poprzez sprzężenie z markerem RFLP m506 (Chang et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 6856-6860), w potomstwie krzyżówki pomiędzy vrn2-1 fca-1 (tło Ler) a fca-10 (tło Ws). Dla dokładnego przeanalizowania pozycji VRN2 użyto dodatkowych markerów RFLP dla tego regionu (Liu et al., Plant J (1996) 10:733-736). Użyliśmy standardowych technik RFLP, stosując sondy kosmidowe wyznakowane 32P oraz systemu detekcji Phosphorlmager. RFLP Ler:Ws wykryto po zastosowaniu trawienia genomowego DNA enzymem EcoRI zarówno sondą g13683 jak i CC36F6. Marker g19247 jest markerem SSLP (stosowane startery g19247F i g19247R, patrz poniżej), wytwarzającym dla Ler prążek po amplifikacji PCR o wielkości w przybliżeniu 750 bp, podczas gdy dla Ws wytwarza prążek 862 bp. Precyzyjne mapowanie VRN2 przeprowadzono przy użyciu serii markerów pochodzących z PCR opartych na genomowej sekwencji Columbia z tego regionu (Bevan et al., supra.). Marker VRN2CD powielano przy użyciu dwóch starterów, VRN2-C i VRN2-D i trawiono enzymem Ddel. To wytwarzało marker CAPS, gdzie Ler daje prążki o długości (w przybliżeniu) 480 bp, 290 bp i 190 bp, podczas gdy Ws daje prążki o długości (w przybliżeniu) 330 bp, 290 bp i 150 bp. Marker VRN2RS jest markerem dominującym dla Ws (tzn. heterozygoty LenWs nie są rozróżnialne od Ws), wytwarzanym poprzez amplifikację genomowego DNA przy użyciu VRN2-R i VRN2-S (patrz poniżej) i trawienie produktu enzymem Mboll. Daje to pojedynczy dominujący prążek (oraz kilka mniejszych prążków, które się nie rozchodzą) w Ler w przybliżeniu 400 bp, podczas gdy w Ws wytwarzane są dwa prążki 400 bp i 300 bp.

Izolacja kosmidu

Kosmid pokrywający regionie pokryty przez subklony z EW16B10 YAC zidentyfikowano poprzez hybrydyzację do wstawek BAC pochodzących z wektorów BAC T5015 i T1C7. DNA BAC oczyszczano a wstawkę izolowano po trawieniu enzymem Notl i rozdziale żelu agarozowym za pomocą elektroforezy pulsowej (PFGE) jak opisano w Bancroft et al., supra. Oczyszczone wstawki BAC znakowano a32P-dCTP przy użyciu losowych starterów i hybrydyzowano do zestawów z kosmidową biblioteką genomowa dla Ler. Identyfikowano kosmidy hybrydyzujące pozytywnie i ponownie przeszukiwano stosując trawienie enzymami restrykcyjnymi, przenoszenie na filtr i hybrydyzację do sondy z wstawki z BAC stosowanej pierwotnie. Selekcjonowano kosmidy zawierające poszukiwany region i uzyskiwano sekwencję genomowego DNA dla końców wstawki przy użyciu zestawu BIGDYE cycle sequencing kit oraz starterów T3 i T7, których sekwencja flankuje wstawkę genomowego DNA. Sekwencję przyrównano z sekwencją genomowa Columbia w celu ustalenia dokładnej pozycji kosmidów.

Komplementacja

Kosmidy w binarnym wektorze 04541 przenoszono do Agrobacterium tumefaciens (szczep C58C1 RifR przez krzyżowanie trój-rodzicielskie (Hoekema et al., Nature (1983) 303: 179-180). Rośliny vrn2-1 fca-1 transformowano tymi szczepami Agrobacterium za pomocą próżniowej infiltracji (Bechtold et al, supra.). Transgeniczne rośliny T1 selekcjonowano na szalkach GM z kanamycyną (50 mg/ml) i przenoszono do ziemi kiedy osiągnęły stadium 3-4 liści. Obecność każdego kosmidu w liniach transgenicznych potwierdzano przy użyciu albo specyficznego polimorfizmu Ler/Col (marker CAPS lub SSLP) lub częściej przez użycie specyficznej diagnostycznej reakcji PCR, przy użyciu startera obecnego w sekwencji wstawki kosmidowej oraz startera obecnego w sekwencji kosmidu flankującej

PL 202 462 B1 wstawkę. Rośliny transgeniczne testowano także na obecność mutacji fca-1 jako, że rośliny T0 powinny nieść tę mutację. Obie metody zastosowane razem zapewniły, że tylko rośliny vrn2-1 fca-1 niosące pożądane kosmidy były dalej analizowane. Dążyliśmy do wytworzenia 5 do 6 niezależnych transformantów T1 dla każdego kosmidu, lecz dla niektórych kosmidów jedynie wytworzono pojedynczą linię. Jednakże, ponieważ obserwowaliśmy komplementację zanim wytworzyliśmy pokolenie T1 dla wszystkich kosmidów, kontynuowaliśmy wytwarzanie dodatkowych roślin T1 niosących kosmidy z regionu VRN2. Rośliny T1 hodowano w komorze z kontrolowanym środowiskiem (warunki jak powyżej) i doprowadzano do krzyżowania wsobnego. Nasiona T2 zbierano i analizowano segregację oporności lub wrażliwości na kanamycynę na szalkach zawierających kanamycynę (jak powyżej), wyniki odczytywano po 14-20 dniach po skiełkowaniu. Potomstwo roślin T1 które segregowało w stosunku 3:1, rośliny oporne do wrażliwych, testowano pod kątem zdolności komplementowania fenotypu mutanta vrn2-1 poprzez wernalizację przez 3 tygodnie i zliczenie całkowitej liczby liści.

Zsekwencjonowane ORFy

Dwie potencjalne otwarte ramki odczytu zsekwencjonowano po reakcji RT-PCR z RNA wyizolowanym z roślin fca-1 i vrn2-1 fca-1. Cząsteczki cDNA uzyskano dzięki odwrotnej transkrypcji, przy użyciu startera dT12-18, a do powielenia regionów odpowiadających sekwencjom ORF ATDL4450W i 5K (VRN2) użyto starterów specyficznych. Zastosowano system HiFi PCR system (Boehringer Mannheim) dla uzyskania wysokiej wierności amplifikacji. Startery VRN2-AL i VRN2-AM użyto do powielenia ATDL4450W, a VRN2-AI i VRN2-AJ do 5K. Dla 5K, w reakcji PCR (VRN2AI-VRN2AJ) nie uzyskano wydajnej produkcji fragmentu o pełnej długości, dlatego przeprowadzono kolejne reakcje w celu powielenia cDNA w dwóch zachodzących na siebie fragmentach przy użyciu kombinacji starterów VRN2-AI z VRN2-AS oraz VRN2-AO z VRN2-AJ. Produkty PCR wyizolowano, oczyszczono i zsekwencjonowano przy użyciu zestawu BIGDYE sequencing kit (PE Applied Biosystems). Zsekwencjonowano co najmniej dwa niezależne produkty PCR dla każdego allelu. Zsekwencjonowaliśmy produkty PCR ATDL4450W przy użyciu starterów stosowanych przy amplifikacji VRN2-AL VRN2-AM oraz VRN2-AU do VRN2-AX. CDNA dla 5K sekwencjonowano z VRN2-AI, VRN2-AJ oraz VRN2-AO do VRN2-AT. Sekwencje przyrównano do kontigów przy użyciu pakietu DNAStar software (LaserGene).

Porównania sekwencji

Sekwencje EST i cDNA przepisano na sekwencje aminokwasowe przy użyciu programu MapDraw z DNAStar (LaserGene). Ujawniło to szereg regionów w których wydaje się, że sekwencja nie była poprawna, niewielkie zmiany w opisanych sekwencjach drastycznie polepszyły podobieństwo do VRN2. Zmodyfikowane sekwencje aminokwasowe były wstępnie przyrównane przy użyciu programów z pakietu MegAlign z DNAStar (LaserGene)i uzyskano następujące dane:

Sekwencje aminokwasowe były identycznie przyrównane przy użyciu programu Clustal V (Higgins and Sharp (1989) CABIOS vol. 5, no. 2, 151-153). Zastosowano następujące parametry: kara za przerwę 10, kara za długość przerwy 10, ktuple 2 oraz tablica reszt ważonych PAM 250. Przyrównanie było dokładniej badane i wprowadzono drobne manualne zmiany w pozycjach przerw dla poprawienia przyrównania.

Sekwencje kwasów nukleinowych (EST i cDNA) były wstępnie przyrównywane przy użyciu metody Hein'a (Hein (1990) Methods in Enzymology, vol. 183, 626-645), przy zastosowaniu parametrów domyślnych: kara za przerwę 11, kara za długość przerwy 3, ktuple 2, oraz ważona tablica reszt ważonych. Tam gdzie przyrównanie sekwencji nukleotydowych (po translacji) nie odpowiadało przyrównaniu sekwencji aminokwasowych miejsca przerw poprawiano tak aby odpowiadały przerwom w przyrównaniach aminokwasowych.

Marker dCAPS do analizy mutacji vrn2-1

Marker pochodny CAPS (dCAPS ) zaprojektowano w ten sposób, że jest on specyficzny do mutacji vrn2-1. Po amplifikacji PCR genomowego DNA przy użyciu starterów VRN2-AY i VRN2-AZ, 170 bp produkt trawiono przez noc enzymem restrykcyjnym Xmnl i produkty rozdzielano w 4% żelu agarozowym. Rośliny dzikiego typu (VRN2) wytwarzają po trawieniu pojedynczy prążek 170 bp, podczas gdy mutanty vrn2-1 wytwarzają dwa prążki o długości 137 bp i 33 bp.

Startery używane do identyfikowania VRN2

Jak wskazano na fig. 3 i fig. 5. Wszystkie startery podane są w orientacji od 5' do 3'.

