JP4021615B2 - 植物成長及び発達の遺伝子制御 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、植物の成長及び／又は発達の遺伝子制御並びにその中の関連する遺伝子のクローニング及び発現に関する。より詳しくは、本発明は、トリチクム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ａｅｓｔｉｖｕｍ）のＲｈｔ遺伝子、及び他の種からの相同体のクローニング及び発現、並びに該遺伝子の植物中での使用に関する。
【０００２】
開花を含む植物の成長及び発達に影響を与える遺伝子メカニズムの理解は、標的植物の特徴を変化させるための手段を供する。成長及び／又は発達特性の操作が有利であり得る種には、全ての作物があり、重要な例は穀類、おそらく温暖な気候帯において最も農業経済的に重要である、コメ及びトウモロコシ、並びにより温帯性の気候における、コムギ、オオムギ、オート及びライ麦である。種子製品のための重要な作物は、脂肪種子なたね及びカノーラ、トウモロコシ、ひまわり、ダイズ及びモロコシ類である。それらの根のために収集される多くの作物は、もちろん種子から毎年、成長され、いずれの種の種子の生産も、植物が開花し、授粉し、そして種子をつける能力に極めて依存する。園芸において、開花を含む成長及び発達の時期の制御は重要である。開花を制御できる園芸植物には、レタス、エンダイブ及びアブラナ属植物、例えばキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワー、並びにカーネーション及びゼラニウムがある。一方で矮性植物及び他方で過剰に大きく丈の高い植物が、樹木、プランテーション作物及び稲科植物を更に含めて、種々の園芸及び農業関係において有利であり得、及び／又は要求さ得る。
【０００３】
ここ数１０年で、半矮性Ｒｈｔホメオアレルの育種プログラムへの組込みのよりコムギ収率が非常に増加している。これらの増加は、コムギ生産性を世界人口の上昇の要求と歩調をそろえることを可能にしている。以前、我々は、アラビドプシス・ガイ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇａｉ）対立遺伝子のクローニングを記述した（１９９７年２月１２日に出願され、１９９８年８月１４日にＷＯ９７／２９１２３として公開されたＰＣＴ／ＧＢ９７／００３９０、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、この全ての内容は引用により本明細書に組み込まれる）。それは、コムギ（単子葉植物）におけるＲｈｔ変異体対立遺伝子と同様、アラビドプシス（双子葉植物）における半優性矮性表現型及び植物成長ホルモンジベレリン（ＧＡ）に対する応答性の減少を与える。ｇａｉは、野生型（ＧＡＩ）タンパク質のＮ末端近くに見い出される１７アミノ酸残基を欠如する変異体タンパク質（ｇａｉ）をコードする。このセグメントの配列はコメｃＤＮＡ配列（ＥＳＴ）中で高度に保存されている。ここで、我々はこのｃＤＮＡがＲｈｔ座を含むことが知られている重複する穀類のゲノムマップの短いセクションにマッピングされること、及び我々がそのｃＤＮＡを用いてコムギのＲｈｔ遺伝子を単離したことを示す。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）及びトリチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）のものとして広範囲に分岐したこのゲノムは、変異させた時にＧＡ応答性に作用し、植物界を通して保存されているＧＡシグナル伝達において配列のための役割を示す保存された配列を有するはずである。更に、Ｒｈｔのクローニングは、以前にコムギで得られたものと同様に大きい収率増強の目的で、多くの異なる作物種への転移を許容する。
【０００４】
半矮性Ｒｈｔホメオアレル（日本の品種Ｎｏｒｉｎ１０から得られるＮｏｒｉｎ１０遺伝子として元来、知られている）の、純血コムギ育種系への導入はいわゆる“グリーン・レボルーション”への最も大きな寄与の１つであった（Galeら、1985, Dwarfing genes in wheat : Progress in Plant Breeding, G.E. Russell (ed) Butterworths, London pp 1-35) 。これらのホメオアレルを含むコムギは、一貫してそれらを欠如するコムギをより多く生産し、現在、世界のコムギ作物の約８０％を含む。この収率増強の生物学的基礎は２重であるようである。第１に、Ｒｈｔ対立遺伝子により供される半矮性表現型は倒伏（風／両による植物の平担化、結果として収率を減少させる）に対する耐性を増加させる。第２に、これらの対立遺伝子は、光吸収の再配分を引きおこし、これは穀粒に対して多く、幹に対して少くなる（Galeら、1985）。これらの特性は、コムギ収率に大きな効果を有し、これは、Ｒｈｔ含有系が農業者により収穫される年の間、２０％超、ＵＫコムギ収率が増加したという事実により証明される。
【０００５】
ｒｈｔ変異体は、ジベレリン（ＧＡ、内因性植物成長レギュレーター）に対するそれらの応答を害する遺伝的に優性の変異体ｒｈｔ対立遺伝子を含むので、矮小になっている（Galeら、1976, Heredity 37 ; 283-289)。これにより、ｒｈｔ変異体の子葉鞘は、野生型コムギ植物のものと異なり、ＧＡ適用に対して応答しない。更に、ｒｈｔ変異体は野生型対照において見い出されるより高いレベルまで、生物学的に活性なＧＡを蓄積する（Lentonら、1987）、Gibberellin insensitivity and depletion in wheat - consequences for development : Hormone action in Plant Development - a critical appraisal. GV Haod, JR Lenton, MB Jackson and RK Atkin (eds) Butterworths, London pp 145-160)。これらの特性（遺伝子優性、ＧＡ応答性の減少、及び高い内因性ＧＡレベル）は他の種における変異により与えられる表現型に共通しており（トウモロコシのＤ８／Ｄ９；アラビドプシスのｇａｉ）、このことは、これらの変異体対立遺伝子はこれらの異なる種においてオルソロガス遺伝子を規定していることを示し、これは、Ｄ８／Ｄ９及びＲｈｔがトウモロコシ及びコムギのゲノム内でシンテニーの座であるという観察結果により更に支持される。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、Ｒｈｔ機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。用語“Ｒｈｔ機能”は、トリチクムのＲｈｔ遺伝子と同様に植物の表現型に作用する能力を示す。“Ｒｈｔ機能”は、植物成長の阻害、サプレッション、リプレッション又は削減として植物内で表現型として観察することができ、ここでその阻害、サプレッション、リプレッション又は削減はＧＡにより拮抗される。Ｒｈｔ発現はＧＡにより拮抗される植物上の矮性表現型を与える傾向がある。
【０００７】
Ｒｈｔ機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からの植物の過剰発現は、ＧＡでの処置により癒され得る植物に矮性表現型を与えるのに用いることができる。
また、本発明の一態様によれば、発現に基づいてｒｈｔ変異体表現型を与える能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。ｒｈｔ変異体植物は野生型と比べて矮小しており、ここでその矮小はＧＡ不感受性である。
【０００８】
ここで“Ｒｈｔ”（大文字で始まる）は、野生型機能をいうのに用いるが、“ｒｈｔ”（大文字で始まらない）は変異体機能をいうのに用いる。
多くの植物成長及び発達課程はジベレリン（ＧＡ）として知られる四環式ジテルペノイド成長因子のファミリーの特定のメンバーにより制御される。（Hooley, Plart. Mol. Riol. 26, 1529-1555 (1994)）。ジベレリン又はＧＡは、図５に示す基本的な炭素環構造を有するジテルペノイド分子を意味し、生物活性を有する場合、我々は、生物学的に活性なジベレリンという。
【０００９】
生物活性は、穀類アリューロンα−アミラーゼ応答の細胞伸長、葉の老化又は顕在化の１又は複数の刺激により定義することができる。当該技術で利用できる多くの標準的アッセイが存在し、それらのいずれかの１又は複数における陽性結果はテストジベレリンを生物的に活性であるとして示す（Hoadら、Phytochemistry 20, 703-713 (1981) ; Serebryakov ら、Phytochemistry 23, 1843-1854 (1984) ; Smith ら、Phytochemistry 33, 17-20 (1993））。
【００１０】
当該技術で利用できるアッセイには、レタス胚軸アッセイ、キュウリ胚軸アッセイ、及びオート第１葉アッセイがあり、それら全てが、適用されるジベレリンが各々の組織の伸長を引きおこす能力に基づいて生物活性を決定する。好ましいアッセイは、テスト組成物がジベレリン欠損植物に適用されるものである。このような好ましいアッセイには、成長を決定するための矮性ＧＡ欠損アラビドプシスの処理、節間伸長が決定される矮性エンドウアッセイ、葉鞘の伸長が決定されるＴａｎ−ｇｉｎｂｏｚｕ矮性ライスアッセイ、及び葉鞘の伸長が決定されるｄ５−トウモロコシアッセイがある。エロンゲーションバイオアッセイは、各々の器官中の全般的な細胞伸長の効果を測定し、特定の細胞型に制限されない。
【００１１】
更に利用できるアッセイには、ドック（Ｒｕｍｅｘ）葉老化アッセイ及び穀類アリューロンα−アミラーゼアッセイがある。穀粒内の内乳の周囲にあるアリューロン細胞は、デンプンを消化して後に成長中の植物により用いられる糖を作り出すα−アミラーゼを発芽により分泌する。その酵素生産はＧＡにより制御される。生物学的に活性なＧＡをキシコ単離されたアリューロン細胞はα−アミラーゼを分泌し、その活性は、例えばデンプンの分解の測定によりアッセイすることができる。
【００１２】
（ＧＡ，ＧＡ3 ，ＧＡ4 及びＧＡn により示される）高い生物活性のために重要な構造的特徴はＢ−環のＣ−６上のカルボキシル基；Ｃ−１９，Ｃ−１０ラクトン；及びＣ−３におけるβ−水酸化である。Ｃ−２におけるβ−水酸化は（ＧＡ8 ，ＧＡ29，ＧＡ34及びＧＡ51により示される）不活性を引きおこす。ｒｈｔ変異体はＧＡ処理、例えばＧＡ1 ，ＧＡ3 又はＧＡ4 での処理に応答しない。
【００１３】
ＧＡでの処理は、好ましくは、水溶液を噴霧することにより、例えば水溶液中１０-4ＭのＧＡ3 又はＧＡ4 を、週ごとに又はより頻繁に、噴霧することにより行われ、また噴霧でなく植物上に液滴をたらすことにより行ってもよい。ＧＡは、有機溶媒、例えばエタノール又はアセトンに溶かして適用することができる。なぜならそれは水よりこれらにより可溶性であるからであるが、これは、これらの溶媒は植物を傷つける傾向があるので好ましくない。有機溶媒を用いるなら、適切な製剤は、８０％エタノールに溶かした２４ηｌの０．６，４．０又は３００mM ＧＡ3 又はＧＡ4 を含む。植物、例えばアラビドプシスは、ＧＡを含む培地、例えば寒天で固体化し、補給ＧＡを含む組織培養培地（ＧＭ）上で成長させることができる。
【００１４】
本発明による核酸は、トリチクムの野生型Ｒｈｔ遺伝子の配列を有しても、供される配列の突然変異体、誘導体、変異体又は対立遺伝子であってもよい。好ましい突然変異体、誘導体、変異体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的特徴、特にＧＡにより拮抗される植物成長阻害の能力、又は植物のＧＡ処理に応答する１もしくは複数の他の特徴を植物に与える能力を保持するタンパク質をコードするものである。他の好ましい突然変異体、誘導体、変異体及び対立遺伝子はｒｈｔ変異体表現型、即ち植物成長の減少であってその減少がＧＡに対して不感受性、即ちＧＡ処理によって克服されないものを与えるタンパク質をコードする。突然変異体、変異体又は誘導体を生産するための配列の変化は、コードされるポリペプチド内の１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導く、核酸内の１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の付加、挿入、欠失又は置換により行うことができる。もちろん、コードされるアミノ酸配列に差を生じない核酸の変化も含まれる。
【００１５】
Ｒｈｔ遺伝子のための好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１に示すＲＨＴアミノ酸配列をコードするもの、特に配列番号２に示すＲｈｔコーディング配列である。好ましいｒｈｔ変異体は、配列番号１に下線で示される１７アミノ酸のうちの一部もしくは全部、及び／又は配列番号１に下線で示される１７アミノ酸配列の直後にある一部もしくは配列：
【００１６】
【化１】
【００１７】
を欠如する。
更に好ましいヌクレオチド配列は、添付のいずれかの他の図に示されるアミノ酸をコードし、特に図に示すコーディング配列である。更に、本発明の更なる実施形態は、全ての態様において、配列番号５，６，７，８，９，１０又は１１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を用いる。このようなコーディング配列は、配列番号１２，１３，１４，１５，１６，１７又は１８に示されるものである。
【００１８】
本発明は、その供される配列のいずれか１つの核酸を含む核酸構成物又はベクター、好ましくはその核酸配列によりコードされるポリペプチドがそれから発現され得る構成物又はベクターも供する。その構成物又はベクターは、好ましくは植物細胞への形質転換のために適している。本発明は、このような構成物又はベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を更に含む。これにより、本発明による核酸を含む宿主細胞、例えば植物細胞が供される。その細胞内で、核酸は、染色体内に組み込むことができる。半数体ゲノム当りに１超の異種ヌクレオチド配列が存在し得る。これは、例えば、以下に議論するように、内因的なレベルと比べて、遺伝子産物の発現の増加を可能にする。
【００１９】
本発明による核酸を含む構成物又はベクターは、特にそのベクターをゲノムへの組換えのために細胞内に核酸を導入するために用いる場合、プロモーター又は他の調節配列を含む必要はない。しかしながら、一態様において、本発明は、発現の調節のための調節配列に連結された（トリチクム以外からの相同体を含む）Ｒｈｔ又はｒｈｔコーディング配列を含む核酸構成物を供する。ここでその調節配列は、そのコーディング配列に天然で融合しているもの以外のものであり、好ましくは別の遺伝子のもの又はそれから得られるものである。
【００２０】
本発明による核酸分子及びベクターは、それらの天然の環境から単離されるなら、実質的に純粋もしくは均一な形態、又は開花を含み得る、成長及び／又は発達に作用し得るポリペプチドをコードする配列以外の関心の種もしくは起源の核酸もしくは遺伝子、例えばＲｈｔコーディング配列以外のトリチクム・アエスチブム核酸を含まない、もしくは実質的に含まない単離物であり得る。用語“核酸単離物”には、全体的に又は部分的に合成された核酸を包含する。
【００２１】
もちろん、核酸は、適切なら、二本鎖又は一本鎖、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、全体的又は部分的に合成したものであり得る。もちろん、本発明による核酸はＲＮＡを含み、ここで示される配列の引用は、ＴのかわりにＵでおきかえて、ＲＮＡ等価物を包含するとして解釈すべきである。
本発明は、開示される核酸配列のいずれかの発現産物、及び適切な宿主細胞内で適切な条件下で、コーディング核酸からの発現により発現産物を生産する方法も包含する。当業者は、組換え遺伝子発現の産物の発現及び回収のためのベクター及びデザインプロトコルを十分に作製することができる。適切なら、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む、適切な調節配列を含む、適切なベクターを選択し又は作製することができる。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook ら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。形質転換手順は用いる宿主に依存することが、十分知られている。核酸の操作のための多くの周知の技術及びプロトコル、例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析におけるものは、Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel ら、eds, John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載される。植物で広範囲に成功して以前に用いられている特定の手順及びベクターは、Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721、並びにGuerinean 及びMullineaux (1993) Plant transformation and expression vectors : Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, Bios ScientiPic Publisher, pp 121-148に記載される。Sambrookら及びAusubel ら並びに全ての他の本明細書に言及される文献の開示は引用により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
ポリヒスチジンタグとの融合物としての発現により、ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）及びＤＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｍｙ）から利用できるＮｉ−ＮＴＡを用いて行われるＲｈｔ又はｒｈｔの精製を行うことができる。Jarknecht ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976 (1991) 並びにＥＰ−Ａ−０２５３３０３及びＥＰ−Ａ−０２８２０４２を参照のこと。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂はタンパク質のＮ−又はＣ−末端近くに連続的ヒスチジンを有するタンパク質について高いアフィニティーを有するので、植物、植物の一部もしくは抽出物から、又はそのタンパク質を発現する組換え生物、例えばイーストもしくは細菌からヒスチジン標識化Ｒｈｔ又はｒｈｔタンパク質を精製するのに用いることができる。
【００２３】
精製されたＲｈｔタンパク質、例えばコーディング核酸からの発現により組換え生産されたものを、当該技術分野で標準的である技術を用いて抗体を生じさせるために用いることができる。抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチドを、更に後述するように、他の種からの相同体を同定するのに用いることができる。
【００２４】
抗体を生産する方法には、哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル）を、タンパク質又はそのフラグメントで免疫化することを含む。抗体は、当該技術で周知である種々の技術のいずれかを用いて免疫化動物から得ることができ、好ましくは関心の抗原への抗体の結合を用いて、スクリーニングすることができよう。例えば、ウエスタンブロット技術又は免疫沈降法を用いることができる（Armitageら、1992, Nature 357 : 80-82) 。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。
【００２５】
哺乳動物を免疫化するかわりとして又は補助として、適切な結合特異性を有する抗体は、例えば表面上に、機能的なイムノグロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、発現されるイムノグロブリン可変ドメインの組換え生産されたライブラリーから得ることができる。例えばＷＯ９２／０１０４７を参照のこと。
【００２６】
Ｒｈｔ又はｒｈｔポリペプチドに対して生じた抗体は、相同なポリペプチド、及び後にそのコーディング遺伝子の同定及び／又は単離に用いることができる。これにより、本発明は、Ｒｈｔ機能又はｒｈｔ変異体表現型を与える能力を有するポリペプチドを同定し又は単離する方法であって、トリチクム・アエスチブムＲｈｔもしくはｒｈｔポリペプチドに結合することができ、又は好ましくはこのようなポリペプチド、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものについての結合特異性を有する抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチド（例えば完全な抗体又はそのフラグメント）で候補のポリペプチドをスクリーニングすることを含む方法を供する。
【００２７】
スクリーニングのための候補ポリペプチドは、例えば、関心の植物から得られる核酸を用いて作られた発現ライブラリーの産物であっても、天然のソースからの精製過程の産物であってもよい。
抗体に結合することが見い出されたポリペプチドは単離することができ、次にアミノ酸配列決定にかけることができる。全体的に又は部分的にポリペプチドを配列決定するためにいずれかの適切な技術を用いることができる（例えばポリペプチドのフラグメントを配列決定することができる）。例えば更に後述されるように、候補核酸へのハイブリダイゼーションにおいてプローブ又はプライマーとして用いるための１又は複数のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドの縮重プール）をデザインすることにより、ポリペプチドをコードする核酸を得ることにおいて、アミノ酸配列情報を用いることができる。
