CN109153988B - 植物的基因组编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种不使用体外培养体系的愈伤组织或组织切片的植物的基因组编辑方法。所述植物的基因组编辑方法包括：利用至少1种核酸和/或至少1种蛋白质包覆直径0.3μm以上且1.5μm以下的微粒的工序、使用基因枪将该包覆后的微粒注入完全成熟种子的胚的芽端的工序、使注入了该包覆后的微粒的芽端生长而得到植物体的工序、以及从该植物体中选择经过基因组编辑的植物体的工序。

Description

植物的基因组编辑方法
技术领域
本发明涉及使用了粒子枪(粒子轰击法)的植物的原位基因组编辑方法。
背景技术
目前已经普及的植物的通常的转化方法是借助根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或通过粒子枪法等将外源基因直接导入体外培养体系的愈伤组织或组织切片的方法。但是，在使用了这样的方法的情况下，即使将核酸酶导入细胞或组织进行基因组编辑，也存在以下问题：根据植物品种，难以进行组织培养，且难以使植物体再生而得到基因组编辑后的植物个体。另外，基因、蛋白质的导入效率不够高，存在为了得到基因导入个体而必须导入选择标记物基因进行标记物筛选的问题。另外，随着需要长期的组织培养，在体细胞突变(体细胞克隆变异)频繁发生方面也存在问题。从减轻基因组编辑植物制备的劳动力、基因重组植物的安全性的观点考虑，要求开发不需要组织培养的植物原位(inplanta)基因组编辑技术及基因组编辑个体的制备方法。
另一方面，在小麦、稻等中，已知不使用体外培养体系的愈伤组织或组织切片的转化法(植物原位转化法)。作为植物原位转化方法，已知使用粒子枪法对暴露的未成熟胚或完全成熟胚的芽端直接导入基因的方法(非专利文献1)。另外，专利文献1及非专利文献2中记载了使土壤杆菌感染刚刚发芽后的完全成熟胚进行基因导入的方法。
但是，这些文献中记载的方法均在很大程度上依赖于实验者的手法，因此基因导入效率低，在重现性方面存在改进的余地。另外，非专利文献1尚未证明导入基因可传递至下一代。由于这些因素，上述方法目前仍未被广泛使用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2005/024034号
非专利文献
非专利文献1：Bilang et al.Transient gene expression in vegetative shotapical meristems of wheat after ballistic microtargeting.Plant Journal(1993)4,735-744.
非专利文献2：Supartana et al.Development of simple and efficient inplanta transformation for rice(Oryza sativa L.)using Agrobacteriumtumefaciencs.Journal of Bioscience AND Bioengineering(2005)4,391-397.
发明内容
发明要解决的课题
本发明提供一种不使用体外培养体系的愈伤组织或组织切片的植物的基因组编辑方法。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果完成了本发明。
即，本发明包含以下部分。
(1)一种植物的基因组编辑方法，该方法包括：利用至少1种核酸和/或至少1种蛋白质包覆微粒的工序、使用基因枪将该包覆后的微粒射入完全成熟种子的胚的芽端或块茎的幼芽的芽端的工序、使射入了该包覆后的微粒的芽端生长而得到植物体的工序、以及从该植物体中选择经过基因组编辑的植物体的工序。
(2)根据(1)的方法，该方法包括：射入所述完全成熟种子的胚的芽端中的L2细胞或块茎的幼芽的芽端中的L2细胞的工序。
(3)根据(1)的方法，该方法包括：射入芽端干细胞以转移至所述完全成熟种子的胚的芽端或块茎的幼芽的芽端中的生殖细胞系的工序。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，所述微粒为直径0.3μm以上且1.5μm以下。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，所述完全成熟种子的胚的芽端是从该完全成熟种子除去胚乳、胚芽鞘、叶原基及多余的盾片而露出的芽端。
(6)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，所述块茎的幼芽的芽端是从该块茎的幼芽除去块茎、叶原基而露出的芽端。
(7)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，所述完全成熟种子是其根长为1mm以下的完全成熟种子。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，所述植物为选自小麦、大麦、稻、玉米、大豆、土豆及苹果中的任1种。
(9)根据(1)～(8)中任一项所述的方法，其中，所述核酸包含编码修饰酶的核酸。
(10)根据(9)所述的方法，其中，所述修饰酶为核酸酶或脱氨基酶。
(11)根据(1)～(10)中任一项所述的方法，其中，所述核酸以分别表达的方式与启动子及终止子结合，且包含能够表达至少1个向导RNA的核酸及编码Cas核酸酶蛋白质的核酸。
(12)根据(1)～(11)中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为核酸酶。
(13)根据(1)～(12)中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为Cas核酸酶。
(14)使用(1)～(13)中任一项所述的方法制备经过基因组编辑的植物体的方法。
(15)一种植物的基因组编辑方法，该方法包括：利用至少1种核酸和/或至少1种蛋白质包覆直径0.3μm以上且1.5μm以下的微粒的工序、使用基因枪将该包覆后的微粒射入完全成熟种子的胚的芽端的工序、使射入了该包覆后的微粒的芽端生长而得到植物体的工序、以及从该植物体中选择经过基因组编辑的植物体的工序。
(16)根据(15)的方法，其中，所述完全成熟种子的胚的芽端是从该完全成熟种子除去胚乳、胚芽鞘、叶原基及多余的盾片而露出的芽端。
(17)根据(15)或(16)中记载的方法，其中，所述完全成熟种子是其根长为1mm以下的完全成熟种子。
(18)根据(15)～(17)中任一项所述的方法，其中，所述植物为选自小麦、稻、玉米及大豆中的任1种。
(19)根据(15)～(18)中任一项所述的方法，其中，所述核酸包含编码核酸酶的核酸。
(20)根据(15)～(19)中任一项所述的方法，其中，所述核酸以分别表达的方式与启动子及终止子结合，且包含能够表达至少1个向导RNA的核酸及编码Cas核酸酶蛋白质的核酸。
(21)根据(15)～(18)中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为核酸酶。
(22)根据(15)～(18)中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为Cas核酸酶。
(23)使用(15)～(22)中任一项所述的方法制备经过基因组编辑的植物体的方法。
(24)利用植物原位法对芽端分生组织中的生殖细胞系或能够转移至其中的干细胞进行基因组编辑的方法。
(25)根据(24)的方法，其包含(1)～(13)中任一项的方法。
(26)使用(24)或(25)中任一项所述的方法制备经过基因组编辑的植物体的方法。
(27)通过(26)的制备方法制备的经过基因组编辑的植物体(不包括申请时公知的植物体)。
发明的效果
根据本发明的方法，通过使用芽端作为粒子枪法的靶，可以重现性良好地进行植物的基因组编辑而不需要进行愈伤组织化及选择标记物基因。根据本发明，可以进行转移至芽端中的生殖细胞系的芽端干细胞的基因组编辑。
附图说明
图1是示出了本发明实施例1的芽端的GFP蛋白质的表达情况的图。
图2是示出了本发明实施例2的T1代转化体的利用基因组PCR确认导入基因的结果的图。
图3是示出了基因导入个体的Southern分析的结果的照片(实施例3)。
图4A是本发明实施例4中进行了GFP荧光观察的全部T1代种子的照片的图。图4B是本发明实施例4中T1代的半切种子的GFP荧光观察照片的图。图4C是本发明实施例4中T1代的幼叶的GFP荧光照片的图。图4D是检测出本发明实施例4中T1代的成熟叶的GFP蛋白质的蛋白质印迹法照片的图。
图5A是示出由从主茎得到的T1种子的幼叶获得的基因组DNA的Southern分析的结果的照片。图5B是示出由从主茎及分蘖得到的T1种子的幼叶获得的基因组DNA的Southern分析的结果的照片(实施例5)。
图6是示出玉米的GFP的短暂性表达的照片(实施例6)。
图7是示出大豆的GFP的短暂性表达的照片(实施例7)。
图8是示出大麦的GFP的短暂性表达的照片(实施例8)。
图9是示出土豆的GFP的短暂性表达的照片(实施例9)。
图10是示出目标基因导入个体的图(实施例12)。
图11是示出导入基因1周后芽端的目标基因的突变导入的图(实施例13)。
图12是示出T0代成熟叶中目标基因导入个体的图(实施例13)。
图13是示出T1代叶中目标基因突变导入的图(实施例13)。
图14是示出通过Cas9蛋白质直接导入而得到的目标基因导入个体的图(实施例14)。
符号说明
Al      糊粉层
E       胚乳
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明的植物原位基因组编辑方法中包括：使植物的完全成熟种子吸水的工序、接着使种子中的胚的芽端露出的工序、接着对芽端的细胞进行基因组编辑的工序。
在本说明书中，“基因组编辑”是所谓的育种新技术(NBT)的技术的一部分，包括以下技术，但并不限定于此，只要是能够编辑基因组的技术即可：通过使用大范围核酸酶(meganuclease)、CRISPR-CAS等切断基因组上的特定基因，导入突变，从而破坏基因；或者，部位特异性地插入或取代DNA片段；或者，通过构建人工酶复合体并在细胞中使其表达，从而高效率地导入目标的点突变，改变基因功能，所述人工酶复合体是对从CRISPR系统中除去核酸酶活性而成的物质赋予作为脱氨基酶的脱氨基酶而得到的。可以通过使用基因组编辑技术高效率地破坏目标基因。在破坏基因的情况下，可以不残留基因重组的痕迹地仅破坏目标基因，因此有的国家也不作为重组植物来处理。另外，根据基因组编辑，可以通过将与切断序列两侧的序列相同的片段预先连接于想要导入该部位的DNA片段两侧，从而高效率地进行部位特异性DNA片段的插入或取代。
在上述意义上，可以认为基因组编辑是与外源基因基本上随机导入的现有植物转化法、例如直接导入法、土壤杆菌法等不同的技术。对于基因组编辑技术而言，其特征在于包括下述工序：使用能够以切断部位为靶的核酸酶、或向导RNA和核酸酶切断基因组DNA的工序，这可以区别于未使用所述能够靶向的核酸酶、或向导RNA和核酸酶的现有转化法。这里，“使用核酸酶、或向导RNA和核酸酶”的意思是指可以将核酸酶蛋白质导入细胞，也可以将编码核酸酶基因的DNA和/或RNA导入细胞而表达核酸酶蛋白质。另外，关于向导RNA，可以将RNA导入细胞，也可以导入能够表达向导RNA的DNA而表达向导RNA。
在本说明书中，“种子”不仅是指在天然或接近天然的条件下栽培(或培养)植物而得到的天然的种子，也包括人工种子，优选为天然的种子。但是，如果可以开发能够得到可转化的芽端的人工种子，则也可以使用这样的人工种子。天然的种子不仅包括在野外的田地等得到的种子，也包括通过温室栽培得到的种子、由离体苗等组织培养物得到的种子。只要通过组织培养(直接重编程(direct reprogramming)等)得到的种子也能够获得芽端，就可以作为本发明的种子使用。