PL 202 462 B1 g19247F g19247R

VRN2-C

VRN2-D

VRN2-R

VRN2-S

VRN2-AI

VRN2-AJ

VRN2-AL

VRN2-AM

VRN2-A0

VRN2-AP

VRN2-AQ

VRN2-AR

VRN2-AS

VRN2-AT

VRN2-AU

VRN2-AV

VRN2-AW

VRN2-AX

VRN2-AY

VRN2-AZ

ACT GTT CGT CTC CTT CAT CAT G

TTG CTT GCC TGA AAA AAG TAT G

TGT CGA TAT GCG ACC AGT ACC

CAG GCT TAG ACC CAA TTG ACC

AGG TAG GAT CCG ACA TCG TCT TCT TAT TTA CCG CTC TTG AAT TCA AAA CTA TTC CTA CTC TCA CAC GCC AAT CGG TGT TTT CGC AGC TTT C AAG AAT AAG TTA CAA TCC GAT AAA TCG G CAG TGG TTG AAG CTT AAG GAG G

GCA ATG AAT AAA TCA TAA TCT TGG

TCT ACT GGG ATG GTA GTT TTC

ATA TCC CGA GGC AAC AGA GCT TG

CAT CTT TGG AAC TCG TTT G

CTC AGT TGT AAT AGT TGC CC

AAG AGT GGG CTA TGG CTG G

GCA ACT CTT TCT CGT AAA ATC TTG

GCC TCC ATA ACT GTC ATC ACA TC

TTT CAT TGG TCA TGG GAT GG

GAC TTC AGA GAT GGG TTT ATG C

TCC ATA TCT AGC TCC TTC GCC

TGC GTT CAT TAA GTA GGC AAC AGA AAA TGG GAG AAG TAG TTA CCT TTG TTT TCT TAC AGA AGA GT

PL 202 462 B1

T a b l i c a 1

Porównanie sekwencji nukleotydowych VRN2 i sekwencji aminokwasowych z sekwencjami z baz danych

	Nukleotydy	Aminokwasy
Sekwencja	Identyczność (%)	Długość	Zakres3	Identyczność (%)	Podobieństwo (%)b	Długość	Zakresc
VRN2 Col	96,5	1722	1-1722	96,1	96,8	445	1-445
C72616 region I	32,4	219	681-899	15,1	42,5	73	151-223
C72616 region H	71,7	247	951-1197	72,7	85,7	82	241-322
C72616 całość	47,7	517	681-1197	40,1	58,1	172	151-322
All 63743 region I	41,0	61	839-899	27,3	68,1	22	202-223
All 63743 region H	71,6	264	951-1214	66,7	77,1	88	241-328
All 63743 całość	65,8	376	839-1214	52,8	66,6	127	202-328
At Hyp 2245035	66,3	570	924-1493	63,7	79,5	190	232-421
KIAA0160 region I	36,6	396	231-626	20,4	39,4	132	1-132
KIAA0160 region H	35,5	904	819-1722	17,7	43,4	249	197-445
KIAA0160 całość	41,1	1492	231-1722	16,0	36,0	445	1-445

a Numeracja względem sekwencji VRN2 cDNA b Podobieństwo zdefiniowane jako identyczność plus podobieństwo w oparciu o zgrupowanie aminokwasów w cztery klasy: (D, E), (R, K, H), (S, T, N, Q, Y), oraz (L, I, V, M, A, G, W, F, P, C). c Numeracja wzglę dem sekwencji aminokwasowej VRN2.

T a b l i c a 2

Przewidywane domeny proteiny VNR2

Domena	Subdomena	Długość	Pozycja	Identyczność (%)	Podobieństwo (%)b	Cząsteczka
DNA/wiążąca proteinę		70	63-132	30,0	51,4	KIAA0160
	Motyw palca cynkowego	22	90-111	50,0	68,1	MmSpalt 1296845
		22	90-111	45,4	68,1	Sc TFIIIA 73093 1
		22	90-111	40,1	72,7	Ce Hyp 2854 197
		22	90-111	36,4	50,0	KIAA0160
	Konserwowany region	41	76-116	43,9	61,0	KIAA0160
Aktywująca		66	263-328	89,4	95,4	All 63743
		68	263-330	83,0	93,2	C72616
		104	263-366	58,6	76,0	At Hyp 2245035
		104	263-366	29,8	49,0	KIAA0160
	Konserwowany region kwasowy	36	281-316	94,4	97,2	All 63743
		36	281-316	86,1	94,4	C72616
		36	281-316	58,3	72,2	At Hyp 2254035
		36	281-316	30,5	50,0	KIAA0160

a Pozycja wzglę dem sekwencji aminokwasowej VRN2. b Podobień stwo obliczono wedł ug definicji z tablicy 1.

