CN104177481B

CN104177481B - 植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104177481B
Application number: CN201310189177.6A
Authority: CN
Inventors: 金危危; 董朝斌; 陈晓阳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-05-21
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2033-05-21
Also published as: CN104177481A

Abstract

本发明公开了一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用。所述蛋白ZmLA1来源于玉米（Zea mays L.），由序列表序列1所示的氨基酸序列组成。本发明所提供的蛋白质或所述基因可用于调控目的植物如下四种性状中至少一种的应用：生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎秆抗倒伏能力和花器官发育；所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种。本发明所提供的基因和蛋白在植物茎秆抗倒伏性、理想株型、花器官形态等一系列与产量直接相关性状的改良中具有广阔的应用前景。

Description

植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用。

背景技术

作为最早为人类认识的植物激素，生长素广泛参与植物生长发育过程的各个阶段。生长素的合成主要以两种方式进行：色氨酸依赖途径和非色氨酸依赖途径。其合成部位主要包括植物顶端分生组织、叶原基、萌发的种子及花粉等新形成的组织。相较于生长素局部区域合成这一特性，生长素极性运输(PAT)是引起植物生长素不均一分布的更主要原因。生长素运输不同于其它植物激素，是以一种极性运输的方式进行，即体内运输方向是单向的，只能从植物体形态学上端向形态学下端运输。通过这种极性运输建立起的生长素浓度梯度特异介导了植物一系列生物学反应，如：细胞伸长、细胞分化、根的伸长、向光性、重力性、顶端优势、花分化和果实形成等。这个过程需要两类生长素运输载体：输入载体和输出载体。拟南芥中已鉴定的生长素输入载体主要有四类：AUX1,LAX1,LAX2和LAX3(类AUX1蛋白)。而输出载体主要包括PIN蛋白家族，在拟南芥中现已鉴定出8个PIN基因，它们可分为两类：长PIN蛋白（PIN1,2,3,4和7）主要定位于细胞质膜上，介导生长素细胞间极性运输；短PIN蛋白（PIN5,6和8）则定位于内膜系统上，介导生长素的胞内运输。

拟南芥输出载体除了PIN蛋白家族外，最近研究发现多重抗药性/磷酸糖蛋白家族(multidrug-resistant/P-glycoprotein，MDR/PGP，ABCB)也参与了生长素极性运输。它是ATP结合盒(ATP—binding cassette，ABC)转运蛋白超级家族中的一个亚家族。其中，PGP1(ABCB1)是最早被发现与生长素极性运输相关的PGP家族成员。另外，PGP4（MDR4）和PGP19(MDR1/ABCB19)也分别被证明作用于植物生长素的极性运输。

植物重力性反应体现为地上部正向重力性反应和根负向重力性两部分，正常的重力性反应对根和地上部各器官的形态发育和生物学功能是必需的。早在近一个世纪之前，人们就提出Cholodny–Went假说，认为生长素的不对称分布是导致植物向重性和向光性等向性运动的原因。Li等也证明烟草向性运动相应部位发生了生长素的不对称分布。生长素还参与调节拟南芥根的重力性反应，这些结果都正面支持了Cholodny–Went假说的正确性。

近年来对于生长素介导植物根重力性生长的研究报道不断涌现。根中生长素的极性分布依赖于AUX1蛋白，aux1突变体表现为根重力性完全丧失。PGP4也参与拟南芥根中生长素运输，pgp4突变体根中生长素向基运输速度明显降低，根向重性反应也随之钝化。最近root growth factors(RGFs)分泌肽家族成员和phosphatidylinositolmonophosphate 5-kinase 2(PIP5K)分别被证明通过调控生长素输出载体的胞内循环来调节植物地上和地下多器官的重力性反应。水稻LAZY1负向调控生长素极性运输，相应的水稻和拟南芥lazy1突变体都表现为地上部重力性反应减弱并伴随分枝角度增大。最近研究者提出一个“tipping point”机制,证明在重力性弯曲生长过程中，一定倾斜角度可作为触发点，引起生长素极性运输流向发生反转，充分证明了生长素极性运输与重力性反应的直接相关性。

