CZ86798A3 - Fertilní transgenní rostlina pšenice, způsob její přípravy, buňky a semena této rostliny - Google Patents
Fertilní transgenní rostlina pšenice, způsob její přípravy, buňky a semena této rostliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ86798A3 CZ86798A3 CZ98867A CZ86798A CZ86798A3 CZ 86798 A3 CZ86798 A3 CZ 86798A3 CZ 98867 A CZ98867 A CZ 98867A CZ 86798 A CZ86798 A CZ 86798A CZ 86798 A3 CZ86798 A3 CZ 86798A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plant
- gene
- wheat
- fertile
- plants
- Prior art date
Links
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 183
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 104
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 87
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 72
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims abstract description 65
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 105
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 82
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 45
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 40
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 26
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 24
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 claims description 21
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 13
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 10
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 5
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150100833 aacC3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150038558 aacC4 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 abstract description 37
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 33
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 74
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 67
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 67
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 58
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 55
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 14
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 13
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 13
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 13
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 11
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 10
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 10
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 7
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- VKTCMMONRNFKJD-BYPYZUCNSA-N (2r)-3-aminosulfanyl-2-(ethylamino)propanoic acid Chemical compound CCN[C@H](C(O)=O)CSN VKTCMMONRNFKJD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 5
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 5
- 241000287937 Colinus Species 0.000 description 4
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 4
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 241001429320 Wheat streak mosaic virus Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N benomyl Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)NCCCC)C(NC(=O)OC)=NC2=C1 RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- -1 but not limited to Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 4
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 3
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 3
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 101710083587 Antifungal protein Proteins 0.000 description 2
- 241000709756 Barley yellow dwarf virus Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 229930189077 Rifamycin Natural products 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- MWZMHLBLVDPOJE-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[[n'-(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)carbamimidoyl]amino]phenyl]sulfonyl-3-phenylurea Chemical compound CC1=CC(C)=NC(N=C(N)NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC(=O)NC=2C=CC=CC=2)=N1 MWZMHLBLVDPOJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCWLJSDMOMMDRF-SZWOQXJISA-N 3-[(3s,6r)-2-oxo-6-[(1s,2r,3r)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]morpholin-3-yl]propanamide Chemical compound NC(=O)CC[C@@H]1NC[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO)OC1=O HCWLJSDMOMMDRF-SZWOQXJISA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- ILQOASSPNGAIBC-UHFFFAOYSA-N Agropine Natural products OC(O)C(O)CC(O)C1CN2C(CCC2=O)C(=O)O1 ILQOASSPNGAIBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000430521 Alyssum Species 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Natural products OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 101150083464 CP gene Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016852 Foetal damage Diseases 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241001441571 Hiodontidae Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-Canavanine Natural products OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-O L-canavanine(1+) Chemical compound NC(N)=[NH+]OCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-O 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001447067 Maize red stripe virus Species 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100214703 Salmonella sp aacC4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100018379 Shigella flexneri icsA gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 244000010375 Talinum crassifolium Species 0.000 description 1
- 235000015055 Talinum crassifolium Nutrition 0.000 description 1
- 240000002805 Triticum turgidum Species 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101100476911 Yersinia enterocolitica yscW gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 108010065885 aminoglycoside N(3')-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 108010002833 beta-lactamase TEM-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004708 ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 229960003292 rifamycin Drugs 0.000 description 1
- HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N rifamycin SV Chemical compound OC1=C(C(O)=C2C)C3=C(O)C=C1NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@@H](OC)\C=C\O[C@@]1(C)OC2=C3C1=O HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N 0.000 description 1
- BTVYFIMKUHNOBZ-QXMMDKDBSA-N rifamycin s Chemical class O=C1C(C(O)=C2C)=C3C(=O)C=C1NC(=O)\C(C)=C/C=C\C(C)C(O)C(C)C(O)C(C)C(OC(C)=O)C(C)C(OC)\C=C/OC1(C)OC2=C3C1=O BTVYFIMKUHNOBZ-QXMMDKDBSA-N 0.000 description 1
- 229940081192 rifamycins Drugs 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 1
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 101150076562 virB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033532 virG gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074257 xylE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Grain Derivatives (AREA)
- Soy Sauces And Products Related Thereto (AREA)
- Seasonings (AREA)
Description
(57) Anotace:
Jsou popsány postupy pro produkci stabilně transformované fertilní pšenice systémem transformujícím pšenici pomocí Agrobacterium. Vynález umožňuje transformaci různých explantátů, Jako jsou čerstvě izolované nebo pre-kultivované nezralé zárodky, zárodečný kalus a suspenze buněk. Také Jsou popsány způsoby pro získání transgenních rostlin po transformaci během krátké doby, pokud jsou explantáty regenerovatelné v době transformace. Proto Je frekvence somaklonálních variací spojených s dlouhodobou kultivací in vitro významně snížena. Frekvence transformace při použití tohoto systému je srovnatelná nebo vyšší než u publikovaných způsobů využívajících jiných systémů, jako je ostřelování mikročásticemi.
(13) Druh dokumentu: A3 (51) Int. Cl6:
C 12 N 15/82 A01H 5/00 • ·
Fertilní transgenní rostlina pšenice, způsob její přípravy a semena této rostliny
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká oblasti molekulární biologie. Přesněji, týká se způsobů pro inkorporaci cizorodé DNA do genomu jednoděložných rostlin, a zejména pšenice. Jsou zde poskytnuty reprodukovatelné systémy pro genetickou transformaci pšenice, způsoby pro selekci stabilních genetických transformantů ze suspenze transformovaných buněk a způsoby pro produkci fertilních rostlin z transformovaných buněk. Příkladné způsoby obsahují použití Agrobacteriumzprostředkované transformace pro zavedení nukleových kyselin do buněk, a selektovatelného a/vyšetřitelného markerového systému, například genů, které udělují resistenci (například na antibiotika, herbicidy atd.) nebo které obsahují jiný fenotypicky pozorovatelný znak. V jiném aspektu se vynález týká produkce stabilně transformovaných a fertilních rostlin pšenice, gamet a potomstva těchto rostlin.
Dosavadní stav techniky
Celý text US patentové přihlášky (USSN) 08/329742 podané 26.10.1994 je zde uveden jako odkaz ve své úplnosti. V průběhu poslední dekády se stal přenos genů z široké škály organismů do plodin možný za použití rekombinantní DNA technologie. Tato výhoda poskytla nesmírné možnosti pro zlepšení resistence rostlin vůči škůdcům, nemocem a herbicidům, a možnosti pro zlepšení biosyntetických procesů • · • ♦ · ♦ · pro změnu kvality produktů rostlin (Knutson a kol., 1992; Piorer a kol., 1992; Vasil a kol., 1992). Nicméně, dostupnost účinných metod transformace pro zavedení cizorodé DNA byla významnou barierou pro většinu jednoděložných druhů, včetně kukuřice, rýže, ovsu, ječmene a zejména pšenice.
Dostupné metody pro transformaci jednoděložných rostlin
Bylo zkoušeno mnoho metod pro transformaci jednoděložných rostlin, ale pouze několik metod vedlo ke stabilní transformaci. Pro většinu transgenních studií u jednoděložných rostlin jsou v současnosti využívány dvě metody: přímý přenos DNA do izolovaných protoplastů a přenos DNA za použití mikroprojektilů (Shimamoto a kol., 1989; Fromm a kol., 1990). Nověji byly také vyvinuty další metody pro použití u jednoděložných rostlin. Následuje podrobný popis metod, které vedly ke stabilně transformovaným a fertilním jednoděložným rostlinám, které jsou schopny přenosu svých genů na potomstvo podle Mendelovské dědičnosti.
Biolistika
Biolistika je nejčastěji používanou transformační metodou pro jednoděložné rostliny. V biolistické metodě jsou mikroprojektilové částice potaženy DNA a akcelerovány s použitím mechanického zařízení na rychlost dostatečnou pro penetraci stěny rostlinné buňky a jádra (mezinárodní patentová přihláška publikační č. WO 91/02071). Cizorodá DNA se inkorporuje do hostitelské DNA, což vede ke vzniku transformované buňky. Existuje mnoho variací biolistické metody (Sanford, 1990; Fromm a kol., 1990; Christou a kol.,
1988); Sauterr a kol., 1991). Tato metoda byla úspěšně použita pro produkci stabilně transformovaných jednoděložných rostlin včetně rýže, kukuřice, pšenice, ječmene a ovsu (Christou a kol., 1991; Gordon-Kamm a kol., 1990; Vasil a kol., 1992, 1993; Wan a kol., 1993; Sommers a kol., 1992).