PL 202 462 B1

SEK ID NR: 1

CAAGCTTCTTCAATTTTGCTTGCTCTCTCTTACACAGCCAATCGGTGTTTTCGCAGCTTTCA

GGCCTCAATCCAAGACATTCTATATAAGCATATTGCAGAAGAGGCGGTTCTAATTGTTGCAT

TGAGTTTATCGCTATGACGTAGGGAAATTCTAATTTAGGGGAGGCCTCAGAGTTTGCACTAA

CTTCATAATCGGCTCTTGACGTTGTTGAGTGTAATTGAACAAGAATGTGTAGGCAGAATTGT

CGCGCGAAATCCTCACCGGAGGAAGTGATTTCAACTGATGAGAATCTCTTGATATATTGTAA

ACCTGTTCGACTATATAACATCTTTCACCTTCGCTCTCTAGGCAACCCATCGTTTCTTCCAA

GATGCTTGAACTACAAAATTGGAGCAAAGCGCAAAAGAAAGTCAAGATCTACTGGGATGGTA

GTTTTCAACTATAAGGATTGTAATAACACATTACAGAAAACTGAAGTTAGGGAGGATTGTTC

TTGTCCATTTTGCTCTATGCTATGTGGTAGCTTCAAGGGGCTGCAATTTCATTTGAATTCAT

CTCATGATTTATTTGAATTTGAGTTCAAGCTTTTCGAAGAATACCAGACAGTTAATGTTTCT

GTAAAACTTAATTCCTTCATATTTGAGGAAGAAGGAAGTGATGACGATAAATTTGAGCCCTT

CTCTCTCTGCTCGAAACCTCGTAAGCGGAGACAAAGAGGTGGCAGAAATAACACCAGGAGAC

TTAAAGTATGCTTTTTACCGTTGGATTCACCCAGTTTAACTAATGGCACAGAAAATGGAATC

ACCCTACTTAATGATGGAAACCGTGGTTTAGGATATCCCGAGGCAACAGAGCTTGCTGGACA

ATTTGAGATGACCAGCAACATTCCACCAGCCATAGCCCACTCTTCTCTGGACGCTGGTGCTA

AAGTTATATTGACAAGCGAAGCTGTGGTCCCTGCTACTAAGACAAGAAAGTTATCTGCTGAG

CGATCAGAGGCTAGAAGCCACCTACTTCTTCAGAAACGCCAATTCTATCATTCTCACAGAGT

CCAGCCAATGGCGCTTGAGCAAGTAATGTCTGACCGGGATAGCGAGGATGAAGTCGATGACG

ATGTTGCAGATTTTGAAGATCGCCAGATGCTTGATGACTTTGTGGATGTGAATAAAGATGAA

AAGCAATTCATGCATCTTTGGAACTCGTTTGTAAGAAAACAAAGGGTTATAGCAGATGGTCA

TATCTCTTGGGCATGTGAAGCATTTTCAAGATTTTACGAGAAAGAGTTGCACCGTTACTCAT

CACTCTTCTGGTGTTGGAGATTGTTTTTGATTAAACTATGGAACCATGGACTTGTCGACTCA

GCCACCATCAACAACTGCAATACCATCCTCGAGAATTGCCGTAATAGCTCAGACACCACCAC

CACCAACAACAACAACAGTGTGGATCGTCCCAGTGACTCAAACACCAACAACAATAACATTG

T GGAT C AT CC C AATGACATAAACAAC AAGAAC AAT GT TGACAACAAGGACAATAACAGCAGA

GAGAAAGTAATTAAATAGGAAAATCTCCGGCTTTTATGATACCGATTTATCGGATTGTAACT

TATTCTTCTTTCTTAAAAAATTGTTTAGGAGCAAACAAATTTTTTATATGTTAGTGTATTCA

ACTGATTACATTTTTAGTTAAAAAAAAAAATGGATTCTGCTTATAACT

PL 202 462 B1

SEK ID NR: 2

MCRQNCRAKSSPEEVISTDENLLIYCKPVRLYNIFHLRSLGNPSFLPRCLNYKIGAKRKRKS

RSTGMVVFNYKDCNNTLQKTEVREDCSCPFCSMLCGSFKGLQFHLNSSHDLFEFEFKLFEEY

QTVNVSVKLNSFIFEEEGSDDDKFEPFSLCSKPRKRRQRGGRNNTRRLKVCFLPLDSPSLTN

GTENGITLLNDGNRGLGYPEATELAGQFEMTSNIPPAIAHSSLDAGAKVILTSEAVVPATKT

RKLSAERSEARSHLLLQKRQFYHSHRVQPMALEQVMSDRDSEDEVDDDVADFEDRQMLDDFV

DVNKDEKQFMHLWNSFVRKQRVIADGHISWACEAFSRFYEKELHRYSSLFWCWRLFLIKLWN

HGLVDSATINNCNTILENCRNSSDTTTTNNNNSVDRPSDSNTNNNNIVDHPNDINNKNNVDN

KDNNSRDKVIK

SEK ID NR: 3

AAAGAGAATGCTTTGACTCTCTCATTGGTCAAACCTGACTGTATTTATATGCGTTATTGTGT

GGTAAAGTTTCGACCTTTGACTTTACAAGTTGGCGTTAAGAAGAGAGATGCGTAGATCAGCG

AGTGGTTCGAGAGTTTTGGATCATTTTCCCCCGACTTCACGGTCTCCACGTCGATCTCAGAG

CATTACATCATTGGAAGATGATGTGGAGGTGCTTTTGCCTAGGTACGATCCGAATTCTCAAG

CGGGGAAGAGAGAGAAGTCAAGATTCAGATTTGCAGAAAACGTCATCCATTTGATTCCTCTC

ATTCTTCTTCTCTGTATCGCAATCCTCTGGCTCTCCTCTTATTCAGGTAAGCCGAGAAATTG

ATTCAATCTCTATGAATCCATAATTGATATGTGAAACTTAATTAGGGATTTTACAAAGGCTC

ATATGGATATGATATGAGGATCGAGATGTCTCTGTAACATTAGAATCTTGTGTTGAATTATT

GTTTCAATTTGTTCATATTATACTAAACCGGTGATGGATTTGGAATTTGTCAGCAGCGTTAA

GGAGTTGAGTTCAAGAAGCAACATGTTGTCTTGTCTCCATGGGAACTCATCATATTCAGTTT

TGGGAAAGGAAACAATTTTTTTTACCGCCGGTGATTATGTGCCGCAAACCATACGTAACTTT

TGTAATTTTCGGTTCTGTAGACACATAAAAGGATCTCTCGTTTTCATGAAATGTATGTTTAA

TATTTCACTATACATCACACAACTCAAGTAGAAAACACTGATGGTTATCCATTAATCATCAT

TCTATTGGTCGAAAACAAGGATTAGTTTCAACTTATTGCTACCTTAGTGATTAGATGTTCCT

GTGAGTTTCAGCTAGCCAAGTCAACTAGAGTTAAACAATGGAATCAAAATACATATTCAGTA

ATTTATTTTAAACTCTGACTATTTATGTAAACAAAAATGGAAATTAAAATTGAAGGTCATGA

AGATTCTATTCTTAGTATGAAAAGTATAGATCAATGATAAAAGTATATACCAGAACAGTGGT

PL 202 462 B1

GGATCTAGAAACATATTTAGTATATGGCACAATATATTTAACATATACAAATTTTAATCTAA

AAGTTGTATTCATTTATGAAAAGACWTCTGAATGAAGCAAATTTATTTGATGTGTTAATCAT

CCATTTATGTGTTAATCAGCCATTGATGTTAGTATAGTACTCTATGCTAACATAATTTTTTT

ATACTATAAATTAAAAAAATAGGTAAGAAAAGAAAAATAGATTAATATAAAAAGCATTTTAT

TAGCTGAAATAAATAAAATGAAAGAAGATAATAACTAATTGACTAAAAAATTAGTAGAGCAT

ATGGGGCACAATACACTAAGTATTTCATCTTTACTATAAAATGTAACAAATTTCAAAATTAT

CAAACTGTATATAGGGCACGTGCCTAGGTACCAATAGACGTACGTCCGCCCTGAAATAAGTT

GGTGAATATGGTTTTAATTCCTCTAATACTCACTGTACTGCCATGGTAGAGGTGAAAAAAAC

AATTTTAGAAATATTATAATGGATTAAGCTGTCCAAGTTGGTCGTATTTTCTTTACATTTTA

TTAACTAATAAACATAAATAAGTTCAACTATTTATTGACTAGTAATAATACGTGTAAAATGT

CTATTGGTTTAAAATATGGGCCATAAGGCCCAGACTTGAAAAAAAAACTTGAAACCCAAAGT

TATATTTTTACTTGTTTCTTCTTTCTCAGTGAATATCTCCCAATCAAGCTTCTTCGATTTTG

CTCTCTCTTACACAGCCAATCGGTGTTTTCGCAGCTTTCAGGTTTGTCTCAATCTCAAATTA

AATCGGAGTCAAGTAATAACAATTGATAAACCTAATTGTTTCCATTGTATTGTAAGATTTGA

AATTTTGCTGTAGATCCGGAATCGAATTCTAGTTCTGGAATCGTTGATCTCGATGGAATTTT

TTTTTTAAGATTTCTTCTTACACATTTGGTTCAAAAGATCACATAGTTTTATTTTAATTTGA

TAAGTATGATGATTCTGCTAAGTGGCATTGGATAAAGTTTTCGTTTTTGCAATACGTCTAAA

CTTGTCTATGTCTTGAATGAACTCTCTGAGTTGCTTAAAAAGTCTTGTGCTTTCTTTATTAC

ACAGGCCTCAATCCAAGACATTCTATATAAGCATATTGCAGAAGAGGCGGTTCTAATTGTTG

CATTGAGTTTATCGCTATGACGTAGGGAAATTCTAATTTAGGGGAGGCCTCAGAGTTTGCAC

TAACTTCATAATCGGCTCTTGACGTTGTTGAGTGTAATTGAACAAGAATGTGTAGGCAGAAT

TGTCGCGCGAAATCCTCACCGGAGGAAGTGATTTCAACTGATGAGAATCTCTTGATATATTG

TAAACCTGTTCGACTATATAACATCTTTCACCTTCGCTCTCTAGGCAACGTATGATTTGCCT

TCCTCTCTCATCATATTAGCTCAGTAATCTTTCATCTCCTGTGTAGATCACCCACTAATAGT

TTGAGTTTGCTAAGCTGATTATGGTCTGATTCATGGCGAGTGTGTGCTTCTTTTGTCTCCTA

AATTTGAACTTGTTGTTTGTTGTTGCAGCCATCGTTTCTTCCAAGATGCTTGAACTACAAAA

TTGGAGCAAAGCGCAAAAGAAAGTATGTTTTCTTCTTGAATGTAGCTGCTACAGTGATATGT

TATTTATCTTACTTCTAATATGGAAGCTGATGACCTATTTTATCTTTGTTGAGTAGATATGG

ACATAATGAATGGTTTCTTCTTTGTTCATGCTATAAACTTACATTTTATAAAATTGTGTTTT

GGTTAGGTCAAGATCTACTGGGATGGTAGTTTTCAACTATAAGGATTGTAATAACACATTAC

AGAAAACTGAAGGTTAGTCTTTTTCTGTTCGTCGACAAAATTCGATGTCAATGTCTATGTTT

PL 202 462 B1

CTCTAGATGATTTGTTATTTACTATTTTTTTCTGTATTGTCATGCAGTTAGGGAGGATTGTT

CTTGTCCATTTTGCTCTATGCTATGTGGTAGCTTCAAGGTGGGCAACTATTACAACTGAGGT

TTCTTCCGGGGCCTTTCATATCTAACACTGTGAAATGCTACTGCTGTTTCATGCTGTATACT

TTCACTGTTTGGTTACATATTTTTGTGTTTGTTGTTTGTCTTCTCACTCTTTTCGAACTGCT

GAGTGTGTGCTTATCTGAGAAAACATGTCCCAGATGGAGCTTACAACCAATTGTCTTGTGTC

TATGCAGGGGCTGCAATTTCATTTGAATTCATCTCATGATTTATTTGAATTTGAGTTCAAGG