需要说明的是，在本发明中，作为得到芽端的材料，优选使用完全成熟种子或地下茎。完全成熟种子是指在受粉后成熟过程结束、且作为种子完全成熟的种子。地下茎是位于地下的茎的总称，是指块状且具有多个芽的块茎、球状且具有大的顶芽的球茎、缩短的茎上带有肥大的鳞片而形成球状的鳞茎等。
在本说明书中，芽端是指茎的顶端的生长点(芽端分生组织)、以及包含生长点及从生长点生出的数片叶原基的组织。在本发明中，可以仅使用除去了叶原基的半球状(圆顶状)的生长点作为芽端，也可以使用包含生长点及叶原基的芽端、包含该芽端的植物组织。通过仅使用除去了叶原基的生长点，可以得到无病毒的组织。另外，在本说明书中，“生殖细胞系”是指从作为生殖细胞来源的原生殖细胞至作为最终产物的卵细胞、精细胞的生殖细胞的总称，“L2层”是指从芽端分生组织的外侧起第2层的细胞层。
1.基因组编辑的前处理工序
本发明的植物原位基因组编辑方法可广泛应用于通常产生种子的植物、产生地下茎的植物及能够进行芽端培养的植物。因此，本发明的植物原位基因组编辑方法的对象植物是包括被子植物及裸子植物的种子植物。被子植物包含单子叶植物及双子叶植物。植物原位基因组编辑法是通常不包含组织培养操作的基因组编辑法，是在植物生长的状态下对生长点部位的细胞进行基因组编辑的方法。其中，在本说明书中，植物原位基因组编辑法以仅包含经过芽端培养得到植物体的组织培养操作而不包含其它组织培养操作的含义使用。植物原位法也是相同的含义。
作为单子叶植物，可以为任意的种类，可以列举例如：禾本科植物、百合科植物、芭蕉科植物、凤梨科植物、兰科植物等。
作为禾本科植物，可以列举：稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、结缕草、高粱、黑麦、粟、甘蔗等。作为百合科植物，可以列举：葱、芦笋等。作为芭蕉科植物，可以举出香蕉等。作为凤梨科植物，可以举出菠萝等。作为兰科植物，可以举出兰等。
作为双子叶植物，可以列举例如：十字花科植物、豆科植物、茄科植物、葫芦科植物、旋花科植物、蔷薇科植物、桑科植物、锦葵科植物、菊科植物、苋科植物、以及蓼科植物等。
作为十字花科植物，可以列举：拟南芥、白菜、油菜、卷心菜、花椰菜、萝卜等。作为豆科植物，可以列举：大豆、赤豆、菜豆、豌豆、豇豆、紫苜蓿等。作为茄科植物，可以列举：番茄、茄子、土豆、烟草、辣椒等。作为葫芦科植物，可以列举：甜瓜、黄瓜、哈密瓜、西瓜等。作为旋花科植物，可以列举：牵牛花、番薯(甘薯)、旋花类等。作为蔷薇科植物，可以列举：玫瑰、草莓、苹果等。作为桑科植物，可以列举：桑、无花果、橡胶树等。作为锦葵科植物，可以列举：棉花、洋麻等。作为菊科植物，可以举出莴苣等。作为苋科植物，可以举出甜菜(甜菜根)等。作为蓼科植物，可以举出荞麦等。
另一方面，作为裸子植物，可以列举：松、杉、银杏及苏铁等。
作为本发明的植物原位基因组编辑方法的一个实施方式，首先使植物的完全成熟种子吸水。可以根据需要在吸水前进行春化处理。吸水可以通过将种子在水中浸种并进行孵育来进行。对于吸水温度而言，例如在小麦、大麦或稻的情况下，优选为15～25℃，在玉米或大豆的情况下，优选为25～35℃。此时，可以更换一次以上的水。对于吸水期间而言，例如，在小麦的情况下，优选为幼根开始伸长之前、或者新的叶原基形成之前。以吸水时间表示时，根据种子的休眠状态而不同，为吸水后不到16小时，优选为12小时。通过该吸水工序，可使种子变软，从而易于使芽端暴露。
2.使种子中的胚的芽端暴露的工序
接着，使上述吸水后的种子中的胚的芽端暴露。在小麦、大麦、稻或玉米的情况下，通过除去胚芽鞘及叶原基来使芽端暴露。在大豆的情况下，通过除去种皮及子叶来使芽端暴露。在土豆的情况下，从种薯进行出芽，从切下的幼芽上除去叶原基，从而使芽端暴露。在苹果的情况下，从种子胚或摘除的顶芽或侧芽中除去叶原基，从而使芽端暴露。作为暴露方法，只要是能够在实体显微镜下除去胚芽鞘及叶原基或种皮及子叶的方法即可，可以是任意的方法，可以列举例如：直径0.2mm左右的针等用于穿刺的器械、镊子、移液管、注射器、以及手术刀及切刀等切断器械。接着，使用手术刀等切断器械切除胚乳及多余的盾片部分，将含有露出的芽端的胚及盾片以芽端向上的方式置于琼脂培养基上。为了得到无病毒的芽端，可以在切下芽端的最终阶段将手术刀换为新的灭菌手术刀。在该情况下，可以得到无病毒的植物体。
3.向芽端的细胞导入核酸和/或蛋白质的工序
在部位特异性核酸酶等待导入基因的导入中，可以使用公知的基因工程方法，没有特别限定。通常，可以制备包含待导入基因的重组载体，可以以完全成熟胚的芽端为靶，利用土壤杆菌法、电穿孔法、粒子枪法、PEG-磷酸钙法、脂质体法、显微注射法、晶须法、等离子体法、激光注射法等导入核酸(重组载体等)、蛋白质等，对于小麦、稻、玉米或大豆而言，从导入植物体的效率的观点考虑，优选为使用粒子枪法导入完全成熟种子胚的方法。另外，粒子枪法对于将基因导入土豆的芽端也是有效的。粒子枪法是使核酸和/或蛋白质包覆金属微粒并射入细胞组织的方法，在如单子叶植物那样土壤杆菌的感染效率低的情况下是有效的。
本发明所使用的载体没有特别限定，例如可以使用pAL系(pAL51、pAL156等)、pUC系(pUC18、pUC19、pUC9等)、pBI系(pBI121、pBI101、pBI221、pBI2113、pBI101.2等)、pPZP系、pSMA系、中间载体系(pLGV23Neo、pNCAT等)、花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆花叶病毒(BGMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。
包含待导入基因的载体例如可以按照以下的方式制备。为了将待导入基因插入载体，例如可以使用如下方法：用适当的限制酶切断经过纯化的DNA，插入适当的载体DNA的限制酶部位或多克隆位点等，并连接至载体。另外，可以通过双交叉重组(double cross-over)将待导入基因插入中间载体，也可以使用TA克隆、无缝克隆(In-Fusion Cloning)等。
成为基因组编辑的标靶的基因没有特别限定，只要是希望进行该基因的破坏或插入/取代的基因即可。另外，对于待导入的核酸酶基因而言，来源的物种可以不同，例如，可以使用动物、植物、微生物、病毒等的基因、人工合成基因。作为这样的基因，可以列举例如：大范围核酸酶基因、TALEN、CRISPR-CAS系统、TARGET AID等。
作为可成为基因组编辑的标靶的基因没有特别限定，可以列举例如：糖代谢相关基因、脂质代谢相关基因、有用物质(医药、酶、色素、芳香成分等)生产相关基因、植物生长控制(促进/抑制)相关基因、开花调节相关基因、耐病虫害性(昆虫摄食损伤抗性、线虫、霉(菌类)及细菌病抗性、病毒(病)抗性等)相关基因、环境胁迫(低温、高温、干燥、盐、光损害、紫外线)耐性相关基因、转运相关基因、制粉特性/制面包特性/制面特性相关基因、重组酶相关基因等。
对于成为基因组编辑的标靶的基因，可以通过重组在切断的部位之间进行外来DNA插入或取代，从而导入待导入突变。
作为部位特异性核酸酶基因编码的蛋白质，可以列举例如：锌指核酸酶、表现出锌指核酸酶活性的蛋白质或TAL effector nuclease(TALLEN)等。锌指核酸酶是多个识别特定碱基的锌指模体和FokI核酸酶的融合蛋白质。TALLEN是Transcription Activator Like(TAL)effector和FokI核酸酶的融合蛋白质。部位特异性核酸酶可以由其它的追加的靶向技术、例如大范围核酸酶、RNA诱导性CRISPR-Cas9、或亮氨酸拉链等构成。
可以通过使用基因枪将部位特异性核酸酶导入芽端进行基因组编辑，从而变更或改变1个以上的基因产物的表达。即，在含有编码1个以上的基因产物的DNA分子且能够表达的细胞中导入可以包含以Cas蛋白质及DNA分子为标靶的1个以上向导RNA的CRISPR-Cas系统，由此，1个以上的向导RNA以编码1个以上基因产物的DNA分子的基因组基因座为标靶，Cas蛋白质使编码1个以上基因产物的DNA分子的基因组基因座断裂，由此可以变更或改变1个以上的基因产物的表达。
将使用基因枪将核酸酶基因或蛋白质导入细胞进行基因组编辑的情况下，未必需要整合至基因组中获得稳定的转化体。可以使核酸酶基因暂时性表达，由此进行基因组编辑。另外，可以通过将蛋白质(及向导RNA)导入细胞来进行基因组编辑。根据这些方法，有时得到的基因组编辑个体不是基因重组体。
Cas蛋白质及向导RNA可以是天然存在的(组合)，也可以不是天然存在的组合。在本发明中，可以变更或改变2个以上的基因产物的表达。向导RNA可以包含融合于tracr序列的引导序列。
向导RNA的长度至少为15、16、17、18、19、20核苷酸。作为优选的核苷酸长度的上限，为30以下，更优选为25以下，进一步优选为22以下，最优选为20以下。
在优选的实施方式中，成为基因组编辑对象的细胞为植物细胞，进一步优选为芽端分生组织的细胞，最优选为转移至芽端分生组织中的生殖细胞系的细胞。
在本发明中，Cas蛋白质可以含有1个以上的核定位信号(NLS)。在一部分实施方式中，Cas蛋白质为II型CRISPR类酶。在一部分实施方式中，Cas蛋白质为Cas9蛋白质。在一部分实施方式中，Cas9蛋白质为肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)或嗜热链球菌(S.thermophilus)Cas9，可以包含来自这些生物的突变Cas9。蛋白质可以为Cas9同源或直向同源(ortholog)。
Cas蛋白质可以为了真核细胞中的表达而进行了密码子最优化。Cas蛋白质可以定位于靶序列的局部存在的1条或2条链的断裂。在本发明的另一方面，使基因产物的表达减少，基因产物为蛋白质。
除了待导入基因以外，还可以将例如启动子、增强子、隔离子、内含子、终止子、poly(A)加尾信号、筛选标记物基因等连结于载体。
待插入载体的待导入基因可以是每1个载体多种，待包覆于微粒的重组载体也可以是每1个微粒多种。例如，可以分别制备包含核酸酶基因的重组载体和包含耐药基因的重组载体，进行混合，包覆微粒，然后射入植物组织。
基因组编辑的ALS可以为2个以上，也可以构建载体以便切断2以上的目标基因。在该情况下，可以制备2种以上的载体，也可以插入1个质粒上来表达多个向导RNA。另外，向导RNA可以包含融合于tracr序列的引导序列。
可以通过基因组编辑，部位特异性切断双链，促进同源重组，进行部位特异性基因组编辑。在该情况下，可以在切断区域的两侧导入具有相同序列的DNA，进行双交叉重组。另外，使用已知作为切口酶(仅在一条DNA链插入切口(nick)的DNA切口酶)而发挥功能的Cas9的D10A突变体，可以同样地进行同源重组。
作为启动子，在植物体内或植物细胞中发挥功能，组成型表达，或者只要是在植物的特定组织内或特定的生长阶段中能够引导表达的DNA，也可以不来自于植物。作为具体例子，可以列举例如：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、El2-35S Omega启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子(Pnos)、来自玉米的泛素启动子、来自稻的肌动蛋白启动子、来自烟草的PR蛋白质启动子、ADH启动子、RuBisco启动子等。可以使用提供翻译活性的序列、例如烟草花叶病毒的Omega序列来提高翻译效率。另外，作为翻译起始区域，通过将IRES(internalribosomal entry site)插入启动子的3’-下游侧且翻译起始密码子的5’-上游侧，可以从多个编码区域翻译蛋白质。
