NO885091L

NO885091L - Spleisede gener samt fremstilling derav.

Info

Publication number: NO885091L
Application number: NO88885091A
Authority: NO
Inventors: Jerzy Paszkowski; Markus Baur; Ingo Potrykus
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-11-16
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1989-05-18
Also published as: NO885091D0; IL88371A0; DK636888D0; BR8805967A; PL275814A1; KR890008321A; NZ226945A; DK636888A; JPH01160489A; EP0317509A3; ZA888523B; EP0317509A2; AU2514388A

Abstract

Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte, som,. basert på homolog rekombinasjon av naturlige eller artifisielt modifiserte gener, genfragmenter eller andre nyttige DNa-sekvenser med homologe ONa-avsnitt innenfor plantegenomet, muliggjør en mSlrettet spleising av genetisk materiale på nøyaktig definerte steder i plantens genom, samt en målrettet, forutsigbar modifikasjon av gener innenfor plantegenomet. Dessuten muliggjør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en målrettet identifikasjon av funksjonen av enkeltgener innenfor plantens totalgenom. Ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse omfatter transgene planter og efterkommerne derav samt planteproduktene derav som oppnås efter denne fremgangsmåte.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte som, basert på den homologe rekombinasjon av naturlige eller artifisielt modifiserte gener, genfragmenter eller på annen måte nyttige DNA-sekvenser med homologe DNA-avsnitt innenfor p1ante-genomet, tillater en målrettet spleising av genetisk materiale på nøyaktig definerte steder i plantens genom og således en målrettet, forutsigbar modifikasjon av gener innenfor p 1 ante-genomet (in situmod i f ikasjon ). Dessuten muliggjør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en målrettet identifikasjon av funksjonen av enkeltgener innenfor plantenes totalgenom. Oppfinnelsen vedrører dessuten transgene planter som oppnås ifølge denne fremgangsmåte, samt deres efterfølgere og planteproduktene derav.

Forutsetning for en presis genetisk manipulasjon av planter er en nøyaktig og forutsigbar forandring av plantegenomet ved målrettet spleising av nye gener i genomet av planteceller, som derefter regenereres til celle-, vevs-eller ka 11usku1 turer eller til hele planter og som således fører til nye planter som viser en ny egenskap.

Intensiv forskning på rekombinant DNA-tek no 1 og i området hos planter har i de siste årene ført til betydelige frem-skritt. Dette gjelder i første linje fremstillingen av transgene planter, til hvilket formål i mellomtiden en rekke av gen-transfer-fremgangsmåter er tilgjengelige, som anvendes allerede rutinemessig i mange laboratorier.

Til de best etablerte og mest hyppig anvendte gen-transfer-fremgangsmåter hører uten tvil Agrobacterium-transformasjonssystemet.

Agrobacterium-celler har på sitt Ti-plasmid et stort DNA-fragment, den såkalte T-DNA-region, som ved transformasjonen av planteceller integreres i plantegenomet.

Dette naturlige gen-transfer-system kan efter utførelsen av forskjellige modifikasjoner anvendes som gen-vektor-system for artifisiell transformasjon av planter.

Ut over dette foreligger det også andre effektive fremgangsmåter til spleising av genetisk materiale i planter, som for det meste beror på nyere utviklinger. Hertil hører f.eks. den direkte gentransfer i protop1 a ster, fusjonen av DNA-holdig, membranovertrukkede vesikler, såkalte liposomer, med protoplastenmembranen, den intranuk1eare mikroinjeksjon av protop1 a ster, samt eventuelt makroin-jeksjonen av genetisk materiale i de meristematiske områder i blomstene.

Disse tidligere nærmere karakteriserte gen-transfer-fremgangsmåter fører riktignok til en spleising av genetisk materiale i plantecellen og til en integrasjon i plantegenomet; men de har den avgjørende ulempe at plasseringen av det spleisede genetiske materiale i det nukleare genomet av planten skjer uspesifikt og således tilfeldig slik at den genomiske lokalisasjon av fremmed-DNA ikke kan forutbestemmes (Potrykus I et al., 1985; Wallroth M et al. 1986; Ambros PF et al., 1986).

På den annen side er det imidlertid kjent at integrasjonsstedet innenfor plantegenomet har en avgjørende innflydelse på effektivitet og styrke i ekspressjonen av de integrerte fremmedgener. Således kan f.eks. ekspressjonsraten i et bestemt integrert fremmedgen avhengig av interasjonsstedet innenfor genomet differere betraktelig hos to forskjellige uavhengig av hverandre frembrakte transgene planter.

Den samme avhengighet av integrasjonsstedet kunne også iakttas i sammenheng med gen - regu1 er i ngen, spesielt ved reaksjonen av integrerte fremmedgener på induksjons-og/eller suppresso r-signa 1 er. Også i dette tilfellet finner man tydelige forskjeller mellom uavhengig av hverandre frembrakte transgene planter.

Denne avhengighet av integrasjonssted kan overvinnes f.eks. ved at man gjennomfører en i n- s itu modifikasjon av gener innenfor plantegenomet.

Innenfor rammen av en slik i n- s i t u modifikasjon av bestemte målgener forblir genet ved sin naturlige, faste posisjon innenfor plantegenomet slik at en optimal ekspresjon og regulering av det respektive målgenet er sikret.

Hittil har det imidlertid ikke vært kjent noen fremgangsmåte som muliggjør en in- s itu modifikasjon av gener innenfor plantegenomet.

På bakgrunn av de generelle bestrebelser på området av p1antegentekno 1 og i en for å øke effekten av regulering og ekspressjon av spleisede fremmedgener i plantecellen, må det ansees som en påtrengende oppgave å utvikle fremgangsmåter som tillater en målrettet integrasjon av fremmedgener på definerte, forutbestembare steder innenfor plantegenomet og som således muliggjør f.eks. en i n- s i t u modifikasjon av plantegener.

Ved gjær, noen andre sopper, samt ved slimsoppen D i ctyo-ste1 i um d i sco i deum (Hinnen H et al., 1978; Miller BL et al., 1987; De Lozanne A and Spudich SA., 1987) kunne den naturligvis meget effektive homologe rekombi nas jon av transformerende DNA anvendes ved undersøkelser av den naturlige genomiske omgivelse av transformerte og modifiserte gener, samt dessuten av en direkte modifikasjon av gener innenfor genomet.

Denne fremgangsmåte kan derimot ikke anvendes på forhold ved taksonomisk høyere stående organismer på grunn av den høyere komp 1 eksisitet.

Hos pattedyr f.eks. finner man ved siden av den nevnte homologe rekombinasjon også en meget effektiv, ikke homolog eller illegitim rekombinasjon av fremmed DNA i genomet, noe som vanskeliggjør en målrettet spleising av fremmed-DNA på et bestemt ønsket sted innenfor genomet.

Også hos planter kan man på grunn av de høye transforma-sjonsrater som kan oppnås med DNA molekyler, som ikke viser noen som helst homologi til avsnitt i plantegenomet (Shillito R et al., 1985; Negrutiu I et al., 1987) ikke med sikkerhet gå ut fra at andelen av den illegitime, ikke homologe rekombnasjon likeledes ligger meget høyt.

Hittil har det vært helt uklart om det i planter overhode eksisterer en homolog rekombinasjon og i tilfellet hvor effektiv denne arbeider.

Følgelig har det hittil heller ikke vært mulig å integrere genetisk materiale målrettet på nøyaktig definerte steder innenfor plantegenomet.

Denne oppgave ble nu innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse overraskende løst ved hjelp av enkelte forholds-regler.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av transgene planter som erkarakterisert vedat man integrerer et gen, et genfragment eller andre nyttige DNA-sekvenser målrettet på et ønsket, forutbestemt sted i plantegenomet ved hjelp av den homologe rekombinasjon.

Herved skal begrepet plantegenom innenfor rammen av denne oppfinnelse definisjonsmessig ikke begrenses til det nukleare genomet, men omfatter også de i mitokondriene og plastidene foreliggende genomavsnitt som ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen likeledes blir tilgjengelig for en målrettet modifikasjon.

Således er det innenfor rammen av denne oppfinnelse nu for første gang mulig å modifisere målrettet og effektivt i n - situ bestemte målgener innenfor plantegenomet (målrettet mutagenese ).

I n- s itu modifikasjonen av gener har i forhold til de hittil praktiserte fremgangsmåter ved modifikasjon av plantegener avgjørende fordeler, hvor det først isoleres et ønsket gen, som deretter modifiseres in v i tro og deretter igjen reintegreres i genomet.

Re integrasjonen av et først isolert og i n- v i tro modifisert gen i plantegenomet skjer rent tilfeldig slik at det, avhengig av integrasjonsstedet, kan oppstå vanskeligheter ved regulering og/eller ekspresjon av det integrerte genet. Ved den innenfor rammen av denne oppfinnelse nu for første gang muliggjorte in- s itu modifikasjon forblir genet derimot i sin naturlige, faste posisjon innenfor plantegenomet, idet en optimal regulering og ekspresjon for det respektive må 1 genet s i kres.

Ved siden av den målrettede og således meget effektive i n- s i t u modifikasjon av plantegener (målrettet mutagenese), åpner fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for en rekke ytterligere anvendelsesmuligheter såsom f.eks. spleising av ytterligere genkopier i regioner med kjent høy ekspresjonsrate samt eliminering og således utkobling av uønskete gener osv.

Detaljert sett er det således ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen f.eks. mulig å bytte ut dominante eller sem i-dom inante alleler som gir planten en med hensyn til dyrkningsmessige og/eller kommersielle synspunkter uønsket egenskap, mot recessive alleler med nyttige og ønskede' egenskaper.

En ytterligere konkret anvendelsesmulighet av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter en målrettet spleising av et ønsket gen i plantegenomet ved hjelp av homolog rekombinasjon med gener eller genfragmenter eller med ellers nyttige DNA-sekvenser som først integreres artifisielt i plantegenomet ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

Det først integrerte gen eller genfragment hhv. den først integrerte DNA-sekvens kan herved anvendes f.eks. som sondemo1eky 1 , ved hjelp av hvilket det er mulig å oppspore regioner innenfor plantegenomet som oppviser fordelaktige egenskaper, f.eks. god ekspresjon eller god regu1erbarhet av det spleisede genet.

Ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan deretter et ønsket gen eller genfragment eller en ellers nyttig DNA-sekvens meget enkelt via homolog rekombinasjon dirigeres inn i dette med henblikk til genekspresjon eller regulerbarheten foretrukkede område innenfor plantegenomet.

Spesielt foretrukket for bruk som sondemo1eky 1 er er gener eller genfragmenter hhv. ellers nyttige DNA-sekvenser som utmerker seg ved lett se 1 eksjonerbarhet, såsom f.eks. gener som fører til fenotypiske seleksjonstrekk i den tras-formerte celle eller plante, spesielt til resistens overfor antibiotika eller overfor bestemte herbicider.

På samme måte er det mulig å koble gener eller genfragmenter eller andre nyttige DNA-sekvenser med gener eller genfragmenter som først ble integrert artifisielt i plantegenomet ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

Således kan f.eks. et gen som koder en ønsket egenskap såsom f.eks. en insektresistens, kobles med et annet, allerede på forhånd artifisielt i genomet av en pynteplante integrert gen som koder f.eks. en herbicidresistens.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til utskiftingen hhv. koblingen av gener eller andre DNA-sekvenser med på forhånd artifisielt i plantegenomet integrerte gener eller DNA-sekvenser.

Det er selvfølgelig ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen på samme måte mulig å skifte ut ønskede gener eller genfragmenter samt andre nyttige DNA-sekvenser med naturlige i plantegenomet allerede foreliggende gener eller koble disse på hverandre.

Herved kan man f.eks. koble et med hensyn til dyrkningsmessige synspunkter ønsket og nyttig gen med et markørgen som lett kan forfølges i fø1gegenerasjoner på grunn av sitt fenotypiske særpreg.

På denne måte er det for en dyrker meget enkelt å forfølge et ønsket gen gjennom fø1gegenerasjonene, idet han orienterer seg efter det fenotypiske markørgen.

En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse består således i rekombinante DNA molekyler som på grunn av sin spesifike konstruksjon er i stand til målrettet å integrere gener eller DNA-sekvenser som eventuelt koder nye og ønsede egenskaper, ved hjelp av den homologe rekombinansjon på definerte steder innenfor plantegenomet.

Dessuten omfatter foreliggende oppfinnelse transgene planter med nye og/eller forbedrede egenskaper, som er blitt transformert med nevnte rekombinante DNA-mo1eky let.

Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten transgene planter som regenereres fra transformerte planteceller som inneholder det nevnte rekombinante DNA molekylet, samt deres frøkorn, og dessuten efterkomerne av transgene planter samt mutantene og variantene derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter likeledes kimære genetiske konstruksjoner, dessuten k1 on ingsbærere og vertsorganismer, samt metoder for målrettet overføring av ønskede egenskaper på planter.

I den følgende beskrivelse vil det bli brukt en rekke uttrykk som er vanlige i den rekombinante DNA teknologi samt i plantegenetikken.