TATGTGGTTTTATGGAAATTCTTGATTTGCTATGCCTTTATTAATGAGGTTATAGTTAAAAA

AGGGTCTTTCCTATTGTAGCTTTCGGAAGAATACCAGACAGTTAATGTTTCTGTAAAACTTA

ATTCCTTCATATTTGAGGTCAGTTACTTTAAACTTGGTTAATTGGGAAATCCGATAGCTGGT

GAAAATTTTGTTTATATTCCATCCTTATTTGTACTAGGAAGAAGGAAGTGATGACGATAAAT

TTGAGCCCTTCTCTCTCTGGTAACCCTCAGAACCCCTTCGATTAAATACCTTAATAGCAGTA

ACTCCTTGCTTCTCTTGTCAGTACATCTCTGTAAATCCAACCATAATGTTTTGCAGCTCGAA

ACCTCGTAAGCGGAGACAAAGAGGTGGCAGAAATAACACCAGGAGACTTAAAGTATGCTTTT

TACCGTTGGATTCACCCAGTTTAACTAATGGCACAGAAAATGGAATCACCCTACTTAATGAT

GGTAAAATCATATCTTCTTCTGTGCGTTCCTTGTGGCTTAGAACTTCATATTACAGAAGAAG

ATACAATGGCCTGATTGTTTAGTTTTTGTACTTCTCCTCGCATTCTTCTTGCGAGGGTATTG

TTACCAGAACTGATGTACAAAATTAATGGCATGCTACAGGAAACCGTGGTTTAGGATATCCC

GAGGCAACAGARCTTGCTGGACAATTTGAGATGACCAGCAACATTCCACCAGCCATAGCCCA

CTCTTCTCTGGACGCTGGTGCTAAAGTTATATTGACAAGCGAAGCTGTGGTCCCTGCTACTA

AGACAAGAAAGTTATCTGCTGAGCGATCAGAGGCTAGAAGGTTTGTTCATCATGACACCCCG

TCATCATAATTACCATTCCTGTTGTTACAAATGTTCTTCCTATTATGGATAAGTGTTTATAG

TACTGCCATATTAACCGAGAAAATTTCTTCCAGCCACCTACTTCTTCAGAAACGCCAATTCT

ATCATTCTCACAGAGTCCAGGTGATCCAAGTTCCTTCACCTACTTCTTAGGCATTTTCTTTA

AATTGCTCATGATGATATCTTATCAAAGCATACTTGGTTTGTTCTCATCCAAATTTGTATTT

TGATCTGTATGTATCAACGCAAAATAGTTATGTCCATGTTGTCTCCGTTTTATTGCCACTAA

CCAAAAAATGCATGTTTCTGTGACAAGCCAATGGCGCTTGAGCAAGTAATGTCTGACCGGGA

TAGCGAGGATGAAGTCGATGACGATGTTGCAGATTTTGAAGATCGCCAGGTATTCCATGATT

TCTTTCTGCGTTCATTAAATAGACAACAGAAAATGGTATATGATGTAACTTGCTAATGGCTT

TTGAAACTTAAAAAAGCTGCAGATGCTTGATGACTTTGTGGATGTGAATAAAGATGAAAAGC

AATTCATGCATCTTTGGAACTCGTTTGTAAGAAAACAAAGGTAACTACTTCTCTTACACATG

AACAGACACAAAAAGACCTTATGTCTTACATTCCATACCTGTCTAAATGATTTTGCTTATGG

PL 202 462 B1

AACTTTGAGCTCAATTATGATTGTTGATGTTTCAGGGTTATAGCAGATGGTCATATTTCTTG

GGCATGTGAAGCATTTTCAAGATTTTACGAGAAAGAGTTGCACCGTTACTCATCACTCTTCT

GGTAATATAAGTACACCAAACATATACAGACACATAACTACACTATCAATCTTGTTTCGTTT

TCTGAAAAAAAAATAAAAATTTCCAGGTGTTGGAGATTGTTTTTGATTAAACTATGGAACCA

TGGACTTGTCGACTCAGCCACCATCAACAACTGCAATACCATCCTCGAGAATTGCCGTAATA

GCTCAGACACCACCACCACCAACAACAACAACAGTGTGGATCGTCCCAGTGACTCAAACACC

AACAACAATAACATTGTGGRTCATCCCAATGACATAAACAACAAGAACAATGTTGACAACAA

GGACAATAACAGCAGAGACAAAGTAATTAAATAGGAAAATCTCCGGCTTTTATGATACCGAT

TTATCGGATTGTAACTTATTCTTCTTTCTTAAAAAATTGTTTAGGAGCAAACAAATTTTTTA

TATGTTAGTGTATTCAACTGATTACATTTTTAGTTAAAAAAAAAAATGGATTCTGCTTATAA

CTAAAAACTGAAAAAAAAGAAAAGTTTCCTTAATTTTTCTTTTTGACTTGAGAAAAAGCTCC

TCTAGTAAATATGAGTTATATATTAATCAAGTACATAACATAAAAATAGTATATATTAAGTG

CCATTTGGACTTGTTCTTTCTCAATGAATCCCTCACAAGCAGCAAGCTTCTTCGATTTTGCT

TTGACACCACCAATCGGTGTTTTCGAATCTTTCAGGTTTGTCTCGATTTCAATCTAGATCGG

AGTCAAGTAATAAAATTGATTAACCTAAGTATTCCCGTTCTCTCGTAAGAGTTGGGATTTAG

CAGTAGATCGGAAATCGGAATTTACGTTTTTGTTAAAAGATTGATGGTTTAGGTAATGGAAC

ATAGTTCTGGATTCATTGCTTCTAGTTGATTCTCGAATTGTTTGATTTCGCAATGCACATTT

TTGTTTCAAAGGATCACAGAATTTGATTTAAAATTTGACAAAATTCCATCAATTTCTCATAT

TAGGGTTTATATTTCTTCTAGTAACTCGAACTTGTTGGAACTCTGTATACTCTGTGCTATGT

AGATAAAGTCTTAACATTTTGGTCAACTTTGTTTGATCTCTAAACTAGTTTGGGCTCTCTGT

TTTAAAGTTTTGTGCTTTCACTATTACACAGGTCTCATACAAGACTACAGTCTCAAGAAGCA

TAATATCGTCGACTCTGTTTTGAGTTTCTCAACAGTGGTTGAAGCTTAAGGAGGTTCTTATG

TGCGTTTTGATATC

PL 202 462 B1

SEK ID NR: 4

CAAGCTTCTTCAATTTTGCTTGCTCTCTCTCTTACACGGCCAATCGGTGTTTTCGCAGCTTT

CAGGCCTCAATACAAGACATTCTATATAAGCATATTGCAGAAGAGGCGGTTCTAATTGTTGC

ATGGAGTTGAACAATATGACGTAGGGAAATTCTAATTTAGGGGAGGCCTCAGAGTTTGCACT

AACTTCATAATCAGCTCTGGACGTTGTTGATTGTATTTGAACAAGAATGTGTAGGCAGAATT

GTCGCGCGAAATCCTCACCGGAGGAAGTGATTTCAACTGATGAGAATCTCTTGATATATTGT

AAACCTGTTCGACTATATAACATCITTCACCTTCGCTCTCTAGGCAACCCATCGTTTCTGCC

AAGATGCTTGAACTACAAAATTGGGGCAAAGCGCAAAAGAAAGTCAAGATCTACTGGGATGG

TAGTTTTCAACTATAAGGATTGTAATAATACATTACAAAGAACTGAAGTTAGGGAGGATTGT

TCTTGTCCATTTTGCTCTATGCTATGTGGTAGCTTCAAGGGGCTGCAATTTCATTTGAATTC

ATCTCATGATTTATTTGAATTTGAGTTCAAGCTTTTGGAAGAATACCAGACAGTTAATGTTT

CTGTAAAACTTAATTCCTTCATATTTGAGGAAGAAGGAAGTGATGATGATAAATTTGAGCCC

TTCTCTCTCTGCTCGAAACCTCGTAAGCGTAGACAAAGAGGTGGCAGAAATAACACCAGGAG

ACTTAAAGTATGCTTTTTACCGTTGGATTCACCCAGTTTAGCTAATGGCACAGAAAATGGAA

TTGCCCTGCTGAATGATGGAAACCGTGGTTTAGGATATCCCGAGGCAACAGAGCTTGCTGGA

CAATTTGAGATGACTAGCAACATTCCACCAGCCATAGCCCACTCTTCTCTGGACGCTGGTGC

TAAAGTTATATTAACAACCGAAGCTGTGGTCCCTGCTACTAAGACAAGAAAGTTATCTGCTG

AGCGATCAGAGGCTAGAAGCCACCTACTTCTTCAGAAACGCCAATTCTATCATTCTCACAGA

GTCCAGCCAATGGCGCTTGAGCAAGTAATGTCTGATCGGGATAGCGAGGATGAAGTCGATGA

CGATGTTGCAGATTTTGAAGATCGCCAGATGCTTGATGACTTTGTGGATGTGAATAAAGATG

AAAAGCAATTCATGCATCTTTGGAACTCGTTTGTAAGAAAACAAAGGGTTATAGCAGATGGT

CATATCTCTTGGGCATGTGAAGTATTTTCAAGATTTTACGAGAAAGAGTTGCACTGTTACTC

ATCACTCTTCTGGTGTTGGAGATTGTTTTTGATTAAACTATGGAACCATGGACTTGTCGACT

CAGCCACCATCAACAACTGCAATACCATCCTCGAGAATTGCCGTAATACCTCAGTCACTAAC

AACAACAACAACAGTGTGGATCATCCCAGTGACTCAAACACCAACAACAATAACATTGTGGA

T C AT C C GAAT GACATAAAAAACAAGAACAATGTTGACAAC AAGGACAAT AACAGCAGAGACA

AGTAATTAAATAGGAAACACTCCGGTTTAGATGATACCGATCTATCGGATTGTAACTTATTC

TTCTTTCTTAAAAAAATTGTTTAGGAGCAAACAAAGATTTTATTTGTTAGTGTATTCAACTG

ATTACATTTTTAGTTAAAAAAATGGATTCTCCTTAATAACT

PL 202 462 B1

SEK ID NR: 5

MCRQNCRAKSSPEEVISTDENLLIYCKPVRLYNIFHLRSLGNPSFLPRCLNYKIGAKRKRKS

RSTGMVVFNYKDCNNTLQRTEVREDCSCPFCSMLCGSFKGLQFHLNSSHDLFEFEFKLLEEY

QTVNVSVKLNSFIFEEEGSDDDKFEPFSLCSKPRKRRQRGGRNNTRRLKVCFLPLDSPSLAN

GTENGIALLNDGNRGLGYPEATELAGQFEMTSNIPPAIAHSSLDAGAKVILTTEAVVPATKT

RKLSAERSEARSHLLLQKRQFYHSHRVQPMALEQVMSDRDSEDEVDDDVADFEDRQMLDDFV

DVNKDEKQFMHLWNSFVRKQRVIADGHISWACEVFSRFYEKELHCYSSLFWCWRLFLIKLWN

HGLVDSATINNCNTILENCRNTSVTNNNNNSVDHPSDSNTNNNNIVDHPNDIKNKNNVDNKD

NNSRDK

SEK ID NR: 6

AAAGAGAAGAGCTTTGACTCTCTCATTGGTCAAACCTGACTGTATTTATATGCGTTATTGTG

TGGTAAAGTTTCGACCTTTGACTTGACAAGTTGCCGTTAAGAAGAGAGATGCGTAGATCAGC

GAGTGGTTCTAGAGTTTTGGATCATTTTCCGGCGACTTCAAGGTCTCCGCCTCGATCTCAGA

GTGTTACAGCAATGGAAGATGATGTGGAGCTGCTTTTGCCTAGGTACGATCCGAATTCTCAA

GCGGGGAAGAGAGAGAAATCAAGATTCAGATTTTCAGAAAACGTCATCCATTTGATTCCTCT

CATTCTTCTTCTCTGTGTCGCAATCCTCTGGCTCTCCTCTTACTCAGGTAAGCCGAGAAATT gtttcaatctctatgaatccataattgatctgtgaaacttaattagggattttacaaagact