生长素极性运输参与的另外一个重要生物学过程是调控分生组织发育和花器官形态建成。以玉米为例，花器官包含雄穗，发育自顶端分生组织；雌穗，发育自雄穗数个节下的腋生分生组织。除着生位置不同外，雌雄穗表现出不完全相同的发育模式，其中雄穗发育包含四种类型的分生组织：特异的分枝分生原基(branch meristem，BM),小穗对分生原基(spikelet pair meristems，SPMs),小穗分生原基(spikeletmeristems，SMs)和小花分生原基(floral meristems，FMs)，然而雌穗发育仅包含SPMs,SMs和FMs。通过对一系列玉米雌雄穗生长素运输相关基因的研究，发现特异的生长素浓度梯度对各级分生原基的生长分化都是必不可少的。玉米生长素输出载体ZmPIN1a和ZmPIN1b特异定位于顶端分生组织和腋生组织的表皮细胞层中，预示着生长素极性运输在花器官起始发育中的重要作用。玉米Barren inflorescence2(Bif2)编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINOID(PID)同源蛋白，通过调控PIN蛋白亚细胞极性定位控制生长素极性运输，且此作用过程在玉米和拟南芥中是保守的。bif2突变则引起雌穗籽粒数减少且雄穗分枝数和小花数明显减少。另外一个半显性bif1突变体中，腋生分生组织的生长素运输速率降低，造成与bif2相似的表型。basic helix–loop–helix（bHLH）转录因子Barren stalk1(Ba1)参与了玉米腋生分生组织的起始过程，且ba1突变体表现为雌穗、雄穗分枝、小花完全缺失。BA1特异表达于花器官分生组织的边界处，并介导形成了局部的生长素浓度梯度，但BA1在生长素极性运输调控途径中的上下游位置尚存争议。

除了生长素极性运输，通过生长素的局部合成建立的生长素浓度梯度也在玉米花器官发育中起重要作用。玉米sparse inflorescence1(spi1)编码黄素单氧酶，其介导催化Trp依赖性生长素合成途径中的限速步骤，与拟南芥YUCCA基因同源，参与腋生分生组织和侧生器官的生长分化，最终完成花器官的形态建成。另一个生长素合成基因vanishing tassel2(vt2)同样为花器官的腋生分生组织发育所必需。遗传学分析表明生长素极性运输与局部组织中的生物合成能协同作用于调控玉米花器官发育过程。

尽管大量研究已明确表明生长素在重力性反应和花器官发育中的重要作用，但还没有同时参与这两个过程调控基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用。

本发明所述蛋白质ZmLA1，来源于玉米（Zea mays L.），是如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物倒伏和/或花器官发育相关的由（a）衍生的蛋白质。

序列表序列1所示的氨基酸序列由413个氨基酸残基组成，其中，第70-90位氨基酸肽段为跨膜结构域，第275-298位、第338-345位两段肽段为罗宾逊（Robinson）核定位信号。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质的编码基因为如下1）-4）基因中的任意一种：

1）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

序列表序列2为蛋白质ZmLA1的编码序列。序列表序列3为玉米基因组DNA上编码序列2的基因。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。

含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

所述重组载体具体可为在pCAMBIA3301-UbiN的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入所述基因得到的重组载体M。

本发明所提供的蛋白质和所述基因可用于调控目的植物如下四种性状中至少一种的应用：生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎秆抗倒伏能力和花器官发育；

所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种；

所述茎秆抗倒伏能力为遗传背景相同的植物在一定生长条件下，茎秆直立生长的植株的茎秆抗倒伏能力高于相同生长条件下茎秆匍匐生长的植株。

所述调控包括促进（如提高、增加或缩短）和抑制（降低、减少或延长）两个方面。

本发明提供一种获得具有如下至少一种表型植物的方法，包括降低所述植物中所述蛋白表达、和/或抑制所述基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率提高，生长素侧向运输效率降低，茎秆抗倒伏能力降低，雌穗花期延迟、雄穗花期延迟、雄穗分枝数减少、雌穗穗柄长度降低、花丝鲜重降低、果穗长度降低、结实率降低。

本发明还提供一种获得具有如下至少一种表型植物的方法，包括提高所述植物中所述蛋白表达、和/或促进所述基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。

本发明还提供一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比具有如下至少一种表型的转基因植物：

生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。

所述导入是通过所述重组载体M实现的。

在上述方法或应用中，所述目的植物或植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为玉米。

本发明还提供如下A）—C）中任一种引物对或引物对组合物及其在玉米育种中应用：

A）引物对M4和引物对M5；

B）引物对M4；

C）引物对M5；

所述引物对M4由序列表序列4所示的单链DNA和序列表序列5所示的单链DNA组成；

所述引物对M5由序列表序列6所示的单链DNA和序列表序列7所示的单链DNA组成。

本发明通过图位克隆获得控制玉米地上部重力性缺失突变体即匍匐（或倒伏）表型突变体的功能基因为序列表序列2和3所示的基因，该基因编码序列表序列1所示的蛋白，并通过表型研究及其表达模式研究揭示蛋白ZmLA1在花器官发育和生长素极性运输中的重要作用。本发明所提供的基因和蛋白在植物茎秆抗倒伏性、理想株型、花器官形态等一系列与产量直接相关性状的改良中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为玉米突变体ps1和玉米自交系Mo17的BC3F2分离群体中直立型（左）和匍匐型（右）单株在7—8叶期的植株表型。