For å sikre en klar og enhetlig forståelse av beskrivelsen og kravene samt omfanget av nevnte uttrykk, skal følgende definisjoner gis: Heterolog( e) gen( er) eller DNA: Den DNA sekvens som koder et spesifikt produkt eller produkter eller oppfyller en biologisk funksjon og som stammer fra en annen spesies enn den som skal spleises inn i nevnte genet; nevnte DNA sekvens blir også betegnet som fremmedgen eller fremmed-DNA.

Homolog( e) gen( er) eller DNA: En DNA sekvens som koder et spesifikt produkt eller produkter eller oppfyller en biologisk funksjon og som stammer fra den samme spesies som nevnte genet skal spleises inn.

Syntetisk( e) gen( er) eller DNA: En DNA-sekvens som koder et spesifikt produkt eller produkter eller oppfyller en biologisk funksjon og som er fremstilt på syntetisk måte.

P1ante- promotor : En kontrol1 sek vens av DNA ekspresjon, som sikrer transkripsjonen av hvilken som helst homolog eFler heterolog DNA gensekvens i en plante, såfremt nevnte gensekvens er knyttet på en operabel måte til en slik promotor.

Terminasjons- sekvens: DNA-sekvens på slutten av en trans - kripsjons-enhet som signaliserer slutten av transkripsjons-prosessen.

Overproduserende plante- promotor ( OPP): P 1 ante-promotor som er i stand til, i en transgen plantecelle å bevirke ekspresjonen av en hvilken som helst på operabel måte knyttet funksjonel gen sek vens(er) i den utstrekning (målt i form av RNA eller po ly.pept i dmengden) at den ligger tydelig høyere enn det kan iakttas på naturlig måte i vertsceller som ikke er transformert med nevnte OPP.

3'/ 5' ikke- trans1atert region: DNA-avsnitt som ligger med strømmen/mot strømmen av koderegionen, som riktignok trans-kriberer i mRNA, men blir ikke oversatt til et polypeptid. Den ne region inneholder regulatoriske sekvenser såsom f.eks. r ibosombindingsstedene (5<1>) eller po 1yadeny1 er ings-signal et (3 1 ) •

Plantemateriale: i kultur eller som sådant levedyktige plantedeler som protop1 a ster, celler, kallus, vev, embryoner, p1anteorganer, knopper, frø osv, samt hele planter.

P1 antece 1 ler: Strukturell og fysiologisk enhet av planten, bestående av en protoplast og en cellevegg.

Protopl ast: "naken" plantecelle uten cellevegg, som er isolert fra planteceller eller plantevev, med potens til å regenerere til en celleklon eller en hel plante.

Ce 11 ek 1 on : Populasjon av genetisk like celler som oppstår fra en celle ved fortløpende mitoser.

Plantevev: En gruppe planteceller som er organisert i form av en strukturell og funksjonell enhet.

P1anteorgan: En strukturell og funksjonell enhet, sammesatt av flere vev, som f.eks. rot, stamme, blad eller embryo.

DNA- ekspresjons- vektor: K1 on ingsbærer , f.eks. et plasmid eller et bakteriofag som inneholder alle signa1-sekvenser som er nødvendig for ekspresjon av en inserert DNA i en egnet vertscelle.

DNA- transfer- vektor: Transferbærer, feks. et ti-plasmid eller en virus som muliggjør spleisingen av genetisk materiale i en egnet vertscelle.

Homolog rekombinasjon: resiprok utskiftning av stykker mellom homologe, dobbe 1tstrengede DNA-mo1eky 1 er.

Mutanter, varianter av transgene planter: etterkomme av en transgen plante som er fremkommet spontant eller artifisielt, under anvendelse av kjente fremgangsmåteforholdsregler, såsom f.eks. UV-behand 1 ing , behandling med mutagene agentier etc, som ennå har særtrekkene og egenskapene ifølge oppfinnelsen av den transgene utgangsp1 ante som har fått disse på grunn av transformasjon med eksogen DNA.

Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er det nu for første gang lykkes å utvikle en fremgangsmåte som mulig-gjør ved planter å integrere målrettet genetisk materiale på definerte forutbestemte posisjoner innefor plantegenomet og å eksprimere der.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen beror på en målrettet integrasjon av genetisk materiale i genomet av planten ved hjelp av den homologe rekombinasjon av naturlige eller artifisielt modifiserte og/eller syntetiske gener eller genfragmenter eller ellers nyttige DNA-sekvenser med homologe DNA-avsnitt innenfor plantegenomet, idet nevnte homologe DNA-avsnitt er en naturlig bestanddel av plantegenomet eller eventuelt først blir innspleiset artifisielt i plantegenomet ved hjelp av kjente fremgangsmåteforholdsregler.

En vesentlig bestanddel av foreliggende oppfinnelser er således rekombinante DNA-mo1eky1 er som på grunn av sin spesifike konstruksjon muliggjør spleising av gener i genomet av en målplante ved hjelp av den homologe rekombinasjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt rekombinante DNA molekyler som muliggjør en målrettet integrasjon av gener, genfragmenter eller ellers nyttige DNA-sekvenser på nøyak-tig definerte steder innenfor plantegenomet, og som erkarakterisert vedat de inneholder DNA som skal integreres, og at nevnte DNA i en viss utstrekning oppviser homologier tilsvarende DNA regioner innenfor plantegenomet eller flankeres av slike homologe DNA-sekvenser at det ved transformasjon av plantecellen som inneholder de homologe DNA regioner, ved homolog rekombinasjon finner sted en målrettet integrasjon av nevnte DNA som skal integreres på nøyaktig definerte steder innenfor plantegenomet.

Det dreier seg her fortrinnsvis om rekombinante DNA molekyler som består av en DNA-sekvens som skal integreres, som eventuelt på operabel måte er knyttet sammen med ekspresjonssignaler som er funksjonsdyktige i plantecellen, samt med flankerende DNA-avsnitt som oppviser homologier til en bestemt region innenfor plantegenomet. I første linje vedrører foreliggende oppfinnelse rekombinante DNA-mo 1 eky1 er som erkarakterisert vedat a) nevnte rekombinante DNA molekyler har et strukturgen som koder en nyttig og ønskelig egenskap, b) nevnte strukturgen eventuelt på operabel måte knyttes sammen med ekspresjonssignaler som er funksjonsdyktige i

p1antece1 ler,

c) nevnte funksjonelle enhet, bestående av strukturgen og eventuelt ekspresjonssignaler, på en måte flankeres av

DNA-sevkenser som i en slik utstrekning oppviser homologier til tilsvarende DNA-regioner innenfor plantegenomet, at det ved transformasjon av plantecellen som inneholder nevnte homologe region, ved homolog rekombinasjon finner sted en målrettet integrasjon av den gensekvens som flankeres av homologe DNA-sekvenser, på definerte steder innenfor p1 a ntegenomet.

Ved siden av strukturgener kan det også brukes hvilke som helst andre gener eller genfragmenter samt DNA-sekvenser.

Videre omfatter det brede konsept av foreliggende oppfinnelse genetiske konstruksjoner, bestående av gener eller genfragmenter eller ellers nyttige DNA-sekvenser, som eventuelt står under kontroll av i planteceller funksjonsdyktige ekspresjonssignaler og som har en tilstrekkelig stor homologi til tilsvarende DNA regioner innenfor plantegenomet, slik at en direkte utskiftning av disse gener eller genfragmenter eller ellers nyttige DNA-sekvenser mot nevnte homologe genomiske DNA ved hjelp av den homologe rekombinasjon kan finne sted.

Ved siden av dobbe 1tkjedet DNA kan det i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også anvendes enkeltkjedet DNA samt delvis enkeltkjedet DNA.

Dessuten består muligheten å anvende DNA/proteinkomplekser hvor mål-DNA som skal integreres, er assosiert med et bestemt funksjonelt protein.

Her skal det f.eks. nevnes noen DNA/protein-komp 1 ekser, som f.eks. et DNA/kromat inbindingsprotein-komp 1 eks , et DNA/ p1 ante v i rus-protein-komp 1 eks eller et DNA/protein-kompieks inklusive heterologe proteiner som f.eks. rekombinansjons-proteiner av bakterier eller gjær (f.eks. RecA, B, C, D). Til bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er i første linje alle de gener egnet som eksprimeres i plantecellen og som gir planten en nyttig og/eller ønsket egenskap, som f.eks. øket resistens eller toleranse overfor patogener

(f.eks. fytopatogene insekter, sopp, bakterier, virus osv.)

i forhold til herbicider, insekticider eller andre biocider, i forhold til klimatiske påvirkninger og lokale særegenheter (f.eks. varme, kulde, vind, tørke, fuktighet, spesielt ekstreme bunnforhold, osmotisk stress osv.) eller enøket dannelse av reserve- og 1agringsstoffer i blad, frø, knoll, rot, stilk osv. Likeledes omfatter foreliggende oppfinnelse gener som koder farmasøytisk aksepterbare aktivsubstanser, som f.eks. alkaloider, steroider, hormoner, immunmodu1atorer, og andre fysiologisk aktive substanser.

Ved siden av naturlig forekommende gener som koder en nyttig og ønsket egenskap, kan innenfor rammen av denne oppfinnelse også anvendes gener som på forhånd ble målrettet modifisert ved hjelp av kjemiske eller genteknologiske metoder.

Dessuten omfatter foreliggende oppfinnelse også slike gener som fremstilles fullstendig ved kjemiske synteser.

Som eksempel skal her nevnes p 1 ante 1 agr ingsprote ingenene. Eventuelle modifikasjoner av proteingenene sikter i første linje til deres am inosyres ammen setning som, som kjent, i de fleste tilfeller bare er av mindre ernær ingsfysio1 og isk verdi. Således har f.eks. zein-lagerproteinet av mais, hvis protein-koder DNA-sekvens er kjent (Wienand K et. al.

Mo 1. Ge n- Genet., 1982: 440 - 444, 1981) et høyt prolin-innhold, mens lysin- og tryptofan-ande1en er meget liten.

Ved utskiftning av planteegne zein-gener med et først modifisert, nu et lysin og/eller tryptofan-r ikere protein eller et på annen måte forbedret zein-protein koderende gen under anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er det nu blitt mulig å forbedre målrettet den ernærings-fysiologiske verdi av bestemte målplanter.

Ut over dette kan dessuten den høye bakgrund av planteegne 1 ag r ingsprote i ner med liten ernær ingsfysio1 og isk verdi, forminskes ved målrettet integrasjon av forstyrre 1sesgener som inaktiverer de nevnte planteegne gener.

Et eksempel på et slikt forstyrre 1sesgen er opaque-2 genet av mais som hemmer ekspresjonen av zeinproteiner.

Dessuten egner seg for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelser andre nyttige DNA-sekvenser, spesielt ikke-koderende DNA-sekvenser med regu1atoriske funksjoner.

Til bruk i framgangsmåten ifølge oppfinnelsen kommer således såvel homologe som også heterologe gen(er) eller DNA, samt syntetiske gener eller DNA ifølge definisjonen innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse i betraktning.

DNA-sekvensene som skal integreres, kan her være konstru-ert utelukkende av genomisk, cDNA hhv. syntetisk DNA. En annen mulighet består i konstruksjonen av hybride DNA-sekvenser, bestående såvel av cDNA som også av genomisk DNA og/eller syntetisk DNA.

I dette tilfellet kan cDNA stamme fra samme genet eller DNA-avsnittet som den genomiske DNA, eller såvel cDNA samt de genomiske DNA kan stamme fra forskjellige gener eller DNA-avsnitt. I hvert tilfellet kan imidlertid såvel de genomiske DNA og/eller de c DNA, hver for seg, fremstilles av samme eller forskjellige gener eller DNA-avsnitt.

Når en DNA-sekvens inneholder andeler av flere enn et gen eller DNA-avsnitt, kan disse stamme fra enten én og samme organisme, av flere organismer som tilhører forskjellige stammer eller variasjoner av disse arter eller forskjellige spesies av samme familie, eller de kan stamme fra organismer som tilhører flere enn én familie av disse eller en annen taksonomisk enhet.

For å sikre ekspresjonen av et strukturgen i plantecellen, kan de koderende gensekvenser eventuelt knyttes sammen først på operabel måte med i planteceller funksjonsdyktige ekspresjons-sekvenser.

De hybride genkonstruksjoner i foreliggende oppfinnelse inneholder således som regel ved siden av strukturgenet(genene) ekspresjons-signa 1 er som innbefatter såvel promoter-og terminator-sekvenser som ytterligere regu 1 at or iske sekvenser fra 3' og 5' ikke translaterte regioner.

Hver promotor og hver terminator som er i stand til å bevirke en induksjon av ekspresjonen av en koderende DNA-sekvens (strukturgen), kan anvendes som bestanddel av den kimære gensekvens. Spesielt egnet er ekspresjonssignaler som stammer fra gener av planter eller plantevirus. Eksempler på egnede promotorer og terminatorer er f.eks. nopa1 in-syntase-gener (nos), octopin-synta se-gener (oes) samt eau i ir i oi/er mosaik virus gener (CaMV). Foretrukket innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er 35S og 19S ekspresjonssigna 1 ene fra CaMV genomet, som ved hjelp av mo 1eky1 arbio1 og iske metoder, slik som beskrevet f.eks. hos Maniatis et al., 1982, kan isoleres fra nevnte genomet og knyttes sammen med den koderende DNA-sekvens.