CATATGGATATGAGGATCGAGATGTCTCTGCAACGTTAGAATCTTGTGTTGAATTATGGTTT

CAATTTGTTCATATAATACTAAATCGGTGATGGATTTGGAATTTGTCAGCAGCGTTAAGGAG

TTGAGTTCCAAAAGCAACATGTTGTCTTGTCTCCATGGGAACTCATATTCAGTTTTGGGAAA

GGAAACAATTCTTTTACCGCCGGTGATTTTGTGCCGCAAACCATTCGTATTTGTAATTTTTG

GTTCTGTAGACACACAAAAGGATCTCTCGTTTTCATGAAATGTATGTTTAATATTTCAGTGA

TATACATCACACAACTCAAGTAGAAAACACTGATGGTTATCCATTAATCATTCTATTGGTCG

AAAAAAAGATTAGTTTCAACTTAATGCCACCTTAGGATTATATGTTCCTGTGAGTTTCAGCT

AGCCAACTCAACTAGAGTTAAACAATGGAATCAAAATACATATTCAGTAATTTATTTTAAAC

TCTGACTATTTATGTAAAACACAAATGGAAATCAAAATTGAAGGTCATGAAGATTCTATTCT

TAGTGTGAAAAGTATAGATCAATGATTCTTAATTTCTTCATCCTCCACGCATAGATCAATGG

PL 202 462 B1

TGAATATGGTTTTAAATCCTCTAATACTCACTGTACTGCCATGGTAGAGTTAAAAAAACAAT

TTTAGAAATATTAGTGGATTAAGGCATTAAGCTGTCCAAGTTGCTTGTATTTTCTTTTCATT

TTATTAATTAAAAAAAAAGTTCAACTATTTATTGACTAATAATAATACGTGTTAAATGGTTA

TCGGTTTAAAATATGGGCCATAGGCCCAGACTTGAAGAAAAACTTGAAACCCAAAGTTTTAT

TTTTACTTGTTTTCTTTCTCAGTGAATATCTCCCAATCAAGCTTCTTCAATTTTGCTTGCTC

TCTCTCTTACACGGCCAATCGGTGTTTTCGCAGCTTTCAGGTTTGTCTCAATCTCAAATTAA

ATCGGAGTCAAGTAATAACAATTGATAACCCTAATTGTTTCAATTATATTGTAAGATTTGAA

ATTTTGCAGTAGATCCGGAATCGTATTCTAGTTCTGGAATCGTTGATCTCGATGGAATTTTT

TTTAAGATTTCTTCATACACATTTGGTTCAAAAGATCACATAATTTTATTTTAATTTGATAA

GTATGATGATTCTGCTAAGTGGCATTGGATAAAGTTTTCATTTTTGCAATACGTCTAAACTT

GTCTATGTCTTGAATGAACTCTCTGAGTTGCTTAAAAAGTCTTGTGCTTTCTTTATTACACA

GGCCTCAATACAAGACATTCTATATAAGCATATTGCAGAAGAGGCGGTTCTAATTGTTGCAT

GGAGTTGAACAATATGACGTAGGGAAATTCTAATTTAGGGGAGGCCTCAGAGTTTGCACTAA

CTTCATAATCAGCTCTGGACGTTGTTGATTGTATTTGAACAAGAATGTGTAGGCAGAATTGT

CGCGCGAAATCCTCACCGGAGGAAGTGATTTCAACTGATGAGAATCTCTTGATATATTGTAA

ACCTGTTCGACTATATAACATCTTTCACCTTCGCTCTCTAGGCAACGTATGATTTGGCCTTC

CTCTCTCATCATTTTAGCTTAGTAATCTTTCATCTCCTGTGTAGATCACCCACTAATAGTTT

GAGTTTGCTAAGCTGATTATGGTCTGACTCATGGCGAGTGTGTGCTTCTTTTGTCTCCTAAT

GTTATTTGAACTTGTTGTTTGTTGTTGCAGCCATCGTTTCTGCCAAGATGCTTGAACTACAA

AATTGGGGCAAAGCGCAAAAGAAAGTATGCGTTTCTTCTTGAATGTAGTTGCCACAGTGATA

TGTTATTTATCTTACTTCTAATATGGAAGCTGATGAACTATTTATCTTTGTTGAGTAGATAT

GGACATAATGAATGGTTTCTTCTTTGTTCATGCTATACACTTATATTTTACAAAATTGTGTT

TTGCTTAGGTCAAGATCTACTGGGATGGTAGTTTTCAACTATAAGGATTGTAATAATACATT

ACAAAGAACTGAAGGTTAGTCTTTTTCTGTTCTTCGACAAAATTCGATGTCAATGTCTATGT

TTCTCTAGATGATTTGTTATTTACTATTTTTTTCTGTATTGTCACGCAGTTAGGGAGGATTG

TTCTTGTCCATTTTGCTCTATGCTATGTGGTAGCTTCAAGGTGGGCAACTATTACAACTGAG

GTTTCTTCCGGGGCCTTTCATATCTAACACTGTGAAATGCTACTGCCGTTTAATGCTATATA

CTTTCACTGTTTGGTTACATATTTTTGTGTTTGTTGTTTGTCTTCTTGCTCTTTTTAAACTG

CTGAGTGTGTGCTTATCTGAGAAAACATGTTCCAGTTCGAGCTTACAATCCATTGTCTTGTG

TCTATGCAGGGGCTGCAATTTCATTTGAATTCATCTCATGATTTATTTGAATTTGAGTTCAA

GGTATGTGGTTTTATGGAATTTCTTGTTTTGCCTATGCCGTTAGTAATGAGGTTATAGTTAA

PL 202 462 B1

AAAAGGGTCTTTCCTATTGTAGCTTTTGGAAGAATACCAGACAGTTAATGTTTCTGTAAAAC

TTAATTCCTTCATATTTGAGGTCAGTTACTTTAAACTTGGTTAATTGGGAAATCCTATAGCT

GGTGAAAATTTGGTTTATATTCCATCCTTATTTGTACTAGGAAGAAGGAAGTGATGATGATA

AATTTGAGCCCTTCTCTCTCTGGTAACTCTCAGAACCCCTTGATTAAATACCTTAATAGCAG

TAACTCCTTGCTTTTCTTGTCAGTACTTCTCTATAAATCCAACCACAATGTTTTGCAGCTCG

AAACCTCGTAAGCGTAGACAAAGAGGTGGCAGAAATAACACCAGGAGACTTAAAGTATGCTT

TTTACCGTTGGATTCACCCAGTTTAGCTAATGGCACAGAAAATGGAATTGCCCTGCTGAATG

ATGGTAAAATCACATCTTCTTCTGTGGTATTCGTTGTGGCTTAGAACTTCATTTTACAGAAG

AAGATACAATGTCCTGATTGTTTAGTTTTTGTACTTCTCCTCGCATTCTTCTTGTGAGGGTA

ATGTTACCAGAACTGATGTACAAAATTAATGGCATGCTACAGGAAACCGTGGTTTAGGATAT

CCCGAGGCAACAGAGCTTGCTGGACAATTTGAGATGACTAGCAACATTCCACCAGCCATAGC

CCACTCTTCTCTGGACGCTGGTGCTAAAGTTATATTAACAACCGAAGCTGTGGTCCCTGCTA

CTAAGACAAGAAAGTTATCTGCTGAGCGATCAGAGGCTAGAAGGTTTGTTCATCATGACACC

CCGTCATCATAATTACCATACCTGTTGTTACAAATGTTCTTCCTATTATGGATAAGTGTTTA

CTGTACTGCCATATTAACCGAGAAAATTTCTTCCAGCCACCTACTTCTTCAGAAACGCCAAT

TCTATCATTCTCACAGAGTCCAGGTGATCCAAGTTCCTTCACCTACTTCTTAGGCATTTTCT

TTAAATTGCTCATGATGATATCTTATCAAAGCATACTTGGTTTGTTCTCATCTAAATTTGTA

TTTTGATTCTGTATGTATCAACGCAAAAAAATTATGTCCATGTTGTCTCCGTTTTATTGCCA

CTAACCAAAAACTGCATGTTTCTTGTGACAAGCCAATGGCGCTTGAGCAAGTAATGTCTGAT

CGGGATAGCGAGGATGAAGTCGATGACGATGTTGCAGATTTTGAAGATCGCCAGGTATTCCA

TGATTTCTTTCTGCGTTCATTAAGTAGGCAACAGAAAATGGTATACGATGTAACTTGCTAAT

GGCTTTTGAAACTTAAAAAAGCTGCAGATGCTTGATGACTTTGTGGATGTGAATAAAGATGA

AAAGCAATTCATGCATCTTTGGAACTCGTTTGTAAGAAAACAAAGGTAACTACTTCTCTTAC

ACTTGAACACACACAAAAAGACCTTATGTCTTACATTCCATACCTGTCTAAATGATTCTGCT

TATGGAACTTTGAGCTCAAATTATGATTGATGTTTGCAGGGTTATAGCAGATGGTCATATCT

CTTGGGCATGTGAAGTATTTTCAAGATTTTACGAGAAAGAGTTGCACTGTTACTCATCACTC

TTCTGGTAATATAAGTACACCAAACATATACAGACACATAACTACACTATCAATTTTGTTTC

GTTTTTCTGAAAGAAAAATAAAAAATTCCAGGTGTTGGAGATTGTTTTTGATTAAACTATGG