作为终止子，只要可以使由上述启动子转录的基因的转录终止、且是具有poly(A)加尾信号的序列即可，可以列举例如：胭脂碱合成酶(NOS)基因的终止子、章鱼碱合成酶(OCS)基因的终止子、CaMV 35S终止子等。
作为筛选标记物基因，可以列举例如：除草剂耐性基因(双丙氨磷耐性基因、草甘膦耐性基因(EPSPS)、磺酰脲类耐性基因(ALS))、耐药基因(四环素耐性基因、氨苄西林耐性基因、卡那霉素耐性基因、潮霉素耐性基因、壮观霉素耐性基因、氯霉素耐性基因、新霉素耐性基因等)、荧光或发光报告基因(荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)、绿色萤光蛋白(GFP)等)、新霉素磷酸转移酶II(NPT II)、二氢叶酸还原酶等酶基因。其中，根据本发明，可以不导入筛选标记物基因而致病经过基因组编辑的植物体。
通过粒子枪法将包含以上述导入基因为标靶的核酸酶的载体射入小麦的完全成熟胚。编码以导入基因为标靶的核酸酶基因的核酸和/或蛋白质(核酸酶等)包覆微粒(微载体、microcarrier)的表面，可以用粒子枪射入植物细胞。作为微粒，为了提高对细胞内的贯穿力，从高比重、且为化学性非活性而不容易对生物体造成伤害的原因考虑，可以优选使用金属微粒。在金属微粒中，特别优选使用金粒子、钨粒子等。
在粒子枪法中，可以如下所述将待导入基因导入植物细胞。首先，将金粒子或钨粒子等微粒清洗灭菌，用涡旋混合器等边搅拌边加入该微粒、核酸(重组载体、直链状DNA、RNA等)和/或蛋白质、CaCl2、亚精胺，将DNA/RNA和/或蛋白质涂敷于金粒子或钨粒子，用乙醇或磷酸缓冲生理盐水(PBS等)进行清洗。
上述微粒的粒径(直径)优选为0.3μm以上且1.5μm以下，更优选的粒径为0.4μm以上，进一步优选为0.5μm以上，特别优选使用0.6μm的粒径。作为粒径的更优选的上限，为1.4μm以下，进一步优选为1.3μm以下，更进一步优选为1.2μm以下，特别优选为1.1μm以下，最优选为1.0μm以下。
对于金粒子或钨粒子而言，使用移液器(PIPETMAN)等尽可能均匀地涂布于Macrocarrier膜，然后在超净工作台等无菌环境中使其干燥。在涂布了蛋白质的微粒的情况下，优选使用亲水性的Macrocarrier膜。
亲水性的Macrocarrier膜可以将亲水性膜粘贴于Macrocarrier膜，也可以实施亲水性涂敷。作为使膜亲水化的方法，可以列举利用表面活性剂、光催化剂、亲水性聚合物的方法等。
作为上述方法中使用的亲水性聚合物，可以列举：聚乙二醇、甲基丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸羟基丙酯、甲基丙烯酸二羟基乙酯、二乙二醇甲基丙烯酸酯、三乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸葡萄糖基乙酯、3-磺丙基甲基丙烯酰氧基乙基二甲基铵甜菜碱、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、1-羧基二甲基甲基丙烯酰氧基乙基甲烷铵等亲水性单体的聚合物。
然后，将Macrocarrier膜、放置有作为标靶的完全成熟胚的芽端的板设置于粒子枪装置，从气体加速管向Macrocarrier膜发射高压氦气。Macrocarrier膜在停止板处停止，但金粒子通过停止板，穿入设置在停止板下的标靶，导入待导入基因。
停止板与作为标靶的芽端的距离根据微粒的粒径而不同，例如优选为9cm以下，更优选为8cm以下，进一步优选为7cm以下，特别优选为6cm以下，作为距离的下限，例如优选为2cm以上，更优选为3cm以上，进一步优选为4cm以上。停止板与标靶的距离可以根据微粒的种类、粒径、气体压力等通过暂时性表达实验等来适当确定最优值。
作为气体压力，根据微粒的种类、与标靶的距离而不同，例如优选为1,100～1,600psi，更优选为1,200～1,500psi。对于气体压力，可以根据微粒的种类、标靶的种类、标靶与停止板的距离等通过暂时性表达实验等来适当确定最优的压力。
在本发明中，作为将微粒射入芽端的次数，优选为2次以上，进一步优选为3次以上，更优选为4次以上。作为将微粒射入芽端的次数的上限，优选为20次以下，更优选为15次以下，进一步优选为10次以下。对于射入次数，可以通过暂时性表达实验等来适当确定最优的次数。
在射入了微粒的细胞中，核酸和/或蛋白质从微粒中游离，核酸转移至核中表达核酸酶，从而切断基因组DNA，在其修复的过程中发生突变，得到经过基因组编辑的细胞。在蛋白质的情况下，利用核转移信号(也可以为细胞器转移信号)转移至核(细胞器)中，切断DNA，从而进行基因组编辑。基因组编辑不仅可以应用于核的基因组基因，而且可以应用于细胞器(叶绿体、线粒体等细胞内小器官)的基因。在该情况下，可以使转移至各细胞器的信号连接于核酸酶而导入，也可以使用仅在各细胞器中表达连接于核酸酶等的启动子的启动子。
使导入核酸酶进行了基因组编辑的完全成熟胚的芽端在琼脂培养基上生长1个月左右，然后移植至土壤中。在对芽端进行射入的情况下，可以通过不施加基于药物等的选择压力(不含抗生素等)而在通常的培养基中使其生长，从而得到经过基因组编辑的植物个体，但也可以通过同时导入核酸酶和耐药基因来选择基因组编辑个体。在导入了耐药基因的情况下，可以通过药物来选择性地培养导入了核酸酶基因和/或核酸酶的细胞。作为适于芽端培养的选择药物，已知例如磺酰脲类除草剂氯磺隆(通过导入突变型ALS基因(乙酰丁酸合成酶基因)可获得耐受性)等。
在导入耐药基因的情况下，该耐药基因可以位于与核酸酶基因相同的载体上，也可以位于其它载体上。在耐药基因和目标基因被插入至不同的载体上的情况下具有如下优点：在它们被整合至不同的染色体时，进行自花受粉、回交而获得后代，从而可以将经过基因组编辑的植物个体与具有耐药基因的植物个体分离。
通过以上的方法可以制备对导入基因进行了基因组编辑的植物体。另外，这样制备的植物稳定地表现出经过基因组编辑的基因的形状，或者抑制导入基因的表达且在后代中正常遗传(传递)。
对小麦的基因导入效率及基因组编辑效率可以如下所述进行研究。
基因的导入效率可以通过以下方式计算：通过从基因导入处理后的生长个体中提取DNA并进行PCR法和/或Southern印迹法，可以检测导入基因是否进行了基因组编辑，根据用于导入的外植体数和具有外源基因的生长个体数，计算出基因组编辑效率。
对于导入基因的基因组编辑效率而言，对于确认了基因导入的生长个体调查了有无从导入基因表达的RNA。有无RNA例如可以通过RT-PCR法等来确认。也可以通过Northern杂交来检测。
另外，也可以调查有无从经过基因组编辑的导入基因表达的蛋白质。有无蛋白质例如可以通过植物片的染色、电泳、ELISA法、RIA、免疫斑点试验、和/或蛋白质印迹法等来确认。然后，根据用于导入的外植体数和确认了导入基因经过基因组编辑的蛋白质的存在(或不存在)的生长个体数，计算出目标基因的基因组编辑效率。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
[实施例1]最适于基因导入的金粒子径的研究
为了找出合适的金粒子径，调查了基因导入处理后的芽端有无GFP荧光或其本代(T0代)有无导入基因。
1.以GFP荧光蛋白质的暂时性表达体系作为指标的研究
(1)小麦完全成熟种子的制备
将小麦(Triticum aestivum cv.Fielder)的完全成熟种子浸渍于HAITER(漂白剂，次氯酸浓度6％、花王株式会社)，在室温下振荡20分钟，然后在超净工作台内用灭菌水清洗。在清洗后，放置在用灭菌水润湿的擦拭纸(Kimtowel)或滤纸上，为了打破休眠，在4℃下孵育2天。然后，在22℃下孵育约12小时，用于以下的实验。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
在实体显微镜下，使用针(直径0.20mm)的前端除去上述发芽种子的胚部分的胚芽鞘及第1叶原基至第3叶原基。然后，用灭菌后的刀(或灭菌后的手术刀)除去胚乳及多余的盾片部分，使芽端部分完全暴露。将其置于MS-maltose培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、30g/L麦芽糖、0.98g/L MES、3％PPM(plant preservative mixture(植物组培抗菌剂)、Nacalai Tesque)、7.0g/L phytagel(注册商标、Sigma-Aldrich)、pH5.8)，使其为30个/板。
(3)基因导入
对小麦完全成熟胚的芽端进行的基因导入可以使用粒子枪法如下进行。
在实施例中，使用了包含荧光报告基因GFP(S65T)的质粒DNA(pUC系质粒)。该基因被设计为在玉米的泛素启动子和第一内含子的控制下进行表达。作为终止子，添加了胭脂碱合成酶(NOS)基因的终止子。
称取0.3μm～1.6μm的各种金粒子30mg，加入70％乙醇500μL，用涡旋混合器充分悬浮。然后，通过离心使金粒子沉淀，除去乙醇。然后，加入50％甘油500μL，制成灭菌金粒溶液。
将用Qiagen Midi Kit(Qiagen)纯化的质粒DNA溶液(1μg/μL)加入1.5mL管中，使得每750μg金粒子为5μg。含有灭菌金粒子的溶液在使用前使用超声波发生器(多贺电机制造的超声波清洗器UW-25)充分进行悬浮，在上述管中加入适当量，利用移液器进行搅拌。接着，在上述管中加入每750μg金粒子2.5M CaCl2(Nacalai Tesque)25μL和0.1M Spermidine(亚精胺、Nacalai Tesque)10μL。在混合后立即用涡旋混合器剧烈混合5分钟，使其悬浮。在室温下静置10分钟后，以9,100×g离心2秒钟。除去上清，用70％乙醇及99.5％乙醇清洗。最后，除去上清，添加99.5％乙醇24μL，使其充分悬浮。在超净工作台内于Macrocarrier的中央各注入6μL，使其风干。
对于粒子枪而言，使用Biolistic(注册商标)PDS-1000/He Particle DeliverySystem(BIO-RAD)，将射入时的压力设为约94.9kgf/cm2(1,350psi)，距靶组织的距离设为5cm(金粒子径0.6μm以上)或3.5cm(金粒子径小于0.6μm)。每1个培养皿各注入4次。在注入后，于22℃、暗处静置过夜。
(4)GFP蛋白质的暂时性表达效率的研究
通过在实体荧光显微镜(Leica公司制造的MZFLIII)下观察芽端的GFP荧光(激发：470/40、吸收：525/50)(图1)，计算出芽端的GFP基因的导入效率。在进行了转化处理的完全成熟胚中，将在芽端组织中观察到5点以上的GFP荧光的个体作为基因导入个体，计算出基因导入效率(基因导入个体/处理完全成熟胚数×100)。其结果是，与金粒子径1.6μm及1.0μm相比，金粒子径0.8μm、0.6μm及0.3μm的情况下，芽端的基因导入效率更高(表1)。特别是在使用了0.6μm时，与其它金粒子径相比，芽端的基因导入效率为72.7％，是最高的(表1)。另外，如后所述，对于基因导入效率，0.6μm的金粒子比1.0μm的金粒子更高。
表1
Figure BDA0001863637220000161
2.以T0代植物的基因组PCR作为指标的研究
(1)小麦完全成熟种子的制备
按照实施例1-1-(1)中记载的方法进行。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例1-1-(2)中记载的方法进行。
(3)基因导入
使用0.6μm、1.0μm这2种金粒子径，按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
(4)转化处理个体的生长