Som utgangsmater i a 1e for 35S-1ranskr i psjonskontro 11-se - kvensen kan ifølge oppfinnelsen anvendes f.eks. Scal-fragmentet fra CaMV stammen "S" som omfatter nukleotidene 6808-7632 i genkortet (Frank G et al., 1980).

Den 19S promoter- og 5' ikke-trans1aterte region befinner seg på et genomfragment mellom Pstl setet (posisjon 5386) og H i nd 111-setet (posisjon 5850) i CaMV genkortet (Hohn et. al., 1982). Den tilsvarende terminator- og 3' ikke-trans1aterte Region ligger på et EcoRV/Bg111-fragment mellom posisjon 7342 og 7643 i CaMV genomet.

Dessuten foretrekkes det innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ekspresjonssigna 1 ene fra CaMV stammen CM 1841, hvis komplette nuk1eotidsekvens er beskrevet hos Gardner RC et a 1. 1981.

En ytterligere aktiv representant av en p1antepromotor som kan anvendes, er en overproduserende p1 antepromotor. Denne form for promotor skulle, såfremt den på operabel måte er knyttet sammen med den gensekvens som koder et ønsket genprodukt, være i stand til å formidle ekspresjonen av nevnte gensekvens.

Overproduserende p 1 antepromotorer som kan anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, innbefatter promotoren av små subenheter (small subunit; ss) fra r i bu 1 ose-1,5-bisfosfat-karboksy1 asen fra soyabønner [Berry-Lowe et al. , J. Molecular and App. Gen. , J_: 483^498 ( 1982 )] samt promotoren fra k1orofy1-a/b-bindingsprotei net. Disse to promotorer er kjent for at de induseres ved lys i eukaryonte planteceller [jfr. f.eks. Genet i c Engi neer i ng of Plants, an Agriculturai Perspective, A. Cashmore, Plenum, New York 1983, s. 29-38; Coruzzi G. et al., The

Journal of Biologi cal Chem istry, 258: 1399 (1983) og Dunsmuir, P. et a 1., Journal of Molecular and Applied Ge netics, 2: 285 (1983)].

De således dannede funksjonelle enheter, bestående av et gen, en hybrid genkonstruksjon eller på annen måte nyttige DNA-sekvenser som eventuelt står under regulatorisk kontroll av i planteceller aktive ekspresjonssignaler, flankeres deretter med DNA-avsnitt som i et slikt omfang oppviser homologier tilsvarende DNA-regi onene innenfor plantegenomet at det ved transformasjon av den plantecelle som inneholder den nevnte homologe region, ved homolog rekombinasjon finner sted en målrettet integrasjon av den gensekvens som flakeres av homologe DNA-sekvenser, på definerte steder innenfor plantegenomet.

Ved valg av egnede flankerende DNA-sekvenser som har tilstrekkelig stor homologi til tilsvarende avsnitt innenfor plantegenomet og således muliggjør en utskiftning av genetisk materiale via homolog rekombinasjon, er det nu for første gang mulig å integrere gener målrettet på forutbestemte steder i plantegenomet og eventuelt å eksprimere disse.

Omfanget av homologien som er nødvendig for en utskiftning via homolog rekombinasjon mellom flankerende DNA og den tilsvarende genomiske DNA-region, er avhengig av forskjellige parametere, som f.eks. den spesifiske kromat instruktur osv., og må derfor, avhengig av de anvendte DNA-sekvenser, tilpasses de tilsvarende behov.

Til bruk som flankerende DNA egner seg innenfor rammen av denne oppfinnelse i første linje DNA-sekvenser som har homologien til slike planteegne gener og/eller genorna vsnitt, hvis nukleotidsekvenser helt eller delvis er kjente, idet slike gener eller genorna vsni11 foretrekkes,

som er lokalisert i områdene, som naturligvis allerede har en høy ekspresjonseff isiens.

Som eksempel skal her nevnes p1 ante 1agerproteingenene -

uten derved å begrense oppfinne 1 se sgjen st anden - som er kjent for at de oppnår meget høye ekspresjonsrater,

avhengig av plantens utviklingsstadium.

Ytterligere gener, hvis nuk 1 eotidsek vens i det minste delvis allerede er kjent og som således kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, omfatter f.eks. nitrat-reduktase genet, psbA genet (Gressel J., Oxford Surv. Plant Mol. Cel 1 Biol. , 2 : 321 - 328, 1985; Zurawski

G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 79: 7699 - 7703, 1982), genet i den lille subenhet (ss) i

r i bu 1 ose - 1,5-bisfosfat-kar bok sy 1 a sen, samt a 1 pha-amy1 ase og sucrose-syntetase genet. Ved siden av plantespesifi ske gener kan det innenfor rammen av foreliggende oppfinnelsen også anvendes alle de gener som på grunn av sterkt utpreget konservatisme i evolusjonens forløp omfatter store områder som oppviser homologi til de tilsvaende p1 antespesi f iske gener.

Her tilhører f.eks. histon-genene, actin-genene samt g 1 ut at i on-S-transfer a se-genene i mammalier, dessuten forskjellige mikrobielle gener, som f.eks. trypofan- og glutamin-syntase-genene.

Disse eksempelvise oppramsinger av mulige og for anvendelse

i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egnede gener tjener kun til bedre illustrasjon av foreliggende oppfinnelse og skal på ingen måte begrense oppfinne1sesgjenstanden.

Dessuten egner seg til anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen slike DNA-sekvenser som har homologi til gener eller genfragmenter eller til ellers nyttige DNA-sekvenser som først ble integrert artifisielt i en målplantes genom ved hjelp av kjente fremgangsmåteforho 1dsreg 1er og hvis mukleotidsekvenser helt eller delvis er kjent. Spesielt foretrukket er slike DNA-sekvenser som er lokalisert i områder som sikrer naturlig en høy ekspresjonseff isi ens.

I en spesifisk utføre 1sesform av foreliggende oppfinnelse dreier det seg ved de ti 1 integrerende DNA og de allerede i plantegenomet foreliggende artifisielt integrerte DNA om innbyrdes komp 1 ementerende DNA-sekvenser som efter foretatt homolog rekombinasjon danner en funksjonell enhet innenfor plantegenomet.

Ved den nevnte funksjonelle enhet kan det dreie seg om et strukturgen som koder et ønsket og nyttig proteinprodukt eller om en kontro11 sek vens som oppfyller en spesifisk regulatorisk funksjon innenfor plantegenomet.

Spesielt foretrukket innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er innbyrdes komp 1ementerende DNA-sekvenser som efter foretatt rekombinasjon danner et funksjonsdyktig strukturgen som koder en spesifisk fenotypisk markør eller et på annen måte lett detekterbart proteinprodukt.

Således er det innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse blitt mulig, ved fremstilling av tilsvarende hybride genkonstruksjoner på den tidligere beskrevne måte, å foreta forutsigbare modifikasjoner av plantegener innenfor plantegenomet.

En vesentlig bestanddel av foreliggende oppfinnelse danner således en fremgangsmåte ved fremstilling av transgene planter, som erkarakterisert vedat man transformerer plantemateriale med en av de ovenfor beskrevne rekombinante DNA molekyler, idet de gener som inneholdes av nevnte rekombinante DNA molekyl, de hybride genkonstruksjoner eller ellers nyttige DNA-sekvenser integreres målrettet ved homolog rekombinasjon på et ønsket forutbestemt sted i p 1 antegenomet.

I et første fremgangsmåtetri nn konstrueres først de foran beskrevne rekombinante DNA molekyler som f.eks. består av et eller flere strukturgener som koder et nyttig og ønsket genprodukt og som er knyttet sammen på operabel måte med i plantecellen funksjonsdyktige ekspresjonssignaler, samt av flankerende sekvensavsnitt som har homologi til planteegne genomavsnitt, og spleises i egnede k 1 on ingsvektorer som er i stand til igjen å danne et funksjonsdyktig gen ved hjelp av den homologe rekombinasjon.

Ved siden av strukturgener kan det også anvendes hvilken som helst andre ønskelige gener eller genfragmenter eller ellers nyttige DNA-sekvenser.

Som k 1 on ingsvektorer anvendes generelt plasmid- eller v i rus(ba kt er i ofage )-vektorer med replikasjons- og kontroll-sekvenser, som stammer fra spesies som er kompatibel med vertsce1 len.

K1 on ingsvek toren bærer som regel en replikasjonsopp-rinnelse, dessuten spesifiske gener som fører til fenotypiske seleksjonssærpreg i den transformerte vertscelle, spesielt til resistenser overfor antibiotika eller overfor bestemte herbicider. De transformerte vektorer kan ved hjelp av disse fenotypiske markører efter en transformasjon selekteres i en vertscelle.

Selekterbare fenotypiske markører som kan anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, omfatter f.eks. resistenser mot ampicillin, tetracyklin, hygromycin, G418, kanamycin og neomycin, uten å begrense således oppfinnel-ses gj en st a nden .

Som vertscelle kommer innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse prokaryonter, inklusive bakterielle vertsceller, såsom f.eks. A. tumefaci ens, E. co 1 i , S. typhimurium 0 g Serrat i a marcescens, samt cyanobakterier i betraktning. Dessuten kan det innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse også anvendes eukaryontiske vertsceller som gjær, myceldannende sopper og planteceller. 1 nnsp 1 eisi ngen av den kimære genkonstruksjon ifølge oppfinnelsen i en egnet kloningsvektor skjer ved hjelp av standardmetoder slik som beskrevet hos f.eks. Maniatis et al. , 1982.

Herved kuttes som regel i første omgang vektoren og DNA-sekvensen som skal innspleises med egnede restriksjonsenzymer. Egnede restriksjonsenzymer er f.eks. slike som gir fragmenter med glatte ender, såsom f.eks. Smal, Hpal og EcoRV, eller enzymer som danner kohesive ender, såsom f.eks. EcoRI, SacI og BamHI.

Såvel fragmenter med butte ender som slike med kohesive ender, som er innbyrdes komplementære, kan ved hjelp av egnede DNA-ligaser igjen knyttes til et enhetlig gjennomgående DNA-molekyl.

Butte ender kan også fremstilles ved behandling av DNA-fragmenter som har overhengende kohesive ender, med Klenow-fragmentet i E.coli DNA-po lymerasen ved å fylle opp hullene med de tilsvarende komplementære nuc 1 eotidene.

På den annen side kan kohesive ender også fremstilles kunstig, f.eks. ved tilføyning av komplementære homopolymere haler på endene av en ønsket DNA-sekvens og det kuttede vektormo 1 eky 1 under anvendelse av en terminal doksynukleotidyl-transerase, eller ved tilføyning av syntetiske o 1 i gon uk 1eotid-sekvenser (Linker), som bærer et restr iksjonsspa 11ningssted, og etterfølgende kutting med det tilsvarende enzym.

K1oningsvektoren og vertscellene som er transformert med denne vektor, anvendes ifølge oppfinnelsen til å øke vektorens kopiantall. Med et øket kopiantall er det mulig å isolere vektoren som bærer den hybride genkonstruksjon ifølge oppfinnelsen, og å anvende det f.eks. ved innspleising av den kimære gensekvens i plantecellen.

En vesentlig bestanddel av foreliggende oppfinnelse ved-rører således konstruksjonen av plasmider som oppviser nevnte kimære genkonstruksjoner, bestående av ett eller flere strukturgener eller ellers ønskelige gener hhv. genfragmenter eller ellers nyttige DNA-sekvenser, som eventuelt er knyttet på operabel måte til i planteceller funkjsonsdyktige ekspresjonssignaler, samt flankerende DNA-sekvenser som har homologi til planteegne genomavsnitt.

I et ytterligere fremgangsmåtetri nn kan plasmidene anvendes til å spleise den ovenfor beskrevne kimære genetiske konstruksjon som eventuelt inneholder et strukturgen som koder et ønsket genprodukt, inn i plantecellen og å integrere den i plantegenomet.

Foreliggende oppfinnelsen vedrører således dessuten fremstillingen av p1ante-resipi ent-ce11 er som får nevnte strukturgen eller ellers ønskede gener hhv. genfragmenter eller ellers nyttige DNA-sekvenser innspleiset i genomet sitt.

I nnsp 1 eisi ngen av den kimære genetiske konstruksjon skjer fortrinnsvis i p 1 anteprotop1 a ster ved hjelp av kjente gen-transfer-fremgangsmåter.

Det eksisterer imidlertid en rekke av meget effektive fremgangsmåter for innspleising av DNA i planteceller, basert på anvendelsen av gentransfer-vektorer eller direkte gentransfer-fremgangsmåter.