Mikroprojektilová metoda přenosu DNA může využívat jako cílové tkáně kalů odvozených od nezralého zárodku nebo nezralých zárodků. Transgenní rostliny byly získány metodou ostřelování mikroprojektily u rýže, ovsu, ječmene a pšenice (Gordon-Kamm a kol.. 1990); Sommers a kol·, 1992; Wan a kol., 1994; Vasil a kol.. 1992).
Metoda ostřelování mikročásticemi obyčejně vyžaduje až 15 měsíců pro získání transgenních rostlin (Gordon-Kamm a kol., 1990; Vasil a kol., 1992). I novější vylepšení transformačních metod za použití nezralých zárodků jako cílové tkáně stále vyžadují 4 až 6 měsíců pro získání transgenních rostlin (Weeks a kol., 1993; Vasil a kol., 1992; Becker a kol·, 1994). Frekvence transformace za použití těchto metod se pohybuje v rozsahu od jedné transformace na 100 až 1000 ostřelovaných zárodků.
Elektroporace
Protoplastové metody byly ve velkém rozsahu použity u rýže, kde byla DNA dopravena do protoplastů pomocí liposomů, PEG a elektroporace. Ačkoliv byl v několika labotatořích získán velký počet transgenních rostlin (Shimamoto a kol., 1989; Datta a kol., 1990), vyžaduje protoplastová metoda ustanovení dlouhodobých embryogenních • · suspenzních kultur. Některé regeneranty z protoplastů jsou infertilní a fenotypicky abnormální, což je způsobeno dlouhodobou suspenzní kultivací (Davey a kol., 1991; Rhodes a kol., 1988). Tyto postupy byly zejména užitečné pro rýži a některé obilniny.
Transformace elektroporací vyžaduje aplikaci krátkodobých, vysokonapěbových elektrických polí pro vytvoření pórů v buněčné membráně, kterými je DNA vychytávána. Tato metoda byla použita pro produkci stabilně transformovaných jednoděložných rostlin (Pasazkowski a kol., 1985; Shillito a kol., 1985; Fromm a kol., 1986), zejména u rýže (Shimamoto a kol., 1992; Datta a kol., 1990, 1992; Hayakawa a kol., 1992).
Chemické ošetření protoplastů
Polyethylenglykolová (PEG) metoda je jednoduše chemické ošetření za přítomnosti protoplastů a DNA (Shillito a kol., 1985; Rhodes a kol., 1988). PEG usnadňuje vychytávání DNA.
Další metody
Pro transformaci jednoděložných rostlin bylo popsáno mnoho dalších metod. Metody popsané pro produkci fertilních transgenních jednoděložných rostlin zahrnují metodu pylové láčky (mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 93/18168; Zahir , 1993, Luo a Wu, 1988) a makro injekci DNA do květních odnoží (Du a kol., 1989; Picard a kol., 1988; De la Pěna a kol., 1987) a tkáňovou inkubaci semen v roztocích
DNA (Tofer a kol., 1989). Přímá injekce exogenní DNA do endospermu fertilizovaného rostlinného vajíčka při nástupu embryogenese byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce publ. č. WO 94/00583. Kromě protoplastové a biolistické metody transformace nejsou další metody reprodukovatelné nebo předpověditelné. Obvykle je zde důkaz exprese, ale zřídkakdy je DNA přenesena na potomstvo.
Nedostatky v dosavadního stavu
Jednou významnou oblasti, kde byl v oboru učiněn malý pokrok, je adaptace bakteriemi zprostředkovaných metod transformace na jednoděložné rostliny. Ačkoli je široce využíván u dvojděložných rostlin, byl Agrobacteriumzprostředkovaný genový přenos při adaptaci na jednoděložné rostliny zklamáním. V literatuře existuje několik zpráv nárokujících Agrobacterium-transformaci u jednoděložných rostlin, jak tomu je například v mezinárodní patentové přihlášce publ. č. WO 94/0077. Konkrétně jsou to metody, které popsal Gould a kol., 1991; Mooney a kol., 1991; a Raineri a kol., 1990, které nárokují Agrobacerium zprostředkovanou transformaci kukuřice, rýže a pšenice. Existují určité důkazy genového přenosu u těchto metod, ale postrádají přesvědčivé důkazy pro účinnost přenosu, reprodukovatelnost a potvrzení genového přenosu (Potrykus, 1990) a chybí jim přenos na potomstvo, pokud jsou rostliny produkovány. V práci Goulda, kde byl presentován důkaz transformovaných rostlin, nebyla Mendelovská dědičnost genů.
De LaFonteyne a kol., (mezinárodní patentová přihláška • · • · publ. č. WO 92/06205) popisuje proces pro transformaci buněk kukuřice za použití kmenů A. tumefaciens v kombinaci s transposonem-zprostředkovanou metodou integrace, ale úspěšnost takových metod u jiných druhů nebyla prokázána.
Mooney a kol. (1991) produkoval transformované buňky ze zárodků pšenice kultivovaných společně s A. tumefaciens, ale frekvence transformace byla velmi nízká a často nereprodukovatelná. Chán a kol., (1993), se následně pokusil o produkci rotlin transgenní rýže za použití A. tumefaciens, ale jeho metoda nebyla obecně přijata, vzhledem k nedostatku dostatečných molekulárních a genetických důkazů pro produkci transgennich rostlin.
Novější pokusy provedené Hiei a kol., (1994) naznačily, že rostliny transgenní rýže mohou být získány po transformaci A. tumefaciens, ale že určité použité bakteriální kmeny a volba bakteriálních vektorů mohou být kritické pro úspěšné získání transgenů. Nedávná zpráva od Ishida a kol., (1996), naznačuje, že vysoce účinná transformace kukuřice byla možná společnou kultivací nezralých zárodků a A. tumefaciens. V obou zprávách týkajících se jak transformace rýže, tak kukuřice, byl pro dosažení vysoce účinné transformace použit super binární vektor pTOK233 obsahující virB, vire a virG geny. Nedávná zpráva od Saito a kol. (mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 95/06722) popisuje metodu pro transformaci jednoděložných rostlin za použití štítku nediferencovaných nezralých zárodků a s použitím A. tumefaciens.
I přes skutečnost, že pšenice je nejrozšířenější • ·
• · užitkovou obilovinou na světě, neexistují na neštěstí žádné přesvědčivé zprávy o použití metod transformace za použití Agrobacterium v přípravě rostlin stabilní, fertilní transgenní pšenice. Obdobně, nebyly vyvinuty žádné metody využívající nezralých zárodečných tkání nebo tkání kalu pro stabilní, vysokofrekvenční transformaci pšenice. Proto, v dosavadním stavu techniky chybí Agrobacteriumzprostředkovaná metoda pro přípravu fertilní, transgenní pšenice.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se snaží překonat tyto a jiné nedostatky dosavadního oboru tím, že poskytuje nové způsoby pro stabilní transformaci jednoděložných rostlin, zejména pšenice, za použití Agrobacterium-zprostředkovaných metod.
Proto zvláštní předmět tohoto vynálezu poskytuje techniky, které umožní přípravu transgenní, fertilní pšenice, která bude preferovaně diploidní a která bude stabilně transformovaná díky zavedení jednoho nebo více požadovaných genů do genomu těchto druhů.
Předkládaný vynález se proto obecně týká způsobů pro produkci rostlin transgenní pšenice. Jak je zde použit, znamená termín transgenní rostliny rostliny, které inkorporovaly exogenní geny nebo DNA sekvence, včetně, ale bez omezení, genů nebo DNA sekvencí, které nejsou normálně přítomné, genů, které nejsou normálně transkribované a translatované (expriyované) v daném typu buněk, nebo jakýchkoliv jiných genů nebo DNA sekvencí, které je žádoucí zavést do netransformovaných rostlin, jako jsou geny, které mohou být normálně přítomny v netransformované rostlině, ale u kterých je žádoucí alterovaná exprese.
Předkládaný vynález může být použit na jakékoliv rostlinné druhy. Zejména je použitelný pro jednoděložné druhy. Konkrétně, je užitečný pro rostlinné druhy, které nemohou po dlouhou dobu zůstávat ve stadiu kalu bez ztráty schopnosti regenerace. Jedním z hlavních druhů použitelných v předkládaném vynálezu je pšenice. Preferované druhy zahrnují pšenici Triticum aestivum, T. turgidum a T. monococum, kdy zejména preferována je T. aestivum. Předkládaný vynález má, při aplikaci na pšenici, tu výhodu, že je nezávislý na genotypu. To znamená, že může být použit na jakýkoliv typ pšenice, včetně ozimné a jarní pšenice. Může být použit pro produkci rostlin transgenní pšenice z jarních kultivarů, jako je například, Bobwhite a Marshall PAVOT1. UC702 a Panewawa, stejně jako z ozimých kultivarů, jako je například HY368, Neeley, FL302, RH91, R332, R1269 a R585.