【００２８】
本発明の更なる態様は、トリチクム以外の植物種からのＲｈｔ相同体を同定シ、クローン化する方法であって、配列番号５７〜７７もしくは配列番号３、又は本明細書の他の図に示すいずれか由来のヌクレオチド配列を用いる方法を供する。これら由来の配列は、それら自体、他の配列を同定し、クローン化することに用いることができる。本明細書に供されるヌクレオチド配列情報又はそのいずれか一部は、相同な配列を見い出すためにデータベースサーチに用いることができ、その発現産物はＲｈｔ機能についてテストすることができる。あるいは、核酸ライブラリーは、当業者に公知の技術を用いてスクリーニングすることができ、それにより、相同な配列を同定し、次にテストすることができる。
【００２９】
例えば、本発明は、Ｒｈｔ又はｒｈｔ相同遺伝子を同定し及び／又は単離する方法であって、Ｒｈｔ機能を有するポリペプチドをコードする核酸又はそのフラグメント、変異体、誘導体もしくは対立遺伝子で候補（又は“標的”）核酸をプロービングすることを含む方法も供する。（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであり得る）候補核酸は、このような相同体をコードする核酸を含み得る又は含むと予想されるいずれかの細胞又は生物から得ることができる。
【００３０】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、候補核酸のプロービングのために用いる核酸は、コーディング配列に相補的である配列番号１に示すアミノ酸配列、又はこれらのいずれかのフラグメントをコードし、最も好ましくは配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む。
あるいは、上述の通り、プローブは、配列番号１に示すＲｈｔアミノ酸配列を有するもののようなＲｈｔ又はｒｈｔポリペプチドに結合することができる抗体の抗原結合ドメインに結合することができるものとして同定されるポリペプチドを配列決定することにより得られるアミノ酸配列情報を用いてデザインすることができる。
【００３１】
プロービングのための好ましい条件は、更に研究することができる、陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるために十分にストリンジェントであるものである。少しだけの陽性クローンが残るまで、次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術分野で公知である。
【００３２】
プロービングのかわりに、なお核酸ハイブリダイゼーションを用いるが、Ｒｈｔ遺伝子からＤＮＡ配列を増幅するようデザインしたオリゴヌクレオチドを、慣用的な手順を用いて、ＰＣＲ又は他の核酸の増幅に関連する方法に用いることができる。例えば“ＰＣＲプロトコル；A Guide to Method and Applications”, Eds, Innisら、1990, Academic Press, New Yorkを参照のこと。
【００３３】
プローブ又はＰＣＲプライマーのデザインに用いるために適した好ましいアミノ酸配列は、Ｒｈｔ遺伝子間で（完全に、実質的に又は部分的に）保存された配列である。
アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝コードの縮重、及び適切なら、候補核酸が得られる生物のコドン用法を考慮して、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーをデザインすることができる。特に、プライマー及びプローブは、例えば配列番号１，３及び／又は配列番号１，７から明らかな保存された配列に基づく情報を用いてデザインすることができる。
【００３４】
全長のコーディング核酸分子が得られていない場合、完全な分子の一部を表すより小さな分子を、全長のクローンを得るために用いることができる。挿入物は、例えば部分的なｃＤＮＡクローンから調製することができ、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。単離された全長のクローンは、ベクター、例えば発現ベクター又は植物への形質転換のために適したベクターにサブクローン化することができる。全長の配列を供するために重複したクローンを用いることができる。
【００３５】
本発明は、Ｒｈｔをコードする核酸、又は配列番号５７〜７７又は配列番号３から得られるヌクレオチド配列を用いて得ることができる相同体、並びに表１に示す配列を含む１又は複数の、例えば一対のプライマーを用いて得ることができる核酸にも広げられる。
本発明の範囲内に、トリチクムのＲｈｔによりコードされるポリペプチドの相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸配列も含まれる。相同体は、トリチクム以外の種からのものであり得る。
【００３６】
相同性はヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列レベルであり得る。好ましくは、その核酸及び／又はアミノ酸配列は配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされる配列と、好ましくは少くとも約５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％又は８５％の相同性、最も好ましくは少くとも９０％、９２％、９５％又は９７％の相同性を有する。このようなポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、トリチクムＲｈｔ遺伝子と、植物中での発現により特定の表現型、好ましくはＧＡ応答性である表現型（即ちＧＡでの処理により植物の特徴に変化がおこる）を与える能力、例えば阻害がＧＡにより拮抗される植物成長を阻害する能力を共有し得る。注意すべきは、植物中でのＲｈｔ発現は植物の１又は複数の他の特徴に作用し得る。トリチクムＲｈｔ遺伝子と共有し得る好ましい特徴は、トリチクムのような植物においてＲｈｔ又は変異体表現型を補給する能力である。ここで、このような表現型はパクロブトラゾールの矮性効果に対する耐性である。オオムギのｓｌｅｎｄｅｒ変異体はコムギゲノム内のＲｈｔのものと等価なオオムギゲノム内の位置に存在する。このような変異体植物は強力にパクロブトラゾール耐性である。本発明者らはｓｌｅｎｄｅｒオオムギ変異体は、オオムギ変異体のコムギ遺伝子での補給を許容する、コムギＲｈｔに対するオルソロガス遺伝子の又は変異体対立遺伝子である。オオムギにｓｌｅｎｄｅｒ変異体を補給する能力は、本発明の実施形態の特徴であり得る。
【００３７】
（本発明による核酸の実施形態によりコードされる）本発明によるポリペプチドの特定の好ましい実施形態には、配列番号１に下線で示される１７アミノ酸配列、又は配列番号１に下線で示される１７アミノ酸中の（位置に関して）各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約１０残基、より好ましくは１１，１２，１３，１４，１５，１６もしくは１７残基を有するアミノ酸の隣接配列、及び／又は配列：
【００３８】
【化２】
【００３９】
又は配列：
【００４０】
【化３】
【００４１】
内の（位置に関して）各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約５残基、より好ましくは６，７，８もしくは９残基を有するアミノ酸の隣接配列がある。更なる実施形態には、２７アミノ酸配列：
【００４２】
【化４】
【００４３】
又はこの配列中の（位置に関して）各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約１５残基、好ましくは１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５もしくは２６残基を有するアミノ酸の隣接配列がある。
十分に理解されるように、アミノ酸レベルでの相同性は一般に、アミノ酸類似性又は同一性に関する。類似性は、“保存性変異”、即ち１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの他のものへの置換、又は１つの極性残基の他のものへの、例えばリシンのアルギニンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、アスパラギンのグルタミンへの置換を許容する。類似性は、当該技術に標準的に用いられるAltschulら（1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10のＴＢＬＡＳＴＮプログラム、より好ましくは配列をアラインするためのNeedleman 及びWunschのアルゴリズムを用いるＧＡＰ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, USA)により規定され、決定される通りであり得る。ＧＡＰのための適切なパラメーターには、デフォルトパラメータ、ギャップ・クリエーション・ペナルティー＝１２及びギャップ・エクステンション・ペナルティー＝４、又はギャップ・クリエーション・ペナルティー＝３．００及びギャップエクステンション・ペナルティー＝０．１がある。相同性は、配列番号１のＲｈｔ配列の全長にわたってもよく、又は好ましくは配列：
【００４４】
【化５】
【００４５】
と比べて１０アミノ酸の隣接配列、及び／又は配列番号１に下線で示される１７アミノ酸と比べて１７アミノ酸の隣接配列、及び／又は配列：
【００４６】
【化６】
【００４７】
と比べて２７アミノ酸の連続配列、又は配列番号１のアミノ酸配列、好ましくは下線の１７アミノ酸及び／又は配列：
【００４８】
【化７】
【００４９】
を含む配列と比べてより長い配列、例えば約３０，４０，５０又はより多くのアミノ酸にわたってもよい。
核酸レベルにおいて、相同性は、全長にわたっても、又は好ましくは配列番号３の配列内の３０ヌクレオチドコーディング配列及び配列：
【００５０】
【化８】
【００５１】
をコードする配列及び／又は配列番号３の配列内の５１ヌクレオチドコーディング配列及び配列番号１に下線で示す１７アミノ酸配列をコードする配列、又はより長い配列、例えば約６０，７０，８０，９０，１００，１２０，１５０又はより多くのヌクレオチド、好ましくは配列番号１の下線の１７アミノ酸をコードする配列番号３の５１ヌクレオチドを含む配列によってもよい。
【００５２】
注意すべきは、類似性は、当該技術で標準的に用いられるAltschulら（1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10のＴＢＬＡＳＴＮプログラム、又はWisconsin Package, Version 8, September 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711)の一部である標準的プログラムＢｅｓｔＦｉｔにより規定され、決定される。ＢｅｓｔＦｉｔは、２つの配列間の類似性の最も優れたセグメントの最適なアラインメントを作り出す。最適なアラインメントは、Smith 及びWaterman（Adv. Appl. Math. (1981) 2 : 482-489)の局所的相同性アルゴリズムを用いて対の数を最大にするようにギャップを挿入することにより見い出される。他のアルゴリズムには、対の数を最大にし、かつギャップの数を最小にするよう２つの完全な配列をアラインするためにNeedleman 及びWunschアルゴリズムを用いるＧＡＰがある。いずれのアルゴリズムであっても、一般に、ＧＡＰギャップ・クリエーション・ペナルティー＝１２及びギャップエクステンション・ペナルティー＝４であるデフォルトパラメータが用いられる。（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（1988) PNAS USA 85 : 2444-2448 の方法を用いる）アルゴリズムＦＡＳＴＡが更にかわりとして用いられる。
【００５３】
本明細書の用語“相同性”及び“相同な”のいずれの使用も、例えば２つのヌクレオチド配列が適切な条件下で組換えるために十分に類似していることを単に要求する“相同時組換え”のような用語の標準的使用において、比較される配列間のいずれの必要な進化的な関係も包含しない。本発明による核酸によりコードされ得る本発明によるポリペプチドの更なる議論は以下に記す。
【００５４】
本発明は、ストリンジェント条件下で本明細書に開示されて特定の配列のいずれか一又は複数のものとハイブリダイズする核酸も包含する。
ハイブリダイゼーションは、核酸でプロービングし、そして（周知の技術に従って）適切なストリンジェント条件下でポジティブなハイブリダイゼーションを同定することにより決定することができる。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるのに十分にストリンジェントであるものである。少い陽性クローンだけが残るまで次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるために当該技術で公知である。
【００５５】
プローブの標的核酸（例えばＤＮＡ）への結合は、当業者の自由に種々の技術のいずれかを用いて測定することができる。例えば、プローブは、放射能で、蛍光で、又は酵素により標識することができる。プローブの標識化を用いない他の方法には、制限フラグメント長多形性の検査、ＰＣＲを用いる増幅、ＲＮＡｓｅ開裂及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングがある。
【００５６】
プロービングは、標準的なサザン・ブロット技術を用いることができる。例えば、ＤＮＡは細胞から抽出し、異なる制限酵素で消化することができる。次に、制限フラグメントは、変性前に、アガロースゲルでの電気泳動により分離し、そしてニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識化プローブは、フィルター上でＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせ、結合を決定することができる。プロービングのためのＤＮＡは、逆転写酵素−ＰＲＣのような技術により細胞からのＲＮＡ調製物から調製することができる。
【００５７】
制限酵素で消化したＤＮＡのサザンブロットに低ストリンジェンシー条件下で種々のプローブをハイブリダイズさせることにより予備実験を行うことができる。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるのに十分にストリンジェントである条件である。少しの陽性クローンだけが残るまで、次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術で公知である。適切な条件は、バックグラウンドハイブリダイゼーションが低い時に多数のハイブリダイズするフラグメントが得られる時に達成されるであろう。これらの条件を用いて、核酸ライブラリー、例えば発現される配列の代表的なｃＤＮＡライブラリーを調査することができる。当業者は、オリゴヌクレオチド長並びに塩基組成、温度等のような因子を考慮して、選択的ハイブリダイゼーションのための要求されるストリンジェンシーの適切な条件を十分に用いることができる。
【００５８】
例えば、スクリーニングは、約３７℃又はそれ超の温度、約５０％未満のホルムアミド濃度、及び中〜低の塩（例えばＳｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ（‘ＳＳＣ’）＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム；０．１５Ｍクエン酸ナトリウム；pH７）濃度を含む条件下で最初に行うことができる。
あるいは、約５０℃又はそれ超の温度及び高い塩（例えば‘ＳＳＰＥ’＝０．１８６mM塩化ナトリウム；９mMリン酸水素二ナトリウム；９mMリン酸二水素ナトリウム；１mM ＥＤＴＡナトリウム；pH７．４）で行うことができる。好ましくは、スクリーニングは約３７℃、約２０％のホルムアミド濃度、及び約５×ＳＳＣの塩濃度、又は約５０℃の温度及び約２×ＳＳＰＥの塩濃度で行われる。これらの条件により、安定なハイブリッドの同定のための完全な相同性を要求することなく、プローブ配列との実質的な相同性（類似性、同一性）を有する配列を同定することができよう。
【００５９】
適切な条件には、例えば約８０〜９０％の同一性である配列の検出のために、４２℃で一晩の、０．２５ＭのＮａ2 ＨＰＯ4 ，pH７．２，６．５％のＳＤＳ，１０％のデキストランスルフェートでのハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ中で５５℃での最後の洗浄がある。約９０％の同一性により大きい配列の検出のために、適切な条件には、６５℃で一晩の、０．２５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，pH７．２，６．５％のＳＤＳ，１０％のデキストランスルフェート中でのハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ中で６０℃での最後の洗浄がある。
【００６０】
Ｒｈｔ遺伝子と他のものからの相同体とを区別するために用いることができる条件は、以下の手順を含み得る。
第１及び第２のＤＮＡ分子をアガロースゲル上に走らせ、メンブランフィルターにブロットする（Sambrookら、1989）。そのフィルターを、一定に振とうしながら、５時間、６５℃で、プレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％ ＳＤＳ，２mM ＥＤＴＡ，２０μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）中でインキュベートする。次に、その溶液を放射能標識化第２ＤＮＡを含む３０mlの溶液に置換し（標準的技術に従って調製したもの；Sambrookら、1999を参照のこと）、一定に振とうしながら６５℃で一晩、インキュベートする。次の朝に、フィルターをそそぎ（３×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ溶液で１回、そそぐ）、次に洗う：６５℃で２５分、３×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ溶液での第１の洗浄；及び同じ時間、同じ温度で０．１×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳでの第２の洗浄。次に、そのフィルター上の放射線パターンを標準的な技術を用いて記録する（Sambrookら、1989を参照のこと）。
【００６１】
必要なら、ストリンジェンシーは、洗浄の温度を増加させ、及び／又はＳＳＣｉｎｉ洗浄液を減少させ又は全く省略することにより増加させることができる。 （ＳＳＣは、１５０mM ＮａＣｌ，１５mMクエン酸ナトリウムである。５０×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液は１％（ｗ／ｖ）ｆｉｃｏｌｌ，１％ポリビニルピロリドン、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンである）。
【００６２】
ｒｈｔ変異体に対する相同性も本発明によって供される。これらは、野生型が、配列番号１に下線で示す１７アミノ酸、又は配列番号１に下線で示す１７アミノ酸中の対応する残基と類似性又は同一性を有する少くとも約１０（より好ましくは１１，１２，１３，１４，１５，１６又は１７）アミノ酸を有する１７アミノ酸の隣接アミノ酸を含むが、変異体はそうでない場合、変異体であり得る。同様に、野生型が、配列：
【００６３】
【化９】
【００６４】
又は配列：
【００６５】
【化１０】
【００６６】
中の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約５（より好ましくは６，７，８又は９）アミノ酸を有する１０アミノ酸の隣接配列を含むが変異体はそうでない場合であり得る。このような変異体ポリペプチドをコードする核酸は、植物内での発現に基づいて、（ＧＡの供給又は涸渇に基づき植物中でいくらかの応答があり得るが）ＧＡでの植物の処理に基づき克服されない又は野生型表現型にもどらない変異体表現型である、ＧＡでの植物の処理に不感受性又は非応答性である表現型を与える。
【００６７】
本発明の更なる態様は、配列番号１に示す種トリチクム・アエスチブムのＲｈｔアミノ酸配列の突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体配列であり、又は他の種の相同体もしくはその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、もしくは変異体であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物を供する。ここでその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、変異体又は相同体は１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、付加及び／又は置換により配列番号１に示すアミノ酸と異なる。それらは、パクロブトラゾールの矮小効果に対して耐性であるＲｈｔ又は変異体表現型を有する植物をテスト核酸で形質転換することによりトランスジェニック植物を生産し、そのトランスジェニック植物内でテスト核酸から発現を引きおこし又は許容し、そのトランスジェニック植物をＲｈｔ又は変異体表現型の補給を示すものについてスクリーニングしてＲｈｔ又は変異体を補給することができるテスト核酸を同定し、そのＲｈｔ又は変異体を補給することができるとして同定された核酸から、配列番号１に下線で示す１７アミノ酸又は配列番号１に下線で示す１７アミノ酸中の対応する位置内の各々のアミノ酸と類似性又は同一性を有する少くとも１０残基、より好ましくは１１，１２，１３，１４，１５，１６又は１７残基を有する隣接１７アミノ酸をコードするヌクレオチド配列、及び／又は配列：