图2为ZmLa1基因的精细定位图。

图3为等位基因突变位点图。

图4为直立型单株雌穗表型（左）和匍匐型单株雌穗表型（右）图。

图5为直立型单株雄穗表型（左）和匍匐型单株雄穗表型（右）图。

图6为ZmLA1蛋白的亚细胞定位结果。其中，图A为质壁分离前的结果，图B为质壁分离后的结果，图中的第一列为暗示场下的结果，第二列为明示场下的结果；标尺代表100μm；图A中，从上至下第一行为转化空载体35S：：EGFP的结果；第二行为转化全长ZmLA1与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LA）；第三行为转化去除NLS1的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LAΔ NLS1）；第四行为转化去除NLS1和NLS2的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LAΔ NLS1NLS2）；第五行为转化去除从NLS1至蛋白末尾的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LAΔ NLS1-to-end）；第六行为转化去除TMD的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体（LAΔ TMD）；图B中，从上至下各行依次为LA、LAΔ NLS1、LAΔ NLS1NLS2、和LAΔ NLS1-to-end的质壁分离结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米自交系B73（以下简称B73）：文献：Schnable PS,et al.The B73 maize genome:complexity,diversity,and dynamics.Science.2009;326(5956):1112-5。公众可从中国农业大学获得。

玉米自交系Mo17（以下简称Mo17）：文献：Brunner S,Fengler K,Morgante M,et al.Evolution of DNA sequence nonhomologies among maize inbreds[J].ThePlant Cell,2005,17(2):343-360。公众可从中国农业大学获得。

玉米突变体la1-PI239110（以下简称la1-1）：玉米遗传协作种质资源库（MaizeGenetics Cooperation Stock Center，http://www.maizegdb.org/cgi-bin/displaystockrecord.cgi?id=14199突变体编号405B）；

玉米突变体la1-MTM4659（以下简称la1-2）：玉米遗传协作种质资源库（MaizeGenetics Cooperation Stock Center，http://www.maizegdb.org/cgi-bin/displaystockrecord.cgi?id=9018815突变体编号406F）；

玉米突变体la1-05HI-RnjxW22GN-333（以下简称la1-3）：玉米遗传协作种质资源库（Maize Genetics Cooperation Stock Center，http://www.maizegdb.org/cgi-bin/displaystockrecord.cgi?id=9018817突变体编号406E）。

实施例1、ZmLA1蛋白及其编码基因的获得

一、玉米突变体ps1的获得及其突变表型的遗传分析

1、玉米突变体ps1的获得

本发明研究小组以玉米自交系综31（Hui Y,Guoying W,Jingrui D.Transformation of Maize Elite Inbred Lines[J].Journal of AgriculturalBiotechnology,2001,4:008.）为背景材料，通过Mu9转座子系统构建了玉米突变体库，发现其中一个突变体（命名为ps1），通过与Mo17连续回交，BC3F2分离群体中具有正常和突变两种表型：

突变型（以下称匍匐表型或倒伏表型）：苗期植株地上部逐渐倾斜，至7片-8片叶期表现为重力性丧失，完全匍匐（或倒伏）于地面（如图1中的右图所示），近地端第一节间出现弯曲，两侧细胞伸长速度不一致。

正常型（以下称直立表型）：植株整个生长期均表现为茎秆直立（如图1中的左图所示）。

以下实验中的直立或匍匐表型均为在7片-8片叶期进行调查的结果。

2、玉米突变体ps1突变表型的遗传分析

杂交组合1及其衍生后代：以纯合突变体ps1（即自交后代匍匐表型不分离）为父本、与母本玉米自交系B73杂交，获得F1代，将该F1代自交获得F2代，将该F1代与母本B73回交获得BC1群体；

杂交组合2及其衍生后代：以纯合突变体ps1为父本、与母本玉米自交系Mo17杂交，获得F1代，将F1代自交获得F2代，将该F1代与母本Mo17回交获得BC1群体；

分别统计上述杂交组合其衍生后代中F2代群体中7片-8片叶期表现为匍匐或直立的单株数和分离比，结果如表2所示。

表2

表2的结果表明，玉米突变体ps1的7-8片叶期匍匐表型受隐性单基因（命名为ps1基因）控制。

二、ps1基因的初步定位及精细定位

1、初步定位

1）定位群体

取步骤一中杂交组合1的杂交F2代群体（其中具有匍匐表型的共609个单株）、杂交组合2的杂交F2代群体（其中具有匍匐表型的共678个单株）、纯合突变体ps1、玉米自交系B73和玉米自交系Mo17单株，分别取叶片按常规方法提取基因组DNA。