Předkládaný vynález je použit pro zavedení cizorodé DNA do regenerovatelné rostlinné tkáně. Jakýkoliv typ cizorodé DNA může být insertován do rostlinných druhů za použití metody podle předkládaného vynálezu. Obecně, cizorodá DNA může být definována tak, aby zahrnovala jakýkoliv typ DNA, která je insertována do rostlinné buňky z vnějšku rostlinné buňky. Způsoby pro inserci klonované DNA do vhodných plasmidových konstruktů a manipulace se vhodnými přenosovými kmeny Agrobacterium jsou obecně dobře známy.
Typ DNA obsažené v cizorodé DNA může zahrnovat DNA, • · · · • · · · · • · · ·· ··
které je již přítomná v rostlinné buňce, DNA z jiné rostliny, DNA z odlišného organismu nebo DNA vyrobenou externě, jako je například DNA obsahující sekvenci antimediátorové zprávy rostlinného genu, DNA sekvence kódující syntetické verze genu, ve které byla modifikována sekvence nukleotidů.
Ve výhodném provedení je použit Agrobacterium tumefaciens C58, anopaliní kmen, pro zprostředkování přenosu DNA do buňky pšenice. Další výhodné kmeny pro použití při provedení vynálezu zahrnují oktopiní kmeny, LBA4404 nebo agropiní kmeny, například EHA101 nebo EHA105.
Ve výhodných provedeních obsahuje cizorodá DNA DNA sekvence, které mohou být funkční v regenerovatelné rostlinné tkáni jako prostředek selekce. Taková DNA může zahrnovat gen, který bude funkční v regenerovatelné rostlinné tkáni a povede k produkci sloučeniny, která bude udělovat rostlinné tkáni resistenci na jinak toxické sloučeniny. Tyto geny jsou v oboru dobře známé a mohou udělovat resistenci na sloučeniny jako jsou antibiotika podobná kanamycinu (Dekeyser a kol., 1989) a herbicidy podobné glyfosatu (Della-Cioppa a kol., 1987) a bialafosu (Vasil a kol., 1992). V rozsahu předkládaného vynálezu mohou být použity jiné prostředky pro selekci. Takové geny zahrnují geny pro CP4, BAR, hygromycin, fosfotransferasy (NPT) a dihydrofolat reduktasu (dhfr).
V jednom provedení je popsán způsob pro produkci transgenní pšenice. Způsob obsahuje, obecně, ustanovení kultury z rostliny pšenice, která má být transformována, transformaci kultury za pomoci přípravku z Agrobacterium obsahujícího DNA, který obsahuje genetickou složku, která má
být zavedena do genomu pšenice, identifikaci nebo selekci transformované buněčné linie a z ní regeneraci transgenní pšenice.
V jiném významném provedení poskytuje vynález způsob pro produkci fertilní transgenní pšenice. Proces vyžaduje ustanovení regenerovatelné kultury z rostlin pšenice, která má být transformována, zavedení DNA přípravku obsahujícího genetickou složku, která má být zavedena do genomu uvedené pšenice, za pomoci Agrobacterium transformace, identifikaci nebo selekci transformované buněčné linie; a regeneraci fertilní rostliny transgenní pšenice z transformované buněčné linie. DNA je přenesena úplným pohlavním cyklem z transgenní rostliny na její potomstvo a potomstvo obsahuje stabilní, chromosomálně integrovanou kopii selektovatelného nebo vyšetřitelného značkovacího genu, který byl do rodiče transformován pomocí Agrobacterium-transformace.
V těchto provedeních zahrnuje DNA přípravek plasmid, konkrétně rekombinantní plasmid jako je pMON18365, který obsahuje nptll gen. Jiné uvažované geny zahrnují selektovatelné nebo vyšetřitelné značkovací geny, jako je například kterýkoliv ze zde popsaných, včetně GUS, zeleného fluorescentního proteinu (GFP) luciferasy (LUC), CP4 a nptll genů. Příklady transposonů a asociovaných genů resistence na antibiotika zahrnují transposony Tns (bia), Tn5 (nptll), Tn7 (dhfr), peniciliny, kanamycin (a neomycin, G418, bleomycin); methotrexat (a trimetoprim); chloramfenikol; kanamycin a tetracyklin.
Charakteristiky užitečné pro selektovatelné markéry
v rostlinách byly uvedeny ve zprávě o použití mikroorganismů (Advisory Committee on Novel Foods and Processes, červenec 1994). Tyto obsahují: i) přísnou selekci s minimálním množstvím netransformované tkáně; ii) velký počet nezávislých transformací bez signifikantní interference s regenerací; iii) použitelnost na velkém množství druhů; a iv) dostupnost testu pro vyšetřování tkání na přítomnost markéru. Jak bylo uvedeno výše, několik markérů antibiotické resistence splňuje tato kriteria, včetně resistence na kanamycin (nptll), hygromycin B (aphIV) a gentamycin (aacC3 a aacC4). Úplnější popis a seznam je uveden v tabulce 1.
- 12 Tabulka 1
Typ
Aminoglykosidová antibiotika
Příklady
1) fosfotransferasové enzymy (APH)
2) adenyltransferasové enzymy (AAD)
3) acetyltransferasy (AAC)
APH(3')II
APHIV
ADD(3'')
AAC(3)-I
AAC(3)-III
AAC(3)-IV
Chloramfenikol chloramfenikol acetyl transferasa (CAT) β-laktamová antibiotika β-laktamasa
TEM-1-β-laktamasa
2,4-diaminopteridon dihydrofolat reduktasa
Glykopeptidy
Pyridonkarboxylové kyseliny
DNA gyrasa
Rifamyciny resistentní RNA polymerasa Makrolidy methyláce 5OS podjednotky Tetracykliny vazba na S4 a S18 proteiny
70S podjednotky ribosomu
TN5-bleomycin resistence na kyselinu nalidixovou resistence na rifamycin resistence na erytromycin exkrece antibiotik z buňky
Pro rostliny byly vyvinuty alternativy k markérům
antibiotické resistence (Advisory Committee on Novel Foods and Processes, červenec 1994). Tyto zahrnují markéry tolerance kovů, kompletační systémy s auxotrofickými markéry, markéry katabolismu cukrů, markéry resistence na L-kanavanin a merkery pro resistenci na lysin a threonin a S-aminoethyl L-cystein. Příklady a další popis je uveden v tabulce 2.
Tabulka 2
| Markér | Příklad |
| Resistence na | resistence na herbicidy může být použita |
| herbicidy | jako selektovatelný markér u rostlin, např. tolerance na glyfosat a bromoynil |
| Tolerance kovů | tolerance kovů, díky inserci savčího genu pro metalothionein |
| Resistence na lysin a threonin a na | dva z enzymů biosyntetické dráhy aspartatové rodiny, která je regulována několika |
| s-aminoethyl L-cystein | zpětnovazebnými smyčkami, byly vyvinuty jako selektovatělně markéry; aktivita aspartat-kinasy (AK) je inhibována milimolárními koncentracemi lysinu a threoninu (LT); aktivita dihydrodipikolin syntasy (DHPS) je inhibována lysinem a vede k sensitivitě na toxický analog lysinu, S-aminoethyl L-cystein (AEC); transgenní rostliny obsahující E.coli geny pro expresi AK a DHPS mohou být kultivovány na mediu obsahujícím LT a AEC. |
Vyšetřovatělně markéry mohou být také použity u rostlin jako alternativy k markérům antibiotické resistence. Takové markéry jsou použity pro detekci přítomnosti nebo pro měření úrovně exprese přeneseného genu. Použití vyšetřovatelných markérů u rostlin pro identifikaci nebo sledování geneticky modifkovaných buněk dobře funguje pouze tehdy, pokud je účinnost modifikace buněk vysoká. Některé z často používaných vyšetřovatelných markérů zahrnují β-glukuronidasu (GUS), jejíž exprese je detekována modrým zabarvením při inkubaci tkáně s 5-brom-4-chlor-3-indolyl-l-glukuronidem; bakteriální luciferasu (LUX), jejíž exprese je detekována emisí světla; světluškovou luciferasu (LUC), jejíž exprese je detekována emisí světla po inkubaci s luciferinem; a β-galaktosidasu, jejíž exprese je detekována světle modrým zabarvením po barvení tkáně 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosidem.