【００６８】
【化１１】
【００６９】
をコードするヌクレオチド配列又は配列：
【００７０】
【化１２】
【００７１】
中の対応する残基と類似性又は同一性を有する少くとも約５（より好ましくは６，７，８又は９）残基を有する１０アミノ酸の隣接配列を削除することにより得ることができる。
本発明の核酸を含む細胞、特に植物細胞又は細菌細胞は本発明の更なる態様を形成する。
【００７２】
その細胞は、核酸の細胞又はその祖先への導入により、例えば当業者に利用できるいずれかの適切な技術を用いる形質転換により、タンパク質をコードする核酸を含み得る。
本発明によれば、ゲノム内に組み込まれた開示される核酸を有する植物細胞も供する。
【００７３】
完全な天然の配列を用いる場合、その植物細胞はその配列の天然の宿主以外の植物のものであり得る。
本発明は、このような植物細胞を含む植物も供する。
本発明によれば、発現の制御のための調節配列の作用的制御下で、本発明により供されるヌクレオチドの配列をそのゲノム内に組み込んだ植物細胞も供する。
【００７４】
本発明の更なる態様は、このような植物細胞を生産する方法であって、ヌクレオチドの配列を含むベクターを植物細胞に導入し、そしてそのベクターと植物細胞との間の組換えを引きおこし又は許容してヌクレオチドの配列をゲノム内に導入することに関する方法も供する。
本発明による植物は、１又は複数の特性において本気に受粉しないものであり得る。植物品種、特に植物育種者の権利による登録可能な植物品種は排除される。植物は“植物品種”であると考える必要はないことに注意のこと。なぜならそれは、植物又はその祖先の細胞内に導入されたトランスジーンをゲノム内に安定に含むだけだからである。
【００７５】
植物に加えて、本発明は、このような植物のいずれかのクローン、種子、自家又はハイブリッド子孫及び後継、並びにこれらのいずれかのいずれか一部、例えば挿穂（ｃｕｔｔｉｎｇ）、種子を供する。本発明は挿穂、種子等を含む、有性又は無性的な再生又は繁殖に用いることができるいずれか一部であるいずれかの植物零余子を供する。このような植物の有性的又は無性的に繁殖された子孫、クローンもしくは後継、又はその植物、子孫、クローンもしくは後継のいずれか一部もしくは零余子も本発明に含まれる。
【００７６】
本発明は更に、植物の細胞内での異種Ｒｈｔ又はｒｈｔ遺伝子配列（又は議論されるようなその突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは相同性）の発現を含む、植物の特徴に影響を与える方法を供する。用語“異種”は、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列が、遺伝子工学を用いて、即ち形質転換を含み得るヒトの介入により、前記植物の細胞又はその祖先に導入されていることを示す。その遺伝子は、ゲノム外ベクター上にあっても、ゲノム内に好ましくは安定に組み込まれてもよい。異種遺伝子は、内因性の等価な遺伝子、即ち成長及び／又は発達の制御下で同じ又は類似する機能を通常、行うものであってもよく、又はその挿入された配列は、内因性遺伝子に加えてもよい。異種遺伝子の導入の利点は、遺伝発現、並びにそれにより優性に従った植物の成長及び／又は発達に影響を与えることができるために、選択されたプロモーターの制御下に遺伝子の発現をおく能力である。更に、野生型遺伝子の突然変異体及び誘導体は、内因性遺伝子のかわりに用いることができる。挿入された遺伝子は宿主細胞に対して外のもの又は外来性、例えば別の植物種のものであってもよい。
【００７７】
本発明を用いて変化させることができる原則的特徴は成長である。
成長レプレッサーとしてのＲｈｔ遺伝子のモデルによれば、遺伝子の下降制御は、少くとも（例えば補うであろう内因性相同体を有するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）でない）Ｒｈｔ機能を与える唯一の内因性遺伝子を有する植物において、成長を促進するために用いることができる。これは、アンチセンス又はセンス制御の使用に関連し得る。丈の高い植物は、関心の植物中のＲｈｔ又は関連する相同体をバックアウトすることにより作ることができる。例えば雑草を矮小に維持するためのＧＡ生合成インヒビターの使用を許容するが作物を高く成長させるため、パクロブトラゾールのようなＧＡ生合成を阻害する化合物に対して耐性である植物を作ることができる。
【００７８】
Ｒｈｔ遺伝子の過剰発現は、Ｒｈｔ抑制モデルにより予想されるように、ＧＡでの処理により補うことができる矮性植物を導き得る。
ｒｈｔ変異体遺伝子は表現型において優先であるので、それらは、ＧＡ不感受性矮性植物を作るために用いることができる。これは、例えばいずれかの形質転換可能な作物、樹木又は果樹種に適用することができる。それは、Ｒｈｔコムギのようなより高収率／少い倒伏を供し得る。コメにおいて、これは、日本及び他所で問題となっているＢａｋａｎｅ病に対するＧＡ不感受性のコメを供することができる。矮性装飾植物は、園芸及び切り花市場のために価値あるものであり得る。配列操作は、種々の程度の激しさの矮小、ＧＡ不感受性表現型を供し得、各々の作物の必要性又は操作者の希望に対して激しさの程度を調節を許容する。ｒｈｔ変異体配列の過剰発現は潜在的に最も有用である。
【００７９】
変化させることができる第２の特徴は植物発達、例えば開花である。特定の植物において、及び特定の環境条件において、ＧＡシグナルは開花誘導のために必要とされる。例えば、短日条件下で成長させたＧＡ欠損変異体アラビドプシス植物はＧＡで処理しなければ開花しないであろう：これらの植物は、長日条件下で成長する時に正常に開花する。アラビドプシス・ガイ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇａｉ）変異体植物は、短日条件下で開花の遅れを示す：激しい変異体は全く開花することができない。これにより、例えばＲｈｔ又はｒｈｔ遺伝子発現又は過剰発現により、開花を誘導するための所定のＧＡ処理まで生長を保持する植物を生産することができる。これは、園芸の分野において又は抽苔の抑制が要求されるホウレンソウ、レタス及び他の作物のために役立つ。
【００８０】
本発明による核酸は、使用者の制御下にＲｈｔ又はｒｈｔコーディング配列をおくために外から誘導できる遺伝子プロモーターの制御下におくことができる。 プロモーターに適用される用語“誘導可能（誘導性）”は、当業者に十分に理解される。本質において、誘導性プロモーターの制御下の発現は、“スイッチ・オン”され、又は適用された刺激に応答して増加する。それら刺激の性質はプロモーター間で多様である。特定の誘導性プロモーターは適切な刺激の欠如下で極めて少い又は検出できないレベルの発現を引きおこす（又は発現しない）。他の誘導性プロモーターは、刺激の欠如下で検出可能な構成物発現を引きおこす。発現のレベルが刺激の欠如下にあっても、正常な刺激の存在下でいずれの誘導性プロモーターからの発現も増加する。好ましい刺激は発現のレベルが表現型の特徴を変えるために有効な量による関連する刺激の適用に基づいて増加する場合である。これにより、レベルが低すぎて要求される表現型をもたらさない（実質的にゼロであり得る）刺激の欠如下で発現の基底レベルを引きおこす誘導性（又は“スイッチ可能な”）プロモーターを用いることができる。刺激の適用に基づいて、要求される表現型をもたらすレベルに発現は増加される（又はスイッチ・オンにされる）。
【００８１】
適切なプロモーターには、本質的に全ての植物組織において高レベルで発現されるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）遺伝子プロモーター（Benfeyら、1990ａ及び1990ｂ）；外来性のセーフナーの適用に応答して活性化されるトウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ異型II（ＧＳＴ−II−２７）遺伝子プロモーター（ＷＯ９３／０１２９４，ＩＣＩ Ｌｔｄ）；植物の頂端分裂組織及び植物体内のいくつかの十分に局在化した位置、例えば内生師部、花の原基、根及び苗条内の分岐点で発現されるカリフラワーｍｅｒｉ５プロモーター（Medford, 1992 ; Medford ら、1991) 並びに花の発達において極めて初期に発現されるアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＬＥＡＦＹプロモーター（Weigelら、1992）がある。
【００８２】
ＧＳＴ−II−２７遺伝子プロモーターは、成長中の植物に適用することができる特定の化学的化合物により誘導されることが示されている。プロモーターは、単子葉及び双子葉植物の両方で機能的である。それゆえ、それは、畑の作物、例えばカノーラ、ひまわり、タバコ、シュガービート、綿；穀類、例えばコムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、モロコシ類；果樹、例えばタバコ、マンゴー、モモ、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、バナナ、及びメロン；及び野菜、例えばニンジン、レタス、キャベツ及びオニオンを含む。遺伝的に改変された種々の植物内で遺伝子発現を制御するために用いることができる。ＧＳＴ−II−２７プロモーターは、根、葉、幹及び再生した組織を含む、種々の組織に用いるためにも適している。
【００８３】
従って、本発明は、更なる態様において、本発明により供されるヌクレオチド配列、例えばトリチクムのＲｈｔ遺伝子、他の植物種からの相同体又はそのいずれかの変異体、誘導体もしくは対立遺伝子に作用可能に連結された誘導性プロモーターを含む遺伝子構成物を供する。これは、遺伝子の発現の制御を可能にする。本発明は、前記遺伝子構成物で形質転換された植物、並びにこのような構成物の植物細胞への導入及び／又は適切な刺激、有効な外来インデューサーの適用による植物細胞内での構成物の発現の誘導を含む方法も供する。プロモーターは、ＧＳＴ−II−２７遺伝子プロモーター又はいずれかの他の誘導性植物プロモーターであり得る。
【００８４】
選択された遺伝子構成物を細胞に導入する場合、特定の考慮がされなければならず、これは当業者に公知である。挿入すべき核酸は、転写を駆動するであろう有効な調節因子を含む構成物内でアセンブルされるべきである。その構成物を細胞に輸送する方法が利用できなければならない。構成物が細胞膜内にあるなら、内因性染色体材料への組込みは行っても行わなくてもよい。最後に、植物を考慮する限り、標的細胞型は、細胞が完全な植物に再生され得るようでなければならない。
【００８５】
抗生物質、例えばカナマイシン、ヒグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゼンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリホセートに対する耐性のような選択的表現型を与えるキメラ遺伝子からなる選択遺伝子マーカーを用いることができる。
本発明の一態様は、トランスジェニック植物の生産における本発明による核酸の使用である。
【００８６】
更なる態様は、核酸を植物細胞に導入し、そしてその核酸の細胞のゲノム内への組込みを引きおこし又は許容することを含む方法を供する。
植物形質転換のいずれかの適切な方法を用いて本発明に従って、核酸を含む植物細胞を作り出すことができる。形質転換の後、植物は形質転換された植物細胞及び組織から再生することができる。
【００８７】
上手く形質転換された細胞及び／又は植物、即ちそれらのゲノム内に組み込まれた構成物で形質転換されたものは、核酸の植物細胞への導入の後、任意に植物への再生の後、例えば１又は複数のマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性を用いて（上述）、選択することができる。
その配列を含むＤＮＡセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝子操作のために既に知られている標準的な技術によって作り出すことができる。ＤＮＡは、いずれかの適切な技術、例えばその天然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリウムにより行われるジスアームドＴｉ−プラスミド・ベクター（ＥＰ−Ａ−２７０３５５，ＥＰ−Ａ−０１１６７１８，ＮＡＲ１２（２２）８７１１−８７２１５ １９８４）、パーティクル又はマイクロプロジェクティルボンバードメント（ＵＳ５１００７９２，ＥＰ−Ａ−４４４８８２，ＥＰ−Ａ−４３４６１６）、マイクロインジェクション（ＷＯ９２／０９６９６，ＷＯ９４／００５８３，ＥＰ３３１０８３，ＥＰ１７５９６６，Green ら（1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press)、エレクトロポレーション（ＥＰ２９０３９５，ＷＯ８７０６６／４ Ｇｅｌｖｉｎ Ｄｅｂｅｙｓｅｒ−添付を参照のこと）、他の形態の直接的ＤＮＡ取込み（ＤＥ４００５１５２，ＷＯ９０１２０９６，ＵＳ４６８４６１１）。リポソーム媒介ＤＮＡ取込み（例えばFreeman ら、Plant Cell Physiol. 29 : 1353 (1984)) 、又はボルテキシング法（例えば Kindle, PNAS U.S.A. 87 : 1228 (1990ｄ））を用いて植物細胞に形質転換することができる。植物細胞の形質転換のための物理的方法はDard, 1991, Biotech. Adv. 9 : 1-11を参照のこと。
【００８８】
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉種を形質転換するために当業者により広く用いられている。現在、ほとんど全ての経済的に関連のある単子葉植物中での安定な繁殖力のあるトランスジェニック植物のルーチン的な生産に対する実質的な進行がある（Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074 ; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384 ; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840 ; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276 ; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740 ; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962 ; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574 ; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591 ; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255 ; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884 ; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839 ; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618 ; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505 ; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200 ; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200 ; Vasil, I.K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937 ; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084 ; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594 ; WO92/14828) 。特に、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、単子葉植物における極めて有効な形質転換法としても、現在、出現している（Hieiら（1994) The Plant Journal 6, 271-282) 。
【００８９】
繁殖できるトランスジェニック植物の生産は、穀類コメ、トウモロコシ、コムギ、オート、及びオオムギにおいて達成されている（Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162. ; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674 ; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4) : 653-671 ; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702に報告される）。
【００９０】
マイクロプロジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接的取込みは、アグロバクテリウムが無能又は無効である場合に好ましい。あるいは、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリウムコート化マイクロパーティクルでのボンバードメント（ＥＰ−Ａ−４８６２３４）又は傷を誘導するためのマイクロプロジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリウムとの同時培養を形質転換過程の効率を増強するために用いることができる。
【００９１】
ブラシカ・ナプス形質転換はMoloney ら（1989) Plant Cell Reports 8 : 238-242に記載される。
形質転換の後、植物は、例えば単細胞、カルス組織又は葉ディスクから、当該技術分野で標準であるように再生することができる。ほぼいずれの植物でも、植物の細胞、組織及び器官から完全に再生することができる。利用できる技術は、Vasil ら（Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II及びIII, Laboratory Procedure and Ther Applications, Academic Press, 1984)及びWeissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989に報告される。
【００９２】
形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換する効率並びに選択された特定の方法で本発明を実施するヒトの経験及び好みにより決定されよう。植物細胞に核酸を導入するための形質転換システムの特定の選択は本発明に本質的でなく、又は本発明を限定するものでもなく、また植物再生のための技術の選択でもないことは当業者に明らかであろう。
【００９３】
本発明において、過剰発現は、センス方向にヌクレオチド配列を導入することにより達成することができる。これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で核酸から本発明による核酸の発現を引きおこし又は許容することを含む方法を供する。
遺伝子産物ポリペプチドの下降発現は、アンチセンス技術又は“センス制御”を用いて達成することができる。アンチセンス遺伝子又は部分的遺伝子配列の遺伝子発現を下降制御するための使用は現在、十分に確立されている。ＤＮＡは、そのＤＮＡの“アンチセンス”鎖の転写が標的遺伝子の“センス”鎖から転写される通常のｍＲＮＡに相補的であるＲＮＡを作り出すように、プロモーターの制御下におかれる。二本鎖ＤＮＡのために、これは、コーディング配列又はそのフラグメントをプロモーターの制御下に“逆方向”におくことにより達成される。相補的アンチセンスＲＮＡ配列は、次に、ｍＲＮＡと結合して二本鎖を形成し、標的遺伝子からの内因性ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害すると考えられる。これが、実際の作用の態様であるか否かはまだ不確かである。しかしながら、技術は確立されている。例えば、Rothstein et al, 1987 ; Smith et al, (1988) Nature 334, 724-726 ; Zhang et al, (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188 。Antisense technology is also reviewed in reviewed in Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, and Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496を参照のこと。
【００９４】
逆方向にあるコーディング配列に対応する完全な配列は用いる必要はない。例えば、十分な長さのフラグメントを用いることができる。アンチセンス阻害のレベルを最適にするためにコーディング配列の種々の部分から種々の大きさのフラグメントをスクリーニングすることは当業者にとって慣用的な事項である。開始メチオニンＡＴＧコドン、及びおそらくその開始コドンの上流に１又は複数のヌクレオチドを含めることが有利であり得る。更なる可能性は、遺伝子の調節配列、例えば耐性が要求される１又は複数の病原体中に１又は複数の遺伝子の特徴的な配列を標的にすることである。適切なフラグメントは、少くとも約１４〜２３ヌクレオチド、例えば約１５，１６もしくは１７又はそれ超、少くとも約２５、少くとも約３０、少くとも約４０、少くとも約５０、又はそれ超のヌクレオチドを有し得る。他のフラグメントは、少くとも約３００ヌクレオチド、少くとも約４００ヌクレオチド、少くとも約５６０ヌクレオチド、少くとも約６００ヌクレオチド、少くとも約７００ヌクレオチド又はそれ超であり得る。このようなセンス方向のフラグメントは、同時抑制に用いることができる（以下を参照のこと）。