将静置过夜后的转化处理个体移植至加入了MS-maltose培养基的一次性植物细胞培养容器(Sigma)，在长日照(22℃、16小时日照)下培育。在使其生长3～4周后，在观察第2～3叶的时刻，移植至装有园艺用育苗培土的盆中。然后，在长日照的人工气候室(24℃、16小时日照、湿度50～70％)中培育至出现第4～6叶。
(5)T0植物叶中有无导入基因
在得到的植物体中，通过PCR法调查了有无作为荧光报告基因的GFP基因。使用氯化苄法从第4～6叶(50mg)中提取基因组DNA，以其为模板，使用由对GFP基因特异性的序列制成的引物进行了PCR反应。
引物的序列：ACGGCCACAAGTTCAGCGT(序列号1)
引物的序列：ACCATGTGATCGCGCTTCT(序列号2)
在PCR反应液中加入基因组DNA20ng、ExTaqHS(注册商标、TaKaRa)0.25U、10×附带的缓冲液1.5μL、2mMdNTPs、引物对各2.5pmol，并用灭菌蒸馏水填充至总计15μL。
PCR使用TaKara PCR Thermal Cycler Dice(注册商标)，在95℃下处理3分钟后，将95℃下30秒钟、60℃下30秒钟及72℃下1分钟的反应作为1个循环，进行了33个循环。在PCR反应后，进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色，检测PCR产物，将检测出预想的601bp的GFP基因片段的个体判断为基因导入个体。
基因导入中使用的金粒子径1.0μm、0.6μm这2种中，根据各自得到的基因导入个体数计算出进行了基因导入处理的完全成熟胚的单位数量的基因导入效率(基因导入个体数/处理完全成熟胚数×100)。
其结果是，在使用了1.0μm直径的金粒子的情况下，未检测出导入基因(表2)。另一方面，在使用了0.6μm直径的金粒子的情况下，确认到导入基因的个体(T0代)检测出来3个个体(基因导入效率1.4％)(表2)。由此可知，与金粒子径1.0μm相比，通过使用实施例1-1-(4)中暂时性表达效率高的金粒子径0.6μm，可提高基因导入效率。
表2
Figure BDA0001863637220000171
[实施例2]最适于基因导入的气体压力的探讨
为了找出适当的气体压力，调查了基因导入处理后芽端有无GFP荧光和其本代(T0代)有无导入基因。
1.以GFP荧光蛋白质的暂时性表达体系为指标的研究
(1)小麦完全成熟种子的制备
按照实施例1-1-(1)中记载的方法进行。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例1-1-(2)中记载的方法进行。
(3)基因导入
将金粒子径设为0.6μm、气体压力设为1,100psi或1,350psi，按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
(4)GFP蛋白质的暂时性表达效率的研究
按照实施例1-1-(4)中记载的方法进行。其结果是，实施例1-1-(4)中记载的基因导入效率在气体压力1,350psi的情况下为74.2％，比气体压力1,100psi的情况下的13.3％高(表3)。另外，如后所述，对于T0代的基因导入效率，气体压力1,350psi也比气体压力1,100psi更高。
表3
Figure BDA0001863637220000181
2.以T0代植物的基因组PCR作为指标的研究
(1)转化处理个体的生长
按照实施例1-2-(4)中记载的方法进行。
(2)T0植物叶中有无导入基因
按照实施例1-2-(5)中记载的方法进行。其结果是，实施例1-2-(5)中记载的基因导入效率在气体压力1,350psi的情况下为4.2％，比气体压力1,100psi的情况的0.8％高(表3)。由此可知，与气体压力1,100psi相比，在实施例2-1-(4)中通过使用GFP蛋白质的暂时性表达效率高的气体压力1,350psi，可提高基因导入效率。
[实施例3]最适于基因导入的吸水时间的探讨
为了找出适当的吸水时间，调查了基因导入处理后芽端有无GFP荧光和其本代(T0代)及下一代(T1代)有无导入基因。
1.完全成熟胚的制备及基因导入操作
(1)小麦完全成熟种子的制备
将小麦(Triticum aestivum cv.Fielder)的完全成熟种子浸渍于HAITER(漂白剂、次氯酸浓度6％)，在室温下振荡20分钟，然后在超净工作台内用灭菌水清洗。在清洗后，放置在用灭菌水润湿的擦拭纸或滤纸上，在4℃下孵育2天。然后，在22℃下进行6～12小时、12～18小时的各时间的孵育，用于以下的实验。种子根长通过将根鞘切开后测定幼根的长度进行了调查。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例1-1-(2)中记载的方法进行。
(3)基因导入
使用0.6μm的金粒子径，按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
2.以T0代及T1代植物的基因组PCR为指标的研究
(1)转化处理个体的生长
对于实施例3-1-(3)中观察到芽端的暂时性GFP荧光的个体，通过实施例1-(2)-4中记载的方法进行培育。
(2)T0植物叶有无导入基因
按照实施例1-2-(5)中记载的方法进行。在对各吸水时间后的完全成熟胚进行了转化处理的情况下，根据各自得到的确认到导入基因的个体(T0代)计算出进行了基因导入处理的完全成熟胚单位数量的基因导入效率(基因导入个体数/处理完全成熟胚数×100)。其结果是，将吸水6～12小时、12～18小时的完全成熟种子用于实验时的基因导入效率分别为3.1％、1.3％(表3)，吸水6～12小时后的完全成熟胚特别高(表4)。
表4
Figure BDA0001863637220000191
(3)T1植物叶有无导入基因
培育上述(2)中确认到导入基因的个体，得到T1种子。将各T1种子播种/培育10～20颗左右，对第1叶(50mg)进行采样。基因组PCR及电泳按照实施例1-(2)-5进行。在对各吸水时间后的完全成熟胚进行了转化处理的情况下，根据各自得到的确认到导入基因的个体(T1代)计算出进行了基因导入处理的完全成熟胚单位数量的基因导入效率(基因导入个体数/处理完全成熟胚数×100)。其结果是，吸水6～12小时、12～18小时的完全成熟种子用于实验时的基因导入效率分别为3.1％(图2系统1及2、表3)、0.7％(图2系统3～5、表3)，吸水6～12小时后的完全成熟胚特别高。根据这些结果可以判断，在基因导入中，完全成熟种子的吸水初期(6小时后至18小时左右，种子根长为1.0mm以下)是适当的，特别优选为吸水6～12小时后。
需要说明的是，对于表4示出的确认到导入基因的个体(T1代)5个系统，通过以GFP基因区域为探针的Southern印迹分析，也确认了GFP基因被插入至基因组DNA(图3)。
[实施例4]T1代的基因表达的确认
对于通过该基因导入法制备的转化小麦中有无导入基因(GFP基因)表达进行了研究。
1.T1种子的GFP荧光观察
将实施例3-2-(3)中得到的T1种子置于灭菌培养皿，在LAS3000(FujiFilm)下观察T1种子的GFP荧光(滤光器510DF10)，结果是在种子中观察到了GFP荧光(图4A)。接着，将观察到GFP荧光的种子半切，在实体荧光显微镜(Leica公司制造的MZFLIII)下进行了胚乳的GFP荧光观察(激发：470/40、吸收：525/50)。其结果是，不仅在胚乳(E)中观察到了GFP荧光，而且在糊粉层(Al)中观察到了GFP荧光(图4B)。
2.T1代幼叶中的GFP荧光蛋白质的表达分析
对实施例3-2-(3)中培育的T1代植物的幼叶进行取样，在实体荧光显微镜(Leica公司制造的MZFLIII)下观察叶中的GFP荧光(激发：470/40、吸收：525/50)。其结果是，如图4C所示，在基因组PCR阳性个体(转化体)中，在叶的气孔细胞中观察到GFP荧光。
接着，从野生型株及转化体(基因导入个体)的各自的成熟叶中提取全部蛋白质，尝试通过蛋白质印迹法(western blot)检测GFP荧光蛋白质。用液氮对成熟叶1g进行冷冻/粉碎后，将其悬浮于蛋白提取缓冲液(0.25M sorbitol、50mM Tris/acetate,pH7.5、1mMEDTA、2mM DTT、1％PVP、10μM PMSF)。将该提取液离心分离(1,100×g、15分钟、4℃)，对其上清进一步进行离心分离(12,800×g、15分钟、4℃)。将该离心分离后得到的上清作为全部蛋白质级分。使用12.5％的SDS聚丙烯酰胺凝胶对全部蛋白质级分20μg进行电泳，通过半干法转移至硝酸纤维素膜。用封闭缓冲液(5％[w/v]Skim Milk Powder in TTBS(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH 7.5))将膜振荡1小时。用TTBS将膜清洗5分钟×3次，然后使一次抗体反应1小时。用TTBS将膜清洗5分钟×3次，然后使二次抗体反应1小时。用TTBS将膜清洗5分钟×3次，然后按照Amersham ECL Western blotting analysis system(GE Healthcare)的instruction manual中记载的方法进行了检测。需要说明的是，作为一次抗体，使用了来自于小鼠IgG1κ的GFP抗体(ROCHE)(稀释2000倍)，作为二次抗体，使用了上述试剂盒附带的过氧化酶标记抗小鼠IgG抗体(稀释5000倍)。
蛋白质印迹法分析的结果是，在转化体中于GFP蛋白质的推测分子量27kDa附近观察到了信号，但在野生型株中未检测到信号(图4D)。根据这些结果可以确认，在通过该基因导入法制备的转化植物中，导入基因正常表达。
对于大麦、玉米、稻、大豆、土豆及苹果，可以通过实质上与小麦相同的方法来得到转化体。
[实施例5]由T0代1个系统得到的T1代各个体的基因型的确认
本方法中制备的基因导入个体(T0代)是在同一个体内具有不同遗传信息的细胞混合存在的嵌合体。因此，为了调查由某1个系统的基因导入个体(T0代)得到的T1种子是否具有各自不同的遗传信息，进行了Southern印迹分析。
从实施例3-2-(3)中得到的T0代的FG1系统的个体中，按照来自主茎及5个分蘖的穗收获T1种子，从中播种多个个体。培养播种的T1代个体，按照
实施例3-2-(3)中记载的方法调查各T1代个体有无导入基因。其结果是，在从来自于分蘖2以外的主茎及分蘖的穗收获的T1代中，确认到了导入基因(表5)。
表5
Figure BDA0001863637220000211
接着，对于从由主茎得到的T1种子14个体(FG1-主茎-1～14)的幼叶得到的基因组DNA进行HindIII处理，以GFP基因区域为探针进行了Southern印迹分析。其结果是，对于全部个体，得到了同样的信号图案(图5A)。另外，对于从由主茎及分蘖1、3、4、5得到的T1种子(FG1-主茎-1、FG1-分蘖1-1、FG1-分蘖3-1、FG1-分蘖4-1、FG1-分蘖5-1)的幼叶得到的基因组DNA进行HindIII处理，与上述同样地进行了Southern印迹分析。其结果是，对于全部个体，得到了同样的信号图案(图5B)。由这些结果可知，从某1个系统的基因导入个体(T0代)得到的多个T1种子具有相同的遗传信息。这表明，转移至生殖细胞系的芽端干细胞是极少数，可以通过该方法对该极少数的芽端干细胞进行基因导入。
[实施例6]得到玉米的转化体
为了确认能否通过与小麦相同的方法得到玉米的转化体，调查了基因导入处理后的芽端有无GFP荧光。
1.以GFP荧光蛋白质的暂时性表达体系为指标的研究
(1)玉米完全成熟种子的制备
将玉米(Snowdent Ohka)的完全成熟种子浸渍于HAITER(次氯酸浓度6％)，在室温下振荡20分钟后，在超净工作台内用灭菌水清洗。在清洗后，放置在用灭菌水润湿的擦拭纸或滤纸上，在30℃下孵育约36小时，用于以下的实验。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