Preferované buňky pro provádění těchto metod zahrnují nezralé zárodky, tkáně kalu, nebo suspenze buněk, a preferovaným kmenem Agrobacterium pro transformaci je A. tumefaciens, kdy zejména jsou preferovány kmeny jako je C58 LBA4404 a EHA101.
Zárodky, které mají být transformovány, mohou být buď čerstvě izolovány z nezralých obilek, nebo mohou být izolovány z nezralých obilek a potom předošetřeny. Izolace nezralých zárodků z nezralých obilek může proběhnout ve stejný den jako inokulace, nebo alternativně, jeden, dva, pět nebo více dní před inokulací. Obdobně, tkáň kalu může být izolována z nezralého zárodku nebo z nezárodečných rostlinných buněk. Zárodek může být poškozen před transformací. Zárodek nebo obilka může být takový, který je 2 nebo více dní po vývoji od květních orgánů a pokud je použita suspenze buněk, pak to mohou být kultury individuálních buněk nebo, alternativně, shluků buněk.
DNA, která má být transformována, je výhodně rekombinantní plasmid, jak je zde popsáno, a může obsahovat jeden nebo více promotorů a/nebo 3' a/nebo 5' regionů operativně navázaných na jednotlivé genetické složky, které mají být transformovány. Zejména jsou preferovány promotory jako je CaMV 35 FMV, ubiquitin, rýžový aktin nebo zesílený CaMV 35S promotor.
Pokud je to žádoucí, může být rostlina odvozená ze transformace kultivována a může být získáno potomstvo. Toto potomstvo může být použito pro přípravu transgenních semen, nebo alternativně, může být kříženo s druhou rostlinou transgenní pšenice pro přípravu fertilní, transgenní pšenice, která obsahuje jeden nebo více požadovaných transgenů. Semena získaná z takového potomstva mohou být klíčena, kultivována a použita pro přípravu dalších generací transgenního potomstva, které budou obsahovat transgeny originálně transformované v rodičovské linii.
V jednom provedení předkládaného vynálezu je nezralý zárodek z rostliny použit jako výchozí materiál. Nezralé zárodky mohou být produkovány za použití známých metod popsaných v oboru. Například, produkce nezralých zárodků pšenice popsal Weeks a kol., (1993) a Vasil a kol., (1993).
• · • · « · · « · · • · · · · ·· • · ·.· ···· · • · · · · · ··· ·· ·· ··
V jiném výhodném provedení předkládaného vynálezu je regenerovatelnou rostlinou tkání kalus. Preferovaný kalus je embryogenní kalus. Embryogenní kalus je produkován z nezralého zárodku. Tento kalus může být produkován izolací a kultivací nezralého zárodku v živném mediu s uhlohydráty a regulátory rostlinného růstu. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu není při produkci embryogenního kalu z pšenice nezbytná eliminace osy zárodku, jak to popisuje Nehra a kol., (1994).
Medium produkující kalus je v oboru dobře známo a může být použito jakékoliv kultivační medium nebo způsob přípravy. Ve výhodném provedení, při přípravě pšeničného kalu, je nezralý zárodek pšenice kultivován po dobu 1 dne až 1 měsíce, výhodně po dobu 4 až 7 dní, v modifikovaném MS mediu obsahujícím okolo 40 g/1 maltosy a okolo 2 mg/1 2,4-D.
V jiném provedení může být 2,4-D nahrazen kombinací 0,5 mg/1
2,4-D a 2,2 mg/1 pichloramu (Chemservice). Medium je zahuštěno 2 g/1 GelriteR (Sigma Chemical, St. Louis, MO) nebo 4 g/1 agarosou s nízkou teplotou tání.
Po transformaci je regenerovatelná rostlinná tkáň umístěna do media, které je schopné produkovat výhonky z regenerovatělně rostlinné tkáně, kde medium dále obsahuje sloučeniny použité pro selekci regenerovatělně rostlinné tkáně obsahující selektovatelné DNA sekvence. Toto kontrastuje s předchozí praxí v oboru, kdy je regenerovatelná rostlinná tkáň obecně podrobena nejprve prodloužené době selekce před vystavením regenerovatelné tkáně mediu schopnému vyvolat tvorbu výhonků.
• · β> ·
- 17 Mediem použitým v tomto kroku může být jakékoliv medium, které umožňuje tvorbu výhonků z regenerovatelné tkáně. V jednom provedení je sloučenina tvořící výhonky přidána do media. Tyto sloučeniny tvořící výhonky jsou dobře známy v oboru (Mursahige a Skoog, 1962; Kasha a kol., 1990). Takové sloučeniny zahrnují slabé regulátory rostlinného růstu a patří sem IAA, IBA a BA v nízkých koncentracích (Becker a kol., 1994; Vasil a kol., 1992). V jiném provedení vynálezu může být pro indukci tvorby výhonků použito medium bez regulátorů rostlinného růstu (Weeks a kol., 1993).
Ve výhodném provedeni, když má být regenerován zárodečný kalus pšenice, obsahuje medium modifikované MS medium s 0,2 mg/1 2,4-D (Murashige a Skoog, 1962; Wan a Lemaux, 1994).
Regenerovatelná rostlinná tkáň je obyčejně umístěna do media podle předkládaného vynálezu po transformaci tak rychle, jak je to možné. Obecně může být tato doba v rozmezí od zhruba 1 dne asi do tří týdnů, ale výhodně je asi od 1 dne do asi 2 týdnů, lépe od asi dvou do přibližně tří týdnů.
Nejvýhodnější je přenesení tkáně do tohoto media za asi jeden až asi dva týdny po transformaci. Ve většině případů proběhne přenos mezi asi 5 a přibližně 11 dnem.
Sloučeninou použitou pro selekci regenerovatelné rostlinné tkáně obsahující selektovatelné DNA sekvence může být jakákoliv z mnoha známých selekčních sloučenin, jako jsou antibiotika a herbicidy. Mezi výhodné sloučeniny patří geneticin (G-418) (aminoglykosid) (Nehra a kol., 1994); glyfosat (Della-Cioppa a kol., 1987) a bialafos (Vasil
- 18 a kol., 1992; Weeks a kol., 1993).
Dostupnost alternativních selekčních činidel je významným požadavkem pro komerční aplikace zemědělské biotechnologie. Použití kanamycinu bylo méně úspěšné pro obilniny vzhledem k vysoké endogenní hladině tolerance (Dekeyser a kol., 1989). Bialafos byl hojně používán jako selekční činidlo při transformaci užitkových obilovin (Weeks a kol., 1993; Vasil a kol., 1993; Becker a kol., 1994; Nehra a kol., 1994; Wan a Lemaux, 1994). Nicméně, potenciálně může být výlučné používání genů kódujících resistenci na bialafos jako selektovatelných markérů ve všech studiích transformace katastrofální. Jsou potřeba jiné selektovatelné markéry a výsledky ukazují, že je zde popsán rychlý regenerační systém dobře fungující s různými selekčními činidly.
Po vytvoření výhonků jsou výhonky přeneseny do druhého media schopného vyvolat tvorbu kořenů z uvedených výhonků. Toto medium může dále obsahovat sloučeniny použité pro selekci regenerovatelné tkáně obsahující selektovatelné DNA sekvence. Přenos do tohoto media proběhne tehdy, když se vyvinou dostatečné výhonky, což je v oboru obecně známo. U pšenice toto proběhne během 25 až 40 dnů po transformaci.
Medium schopné vyvolat tvorbu kořenů může být jakékoliv medium produkující kořeny. Tato media jsou v oboru dobře známa (Weeks a kol., 1993; Vasil a kol., 1992). Jedním z výhodných medií produkujících kořeny je modifikované MS medium bez jakéhokoliv regulátoru rostlinného růstu (Murashige a Skoog, 1962; Zhou a kol., 1992).
···· · · · · · · · · ···· · · · · · ·· • ·· · · · · · · ···· · • « · · ··· 9 · · • · ·· ····· ·· · ·
- 19 Po vytvoření kořenů mohou být rostliny přeneseny do půdy a kultivovány pro produkci semen podle metod v oboru známých.