【００９５】
配列の全体の相補性は本質的ではないが、好ましい。１又は複数のヌクレオチドは標的遺伝子からアンチセンス構成物において異なり得る。特に植物細胞中に存在する条件下で、各々のアンチセンス及びセンスＲＮＡ分子がハイブリダイズするために十分な相同性があることが好ましい。
これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で本発明による核酸からのアンチセンス転写を引きおこし又は許容することを含む方法も供する。
【００９６】
標的遺伝子の更なるコピーが標的遺伝子と同じ方向であるセンス方向で挿入される場合、標的遺伝子からのタンパク質の過剰発現がおこる個体及び下降発現がおこるいくらかの個体を含む所定範囲の表現型が作られる。その挿入された遺伝子が内因性遺伝子の一部だけである場合、トランスジェニック集団中の下降発現する個体の数は増加する。センス制御、特に下降制御がおこるメカニズムは十分に理解されていない。しかしながら、この技術は、科学及び特許文献にも十分に報告され、遺伝子制御のために慣用的に用いられる。例えば、van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299 ; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289 ; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, and US-A-5,231,020も参照のこと。
【００９７】
これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で本発明による核酸からの発現を引きおこし又は許容することを含む方法も供する。これは、成長に影響を与えるために用いることができる。
本発明の態様及び実施形態は、添付の図面を引用して例により詳述されよう。更なる態様及び実施形態は当業者に明らかであろう。本明細書に言及される全ての文献は引用により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
以前に、我々は、アラビドプシスのＧＡＩ遺伝子をクローン化した（ＰＣＴ／ＧＢ９７／００３９０−ＷＯ９７／２９１９３，１９９７年８月１４日公開）。野生型（ＧＡＩ）のＤＮＡ配列と変異体（ｇａｉ）対立遺伝子との比較は、ｇａｉが、タンパク質のＮ末端近くからの１７アミノ酸のセグメントを欠如する変異体の予想されるタンパク質産物（ｇａｉ）をコードすることを示した。ＤＮＡ配列データベースのＧＡＩ配列でのスクリーニングは、ｇａｉタンパク質中のＧＡＩから削除されたセグメントのものに極めて密接に関連した配列の領域を含むコメＥＳＴ（Ｄ３９４６０）の存在を示した。領域ＤＥＬＬＡ（配列番号１０７）からＥＱＬＥ（配列番号１０８）への予想されるアミノ酸配列の比較は両方の配列で同じである。２つの差（Ｖ／Ａ；Ｅ／Ｄ）は保存性置換であり、ここで、１つのアミノ酸残基は極めて類似した化学特性を有する別のものに置換されている。更に、同一性の領域はｇａｉタンパク質内の欠失領域の境界を超えて広がっている。配列：
【００９９】
【化１３】
【０１００】
はｇａｉ中の欠失により影響を受けないが、ＧＡＩ（配列番号７８）とＤ３９４６０配列（配列番号７９）との間で完全に保存されている。
Ｄ３９４６０の約７６０bpのＳａｌＩ−ＮｏｔＩサブフラグメントを、コムギｃＤＮＡ及び（種々のＣｈｉｎｅｓｅ ＳｐｒｉｎｇからのＤＮＡから作った）ゲノムライブラリーから並び（系統Ｂ７３Ｎから作った）トウモロコシゲノムライブラリーからハイブリダイズするクローンを単離するために低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション実験に用いた。Ｃ１５−１及びＣ１５−１０（ｃＤＮＡ）、並びに５ａｌ及び１４ａｌ（ゲノムクローン）を含むいくつかのコムギクローンを単離した。クローンＣ１５−１は遺伝子マッピング実験に用いられている。零染色体−４染色体分析は、クローンＣ１５−１がコムギ染色体４Ａ，４Ｂ及び４Ｄ由来のゲノムＤＮＡフラグメントとハイブリダイズすることを示した。これは、Ｒｈｔ座がグループ４染色体にマッピングされるので、Ｒｈｔ配列を含むクローンＣ１５−１と一致する。更に、Ｒｈｔ−Ｄｌｂ（以前はＲｈｔ２）対立遺伝子について分離する集団を用いる組換え体分析は、変異体対立遺伝子との完全な同時分離を示すハイブリダイズするフラグメントを同定した。これは、グループ４染色体の（Ｒｈｔを含むことが既に知られていた）２cMセグメント内のｃＤＮＡ Ｃ１５−１中のｍＲＮＡ配列をコードする遺伝子のゲノム位置に位置し、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンが実際Ｒｈｔ遺伝子を含むという強力な証拠を供した。ここで開示されるトウモロコシＤ８ ＤＮＡ配列は１ａｌからのサブクローン化した隣接１．８kb及び３．０kb ＳａｌＩフラグメント（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM ＳＫ+ にクローン化したもの）からのものである。ここで開示されるコムギＲｈｔ配列はクローン５ａｌから（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM ＳＫ+ にクローン化した）５．７kb ＤｒａＩサブフラグメントである。
【０１０１】
配列番号５７は、ｃＤＮＡ Ｃ１５−１の完全な（シングルパス）ＤＮＡ配列を供する。我々は、Ｃ１５−１０のためのＤＮＡ配列も得て；それはＣ１５−１のものと同一であり、それゆえ示さない。配列番号５８〜７０及び配列番号７１〜７７はクローン１４ａｌ及び５ａｌからの個々の配列決定のランからのオリジナルのデータを示す。配列番号５７〜７７に示す配列は、配列番号３に示す複合ＤＮＡ配列を作るために重複させることができる。この配列は、配列番号２に示すＧＡＩのもの（ＧＡＩ）との、コムギ配列の予想される翻訳産物（Ｒｈｔ）のアミノ酸配列（配列番号１）の比較により示される通り、アラビドプシスＧＡＩのものとの強力な相同性を示す。特に、仮定上のＲｈｔの予想されるアミノ酸配列は、ｇａｉ内で失った領域中にわたってＧＡＩとの近同一性の領域を示す。図４（配列番号１，２，２０）は、コメＥＳＴ内のｇａｉ削除領域を超えて広がる相同性がＲｈｔ（
【０１０２】
【化１４】
【０１０３】
）内でも保存されていることを示し、これにより、この領域は、ｇａｉ欠失において見い出されるものに加えて、ＧＡシグナル伝達に関連することを示す。この領域は、ＧＡＩに配列において関連するがＧＡシグナル伝達には関連しない他のタンパク質であるＳＣＲにおいて見い出されない。上述の配列決定実験に用いたプライマーを表１に示す（配列番号２１〜５５）。
【０１０４】
これらの配列が実際にコムギＲｈｔ及びトウモロコシＤ８座であることの更なる確認は、以下の通り、種々の変異体対立遺伝子からの遺伝子配列の分析により得られている。
本発明者らは、そのクローンを得て配列決定し、コメＥＳＴ Ｄ３９４６０としてデータベースに基づいて同定した。この研究から生じた予想されるアミノ酸配列を各々配列番号１２及び配列番号５に示す。
【０１０５】
アラビドプシスのＧＡＩ遺伝子に基づく以前の研究は、ＧＡＩタンパク質が２つのセクション、周知の機能のいずれかのタンパク質とも相同性を示さないＮ末端半分、及びアラビドプシスＳＣＲ候補転写因子（Pengら、(1997) Genes and Development 11 : 3194-3205 : PCT/GB97/00390) と広範囲の相同性を示すＣ末端半分からなることを示した。上述の通り、タンパク質のＮ末端半分の一部分の欠如はｇａｉ変異体対立遺伝子のＧＡ応答特性を減少させる（Pengら、1997 ; PCT/GB97/00390)。それゆえ、本発明者らは、Ｄ８及びＲｈｔが各々アラビドプシスＧＡＩのトウモロコシ及びコムギ機能的相同体（オルソロガス）であるなら、Ｄ８及びＲｈｔの優性変異体対立遺伝子は、それらがコードするタンパク質のＮ末端セクションに作用する変異も引きおこすはずである。
【０１０６】
先の報告は、いくつかのＤ８において及びＲｈｔにおいて優性な変異体対立遺伝子、特にＤ８−１，Ｄ８−２０２３及びＲｈｔ−Ｄｌｃ（以前はＲｈｔ１０）を記述する（Boerner ら、(1996) Euphytica 89 : 69-75 ; Harberd and Freeling (1989) Genetics 121 : 827-838 ; Winkler及びFreeling (1994) Planta 193 : 341-348) 。それゆえ、本発明者らは、これらの変異体から候補Ｄ８／Ｒｈｔ遺伝子をクローン化し、そのタンパク質のＮ末端半分をコードする遺伝子の部分をＤＮＡ配列決定することにより検査した。
【０１０７】
Ｄ８／Ｒｈｔタンパク質のＮ末端半分の一部をコードする候補Ｄ８又はＲｈｔ遺伝子のフラグメントを、Ｄ８−１，Ｄ８−２０２３及びＲｈｔ−Ｄｌｃを含む植物のゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより、増幅のための次のプライマーを用いて増幅した：Ｄ８−１のためにプライマーＺＭ−１５及びＺＭ−２４；Ｄ８−２０２３のためにプライマーＺＭ−９及びＺＭ−１１；Ｒｈｔ−Ｄｌｃのために、ネスティドＰＣＲを、Ｒｈｔ−１５及びＲｈｔ−２６、次にＲｈｔ−１６及びＲｈｔ−２を用いて行った。ＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｇｅｎｃＡｍｐ ＸＬ ＰＣＲキットを用いて、以下の条件を用いて行った：反応を９４℃で１分、インキュベートし、次に９４℃，１５秒−Ｘ℃，１５秒−６９℃，５分の１３サイクル（ここで、Ｘは６４℃で始めてサイクル当り１℃減少させ５２℃で終える）、次に９４℃，１５秒−５３℃，１５秒−６５℃，５分の２５サイクル、次に７０℃で１０分でインキュベートした。これらのフラグメントを、次にｐＧＥＭR −Ｔ Ｅａｓｙベクター（Promega, Technical Manual を参照のこと）にクローン化し、それらのＤＮＡ配列を決定した。
【０１０８】
上述の変異体の各々において候補Ｄ８及びＲｈｔ遺伝子中で変異を見い出した。Ｄ８−１変異はアミノ酸ＶＡＱＫ（５５−５９）（配列番号１０１）を除去し、Ｇを加える枠内欠失である（配列番号１６及び配列番号９の配列を参照のこと）。この欠失は上述の保存された
【０１０９】
【化１５】
【０１１０】
相同性ブロックと重複する。Ｄ８−２０２３はＤ８タンパク質のＮ末端からアミノ酸
【０１１１】
【化１６】
【０１１２】
を除去する別の枠内欠失変異である（配列番号１７及び配列番号１０を参照のこと）。この欠失は、ｇａｉ又はＤ８−１内の欠失と重複しないが、ＧＡＩ，Ｄ８及びＲｈｔ間で高度に保存された別の領域をカバーする（配列番号２，５，７を参照のこと）。最後に、Ｒｈｔ−Ｄｌｃは、それがコードする変異体Ｒｈｔタンパク質のＮ末端領域内のアミノ酸
【０１１３】
【化１７】
【０１１４】
を除去する別の小さな枠内欠失を含む（配列番号１８及び配列番号１１を参照のこと）（ＬＮ−ＰはＧＡＩ，Ｄ８及びＲｈｔ間で保存されている。配列番号２，５，７を参照のこと）。
これにより、上述の変異体対立遺伝子の全ては優性であり、ＧＡ応答性の減少に関連した矮性を与える。全部で３つのこれらの対立遺伝子は、それらがコードするタンパク質のＮ末端半分の一部分を除去する欠失変異を含む。これらの観察結果は、トウモロコシ及びコムギのＤ８及びＲｈｔ遺伝子がクローン化されていることを示す。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｆｉｇｕｒｅ１：白抜きで示す相同性の領域を伴う、コメＥＳＴ Ｄ３９４６０（Ｏ８３０）（配列番号７９）とのＮ末端の予想されるＧＡＩアミノ酸配列（Ｇａｉ）（配列番号７８）のアラインメント。
【図２】 Ｆｉｇｕｒｅ２：Ｃ１５−１，１４ａｌ及び５ａｌからのＤＮＡ配列。
Ｆｉｇｕｒｅ２ａは、保存性ＤＮＡ配列ｃＤＮＡ Ｃ１５−１（シングル・パス配列決定により得たもの）（配列番号５７）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ２ｂは、１４ａｌからのもとのＤＮＡ配列決定ランからのデータを示す（シングルパス）（配列番号５８〜７０）。
Ｆｉｇｕｒｅ２ｃは、５ａｌからのもとのＤＮＡ配列決定ランからのデータを示す（シングルパス）（配列番号７１〜７７）。
【図３】 Ｆｉｇｕｒｅ３：Ｒｈｔ配列。
Ｆｉｇｕｒｅ３ａは、コーディング配列を含む、図２におけるデータ由来のコムギＲｈｔ遺伝子の複合ＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。
Ｆｉｇｕｒｅ３ｂは、アラビドプシスの全体の予想されるＧＡＩタンパク質配列（Ｇａｉ）（配列番号２）との、図２のコーディング配列によりコードされる全体の予想されるＲｈｔタンパク質配列（ｒｈｔ）（配列番号１）のアラインメントを示す。配列同一性の領域を白抜きで示す。
【図４】 Ｆｉｇｕｒｅ４：Ｄ３９４６０配列。
Ｆｉｇｕｒｅ４ａは、コメｃＤＮＡ Ｄ３９４６０のＤＮＡ配列（シングルパス）（配列番号１９）を示す。このｃＤＮＡは、それが得られるｍＲＮＡの３′末端を失っている不完全な部分的クローンである。
Ｆｉｇｕｒｅ４ｂは、全体の予想されるＲｈｔタンパク質（コムギ−図２のコーディング配列によりコードされる）（配列番号１）の、ＧＡＩのもの（Ｇａｉ）（配列番号２）及び図４ａのＤＮＡ配列から予想されるコメタンパク質配列（配列番号２０）とのアラインメントを示す。アミノ酸同一性の領域を白抜きで示し；いくつかの保存性置換を陰で示す。
【図５】 Ｆｉｇｕｒｅ５：ジベレリンの基本的炭素環構造。
【図６】 Ｆｉｇｕｒｅ６：コメＥＳＴ配列。
Ｆｉｇｕｒｅ６ａは、本発明により決定した。コメＥＳＴ Ｄ３９４６０のヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ６ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ６ａのコメＥＳＴ配列によりコードされる予想されるアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図７】 Ｆｉｇｕｒｅ７：コムギＣ１５−１ｃＤＮＡ。
Ｆｉｇｕｒｅ７ａは、コムギＣ１５−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ７ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ７ａのコムギＣ１５−１ｃＤＮＡの予想されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図８】 Ｆｉｇｕｒｅ８：コムギ５ａｌゲノムクローン。
Ｆｉｇｕｒｅ８ａは、５ａｌコムギゲノムクローンのヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ８ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ８ａの５ａｌコムギゲノムクローンの予想されるアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図９】 Ｆｉｇｕｒｅ９：トウモロコシゲノムクローン。
Ｆｉｇｕｒｅ９ａは、１ａｌトウモロコシゲノムクローン、即ちＤ８のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ９ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ９ａのトウモロコシ１ａｌゲルクローンのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図１０】 Ｆｉｇｕｒｅ１０は、トウモロコシＤ８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）の、コムギＲｈｔポリペプチド（配列番号７）、本発明者らにより決定されたコメＥＳＴ配列及びアラビドプシス・タリアナＧａｉポリペプチド（配列番号２）とのＰＲＥＴＴＹＢＯＸアラインメントを示す。
【図１１】 Ｆｉｇｕｒｅ１１：トウモロコシＤ８対立遺伝子の配列。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ａは、トウモロコシＤ８−１対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ｂは、トウモロコシ対立遺伝子の部分的アミノ酸配列（配列番号９）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ｃは、トウモロコシＤ８−２０２３対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ｄは、トウモロコシＤ８−２０２３対立遺伝子の部分的アミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１２】 Ｆｉｇｕｒｅ１２：コムギｒｈｔ−１０対立遺伝子。
Ｆｉｇｕｒｅ１２ａは、コムギｒｈｔ−１０対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１２ｂは、コムギｒｈｔ−１０対立遺伝子の部分的アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
本発明は、植物の成長及び／又は発達の遺伝子制御並びにその中の関連する遺伝子のクローニング及び発現に関する。より詳しくは、本発明は、トリチクム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ａｅｓｔｉｖｕｍ）のＲｈｔ遺伝子、及び他の種からの相同体のクローニング及び発現、並びに該遺伝子の植物中での使用に関する。
【０００２】
開花を含む植物の成長及び発達に影響を与える遺伝子メカニズムの理解は、標的植物の特徴を変化させるための手段を供する。成長及び／又は発達特性の操作が有利であり得る種には、全ての作物があり、重要な例は穀類、おそらく温暖な気候帯において最も農業経済的に重要である、コメ及びトウモロコシ、並びにより温帯性の気候における、コムギ、オオムギ、オート及びライ麦である。種子製品のための重要な作物は、脂肪種子なたね及びカノーラ、トウモロコシ、ひまわり、ダイズ及びモロコシ類である。それらの根のために収集される多くの作物は、もちろん種子から毎年、成長され、いずれの種の種子の生産も、植物が開花し、授粉し、そして種子をつける能力に極めて依存する。園芸において、開花を含む成長及び発達の時期の制御は重要である。開花を制御できる園芸植物には、レタス、エンダイブ及びアブラナ属植物、例えばキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワー、並びにカーネーション及びゼラニウムがある。一方で矮性植物及び他方で過剰に大きく丈の高い植物が、樹木、プランテーション作物及び稲科植物を更に含めて、種々の園芸及び農業関係において有利であり得、及び／又は要求さ得る。
【０００３】
ここ数１０年で、半矮性Ｒｈｔホメオアレルの育種プログラムへの組込みのよりコムギ収率が非常に増加している。これらの増加は、コムギ生産性を世界人口の上昇の要求と歩調をそろえることを可能にしている。以前、我々は、アラビドプシス・ガイ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇａｉ）対立遺伝子のクローニングを記述した（１９９７年２月１２日に出願され、１９９８年８月１４日にＷＯ９７／２９１２３として公開されたＰＣＴ／ＧＢ９７／００３９０、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、この全ての内容は引用により本明細書に組み込まれる）。それは、コムギ（単子葉植物）におけるＲｈｔ変異体対立遺伝子と同様、アラビドプシス（双子葉植物）における半優性矮性表現型及び植物成長ホルモンジベレリン（ＧＡ）に対する応答性の減少を与える。ｇａｉは、野生型（ＧＡＩ）タンパク質のＮ末端近くに見い出される１７アミノ酸残基を欠如する変異体タンパク質（ｇａｉ）をコードする。このセグメントの配列はコメｃＤＮＡ配列（ＥＳＴ）中で高度に保存されている。ここで、我々はこのｃＤＮＡがＲｈｔ座を含むことが知られている重複する穀類のゲノムマップの短いセクションにマッピングされること、及び我々がそのｃＤＮＡを用いてコムギのＲｈｔ遺伝子を単離したことを示す。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）及びトリチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）のものとして広範囲に分岐したこのゲノムは、変異させた時にＧＡ応答性に作用し、植物界を通して保存されているＧＡシグナル伝達において配列のための役割を示す保存された配列を有するはずである。更に、Ｒｈｔのクローニングは、以前にコムギで得られたものと同様に大きい収率増強の目的で、多くの異なる作物種への転移を許容する。
【０００４】
半矮性Ｒｈｔホメオアレル（日本の品種Ｎｏｒｉｎ１０から得られるＮｏｒｉｎ１０遺伝子として元来、知られている）の、純血コムギ育種系への導入はいわゆる“グリーン・レボルーション”への最も大きな寄与の１つであった（Galeら、1985, Dwarfing genes in wheat : Progress in Plant Breeding, G.E. Russell (ed) Butterworths, London pp 1-35) 。これらのホメオアレルを含むコムギは、一貫してそれらを欠如するコムギをより多く生産し、現在、世界のコムギ作物の約８０％を含む。この収率増強の生物学的基礎は２重であるようである。第１に、Ｒｈｔ対立遺伝子により供される半矮性表現型は倒伏（風／両による植物の平担化、結果として収率を減少させる）に対する耐性を増加させる。第２に、これらの対立遺伝子は、光吸収の再配分を引きおこし、これは穀粒に対して多く、幹に対して少くなる（Galeら、1985）。これらの特性は、コムギ収率に大きな効果を有し、これは、Ｒｈｔ含有系が農業者により収穫される年の間、２０％超、ＵＫコムギ収率が増加したという事実により証明される。