En mulighet består f.eks. i at man bringer planteceller i kontakt med virus eller med agrobacterium. Dette kan foretas ved infeksjon av sensitive planteceller eller ved co-ku11i ver ing av protoplaster som avledes fra planteceller. Cauliflower Mosaik viruset (CaMV) kan innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse likeledes anvendes som vektor for innspleising av den kimære genetiske konstruksjon ifølge oppfinnelsen i planten (Hohn et al., i "Molecular Biology of Plant Tumors", academic Press, New York, 1982, s. 549-560; Howell, US-patent nr. 4 407 956). Det totale virale DNA-genomet av CaMV integreres herved i et bakterielt fore 1drep 1 asmid under utformning av et rekombinant DNA molekyl som kan formeres i bakterier. Efter foretatt kloning spaltes det rekombinante plasmidet ved hjelp av restriksjonsenzymer enten tilfellig eller på helt spesifike ikke essensielle steder innenfor den virale del av det rekombinante plasmid, f.eks. innenfor genet som koder virusens overførbarhet ved bladlus, for å kunne innspleise den hybride genkonstruksjon.

Et lite o1ogonuk 1eotid, en såkalt linker, som har et eneste, spesifikt restriksjonskjenningssted, kan likeledes integreres. Det således modifiserte rekombinante plasmid klones påny og modifiseres ytterligere ved innspleising av den hybride genkonstruksjon på et kun engang forekommende restriksjonssted.

Den modifiserte virale andel i det rekombinante plasmid, kuttes ut fra det bakterielle fore 1dre-p1 asmi det og brukes til inokulasjon av plantecellen eller den totale plante.

En annen metode til innspleising av den kimære genkonstruksjon i cellen betjener seg av infeksjonen av plantecellen med Agrobacterium tumefaciens, som er transformert med nevnte genkonstruksjon. De transgene planteceller kultiveres deretter under egnede, for fagmannen kjente kul-ti ver i ngs bet i nge 1 ser slik at de danner skudd og røtt og til

slutt resulterer i den totale plante.

Den kimære genkonstruksjon kan overføres f.eks. ved hjelp av ti-plasmidet av Agrobacterium tumefaciens i egnede planteceller [DeCleene et al., Bot. Rev., 47: 147-194 (1981); Bot. Rev. , 4_2: 389 -466 (1976)]. Ti-plasmidet overføres i løpet av infeksjonen ved Agrobacterium tu mefaciens t i 1 planten og integreres stabilt i plantegenomet. [Horsch et. a_l., Science, 233: 496-498 ( 1984 ); Fraley et al., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80: 4803 (1983)].

Ti-plasmider har to regioner som er essensielle for fremstillingen av transformerte celler. En derav, nemlig transfer-DNA regionen, overføres på planten og fører til induksjon av tumorer. Den andre, (vir) regionen som gir virulens, er bare essensiell for tumorens utformning, men ikke for dens opprettholdelse. Transfer-DNA regionens dimensjoner kan økes ved spleising av den kimære genkonstruksjon, uten at overføringsevnen påvirkes. Ved fjerning av tumorforårsakende gener, hvorved de transgene planteceller blir ikke-tumorøse, og ved spleising av en selek-sjonerbar markør, kan det modifiserte ti-plasmid anvendes som vektor for overføring av genkonstruksjonen ifølge oppfinnelsen i en egnet plantecelle.

Vir-regionen bevirker overføringen av T-DNA regionen av Agrobacteri um til plantecellens genom, uavhengig om T-DNA-regi onen og vir-regionen foreligger på samme vektor eller på forskjellige vektorer innenfor den samme Agrobacterium-celle. En vir-region på et kromosom induserer likeledes transfer i ngen av T-DNA fra en vektor til en plantecelle.

Foretrukket er et system til overføring av en T-DNA-region fra et Agrobacterium til planteceller, som erkarakterisert vedat vir-regionen og T-DNA-regi onen ligger på forskjellige vektorer. Et slikt system er kjent under begrepet "binært vektor-system" og vektoren som inneholder T-DNA, betegnes som en "binær vektor".

Hver vektor som inneholder T-DMA, som kan overføres til planteceller og som tillater en seleksjon av de transformerte celler, er egnet til anvendelse innenfor rammen av denne oppf i nne1 se.

Ved bruk av ny utviklede transformasjonsteknikker kan imidlertid også slike p1 antespeci es transformeres i n v i t ro, som ikke er naturlige vertsplanter for Ag robacter i um. Således er f.eks. monokotyle planter, spesielt kornarter og gress, ingen naturlige vertsceller for Agrobacteri um.

Det foreligger i mellomtiden flere henvisninger på at også monokoty1edoner kan transformeres med Agrobacteri um , slik at det under anvendelse av nye eksperimentelle tilførings-steder som nu blir tilgjengelige, også korn og gress-speci es er tilgejgelige for en transformasjon [Grimsley NH, et al., Nature, 325: 1 77- 1 79 ( 1 987 )].

Foretrukket innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er den direkte innspleising av genkonstruksjonene ifølge oppfinnelsen i p1 anteprotop1 a ster, for hvilke likeledes foreligger allerede en rekke fremgangsmåter.

Således kan det genetiske materiale som inneholdes av en vektor, mi kro inji seres direkte i plantecellen f.eks. ved hjelp av mikropipetter for den mekaniske transfering av den rekombinante DNA. (Neuhaus et al., 1987).

Ytterligere muligheter for den direkte overføring av genetisk materiale til planteceller består i behandlingen av protoplaster med fremgangsmåteforholdsregler som modifiserer plasmamembranen, som f.eks. po 1 yety1 eng 1yko1-behandlingen [Paszkowski et al., EMBO J., 3: 2717-22 ( 1984))], varmesjokkbehand1 i ngen eller e1ektroporasjonen samt en kombinasjon av disse fremgangsmåteforholdsregler [Shillito et al., Bio Technology, 3: 1099-1103 (1985); Fromm et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 5824 (1985)].

Ved elektroporasjons-teknikken utsettes p1 anteprotop 1 astene sammen med plasmidene som inneholder den hybride genkonstruksjon, for elektriske impulser med høy feltstyrke. Dette fører til en reversibel permeabi1itetsøkning av bio-membraner og muliggjør således innsp1eisi ngen av plasmidene. E1ektroporerte p1 anteprotop1 aster fornyer celle-veggen sine, deler seg og danner kallusvev. Seleksjonen av den transformerte plantecelle kan skje ved hjelp av den ovenfor beskrevne fenotyptiske markør.

En ytterligere fremgangsmåte til den direkte innføring av genetisk materiale i planteceller, som innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er spesielt foretrukket, er beskrevet hos Negrutiu I et al., 1987.

Det dreier seg herved om en fremgangsmåte som beror på rent kjemiske fremgangsmåteforho 1dsreg 1 er og muliggjør en meget effektiv og hurtig gjennomføring av transformasjonen.

I detalj består denne fremgangsmåte i at man

- isolerer p1 anteprotop1 aster fra hvilket som helst plantevev og kultiverer eventuelt i et nær ingsmed ium som vanligvis anvendes for kultivering av p1 ateprotop 1 a ster ; - forinkuberer nevnte protoplaster før den egentlige transformasjon i 20 minutter til 6 timer i et for inkubasjons - medium, inneholdende jordalkali og/eller a 1ka 1 ikat ioner, fortrinnsvis Ca^+-, K+ og /eller Na<+->ioner, samt en egnet C-kilde, ved en temperatur på 4° til 10°C; - separerer protop1 astene deretter fra for inkubasjon smed i et og resuspenderer i det egentlige transformasjonsmedium , inneholdende som essensiell bestanddel 0.1 til 60 mM, fortrinnsvis 10 til 30 mM Mg^<+->ioner, i nærvær eller fravær av Ca^<+->ioner; - tilsetter til transformasjonsoppløsningen umiddelbart deretter en DNA-prøve, inneholdende én eller flere gener, under kontroll av ekspresjonssignaler som er aktive i planter, samt en bærer-DNA; - tilsetter noen sekunder til inntil 20 minutter senere, fortrinnsvis 0,1 til 10 minutter senere en agens som modifiserer plasmamembranen; - inkuberer protoplasten og DNA-prøven i nevnte transfor-ma sjon so pp 1 øsning for et tidsrom som sikrer opptaket av DNA i protop 1 åstene; og - om ønsket, regenerer hele planter fra de transformerte protop1 åster.

Spesielt foretrukket innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er den direkte gentransfering under anvendelse av Co-tranformasjon (Schocher R.J. et al., B io/ Techno logy, 4: 1093-1096, 1086).

Ved Co-transformasjonen dreier det seg om en metode som beror på samtidig opptak og integrasjon av forskjellige DNA-mo1eky1 er (ikke-se 1 eksjoner bart og se 1 eksjoner bart gen) i plantegenomet og som således muliggjør å finne de celler som er transformert med ikke-se1ekterbare gener.

Den ovenfor gitte eksempelvise opplisting av mulige trans-formasjonsfremgangsmåter gir ingen fullstendighet og skal på ingen måte begrense oppfinnelsengjenstanden.

De ce 11 eko1 onner som får innspleiset den hybride genkonstruksjon i genomet, bestemmes ved hjelp av konvensjonelle seleksjons-, screenings- og på v isningsmetode r og anvendes til regenerasjon av transgene planter.

Regenerasjonen av protoplaster som holdes i kulturer, til hele planter, er beskrevet hos Evans, et al., "Protoplast Isolation and Culture", i Handbook of Plant Cell Culture, J_: 124- 1 76 (MacMi 1 lanPubl ishing Co. New York 1983 ); M. R . Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts ", Protoplasts, 1 983, Lecture Proceedings, s. 19-29, (Birkhåuser, Basel 1983); P.J. Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", i Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, s. 31-41), (Birkhåuser, Basel 1983); og H. Binding, "Regeneration of Plants", i P1 ant Protoplasts, s. 21-37, (CRC Press, Boca Raton 1985) og Potryhus I and Sh i 11 i to RD, Methods in Enzymology, Vol 118, Plant Molecular Biology, eds. A. and H. Weissbach, Academic Press, Orlando, 1986.

Regenerasjonsfremgangsmåtene er forskjellige fra p1antespesi es til plantespesies. Generelt stimuleres imdilertid protop1 åstene til deling og ce11 eveggdan ne 1 se i ett av de kjente kulturmedier. Det oppstår til slutt ka 11usku1 turer som induseres med bestemte akt ivstoffer, som f.eks. auxiner og cytokininer, til rot- hhv. skudddanne 1 se.

De således frembrakte små planter kan deretter overføres til jord og v idereku11i veres på samme måte som normal frø-a v 1.

En effektiv regenerasjon avhenger i første linje av mediet, av genotyp og av kulturens forhistorie. Hvis disse tre variabler kontrolleres tilstrekkelig, blir regenerasjonen fullstendig reproduserbar og gjentagbar.

De regenererte transgene planter som inneholder et i plantecellen eksprimerbart strukturgen av den foran beskrevne hybride genkonstruksjon som integral bestanddel av plantegenomet, formeres fortrinnsvis vegetativt i form av sterile spi re-ku1 turer.

Den stabile integrasjon av et funksjonsdyktig eksprimerbart gen i plantegenomet av den regenererte transgene plante, bestemmes ved hjelp av den mitotiske stabilitet av det integrerte gen samt på grunn av sin opptreten som Mendelsk trekk under meiosen og under anvende 1 se . a v "Southern blot" analysen (Southern EM, 1975).

En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse ved-rører således fremstillingen av transgene planter med for-bedrete og/eller ønskede egenskaper ved målrettet spleising av DNA på forutbestemte steder innenfor plantegenomet, spesielt slike som sikrer en høy ekspresjonseffisiens og fordelaktig regu1erbarhet.

Oppfinnelsen omfatter likeledes transgene planter som er blitt transformert ved hjelp av den foran beskrevne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen , samt deres aseksuelle og/eller seksuelle etterkommere som enda oppviser de nye og ønskede egenskaper som forutsettes av moderplantes transformasjon.

Under begrepene aseksuelle og/eller seksuelle etterkommere av transgene planter, faller ifløge definisjonen innenfor rammen av denne oppfinnelse således også alle muntantene og variantene som kan utvinnes ved hjelp av kjente fremgangsmåter, som f.eks. ved cellefus joner eller mutantselek-sjoner, og som har de karakteristiske egenskaper for de transformerte utgangsplanter, samt samtlige krysnings- og fusjonsprodukter med det transformerte plantemateriale. Oppfinnelsen vedrører også formeringsmaterialet av transgene planter.

Under forme ringsmateriale av transgene planter forståes det innen rammen av denne oppfinnelse hvilket som helst plantemateriale som kan formeres på seksuell eller aseksuell måte hhv. i n- v i vo eller in- vitro. Spesielt foretrukket er innen rammen av foreliggende oppfinnelse i første linje protop1 aster, celler, kalli, vev, organer, frø, embryo, pollen, eggeceller, zygotoer, samt hvilket som helst annet former ingsmateri a 1e som kan oppnås fra transgene planter.

Plantedeler, som f.eks. blomster, stilker, frukt, blader, røtter, som stammer fra transgene planter eller deres etterfølgere som forut er blitt transformert ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og som således i det minste delvis er bygget opp av transgene celler, er likeledes gjenstand for foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egner seg for transformasjon av samtlige planter, spesielt av de systematiske grupper Ang iospermae og Gymnospermae.