2）SSR多态性筛选

在F2代群体中，按表型性状随机抽取10个匍匐单株的DNA，混合，获得匍匐表型DNA池，随机抽取10个直立单株的DNA，混合，获得直立表型DNA池。用408个已公布的玉米SSR标记的引物对、分别以各杂交组合1和2中的父本和母本的基因组DNA和两个DNA池为模板，按照SSR标记所在的染色体为序，进行PCR扩增，选择扩增产物在各杂交组合中父本和母本间存在SSR多态性的引物对，并记录两个DNA池的带型。

3）SSR与目标性状或目标基因的连锁分析

用步骤2）的方式筛选至4号染色体，SSR标记umc2176和umc1117扩增产物在父本和母本间存在SSR多态性，且匍匐表型DNA池的带型与亲本纯合突变体ps1带型一致，直立表型DNA池的带型为两亲本的杂合。为了验证此结果，在F2代群体中，按表型为匍匐和直立的数量之比为1:3的性状比随机抽取62个单株的基因组DNA，使用SSR标记umc2176和umc1117的引物对以及umc2176和umc1117之间的新开发的SSR标记M1和M7的引物对，分别进行PCR扩增，记录每个引物对对每个单株的扩增结果（即带型或产物大小），将带型结果与匍匐或直立表型性状进行比对，结果显示，在这62个单株中，这4个引物对的带型结果与性状均相一致（即带型和性状均与母本、父本或F1代之一的带型和性状相同），证明这4个引物对与目的基因是连锁的，SSR标记umc2176和umc1117以及其M1和M7在玉米4号染色体上的位置如表3所示。

表3.初步定位得到的与ps1基因连锁的SSR标记

注：表中的产物大小是指以B73的基因组DNA为模板的扩增结果。

然后，取F₂群体中的所有匍匐表型植株的基因组DNA，分别用M1和M7引物对进行PCR扩增，记录带型并统计SSR标记与ps1基因之间发生单交换植株数、双交换植株数、不交换植株数，计算重组率，结果如表4和表5所示。

不交换：带型与匍匐表型的父本的带型一致；

双交换：带型与直立表型的母本的带型一致；

单交换：带型与F1单株的带型一致；

重组率=（单交换数+2×双交换数）/总数；

表4.初步定位得到的SSR标记在杂交组合1的F₂代匍匐表型植株中重组情况

SSR引物对	单交换数	双交换数	不交换数	总数	重组率（%）
						M1	8	0	603	609	1.31
M7	5	0	604	609	0.82

表5.初步定位得到的SSR标记在杂交组合2的F₂代匍匐表型植株中重组情况

SSR引物对	单交换数	双交换数	不交换数	总数	重组率（%）
						M1	11	0	667	678	1.62
M7	7	0	671	678	1.03

表3—5的结果表明：ps1基因在SSR标记M1和M7之间，距离是980Kb。

2、精细定位

1）根据玉米自交系B73全基因组物理图谱，在M1和M7两个SSR标记之间的980Kb区域，使用SSR Hunter软件查找SSR位点，设计SSR引物，获得35对SSR引物；

2）按照步骤1中2）的方法，从步骤1）获得的35对SSR引物中筛选得到在杂交组合1的亲本间具有多态性的引物4对，分别为M2、M3、M4和M6；在杂交组合2的亲本间存在多态性的引物4对，分别为M2、M3、M5和M6。该4对引物或标记的信息如表6所示。

表6.精细定位得到的在亲本间具有多态性的SSR标记

3）按照步骤1中3）的方法，将步骤2）筛选得到引物与F₂群体中所有匍匐表型单株进行连锁性分析，结果如表7和表8所示。

表7.精细定位得到的SSR标记在杂交组合1的F2匍匐表型植株中的重组情况

SSR引物对	单交换数	双交换数	不交换数	总数	重组率（%）
						M2	4	0	605	609	0.66
M3	1	0	608	609	0.16
						M4	1	0	608	609	0.16
M6	1	0	608	609	0.16

表8.精细定位得到的SSR标记在杂交组合2的F2匍匐表型植株中的重组情况

SSR引物对	单交换数	双交换数	不交换数	总数	重组率（%）
						M2	7	0	671	678	1.03
M3	3	0	675	678	0.44
						M5	1	0	677	678	0.15
M6	2	0	676	678	0.29

表6—8的结果表明：ps1基因位于M4和M5两个SSR标记之间，距离是56Kb。

三、目标区域中候选基因的分析

对ps1基因所在的56kb区间进行基因注释以及候选基因的生物信息学分析，结果表明该区域有8个潜在的开放阅读框（图2），其中只有一个有对应的EST序列GRMZM2G135019支持，其功能注释未知。对纯合突变体ps1、玉米自交系Mo17和B73、以及杂交组合1和2中的F2代群体中的匍匐表型和直立表型单株中编码GRMZM2G135019的基因组DNA进行测序分析。结果表明：ps1纯合突变体的扩增产物为在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第四个外显子上存在一个Mudr转座子插入（图3）。基于此，将GRMZM2G135019作为候选基因进行以下功能研究。