【０００５】
ｒｈｔ変異体は、ジベレリン（ＧＡ、内因性植物成長レギュレーター）に対するそれらの応答を害する遺伝的に優性の変異体ｒｈｔ対立遺伝子を含むので、矮小になっている（Galeら、1976, Heredity 37 ; 283-289)。これにより、ｒｈｔ変異体の子葉鞘は、野生型コムギ植物のものと異なり、ＧＡ適用に対して応答しない。更に、ｒｈｔ変異体は野生型対照において見い出されるより高いレベルまで、生物学的に活性なＧＡを蓄積する（Lentonら、1987）、Gibberellin insensitivity and depletion in wheat - consequences for development : Hormone action in Plant Development - a critical appraisal. GV Haod, JR Lenton, MB Jackson and RK Atkin (eds) Butterworths, London pp 145-160)。これらの特性（遺伝子優性、ＧＡ応答性の減少、及び高い内因性ＧＡレベル）は他の種における変異により与えられる表現型に共通しており（トウモロコシのＤ８／Ｄ９；アラビドプシスのｇａｉ）、このことは、これらの変異体対立遺伝子はこれらの異なる種においてオルソロガス遺伝子を規定していることを示し、これは、Ｄ８／Ｄ９及びＲｈｔがトウモロコシ及びコムギのゲノム内でシンテニーの座であるという観察結果により更に支持される。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、Ｒｈｔ機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。用語“Ｒｈｔ機能”は、トリチクムのＲｈｔ遺伝子と同様に植物の表現型に作用する能力を示す。“Ｒｈｔ機能”は、植物成長の阻害、サプレッション、リプレッション又は削減として植物内で表現型として観察することができ、ここでその阻害、サプレッション、リプレッション又は削減はＧＡにより拮抗される。Ｒｈｔ発現はＧＡにより拮抗される植物上の矮性表現型を与える傾向がある。
【０００７】
Ｒｈｔ機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からの植物の過剰発現は、ＧＡでの処置により癒され得る植物に矮性表現型を与えるのに用いることができる。
また、本発明の一態様によれば、発現に基づいてｒｈｔ変異体表現型を与える能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。ｒｈｔ変異体植物は野生型と比べて矮小しており、ここでその矮小はＧＡ不感受性である。
【０００８】
ここで“Ｒｈｔ”（大文字で始まる）は、野生型機能をいうのに用いるが、“ｒｈｔ”（大文字で始まらない）は変異体機能をいうのに用いる。
多くの植物成長及び発達課程はジベレリン（ＧＡ）として知られる四環式ジテルペノイド成長因子のファミリーの特定のメンバーにより制御される。（Hooley, Plart. Mol. Riol. 26, 1529-1555 (1994)）。ジベレリン又はＧＡは、図５に示す基本的な炭素環構造を有するジテルペノイド分子を意味し、生物活性を有する場合、我々は、生物学的に活性なジベレリンという。
【０００９】
生物活性は、穀類アリューロンα−アミラーゼ応答の細胞伸長、葉の老化又は顕在化の１又は複数の刺激により定義することができる。当該技術で利用できる多くの標準的アッセイが存在し、それらのいずれかの１又は複数における陽性結果はテストジベレリンを生物的に活性であるとして示す（Hoadら、Phytochemistry 20, 703-713 (1981) ; Serebryakov ら、Phytochemistry 23, 1843-1854 (1984) ; Smith ら、Phytochemistry 33, 17-20 (1993））。
【００１０】
当該技術で利用できるアッセイには、レタス胚軸アッセイ、キュウリ胚軸アッセイ、及びオート第１葉アッセイがあり、それら全てが、適用されるジベレリンが各々の組織の伸長を引きおこす能力に基づいて生物活性を決定する。好ましいアッセイは、テスト組成物がジベレリン欠損植物に適用されるものである。このような好ましいアッセイには、成長を決定するための矮性ＧＡ欠損アラビドプシスの処理、節間伸長が決定される矮性エンドウアッセイ、葉鞘の伸長が決定されるＴａｎ−ｇｉｎｂｏｚｕ矮性ライスアッセイ、及び葉鞘の伸長が決定されるｄ５−トウモロコシアッセイがある。エロンゲーションバイオアッセイは、各々の器官中の全般的な細胞伸長の効果を測定し、特定の細胞型に制限されない。
【００１１】
更に利用できるアッセイには、ドック（Ｒｕｍｅｘ）葉老化アッセイ及び穀類アリューロンα−アミラーゼアッセイがある。穀粒内の内乳の周囲にあるアリューロン細胞は、デンプンを消化して後に成長中の植物により用いられる糖を作り出すα−アミラーゼを発芽により分泌する。その酵素生産はＧＡにより制御される。生物学的に活性なＧＡをキシコ単離されたアリューロン細胞はα−アミラーゼを分泌し、その活性は、例えばデンプンの分解の測定によりアッセイすることができる。
【００１２】
（ＧＡ，ＧＡ3 ，ＧＡ4 及びＧＡn により示される）高い生物活性のために重要な構造的特徴はＢ−環のＣ−６上のカルボキシル基；Ｃ−１９，Ｃ−１０ラクトン；及びＣ−３におけるβ−水酸化である。Ｃ−２におけるβ−水酸化は（ＧＡ8 ，ＧＡ29，ＧＡ34及びＧＡ51により示される）不活性を引きおこす。ｒｈｔ変異体はＧＡ処理、例えばＧＡ1 ，ＧＡ3 又はＧＡ4 での処理に応答しない。
【００１３】
ＧＡでの処理は、好ましくは、水溶液を噴霧することにより、例えば水溶液中１０-4ＭのＧＡ3 又はＧＡ4 を、週ごとに又はより頻繁に、噴霧することにより行われ、また噴霧でなく植物上に液滴をたらすことにより行ってもよい。ＧＡは、有機溶媒、例えばエタノール又はアセトンに溶かして適用することができる。なぜならそれは水よりこれらにより可溶性であるからであるが、これは、これらの溶媒は植物を傷つける傾向があるので好ましくない。有機溶媒を用いるなら、適切な製剤は、８０％エタノールに溶かした２４ηｌの０．６，４．０又は３００mM ＧＡ3 又はＧＡ4 を含む。植物、例えばアラビドプシスは、ＧＡを含む培地、例えば寒天で固体化し、補給ＧＡを含む組織培養培地（ＧＭ）上で成長させることができる。
【００１４】
本発明による核酸は、トリチクムの野生型Ｒｈｔ遺伝子の配列を有しても、供される配列の突然変異体、誘導体、変異体又は対立遺伝子であってもよい。好ましい突然変異体、誘導体、変異体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的特徴、特にＧＡにより拮抗される植物成長阻害の能力、又は植物のＧＡ処理に応答する１もしくは複数の他の特徴を植物に与える能力を保持するタンパク質をコードするものである。他の好ましい突然変異体、誘導体、変異体及び対立遺伝子はｒｈｔ変異体表現型、即ち植物成長の減少であってその減少がＧＡに対して不感受性、即ちＧＡ処理によって克服されないものを与えるタンパク質をコードする。突然変異体、変異体又は誘導体を生産するための配列の変化は、コードされるポリペプチド内の１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導く、核酸内の１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の付加、挿入、欠失又は置換により行うことができる。もちろん、コードされるアミノ酸配列に差を生じない核酸の変化も含まれる。
【００１５】
Ｒｈｔ遺伝子のための好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１に示すＲＨＴアミノ酸配列をコードするもの、特に配列番号２に示すＲｈｔコーディング配列である。好ましいｒｈｔ変異体は、配列番号１に下線で示される１７アミノ酸のうちの一部もしくは全部、及び／又は配列番号１に下線で示される１７アミノ酸配列の直後にある一部もしくは配列：
【００１６】
【化１】
を欠如する。
更に好ましいヌクレオチド配列は、添付のいずれかの他の図に示されるアミノ酸をコードし、特に図に示すコーディング配列である。更に、本発明の更なる実施形態は、全ての態様において、配列番号５，６，７，８，９，１０又は１１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を用いる。このようなコーディング配列は、配列番号１２，１３，１４，１５，１６，１７又は１８に示されるものである。
【００１８】
本発明は、その供される配列のいずれか１つの核酸を含む核酸構成物又はベクター、好ましくはその核酸配列によりコードされるポリペプチドがそれから発現され得る構成物又はベクターも供する。その構成物又はベクターは、好ましくは植物細胞への形質転換のために適している。本発明は、このような構成物又はベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を更に含む。これにより、本発明による核酸を含む宿主細胞、例えば植物細胞が供される。その細胞内で、核酸は、染色体内に組み込むことができる。半数体ゲノム当りに１超の異種ヌクレオチド配列が存在し得る。これは、例えば、以下に議論するように、内因的なレベルと比べて、遺伝子産物の発現の増加を可能にする。
【００１９】
本発明による核酸を含む構成物又はベクターは、特にそのベクターをゲノムへの組換えのために細胞内に核酸を導入するために用いる場合、プロモーター又は他の調節配列を含む必要はない。しかしながら、一態様において、本発明は、発現の調節のための調節配列に連結された（トリチクム以外からの相同体を含む）Ｒｈｔ又はｒｈｔコーディング配列を含む核酸構成物を供する。ここでその調節配列は、そのコーディング配列に天然で融合しているもの以外のものであり、好ましくは別の遺伝子のもの又はそれから得られるものである。
【００２０】
本発明による核酸分子及びベクターは、それらの天然の環境から単離されるなら、実質的に純粋もしくは均一な形態、又は開花を含み得る、成長及び／又は発達に作用し得るポリペプチドをコードする配列以外の関心の種もしくは起源の核酸もしくは遺伝子、例えばＲｈｔコーディング配列以外のトリチクム・アエスチブム核酸を含まない、もしくは実質的に含まない単離物であり得る。用語“核酸単離物”には、全体的に又は部分的に合成された核酸を包含する。
【００２１】
もちろん、核酸は、適切なら、二本鎖又は一本鎖、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、全体的又は部分的に合成したものであり得る。もちろん、本発明による核酸はＲＮＡを含み、ここで示される配列の引用は、ＴのかわりにＵでおきかえて、ＲＮＡ等価物を包含するとして解釈すべきである。
本発明は、開示される核酸配列のいずれかの発現産物、及び適切な宿主細胞内で適切な条件下で、コーディング核酸からの発現により発現産物を生産する方法も包含する。当業者は、組換え遺伝子発現の産物の発現及び回収のためのベクター及びデザインプロトコルを十分に作製することができる。適切なら、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む、適切な調節配列を含む、適切なベクターを選択し又は作製することができる。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook ら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。形質転換手順は用いる宿主に依存することが、十分知られている。核酸の操作のための多くの周知の技術及びプロトコル、例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析におけるものは、Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel ら、eds, John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載される。植物で広範囲に成功して以前に用いられている特定の手順及びベクターは、Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721、並びにGuerinean 及びMullineaux (1993) Plant transformation and expression vectors : Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, Bios ScientiPic Publisher, pp 121-148に記載される。Sambrookら及びAusubel ら並びに全ての他の本明細書に言及される文献の開示は引用により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
ポリヒスチジンタグとの融合物としての発現により、ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）及びＤＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｍｙ）から利用できるＮｉ−ＮＴＡを用いて行われるＲｈｔ又はｒｈｔの精製を行うことができる。Jarknecht ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976 (1991) 並びにＥＰ−Ａ−０２５３３０３及びＥＰ−Ａ−０２８２０４２を参照のこと。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂はタンパク質のＮ−又はＣ−末端近くに連続的ヒスチジンを有するタンパク質について高いアフィニティーを有するので、植物、植物の一部もしくは抽出物から、又はそのタンパク質を発現する組換え生物、例えばイーストもしくは細菌からヒスチジン標識化Ｒｈｔ又はｒｈｔタンパク質を精製するのに用いることができる。
【００２３】
精製されたＲｈｔタンパク質、例えばコーディング核酸からの発現により組換え生産されたものを、当該技術分野で標準的である技術を用いて抗体を生じさせるために用いることができる。抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチドを、更に後述するように、他の種からの相同体を同定するのに用いることができる。
【００２４】
抗体を生産する方法には、哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル）を、タンパク質又はそのフラグメントで免疫化することを含む。抗体は、当該技術で周知である種々の技術のいずれかを用いて免疫化動物から得ることができ、好ましくは関心の抗原への抗体の結合を用いて、スクリーニングすることができよう。例えば、ウエスタンブロット技術又は免疫沈降法を用いることができる（Armitageら、1992, Nature 357 : 80-82) 。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。
【００２５】
哺乳動物を免疫化するかわりとして又は補助として、適切な結合特異性を有する抗体は、例えば表面上に、機能的なイムノグロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、発現されるイムノグロブリン可変ドメインの組換え生産されたライブラリーから得ることができる。例えばＷＯ９２／０１０４７を参照のこと。
【００２６】
Ｒｈｔ又はｒｈｔポリペプチドに対して生じた抗体は、相同なポリペプチド、及び後にそのコーディング遺伝子の同定及び／又は単離に用いることができる。これにより、本発明は、Ｒｈｔ機能又はｒｈｔ変異体表現型を与える能力を有するポリペプチドを同定し又は単離する方法であって、トリチクム・アエスチブムＲｈｔもしくはｒｈｔポリペプチドに結合することができ、又は好ましくはこのようなポリペプチド、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものについての結合特異性を有する抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチド（例えば完全な抗体又はそのフラグメント）で候補のポリペプチドをスクリーニングすることを含む方法を供する。
【００２７】
スクリーニングのための候補ポリペプチドは、例えば、関心の植物から得られる核酸を用いて作られた発現ライブラリーの産物であっても、天然のソースからの精製過程の産物であってもよい。
抗体に結合することが見い出されたポリペプチドは単離することができ、次にアミノ酸配列決定にかけることができる。全体的に又は部分的にポリペプチドを配列決定するためにいずれかの適切な技術を用いることができる（例えばポリペプチドのフラグメントを配列決定することができる）。例えば更に後述されるように、候補核酸へのハイブリダイゼーションにおいてプローブ又はプライマーとして用いるための１又は複数のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドの縮重プール）をデザインすることにより、ポリペプチドをコードする核酸を得ることにおいて、アミノ酸配列情報を用いることができる。
【００２８】
本発明の更なる態様は、トリチクム以外の植物種からのＲｈｔ相同体を同定シ、クローン化する方法であって、配列番号５７〜７７もしくは配列番号３、又は本明細書の他の図に示すいずれか由来のヌクレオチド配列を用いる方法を供する。これら由来の配列は、それら自体、他の配列を同定し、クローン化することに用いることができる。本明細書に供されるヌクレオチド配列情報又はそのいずれか一部は、相同な配列を見い出すためにデータベースサーチに用いることができ、その発現産物はＲｈｔ機能についてテストすることができる。あるいは、核酸ライブラリーは、当業者に公知の技術を用いてスクリーニングすることができ、それにより、相同な配列を同定し、次にテストすることができる。
【００２９】
例えば、本発明は、Ｒｈｔ又はｒｈｔ相同遺伝子を同定し及び／又は単離する方法であって、Ｒｈｔ機能を有するポリペプチドをコードする核酸又はそのフラグメント、変異体、誘導体もしくは対立遺伝子で候補（又は“標的”）核酸をプロービングすることを含む方法も供する。（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであり得る）候補核酸は、このような相同体をコードする核酸を含み得る又は含むと予想されるいずれかの細胞又は生物から得ることができる。
【００３０】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、候補核酸のプロービングのために用いる核酸は、コーディング配列に相補的である配列番号１に示すアミノ酸配列、又はこれらのいずれかのフラグメントをコードし、最も好ましくは配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む。
あるいは、上述の通り、プローブは、配列番号１に示すＲｈｔアミノ酸配列を有するもののようなＲｈｔ又はｒｈｔポリペプチドに結合することができる抗体の抗原結合ドメインに結合することができるものとして同定されるポリペプチドを配列決定することにより得られるアミノ酸配列情報を用いてデザインすることができる。
【００３１】
プロービングのための好ましい条件は、更に研究することができる、陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるために十分にストリンジェントであるものである。少しだけの陽性クローンが残るまで、次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術分野で公知である。
【００３２】
プロービングのかわりに、なお核酸ハイブリダイゼーションを用いるが、Ｒｈｔ遺伝子からＤＮＡ配列を増幅するようデザインしたオリゴヌクレオチドを、慣用的な手順を用いて、ＰＣＲ又は他の核酸の増幅に関連する方法に用いることができる。例えば“ＰＣＲプロトコル；A Guide to Method and Applications”, Eds, Innisら、1990, Academic Press, New Yorkを参照のこと。
【００３３】
プローブ又はＰＣＲプライマーのデザインに用いるために適した好ましいアミノ酸配列は、Ｒｈｔ遺伝子間で（完全に、実質的に又は部分的に）保存された配列である。
アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝コードの縮重、及び適切なら、候補核酸が得られる生物のコドン用法を考慮して、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーをデザインすることができる。特に、プライマー及びプローブは、例えば配列番号１，３及び／又は配列番号１，７から明らかな保存された配列に基づく情報を用いてデザインすることができる。
【００３４】
全長のコーディング核酸分子が得られていない場合、完全な分子の一部を表すより小さな分子を、全長のクローンを得るために用いることができる。挿入物は、例えば部分的なｃＤＮＡクローンから調製することができ、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。単離された全長のクローンは、ベクター、例えば発現ベクター又は植物への形質転換のために適したベクターにサブクローン化することができる。全長の配列を供するために重複したクローンを用いることができる。
【００３５】
本発明は、Ｒｈｔをコードする核酸、又は配列番号５７〜７７又は配列番号３から得られるヌクレオチド配列を用いて得ることができる相同体、並びに表１に示す配列を含む１又は複数の、例えば一対のプライマーを用いて得ることができる核酸にも広げられる。