在实体显微镜下，用灭菌后的刀(或灭菌后的手术刀)除去胚乳及多余的盾片部分。然后，使用针(直径0.20mm)的前端除去上述发芽种子的胚部分的子叶鞘及叶原基，使芽端部分完全暴露。将其置于MS-maltose培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、30g/L麦芽糖、0.98g/L MES、3％PPM(plant preservative mixture、注册商标、Nacalai Tesque)、7.0g/Lphytagel、pH5.8)，使其为10个/板。每一个处理区准备2个上述的板。
(3)基因导入
按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
(4)GFP蛋白质的暂时性表达效率的研究
通过在实体荧光显微镜(Leica公司制造的MZFLIII)下观察芽端的GFP荧光(激发：470/40、吸收：525/50)吸收：525/50)(图6)，计算出芽端的GFP基因的导入效率。在进行了转化处理的完全成熟胚中，将在芽端组织中观察到5点以上的GFP荧光的个体作为基因导入个体，计算出基因导入效率(基因导入个体/处理完全成熟胚数×100)。其结果是，与金粒子径1.6μm及1.0μm相比，金粒子径0.8μm、0.6μm及0.3μm的情况下，芽端的基因导入效率更高(表6)。特别是在使用了0.6μm时，与其它金粒子径相比，芽端的基因导入效率为85％，是最高的(表6)。
表6
Figure BDA0001863637220000231
[实施例7]得到大豆的转化体
为了确认能否通过与小麦相同的方法得到大豆的转化体，调查了基因导入处理后的芽端有无GFP荧光及随后得到转化体的效率。
1.GFP荧光蛋白质的暂时性表达体系为指标的研究
(1)大豆完全成熟种子的制备
将大豆(Yukihomare)的完全成熟种子浸渍于HAITER(次氯酸浓度6％)，在室温下振荡3分钟，然后在超净工作台内用灭菌水清洗。在清洗后，放置在用灭菌水润湿的擦拭纸或滤纸上，在23℃下孵育约40小时，用于以下的实验。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
在实体显微镜下，用灭菌后的刀(或灭菌后的手术刀)将子叶完全切除，使其仅为胚轴。然后，用针(直径0.20mm)的前端除去上述胚轴的初生叶和基部，使芽端部分完全暴露。将其置于BM培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、3％蔗糖、0.50g/L MES、3％PPM(plantpreservative mixture、Nacalai Tesque)、6.0g/L phytagel、pH5.7)，使其为约15个/板。
(3)基因导入
作为启动子，使用花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
(4)GFP蛋白质的暂时性表达效率的研究
通过在实体荧光显微镜(Leica公司制造的MZFLIII)下观察芽端的GFP荧光(激发：470/40、吸收：525/50)(图7)，计算出芽端的GFP基因的导入效率。在进行了转化处理的完全成熟胚中，将在芽端组织中观察到5点以上的GFP荧光的个体作为基因导入个体，计算出基因导入效率(基因导入个体/处理完全成熟胚数×100)。其结果是，与金粒子径1.6μm及1.0μm相比，金粒子径0.6μm的情况下，芽端的基因导入效率高达85.0％(表7)。
表7
Figure BDA0001863637220000241
2.以T0代植物的基因组PCR为指标的研究
(1)转化处理个体的生长
将静置过夜的转化处理个体移植至加入了RM培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、3％蔗糖、0.50g/L MES、3％PPM(plant preservative mixture、Nacalai Tesque)、0.3％结冷胶(gelrite)、pH5.7)的一次性植物细胞培养容器(Sigma)，在培养箱(23℃、16小时日照)中培育。在观察根的生长及从芽端分化叶的时刻，移植至装有园艺用育苗培土的单元盆(celltray)中。然后，在相同的培养箱中培育至第2叶。
(2)T0植物叶有无导入基因
在得到的植物体中，通过PCR法调查了有无作为荧光报告基因的GFP基因。使用氯化苄法从第2叶(50mg)中提取基因组DNA，以其为模板，使用由对GFP基因特异性的序列制成的引物进行了PCR反应。
引物的序列：ACGGCCACAAGTTCAGCGT(序列号1)
引物的序列：ACCATGTGATCGCGCTTCT(序列号2)
PCR反应液中加入基因组DNA20ng、ExTaqHS(TaKaRa)0.25U、10×附带的缓冲液1.5μL、2mM dNTPs、引物对各2.5pmol，用灭菌蒸馏水填充至总计15μL。
PCR使用TaKara PCR Thermal Cycler Dice，在95℃下处理3分钟后，将95℃下30秒钟、60℃下30秒钟及72℃下1分钟的反应作为1个循环，进行了32个循环。在PCR反应后，进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色，通过紫外线照射检测PCR产物，将检测出预想的601bp的GFP基因片段的个体判断为基因导入个体。
基因导入中使用的金粒子径1.0μm、0.6μm这2种中，根据各自得到的基因导入个体数计算出进行了基因导入处理的完全成熟胚的单位数量的基因导入效率(基因导入个体数/处理完全成熟胚数×100)。
其结果是，在使用了0.6μm直径的金粒子的情况下，处理完全成熟胚470个体中确认到导入基因的个体(T0代)为63个个体(基因导入效率为13.4％)。由此可知，通过使用实施例7-1-(4)中暂时性表达效率高的金粒子径0.6μm，能够以高效率获得大豆的基因导入个体。
[实施例8]得到大麦的转化体
为了确认能否通过与小麦相同的方法得到大麦的转化体，调查了基因导入处理后的芽端有无GFP荧光。
1.以GFP荧光蛋白质的暂时性表达体系为指标的研究
(1)大麦完全成熟种子的制备
将大麦(Wasedori-nijo)的完全成熟种子浸渍于HAITER(次氯酸浓度6％)，在室温下振荡20分钟后，在超净工作台内用灭菌水清洗。在清洗后，放置在用灭菌水润湿的擦拭纸或滤纸上，在4℃下孵育2天，然后在22℃下孵育6～12小时，用于以下的实验。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
在实体显微镜下用灭菌后的手术刀除去胚乳及多余的盾片部分。然后，使用针(直径0.20mm)的前端除去上述发芽种子的胚部分的子叶鞘及叶原基，使芽端部分完全暴露。将其置于MS-maltose培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、30g/L麦芽糖、0.98g/L MES、3％PPM(plant preservative mixture、注册商标、Nacalai Tesque)、7.0g/L phytagel、pH5.8)，使其为30个/板。
(3)基因导入
按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
(4)GFP蛋白质的暂时性表达效率的研究
按照实施例1-1-(4)中记载的方法进行。其结果是，与金粒子径1.6μm及1.0μm相比，在金粒子径0.8μm、0.6μm及0.3μm的情况下，芽端的基因导入效率更高(表9)。特别是在使用了0.3μm时，与其它金粒子径相比，芽端的基因导入效率为80％，是最高的(图8、表8)。
表8
Figure BDA0001863637220000251
[实施例9]得到土豆的转化体
为了确认能否通过与小麦相同的方法得到土豆的转化体，调查了基因导入处理后的芽端有无GFP荧光。
1.土豆的制备
用HAITER(次氯酸浓度1％)对种薯(男爵)进行消毒、水洗，在干燥后于22℃、荧光灯下孵育1～2周，进行出芽。
2.芽端的暴露
在实体显微镜下使用灭菌后的手术刀，用针(直径0.20mm)的前端从胚芽中除去叶原基，使芽端部分完全暴露。将其置于MS培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、30g/L蔗糖、0.98g/L MES、3％PPM(plant preservative mixture、注册商标、Nacalai Tesque)、7.0g/Lphytagel、pH5.8)，使其为40个/板。
3.基因导入
将导入载体设为pUC18-35S-GFP，按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
4.GFP蛋白质的暂时性表达效率的研究
按照实施例1-1-(4)中记载的方法进行。其结果是，通过使用金粒子径0.6μm，可以观察到芽端的GFP荧光。(图9)。
[实施例10]得到稻的转化体
对于稻，可以通过实质上与小麦相同的方法得到转化体。
1.稻完全成熟种子的制备
按照实施例1-1-(1)中记载的方法对脱粒后的稻(品种：日本晴)的完全成熟种子进行灭菌，在清洗后，放置在用灭菌水润湿的擦拭纸或滤纸上，将在25℃下孵育了24小时～48小时的种子用于以下的实验。
2.完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例1-1-(2)中记载的方法使完全成熟种子胚中的芽端完全暴露。将使芽端暴露的完全成熟胚置于MS-maltose培养基，使其为约30个/板。
3.基因导入
对稻完全成熟胚的芽端进行基因导入可以按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
在按照实施例1-1-(4)中记载的方法使用金粒子径0.6μm进行了转化处理的个体中，筛选在芽端组织中观察到GFP荧光的个体。
5.转化处理个体的生长
按照实施例1-2-(4)中记载的方法使转化处理个体生长。
6.T0植物叶的导入基因的确认
按照实施例1-2-(5)中记载的方法得到确认了基因导入的个体。培育得到的个体，获得下一代种子，由此可以得到稳定的转化体。
[实施例11]得到苹果的转化体
对于苹果，可以通过实质上与小麦相同的方法得到转化体。
1.苹果芽端的制备
苹果(品种：Jonah Gold)的芽端的制备按照“植物组织培养,9(2),69-73(1992)”中记载的芽端培养的诱导条件来实施。
2.芽端的暴露
将通过1.的方法制备的芽端置于MS-maltose培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、30g/L麦芽糖、0.98g/L MES、3％PPM(plant preservative mixture、注册商标、NacalaiTesque)、7.0g/L phytagel、pH5.8)，使其为约30个/板。
3.基因导入
作为启动子，使用花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，按照实施例1-1-(3)中记载的方法进行。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
在按照实施例1-1-(4)中记载的方法使用金粒子径0.6μm进行了转化处理的个体中，筛选在芽端组织中观察到GFP荧光的个体。
5.转化处理个体的生长
按照实施例1-2-(4)中记载的方法使转化处理个体生长。
6.T0植物叶的导入基因的确认