四、三个等位突变体的等位测验分析

1、等位性测验

玉米la1突变体是20世纪30年代首次报道的经典突变体，其地上部重力性缺失的表型与ps1突变体极为相似。将三个la1等位突变体la1-1、la1-2和la1-3，分别与ps1纯合突变体正反交，F1代植株均为匍匐表型。已知这三个la1突变体与ps1突变体均为隐性突变，综上可证明la1和ps1为等位突变，将发生突变的基因命名为ZmLa1基因，由于在步骤三中将GRMZM2G135019作为ps1基因的候选基因，因此，这里的ZmLa1基因即为GRMZM2G135019及编码该EST的基因组DNA。

2、突变位点差异分析

对三个la1突变体的基因组DNA分别在编码GRMZM2G135019的位置进行测序分析，结果：la1-1突变体是在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第三个外显子上存在4bp插入，造成转录提前终止；la1-2突变体是在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第四个外显子上存在25bp插入，造成转录提前终止；la1-3突变体是在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第一个内含子的剪接受体G单碱基突变为T，造成无法正确剪接（图3）。

步骤三和四的结果表明，所述四个等位突变体均在编码GRMZM2G135019的基因组DNA上发生了突变，证明ZmLa1基因及其表达的蛋白控制相同的匍匐突变性状。

五、蛋白ZmLa1及其编码基因的获得

提取玉米自交系B73的近地端第三茎节总RNA，反转录得到cDNA，然后以该cDNA为模板，使用引物pla-F:ATGAAGCTCCTGGGTTGGA和pla-R:CTACAGCTCCAGCACCAAGTATT进行PCR扩增，回收纯化1.2kb的扩增产物进行测序，结果该1.2kb的扩增产物的序列如序列表序列2所示。

将序列表的序列1所示的蛋白命名为ZmLA1蛋白（由413个氨基酸残基组成）。将ZmLA1蛋白的编码基因命名为ZmLa1基因。ZmLa1基因的开放阅读框（1242bp）如序列表的序列2所示。ZmLa1基因的基因组DNA如序列表的序列3所示，其中，含5个外显子，长度分别为：6bp（序列3的第2711-2818位），73bp（序列3的第3144-3216位），869bp（序列3的第4707-5572位），274bp（序列3的第8202-8475位），20bp（序列3的第8728-8747位）；含4个内含子，长度分别为：319bp（序列3的第2825-3143位），1487bp（序列3的第3217-4703位），2628bp（序列3的第5573-8201位），252bp（序列3的第8476-8727位），5’UTR（非翻译区）长度为108bp（序列3的第2711-2818位），3’UTR长度为501bp（序列3的第8748-9248位）。

实施例2、ZmLA1介导生长素的极性运输

一、生长素IAA向基极性运输测定

玉米自交系Mo17作轮回父本与纯合突变体ps1连续回交三代，再自交获得BC3F2群体。取分离出现的匍匐和直立单株的种子，28℃暗培养3天，取胚芽鞘，分别截取顶端2mm以下的2cm长的区段，每0.5cm用记号笔标记。将截取的区段放入1/2MS液体培养基中，在摇床上100转/分钟漂洗2.5小时，以去除内源IAA。用滤纸吸干胚芽鞘区段表面液体，将胚芽鞘区段的顶端分别进行如下三种处理（每个处理设三次重复，每个重复设5个胚芽鞘）：

处理A：插入10ul含有500nM的³H-IAA的0.35%的植物凝胶培养基中；

处理B：插入10ul含有500nM的³H-IAA和500nM生长素极性运输抑制剂NPA的0.35%的植物凝胶培养基中；

处理C：插入10ul含有500nM生长素类似物¹⁴C-BA的0.35%的植物凝胶培养基中（为了排除弱酸自由扩散对生长素的运输的影响）；

为避免胚芽鞘干燥失水，在胚芽鞘区段未施加生长素的一端涂抹少量的凡士林。然后将胚芽鞘区段于室温暗处放置2.5h，从未插入到培养基的一端截取0.5cm的胚芽鞘，放入新的离心管中，用1/2MS液体培养基快速漂洗2次，然后转入到含有2ml闪烁液（美国Perkin-Elmer/珀金埃尔默，产品目录编号6013591）的闪烁管中浸泡18-24h，用液闪仪（1450MicroBeta TriLux,Perkin-Elmer）计数，三次重复的平均值±标准差的结果如表10所示。

表10、³H标记的生长素（³H-IAA）的极性运输检测结果（单位：射线每分钟衰变次数，简称DPM）

处理	正常型（直立）	突变型（匍匐）
			A（³H-IAA）	10057.5±5350	41928±9563
B（³H-IAA+NPA）	2794±260	5619±233
			C（¹⁴C-BA）	1083±327	1120±20.5