Předkládaný vynález popisuje reprodukovatelnou účinnou metodu používající Agrobacterium pro transformaci jednoděložných rostlin, zejména pšenice a kukuřice, za využití běžného binárního vektoru používaného pro transformaci dvouděložných rostlin. Vynález poskytuje rychlý a účinný transformační a regenerační systém využívající Agrobacterium, který je zejména použitelný pro transformaci pšenice a kukuřice. Rostliny regenerované z tohoto systému jsou fenotypově normální a plně fertilní. Transgeny jsou přeneseny do R1 potomstva podle Mendelovské dědičnosti.
Ve výhodném provedení poskytuje vynález rychlý a účinný transformační systém pro pšenici, který využívá čerstvě izolovaných nezralých zárodků, předem kultivovaných zárodků a proliferujících kalů z nezralých zárodků. Nový transformační systém vyžaduje pro získání transgenních rostlin dobu okolo 3 měsíců a frekvence transformace ve zde popsaných nových způsobech jsou reprodukovatělně 0,3 až 4,3%.
V obecném smyslu poskytuje předkládaný vynález způsob pro produkci transformovaných jednoděložných rostlin, které obsahují exogenní DNA. Takový způsob obecně vyžaduje izolaci regenerovatelné rostlinné tkáně z rostliny, přenos cizorodé DNA do regenerovatelné rostlinné tkáně 1- až 3-hodinovou inokulací regenerovatelné tkáně Agrobacteriem a společnou kultivaci rostlinné tkáně s Agrobacterium po dobu 2 až 3 dní. Typicky obsahuje cizorodá DNA, která má být insertována do • ·
- 20 rostlinného genomu, DNA sekvenci selektovatelného markéru, kde tato sekvence může působit v regenerovatelné tkáni jako prostředek selekce. Buňky jsou potom kultivovány po dobu asi 2 až přibližně 5 dní v medium pro kalus obsahujícím antibiotika pro usmrcení Agrobacterium a asi o 1 až 2 týdny později je regenerovatelná tkáň umístěna do media schopného vyvolat tvorbu výhonků ze tkáně. Toto medium dále obsahuje sloučeninu použitou pro selekci regenerovatelné tkáně obsahující selektovatelné DNA sekvence; a po vytvoření alespoň jednoho výhonku je výhonek obvykle přenesen do druhého media schopného vyvolat tvorbu kořenů u výhonku.
Exogenní geny
Jeden aspekt vynálezu se obecně týká transgenních rostlin, které exprivují jeden nebo více exogenních genů transformovaných pomocí A. tumefaciens. Jak je zde použit, označuje termín transgenní rostliny rostliny, které inkorporovaly DNA sekvence, včetně, ale bez omezení, genů, které pravděpodobně nejsou za normálního stavu přítomny, DNA sekvencí, které nejsou normálně transkribovány do RNA nebo translatovány na protein (exprivovány) nebo jakýchkoliv jiných genů nebo DNA sekvencí, které mají být zavedeny do netransformovaných rostlin, jako jsou geny, které mohou být normálně přítomny v netransformovaných rostlinách, ale které mají být geneticky zpracované nebo mají mít pozměněnou expresi. Předpokládá se, že v některých případech bude genom transgenních rostlin podle předkládaného vynálezu zvětšen díky stabilnímu vložení transgenu. Nicméně, v jiných případech bude vložený gen nahrazovat endogenní sekvenci.
« · • · * · • · · • · · ·
- 21 Příklady genů, které mohou být vloženy, zahrnují například DNA sekvence nebo geny z jiných druhů, nebo rovněž geny nebo sekvence, které pocházejí ze stejného druhu nebo jsou přítomny ve stejném druhu, ale jsou do přijímajících buněk vloženy metodami genetického inženýrství, a ne technikami klasické reprodukce nebo křížení. Nicméně, termín exogenní je také míněn tak, aby označoval geny, které nejsou normálně přítomné v buňkách, které mají být transformovány, nebo jednoduše asi nejsou přítomny ve formě, struktuře atd., ve které se nalézají ve transformujícím DNA segmentu nebo genu, nebo geny, které jsou stále normálně přítomny ve větším množství, než je žádoucí, např. které jsou nadměrně exprivovány. Proto termín exogenní gen nebo DNA označuje jakýkoliv gen nebo DNA segment, který je vložen do recipientní buňky, bez ohledu na to, že podobný gen může již být v takové buňce přítomen.
Počátečním krokem v produkci fertilních trnsgenních rostlin je získání DNA přípravku, např. vektorů, plasmidů, lineárních fragmentů DNA a podobně, jejichž složka má být přenesena do recipientních buněk jednoděložné rostliny. DNA segmenty pro použití při transformaci takových buněk budou, samozřejmě, obecně obsahovat gen nebo geny, které mají být vloženy do buněk. Tyto geny mohou dále obsahovat struktury jako jsou promotory, enhancery, polylinkery nebo i regulační geny, jak je to žádoucí.
Vektory, plasmidy, kosmidy, YAC (kvasinkové arteficiální chromosomy) a DNA segmenty pro použití při transformaci takových buněk budou, amozřejmě, obecně obsahovat cDNA, gen nebo genovou sekvenci, která má být • ·
transformována do jednoděložných rostlin. Tyto DNA konstrukty mohou dále obsahovat struktury jako jsou promotory, enhancery, polylinkery nebo i regulační geny, pokud je to žádoucí. DNA segment nebo gen může kodovat buď nativní nebo modifikovaný protein nebo polypeptid, který bude exprivován ve výsledných rekombinantních buňkách, a/nebo který bude způsobovat vylepšený fenotyp regenerované rostliny.
Pro zlepšení schopnosti identifikace transformantů může být žádoucí použití selektovatelného nebo vyšetřovatelného markerového genu spolu s požadovaným exprivovatelným genem. Markerové geny kódují fenotyp, který umožňuje odlišení buněk, které exprivují markerový gen od buněk, které nemají markér. Takové geny mohou kodovat bud’ selektovatelný nebo vyšetřitelný markér, v závislosti na tom, zda markér uděluje rys, který je možno selektovat chemickými prostředky, t.j. použitím selektivního činidla (například herbicidu, antibiotika a podobně). V oboru je známo mnoho příkladů vhodných markerových genů a mohou být využity při provádění předkládaného vynálezu.
Selektovatelné markéry, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, zahrnuji, ale nejsou omezeny na, nptll gen; bar gen, který kóduje resistenci na bialafos; mutantní gen pro EPSP syntasu, který kóduje resistenci na glyfosat; gen pro nitrilasu, který udílí resistenci na bromoxynil; mutantní gen pro acetolaktat syntasu (ALS), který udílí resistenci na imidazolinon nebo na sulfonylmočovinu; nebo DHFR gen pro resistenci na methotrexat.
Příklady vyšetřovatelných markérů zahrnují β-glukoro- 23 -
nidasu nebo uidA gen (GUS), který kóduje enzym, pro který jsou známé různé chromogenní substráty; gen pro β-laktamasu, gen pro luciferasu, xylE gen, gen pro α-amylasu; gen pro tyrosinasu, α-galaktosidasu, nebo jakýkoliv jiný vhodný vyšetřovatelný markér, který je odborníkovi v oboru znám.
Ve světle tohoto zjištění bude odborníkovi v oboru zřejmé, že může být použito mnoha jiných možných selektovatelných a/nebo vyšetřitelných markerových genů. Proto je předešlá diskuse pouze ilustrativní a ne vyčerpávající. Ačkoliv je předkládané zjištění podrobně doložen v příkladech za použití nptll a GUS genů, spadají použitelné techniky pro tvorbu a použití jakýchkoliv jiných vyšetřitelných nebo selektovatelných markerových genů z hlediska předkládaného vynálezu do praxe v oboru známé.
Volba jednotlivých DNA segmentů, které mají být přeneseny do buněk příjemce, bude záviset na účelu transformace. Jedním z hlavních cílů transformace plodin je přidání nějakých komerčně žádoucích, agronomický významných rysů rostlině. Takové rysy zahrnují, ale nejsou omezeny na, resistenci na herbicidy, zvýšený výnos, resistenci vůči hmyzu a nemocem, fyzikální podobu, obsah a vzhled potravy, atd. Například, může být žádoucí inkorporace jednoho nebo více genů kódujících insekticidní geny, kde tyto geny zahrnují gen pro krystalický toxin Bacillus thuringiensis, který způsobuje resistenci na hmyz řádu Lepidopteran a Coleopteran. Takové geny jsou odborníkům v oboru dobře známé a předpokládá se, že budou užitečné v provádění způsobů transformace zde popsaných pro jednoděložné rostliny jako je pšenice.