AACCATGGACTTGTCGACTCAGCCACCATCAACAACTGCAATACCATCCTCGAGAATTGCCG

TAATACCTCAGTCACTAACAACAACAACAACAGTGTGGATCATCCCAGTGACTCAAACACCA

ACAACAATAACATTGTGGATCATCCGAATGACATAAAAAACAAGAACAATGTTGACAACAAG

PL 202 462 B1

GACAATAACAGCAGAGACAAGTAATTAAATAGGAAACACTCCGGTTTAGATGATACCGATCT

ATCGGATTGTAACTTATTCTTCTTTCTTAAAAAAATTGTTTAGGAGCAAACAAAGATTTTAT

TTGTTAGTGTATTCAACTGATTACATTTTTAGTTAAAAAAATGGATTCTCCTTAATAACTAA

AGACTGAAAAATAAGATAAGTTTCCTTAATTTTTCTTTTTGACTTGAGAAAAAGCTCCTCTA

GACCTCTAGTAAATAGGAGTTATATATTAATCAAGTACATAACATAAAAATATATATATTAA

GT GCAAATAGAT T GAAAACAAAT CAAGAAATTAAT TAAGACACAGTGAT TAAGC TTAAAAC C

CCATTTTGACTTGTTCTTTCTCAATGAATCCCTCACAAGCAGCAAGCTTCTTCGATTTTGCT

TTGACACCACCAATCAGTGTTTTCGAATCTTTCAGGTTTGTCTCGATTTCAAACTAGATCGG

AGTCAAGTGATAAAATTGACTAACATAATTATTCCCGTTCTCTCGTAAGAGTTGGGATTTAG

CAGTAGATCGGAAATCGGAATTTACGTTTTTGTTAAAAGATTGATGGTTTAGGTAATAAAAC

ATAGTTCTGGATTCATTGCTTCTAGTTGATTCTCGAATTGTTTGATTTCGCAATGCACATTT

TTGGTTCAAAGGATCACATAATTTGCTTTAAAATTTGACAAAACATACCATCAAATTTCTCA

TATTTCTTCAAGTAACTCGAACTTGTTGGAAATCTATATACTCTGGGCTATGTAGATAAAGT

CTTAACATTTTGGTCAACATTGTTTGTTCTCTAAACTAGTTTGGGTTCTCTGTTTTAAAGTT

TGGTGCTTTCACTATTACACAGGTCTTATACAAGACTACAGTCTCTAGAAGCATAATATCGT

CGACTCTGTTTTGAGTTTCCCAACAGTGGTTGAAGCTTAAGGAGGTTCTTATGTGCCTTTTG

AAATC

SEK ID NR: 7

CAAGCTTCTTCAATTTTGCTTGCTCTCTCTCTTACACGGCCAATCGGTGTTTTCGCAGCTTT

CAGGCCTCAATACAAGACATTCTATATAAGCATATTGCAGAAGAGGCGGTTCTAATTGTTGC

ATGGAGTTGAACAATATGACGTAGGGAAATTCTAATTTAGGGGAGGCCTCAGAGTTTGCACT

AACTTCATAATCAGCTCTGGACGTTGTTGATTGTATTTGAACAAGAATGTGTAGGCAGAATT

GTCGCGCGAAATCCTCACCGGAGGAAGTGATTTCAACTGATGAGAATCTCTTGATATATTGT

AAACCTGTTCGACTATATAACATCTTTCACCTTCGCTCTCTAGGCAACCCATCGTTTCTGCC

AAGATGCTTGAACTACAAAATTGGGGCAAAGCGCAAAAGAAAGTCAAGATCTACTGGGATGG

TAGTTTTCAACTATAAGGATTGTAATAATACATTACAAAGAACTGAAGTTAGGGAGGATTGT

TCTTGTCCATTTTGCTCTATGCTATGTGGTAGCTTCAAGGTGGGCAACTATTACAACTGAGG

GGCTGCAATTTCATTTGAATTCATCTCATGATTTATTTGAATTTGAGTTCAAGCTTTTGGAA

PL 202 462 B1

GAATACCAGACAGTTAATGTTTCTGTAAAACTTAATTCCTTCATATTTGAGGAAGAAGGAAG

TGATGATGATAAATTTGAGCCCTTCTCTCTCTGCTCGAAACCTCGTAAGCGTAGACAAAGAG

GTGGCAGAAATAACACCAGGAGACTTAAAGTATGCTTTTTACCGTTGGATTCACCCAGTTTA

GCTAATGGCACAGAAAATGGAATTGCCCTGCTGAATGATGGAAACCGTGGTTTAGGATATCC

CGAGGCAACAGAGCTTGCTGGACAATTTGAGATGACTAGCAACATTCCACCAGCCATAGCCC

ACTCTTCTCTGGACGCTGGTGCTAAAGTTATATTAACAACCGAAGCTGTGGTCCCTGCTACT

AAGACAAGAAAGTTATCTGCTGAGCGATCAGAGGCTAGAAGCCACCTACTTCTTCAGAAACG

CCAATTCTATCATTCTCACAGAGTCCAGCCAATGGCGCTTGAGCAAGTAATGTCTGATCGGG

ATAGCGAGGATGAAGTCGATGACGATGTTGCAGATTTTGAAGATCGCCAGATGCTTGATGAC

TTTGTGGATGTGAATAAAGATGAAAAGCAATTCATGCATCTTTGGAACTCGTTTGTAAGAAA

ACAAAGGGTTATAGCAGATGGTCATATCTCTTGGGCATGTGAAGTATTTTCAAGATTTTACG

AGAAAGAGTTGCACTGTTACTCATCACTCTTCTGGTGTTGGAGATTGTTTTTGATTAAACTA

TGGAACCATGGACTTGTCGACTCAGCCACCATCAACAACTGCAATACCATCCTCGAGAATTG

CCGTAATACCTCAGTCACTAACAACAACAACAACAGTGTGGATCATCCCAGTGACTCAAACA

CCAACAACAATAACATTGTGGATCATCCGAATGACATAAAAAACAAGAACAATGTTGACAAC

AAGGACAATAACAGCAGAGACAAGTAATTAAATAGGAAACACTCCGGTTTAGATGATACCGA

TCTATCGGATTGTAACTTATTCTTCTTTCTTAAAAAAATTGTTTAGGAGCAAACAAAGATTT

TATTTGTTAGTGTATTCAACTGATTACATTTTTAGTTAAAAAAATGGATTCTCCTTAATAAC

T

SEK ID NR: 8

MCRQNCRAKSSPEEVISTDENLLIYCKPVRLYNIFHLRSLGNPSFLPRCLNYKIGAKRKRKS

RSTGMVVFNYKDCNNTLQRTEVREDCSCPFCSMLCGSFKVGNYYN

SEK ID NR: 9

ACATTTTCGTACCGCTCAAGATTTAAGAAGCGTAAAAGGGTGGAAATCTCAAGTGATAAAAT

TAGGCATGTACATCCACATATTGTGGATTCAGGATCACCTGAAGATGCCCAGGCAGGATCTG

PL 202 462 B1

AAGACGATTACGTGCAGAGGGAAAATGGTAGTTCTGTAGCACACGCTTCTGTTGATCCTGCT

AATTCATTACACGGTAGCAATCTTTCAGCACCAACAGTGTTACAGTTTGGGAAGACAAGAAA

GCTGTCTGTTGAACGAGCTGATCCCAGAAATCGGCAGCTCCTACAAAAACGCCAGTTCTTTC

ATTCTCACAGGGCTCAACCAATGGCATTGGGAGCAGTTTTCTCAGATCGTGATAGTGAAGAT

GAGGTTGATGATGACATTGCTGATTTTGAAGATAGACAGATGCTTGATGATTTTGTTGATGT

TACCAAAGACGAACTTATTATGCATATGG

SEK ID NR: 10

TFSYRSRFKKRKRVEISSDKIRHVHPHIVDSGSPEDAQAGSEDDYVQRENGSSVAHASVDPA

NSLHGSNLSAPTVLQFGKTRKLSVERADPRNRQLLQKRQFFHSHRAQPMALGAVFSDRDSED

EVDDDIADFEDRQMLDDFVDVTKDELIMHM

SEK ID NR: 11

ACATGCATATCCTGATGCTGAATGTGCTCAATTGGTACCTGGGAATAATCTTGCACCTCCTG

CCATGCTACAATTTGCAAAGACAAGAAAATTATCAATTGAACGGTCTGACATGAGAAACCGT

ACACTCCTTCACAAACGACAATTTTTTCACTCACATAGAGCTCAGCCAATGGCAGCTGAGCA

AGTTATGTCAGATCGGGATAGTGAGGATGAAGTTGACGATGATGTTGCAGATTTTGAAGACC

GAAGGATGCTTGATGATTTTGTAGACGTGACTAAAGATGAGAAGCAAATGATGCACTTGTGG

AACTCATTTGTGAGG

SEK ID NR: 12

HZ\YPDAECAQLVPGNNLAPPAMLQFAKTRKLSIERSDMRNRTLLHKRQFFHSHRAQPMAA.EQ

VMSDRDSEDEVDDDVADFEDRRMLDDFVDVTKDEKQMMHLWNSFVR

PL 202 462 B1

SEK ID NR: 13

ATGGATCCGATTAAGCTGACAACAGAAGCTAAGGTCCCTGCTAAGCGATCAAAGGCTA.CAAG

CCACTACTTGCCTCTTCATAAACGCCAGTTCTATCATTCCCGAACCGGTCAGCCATTGTCAC