Blandt Gymnospermae er av spesiell interesse plantene i klassen Con i ferae.

Blandt Ang iospermae er det ved siden av løvtrær og busker planter av familien So 1anaceae, Cruc iferae, Compos itae, L i 1 i aceae, V itaceae, Chenopod i aceae , Rutaceae , A11 i aceae , Amary11idaceae, Asparagaceae, Orch idaceae, P a 1mae, B rome - 1 i aceae, Rub i aceae, Theaceae, Mu s aceae eller Gram i neae og familien Leguminosae, frem for alt familien Papilionaceae av spesiell interesse. Foretrukket er representanter av familien Solanaceae, Cruciferae og Gr am i neae.

Målkulturer ifølge foreliggende oppfinnelse er f.eks. også følgende: Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycoperison, Nicotinana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Ant irrhinium, Hemeroca11 is , Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranuculus, Senecio, Sa 1pig 1 ossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum og Sorghus, samt fra rekken: Ipomoea, Passiflora, Cyclamen, Mal us, Prunus, Rosa, Rubus, Populus, Santalum, Allium, Lilium, Narcissus, Ananas, Archis, Phaseolus og Pisum.

På grunn av nyere utviklinger på området in v i t ro kultivering av planter, fortrinnsvis innenfor plantere-generasjonen, er det imellomtiden blitt mulig ut fra p1 anteprotop1 a ster å regenerere hele planter innenfor familien Gramineae. Eksempler på heldig gjennomførte regenerasjon sek s per imen ter ved Gramineer er u.a. beskrevet hos Abdullah, R et al., Bio/ Teehno 1 ogy , 4: 1 087- 1 090, 1 986, Fujimura, T., et al., Plant Tissue Culture Lett, 2_:74-75, 1985, Toriyama, K., et al., Theor Appl Genet, 73: 16-19, 1986, Yamada, Y., et al., Plant Cell Rep, 5:85-88, 1986 (Reis) samt hos Rhodes et al. (1988) for rna isprotoplåster.

Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse kan således også følgende planter anvendes: Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeium, Secale og Setar i a.

De modne planter som er dyrket frem fra transformerte planteceller, krysses med seg selv til frøproduksjon. Noen av frøene inneholder de gener som koder en nyttig og ønsket egenskap i et forhold som adlyder nøyaktig de etablerte lover innenfor arven. Disse frøene kan anvendes ved produksjonen av transgene planter.

Hymozygote linjer kan utvinnes ved gjentagen selvbestøvning og fremstilling av inna v 1 -1 injer. Disse innav 1 -1 injer kan igjen anvendes til utvikling av hybrider. Ved denne fremgangsmåte krysses til produksjon en innav-linje som inneholder nevnte fremmedgen, med en annen inna v 1 -1 inje.

Efter den generelle beskr i ve 1 se a v foreliggende oppfinnelsen skal det nu for å gi en bedre forståelse refereres til

spesifiske utføre 1seseksemp1er som er tatt med for å illu-strere oppfinnelsen, men som ikke har noen limiterende

karakter, med mindre det blir spesielt henvist til dette.

Ikke- begrensende utføre lseseksemp ler:

Generelle rekombinante DNA- teknikker

Fordi mange av de rekombinante DNA-teknikker som er benyttet i.foreliggende oppfinnelse, er .vanlig rutine for fagmannen, skal det her gis bare en kort beskrivelse av disse generelt brukte teknikker. Når det ikke er angitt noe

annet, er alle disse fremgangsmåter beskrevet av Man i at i s et al. ( 1982 ).

A. Kutting med restr iksjonsendonuk 1easer

I den av produsenten, New England Biolabs, Beverly, MA., anbefalte pufferopp1øsning foreligger i reaksjonsti 1 - f øri ngsstedet på typisk måte ca. 50 til 500 yjg/ml DNA. For hvert pg DNA tilsettes 2 til 5 enheter restriksjonsendo-nukleaser og reaksjonsti 1 før ingsstedet inkuberes i én til tre timer ved den av produsenten anbefalte temperatur. Reaksjonen avsluttes ved 10 minutters oppvarmning til 65°C eller ved ekstraksjon med fenol, fulgt av presipi-tasjon av DNA med etanol. Denne teknikk er også beskrevet på side 104 til 106 hos Maniatis et al.

B. Behandling av DNA med polymerase for å frembringe butte ender. 50 til 500 jug/ml DNA-t ragmenter tilsettes reaksjon st i 1 fø-ringsstedet i en puffer som er anbefalt av produsenten, New England Biolabs. Reaksjon st i 1 før ingsstedet inneholder alle fire desoksynukleotidtrifosfater i konsentrasjoner på 0.2 mM. Reaksjonen skjer i løpet av 30 minutter ved 15<0>C og avsluttes ved 10 minutters oppvarmning til 65°C. For fragmenter som oppnås ved kutting med restrikjsonsendo-nukleaser som frembringer 5 '-fremtredende ender, såsom EcoRI og BamHI, benyttes det store fragment, eller Klenow-fragmentet i DNA-po lymerasen. For fragmenter som oppnås ved endonukleaser som frembringer 3 1-fremtrendende ender, såsom Pstl og SacI , benyttes T4-DNA-polymerasen. Anvendelsen av disse to enzymer beskrives på side 113 til 121 hos Man i at i s et al. C. Agarose-ge1ektroforese og rensning av DNA-fragmenter av geler.

Aga rose-ge1e1 ektroforese gjennomføres i et horisontalt apparat som er beskrevet på side 150 til 163 hos Maniatis et al. Den anvendte puffer er den der beskrevne tris-borat-puffer. DNA-fragmentene farves med 0.5 yUg/ml et idiumbromid som foreligger enten i gel- eller tankpufferen under elektroforesen, eller som tilsettes efter elektroforesen. DNA gjøres synlig ved hjelp av belysning med langbølget u11ra v io 1 ett 1 ys. Når fragmentene ikke skal skilles fra gelen, skal det anvendes en agarose som gelerer ved lav temperatur og som leveres av Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Efter elektroforesen klippes det ønskede fragmentet ut, legges i et lite plastrør, oppvarmes ca. 15 minutter til 65°C, ekstraheres tre ganger med fenol og felles ut to ganger med etanol. Denne framgangsmåte kan lett forandres i forhold til den som er beskrevet på 170 hos Maniatis et al.

Som alternativ kan DNA isoleres fra agarosen ved hjelp av Geneclean Kits (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA). D. Tilsetning av syntetiske 1 inkerfragmenter på DNA-ender.

Om det ønskes et nytt endonuk1eases pa 11ningssted tilføyet ved enden av en DNA-molekyl, behandles molekylet likeledes først med DNA-polymerase for å frembringe glatte ender, slik som beskrevet i avsnittet ovenfor. Ca. 0.1 til 1.0 ug av dette fragment tilsettes til ca. 10 ng fosforylert linker-DNA, som leveres av New England Biolabs, i en volum på 20 til 30 pl med 2 ul T4 DNA-ligase fra New England Biolabs, og ImM ATP i den av produsenten anbefalte puffer. Efter inkubasjon natten over ved 15°C avsluttes

reaksjonen ved 10 minutters oppvarmning til 65°C. Reaks jonsti 1 f øyn i ngsstedet fortynnes til ca. 100 p 1 i en puffer som er riktig for restrikjsonsendonuk1easen som kutter den syntetiske 1 inkersekvens. Det tilsettes omtrent 50 til 200 enheter av denne endonuk1easen. Blandingen inkuberes 2 til 6 timer ved passende temperatur, deretter underkastes fragmentet en aga rose-ge1e1 ekt rotorese og renses som beskrevet ovenfor. Det resulterende fragment vil nu ha ender med ender som frembringes ved kutting med restriksjonsendonukleasen. Disse ender er vanligvis kohesive slik at det resulterende fragment lett kan knyttes til andre fragmenter med de samme kohesive ender.

E. Fjerning av 5'-terminale fosfater fra DNA-fragmenter.

Under p1 asmi dk 1 on ingstr innene forminsker behandlingen av vektorplasmidet med fosfatase vektorens resirkularisasjon (diskutert på side 13 hos Maniatis et al.). Efter kutting av DNA med den riktige restriksjonsendonukleasen, tilsettes en enhet alkalisk fosfatase fra tarm fra kalv, som leveres av Boehr inger-Mannhe im, Mannheim. DNA inkuberes i en time ved 37°C og ekstraheres deretter to ganger med fenol og felles ut med etanol.

F. Sammenknytning av DNA-fragmentene.

Når fragmenter med komplementære kohesive ender skal knyttes sammen, inkuberes ca. 100 ng av hvert fragment i en reaksjonsb1 anding av 20 til 40 pl med ca. 0.2 enheter T4 DNA-ligase fra New England Biolabs i en puffer som anbefales av produsenten. Inkubasjonen gjennomføres i 1 til 20 timer ved 150 C. Når DNA-fragmentene skal knyttes sammen med glatte ender, inkuberes disse som ovenfor angitt, bortsett fra at mengden av T4 DNa-ligasen økes fra 2 t i 1 4 enheter.

G. Transformasjonen av DNA i E. co 1 i .

E. co 1 i Stamm HB101 anvendes for de fleste eksperimenter. DNA innføres i E. coli ved ka 1siumk1 or idfremgangsmåten slik som beskrevet hos Maniatis et al., s. 250 - 251.

H. Screening av E. co 1 i på plasmider.

Efter transformasjonen testes de resulterende kolonier av E. coli på nærværet av det ønskede plasmid ved hjelp av en rask p1 asmidiso1 asjonsfremgangsmåte. To vanlige fremgangsmåter er beskrevet på s. 366 - 369 hos Maniatis et al. I. Isolering av plasmid-DNA i stor målestokk.

Fremgangsmåter til isolering av plasmider fra E_. coli i stor målestokk er beskrevet på s. 88 - 94 hos Maniatis et.

il-

J. Kloning i M13 fagvektorer.

Den etterfølgende beskrivelse skal forstås slik at den dobbe 1tkjedete replikative form for fag M13-avkom benyttes for rut inefremgangsmåter, som kutting med

restr iksjonsendonuk1ease, sammenknytting etc.

Enzymer leveres, når det ikke henvises til noe annet, fra

Boehringer Biolabs (BRL). De anvendes ifølge produsentens oppgave, med mindre det ikke er angitt noe annet.

Eksempel 1: Konst ruksjon av plasm idet pABDI

Man kutter de fritt tilgjengelige plasmider pkm 21 og pkm 244 [Beck, E., et al., Gene _19, 327 -336 (1982)] med re-striksjons-endonukleasen Pstl. Plasmidenes fragmenter som brukes til rekombinasjonen, renses ved hjelp av elektroforese i 0,8% agarose-gel. Plasmidet som oppnås fra bruddstykkenes forbindelse pkm 21244 inneholder en kombinasjon av 5'- og 3 ' -Bal 31 - delesjon av NPT-11-genet, som beskrevet av Beck et al. i Gene J_9, 327 -336 ( 1 982). For å forbinde promoters igna1 et i Cau1 i f 1ower-mos a ikk-v i rus et med Hind111-fragmentet i plasmidet pkm 21 244, konstrueres koblingsplasmidet pJPAX. Kob1 ingsp 1 asmi det pJPAX oppnås fra plasmidene pUC8 og pUC9 [Messing, J. and J. Vieira, Gene j_9, 269 -276 ( 1982 )]. 10 basepar av plasmidets kob1 ingssek vens pUC9 separeres ved kutting av Hindi 11- og Sa 11-pos isjonen og den etterfølgende påfylling av de adhe-sive ender med po 1ymerase-1-K1enow-fragmentet [Jacobsen, H., et al., Eur. J. Biochem. 45, 623 (1974)] og forbindelsen av po lynuk 1 eoti dkjeden , idet Hind III - pos isjonen igjen opprettes. Et syntetisk koblingsledd av 8 basepar (Xhol) innføyes på SmaI-pos isjonen av denne separerte koblings sekvens. Rekombinasjonen av de egnede Xorl- og Hind111-fragmenter i plasmidet pUC8 og det modifiserte plasmid pUC9, gir plasmidet pJPAX med en delvis asymme-trisk kob1 ingssek vens med de påfølgende restriksjonssteder : EcoRI, Smal, BamHT, SalT, Pstl, HindHI, BamHI, Xhol og EcoRT. CaMv gen VI promotor-regi onen som er knyttet sammen med NPT II struktur genet, stammer fra genomet for CaMV-stammen CM 4-184, en variant av CaMV-stammen CM 1841, hvis komplette nuk1eotidsekvens er beskrevet hos Gardner RC et al. CaMV promotor-regi onen kloner i cosmidet pHC 79 som omfatter 6 k.b, et avkom av E. coli plasmidet pBR322 ,[Hohn B and Co11 ing J, 1980], idet CaMV genomet samt cosmidet pHC79 kuttes med Bstll og de resulterende bruddstykker knyttes sammen. Forbindelsen av 5 '-ekspresjonssigna 1 et i Cau1 i11ower-moasikk-v i rus-genet VI og HindI I 1-fragmentet i NPT-II-genet bevirkes i plasmidet pJPAX ved innføyning av promoterregi onen i Cau1 i f 1ower-mosa ikk-v i rus-genet VI mellom Pstl- og Hind 111 - posisjonen . Det således oppnådde plasmidet kuttes opp på den eneste Hind 111 - pos isjon og Hind111-fragmentet i plasmidet pkm 2 1 244 bygges inn i kuttestedet i begge orienteringsretninger, idet man oppnår plasmidene pJPAX Cakm<+>og pJPAX Cakm". For å skape en EcoRV-sek vens i nærheten av 3 1 terminasjonssigna 1 et i NPT-11-hy br idgenet, bygges et BamHI-fragment av plasmidet pJPAX Cakm<+>inn i BamHI - pos isjonen av plasmidet pBR 327 [Soberon, X. et al., Gene 9, 287-305 (1980)]. Man oppnår plasmidet pBR 327 Cakm. EcoRV-fragmentet i plasmidet pBR

327 Cakm som inneholder de nye DNA-konstruksjoner, anvendes for å erstatte EcoRV-regionen i Cau1 i f 1ower-mosa ikk-v i rus - genet VI som er klonet på Sa 11 - pos isjonen i plasmidet pUC8, idet man stiller den protein-koderende DNA-sekvens i NPT-II-genet under kontrollen av 5'- og 3<1->ekspressjons-signalene i Cau1 i f 1ower-mosaikk-genet VI. De således oppnådde plasmider har betegnelsen pABDI og pABDII (jfr. fig. 1 ).