向基运输是地上部中最主要的生长素极性运输形式。表10的³H标记的生长素（³H-IAA）极性运输实验结果表明，突变型向基运输效率明显提高，为野生型的4倍；且在生长素极性运输抑制剂NPA的影响下，这种向基运输效率明显提高的变化仍然存在。

二、IAA侧向运输测定

玉米自交系Mo17作轮回父本与纯合突变体ps1连续回交三代，再自交获得BC3F2群体。取分离出现的匍匐和直立单株的种子，28℃暗培养3天，取胚芽鞘，分别截取顶端2mm以下的1cm长的区段，放入1/2MS液体培养基中，在摇床上100转/分钟漂洗2.5小时，以去除内源IAA。用滤纸吸干胚芽鞘区段表面液体，将胚芽鞘区段水平放置于载玻片上，并使其顶端紧贴于含有500nM ³H-IAA的琼脂块（0.4×0.4×0.2cm）（设三次重复，每个重复设5个胚芽鞘），室温暗处放置2.5h后，将水平放置的胚芽鞘区段沿水平方向均分为上下两段，在2ml闪烁液的闪烁管中浸泡18-24h后，用液闪仪（1450MicroBeta TriLux,Perkin-Elmer）计数。结果如表11所示。

表11、³H标记的生长素（³H-IAA）的侧向运输检测结果（单位：DPM）

注：**表示同一类型单株上下两段的结果在p<0.01差异显著。

表11的结果表明，侧向运输过程中，正常型（直立）植株水平放置的胚芽鞘上下两侧（即竖直放置时的左右两侧）生长素呈不对称分布，而在突变型（匍匐）植株中仍为均匀分布，即突变型（匍匐）植株的生长素侧向运输效率降低。

实施例3、ZmLA1蛋白调控植物营养生长及生殖生长的组织发育

玉米自交系Mo17作轮回父本与纯合突变体ps1连续回交三代，再自交，将获得的BC3F2群体种植于大田，进行正常水肥管理，期间对分离出现的匍匐和直立表型的单株进行性状考察。结果表9所示，与直立表型单株相比，匍匐表型单株的株高极显著降低；通过对散粉和吐丝期的考察，匍匐单株雌雄穗花期分别延迟5天和7天以上；扫描电镜观察分化中的雌雄穗，发现同时期匍匐表型单株的小穗原基分化阶段滞后于直立表型单株，并出现穗行不整齐现象；分别统计雄穗分枝数，发现突变导致雄穗分枝数减少近3个；匍匐表型单株中雌雄穗小花数目明显减少，且各雄穗分枝顶端和雌穗顶端小花多退化（图5）；匍匐表型单株雌穗穗柄长度降低为直立表型单株的一半，花丝数目和鲜重也显著减少，果穗明显缩短，结实率显著降低（图4）。

表9、ZmLA1蛋白调控植物营养生长及生殖生长的组织发育的统计结果

注：**表示同一性状的两种表型单株的结果在p<0.01差异显著。

实施例2和3的结果表明，蛋白ZmLA1通过调控生长素极性运输，建立特异的生长素浓度梯度，在玉米各组织发育和形态建成过程中起关键作用。

实施例4、蛋白ZmLA1的亚细胞定位

通过生物信息学预测得知序列表序列1所示的ZmLA1蛋白中的第70-90位氨基酸肽段为潜在的跨膜结构域（TMD），预示着该蛋白可能为膜定位；第275-298位、第338-345位两段肽段为潜在的罗宾逊（Robinson）核定位信号（NLS）。分别将上述预测的跨膜结构域（序列表序列1的第70-90位）和核定位信号（序列表序列1的第275-298位和第338-345位）特异敲除后，与GFP形成融合蛋白，通过亚细胞定位实验证明ZmLA1全长蛋白特异定位于细胞膜和细胞核上，TMD缺失的ZmLA1残段仅定位细胞核，而两段NLS同时缺失的ZmLA1残段仅定位于细胞膜上。

具体操作方法如下：

1、重组表达载体的构建

1）以载体pEGFP（Clontech）为模板，用引物5’-GTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’和5’-CTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’PCR扩增绿色荧光蛋白EGFP的基因片段，测序证实后用SalⅠ和PstⅠ双酶切，回收酶切片段，与经过SalⅠ和PstⅠ双酶切的载体pCAMBIA1300的骨架片段连接获得重组载体35S：：EGFP，经测序证实，重组载体35S：：EGFP为在载体pCAMBIA1300（CAMBIA）的SalⅠ和PstⅠ位点间插入了绿色荧光蛋白EGFP的基因。

2）将序列表序列2所示的DNA片段连入载体35S::EGFP的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得全长ZmLA1与GFP融合蛋白的重组表达载体35S::La1:GFP，并经测序证实。