本発明の範囲内に、トリチクムのＲｈｔによりコードされるポリペプチドの相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸配列も含まれる。相同体は、トリチクム以外の種からのものであり得る。
【００３６】
相同性はヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列レベルであり得る。好ましくは、その核酸及び／又はアミノ酸配列は配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされる配列と、好ましくは少くとも約５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％又は８５％の相同性、最も好ましくは少くとも９０％、９２％、９５％又は９７％の相同性を有する。このようなポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、トリチクムＲｈｔ遺伝子と、植物中での発現により特定の表現型、好ましくはＧＡ応答性である表現型（即ちＧＡでの処理により植物の特徴に変化がおこる）を与える能力、例えば阻害がＧＡにより拮抗される植物成長を阻害する能力を共有し得る。注意すべきは、植物中でのＲｈｔ発現は植物の１又は複数の他の特徴に作用し得る。トリチクムＲｈｔ遺伝子と共有し得る好ましい特徴は、トリチクムのような植物においてＲｈｔ又は変異体表現型を補給する能力である。ここで、このような表現型はパクロブトラゾールの矮性効果に対する耐性である。オオムギのｓｌｅｎｄｅｒ変異体はコムギゲノム内のＲｈｔのものと等価なオオムギゲノム内の位置に存在する。このような変異体植物は強力にパクロブトラゾール耐性である。本発明者らはｓｌｅｎｄｅｒオオムギ変異体は、オオムギ変異体のコムギ遺伝子での補給を許容する、コムギＲｈｔに対するオルソロガス遺伝子の又は変異体対立遺伝子である。オオムギにｓｌｅｎｄｅｒ変異体を補給する能力は、本発明の実施形態の特徴であり得る。
【００３７】
（本発明による核酸の実施形態によりコードされる）本発明によるポリペプチドの特定の好ましい実施形態には、配列番号１に下線で示される１７アミノ酸配列、又は配列番号１に下線で示される１７アミノ酸中の（位置に関して）各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約１０残基、より好ましくは１１，１２，１３，１４，１５，１６もしくは１７残基を有するアミノ酸の隣接配列、及び／又は配列：
【００３８】
【化２】
又は配列：
【００４０】
【化３】
内の（位置に関して）各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約５残基、より好ましくは６，７，８もしくは９残基を有するアミノ酸の隣接配列がある。更なる実施形態には、２７アミノ酸配列：
【００４２】
【化４】
又はこの配列中の（位置に関して）各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約１５残基、好ましくは１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５もしくは２６残基を有するアミノ酸の隣接配列がある。
十分に理解されるように、アミノ酸レベルでの相同性は一般に、アミノ酸類似性又は同一性に関する。類似性は、“保存性変異”、即ち１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの他のものへの置換、又は１つの極性残基の他のものへの、例えばリシンのアルギニンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、アスパラギンのグルタミンへの置換を許容する。類似性は、当該技術に標準的に用いられるAltschulら（1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10のＴＢＬＡＳＴＮプログラム、より好ましくは配列をアラインするためのNeedleman 及びWunschのアルゴリズムを用いるＧＡＰ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, USA)により規定され、決定される通りであり得る。ＧＡＰのための適切なパラメーターには、デフォルトパラメータ、ギャップ・クリエーション・ペナルティー＝１２及びギャップ・エクステンション・ペナルティー＝４、又はギャップ・クリエーション・ペナルティー＝３．００及びギャップエクステンション・ペナルティー＝０．１がある。相同性は、配列番号１のＲｈｔ配列の全長にわたってもよく、又は好ましくは配列：
【００４４】
【化５】
と比べて１０アミノ酸の隣接配列、及び／又は配列番号１に下線で示される１７アミノ酸と比べて１７アミノ酸の隣接配列、及び／又は配列：
【００４６】
【化６】
と比べて２７アミノ酸の連続配列、又は配列番号１のアミノ酸配列、好ましくは下線の１７アミノ酸及び／又は配列：
【００４８】
【化７】
を含む配列と比べてより長い配列、例えば約３０，４０，５０又はより多くのアミノ酸にわたってもよい。
核酸レベルにおいて、相同性は、全長にわたっても、又は好ましくは配列番号３の配列内の３０ヌクレオチドコーディング配列及び配列：
【００５０】
【化８】
をコードする配列及び／又は配列番号３の配列内の５１ヌクレオチドコーディング配列及び配列番号１に下線で示す１７アミノ酸配列をコードする配列、又はより長い配列、例えば約６０，７０，８０，９０，１００，１２０，１５０又はより多くのヌクレオチド、好ましくは配列番号１の下線の１７アミノ酸をコードする配列番号３の５１ヌクレオチドを含む配列によってもよい。
【００５２】
注意すべきは、類似性は、当該技術で標準的に用いられるAltschulら（1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10のＴＢＬＡＳＴＮプログラム、又はWisconsin Package, Version 8, September 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711)の一部である標準的プログラムＢｅｓｔＦｉｔにより規定され、決定される。ＢｅｓｔＦｉｔは、２つの配列間の類似性の最も優れたセグメントの最適なアラインメントを作り出す。最適なアラインメントは、Smith 及びWaterman（Adv. Appl. Math. (1981) 2 : 482-489)の局所的相同性アルゴリズムを用いて対の数を最大にするようにギャップを挿入することにより見い出される。他のアルゴリズムには、対の数を最大にし、かつギャップの数を最小にするよう２つの完全な配列をアラインするためにNeedleman 及びWunschアルゴリズムを用いるＧＡＰがある。いずれのアルゴリズムであっても、一般に、ＧＡＰギャップ・クリエーション・ペナルティー＝１２及びギャップエクステンション・ペナルティー＝４であるデフォルトパラメータが用いられる。（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（1988) PNAS USA 85 : 2444-2448 の方法を用いる）アルゴリズムＦＡＳＴＡが更にかわりとして用いられる。
【００５３】
本明細書の用語“相同性”及び“相同な”のいずれの使用も、例えば２つのヌクレオチド配列が適切な条件下で組換えるために十分に類似していることを単に要求する“相同時組換え”のような用語の標準的使用において、比較される配列間のいずれの必要な進化的な関係も包含しない。本発明による核酸によりコードされ得る本発明によるポリペプチドの更なる議論は以下に記す。
【００５４】
本発明は、ストリンジェント条件下で本明細書に開示されて特定の配列のいずれか一又は複数のものとハイブリダイズする核酸も包含する。
ハイブリダイゼーションは、核酸でプロービングし、そして（周知の技術に従って）適切なストリンジェント条件下でポジティブなハイブリダイゼーションを同定することにより決定することができる。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるのに十分にストリンジェントであるものである。少い陽性クローンだけが残るまで次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるために当該技術で公知である。
【００５５】
プローブの標的核酸（例えばＤＮＡ）への結合は、当業者の自由に種々の技術のいずれかを用いて測定することができる。例えば、プローブは、放射能で、蛍光で、又は酵素により標識することができる。プローブの標識化を用いない他の方法には、制限フラグメント長多形性の検査、ＰＣＲを用いる増幅、ＲＮＡｓｅ開裂及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングがある。
【００５６】
プロービングは、標準的なサザン・ブロット技術を用いることができる。例えば、ＤＮＡは細胞から抽出し、異なる制限酵素で消化することができる。次に、制限フラグメントは、変性前に、アガロースゲルでの電気泳動により分離し、そしてニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識化プローブは、フィルター上でＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせ、結合を決定することができる。プロービングのためのＤＮＡは、逆転写酵素−ＰＲＣのような技術により細胞からのＲＮＡ調製物から調製することができる。
【００５７】
制限酵素で消化したＤＮＡのサザンブロットに低ストリンジェンシー条件下で種々のプローブをハイブリダイズさせることにより予備実験を行うことができる。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるのに十分にストリンジェントである条件である。少しの陽性クローンだけが残るまで、次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術で公知である。適切な条件は、バックグラウンドハイブリダイゼーションが低い時に多数のハイブリダイズするフラグメントが得られる時に達成されるであろう。これらの条件を用いて、核酸ライブラリー、例えば発現される配列の代表的なｃＤＮＡライブラリーを調査することができる。当業者は、オリゴヌクレオチド長並びに塩基組成、温度等のような因子を考慮して、選択的ハイブリダイゼーションのための要求されるストリンジェンシーの適切な条件を十分に用いることができる。
【００５８】
例えば、スクリーニングは、約３７℃又はそれ超の温度、約５０％未満のホルムアミド濃度、及び中〜低の塩（例えばＳｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ（‘ＳＳＣ’）＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム；０．１５Ｍクエン酸ナトリウム；pH７）濃度を含む条件下で最初に行うことができる。
あるいは、約５０℃又はそれ超の温度及び高い塩（例えば‘ＳＳＰＥ’＝０．１８６mM塩化ナトリウム；９mMリン酸水素二ナトリウム；９mMリン酸二水素ナトリウム；１mM ＥＤＴＡナトリウム；pH７．４）で行うことができる。好ましくは、スクリーニングは約３７℃、約２０％のホルムアミド濃度、及び約５×ＳＳＣの塩濃度、又は約５０℃の温度及び約２×ＳＳＰＥの塩濃度で行われる。これらの条件により、安定なハイブリッドの同定のための完全な相同性を要求することなく、プローブ配列との実質的な相同性（類似性、同一性）を有する配列を同定することができよう。
【００５９】
適切な条件には、例えば約８０〜９０％の同一性である配列の検出のために、４２℃で一晩の、０．２５ＭのＮａ2 ＨＰＯ4 ，pH７．２，６．５％のＳＤＳ，１０％のデキストランスルフェートでのハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ中で５５℃での最後の洗浄がある。約９０％の同一性により大きい配列の検出のために、適切な条件には、６５℃で一晩の、０．２５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，pH７．２，６．５％のＳＤＳ，１０％のデキストランスルフェート中でのハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ中で６０℃での最後の洗浄がある。
【００６０】
Ｒｈｔ遺伝子と他のものからの相同体とを区別するために用いることができる条件は、以下の手順を含み得る。
第１及び第２のＤＮＡ分子をアガロースゲル上に走らせ、メンブランフィルターにブロットする（Sambrookら、1989）。そのフィルターを、一定に振とうしながら、５時間、６５℃で、プレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％ ＳＤＳ，２mM ＥＤＴＡ，２０μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）中でインキュベートする。次に、その溶液を放射能標識化第２ＤＮＡを含む３０mlの溶液に置換し（標準的技術に従って調製したもの；Sambrookら、1999を参照のこと）、一定に振とうしながら６５℃で一晩、インキュベートする。次の朝に、フィルターをそそぎ（３×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ溶液で１回、そそぐ）、次に洗う：６５℃で２５分、３×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ溶液での第１の洗浄；及び同じ時間、同じ温度で０．１×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳでの第２の洗浄。次に、そのフィルター上の放射線パターンを標準的な技術を用いて記録する（Sambrookら、1989を参照のこと）。
【００６１】
必要なら、ストリンジェンシーは、洗浄の温度を増加させ、及び／又はＳＳＣｉｎｉ洗浄液を減少させ又は全く省略することにより増加させることができる。 （ＳＳＣは、１５０mM ＮａＣｌ，１５mMクエン酸ナトリウムである。５０×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液は１％（ｗ／ｖ）ｆｉｃｏｌｌ，１％ポリビニルピロリドン、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンである）。
【００６２】
ｒｈｔ変異体に対する相同性も本発明によって供される。これらは、野生型が、配列番号１に下線で示す１７アミノ酸、又は配列番号１に下線で示す１７アミノ酸中の対応する残基と類似性又は同一性を有する少くとも約１０（より好ましくは１１，１２，１３，１４，１５，１６又は１７）アミノ酸を有する１７アミノ酸の隣接アミノ酸を含むが、変異体はそうでない場合、変異体であり得る。同様に、野生型が、配列：
【００６３】
【化９】
又は配列：
【００６５】
【化１０】
中の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約５（より好ましくは６，７，８又は９）アミノ酸を有する１０アミノ酸の隣接配列を含むが変異体はそうでない場合であり得る。このような変異体ポリペプチドをコードする核酸は、植物内での発現に基づいて、（ＧＡの供給又は涸渇に基づき植物中でいくらかの応答があり得るが）ＧＡでの植物の処理に基づき克服されない又は野生型表現型にもどらない変異体表現型である、ＧＡでの植物の処理に不感受性又は非応答性である表現型を与える。
【００６７】
本発明の更なる態様は、配列番号１に示す種トリチクム・アエスチブムのＲｈｔアミノ酸配列の突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体配列であり、又は他の種の相同体もしくはその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、もしくは変異体であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物を供する。ここでその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、変異体又は相同体は１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、付加及び／又は置換により配列番号１に示すアミノ酸と異なる。それらは、パクロブトラゾールの矮小効果に対して耐性であるＲｈｔ又は変異体表現型を有する植物をテスト核酸で形質転換することによりトランスジェニック植物を生産し、そのトランスジェニック植物内でテスト核酸から発現を引きおこし又は許容し、そのトランスジェニック植物をＲｈｔ又は変異体表現型の補給を示すものについてスクリーニングしてＲｈｔ又は変異体を補給することができるテスト核酸を同定し、そのＲｈｔ又は変異体を補給することができるとして同定された核酸から、配列番号１に下線で示す１７アミノ酸又は配列番号１に下線で示す１７アミノ酸中の対応する位置内の各々のアミノ酸と類似性又は同一性を有する少くとも１０残基、より好ましくは１１，１２，１３，１４，１５，１６又は１７残基を有する隣接１７アミノ酸をコードするヌクレオチド配列、及び／又は配列：
【００６８】
【化１１】
をコードするヌクレオチド配列又は配列：
【００７０】
【化１２】
中の対応する残基と類似性又は同一性を有する少くとも約５（より好ましくは６，７，８又は９）残基を有する１０アミノ酸の隣接配列を削除することにより得ることができる。
本発明の核酸を含む細胞、特に植物細胞又は細菌細胞は本発明の更なる態様を形成する。
【００７２】
その細胞は、核酸の細胞又はその祖先への導入により、例えば当業者に利用できるいずれかの適切な技術を用いる形質転換により、タンパク質をコードする核酸を含み得る。
本発明によれば、ゲノム内に組み込まれた開示される核酸を有する植物細胞も供する。
【００７３】
完全な天然の配列を用いる場合、その植物細胞はその配列の天然の宿主以外の植物のものであり得る。
本発明は、このような植物細胞を含む植物も供する。
本発明によれば、発現の制御のための調節配列の作用的制御下で、本発明により供されるヌクレオチドの配列をそのゲノム内に組み込んだ植物細胞も供する。
【００７４】
本発明の更なる態様は、このような植物細胞を生産する方法であって、ヌクレオチドの配列を含むベクターを植物細胞に導入し、そしてそのベクターと植物細胞との間の組換えを引きおこし又は許容してヌクレオチドの配列をゲノム内に導入することに関する方法も供する。
本発明による植物は、１又は複数の特性において本気に受粉しないものであり得る。植物品種、特に植物育種者の権利による登録可能な植物品種は排除される。植物は“植物品種”であると考える必要はないことに注意のこと。なぜならそれは、植物又はその祖先の細胞内に導入されたトランスジーンをゲノム内に安定に含むだけだからである。
【００７５】
植物に加えて、本発明は、このような植物のいずれかのクローン、種子、自家又はハイブリッド子孫及び後継、並びにこれらのいずれかのいずれか一部、例えば挿穂（ｃｕｔｔｉｎｇ）、種子を供する。本発明は挿穂、種子等を含む、有性又は無性的な再生又は繁殖に用いることができるいずれか一部であるいずれかの植物零余子を供する。このような植物の有性的又は無性的に繁殖された子孫、クローンもしくは後継、又はその植物、子孫、クローンもしくは後継のいずれか一部もしくは零余子も本発明に含まれる。
【００７６】
本発明は更に、植物の細胞内での異種Ｒｈｔ又はｒｈｔ遺伝子配列（又は議論されるようなその突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは相同性）の発現を含む、植物の特徴に影響を与える方法を供する。用語“異種”は、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列が、遺伝子工学を用いて、即ち形質転換を含み得るヒトの介入により、前記植物の細胞又はその祖先に導入されていることを示す。その遺伝子は、ゲノム外ベクター上にあっても、ゲノム内に好ましくは安定に組み込まれてもよい。異種遺伝子は、内因性の等価な遺伝子、即ち成長及び／又は発達の制御下で同じ又は類似する機能を通常、行うものであってもよく、又はその挿入された配列は、内因性遺伝子に加えてもよい。異種遺伝子の導入の利点は、遺伝発現、並びにそれにより優性に従った植物の成長及び／又は発達に影響を与えることができるために、選択されたプロモーターの制御下に遺伝子の発現をおく能力である。更に、野生型遺伝子の突然変異体及び誘導体は、内因性遺伝子のかわりに用いることができる。挿入された遺伝子は宿主細胞に対して外のもの又は外来性、例えば別の植物種のものであってもよい。
【００７７】
本発明を用いて変化させることができる原則的特徴は成長である。
成長レプレッサーとしてのＲｈｔ遺伝子のモデルによれば、遺伝子の下降制御は、少くとも（例えば補うであろう内因性相同体を有するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）でない）Ｒｈｔ機能を与える唯一の内因性遺伝子を有する植物において、成長を促進するために用いることができる。これは、アンチセンス又はセンス制御の使用に関連し得る。丈の高い植物は、関心の植物中のＲｈｔ又は関連する相同体をバックアウトすることにより作ることができる。例えば雑草を矮小に維持するためのＧＡ生合成インヒビターの使用を許容するが作物を高く成長させるため、パクロブトラゾールのようなＧＡ生合成を阻害する化合物に対して耐性である植物を作ることができる。
【００７８】
Ｒｈｔ遺伝子の過剰発現は、Ｒｈｔ抑制モデルにより予想されるように、ＧＡでの処理により補うことができる矮性植物を導き得る。
ｒｈｔ変異体遺伝子は表現型において優先であるので、それらは、ＧＡ不感受性矮性植物を作るために用いることができる。これは、例えばいずれかの形質転換可能な作物、樹木又は果樹種に適用することができる。それは、Ｒｈｔコムギのようなより高収率／少い倒伏を供し得る。コメにおいて、これは、日本及び他所で問題となっているＢａｋａｎｅ病に対するＧＡ不感受性のコメを供することができる。矮性装飾植物は、園芸及び切り花市場のために価値あるものであり得る。配列操作は、種々の程度の激しさの矮小、ＧＡ不感受性表現型を供し得、各々の作物の必要性又は操作者の希望に対して激しさの程度を調節を許容する。ｒｈｔ変異体配列の過剰発現は潜在的に最も有用である。