Eksempel 2: Konstruksjon av plasmidet pHP23A Konstruksjonen av plasmidet pHP23 skjer efter innskudd av et EcoRV-fragment i plasmidet pABDI, som inneholder APH-(3')11-strukturgenet samt en del av 19S RNA promotor-sekvensen av CaMV, inn i Smal-siden i plasmidet pDH51 (jfr. fig. 2).

Plasmidet pDH51 er beskrevet hos Pietrzak et al., 1986 (26). Dette plasmid inneholder 35S promotor - reg i onen og terminator-regi onen av CaMV som er separert ved en innskudd po ly 1 inker-regi on som inneholder tallrike k 1 on ingssteder.

Som utgangsmateri a 1e for 35S promotor-/terminator regionen tjener et Sea I-fragment av CaMV "S" som omfatter nukleotiden 6808-7632 i genkortet (Frank G et al., Cel1, 2J_: ( 285-294, 1980 ), og som spleises inn i Smal-stedet for pUC 18 (Norrander J. et al., Gene, 26: 1 0 1 - 1 06, 1983 ), under dannelse av plasmid pDB21. Dette fordøyes deretter med restrikjsonsenzymet Hphl. De kohesive ender fjernes ved behandling med T4 DNA polymerase.

Et fragment som inneholder 35S promotor-regi onen [p U C18 pos. 21 (Hph I)-412 (Smal) plus CaMV pos. 6808-7437 (Hphl), knyttes sammen med Kpnl linkere, kuttes med Ncol (pos. 6909 CaMv), de kohesive ender fylles ved hjelp av DNA-polyme-rasens Klenow-fragmentet, knyttes sammen med EcoRI - 1 inkere og til slutt fordøyes med EcoRI og Kpnl.

Det resulterende EcoRI/KpnI - fragment som inneholder CaMv promotor-sekvensen, spleises deretter inn i plasmidet pUC18 mellom Kpnl og EcoRI restrikjsonskuttesteder. På denne måte oppnås plasmidet pDG2.

Et annet fragment som bærer termi nasjonssigna1 ene [CaMV pos. 7439 (Hphl)-7632 plus pUC18 pos. 413-1550 (Hphl)], kuttes med EcoRI, de kohesive ender fylles med Klenow, for-synes med Hindi 11 linkere og fordøyes med Hindi 11 og Sphl.

Det resulterende sphl-hindlll fragmentet som inneholder CaMV terminator-sekvensen, spleises deretter inn i plasmidet pDG2, nemlig i Hindi 11 og Sphl restriksjonskutte-stedene.

pHP23 modifiseres ved deles jon av en del av polylinker-

regionen. Efter kutting av plasmidet med BamHI og Sphl og delesjon av BamHI-SphI fragmentet, fjernes de kohesive ender ved hjelp av T4-polymerase og bruddstykkene knyttes sammen under dannelse av pHP23 /\ .

Konstruksjonen av p H P 2 3 Zl kompletteres ved reklonering av et EcoRI - f ragment som bærer hybrid-genet, i plasmidet p U C19 (Roberts RJ, 1984), som gjør fremstillingen av delesjonsmutanter enk 1 ere.

Eksempel 3: Konstruksjon av plasmidet pABDH

BamHI fragmentet av plasmidet pLG88, som er beskrevet hos Blochlinger og Diggelmann, Mol. Cel 1. Biol., 4 ( 12): 2929 - 293 1, 1984 og som inneholder regionen i hygromycinfos fo-transferansen (hph) som koder proteinet, spleises inn i BamHI siden i p D0B612 (Balazs E et al., Gene, 40: 343-348, 1985) under dannelse av pABDH (jfr. fig. 2).

Eksempel 4: Gen- targeting

2 Plasmider med forskjellige oppbygginger av A P H(3 ' ) 11 hybrid markør-genet anvendes ved fremstilling av delesjonsmutanter som er innbyrdes komp 1ementerende.

N j -stamme

1. Plasmid pABDI (jfr. fig. la) som er beskrevet hos Paszkowski J et al., Embo J,3<_>, 27 1 7 -2722, 1 984) kuttes med restriksjonsenzymene Ball og Smal. Ved delesjon av Ba 11-sma I - f ragmentet i pABDI oppnås de 1 esjonsmutantene A -Ball (jfr. fig. lb). 2. Li near isering av dette plasmid på Ndel restriksjons-kuttestedet.

3. Integrasjon av det lineariserte plasmid i det

nukleare genomet i tabakk ved Co-transformas jon med

pABDH. På denne måte oppnår man Nj-stammen i Target-tabakken.

Rp, R^-stamme

1. Kutting av pABDI med Narl. Ved delesjon av Narl-fragmentet i plasmidet pABDI oppnår man de 1 esjonsmutyantene A Narla (jfr. fig. lc). 2. Li near i ser ing av plasmidet på Ndel restr iksjonskutte - stedet. 3. Co-transformasjon av A Narl i tobakk-genomet. Man oppnår Target-stammene R2og R^.

Jj , -stamme

1. Kutting av pABDI med Pstl. Ved delesjon av Pstl-fragmentet i plasmidet pABDI oppnår man de 1 esjonsmutantene A Pst I (jfr. fig. Id). 2. Li near i ser ing av plasmidet på Ndel restr ikjsonskutte-stedet. 3. Innføring av A Pstl i tabakk-genomet gir Target stammene Jjog J^.

Delesjons- mutanter

A Sphl ( p 19SphI):

Kutting av plasmid pHP23 A med sphl og delesjon av Sp hI - fragmentet fører til delesjonsmutantene Sphl (jfr. fig.

1 f ).

A Nar Ib ( p! 9NarIb) :

Kutting av plasmid pHP23 A med Narl og delesjon av Narl- fragmentet fører til delesjonsmutantene A Narlb (jfr. fig. lg).

De anvendte metoder for p1 asmid-konstruksjonen er beskrevet hos Maniatis et al., 1982.

Eksempel 5: Fremstilling av tobakkprotopI åster Tobakkprotop1 åster fremstilles efter konvensjonelle metoder ut fra en ta bakk-sus pensjonku11ur (Potrykus I and Shillito RD, Methods in Enzymology, Vol. 118, Plant Molecular Biology, eds. A and H. Weissbach, Academic Press, Orlande, 1986). Fullstendig utfoldede blader hos 6 uker gamle sp ire-ku1 turer fjernes under sterile betingelser og fuktes grundig med en enzymoppløsning med følgende sammensetning:

Enzymoppløsning

H20 70 mg

Sakkarose 13 mg

Macerozymer 1 mg

R 10

Cellulose 2 g

'Onozuka' Rjq

Drisellase 0.13 g

MES 0.5 ml

pH 6.0

Bladene kuttes deretter i 1-2 cm store kvadratiske stykker og får svømme opp på ovennevnte enzymoppløsning. Inkubasjonen skjer natten over ved en temperatur på 26°C i mørke. Dene blanding rystes deretter lett og inkuberes for ytterligere 30 minutter inntil fullstendig fordøyning.

Denne suspensjon filtreres deretter til separasjon av ufordøyede vevsrester gjennom en stålsil med en maske-vidde på 100 jum, spyles med 0.6 M s uk roseopp 1 øs n i ng (MES, pH 5-6) og sentrifugeres deretter i 10 minutter ved 100 g. På grunn av denne behandling samler det seg protoplaster på mediets overflate som deretter trekkes av unbder protop1 åster, f.eks. under anvendelse av en sterilisert i njeksjonssprøyte.

Protoplastene resuspenderes deretter i et K3A medium som inneholder 0,4 M sukrose og som vaskes på den foran angitte måte 3 x ved flotasjon og etterfølgende fjerning av mediet for å fjerne det vedhengende enzymet. De rensede protoplaster suspenderes deretter i en oppløsning av 0,4 M mannitt og 1 g/liter MES slik at det foreligger en proto-plasttetthet på 1,2 til 1,6 x IO<4>ml.

Eksempel 6: Co- transformas jon av protoplaster av Nicotiana tabacum cv. Petit Havanna SRI ved hjelp av Mg^+/ PEG-behandling ( Negrutiu, I, et al. 1987)

Co-transformasjonen av de 1 esjonsp1 asmid-DNA og pABDH-DNA gjennomføres tilsvarende anvisningene hos Schocher et al., 1986. For gjennomføringen av transformasjonseksperimentene blir først protoplastene vasket, tellet og deretter resus-pendert i et W5-medium [154 mM NaCl, 125 mM CaC12

2H20, 5mM KC1, 5 mM glukose, pH 5.6; Menczel, L. et al.

(1981)], som sikrer en høy overlevelsesrate av de isolerte protoplaster, i en celletetthet på 1-2.5 x 10 celler pr. ml. Protoplastene anvendes så efter en inkubasjonstid på 30 minutter ved 6°C til 8°C til transformasjonseksperi - mentene.

Kort før den egentlige transformasjon av de isolerte protoplaster erstattes W^-mediet med det egentlige transfor-ma sjonsmedi et. Det dreier seg her om en Mannitt/rnagne-sium-oppløsning [MaMg-Lsg: 0.4-0.5 mM manitt, 0.1 % MES (Mo rfo1 i netansu1 fon sy re), pH 5.6] med en Mg^ + -konsentrasjon på 12 til 16 mM. Dertil separeres først protoplastene fra W^-oppløsningen ved 5-minutters sentr i fugering ved 100 g og resuspenderes i MaMg-mediet (0.3 ml). Til denne suspensjon tilsettes 65 ^u 1 av en vandig DNa-opp 1 øs n i ng , inneholdende 5 - 10 ug delesjonsplasmid-DNA, 2 jjq av plasmidet pABDH og 40 jjg ka 1 vehymus-ca rr i er DNA. Ved sistnevnte dreier det seg om en nøytral carrier-DNA uten transformerende innskudd som tilsettes i overskudd til denne blanding, for å beskytte mot en muk1easefordøyning av DNA som skal transformeres. Plasmid og carrier DNA steri-liseres forut ved etanol rep res ipi tasjon som er beskrevet hos Paszkowski und Saul, 1986. Efter et tidsrom på ca. 0.1 til 10 minutter efter DNA-1i 1setni ngen , skjer applikasjonen av en vandig 40 % polyetylenglykoloppløsning (w/v), til en sluttkonsentrasjon på 24 til 28 % (w/v) er oppnådd. Spesielt fordelaktig har bruken av PEG av CMS typ vist seg å være. Herved dreier det seg om en Ca^<+->holdig [0.1 M Ca(N03 ) 2-4H20 ] 0.4 M rnani11opp1øsning som inneholder

PEG med mo 1 eku1 a rvekt på ca. 1000 til ca. 6000 i en sluttkonsentrasjon på 40 % (w/v). pH-verdien av denne oppløsning ligger ved pH 7 til 9 fNegrutiu, I. et al.

(1986a ) ].

I tilfellet Nicotiana tabacum cv. Petit Havanna SRI anvendes fortrinnsvis PEG CMS 4000. pH-verdien av trans-formasjonsmedi et justeres deretter til en verdi på pH 7. Denne blanding inkuberes under leilighetsvis rysting i 30 minutter ved 26°C.