• · · ·
* · • · • · · • · · · ·· · · · • · ·
Transgenní rostliny
Významným aspektem předkládaného vynálezu jsou přípravky obsahující rostliny fertilní kultivované transgenní pšenice. U těchto rostlin byl genom zvětšen vložením předem vybrané genetické složky do genomu, za vzniku transgenní rostliny. Transgen obyčejně obsahuje genetickou složku, která obsahuje jeden nebo více exogenních genů umístěných pod kontrolou jednoho nebo více předem vybraných genetických kontrolních elementů nebo promotorů. Takovou rostlinu je možné připravit za použití procesů zde , které
zahrnují přípravu DNA přípravku in vitro, kde tento přípravek obsahuje genetickou složku, která má být vložena do genomu pšenice a potom vložení DNA do buňky pšenice za použití transformace využívající Agrobacterium. Genetická složka obvykle obsahuje jeden nebo více selektovatelných nebo vyšetřitelných genů poslaných výše. Po transformaci jsou z buněk, které dostaly exogenní gen(y), regenerovány rostliny pšenice a mohou být získány vzniklé fertilní, transgenní rostliny, které mají zvětšené genomy díky stabilnímu vložení genetické složky.
V tomto procesu mohou být buňky, které jsou transformovány dediferencovány, nebo mohou být dále dediferencovány a kultivovány v dediferencovaném stavu až do doby, než proběhne diferenciace a dozrání rostlinek. Ve výhodných provedeních zahrnují tyto recipientově buňky nezralé zárodky embrya, tkáně kalu, nebo alternativně, suspenze buněk. Zárodky mohou být čerstvě izolovány z nezralých obilek nebo, alternativně, izolovány z nezralých obilek a potom ošetřena před inokulací. Nezralý zárodek může být izolován z nezralých • ·
- 25 obilek v den inokulace nebo, alternativně, jeden nebo dva, nebo 5 nebo 10 i více dní před inokulací. Zárodkem může být zárodek, který je 1 nebo 2 nebo více dní po vývoji z květních orgánů nebo, alternativně, obilka může být 1 nebo 2 nebo i více dní po vývoji z květních orgánů.
Pokud je tkáň kalu použita jako recipientově buňka, tak může být kalus izolován buď z nezralého zárodku, nebo z neembryonálních buněk. V jistých aspektech může být žádoucí poškození zárodku před transformací, což může navodit účinnost transformace.
Také jsou zde popsány rostliny fertilní, transgenní pšenice, jejíž genetická výbava byla pozměněna přidáním DNA přípravku obsahujícího předem vybraný funkční genetický element, který obsahuje transgen vybraný ze skupiny skládající se z nptll genu, bia genu, nptl, dhfr, aphIV, aacC3, aacC4 genu a GUS genu. Zejména výhodné jsou geny kódující resistenci na glyfosat nebo přijatelný markerový gen jako je nptll gen.
Recipientově buňky mohou být zároveň transformovány více než jedním exogenním genem a za takových okoloností mohou být exogenní geny umístěny na jediném DNA segmentu nebo, alternativně, na jednom nebo více plasmidech, každý pod kontrolou jiného kontrolního elementu.
Zejména výhodnými plasmidy jsou rekombinantní plasmidy jako je pMON18365, pMON32614, pMON30053, pMON25457, pMON30052 a pMON19450. Geny mohou být umístěny pod kontrolou promotoru jako je CaMV 35S, ubiquitin, rýžový aktin nebo
posílený CaMV 35S promotor. Pokud je to žádoucí, mohou DNA segmenty, které mají být transformovány, obsahovat další 5' a/nebo 3' regiony operativně navázané na geny.
Transgenní potomstvo, semena a odvozené buněčné linie
Další důležité aspekty vynálezu zahrnují potomstvo transgenních rostlin připravených popsanými metodami, stejně jako buňky připravené z takového potomstva a semena získaná z takového potomstva.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázky tvoří část tohoto popisu a jsou zde uvedeny pro další demonstraci jistých aspektů předkládaného vynálezu. Vynález může být lépe pochopen odkazem na tyto obrázky spolu s podrobným popisem specifických provedení zde uvedeným.
Obrázek 1 znázorňuje strukturu pMON18365, který je příkladem plasmidu neseného v Agrobacterium, který byl použit v tomto vynálezu. V T-DNA regionu jsou GUS i nptll geny řízeny posíleným 35S promotorem a intronovým kukuřičným HSP70 intronem. GUS gen také obsahuje dva introny.
Obrázek 2 znázorňuje strukturu pMON18364, který byl použit při konstrukci pMON18365.
Obrázek 3 znázorňuje strukturu pMON18342, který byl použit při konstrukci pMON18365.
Obrázek 4 znázorňuje strukturu pMON19476, který byl • ·
použit při konstrukci pMON18365.
Obrázek 5 znázorňuje strukturu pMON18361, který byl použit při konstrukci pMON18365.
Obrázek 6 znázorňuje strukturu pMON32614.
Obrázek 7 znázorňuje strukturu pMON25457.
Obrázek 8 znázorňuje strukturu pMON30053.
Obrázek 9 znázorňuje strukturu pMON30052.
Obrázek 10 znázorňuje strukturu pMON19450.
Obrázek 11 znázorňuje obecný protokol pro transformaci nezralých zárodků za použití metod zde popsaných.
Na obrázku 11 i na dalších místech popisu d znamená den, t znamená týden.
Obrázek 12 znázorňuje obecný protokol pro transformaci suspenze buněk za použití metod zde popsaných.
Dále se popisují ilustrativní provedení vynálezu.
Některé výhody vynálezu
Odborník v oboru ocení mnoho výhod způsobů a přípravků poskytnutých v předkládaném vynálezu. Několik takových výhod může být shrnuto následovně:
• ··
- 28 Dosažení účinné transformace za použití běžného binárního vektoru
Běžný binární vektor pMON18365 byl použit ve všech pokusech v tomto vynálezu. Ve většině pokusů byla dosažena účinná transformace. Tato skutečnost naznačuje, že super binární vektor nemusí být nezbytný, ačkoliv bylo ukázáno, že je zásadní pro dosažení vysokého stupně transformace kukuřice (Ishida a kol., 1996).
Transformace za použití různých explantátů
Různé typy explantátů - nezralé zárodky, embryogenní kalus a suspenze buněk - byly použity jako explantáty pro infekci Agrobacterium v tomto vynálezu. Stabilní transformanty (kolonie ze suspenze buněk a rostliny z embryí a embryogenního kalu) byly generovány ze všech těchto explantátů, což činí tento vynález lepším než jsou jiné publikované transformační systémy využívající Agrobacterium, jako je systém pro kukuřici (Ishida a kol., 1996), ve kterém mohou být pro produkci transgenních rostlin použita pouze čerstvě izolované nezralé zárodky.
Účinná a rychlá produkce stabilních transformantů
Vysoce účinná exprese GUS genu byla pozorována u explantátů krátce po infekci Agrobacterium jak je ilustrováno v tabulkách 4 a 7. V případě, že byla inokulována suspenze buněk, mohlo být získáno přibližně 200 stabilních transformantů (kolonií) z 1 ml buněk po 40 až 60 dnech
• · ·
- 29 selekce na mediu obsahujících selektivní činidlo, jako je G418. Transformované rostlinky mohly být vyvinuty z nezralých zárodků a části kalu v mediu obsahujícím G-418 několik týdnů po inokulaci. Pouze 3 měsíce od infekce Agrobacterium byly nutné pro zasazení rostlin do půdy. V pokusech, které generovaly transgenní rostliny, byla účinnost stabilní transformace v rozmezí od 0,3 do 4,3 % (počet trangenních dějů/počet inokulovaných explantátů) (tabulka 5), což je srovnatelné nebo vyšší, než je účinnost publikovaná za použití jiných transfromačních systémů (Vasil a kol., 1992, 1993; Weeks a kol., 1993; Nehra a kol., 1994; Becker a kol., 1994; Zhou a kol., 1995). Transgenní rostliny měly normální morfologii a byly plně fertilní.
Mendelovská segregace transgenu v potomstvu
Exprese transgenu byla studována v potomstvu (R^ generaci) 4 primárné transformovaných rostlin ze 2 pokusů. GUS aktivita byla pozorována přibližně u 3/4 jedinců (semena a rostliny) R]_ generace (tabulka 6), což ukazuje, že gen byl přenesen na potomky podle Mendelovské dědičnosti. U rostlin nebyly pozorovány žádné abnormality.