【００７９】
変化させることができる第２の特徴は植物発達、例えば開花である。特定の植物において、及び特定の環境条件において、ＧＡシグナルは開花誘導のために必要とされる。例えば、短日条件下で成長させたＧＡ欠損変異体アラビドプシス植物はＧＡで処理しなければ開花しないであろう：これらの植物は、長日条件下で成長する時に正常に開花する。アラビドプシス・ガイ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇａｉ）変異体植物は、短日条件下で開花の遅れを示す：激しい変異体は全く開花することができない。これにより、例えばＲｈｔ又はｒｈｔ遺伝子発現又は過剰発現により、開花を誘導するための所定のＧＡ処理まで生長を保持する植物を生産することができる。これは、園芸の分野において又は抽苔の抑制が要求されるホウレンソウ、レタス及び他の作物のために役立つ。
【００８０】
本発明による核酸は、使用者の制御下にＲｈｔ又はｒｈｔコーディング配列をおくために外から誘導できる遺伝子プロモーターの制御下におくことができる。 プロモーターに適用される用語“誘導可能（誘導性）”は、当業者に十分に理解される。本質において、誘導性プロモーターの制御下の発現は、“スイッチ・オン”され、又は適用された刺激に応答して増加する。それら刺激の性質はプロモーター間で多様である。特定の誘導性プロモーターは適切な刺激の欠如下で極めて少い又は検出できないレベルの発現を引きおこす（又は発現しない）。他の誘導性プロモーターは、刺激の欠如下で検出可能な構成物発現を引きおこす。発現のレベルが刺激の欠如下にあっても、正常な刺激の存在下でいずれの誘導性プロモーターからの発現も増加する。好ましい刺激は発現のレベルが表現型の特徴を変えるために有効な量による関連する刺激の適用に基づいて増加する場合である。これにより、レベルが低すぎて要求される表現型をもたらさない（実質的にゼロであり得る）刺激の欠如下で発現の基底レベルを引きおこす誘導性（又は“スイッチ可能な”）プロモーターを用いることができる。刺激の適用に基づいて、要求される表現型をもたらすレベルに発現は増加される（又はスイッチ・オンにされる）。
【００８１】
適切なプロモーターには、本質的に全ての植物組織において高レベルで発現されるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）遺伝子プロモーター（Benfeyら、1990ａ及び1990ｂ）；外来性のセーフナーの適用に応答して活性化されるトウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ異型II（ＧＳＴ−II−２７）遺伝子プロモーター（ＷＯ９３／０１２９４，ＩＣＩ Ｌｔｄ）；植物の頂端分裂組織及び植物体内のいくつかの十分に局在化した位置、例えば内生師部、花の原基、根及び苗条内の分岐点で発現されるカリフラワーｍｅｒｉ５プロモーター（Medford, 1992 ; Medford ら、1991) 並びに花の発達において極めて初期に発現されるアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＬＥＡＦＹプロモーター（Weigelら、1992）がある。
【００８２】
ＧＳＴ−II−２７遺伝子プロモーターは、成長中の植物に適用することができる特定の化学的化合物により誘導されることが示されている。プロモーターは、単子葉及び双子葉植物の両方で機能的である。それゆえ、それは、畑の作物、例えばカノーラ、ひまわり、タバコ、シュガービート、綿；穀類、例えばコムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、モロコシ類；果樹、例えばタバコ、マンゴー、モモ、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、バナナ、及びメロン；及び野菜、例えばニンジン、レタス、キャベツ及びオニオンを含む。遺伝的に改変された種々の植物内で遺伝子発現を制御するために用いることができる。ＧＳＴ−II−２７プロモーターは、根、葉、幹及び再生した組織を含む、種々の組織に用いるためにも適している。
【００８３】
従って、本発明は、更なる態様において、本発明により供されるヌクレオチド配列、例えばトリチクムのＲｈｔ遺伝子、他の植物種からの相同体又はそのいずれかの変異体、誘導体もしくは対立遺伝子に作用可能に連結された誘導性プロモーターを含む遺伝子構成物を供する。これは、遺伝子の発現の制御を可能にする。本発明は、前記遺伝子構成物で形質転換された植物、並びにこのような構成物の植物細胞への導入及び／又は適切な刺激、有効な外来インデューサーの適用による植物細胞内での構成物の発現の誘導を含む方法も供する。プロモーターは、ＧＳＴ−II−２７遺伝子プロモーター又はいずれかの他の誘導性植物プロモーターであり得る。
【００８４】
選択された遺伝子構成物を細胞に導入する場合、特定の考慮がされなければならず、これは当業者に公知である。挿入すべき核酸は、転写を駆動するであろう有効な調節因子を含む構成物内でアセンブルされるべきである。その構成物を細胞に輸送する方法が利用できなければならない。構成物が細胞膜内にあるなら、内因性染色体材料への組込みは行っても行わなくてもよい。最後に、植物を考慮する限り、標的細胞型は、細胞が完全な植物に再生され得るようでなければならない。
【００８５】
抗生物質、例えばカナマイシン、ヒグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゼンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリホセートに対する耐性のような選択的表現型を与えるキメラ遺伝子からなる選択遺伝子マーカーを用いることができる。
本発明の一態様は、トランスジェニック植物の生産における本発明による核酸の使用である。
【００８６】
更なる態様は、核酸を植物細胞に導入し、そしてその核酸の細胞のゲノム内への組込みを引きおこし又は許容することを含む方法を供する。
植物形質転換のいずれかの適切な方法を用いて本発明に従って、核酸を含む植物細胞を作り出すことができる。形質転換の後、植物は形質転換された植物細胞及び組織から再生することができる。
【００８７】
上手く形質転換された細胞及び／又は植物、即ちそれらのゲノム内に組み込まれた構成物で形質転換されたものは、核酸の植物細胞への導入の後、任意に植物への再生の後、例えば１又は複数のマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性を用いて（上述）、選択することができる。
その配列を含むＤＮＡセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝子操作のために既に知られている標準的な技術によって作り出すことができる。ＤＮＡは、いずれかの適切な技術、例えばその天然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリウムにより行われるジスアームドＴｉ−プラスミド・ベクター（ＥＰ−Ａ−２７０３５５，ＥＰ−Ａ−０１１６７１８，ＮＡＲ１２（２２）８７１１−８７２１５ １９８４）、パーティクル又はマイクロプロジェクティルボンバードメント（ＵＳ５１００７９２，ＥＰ−Ａ−４４４８８２，ＥＰ−Ａ−４３４６１６）、マイクロインジェクション（ＷＯ９２／０９６９６，ＷＯ９４／００５８３，ＥＰ３３１０８３，ＥＰ１７５９６６，Green ら（1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press)、エレクトロポレーション（ＥＰ２９０３９５，ＷＯ８７０６６／４ Ｇｅｌｖｉｎ Ｄｅｂｅｙｓｅｒ−添付を参照のこと）、他の形態の直接的ＤＮＡ取込み（ＤＥ４００５１５２，ＷＯ９０１２０９６，ＵＳ４６８４６１１）。リポソーム媒介ＤＮＡ取込み（例えばFreeman ら、Plant Cell Physiol. 29 : 1353 (1984)) 、又はボルテキシング法（例えば Kindle, PNAS U.S.A. 87 : 1228 (1990ｄ））を用いて植物細胞に形質転換することができる。植物細胞の形質転換のための物理的方法はDard, 1991, Biotech. Adv. 9 : 1-11を参照のこと。
【００８８】
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉種を形質転換するために当業者により広く用いられている。現在、ほとんど全ての経済的に関連のある単子葉植物中での安定な繁殖力のあるトランスジェニック植物のルーチン的な生産に対する実質的な進行がある（Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074 ; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384 ; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840 ; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276 ; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740 ; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962 ; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574 ; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591 ; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255 ; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884 ; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839 ; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618 ; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505 ; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200 ; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200 ; Vasil, I.K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937 ; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084 ; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594 ; WO92/14828) 。特に、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、単子葉植物における極めて有効な形質転換法としても、現在、出現している（Hieiら（1994) The Plant Journal 6, 271-282) 。
【００８９】
繁殖できるトランスジェニック植物の生産は、穀類コメ、トウモロコシ、コムギ、オート、及びオオムギにおいて達成されている（Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162. ; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674 ; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4) : 653-671 ; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702に報告される）。
【００９０】
マイクロプロジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接的取込みは、アグロバクテリウムが無能又は無効である場合に好ましい。あるいは、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリウムコート化マイクロパーティクルでのボンバードメント（ＥＰ−Ａ−４８６２３４）又は傷を誘導するためのマイクロプロジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリウムとの同時培養を形質転換過程の効率を増強するために用いることができる。
【００９１】
ブラシカ・ナプス形質転換はMoloney ら（1989) Plant Cell Reports 8 : 238-242に記載される。
形質転換の後、植物は、例えば単細胞、カルス組織又は葉ディスクから、当該技術分野で標準であるように再生することができる。ほぼいずれの植物でも、植物の細胞、組織及び器官から完全に再生することができる。利用できる技術は、Vasil ら（Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II及びIII, Laboratory Procedure and Ther Applications, Academic Press, 1984)及びWeissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989に報告される。
【００９２】
形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換する効率並びに選択された特定の方法で本発明を実施するヒトの経験及び好みにより決定されよう。植物細胞に核酸を導入するための形質転換システムの特定の選択は本発明に本質的でなく、又は本発明を限定するものでもなく、また植物再生のための技術の選択でもないことは当業者に明らかであろう。
【００９３】
本発明において、過剰発現は、センス方向にヌクレオチド配列を導入することにより達成することができる。これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で核酸から本発明による核酸の発現を引きおこし又は許容することを含む方法を供する。
遺伝子産物ポリペプチドの下降発現は、アンチセンス技術又は“センス制御”を用いて達成することができる。アンチセンス遺伝子又は部分的遺伝子配列の遺伝子発現を下降制御するための使用は現在、十分に確立されている。ＤＮＡは、そのＤＮＡの“アンチセンス”鎖の転写が標的遺伝子の“センス”鎖から転写される通常のｍＲＮＡに相補的であるＲＮＡを作り出すように、プロモーターの制御下におかれる。二本鎖ＤＮＡのために、これは、コーディング配列又はそのフラグメントをプロモーターの制御下に“逆方向”におくことにより達成される。相補的アンチセンスＲＮＡ配列は、次に、ｍＲＮＡと結合して二本鎖を形成し、標的遺伝子からの内因性ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害すると考えられる。これが、実際の作用の態様であるか否かはまだ不確かである。しかしながら、技術は確立されている。例えば、Rothstein et al, 1987 ; Smith et al, (1988) Nature 334, 724-726 ; Zhang et al, (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188 。Antisense technology is also reviewed in reviewed in Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, and Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496を参照のこと。
【００９４】
逆方向にあるコーディング配列に対応する完全な配列は用いる必要はない。例えば、十分な長さのフラグメントを用いることができる。アンチセンス阻害のレベルを最適にするためにコーディング配列の種々の部分から種々の大きさのフラグメントをスクリーニングすることは当業者にとって慣用的な事項である。開始メチオニンＡＴＧコドン、及びおそらくその開始コドンの上流に１又は複数のヌクレオチドを含めることが有利であり得る。更なる可能性は、遺伝子の調節配列、例えば耐性が要求される１又は複数の病原体中に１又は複数の遺伝子の特徴的な配列を標的にすることである。適切なフラグメントは、少くとも約１４〜２３ヌクレオチド、例えば約１５，１６もしくは１７又はそれ超、少くとも約２５、少くとも約３０、少くとも約４０、少くとも約５０、又はそれ超のヌクレオチドを有し得る。他のフラグメントは、少くとも約３００ヌクレオチド、少くとも約４００ヌクレオチド、少くとも約５６０ヌクレオチド、少くとも約６００ヌクレオチド、少くとも約７００ヌクレオチド又はそれ超であり得る。このようなセンス方向のフラグメントは、同時抑制に用いることができる（以下を参照のこと）。
【００９５】
配列の全体の相補性は本質的ではないが、好ましい。１又は複数のヌクレオチドは標的遺伝子からアンチセンス構成物において異なり得る。特に植物細胞中に存在する条件下で、各々のアンチセンス及びセンスＲＮＡ分子がハイブリダイズするために十分な相同性があることが好ましい。
これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で本発明による核酸からのアンチセンス転写を引きおこし又は許容することを含む方法も供する。
【００９６】
標的遺伝子の更なるコピーが標的遺伝子と同じ方向であるセンス方向で挿入される場合、標的遺伝子からのタンパク質の過剰発現がおこる個体及び下降発現がおこるいくらかの個体を含む所定範囲の表現型が作られる。その挿入された遺伝子が内因性遺伝子の一部だけである場合、トランスジェニック集団中の下降発現する個体の数は増加する。センス制御、特に下降制御がおこるメカニズムは十分に理解されていない。しかしながら、この技術は、科学及び特許文献にも十分に報告され、遺伝子制御のために慣用的に用いられる。例えば、van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299 ; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289 ; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, and US-A-5,231,020も参照のこと。
【００９７】
これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で本発明による核酸からの発現を引きおこし又は許容することを含む方法も供する。これは、成長に影響を与えるために用いることができる。
本発明の態様及び実施形態は、添付の図面を引用して例により詳述されよう。更なる態様及び実施形態は当業者に明らかであろう。本明細書に言及される全ての文献は引用により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
以前に、我々は、アラビドプシスのＧＡＩ遺伝子をクローン化した（ＰＣＴ／ＧＢ９７／００３９０−ＷＯ９７／２９１９３，１９９７年８月１４日公開）。野生型（ＧＡＩ）のＤＮＡ配列と変異体（ｇａｉ）対立遺伝子との比較は、ｇａｉが、タンパク質のＮ末端近くからの１７アミノ酸のセグメントを欠如する変異体の予想されるタンパク質産物（ｇａｉ）をコードすることを示した。ＤＮＡ配列データベースのＧＡＩ配列でのスクリーニングは、ｇａｉタンパク質中のＧＡＩから削除されたセグメントのものに極めて密接に関連した配列の領域を含むコメＥＳＴ（Ｄ３９４６０）の存在を示した。領域ＤＥＬＬＡ（配列番号１０７）からＥＱＬＥ（配列番号１０８）への予想されるアミノ酸配列の比較は両方の配列で同じである。２つの差（Ｖ／Ａ；Ｅ／Ｄ）は保存性置換であり、ここで、１つのアミノ酸残基は極めて類似した化学特性を有する別のものに置換されている。更に、同一性の領域はｇａｉタンパク質内の欠失領域の境界を超えて広がっている。配列：
【００９９】
【化１３】
はｇａｉ中の欠失により影響を受けないが、ＧＡＩ（配列番号７８）とＤ３９４６０配列（配列番号７９）との間で完全に保存されている。
Ｄ３９４６０の約７６０bpのＳａｌＩ−ＮｏｔＩサブフラグメントを、コムギｃＤＮＡ及び（種々のＣｈｉｎｅｓｅ ＳｐｒｉｎｇからのＤＮＡから作った）ゲノムライブラリーから並び（系統Ｂ７３Ｎから作った）トウモロコシゲノムライブラリーからハイブリダイズするクローンを単離するために低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション実験に用いた。Ｃ１５−１及びＣ１５−１０（ｃＤＮＡ）、並びに５ａｌ及び１４ａｌ（ゲノムクローン）を含むいくつかのコムギクローンを単離した。クローンＣ１５−１は遺伝子マッピング実験に用いられている。零染色体−４染色体分析は、クローンＣ１５−１がコムギ染色体４Ａ，４Ｂ及び４Ｄ由来のゲノムＤＮＡフラグメントとハイブリダイズすることを示した。これは、Ｒｈｔ座がグループ４染色体にマッピングされるので、Ｒｈｔ配列を含むクローンＣ１５−１と一致する。更に、Ｒｈｔ−Ｄｌｂ（以前はＲｈｔ２）対立遺伝子について分離する集団を用いる組換え体分析は、変異体対立遺伝子との完全な同時分離を示すハイブリダイズするフラグメントを同定した。これは、グループ４染色体の（Ｒｈｔを含むことが既に知られていた）２cMセグメント内のｃＤＮＡ Ｃ１５−１中のｍＲＮＡ配列をコードする遺伝子のゲノム位置に位置し、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンが実際Ｒｈｔ遺伝子を含むという強力な証拠を供した。ここで開示されるトウモロコシＤ８ ＤＮＡ配列は１ａｌからのサブクローン化した隣接１．８kb及び３．０kb ＳａｌＩフラグメント（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM ＳＫ+ にクローン化したもの）からのものである。ここで開示されるコムギＲｈｔ配列はクローン５ａｌから（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM ＳＫ+ にクローン化した）５．７kb ＤｒａＩサブフラグメントである。