按照实施例1-2-(5)中记载的方法得到确认了基因导入的个体。培育得到的个体，获得下一代种子，由此可以获得稳定的转化体。
[实施例12]利用了该基因导入法的靶突变导入
为了验证能否利用该基因导入法进行小麦的基因组编辑，尝试了利用RNA诱导性CRISPR/Cas9进行的靶序列的突变导入。需要说明的是，根据
实施例1-1-(4)使用该基因导入法制备稳定的转化体时，金粒子径优选为0.3μm以上且0.9μm以下，但在制备基因组编辑个体时，只要核酸酶等在植物细胞核内或细胞器内暂时性表达即可，因此并不限定于上述粒子径。因此，对使用该基因导入法能够进行小麦的基因组编辑的金粒子径的范围进行了探讨。
1.以GFP荧光为指标的靶突变导入的确认
(1)小麦完全成熟种子的制备
将小麦(Triticum aestivum cv.Fielder)的完全成熟种子浸渍于HAITER(次氯酸浓度6％)，在室温下振荡20分钟，然后在超净工作台内用灭菌水清洗。在清洗后，放置在用灭菌水润湿的擦拭纸或滤纸上，为了打破休眠，在4℃下孵育了2天。然后在22℃下孵育约12小时，用于以下的实验。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例1-1-(2)中记载的方法进行。
(3)基因导入
使用粒子枪法如下所述进行了对小麦完全成熟胚的芽端的基因导入。
在实施例中，使用了靶质粒DNA(pUC系质粒)，所述靶质粒DNA在荧光报告基因(GFP)的起始密码子后紧接着插入有TaMLO基因内部的20bp部分序列(CCGTCACGCAGGACCCAATCTCC：序列号3)作为靶序列。该基因设计为在玉米的泛素启动子和第一内含子的控制下表达。作为终止子，添加了胭脂碱合成酶(NOS)基因的终止子。通过将gRNA/Cas9一体型质粒与该载体共导入，Cas9切断TaMLO基因靶序列，在修复过程中缺失2个碱基或插入1个碱基。其结果是，发生翻译框移位，GFP基因的密码子的读码框恢复，表达活性型的GFP蛋白质。
该一体型质粒(pUC系质粒)中的gRNA设计为在来自小麦的U6启动子的控制下表达。该Cas9基因设计为在玉米的泛素启动子和第一内含子的控制下表达。作为终止子，添加了胭脂碱合成酶(NOS)基因的终止子。
金粒子的制备及导入操作按照实施例2-1-(3)的方法进行。其中，以每750μg金粒子分别为2.5μg及7.5μg的方式加入靶质粒DNA溶液及gRNA/Cas9一体型质粒。对于每1次射入的金粒子量而言，在金粒子径0.3μm的情况下为375μg，在除此以外的金粒子径的情况下为187.5μg。
(4)通过TaMLO基因序列切断进行GFP荧光的确认
通过在实体荧光显微镜(Leica、MZFLIII)下观察芽端的GFP荧光(激发：470/40、吸收：525/50)，调查了有无TaMLO基因靶序列的切断。在进行了基因导入处理的完全成熟胚中，将芽端组织中观察到1点以上的GFP荧光的个体作为靶序列切断个体，计算出靶序列切断导入效率(靶序列切断个体/处理完全成熟胚数×100)。进行2次实验，将靶序列切断导入效率的平均值示于表11。其结果是，在将靶质粒DNA及gRNA/Cas9一体型质粒共导入时，在金粒子径0.3μm～1.0μm的情况下观察了表示靶序列切断的GFP荧光，但在金粒子径1.6μm的情况下未观察到(表9)。另外，在使用了金粒子径0.6μm的情况下，该效率为23.5％，是最高的(表9、图10)。根据这些结果可知，为了使用该基因导入法制备基因组编辑个体，金粒子径可以为低于1.6μm，金粒子径优选为0.6μm。
表9
Figure BDA0001863637220000291
[实施例13]利用了该基因导入法的靶突变导入(T0代、T1代)
为了验证能否利用该基因导入法进行小麦内部存在的目标基因的基因组编辑，尝试了利用RNA诱导性CRISPR/Cas9进行的TaQsd1基因(alanine aminotransferase基因)、TaLOX2基因(lipoxygenase基因)及TaGASR7基因(Snakin/GASA基因)的突变导入。需要说明的是，TaQsd1基因的突变导入中使用了实用品种“Haruyokoi”，其它中使用了“Bobwhite”。
1.基因导入后第一周的目标基因突变导入的确认
(1)小麦完全成熟种子的制备
使用小麦(Triticum aestivum cv.Bobwhite、Triticum aestivumcv.Haruyokoi)的完全成熟种子，按照实施例1-1-(1)的方法进行。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例1-1-(2)中记载的方法进行。
(3)基因导入
使用粒子枪法如下所述进行了对小麦完全成熟胚的芽端的基因导入。
在实施例中，作为gRNA表达用质粒，对pTAKN-2载体的多克隆位点克隆了小麦U6启动子及gRNA scaffold。然后，对内部的BbsI位点导入各目标基因的靶序列，制成各gRNA表达用质粒。
TaQsd1靶序列：ACGGATCCACCTCCCTGCAGCGG(序列号4)
TaLOX2靶序列：GTGCCGCGCGACGAGCTCTTCGG(序列号5)
TaGASR7靶序列：CCGCCGGGCACCTACGGCAAC(序列号6)
以每750μg金粒子分别为5μg、2.5μg、2.5μg的方式加入上述各gRNA表达用质粒、Cas9基因表达用质粒及GFP表达用质粒(参照实施例1-1-(3))。金粒子径设为0.6μm，以每1次射入的金粒子量为187.5μg的方式加入。
(4)通过各目标基因序列切断进行突变导入的确认
将在实体荧光显微镜(Leica、MZFLIII)下观察到芽端的GFP荧光(激发：470/40、吸收：525/50)的个体移植至加入了MS-maltose培养基的一次性植物细胞培养容器(Sigma)，在长日照(22℃、16小时日照)下培育。在约1周后，切下各个体中的芽端，加入添加有2μL的DNAzol Direct(注册商标、Cosmo Bio)的8连管PCR管，提取出基因组DNA。
以此为模板，使用由对各基因特异性的序列制备的引物进行了PCR反应。
TaQsd1-F：CAGCCTGGAGGGAATGACC(序列号7)
TaQsd1-R：ACCTGGTGGAATCCAGAGC(序列号8)
TaLOX2-F：CGTCTACCGCTACGACGTCTACAACG(序列号9)
TaLOX2-R：GGTCGCCGTACTTGCTCGGATCAAGT(序列号10)
TaGASR7-F：CCTTCATCCTTCAGCCATGCAT(序列号11)
TaGASR7-R：CCACTAAATGCCTATCACATACG(序列号12)
在PCR反应液中加入基因组DNA0.5μL、KODFXNeo(TOYOBO)0.4U、2×附带的缓冲液10μL、0.4mMdNTPs、引物对各0.2μM，用灭菌蒸馏水填充至总计20μL。
PCR使用TaKara PCR Thermal Cycler Dice，将98℃下10秒钟、68℃下1分钟的反应作为1个循环，将其进行了35个循环。在PCR反应后，加入各PCR产物1μL、10×附带的缓冲液1μL、适当的限制酶5U，用灭菌蒸馏水填充至总计10μL。在37℃下反应过夜，然后进行2.0％的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭进行染色。
在野生型株的情况下，PCR产物被限制酶完全切断，与此相对，在导入了突变的个体的情况下，PCR产物中产生切断残余。从切断残留的条带中提取DNA并纯化，进行序列分析，对于在目标基因序列中导入了突变的个体，判断为目标基因突变导入个体(图11)。其结果是，对于全部的目标基因，在基因组编辑用载体导入后第1周的芽端中的细胞群中确认了突变导入。
2.T0代成熟叶及T1代幼叶的目标基因突变导入确认
(1)小麦完全成熟种子的制备
按照实施例13-1-(1)中记载的方法进行。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例13-1-(2)中记载的方法进行。
(3)基因导入
按照实施例13-1-(3)中记载的方法进行。
(4)基因导入个体的生长
将静置过夜的基因导入个体移植至加入了MS-maltose培养基的一次性植物细胞培养容器(Sigma)，在长日照(22℃、16小时日照)下培育。在使其生长2周后，在观察第2～3叶的时刻，移植至装有园艺用育苗培土的盆中。之后，在长日照的人工气候室(24℃、16小时日照、湿度50～70％)中培育。
(5)T0植物叶的目标基因突变导入的确认
在得到的植物体中，调查了是否在目标基因中导入了突变。使用氯化苄法从第5叶或旗叶(50mg)中提取基因组DNA，以其为模板，使用由对各基因特异性的序列制备的引物进行了PCR反应。
在PCR反应液中加入基因组DNA0.7μL、KODFXNeo(TOYOBO)0.4U、2×附带的缓冲液5μL、0.4mMdNTPs、引物对各0.2μM，用灭菌蒸馏水填充至总计10μL。
PCR使用TaKara PCR Thermal Cycler Dice，以98℃下10秒钟、68℃下1分钟的反应作为1个循环，将其进行了32个循环。PCR/限制酶分析按照实施例13-1-(4)中记载的方法进行。
在野生型株的情况下，PCR产物被限制酶完全切断，与此相对，在导入了突变的个体中，在PCR产物中产生切断残余。从切断残留的条带中提取DNA并纯化，进行序列分析，对于在目标基因序列中导入了突变的个体，判断为目标基因突变导入个体。其结果是，对于全部的目标基因，在T0代成熟叶中确认了目标基因突变导入(图12、表10)。
[表10]
Figure BDA0001863637220000311
(6)T1植物叶的目标基因突变导入的确认
从上述(5)中确认到突变的TaQsd1突变导入个体中回收T1种子，使用氯化苄法从T1代植物的幼叶(50mg)中提取基因组DNA。随后的目标基因突变导入的确认按照上述(5)中记载的方法进行。其结果是，对于T1代2系统，确认了T1代幼叶的目标基因突变导入。图13示出了T1代1系统的分析结果。在16个个体中，对于9个个体确认了在目标基因中已导入了突变。可知，通过使用该基因导入法，可以对转移至芽端中的生殖细胞系的芽端干细胞进行基因组编辑。
[实施例14]通过利用了该基因导入法的Cas9蛋白质导入进行的靶突变导入
对于能否通过利用了该基因导入法的gRNA/Cas9蛋白质导入，从而对内部存在于小麦中的目标基因进行基因组编辑。在进行检验时，将以TaLOX2基为靶gRNA及Cas9蛋白质的复合体导入小麦芽端。
1.基因导入后第一周的目标基因突变导入的确认
(1)小麦完全成熟种子的制备
使用小麦(Triticum aestivum cv.Bobwhite)的完全成熟种子，按照实施例1-1-(1)的方法进行。
(2)完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例1-1-(2)的方法进行。
(3)gRNA/Cas9蛋白质导入
使用粒子枪法如下所述进行了对小麦完全成熟胚的芽端的基因导入。
在实施例中，使用crRNA及tracrRNA(FASMAC)的混合物(0.5μg/μL)作为gRNA。使用来自于Streptococcus pyogenes的EnGen Cas9NLS(NEB)作为Cas9蛋白质。
crRNA：
GUGCCGCGCGACGAGCUCUUguuuuagagcuaugcuguuuug(序列号13)
tracrRNA：
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(序列号14)