3）将敲除第822—894位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得去除NLS1的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体La1ΔNLS1:GFP，并经测序证实。

4）将敲除第822-894位和第1012-1035位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP BamHⅠ和XbalⅠ酶切位点间，获得去除NLS1和NLS2的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体La1ΔNLS1NLS2:GFP，并经测序证实。

5）将敲除第822-1242位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得去除从NLS1至蛋白末尾的ZmLA1残段重组表达载体La1ΔNLS1-to-end:GFP，并经测序证实。

6）将敲除第208-270位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得去除TMD的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体La1ΔTMD:GFP，并经测序证实。

2、金粉洗涤与分装

按10倍量称取15mg金粉放入灭菌后的1.5ml的离心管中，向离心管中加入500μl冰冻（-20℃）无水乙醇，震荡15秒，收集金粉到离心管管底部，静止30分钟，直到金粉全部沉淀；然后转速3000rpm离心60秒，以彻底去除乙醇；再向离心管中加入冰浴的无菌ddH₂O，用手指轻弹混匀，然后转速3000rpm离心60秒。重复上述步骤2-3次，最后一次用转速5000rpm离心15秒,弃上清，再用500μl ddH₂O悬浮。震荡15秒，然后快速悬浮混匀，边混边分装至10个离心管中，用25ul的量分装，重复分装两次，第一遍从第一个管开始，第二遍从最后一个管开始，这样每个离心管含有50μl水，1.5mg金粉。然后密封于-20℃保存备用。

3、DNA包裹

先把分装好的金粉(-20℃)（每管1.5mg并保存在50μl超纯水当中）放在冰上，同时把CaCl₂浓度为2.5M(4℃)和亚精胺浓度为0.1M(-20℃)也放在冰上融化，其中CaCl₂和亚精胺分装成一次性使用的包装；用手指轻轻弹装有金粉的离心管使之悬浮起来，然后加入60-200ng目的DNA（步骤1中2）—6）中制备的重组载体之一）,迅速用手指轻弹使之混匀，然后加入50μl CaCL₂并用枪头轻轻吸打使之混匀，然后加入20μl亚精胺，静置30秒把离心管放在漩涡振荡器上面震荡10分钟；离心管放到冰上静置5分钟，然后2000rpm离心15秒，用吸头吸掉上清，加入预冷（-20℃）的无水乙醇250μl，并用枪头轻轻吸打混匀重复以上步骤3-4次，然后加入无水乙醇120-140μl使之平均分成8份并加到宏载片上面开始基因枪轰击。

4、受体材料的轰击

取新鲜洋葱，用镊子撕取内层表皮，切成2cm×2cm左右的小片，将其摆放在MS培养基中央区域，紧密平铺贴合培养基并无气泡。选用650psi的破裂膜，用移液器将包裹后的15μl金粉-DNA混合物点在轰击膜中央，采用PDS-1000/He（Gene GunSystem）型基因枪（Bio-Rad）进行轰击，轰击距离6cm，真空度为28In·Hg。轰击后的洋葱表皮细胞28℃暗培养24h后在共聚焦显微镜（Confocal:Carl Zeiss LSM 510）下后观察GFP荧光。

5、荧光观察

小心的把基因枪轰击后的洋葱表皮从MS培养基中取下，背面朝上平铺在加有水的载玻片上，盖上盖玻片，用激光扫瞄共聚焦显微镜（Confocal:Carl Zeiss LSM 510）观察GFP荧光。参数：激发光波长488nm，GFP荧光通过505-530nm的滤光片接收。若细胞膜上分布有特异的GFP信号，则在盖玻片一侧滴一滴0.35mol/L蔗糖溶液，用吸水纸从另一侧轻吸，至洋葱表皮完全接触蔗糖溶液。静置10分钟后观察质壁分离后的GFP信号。

结果：如图6所示。对照35S::EGFP分布于细胞膜、细胞质和细胞核等整个细胞中，无特异；35S::La1:GFP融合表达的绿色荧光蛋白定位于细胞膜和细胞核中。NLS缺失的Zm LA1残段仅定位细胞核中，缺失其中一段NLS并不影响核定位特性，而两段NLS同时缺失的Zm LA1残段仅定位于细胞膜上。TMD缺失的Zm LA1残段仅定位细胞核中。

实施例5、ZmLA1编码基因的过表达对植物性状的影响

一、重组表达载体的构建

1、以B73胚芽鞘cDNA为模板，利用引物5’-CGGGATCCATGAAGCTCCTGGGTTGGAT-3’和5’-GGGGTACCCTACAGCTCCAGCACCAAGT-3’进行PCR扩增，回收纯化1.2kb的DNA片段，用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切，与用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切的质粒pCAMBIA3301-UbiN（参考文献：Yu B,Lin Z,Li H,et al.TAC1,a major quantitativetrait locus controlling tiller angle in rice[J].The Plant Journal,2007,52(5):891-898.公众可从中国农业大学获得）的载体骨架相连，获得重组载体pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1,经测序证实，该载体为在pCAMBIA3301-UbiN的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA片段，其中，目的基因ZmLA1的启动子为玉米泛素启动子。