Produkce regenerovatelných transgenních rostlin
Z 5 studií bylo identifikováno celkem 9 případů (7 různých ošetření) (tabulka 3). Na 5 rostlinách ze 3 dějů z ExpAG2 a AG13 byla provedena Southern analýza. Výsledky ukazují, že všech 5 rostlin mělo transgeny integrovány do genomu. Rostliny ze 6 dalších dějů (z ExpAG22, AG25 a AG30) byly identifikovány GUS histochemickým testem a jsou bud’
v půdě, nebo v Sundae nádobkách. Všechny měly vysokou až střední aktivitu GUS. Účinnosti transformace ze dvou studií byly 2,7 a 2,1 %.
Všechny případy byly generovány z inokulované embryogenní tkáně kalu nebo z předkultivovaných nezralých zárodků (IEs) (tabulka 4). Způsob inokulace a podmínky se mezi těmito studiemi lišily. Výsledky ukazují, že transformace pšenice zprostředkovaná Agrobacterium je opakovatelná a že embryogenní tkáň kalu a předkultivovaná IEs jsou vhodnými explantáty pro infekci Agrobacterium.
Segregace 3:1 aktivity GUS v R-^ potomstvu
Rj rostliny ze tří transgenních rostlin z ExpAG13 (tabulka 3) byly produkovány klíčením R^ nezralých embryí in vitro. Rostliny byly přeneseny do půdy a GUS aktivita byla měřena v R-^ potomstvu a nezralá semena s odstraněnými zárodky byla rozříznuta na dvě poloviny podélně a byla použita pro histochemický test na GUS. Tkáň štítku byla také odebrána na GUS test z některých klíčících zárodků. Mateřská tkáň, perikarp, každého semene byla GUS pozitivní, jak bylo očekáváno. Nicméně, aleuronová vrstva semen a tkáň štítku zárodků se segregovala na GUS pozitivní a GUS negativní. Poměr GUS-pozitivních a GUS-negativních rostlin se významně nelišil od 3:1 podle kappa2 testu (tabulka 2), což ukazuje, že transgen byl s největší pravděpodobností insertován do jediného lokusu.
- 31 Tabulka 3
Transgenní případy generované transformací zprostředkovanou
Agrobacterium
| Pokusošetření | Explantát | počet kusů | inokulace (%)2 | č. děje (rostlina) | TE 1 |
| AG2-05 | 3-t kalus | 73(velkých) | 3h, vakuová infiltrace | 2 (2) | 2,7 |
| AG13-03 | 2-t kalus | 47(velkých) | vakuová inokulace | 1 (3) | 2,1 |
| AG22-05 | 10-d kalus | 239(malých) | 3h, namočení | 1 | NA |
| AG22-06 | 25-d kalus | 308(malých) | 3h, namočení | 1 | NA |
| AG25-24 | 6-d IEs | 40 | 3h, namočení | 1 | NA |
| AG30-02 | 3-d IEs | 98 | 3h, namočení | 1 | NA |
| AG30-05 | 3-d IEs | 104 | 3h, namočení | 2 | NA |
• ·
Tabulka 4
Aktivita GUS v aleuronové vrstvě nebo ve štítku v potomstvu ze semen RQ rostlin
Ro rostlina počet test, počet GUS počet GUS chi-square U Ί
R-j- semen pozitivních negativních hodnota semen semen
| AG13-03-02-01 | 31 | 22 | 9 | 0,27 |
| AG13-03-02-02 | 28 | 22 | 6 | 0,19 |
| AG13-03-02-03 | 124 | 96 | 28 | 0,387 |
| Ί *· Tato hodnota | byla | vypočítána na | základě hypotesy | segregace |
Kritická hodnota při a = 0,05 a df = 1 byla 3,84, vyšší než jakákoliv z chi-square hodnot v tabulce. Proto, žádný ze segregačních poměrů nebyl signifikantně odlišný od hypoteticky předpovězeného poměru 3:1.
Metody obsahující selektovatelné markéry schválené EPA a FDA
Ačkoliv většina z popsaných metod pro příbuzné obilniny spočívá v použití hygromycin fosfotransferasy (HPT) jako selektovatelného markéru, překonává předkládaný vynález toto omezení využitím nptll jako selektovatelného markéru.
nptll gen (který kóduje neomycin fosfotransferasu) je nejčastěji akceptovaným selektovatelným markérem v oboru a byl schválen Enviromental Protection Agency jako pesticidně
inertní. Podobně, jeho schválení Food and Drug Administration jako nepřímý potravní doplněk činí tento markér lepším než jsou markéry jako je hygromycin, který nebyl podobné schválen těmito úřady.
Rozdíly od systémů vyvinutých pro rýži a pro kukuřici
Předkládaný vynález se významně liší od metod popsaných v poslední době pro jiné obilniny. Oproti dřívějším metodám použitým pro transformaci rýže, nevyžadují předkládané metody pro inokulaci ošetření ve vysoce osmotickém prostředí. Podobně, předkládaný vynález se liší od metod popsaných pro transformaci kukuřice v tom, že není omezen na použití pouze čerstvě izolovaných nezralých zárodků jako explantátů. Předkládaný vynález je také dobře účinný pro předkultivované nezralé zárodky nebo tkáň kalu a není omezen na čerstvě izolovanou zárodečnou tkáň.
Jiným významným rozdílem vůči dříve popsaným metodám je to, že metody podle předkládaného vynálezu jsou aplikovatelné za použití standartních binárních plasmidů, které jsou dobře známé v oboru, a není nutná konstrukce a použití super binárních plasmidů, jak je to popsáno ve dřívějších pracích. Binární plasmid je nejběžnějším typem používaným pro většinu metod pro transformaci dvojdéložných rostlin a odborníkovi v oboru jsou binární plasmidy snadno dostupné pro použití při metodách zde popsaných.
Následující příklady jsou zde uvedeny pro demonstraci výhodných provedení vynálezu. Odborníkovi v oboru by mělo být jasné, že techniky popsané v příkladech, které následují, představují techniky objevené původcem dobře fungující při provádění vynálezu, a proto mohou být považovány za výhodné způsoby pro jeho provádění. Nicméně ve světle podaného popisu by odborníkovi v oboru mělo být zřejmé, že může být provedeno mnoho změn ve specifických provedeních, která jsou popsána, a stále budou získány podobné výsledky bez odchýlení se od rozsahu a duchu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 - Transformace za použití nezralých zárodků
1. Příprava explantátu
V této studii byla použita jarní pšenice Triticum aestivum kultivar Bobwhite. Zásobní rostliny byly kultivovány v růstové komůrce s kontrolovaným prostředím s 16-hodinovou fotoperiodou při 800 μιηο1.ιιΓ2.5-1 dodávaným vysoce intenzivním ozářením světlem (HID) Sylvania (GTE Products Corp., Manchester, NH). Denní/noční teplota byla 18/16 °C. Nezralé obilky byly z rostlin odebrány 14 dní po vývoji z květních orgánů. Nezralé zárodky (IEs) byly asepticky vyříznuty a byly kultivovány na následujícím pre-kultivačním mediu před inokulací:
1) semisolidní kalus-indukující medium CM4 nebo CM4C (tabulka 5) po dobu 1-6 dnů;
2) kapalné CM4C doplněném 0,25 M rafinosou a manitolem po dobu 1 dne;
3) kapalném CM4 mediu s 1/10 ředěním MS solí a doplněném 10 g/1 glukosou, 3,9 g/1 MES po dobu 1 až 3 hodin.
Všechny kultivace byly prováděny při teplotě 23 až 25 °C.
Tabulka 5
Doplňkové složky v základním mediu1
| Složka | CM4 | CM4C | MMS.2C | MMS0C | MS1WSM4 | MS2WCM4 |
| 2,4-D (mg/1) | 0,5 | 0,5 | 0,2 | — | 1,0 | 2,0 |
| Pichloram (mg/1)2 | 2,2 | 2,2 | — | — | — | — |
| Maltosa (g/1) | 40 | 40 | 40 | 40 | — | — |
| Sacharosa (g/1) | — | — | — | — | 20 | 20 |
| Glutamin (g/1) | 0,5 | 0,5 | — | — | — | — |
| Chlorid hořečnatý | 0,75 | 0,75 | — | — | 0,75 | 0,75 |
| (g/1) | ||||||
| Hydrolyzát kaseinu | 0,1 | 0,1 | — | — | — | — |
| (g/1) | ||||||
| MES (g/1) | — | 1,95 | 1,95 | 1,95 | — | — |
| Kyselina askorbová | — | 100 | 100 | 100 | — | — |
| (mg/1)2 | ||||||
| I-asparagin (g/1) | — | — | — | — | 0,15 | 0,15 |
| Thiamin HCl (mg/1) | — | — | — | — | 0,5 | 0,5 |
| Želatinizuj ící | 2(P) | 2(P) | 2(G) | 2 (G) | — | 2(P) |
| činidlo (g/1)3 |
Ί
Všechna media obsahovala základní soli (MS základní soli) a vitaminy (MS vitaminy) z Murashige a Skoog (1962) media, pokud není uvedeno jinak. pH každého media bylo upraveno na 5,8.