加入上述各gRNA 4μg、Cas9蛋白质7μg、10×Cas9缓冲液2μL、Ribolock RNaseInhibitor 0.5μL，用灭菌蒸馏水填充至总计20μL。在室温下静置15分钟后，加入金粒子750μg或1500μg，在冰上静置10分钟。舍弃上清，然后加入GFP表达用质粒(参照实施例1-1-(3))2.5μg及灭菌蒸馏水32μL，将其用作金粒子/Cas9复合体。需要说明的是，金粒子径设为0.6μm，每一次注入的金粒子量为187.5或375μg，每1个板进行4次注入。在超净工作台内将切成1.0～1.5cm见方的亲水性膜(3M、SH2CLHF)粘贴于macrocarrier的中央。在其上每次注入上述金粒子/Cas9复合体8μL，使其风干。注入条件按照实施例1-1-(3)进行。
(4)通过TaLOX2目标基因序列切断进行突变导入的确认
按照实施例13-1-(4)中记载的方法进行了分析。
在未使用亲水性膜时，未观察到芽端的GFP荧光，与此相对，在使用时，观察了GFP荧光(表11)。另外，通过将每1次注入的金粒子量从187.5μg增加至375μg，使GFP荧光的表达效率从23.3％提高至66.7％(表11)。可知，通过使用亲水性膜，可以高效率地向芽端导入分散于水性溶剂的金粒子。对于观察到GFP荧光的个体，按照实施例13-1-(4)进行了PCR/限制酶分析，结果是，在野生型株的情况下，PCR产物被限制酶完全切断，与此相对，在导入了突变的个体的情况下，在PCR产物中产生切断残余。从切断残留的条带中提取DNA并纯化，进行序列分析，结果是确认到在目标基因序列中导入了突变(图14)。其结果是，对于TaLOX2目标基因，在gRNA/Cas9蛋白质导入后第1周的芽端中的细胞群中确认了突变导入。
表11
亲水性膜带来的金粒子导入效率提高
Figure BDA0001863637220000331
[实施例15]利用了该基因导入法的大豆的靶突变导入
对于大豆，可以通过实质上与小麦相同的方法来得到目标基因突变导入个体。
1.大豆完全成熟种子的制备
使用大豆(Fukuyutaka、Enrei)的完全成熟种子，按照实施例7-1-(1)中记载的方法制备。
2.完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例7-1-(2)中记载的方法进行。
3.基因导入
使用粒子枪法如下所述进行了对完全成熟胚的芽端的基因导入。
在实施例中，作为gRNA表达用质粒，对pTAKN-2载体的多克隆位点克隆了大豆U6启动子及gRNA scaffold。然后，对内部的BbsI位点导入目标基因的靶序列，制成各gRNA表达用质粒。
Glyma.10G244400.1靶序列：CCTCCGCCCAAGGCTCCGCCACC(序列号15)
Glyma.20G150000.1靶序列：CCTCCGCCCAAGGCTCCGCCACC(序列号15)
以每750μg金粒子分别为5μg、2.5μg、2.5μg的方式加入上述各gRNA表达用质粒、Cas9基因表达用质粒及GFP表达用质粒(参照实施例7-1-(3))。金粒子径设为0.6μm，以每1次射入的金粒子量为187.5μg的方式加入。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的挑选
将在实体荧光显微镜(Leica、MZFLIII)下观察到芽端的GFP荧光(激发：470/40、吸收：525/50)的个体移植至加入了RM培养基(4.3g/L MS盐、MS维生素、3％蔗糖、0.50g/LMES、3％PPM(plant preservative mixture、Nacalai Tesque)、0.3％结冷胶(gelrite)、pH5.7)的一次性植物细胞培养容器(Sigma)，在培养箱(23℃、16小时日照)中培育。
5.基因导入个体的生长
按照实施例7-2-(1)中记载的方法进行。
6.T0植物叶的目标基因突变导入的确认
在得到的植物体中，调查了目标基因中是否导入了突变。使用氯化苄法从新生长的叶(50mg)中提取基因组DNA，以其为模板，使用由对各基因特异性的序列制成的引物进行了PCR反应。PCR/限制酶分析按照实施例13-1-(4)中记载的方法进行。通过直接培育导入了突变的个体，获得下一代的种子，可以得到稳定地在目标基因中导入了突变的个体。
[实施例16]通过利用了该基因导入法的Cas9蛋白质导入对大豆导入靶突变
对于大豆，也可以通过实质上与小麦相同的方法得到目标基因突变导入个体。例如，将以Glyma.10G244400.1基因为靶的gRNA及Cas9蛋白质的复合体导入芽端。
1.大豆完全成熟种子的制备
按照实施例15-1中记载的方法进行。
2.完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例15-2中记载的方法进行。
3.gRNA/Cas9蛋白质导入
使用粒子枪法如下所述进行了对大豆完全成熟胚的芽端的基因导入。
在实施例中，使用crRNA及tracrRNA(FASMAC)的混合物(0.5μg/μL)作为gRNA。使用来自于Streptococcus pyogenes的EnGen Cas9NLS(NEB)作为Cas9蛋白质。
crRNA：
GGUGGCGGAGCCUUGGGCGGguuuuagagcuaugcuguuuug(序列号16)
tracrRNA：
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(序列号14)
注入条件按照实施例14-1-(3)中记载的方法。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
按照实施例15-4中记载的方法进行。
5.基因导入个体的生长
按照实施例15-5中记载的方法进行。
6.T0植物叶的目标基因突变导入的确认
按照实施例15-6中记载的方法，可以得到稳定地在目标基因中导入了突变的个体。
[实施例17]通过利用了该基因导入法的Cas9蛋白质导入对稻导入靶突变
对于稻，也可以通过实质上与小麦相同的方法得到目标基因突变导入个体。例如，将以OsPDS(稻phytoene desaturase)基因为靶的gRNA及Cas9蛋白质的复合体导入稻的芽端。
1.稻完全成熟种子的制备
按照实施例10-1中记载的方法进行。
2.完全成熟种子胚中的芽端的暴露
按照实施例10-2中记载的方法进行。
3.gRNA/Cas9蛋白质导入
使用粒子枪法如下所述进行了对稻完全成熟胚的芽端的基因导入。
在实施例中，使用crRNA及tracrRNA(FASMAC)的混合物(0.5μg/μL)作为gRNA。使用来自于Streptococcus pyogenes的EnGen Cas9NLS(NEB)作为Cas9蛋白质。
crRNA：
GUUGGUCUUUGCUCCUGCAGguuuuagagcuaugcuguuuug(序列号17)
tracrRNA：
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(序列号14)
注入条件按照实施例14-1-(3)中记载的方法。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
按照实施例10-4中记载的方法进行。
5.基因导入个体的生长
按照实施例10-5中记载的方法进行。
6.T0植物叶的目标基因突变导入的确认
按照实施例15-6中记载的方法，可以得到稳定地在目标基因中导入了突变的个体。
[实施例18]通过利用了该基因导入法的Cas9蛋白质导入对苹果导入靶突变
对于苹果而言，可以通过实质上与小麦相同的方法得到目标基因突变导入个体。例如，将以苹果PDS(phytoene desaturase)基因为靶的gRNA及Cas9蛋白质的复合体导入苹果的芽端。
1.苹果芽端的制备
按照实施例11-1中记载的方法进行。
2.芽端的暴露
按照实施例11-2中记载的方法进行。
3.导入gRNA/Cas9蛋白质
使用粒子枪法如下所述进行了对苹果的芽端的基因导入。
在实施例中，使用crRNA及tracrRNA(FASMAC)的混合物(0.5μg/μL)作为gRNA。使用来自于Streptococcus pyogenes的EnGen Cas9NLS(NEB)作为Cas9蛋白质。
crRNA：
ACCUGAUCGAGUAACUACAGguuuuagagcuaugcuguuuug(序列号18)
tracrRNA：
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(序列号14)
注入条件按照实施例14-1-(3)中记载的方法。其中，使用实施例7-1-(3)中记载的GFP载体。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
按照实施例11-4中记载的方法进行。
5.基因导入个体的生长
按照实施例11-5中记载的方法进行。
6.T0植物叶的目标基因突变导入的确认
按照实施例15-6中记载的方法进行，可以得到稳定地在目标基因中导入了突变的个体。
[实施例19]通过利用了该基因导入法的Cas9蛋白质导入对土豆导入靶突变
对于土豆，也可以通过实质上与小麦相同的方法得到目标基因突变导入个体。例如，将以StIAA2(an Auxin/Indole-3-Acetic Acid family member)基因为靶的gRNA及Cas9蛋白质的复合体导入土豆芽端。
1.土豆芽端的制备
按照实施例9-1中记载的方法进行。
2.芽端的暴露
按照实施例9-2中记载的方法进行。
3.导入gRNA/Cas9蛋白质
使用粒子枪法如下所述进行了对土豆的芽端的基因导入。
在实施例中，使用crRNA及tracrRNA(FASMAC)的混合物(0.5μg/μL)作为gRNA。使用来自于Streptococcus pyogenes的EnGen Cas9NLS(NEB)作为Cas9蛋白质。
crRNA：
GAUGUUUAGCUCCUUUACUAguuuuagagcuaugcuguuuug(序列号19)
tracrRNA：
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(序列号14)
射入条件按照实施例14-1-(3)中记载的方法。其中，使用实施例7-1-(3)中记载的GFP载体。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
按照实施例9-(4)中记载的方法进行。
5.基因导入个体的生长
按照实施例1-2-(4)中记载的方法进行。
6.T0植物叶的目标基因突变导入的确认
按照实施例15-6中记载的方法，可以得到稳定地在目标基因中导入了突变的个体。
[实施例20]通过利用了该基因导入法的Cas9蛋白质导入对玉米导入靶突变
对于玉米而言，也可以通过实质上与小麦相同的方法得到目标基因突变导入个体。例如，将以ZmALS2(玉米acetolactate synthase)基因为靶的gRNA及Cas9蛋白质的复合体导入玉米芽端。
1.玉米芽端的制备
按照实施例6-1-(1)中记载的方法进行。
2.芽端的暴露
按照实施例6-1-(2)中记载的方法进行。
3.导入gRNA/Cas9蛋白质
使用粒子枪法如下所述进行了对玉米的芽端的基因导入。
在实施例中，使用crRNA及tracrRNA(FASMAC)的混合物(0.5μg/μL)作为gRNA。使用来自于Streptococcus pyogenes的EnGen Cas9NLS(NEB)作为Cas9蛋白质。
crRNA：
GCUGCUCGAUUCCGUCCCCAguuuuagagcuaugcuguuuug(序列号20)
tracrRNA：
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(序列号14)
射入条件按照实施例14-1-(3)中记载的方法。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