二、转基因植物的获得

1、将步骤一获得的重组载体pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1转化根癌农杆菌EHA105，获得含有pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1的根癌农杆菌EHA105，即重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1。

将载体pCAMBIA3301-UbiN转化根癌农杆菌EHA105，获得含有pCAMBIA3301-UbiN的根癌农杆菌EHA105，即重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN。

2、利用步骤1的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1转化玉米杂交种HiⅡ（文献：Armstrong C L,Green C E,Phillips R L.Development and availabilityof germplasm with high Type II culture formation response[J].Maize geneticscooperation news letter,1991.，公众可从中国农业大学获得，为玉米自交系B73与玉米自交系A188的杂交F1代），获得转基因植株；利用步骤1的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN转化HiⅡ，获得转空载体对照植株。

具体转化方法如下：

（1）把刚剥离的HiⅡ植株的幼胚完全浸泡入重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1或pCAMBIA3301-UbiN的菌液（OD₅₅₀=0.3-0.4）中10分钟。

（2）把浸染过的幼胚转移到共培养培养基（N6盐4g/L、2,4-D1.5mg/L、脯氨酸0.7g/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8；121℃灭菌15分钟后加入硝酸银至终浓度为0.85mg/L,乙酰丁香酮至终浓度为100mM，半胱氨酸至终浓度为300mg/L，1000×N6维生素至1ml/L）,使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌，用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。

（3）把幼胚转移到静息培养基（共培养培养基+100mg/L羧苄青霉素）上，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。

（4）把幼胚转移到选择培养基甲（N6盐4g/L、2,4-D 1.5mg/L、脯氨酸0.7g/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8；121℃灭菌15分钟后加入硝酸银至终浓度为0.85mg/L,半胱氨酸至终浓度为300mg/L，1000×N6维生素至1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L,潮霉素至终浓度为50mg/L）上，培养两周；培养条件为：28℃，黑暗条件下培养。

（5）把幼胚转移到选择培养基乙（N6盐4g/L、2,4-D 1.5mg/L、脯氨酸0.7g/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8；121℃灭菌15分钟后加入硝酸银至终浓度为0.85mg/L,半胱氨酸至终浓度为300mg/L，1000×N6维生素至1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L,潮霉素至终浓度为100mg/L）上，培养至产生明显的愈伤组织（约3周）；培养条件为：28℃，黑暗条件下培养。

（6）将愈伤组织转移到在再生培养基I（MS盐4.3g/L、2,4-D 1.5mg/L、葡萄糖60g/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8；121℃灭菌15分钟后加入1000×MS维生素至终浓度为1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L,潮霉素至终浓度为100mg/L）上培养3周；培养条件为：28℃，黑暗条件下培养。

（7）然后转移到再生培养基II（MS盐4.3g/L、2,4-D 1.5mg/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8；121℃灭菌15分钟后加入1000×MS维生素至终浓度为1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L）上培养至发芽，即为转基因植株或转空载体对照植株；培养条件为：26℃，光照强度为10000LUX条件下培养。

3、表型结果

与转化空载体和未转基因的野生型植株相比，转基因植株或含有序列表序列2所示基因的玉米植株的表型如下：

生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高；同时，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。

Claims

1.一种蛋白质或其编码基因在调控目的玉米如下四种性状中至少一种的应用：生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎秆抗倒伏能力和花器官发育；

所述蛋白质为由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)：

1)序列表序列2所示的DNA分子；

2)序列表序列3所示的DNA分子。

3.一种获得具有如下至少一种表型玉米的方法，包括降低所述玉米中由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质表达、和/或抑制所述蛋白质编码基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率提高，生长素侧向运输效率降低，茎秆抗倒伏能力降低，雌穗花期延迟、雄穗花期延迟、雄穗分枝数减少、雌穗穗柄长度降低、花丝鲜重降低、果穗长度降低和结实率降低。

4.一种获得具有如下至少一种表型玉米的方法，包括提高所述玉米中由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白表达、和/或促进所述蛋白质编码基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加和结实率提高。

5.一种培育转基因玉米的方法，是将由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的玉米中，得到与所述目的玉米相比具有如下至少一种表型的转基因玉米：

生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加和结实率提高。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述导入是通过重组载体实现的；

所述重组载体为在pCAMBIA3301-UbiN的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因得到的重组载体。

7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)：

1)序列表序列2所示的DNA分子；

2)序列表序列3所示的DNA分子。