Ved anvendelse av høye PEG-konsentrasjoner på >20 % er en trinnvis fortynning med 3 til 5 ganger volum av en 0.2 M CaCl2-oppløsning fordelaktig. Deretter avsentri fugeres

de på den angitte måte behandlede protoplaster (5 minutter ved 100 g) og resuspenderes i ferskt K^-medium (0.3 ml protoplastenoppløsning i 10 ml ferskt K^-medium). Den ytterligere inkubasjon skjer i 10 ml-porsjoner i Petri-skåler på 10 cm diameter ved 24°C i mørke, idet populasjonstettheten er på 4 til 8x10 4protoplaster pr.

ml. Efter 3 dager fortynnes kulturmediet med 0.3 volumdeler fersk K^-medium pr. skål og inkuberes ytterligere 4 dager ved 24°C og 3000 lux kunstig belysning. Efter totalt 7 dager innføres klonene som er utviklet fra protoplastene, i nær ingsmedium som er størknet i 1 % agarose og som inneholder 12 mg/l hygromycin og kultiveres efter "bead type "-kulturmetoden [Shillito, R.D. et al, Plant Cell Reports, 2, 244-247 (1983)] ved 24°C i mørke. Nær ingsmed i et erstattes hver 5. dag med en fersk likearted nær ingsoppløsning.

Efter 6 uker overføres de hygromycin-res istente kloner som har fått en diameter på 1-2 mm, til et med agar størknet ant ibi ot ikaho1dig medium uten hygromycin.

Ku 11i ver ingsbet inge1 sene samt regenerasjons-protokollen er beskrevet hos Saul et al., 1987.

Eksempel 7: Undersøkelse av hygromycin- res istente kloner

på spleising av A P H( 3 ' ) 11 delesjonsmutanter Totalt ble 7 hygromycin-res istente kloner testet ved hjelp av Southern blot Hybr idisat i on på spleising av APH(3')II de 1 esjonsmutanter i plantegenomet.

Fem av de testede kloner som har den ventede genkonstruksjon (3 forskjellige APH(3 ' ) II-gen-de 1 esjoner ) anvendes i de videre eksperimenter.

Kopiantallet av target-delesjonen varierer i et område på to til ti. (Stamme Jj- 3 kopier, stamme J~- 7 kopier. Stamme Nj- 5 kopier, stamme R2- 2 kopier, stamme R^

- 10 kopier).

Av disse cellelinjer regenereres de transgene planter ifølge den hos Saul et al., 1987 beskrevne regenerasjons-protokoll og formeres videre i form av sterile spirekultu-rer.

Efter flere subku11i ver inger oppnår man blader som gir et godt utbytte av pro 1 i fer ierende protoplaster. Integrasjonen av genoppbygningen i det nukleare genomet verifiseres ved hjelp av den mitotiske stabilitet og arv som et singulært Mendelsk trekk ved hjelp av Southern blot hybridisering.

Eksempe1 8 : " Gen Targeting" eksperime nter

For "gene targeting" eksperimenter anvendes protoplaster av de 5 på forhånd valgte linjer. Plasmid DNA, som inneholder komp 1ementerende avsnitt av det kimære APH(3 1 ) 11 - gen, spleises ved hjelp av de i eksempel 6 beskrevne direkte gentransfer-fremgangsmåter inn i protoplastene i de korresponderende p1antestammer, idet følgende kombinasjoner er valgt.

pl9NarIb med stamme Nj

p 19 S p h I med stamme R^, R3, Jjog J^.

Eksempel 9: Utvalg av kanamycin- resistente cellekloner Efter 3 til 4 uker fortsatt kultivering i kanamycin-ho 1 - dig nær ingsmed ium plantes de resistente kalli med en diameter på 2 til 3 mm på LS-ku1turmedium som er størknet med agar [Linsmaier EM and Skoog F, Phys i 01. Plant. 18: 1 00 -1 27, 1 965 ], inneholdende 0.05 mg/l 2,4-dik1orfenoksy - eddiksyre, 2 mg/l 1-nafty 1 edd iksyre , 0.1 mg/l 6-benzyl-aminopurin, 0.1 mg/l kinetin og 75 mg/l kanamycin. Ved spi re induksjon på LS-medium inneholdende 150 mg/l kanamycin og 0.2 mg/l 6-benzy1aminopurin og etterfølgende rotdannelse på T-medium [Nitsch, YP and Nitsch C, Science, 163: 85-87 1969 ] oppnår man kanamycin-res istente Nicotiana tabacum-planter av sorten Petit Havanna SRI.

Eksempel 10: Påvisning av NPT- II- genet i p 1 antearv egodset 0,5 g kallus av de transformerte cellekulturer eller blad-vev fra den derav regenererte plante homogeniseres ved 0°C i 15 1 sakkaroseoppløsning, inneholdende 50 mMo 1/1 etylendiamin-N,N,N' ,N'-tetraeddiksyre, EDTA), 0,25 Mol/l natriumklorid og 50 mMo 1/1 a,a,a-tris-(hydroksymetyl)-mety 1 am in-hydrok1 or id (TRIS-HC1) ved pH 8,0. Ved sentri-fugering av homogen i sa tet i 5 minutter ved 1 000 g grovse-pareres cellekjernene. Cellekjernene resuspenderes i 15 % sakkaroseoppløsning, inneholdende 50 mMol/1 EDTA og 50 mMol/1 TRIS-HC1, blandes ved pH 8,0, med natrium-do-dekylsulfat til en sluttkonsentrasjon på 0,2 % og oppvarmes i 10 minutter til 70°C. Efter avkjøling til 20-25°C tilsettes til blandingen kaliumacetat inntil en konsentrasjon på 0,5 Mol/l. Denne blanding inkuberes i 1 time ved 0°C. Det utfelte bunnfall sentrifugeres ved sentr i fuger ing (15 minutter ved 4°C i en

mikrosentri fuge ). Fra den resterende væske utfelles DNS ved blanding med 2,5 ganger mengden etanol ved 20-25°C.

Den separerte DNS oppløses i en oppløsning av 10 mMol TRIS-HC1, inneholdende 10 ug/ml ribonuclease A, inkuberes i 10 minutter ved 37°C, blandes med proteinase K inntil en konsentrasjon på 250^ug/ml og inkuberes ytterligere en time ved 37°C. Proteinasen K fjernes ved fenol- og kloroform/ isoamylakohol-ekstraskjoner. Fra den vandige fase utfelles DNS ved tilsetning av 0,6 volumdeler 0,6 molar isopropano1 isk natr i urnacetat-opp 1 øsning og oppløses i en oppløsning, inneholdende 10 mMol/1 TRIS-HC1 og 5 mMol/1 EDTA ved pH 7,5. Ved denne preparering oppnår man DNS-sekvenser som inneholder fortrinnsvis mere enn 50'000 basepar. Restriksjon av denne DNA med EcoRV-endonuk1ease, hybridisering av fragmentene med radioaktiv markerte Hindlll- bruddstykker av NPT-II-genet og sammenligning med plasmid pABDI viser i en "Southern Blot "-ana lyse nærværet av NPT-II-genet i cellekjerne-DNS av de transformerte' Nicotiana tabacum-celler.

Eksempel 11: Southern blot- analyse:

Analysen av plante DNA gjennomføres tilsvarende en av de hos Paszkowski und Saul, 1983 beskrevne metoder.

Omtrent 5 ug genomisk DNA kuttes valgfritt med EcoRV eller Hind 111 - restr iksjonsenzymer og de oppnådde bruddstykker oppspaltes ved elektroforese i en 1 % standard-agarose-gel.

(Maniatis T et al., 1982 ).

Southern blot analysen gjennomføres ifølge anvisningene hos Paszkowski und Saul, 1986.

Nick-trans 1 asjonen erstattes derved med "random primer" metoden som er beskrevet hos Feinberg und Vogelstein, 1983.

Dette fører til en reproduserbar aktivitet på mere enn

IO<8>Cpm/jug DNA.

Resultater

Fra 3 uavhengig av hverandre gjennomførte eksperimenter, hvor totalt 1,4 x 10 Q protoplaster deltok, oppnådde man 8 kanamycin resistente cellekloner.

I de samtidig gjennomførte kontro11 forsøk hvor det ble anvendt Wildtyp SRI protoplaster og hvor ingen komplementære de 1 esjonsmutanter ble tilbudt, kunne ingen resistente kloner iakttas.

Kanamycin-resistente cellelinjer oppnådde man i første linje fra mottagerstammene J 2 0 9 R 3 •

Frekvensen av dannelsen av kanamycin-res istente kloner kan sammenlignes med transformasjonsfrekvensen av parallell gjennomførte forsøk hvor ikke-avbrudte hybride genkonstruk-sjonerbleanvendt.

De anvendte 3' og 5' APH(3' ) 11 gen-de 1 esjoner stammer fra to hybride gener som adskiller seg i sin promotor og terminator-reg ion.

Således fører en homolog rekombinasjon av disse delesjonsmutanter til et markørgen som bærer ny kombinerte flankerende DNA sekvenser som i sammenligning til de før eksisterende genkonstruksjoner fører til anderledes restriksjonsfragmenter.

Southern blot analysen bekrefter at en homolog rekombinasjon har funnet sted på de sentrale homo 1 og ieområder i de to APH(31 ) 11 de 1 esjonsmutantene og utelukker således samtidig muligheten for en transformasjon ved kontaminerende foreldre-plasmider.

DNA- ana lyse

DNA fra 4 J2komp 1ementerende kloner ble undersøkt.

Et EcoRV-fragment (1247 bp) som står i sammenheng med de nye markør-gener, ble påvist hos samtlige undersøkte kana-myc in-resistente kloner.

Samtidig gjør Southern blot analysen tydelig at ikke alle integrerte APH(3 1 ) 11 gende1 esjoner kunne korrigeres.

Tilsynekomsten av DNA-fragmenter som tilsvarer den igjen-opprettede fullstendige gen-kopi, kommer samtidig med en avtagning av de deleterte gen-kopier. Dette gir en henvisning til at det innenfor genomet ved homolog rekombinasjon kommer til en spesifisk korrektur av den muterte gen-kopi ved den innspleisede DNA.

En genomiske kartlegging viser at et Hindlll fragment av 805 bp som bærer den region i APH(3')II genet som koder proteinene, blir eksakt rekonstruert.

Dette betyr at den hybride genkorrektur med største sannsynlighet forløper eksakt.

Påvisning av overføringen av det transformerte gen tii de seksuelle etterkommere samt dens arv som normalt plantegen.

Omfangsrike genetiske krysningsa na 1 yser og utførlige mo 1eky 1 arbio1 og iske studier (f.eks. "Southern b 1 ot "-ana lysen av DNS i plantegenomet; Undersøkelser av enzymaktiviteten i am inog1ykos id-fos fot ransferanse, dvs. enzymet for kanamycin - spes i f isk fos fory1 er ing ) med de gen-netisk forandrede planter(første generasjon og etterføl-gerne) har gitt følgende resultater: 1. Det bakterielle gen er stabilt spleiset inn i p 1 antegenomet; 2. Det overføres som regel uforandret og regelmessig på krysningsefterkommerne; 3. Arvegangen tilsvarer den i et naturlig, enkelt, dom i nant pl antegen ; 4. Den molekylare analyse ved hjelp av DNS-hybr idiser ing og enzymtest bekrefter resultatene av den genetiske krysn i ngsanalyse ; 5. De genetisk forandrede planter har beholdt sin normale, naturlige fenotyp under behandlingen; det ble altså ikke fastslått noen uønskede forandringer.

Disse resultater viser at man med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til direkte genoverføring i protoplaster har funnet den beste måte for en målrettet genetisk forandring av plantemateriale. Den genetiske forandring er stabil og uønskede forandringer av plantens genotyp opptrer ikke.

Fra den ifølge a) oppnådde kanamycin-resistente tobakks-plante utvinnes homozygote linjer efter kjente metoder, nemlig i seg selv og ved utvelgelse. Således blir Ni cot i ana-tabacum planter tilgjengelige, hvor hvert haploid genom inneholder kun en eneste kopi av neomycintransferase-genet NPT-II.

D eponer i ng:

Plasmidet p 19 S p h I ifølge foreliggende oppfinnelse ble med sikte på patentering, i overensstemmelse med kravene i Budapest Konvensjonen, deponert ved "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" (DSM), Forbundsrepublikk Tyskland, som er anerkjent som internasjonalt deponer ingssted. En erklæring på levedyktigheten av de deponerte prøver ble utstedt av

nevnte internasjonale deponer ingssted.

Mikroorganisme Deponerings- Deponerting- Datum for datum nummer<*>levedyktig-hetsattesten ;p19 Sph I 27.1 0. 1987 DSM 4289 4.1 1.1987 ;( Escheri ch i a;coli trans -;formert med;p 1 9Sph I;plasmid DNA;<*>Deponer ings-nummer, utstedt ved ovennevnte internasjonale deponeringssted.