TTGAGCAAGTTATGTCTGACCGAGATAGCGAAAATGACGTCGACAAAAATGATGATGCTGCA

CATCTCGAAGAAAGCCAGATGCTTAATGGTTCCATGGATGAGAATGAAATCGTAGCAGAGAG

ATTCATAAAACTTTGGAACTCCTTTGTTAAACAGCAAAGGATTGTTGCAGATGCTCATATTC

CTTGGGCATGTGAAGCATTCTCAAGATTACACCTGCAAGAGCTGCGCAGTAACTTATCACTC

GACTTGTGCTGGAGACAATTCATGATCAAACAATGGGATTATGGACTTCTTGACAGAGTCAC

CATGAACAAATGCAATACCATCATCTACCATAATATCTCAACTACCAACGATGACATAAACA

ATAACAACACAAGGACGACTGATAATATGGATGTTGTCGACGATGACATAAACAGAGACAAG

SEK ID NR: 14

MDPIKLTTEAKVPAKRSKATSHYLPLHKRQFYHSRTGQPLSLEQVMSDRDSENDVDKNDDAA

HLEESQMLNGSMDENEIVAERFIKLWNSFVKQQRIVADAHIPWACEAFSRLHLQELRSNLSL

DLCWRQFMIKQWDYGLLDRVTMNKCNTIIYHNISTTNDDINNNNTRTTDNMDVVDDDINRDK

SEK ID NR: 15

CTCTGAGGAGACACTTTTTTTTTCCTCCCTCCTTCCCTCCTCTCCTCCTCCCTTCCCTTCCC

CTCTCCTCCCCTCTCTCCTCCTTCCCCCCTCGGTCCGCCGGAGCCTGCTGGGGCGAGCGGTT

GGTATTGCAGGCGCTTGCTCTCCGGGGCCGCCCGGCGGGTAGCTGGCGGGGGGAGGAGGCAG

GAACCGCGATGGCGCCTCAGAAGCACGGCGGTGGGGGAGGGGGCGGCTCGGGGCCCAGCGCG

GGGTCCGGGGGAGGCGGCTTCGGGGGTTCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGACGGCTTCGGGCGG

CAAATCCGGCGGCGGGAGCTGTGGAGGGGGTGGCAGTTACTCGGCCTCCTCCTCCTCCTCCG

CGGCGGCAGCGGCGGGGGCTGCGGTGTTACCGGTGAAGAAGCCGAAAATGGAGCACGTCCAG

GCTGACCACGAGCTTTTCCTCCAGGCCTTTGAGAAGCCAACACAGATCTATAGATTTCTTCG

AACTCGGAATCTCATAGCACCAATATTTTTGCACAGAACTCTTACTTACATGTCTCATCGAA

PL 202 462 B1

ACTCCAGAACAAACATCAAAAGGAAAACATTTAAAGTTGATGATATGTTATCAAAAGTAGAG

AAAATGAAAGGAGAGCAAGAATCTCATAGCTTGTCAGCTCATTTGCAGCTTACGTTTACTGG

TTTCTTCCACAAAAATGATAAGCCATCACCAAACTCAGAAAATGAACAAAATTCTGTTACCC

TGGAAGTCCTGCTTGTGAAAGTTTGCCACAAAAAAAGAAAGGATGTAAGTTGTCCAATAAGG

CAAGTTCCCACAGGTAAAAAGCAGGTGCCTTTGATTCCTGACCTCAATCAAACAAAACCCGG

AAATTTCCCGTCCCTTGCAGTTTCCAGTAATGAATTTGAACCTAGTAACAGCCATATGGTGA

AGTCTTACTCGTTGCTATTTAGAGTGACTCGTCCAGGAAGAAGAGAGTTTAATGGAATGATT

AATGGAGAAACCAATGAAAATATTGATGTCAATGAAGAGCTTCCAGCCAGAAGAAAACGAAA

TCGTGAGGATGGGGAAAAGACATTTGTTGCACAAATGACAGTATTTGATAAAAACAGGCGCT

TACAGCTTTTAGATGGGGAATATGAAGTAGCCATGCAGGAAATGGAAGAATGTCCAATAAGC

AAGAAAAGAGCAACATGGGAGACTATTCTTGATGGGAAGAGGCTGCCTCCATTCGAAACATT

TTCTCAGGGACCTACGTTGCAGTTCACTCTTCGTTGGACAGGAGAGACCAATGATAAATCTA

CGGCTCCTATTGCCAAACCTCTTGCCACTAGAAATTCAGAGAGTCTCCATCAGGAAAACAAG

CCTGGTTCAGTTAAACCTACTCAAACTATTGCTGTTAAAGAATCATTGACTACAGATCTACA

AACAAGAAAAGAAAAGGATACTCCAAATGAAAACCGACAAAAATTAAGAATATTTTATCAGT

TTCTCTATAACAACAATACAAGGCAACAAACTGAAGCAAGAGATGACCTGCATTGCCCTTGG

TGTACTCTGAACTGCCGCAAACTTTATAGTTTACTCAAGCATCTTAAACTCTGCCATAGCAG

ATTTATCTTCAACTATGTTTATCATCCAAAAGGTGCTAGGATAGATGTTTCTATCAATGAGT

GTTATGATGGCTCCTATGCAGGAAATCCTCAGGATATTCATCGCCAACCTGGATTTGCTTTT

AGTCGCAACGGACCAGTTAAGAGAACACCTATCACACATATTCTTGTGTGCAGGCCAAAACG

AACAAAAGCAAGCATGTCTGAATTTCTTGAATCTGAAGATGGGGAAGTAGAACAGCAAAGAA

CATATAGTAGTGGCCACAATCGTCTGTATTTCCATAGTGATACCTGCTTACCTCTCCGTCCA

CAA-GAAATGGAAGTAGATAGTGAAGATGAAAAGGATCCTGAATGGCTAAGAGAAAAAACCAT

TACACAAATTGAAGAGTTTTCTGATGTTAATGAAGGAGAGAAAGAAGTGATGAAACTCTGGA

ATCTCCATGTCATGAAGCATGGGTTTATTGCTGACAATCAAATGAATCATGCCTGTATGCTG

TTTGTAGAAAATTATGGACAGAAAATAATTAAGAAGAATTTATGTCGAAACTTCATGCTTCA

TCTAGTCAGCATGCATGACTTTAATCTTATTAGCATAATGTCAATAGATAAAGCTGTTACCA

AGCTCCGTGAAATGCAGCAAAAATTAGAAAAGGGGGAATCTGCTTCCCCTGCAAACGAAGAA

ATAACTGAAGAACAAAATGGGACAGCAAATGGATTTAGTGAAATTAACTCAAAAGAGAAAGC

TTTGGAAACAGATAGTGTCTCAGGGGTTTCAAAACAGAGCAAAAAACAAAAACTCTGAAAAG

CTCTAACCCCATGTTATGGACAAACACTGAAATTACATTTTAGGGAATTCATCCTCTAAGAA

PL 202 462 B1

TTATGTTTTTGTTTTTAATCATATGTTCCAAACAGGCACTGTTAGATGAAGTAAATGATTTC

AACAAGGATATTTGTATCAGGGTTCTACTTCACTTCATTATGCAGCATTACATGTATATCAC

TTTTATTGATGTCATTAAAACATTCTGTACTTTAAGCATGAAAAGCAATATTTCAAAGTATT

TTTAAACTCAACAAATGTCATCAAATATGTTGAATTGATCTAGAAATTATTTCATATATAAA

TCAGAATTTTTTTGCATTTATGAACGGCTGTTTTTCTACTTTGTAATTGTGAGACATTTTCT

TGGGGAGGGAAAATTGGAATGGTTCCCTTTTTTAGAAATTGAAGTGGTCTTCATATGTCAAC

TACAGAAAAGGAAAAAAATAGAAATTGAAGGATTTTTATGAAATTATATTGCATTACTATTT

GCAGTCAAACTTTGATCCTTGTTTTTGAAATCATTTGTCAATTCGGAATGAAAAATTATAAT

GTAATTTTACATTACATAAGTTCCTTTTACAATTAAAAAATAGCACTTCTTCATCTTATGCC

TGTTTGAGAAGATATTAAATTTTCACATTGTTGACAGTGAAATGCTATGTTGGTTTATAAGA

TTACAGACCATTTGTTTTCATGTGGATAATTTTAGTGCATTGCTCACCCGGTATGTTTTTTT

TTTTTAACTTGAACATTTTGCTTGTTTTGTTTTTCTTTTTTAATTAGATAATCACACGGAAA

ATTAAGCTGTTCATATCTTTAAATTAGGATTGCAAACCAAGGAAAGAACGCATTTGAGATTT

TAAGATGTCACTTATAAGGGGAGAAGTGTTCTTAAAAAGTCAACCAGAAAACTGTTATGCCT

TTTATTTGTTTGCAAGGATGTCTTTGTAATGTGTTTCATGAATAGAATATCCAATAGAGATA

AGCTGACTTGAATCATTTTGAGCAATTTTGCCCTGTGTTATATGTGTTTCACGCACATATTT

GCAGTTGGATTTTCTCCAACAGAAAGTGGATTCACTACTGGCACATTAACAAGCACCAATAG _{GTTTTTATTCCAACTCCGAGCAC}r_{rGTggTTGAGTAACATCACCTCAATTTTTTATTATCCTT}