【０１０１】
配列番号５７は、ｃＤＮＡ Ｃ１５−１の完全な（シングルパス）ＤＮＡ配列を供する。我々は、Ｃ１５−１０のためのＤＮＡ配列も得て；それはＣ１５−１のものと同一であり、それゆえ示さない。配列番号５８〜７０及び配列番号７１〜７７はクローン１４ａｌ及び５ａｌからの個々の配列決定のランからのオリジナルのデータを示す。配列番号５７〜７７に示す配列は、配列番号３に示す複合ＤＮＡ配列を作るために重複させることができる。この配列は、配列番号２に示すＧＡＩのもの（ＧＡＩ）との、コムギ配列の予想される翻訳産物（Ｒｈｔ）のアミノ酸配列（配列番号１）の比較により示される通り、アラビドプシスＧＡＩのものとの強力な相同性を示す。特に、仮定上のＲｈｔの予想されるアミノ酸配列は、ｇａｉ内で失った領域中にわたってＧＡＩとの近同一性の領域を示す。図４（配列番号１，２，２０）は、コメＥＳＴ内のｇａｉ削除領域を超えて広がる相同性がＲｈｔ（
【０１０２】
【化１４】
）内でも保存されていることを示し、これにより、この領域は、ｇａｉ欠失において見い出されるものに加えて、ＧＡシグナル伝達に関連することを示す。この領域は、ＧＡＩに配列において関連するがＧＡシグナル伝達には関連しない他のタンパク質であるＳＣＲにおいて見い出されない。上述の配列決定実験に用いたプライマーを表１に示す（配列番号２１〜５５）。
【０１０４】
これらの配列が実際にコムギＲｈｔ及びトウモロコシＤ８座であることの更なる確認は、以下の通り、種々の変異体対立遺伝子からの遺伝子配列の分析により得られている。
本発明者らは、そのクローンを得て配列決定し、コメＥＳＴ Ｄ３９４６０としてデータベースに基づいて同定した。この研究から生じた予想されるアミノ酸配列を各々配列番号１２及び配列番号５に示す。
【０１０５】
アラビドプシスのＧＡＩ遺伝子に基づく以前の研究は、ＧＡＩタンパク質が２つのセクション、周知の機能のいずれかのタンパク質とも相同性を示さないＮ末端半分、及びアラビドプシスＳＣＲ候補転写因子（Pengら、(1997) Genes and Development 11 : 3194-3205 : PCT/GB97/00390) と広範囲の相同性を示すＣ末端半分からなることを示した。上述の通り、タンパク質のＮ末端半分の一部分の欠如はｇａｉ変異体対立遺伝子のＧＡ応答特性を減少させる（Pengら、1997 ; PCT/GB97/00390)。それゆえ、本発明者らは、Ｄ８及びＲｈｔが各々アラビドプシスＧＡＩのトウモロコシ及びコムギ機能的相同体（オルソロガス）であるなら、Ｄ８及びＲｈｔの優性変異体対立遺伝子は、それらがコードするタンパク質のＮ末端セクションに作用する変異も引きおこすはずである。
【０１０６】
先の報告は、いくつかのＤ８において及びＲｈｔにおいて優性な変異体対立遺伝子、特にＤ８−１，Ｄ８−２０２３及びＲｈｔ−Ｄｌｃ（以前はＲｈｔ１０）を記述する（Boerner ら、(1996) Euphytica 89 : 69-75 ; Harberd and Freeling (1989) Genetics 121 : 827-838 ; Winkler及びFreeling (1994) Planta 193 : 341-348) 。それゆえ、本発明者らは、これらの変異体から候補Ｄ８／Ｒｈｔ遺伝子をクローン化し、そのタンパク質のＮ末端半分をコードする遺伝子の部分をＤＮＡ配列決定することにより検査した。
【０１０７】
Ｄ８／Ｒｈｔタンパク質のＮ末端半分の一部をコードする候補Ｄ８又はＲｈｔ遺伝子のフラグメントを、Ｄ８−１，Ｄ８−２０２３及びＲｈｔ−Ｄｌｃを含む植物のゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより、増幅のための次のプライマーを用いて増幅した：Ｄ８−１のためにプライマーＺＭ−１５及びＺＭ−２４；Ｄ８−２０２３のためにプライマーＺＭ−９及びＺＭ−１１；Ｒｈｔ−Ｄｌｃのために、ネスティドＰＣＲを、Ｒｈｔ−１５及びＲｈｔ−２６、次にＲｈｔ−１６及びＲｈｔ−２を用いて行った。ＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｇｅｎｃＡｍｐ ＸＬ ＰＣＲキットを用いて、以下の条件を用いて行った：反応を９４℃で１分、インキュベートし、次に９４℃，１５秒−Ｘ℃，１５秒−６９℃，５分の１３サイクル（ここで、Ｘは６４℃で始めてサイクル当り１℃減少させ５２℃で終える）、次に９４℃，１５秒−５３℃，１５秒−６５℃，５分の２５サイクル、次に７０℃で１０分でインキュベートした。これらのフラグメントを、次にｐＧＥＭR −Ｔ Ｅａｓｙベクター（Promega, Technical Manual を参照のこと）にクローン化し、それらのＤＮＡ配列を決定した。
【０１０８】
上述の変異体の各々において候補Ｄ８及びＲｈｔ遺伝子中で変異を見い出した。Ｄ８−１変異はアミノ酸ＶＡＱＫ（５５−５９）（配列番号１０１）を除去し、Ｇを加える枠内欠失である（配列番号１６及び配列番号９の配列を参照のこと）。この欠失は上述の保存された
【０１０９】
【化１５】
相同性ブロックと重複する。Ｄ８−２０２３はＤ８タンパク質のＮ末端からアミノ酸
【０１１１】
【化１６】
を除去する別の枠内欠失変異である（配列番号１７及び配列番号１０を参照のこと）。この欠失は、ｇａｉ又はＤ８−１内の欠失と重複しないが、ＧＡＩ，Ｄ８及びＲｈｔ間で高度に保存された別の領域をカバーする（配列番号２，５，７を参照のこと）。最後に、Ｒｈｔ−Ｄｌｃは、それがコードする変異体Ｒｈｔタンパク質のＮ末端領域内のアミノ酸
【０１１３】
【化１７】
を除去する別の小さな枠内欠失を含む（配列番号１８及び配列番号１１を参照のこと）（ＬＮ−ＰはＧＡＩ，Ｄ８及びＲｈｔ間で保存されている。配列番号２，５，７を参照のこと）。
これにより、上述の変異体対立遺伝子の全ては優性であり、ＧＡ応答性の減少に関連した矮性を与える。全部で３つのこれらの対立遺伝子は、それらがコードするタンパク質のＮ末端半分の一部分を除去する欠失変異を含む。これらの観察結果は、トウモロコシ及びコムギのＤ８及びＲｈｔ遺伝子がクローン化されていることを示す。
【０１１５】
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｆｉｇｕｒｅ１：白抜きで示す相同性の領域を伴う、コメＥＳＴ Ｄ３９４６０（Ｏ８３０）（配列番号７９）とのＮ末端の予想されるＧＡＩアミノ酸配列（Ｇａｉ）（配列番号７８）のアラインメント。
【図２】 Ｆｉｇｕｒｅ２：Ｃ１５−１，１４ａｌ及び５ａｌからのＤＮＡ配列。
Ｆｉｇｕｒｅ２ａは、保存性ＤＮＡ配列ｃＤＮＡ Ｃ１５−１（シングル・パス配列決定により得たもの）（配列番号５７）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ２ｂは、１４ａｌからのもとのＤＮＡ配列決定ランからのデータを示す（シングルパス）（配列番号５８〜７０）。
Ｆｉｇｕｒｅ２ｃは、５ａｌからのもとのＤＮＡ配列決定ランからのデータを示す（シングルパス）（配列番号７１〜７７）。
【図３】 Ｆｉｇｕｒｅ３：Ｒｈｔ配列。
Ｆｉｇｕｒｅ３ａは、コーディング配列を含む、図２におけるデータ由来のコムギＲｈｔ遺伝子の複合ＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。
Ｆｉｇｕｒｅ３ｂは、アラビドプシスの全体の予想されるＧＡＩタンパク質配列（Ｇａｉ）（配列番号２）との、図２のコーディング配列によりコードされる全体の予想されるＲｈｔタンパク質配列（ｒｈｔ）（配列番号１）のアラインメントを示す。配列同一性の領域を白抜きで示す。
【図４】 Ｆｉｇｕｒｅ４：Ｄ３９４６０配列。
Ｆｉｇｕｒｅ４ａは、コメｃＤＮＡ Ｄ３９４６０のＤＮＡ配列（シングルパス）（配列番号１９）を示す。このｃＤＮＡは、それが得られるｍＲＮＡの３′末端を失っている不完全な部分的クローンである。
Ｆｉｇｕｒｅ４ｂは、全体の予想されるＲｈｔタンパク質（コムギ−図２のコーディング配列によりコードされる）（配列番号１）の、ＧＡＩのもの（Ｇａｉ）（配列番号２）及び図４ａのＤＮＡ配列から予想されるコメタンパク質配列（配列番号２０）とのアラインメントを示す。アミノ酸同一性の領域を白抜きで示し；いくつかの保存性置換を陰で示す。
【図５】 Ｆｉｇｕｒｅ５：ジベレリンの基本的炭素環構造。
【図６】 Ｆｉｇｕｒｅ６：コメＥＳＴ配列。
Ｆｉｇｕｒｅ６ａは、本発明により決定した。コメＥＳＴ Ｄ３９４６０のヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ６ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ６ａのコメＥＳＴ配列によりコードされる予想されるアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図７】 Ｆｉｇｕｒｅ７：コムギＣ１５−１ｃＤＮＡ。
Ｆｉｇｕｒｅ７ａは、コムギＣ１５−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ７ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ７ａのコムギＣ１５−１ｃＤＮＡの予想されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図８】 Ｆｉｇｕｒｅ８：コムギ５ａｌゲノムクローン。
Ｆｉｇｕｒｅ８ａは、５ａｌコムギゲノムクローンのヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ８ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ８ａの５ａｌコムギゲノムクローンの予想されるアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図９】 Ｆｉｇｕｒｅ９：トウモロコシゲノムクローン。
Ｆｉｇｕｒｅ９ａは、１ａｌトウモロコシゲノムクローン、即ちＤ８のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ９ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ９ａのトウモロコシ１ａｌゲルクローンのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図１０】 Ｆｉｇｕｒｅ１０は、トウモロコシＤ８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）の、コムギＲｈｔポリペプチド（配列番号７）、本発明者らにより決定されたコメＥＳＴ配列及びアラビドプシス・タリアナＧａｉポリペプチド（配列番号２）とのＰＲＥＴＴＹＢＯＸアラインメントを示す。
【図１１】 Ｆｉｇｕｒｅ１１：トウモロコシＤ８対立遺伝子の配列。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ａは、トウモロコシＤ８−１対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ｂは、トウモロコシ対立遺伝子の部分的アミノ酸配列（配列番号９）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ｃは、トウモロコシＤ８−２０２３対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１１ｄは、トウモロコシＤ８−２０２３対立遺伝子の部分的アミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１２】 Ｆｉｇｕｒｅ１２：コムギｒｈｔ−１０対立遺伝子。
Ｆｉｇｕｒｅ１２ａは、コムギｒｈｔ−１０対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１２ｂは、コムギｒｈｔ−１０対立遺伝子の部分的アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
Claims (41)
- トリチクム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ａｅｓｔｉｖｕｍ）植物中での発現に基づいて該植物の成長を阻害するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該阻害がジベレリンにより拮抗され、ここで該ポリペプチドが、以下の：
（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるトリチクム・アエスチブムのＲｈｔポリペプチド；又は
（ｂ）１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加によりポリペプチド（ａ）から生じるポリペプチド、
であることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドが、（ｂ）であり、且つ配列番号１０４に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドが、（ｂ）であり、且つ１７個のアミノ酸の隣接配列を含み、ここで該配列中の少くとも１０の残基が、配列番号１０４に示すアミノ酸配列中の対応する位置の残基に対してアミノ酸の保存性変異を有するか又は同一性を示すことを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドが（ｂ）であり、且つ１７個のアミノ酸の隣接配列を含み、ここで該配列中の１６残基が配列番号１０４に示すアミノ酸配列中の対応する位置の残基とアミノ酸同一性を示すことを特徴とする請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号７に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号１４に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- トウモロコシＤ８ポリペプチドについての配列番号８に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号１５に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号５に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号１２に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるｒｈｔヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該ｒｈｔヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるトリチクム・アエスチブムのＲｈｔポリペプチドのアミノ酸配列から配列番号１０４に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるｒｈｔヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該ｒｈｔヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるトリチクム・アエスチブムのＲｈｔポリペプチドのアミノ酸配列から配列番号１０３に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるｒｈｔヌル変異体表現型 植物中での発現に基づいて該ｒｈｔヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列から配列番号１０６に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるｒｈｔヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該ｒｈｔヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号１５に示すコーディングヌクレオチド配列から配列番号１０６に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドが削除されたヌクレオチド配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるｒｈｔヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該ｒｈｔヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列から配列番号１０１に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるｒｈｔヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該ｒｈｔヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列から配列番号１０２に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリペプチド。
- 配列番号１０４に示すアミノ酸配列が削除されている、配列番号７に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号１４に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１０４に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドが削除されていることを特徴とする請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが発現のための調節配列に作用可能に連結していることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
- 前記調節配列が、誘導性プロモーターを含むことを特徴とする請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含み、植物細胞の形質転換のために適した核酸ベクター。
- 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の異種ポリヌクレオチド又は核酸ベクターを含む宿主細胞。
- 微生物である請求項２２に記載の宿主細胞。
- 植物細胞である請求項２２に記載の宿主細胞。
- 染色体内に異種の前記ポリヌクレオチドを有する請求項２４に記載の植物細胞。
- 半数体ゲノム当り１超の前記ポリヌクレオチドを有する請求項２５に記載の植物細胞。
- 植物、植物の一部もしくは植物の零余子、又は植物の抽出物もしくは誘導体内に含まれる請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の植物細胞。
- 請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の細胞を生産する方法であって、前記ポリヌクレオチド又は核酸ベクターを形質転換により前記細胞に組み込むことを含む、前記方法。
- 前記ポリヌクレオチドを、細胞ゲノム核酸で、安定に中に組み込まれるように組換えることを含む請求項２８に記載の方法。
- １又は複数の形質転換された細胞から植物を再生することを含む請求項２８又は２９に記載の方法。
- 請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の植物細胞を含む植物。
- 請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の植物細胞を含む植物の一部又は零余子。
- 植物を生産する方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は核酸ベクターを植物細胞に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む、前記方法。
- 前記植物細胞から再生された前記植物の子孫又は派生物を有性又は無性生殖により繁殖させ又は増殖させることを含む請求項３３に記載の方法。
- 植物の特徴に影響を与える方法であって、該植物の細胞内で、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の異種ポリヌクレオチドからの発現を引きおこし又は許容することを含む、前記方法。
- トランスジェニック植物の生産における請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項２１に記載のベクターの使用。
- 請求項１に記載のポリヌクレオチドを同定し又は得る方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに由来するヌクレオチド配列から成る核酸分子を用いて候補核酸をスクリーニングすることを含む、前記方法。
- ＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
- 前記プライマーが、配列番号２１〜５５及び８０〜１００に示すプライマーから選択されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
- 請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド。
- 請求項４０に記載のポリペプチドについての特定の結合アフィニティーを有する抗原結合部位を含む抗体。
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