Litteraturfortegnelse:

1. Abdullah R et al., Bio/ Teehno 1ogy, 4: 1 087- 1090, 1986

2. Ambros PF et al., EMBO J., 5: 2073-2077, 1986.

3. Balazs E et al., Gene, 40: 343-348, 1985

4. Beck E et al., Gene, _1 9: 327 -336, 1 982

5. Berry-Lowe et al., J. Mol. Appl. Genet. J_, 483-498,1982 6. Binding H, "Regeneration of Plants", i Plant

Protoplasts, s. 21-37 (CRC Press, Boca Raton 1985)

7. Blochlinger und Diggelmann, Mol. Ce 11. Biol., 4( 12') : 2929-2931, 1984 8. Cashmore A., Geneti c Engineeri ng of Plants, an Agricultura1 Perspektiv, Plenum Press, New York, 1983, pp 29-38 9. Coruzzi G et al. The J ournal o f Biologica l Chemistry, 258: 1399, 1983 10. Dale PJ, "Protoplast Culture and Plant regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", i Protop lasts 1983 - Lecture Proceedings, s. 31-41, (Birkhåuser,

Basel 1983)

11. Davey MR, "Recent Developments in the Culture of Plant Protop1 asts", Protoplasts, 1983 - Lecture Proceedings,

s. 19-29, (Birkhåuser, Basel 1983);

12a. De Clene et al., Bot. Rev., 47: 147-194, 1981,

12b. De Clene et al., Bot. Rev., 42: 389-466, 1976,

13. De Lozanne A and Spudich JA, Science, 236: 1086-1091, 1987 , 14. Dunsmuir P et al., J. Mol. Appl. Genet., 2: 285, 1983,

15. Evans, et al., "Protoplast Isolation and Culture",

i Handbook fo Plant Cell Culture, 1: 124-176 (MacMillan

Publishing Co. New York 1983),

16. Feinberg AP and Vogelstein B, Analytical Biochem istry, 132: 6-13, 1982, 17. Fraley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80: 4803, 1983,

18. Frank G et al., Cell, 2A: 285-294, 1980,

19. Fromm et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 5824, 1985, 20. Fujimura T, et al., Plant tissue Culture Lett, 2: 74-75, 1985, 21. Gardner RC et al., Nucl. Acids Res., 9: 2871-2888, 1981

22. Gres sel J, Oxford Surv. Plant Mol Cell Biol., 2:

321 - 328, 1985

23. Gritz I and Davies J, Gene, 25: 179-188, 1983

24. Hinnen H et al., Proe. N ati. Acad. Sei, USA, 75: 1929-1933, 1978 25. Hohn et al., i " Molecular Biology of Plant Tumors" Academic Press, New York, s. 549-560, 1982

26. Hohn B and Collins J, Gene, _H: 291-298, 1980

27. Horsch et al., Science, 233: 496-498, 1984

28. Howell, US-patent nr. 4 407 956

29. Jacobsen H ^et_aj_. , Eur. J. Bi ochem. , 45: 623, 1 9 74 30. Linsmaier EM and Skoor F, Physio l. Plant, J_8: 1 00- 1 27, 1965 31. Maniatis et al., Molecuiar Cloning, Cold Spring Harbor

Laboratory, 1982

32. Menczel L et al., Theor AppI. Genet., 59: 191-195, 1981

33. Msssing J and Vieira J, Gene, 19: 269-276: 1982

34. Miller Bl et al., Mol. Cel 1. Biol. , 7: 427-434, 1987 35. Negrutiu J. et al., Plant Mol. Biol., 8: 363-373, 1987 36. Negrutiu J. et al., Theor. App1. Genet, 72: 279 -286 , 1986a 37. Neuhaus G. et al., Theor. Appl. Genet., 74: 30-36, 1987

38. Nitsch YP and Nitsch C, Science, 1963: 85-87, 1969

39. Norrander J et al., Gene, 26: 101-106, 1983

40. Paszkowski J et al., E MBO J., 3: 2717-2722, 1984

41. Paszkowski J and Saul M, Methods in Enzymology, 118: 627-646, 1986 42. Pietrzak M. et al., Nucl. Acids Res. , J_4: 5857 -5868, 1986 43. Pot rykus J et al., Mol. Gen. Genet. , 199 : 169-177, 1985 44. Potrykus I and Sh i 11 i to RD, Methods in Enzymology, Vol 118, Plant Molecuiar Biology, eds. A. and H.

Weissbach, Academic Press, Orlando, 1986

45. Rhodes et al., Biotechno 1 ogy , 6: 56 -59, 1988

46. Roberts RJ, Nucleic Acids Res., 12, 1984

47. Schocher RJ et al., Bio/ Teehno 1ogy, 4: 1093-1 096, 1986 48. Shillito RD, et al., Bio/ Techno1ogy, 3: 1 099 -1 103, 1985 49. Shillito RD, et al., P lant Cell Reports, 2: 244-247, 1983

50. Soberon X et al., Gene, 9: 287-305, 1980

51. Southern EM, J. Moi. Biol., 98: 503-517, 1975

52. Toriyama K, et al., Theor Appl Genet, 73: 16-19, 1986

53. Wallroth M et al., Mo l. Gen. Genet, 202: 6-15, 1986

54. Wienand K et al., Mol. Gen. Genet, 182: 440-444, 1981

55. Yamada Y, et al., Plant Cel1 Rep, 5: 85-88, 1986

56. Zarawski G et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 79: 7699-7703, 1982

Claims

1. Rekombinant DNA molekyl som muliggjør en målrettet integrasjon av gener, genfragmenter eller andre DNA-sekvenser på nøyaktig definerte steder innenfor plantegenomet, karakterisert ved at nevnte rekombinante DNA molekyl inneholder DNA som skal integreres, og nevnte DNA oppviser homologier tilsvarende DNA regioner innenfor plantegenomet eller flankeres av slike homologe DNA-sekvenser i den utstrekning at det ved transformasjon av plantecellene som inneholder de homologe DNA regioner, ved homolog rekombinasjon finner sted en målrettet integrasjon av nevnte DNA som skal integreres, på nøyaktig definerte steder innenfor plantegenomet.

2. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA som skal integreres, som eventuelt står under kontroll av ekspresjonssignaler som er funksjonsdyktige i plantecellen, er knyttet sammen med flankerende DNA-avsnitt som oppviser homologier med en bestemt region innenfor plantegenomet.

3. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA som skal integreres, som eventuelt står under kontroll av ekspresjonssignaler som er funksjonsdyktige i plantecellen, oppviser en tilstrekkelig stor homologi til tilsvarende DNA-regioner innenfor plantegenomet, slik at det ved hjelp av den homologe rekombinasjon skjer en direkte utskiftning av nevnte DNA som skal integreres, mot nevnte homologe genomiske DNA.

4. Rekombinant DNA molekyl ifølge ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at nevnte DNA som skal integreres a) består enten av genomisk DNA, av en cDNA eller av syntetisk DNA; b) er sammensatt av genomisk DNA såvel som cDNA og/eller syntetisk DNA; c) er sammensatt av et gen(er) eller andre DNA-fragmenter av flere organismer som tilhører forskjellige familier; d) er sammensatt av et gen(er) eller andre DNA-fragmenter av organismer som tilhører forskjellige stammer, eller varianter av en art eller forskjellige spesies av en familie; eller e) er sammensatt av andeler av flere enn ett gen av samme organisme.

5. Rekombinant DNA molekyl som angitt i ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det ved nevnte DNA som skal integreres, dreier seg om et strukturgen som gir den transformerte plante en nyttig og ønsket egenskap.

6. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 5, karakterisert ved at nevnte strukturgen a) gir planten en øket resistens eller toleranse overfor patogener, herbicider, insekticider eller andre biocider; b) forbedrer dannelsen og kvaliteten av reserve- og lagringsstoffer i blader, frø, knoller, røtter og stilker; c) er et p1 ante1agringsprotei ngen ; eller d) koder farmasøytisk aksepterbare akti vsubstanse r.

7. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at det ved DNA som ska'l integreres, dreier som om ikke-koderende DNA-sekvenser med regulatorisk funksjon.

'8. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 2, karakterisert ved at nevnte ekspresjonssignaler stammer fra gener av planter eller plantevirus.

9. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 8, karakterisert ved at a) nevnte ekspresjonssignaler stammer fra et plantegen som koder den minste subenhet i r i bu 1 ose -1 ,5-bisfos fatka rbok - sylasen eller klorofyll a/b bindingsproteinet; b) stammer fra gener fra Cauliflower mosaikk virus (CaMV).

10. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at det ved nevnte flank erend e' DNA-sekvenser dreier seg om slike som har homologi til planteegne gener eller genomavsnitt.

11. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at det ved nevnte flankerende DNA-sekvenser dreier seg om slike som oppviser homologi til gener eller genfragmenter eller andre nyttige DNA-sekvenser, som forut er blitt artifisielt integrert i genomet av en målplante ved hjelp av kjente fremgangs- måt eforholdsregler, og hvis nukleotidsevkenser helt eller delvis er kjente.

12. " Rekombinant DNA molekyl somangitt i krav 11, karakterisert ved at det ved nevnte flankerende DNA og det DNA som er artifisielt integrert i plantegenomet, dreier seg om innbyrdes komp 1ementerende DNA-sekvenser som efter foretatt homolog rekombinasjon danner, en funksjonell enhet innenfor plantegenomet.

13. Rekombinant DNA molekyl som angitt i ett av kravene 10 til 12, karakterisert ved atnevnte gener eller genfragmenter eller andre nyttige DNA-sekvenser er lokalisert i områder innenfor plantegenomet, som naturligvis oppviser en høy ekspresjonsrate.

14. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at a) nevnte rekombinante DNA molekyl inneholder et strukturgen ifølge ett av kravene 5 eller 6, b) nevnte strukturgen eventuelt på operabel måte er knyttet sammen med i planteceller funksjonsdyktige eks pressjonssigna 1 er ifølge ett av kravene 8 eller 9, c) nevnte funksjonelle enhet, bestående av strukturgen og eventuelt ekspresjonssignaler, på en måte flankeres av DNA-sekvenser som i en slik utstrekning oppviser homologier til tisvarende DNA-regioner innenfor plantegenomet, at det ved transformasjon av plantecellen som inneholder nevnte homologe region, ved homolog rekombinasjon finner sted en målrettet integrasjon av den gensekvens som flankeres av homologe DNA-sekvenser, på definerte steder innenfor p 1 a ntegenomet.

15. Fremgangsmåte ved fremstilling av transgene planter, karakterisert ved at man transformerer et gen, et genfragment eller andre nyttige DNA sekvenser under anvendelse av et rekombinant DNA molekyl ifølge ett av kravene 1 til 14, ved hjelp av kjente fremgangsmåter inn i en plantecelle og integrerer det målrettet inn i plantegenomet på et på forhånd bestemt sted via homolog rekombinasjon.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert ved at transformasjonen av plantematerialet som inneholder de homologe DNA-avsnitt, gjennomføres under anvendelse av a) Agrobacterium-transformasjonssystemet; b) CaMV-transformasjonssystemet; c) direkte gentransfer ing; eller d) en Co-transtormasjon.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert ved at man integrerer naturlige eller modifiserte gener eller genfragmenter eller andre nyttige DNA-sekvenser inn i plantegenomet ved rekombinasjon med homologe DNA-avsnitt innenfor plantegenomet.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert ved at integrasjonen skjer i en region i plantegenomet, som sikrer en høy ekspresjonseffekti v itet og/eller en fordelaktig regulerbarhet av det integrerte genet.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at nevnte homologe genomiske DNA-avsnitt er en naturlig bestanddel av plantegenomet eller er blitt integrert artifisielt i p1antegneomet ved hjelp av kjente fremgangsmåteforholdsregler.

20. En DNA-transfer-vektor, karakterisert ved at den inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge ett av kravene 1 til 14.

21. En DNA-ekspresjons-vektor, karakterisert ved at den inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge ett av kravene 1 til 14.

22. En vertscelle, karakterisert ved at den a) inneholder en DNA-transfer-vektor ifølge krav 21; eller b) inneholder en DNA-ekspresjons-vektor ifølge krav 21.

23. En vertscelle som angitt i krav 22, karakterisert ved at dreier seg om a) en mirkoorganisme eller b ) en pl antece11e.

24. Plantemateriale bestående av en transgen plante og dennes frø, karakterisert ved at nevnte plantemateriale er blitt transformert med et rekombinant DNA molekyl ifølge ett av kravene 1 til 14.

25. En plantecelle, karakterisert ved at den inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge ett av kravene 1 til 14.

26. Plantemateriale bestående av en transgen plante og dennes frø, karakterisert ved at nevnte plantemateriale inneholder planteceller ifølge krav 25.

27. Plantemateriale bestående av en transgen plante og dennes frø, karakterisert ved at nevnte plantemateriale er blitt regenerert fra planteceller ifølge krav 25.

28. Etterkommere av en transgen plante ifølge ett av kravene 24, 26 og 27, idet nevnte etterkommere også innbefatter mutanter og varianter.

29. Former ingsmateri a 1e av transgene planter ifølge ett av kravene 24 og 26 til 28, karakterisert ved at det dreier seg om protoplaster, celler, kalli, vev, organerfrø, pollen, eggeceller, zygoter, embryo eller annet former ingsmateri a 1e som kan oppnås fra en transgenplante.

30. Plantedeler, såsom f.eks. blomster, stilker, frukt, blader, røtter, som stammer fra transgene planter eller deres etterkommere, som før er blitt transformert ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og som er bygget opp i det minste delvis av transgene celler.