AAAGATATTGCATTTTCATATTCTTTATTTATAAAGGATCAATGCTGCTGTAAATACAGGTA

TTTTTAATTTTAAAATTTCATTCCACCACCATCAGATGCAGTTCCCTATTTTGTTTAATGAA

GGGATATATAAGCTTTCTAATGGTGTCTTCAGAAATTTATAAAATGTAAATACTGATTTGAC

TGGTCTTTAAGATGTGTTTAACTGTGAGGCTATTTAACGAATAGTGTGGATGTGATTTGTCA

TCCAGTATTAAGTTCTTAGTCATTGATTTTTGTGTTTAAAAAAAAATAGGAAAGAGGGAAAC

TGCAGCTTTCATTACAGATTCCTTGATTGGTAAGCTCTCCAAATGATGAGTTCTAGTAAACT

CTGATTTTTGCCTCTGGATAGTAGATCTCGAGCGTTTATCTCGGGCTTTAATTTGCTAAAGC

TGTGCACATATGTAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTATTTTAGGGGAGATGTAGGTGTAGAATT

ATTGCTTATGTCATTTCTTAAGCAGTTATGCTCTTAATGCTTAAAAGAAGGCTAGCATTGTT

TGCACAAAAAGTTGGTGATTCCCACCCCAAATAGTAATAAAATTACTTCTGTTGAGTAAACT

TTTTATGTCATCGTAAAAGCTGGAAAAATCCCTTTGTTTCTATTTATAAAAAAAGTGCTTTT

CTATATGTACCCTTGATAACAGATTTTGAAGAAATCCTGTAAGATGATAAAGCATTTGAATG

GTACAGTAGATGTAAAAAAAATTCAGTTTAAAAGAACATTTGTTTTTACATTAAATGTTTAT

PL 202 462 B1

Τ Τ GAAATCAAATGATTTTGTACATAAAGTTCAATAATAT

SEK ID NR: 16

LRRHFFFPPSFPPLLLPSLPLSSPLSSFPPRSAGACWGERLVLQALALRGRPAGSWRGEEAG TAMAPQKHGGGGGGGSGPSAGSGGGGFGGSAAVAAATASGGKSGGGSCGGGGSYSASSSSSA AAAAGAAVLPVKKPKMEHVQADHELFLQAFEKPTQIYRFLRTRNLIAPIFLHRTLTYMSHRN SRTNIKRKTFKVDDMLSKVEKMKGEQESHSLSAHLQLTFTGFFHKNDKPSPNSENEQNSVTL EVLLVKVCHKKRKDVSCPIRQVPTGKKQVPLIPDLNQTKPGNFPSLAVSSNEFEPSNSHMVK SYSLLFRVTRPGRREFNGMINGETNENIDVNEELPARRKRNREDGEKTFVAQMTVFDKNRRL QLLDGEYEVAMQEMEECPISKKRATWETILDGKRLPPFETFSQGPTLQFTLRWTGETNDKST APIAKPLATRNSESLHQENKPGSVKPTQTIAVKESLTTDLQTRKEKDTPNENRQKLRIFYQF LYNNNTRQQTEARDDLHCPWCTLNCRKLYSLLKHLKLCHSRFIFNYVYHPKGARIDVSINEC YDGSYAGNPQDIHRQPGFAFSRNGPVKRTPITHILVCRPKRTKASMSEFLESEDGEVEQQRT YSSGHNRLYFHSDTCLPLRPQEMEVDSEDEKDPEWLREKTITQIEEFSDVNEGEKEVMKLWN LHVMKHGFIADNQMNHACMLFVENYGQKIIKKNLCRNFMLHLVSMHDFNLISIMSIDKAVTK

LREMQQKLEKGESASPANEEITEEQNGTANGFSEINSKEKALETDSVSGVSKQSKKQKL

Claims (43)

1. Wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2 o sekwencji, która ma co najmniej 70% sekwencji identycznej z pełnej długości sekwencją nukleotydową SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7 i która to sekwencja jest zdolna do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, przy czym właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia.

2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja jest w co najmniej 80% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7.

3. Kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że sekwencja jest w co najmniej 90% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7.

4. Kwas nukleinowy według zastrz. 3, znamienny tym, że sekwencja jest w co najmniej 95% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7.

5. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jest zdolny do redukcji wernalizacji rośliny wymaganej do kwitnienia.

6. Kwas nukleinowy według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 2.

PL 202 462 B1

7. Kwas nukleinowy według zastrz. 6, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 1.

8. Kwas nukleinowy według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 5.

9. Kwas nukleinowy według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 4.

10. Kwas nukleinowy według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 8.

11. Kwas nukleinowy według zastrz. 10, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 7.

12. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową z SEK ID NR: 3 lub SEK ID NR: 6.

13. Kwas nukleinowy według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmuje sekwencję posiadającą promotor i/lub funkcję regulacyjną.

14. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że obejmuje wariant sekwencji homologiczny do wariantu sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7, przy czym wariant sekwencji jest sekwencją VRN2 uzyskaną z rośliny innego gatunku niż Arabidopsis thaliana.

15. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że obejmuje sekwencję komplementarną do sekwencji określonej w dowolnym z zastrz. 1 do 14.

16. Para starterów z których każdy zawiera wyizolowany kwas nukleinowy mający jako sekwencję kodującą sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b, przy czym kwas nukleinowy ma długość 15 do 40 nukleotydów.

17. Para starterów z których każdy zawiera wyizolowany kwas nukleinowy używany jako sonda lub starter, mający sekwencję, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych, przy czym kwas nukleinowy ma długość 15 do 40 nukleotydów.

18. Para starterów według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że każdy izolowany kwas nukleinowy ma długość 19 do 28 nukleotydów.

19. Para starterów według dowolnego z zastrz. 16 do 18, znamienna tym, że jest wybrana z sekwencji

ATA TCC CGA GGC AAC AGA GCT TG i AAG AAT AAG TTA CAA TCC GAT AAA TCG G;

TCT ACT GGG ATG TTT CGC AGC TTT C i AAG AGT GGG CTA TGG CTG G; oraz

GCC AAT CGG TGT TTT CGC AGC TTT C i AAG AAT AAG TTA CAA TCC GAT AAA TCG G.

20. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego, znamienny tym, że wytwarza się pochodną sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7 przez dokonanie jednej lub większej liczby addycji, insercji, delecji lub substytucji w sekwencji nukleotydowej i gdzie sekwencja pochodna jest albo zdolna do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, przy czym właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia lub odpowiedź unikania cienia albo posiada promotor i/lub funkcję regulacyjną, przy czym sposób zawiera etap modyfikacji każdej z sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7.

21. Sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego zdefiniowanego w dowolnym z zastrz. 1 do 15, znamienny tym, że przeszukuje się bazę danych przy użyciu sekwencji nukleotydowej sondy lub startera, przy czym sondą lub starterem jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych albo wykorzystuje się parę starterów określonych w zastrz. 16 do 19.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że:

PL 202 462 B1 (a) dostarcza się preparat kwasu nukleinowego z komórki roślinnej, (b) dostarcza się cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest sondą, lub dostarcza się parę starterów cząstek kwasu nukleinowego odpowiednich do PCR, przy czym sondą lub co najmniej jednym ze starterów w parze starterów jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych, (c) kontaktuje się kwas nukleinowy w preparacie z sondą w warunkach odpowiednich dla hybrydyzacji lub ze starterami w warunkach odpowiednich do przeprowadzenia reakcji PCR oraz (d) identyfikuje się kwas nukleinowy określony w dowolnym z zastrz. 1 do 15, o ile jest obecny, poprzez jego hybrydyzację z sondą kwasu nukleinowego lub przeprowadza się reakcję PCR i określa się obecność lub brak zamplifikowanego produktu PCR.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się parę starterów kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 16 do 19.

24. Sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN, znamienny tym, że wykorzystuje się sondę lub starter, przy czym sondą lub starterem jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych lub wykorzystuje się parę starterów określoną w zastrz. 16 do 19.

25. Zrekombinowany wektor, znamienny tym, że obejmuje kwas nukleinowy określony w zastrz. 1 do 15.

26. Wektor według zastrz. 25, znamienny tym, że kwas nukleinowy objęty wektorem jest zdolny do regulowania jednym lub większą liczbą genów wymaganych w przejściu ze wzrostu wegetatywnego do stadium reprodukcji i/lub jest zdolny do regulowania jednym lub większą liczbą genów wymaganych w określaniu wielkości liścia i/lub kształtu.

27. Wektor według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z promotorem do transkrypcji w komórce gospodarza, przy czym promotor jest ewentualnie promotorem indukowanym.

28. Wektor według zastrz. 27, znamienny tym, że promotor jest promotorem konstytutywnym.

29. Wektor według zastrz. 25 do 26, znamienny tym, że jest wektorem roślinnym.

30. Komórka gospodarza stransformowana kwasem nukleinowym określonym w zastrz. 1 do 15, który jest kwasem heterologicznym w komórce.

31. Komórka gospodarza według zastrz. 30, znamienna tym, że jest komórką roślinną, ewentualnie obecną w roślinie.

32. Sposób transformowania komórki gospodarza, znamienny tym, że do komórki gospodarza wprowadza się wektor określony w zastrz. 25 - 29.

33. Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, znamienny tym, że do komórki gospodarza wprowadza się wektor określony w zastrz. 25 do 29 i następnie regeneruje się roślinę ze stransformowanej komórki gospodarza.

34. Roślina transgeniczna otrzymywana sposobem określonym w zastrz. 33, która jest klonem lub skrzyżowaną wsobnie lub potomstwem hybrydowym lub innym potomkiem rośliny transgenicznej, która w każdym przypadku zawiera komórkę roślinną określoną w zastrz. 31.

35. Roślina według zastrz. 34, znamienna tym, że jest rośliną rolniczą lub ogrodniczą.

36. Roślina według zastrz. 34 albo 35, znamienna tym, że jest wyselekcjonowana z roślin: ryż, kukurydza, pszenica, jęczmień, owies, żyto, rzepak z oleistymi nasionami, burak cukrowy, słonecznik, soja, sorgo, sałata, endywia, kapusta, brokuły, kalafior, goździk, pelargonia, tytoń, bawełna, rzepak, pomidor, mango, brzoskwinia, jabłko, gruszka, truskawka, banan, melon, marchew, cebula, groch, seler.

37. Roślina według zastrz. 36, znamienna tym, że jest wyselekcjonowana z roślin: tytoń, rzepak z oleistymi nasionami, ryż i pszenica.

PL 202 462 B1

38. Część lub rozmnóżka rośliny określonej w zastrz. 34 do 37 zawierająca komórkę roślinną określoną w zastrz. 31.

39. Wyizolowany polipeptyd, znamienny tym, że składa się z sekwencji z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 albo zawiera co najmniej 70% sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencją SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 5 lub SEK ID NR: 8, który to polipeptyd jest zdolny do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, przy czym właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia.

40. Polipeptyd według zastrz. 39, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową składającą się z sekwencji z SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 5 lub SEK ID NR: 8.

41. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w zastrz. 39 do 40, znamienny tym, że w odpowiedniej komórce gospodarza wywoł uje się lub umo ż liwia się wytwarzanie kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 1 do 15.

42. Sposób zaburzania właściwości fizycznych rośliny wyselekcjonowanych spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia, znamienny tym, że (i) wywołuje się lub umożliwia się w roślinie transkrypcję z kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 15 lub (ii) wywołuje się lub umożliwia się transkrypcję z kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 1 do 14.

43. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że wywołuje się lub umożliwia się transkrypcję z kwasu nukleinowego okreś lonego w zastrz. 1 do 14 i redukuje się ekspresję VRN2 poprzez kosupresję.