在按照实施例1-1-(4)中记载的方法使用金粒子径0.6μm进行了转化处理的个体中，筛选在芽端组织中观察到GFP荧光的个体。
5.基因导入个体的生长
按照实施例1-2-(4)中记载的方法进行。
6.T0植物叶的目标基因突变导入的确认
按照实施例15-6中记载的方法，可以得到稳定地在目标基因中导入了突变的个体。
[实施例21]通过利用了该基因导入法的Cas9蛋白质导入对大麦导入靶突变
对于大麦而言，也可以通过实质上与小麦相同的方法得到目标基因突变导入个体。例如，将以HvPM19(大麦ABA-inducible plasma membrane protein)基因为靶的gRNA及Cas9蛋白质的复合体导入大麦芽端。
1.大麦芽端的制备
按照实施例8-1-(1)中记载的方法进行。
2.芽端的暴露
按照实施例8-1-(2)中记载的方法进行。
3.导入gRNA/Cas9蛋白质
使用粒子枪法如下所述进行了对大麦的芽端的基因导入。
在实施例中，使用crRNA及tracrRNA(FASMAC)的混合物(0.5μg/μL)作为gRNA。使用来自于Streptococcus pyogenes的EnGen Cas9NLS(NEB)作为Cas9蛋白质。
crRNA：
GCUCUCCACUCUGGGCUCUUguuuuagagcuaugcuguuuug(序列号21)
tracrRNA：
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(序列号14)
射入条件按照实施例14-1-(3)中记载的方法。
4.以GFP蛋白质的暂时性表达为指标的筛选
在按照实施例1-1-(4)中记载的方法使用金粒子径0.6μm进行了转化处理的个体中，筛选在芽端组织中观察到GFP荧光的个体。
5.基因导入个体的生长
按照实施例1-2-(4)中记载的方法进行。
6.T0植物叶的目标基因突变导入的确认
按照实施例15-6中记载的方法，可以得到稳定地在目标基因中导入了突变的个体。
工业实用性
本发明可以用于农业、医药工业、酶工业等。
序列表
<110> 株式会社钟化（Kaneka Corporation）
<120> 植物的基因组编辑方法
<130> P2-18K08067
<140> PCT/JP2017/018263
<141> 2017-05-15
<150> JP 2016-97465
<151> 2016-05-13
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP 正向引物
<400> 1
acggccacaa gttcagcgt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP 反向引物
<400> 2
accatgtgat cgcgcttct 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaMLO 20bp
<400> 3
ccgtcacgca ggacccaatc tcc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaQsd1 靶
<400> 4
acggatccac ctccctgcag cgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaLox2 靶序列
<400> 5
gtgccgcgcg acgagctctt cgg 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaGASR7 靶序列
<400> 6
ccgccgggca cctacggcaa c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaQsd1-F 引物
<400> 7
cagcctggag ggaatgacc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaQsd1-R 引物
<400> 8
acctggtgga atccagagc 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaLox2-F 引物
<400> 9
cgtctaccgc tacgacgtct acaacg 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaLox2-R 引物
<400> 10
ggtcgccgta cttgctcgga tcaagt 26
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaGASR7-F 引物
<400> 11
ccttcatcct tcagccatgc at 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaGASR7-R 引物
<400> 12
ccactaaatg cctatcacat acg 23
<210> 13
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NLS crRNA1
<400> 13
gugccgcgcg acgagcucuu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 14
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tracrRNA
<400> 14
aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60
gucggugcu 69
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glyma 10G244400.1 20G150000.1 靶
<400> 15
cctccgccca aggctccgcc acc 23
<210> 16
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NLScrRNA gm 10G244400.1
<400> 16
gguggcggag ccuugggcgg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 17
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> crRNA2 稻 OsPDS
<400> 17
guuggucuuu gcuccugcag guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 18
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> crRNA3 苹果 PDS
<400> 18
accugaucga guaacuacag guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 19
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> crRNA4 土豆 StIAA2
<400> 19
gauguuuagc uccuuuacua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 20
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> crRNA Zm ALS2
<400> 20
gcugcucgau uccgucccca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 21
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> crRNA 大麦 HvPM19
<400> 21
gcucuccacu cugggcucuu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42

Claims (17)

1.一种植物的基因组编辑方法，该方法包括：
利用蛋白质包覆微粒的工序；
使用基因枪将该包覆后的微粒射入完全成熟种子的胚的芽端、块茎的幼芽的芽端、或者顶芽或侧芽的芽端的工序；
使射入了该包覆后的微粒的芽端生长而得到植物体的工序；以及
从该植物体中选择经过基因组编辑的植物体的工序，
所述射入的工序中使用亲水性macrocarrier膜。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：
射入所述完全成熟种子的胚的芽端、块茎的幼芽的芽端、或者顶芽或侧芽的芽端中的L2细胞的工序。
3.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：
射入芽端干细胞以转移至所述完全成熟种子的胚的芽端、块茎的幼芽的芽端、或者顶芽或侧芽的芽端中的生殖细胞系的工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述微粒为直径0.3μm以上且1.5μm以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
所述完全成熟种子的胚的芽端是从该完全成熟种子除去胚乳、胚芽鞘、叶原基及多余的盾片而露出的芽端。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
所述块茎的幼芽的芽端是从该块茎的幼芽除去块茎、叶原基而露出的芽端。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
所述顶芽或侧芽的芽端是从该顶芽或侧芽除去叶原基而露出的芽端。
8.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
所述完全成熟种子是其根长为1mm以下的完全成熟种子。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
所述植物为选自小麦、大麦、稻、玉米、大豆、土豆及苹果中的任1种。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白质为核酸酶。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白质为Cas核酸酶。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
在向所述芽端进行射入的工序中，停止板和芽端以所述停止板与所述芽端之间的距离为6cm以下的方式被设置于基因枪。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，
在得到所述植物体的工序中，不施加选择压力而使其生长。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，
向所述芽端射入所述微粒的次数为2次以上。
15.使用权利要求1～14中任一项所述的方法制备经过基因组编辑的植物体的方法。
16.利用植物原位法对芽端分生组织中的生殖细胞系或能够转移至其中的干细胞进行基因组编辑的方法，该方法包括权利要求1～14中任一项的方法。
17.使用权利要求16所述的方法制备经过基因组编辑的植物体的方法。
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