2 Sterilizované filtrem a přidané do media po autoklavování.
3 Phytagel™ (P) a GelriteR (G) 4 V mediu nebyly přítomné žádné MS vitaminy.
• ·
2. Kultura Agrobacterium
Oslabený kmen Agrobacterium tumefaciens C58 (ABI) nesoucí binární vektor pMON18365 (obrázek 1) byl použit ve • všech studiích. pMON18365 obsahuje GUS (uidA) gen s intronem a s nptll genem jako selektovatelným markérem v T-DNA • (přenosová DNA) regionu. Oba geny jsou pod kontrolou posíleného CaMV 35S promotoru. Kultury Agrobacterium byly iniciovány ze zásob v glycerolu a byly kultivovány přes noc při 25 až 26 °C na rotační třepačce (frekvence otáčení 150 za minutu) v kapalném LB mediu (Miller, 1972) obsahujícím 50 mg/1 kanamycinu, streptomycinu i spektinomycinu, 25 mg/1 chloramfenikolu a 200 μΜ acetosyringonu, do střední log fáze <OD660 = 1 - Χ'5)· Buňky Agrobacterium byly odebrány centrifugací a byly resuspendovány v inokulačním mediu, CM4 nebo CM4C (tabulka 9) s 1/10 ředěním MS solí a doplněném 10 g/1 glukosy a 200 μΜ acetosyringonu. Hustota buněk Agrobacterium byla upravena pro inokulaci na OD660 = 2.
3. Inokulace a současná kultivace
IEs přechodně uchovávané v kapalném pre-kultivačním mediu 3 byly přeneseny do suspenze buněk Agrobacterium » v Petriho miskách (25 x 100 mm). Poměr mezi Agrobacterium a IEs byl přibližně 30 ml: 200 IEs. Do inokulačního media byl • přidán surfaktant, SilwetR (Monsanto, St. Louis, MO), v koncentraci 0,01 až 0,75 %. Inokulace byla prováděna při až 25 °C po dobu 3 hodin ve tmě. Po inokulaci byla Agrobacteria odstraněna vakuem nebo použitím přenosové pipety a IEs byly umístěny do media pro současnou kultivaci, CM4 nebo CM4/C s 1/10 ředěním MS solí a 1,5 mg/1 extra 2,4-D a doplněném 10 g/1 glukosou a 200 μΜ acetosyringonu. Zárodky byly umístěny stranou štítku nahoru a byly současné kultivovány s Agrobacterium po dobu 2 až 3 dnů při 25 °C ve tmě. Pre-kultivované nezralé zárodky (kultivované na mediu po dobu 1 až 6 dnů) byly inokulovány Agrobacteriem podle jednoho z následujících způsobů: 1) ponořením do suspenze buněk Agrobacterium na dobu 1 až 3 hodin. 2) IEs byly ponořeny do suspenze buněk Agrobacterium v Petriho miskách nebo v klastrech pro buněčné kultury, které byly potom umístěny v sušící nádobě a byly vakuovány po dobu 3 hodin za použití vakuového systému. V některých studiích byl do inokulačního media přidán SilwetR v koncentraci 0,01 %. Po inokulaci byly nezralé zárodky naneseny na sterilní papírové filtry a potom byly přeneseny do jednoho z následujících medií pro současnou kultivaci: 1) semisolidního CM4 nebo CM4C media (tabulka 5) doplněného 10 g/1 glukosy a 200 μΜ acetosyringonu; 2) kapalného nebo semisolidního CM4C media s 1/10 ředěním MS solí a doplněného 10 g/1 glukosy a 200 μΜ acetosyringonu. Filtrační papír (Whatman č. 1) byl v některých studiích položen na medium; 3) kapalného CM4 nebo CM4C s 1/10 ředěním MS solí a 3,9 g/1 MES a doplněného 10 g/1 glukosy a 200 μΜ acetosyringonu. Nezralé zárodky byly umístěny na medium nebo na filtrační papír stranou štítku nahoru. Pro kultivaci zárodků v kapalném mediu byla každá kultivační plotna připravena přidáním 8 ml kapalného media do Petriho misky (15 mm x 100 mm) obsahující 6 kusů filtračního papíru Whatman č·1 (8,5 cm). Explantáty byly současně kultivovány s Agrobacterium při 24 °C ve tmě po dobu 2 až 3 dnů. Po současné kultivaci byly nezralé zárodky vypláchnuty kapalným CM4 nebo CM4C mediem doplněným 500 mg/1 karbencilinu • · • β ·· ··· · ♦ ·· • ·· ·· ·· · · ···· ···· · · · ·· ·· ·· ····· · · · *
- 38 (zpožďující medium). Infikované nezralé zárodky byly kultivovány v solidním zpožďujícím mediu po dobu 2 až 5 dnů. Obecný protokol pro tuto transformaci je uveden na obrázku 6.
Účinnost přenosu T-DNA
Účinnost přenosu T-DNA byla měřena testem přechodné exprese GUS s 2 až 3 denním odstupem od selekce. Ve většině studií byly pozorovány vysoké hladiny přechodné GUS exprese, což naznačuje, že přenos T-DNA byl velmi účinný. Účinek Silwet na přenos T-DNA byl intenzivně studován na různých explantátech. Jak ukazuje tabulka 6, SilwetR v koncentraci 0,05 - 0,1 % signifikantně zvyšoval přechodnou GUS expresi v čerstvě izolovaných IEs. Podobné výsledky byly také pozorovány pro pre-kultivované IEs a zárodečný kalus jako explantáty pro inokulaci. Pro nezralé zárodky pre-kultivované po dobu 1 až 2 dnů byly GUS skvrny lokalizovány nejvíce podél okraje štítku, ze kterého se vyvíjí menší množstí zárodečného kalusu. GUS skvrny byly, nicméně, nacházeny v kalus tvořících oblastech zárodků pre-kultivovaných 3 dny nebo déle.
• · · · · t· ·· · · • ·· · · · · · · · · · • · · · ··· · · · · • · · · · ·· · · · · · · · ···· ··· ··· ·· ·· ····· · · ··
- 39 Tabulka 6
Účinek surfaktantu na expresi GUS, pokud je přítomen v inokulačnim mediu·1· 5
| Silwet (%) | GUS pozitivní skvrny/explantát | Počet explantátů t/GUS pozitivní skvrny/celkový počet explantátů (% |
| 0,00 | 7,8 | 11/34 (32) |
| 0,01 | 17,6 | 15/19 (79) |
| 0,05 | 149 | 13/13 (100) |
| 0,1 | 111 | 8/8 (100) |
| 0,5 | 1 | 1/1 (100) |
1 Explantáty byly IEs izolované několik hodin před inokulací.
5. Selekce a regenerace rostlin
Po 2 až 5 dnech ve zpožďovacím mediu byly Agrobacteriem infikované nezralé zárodky přeneseny do kalus-indukčního media, CM4 nebo CM4C (tabulka 5) media s 25 mg/1 G418 a 25 mg/1 karbencilinu. Nezralé zárodky byly kultivovány po dobu 2 až 3 týdnů pro indukci kalu před tím, než byly přeneseny do prvního regeneračního media, MMS.2C (tabulka 5) s 25 mg/1 G418 a 250 mg/1 karbencilinu. Při přenosu do regeneračního media byl každý kus kalu rozdělen na několik menších kousků (« 2 mm). Po dvou týdnech kultivace na prvním regeneračním mediu byly mladé výhonky a živá tkáň kalu přeneseny do druhého regeneračního media, MMSOC (tabulka 5) se stejnými koncentracemi G418 a karbencilinu. Rostlinky, • · ··· · • · · · · · · • · · ♦· · • · · ·· · ·
u kterých bylo později potvrzeno, že jsou správnými transformanty, rostly v tomto mediu rychle a tvořily silné kořenové systémy. Nicméně, v tomto stadiu zde byly některé rostlinky vykazující určitou resistenci na G418. Mohly růst dobře a mohly tvořit jeden nebo více kořenů, ačkoliv nerostly tak rychle jako řádné transformanty. Když byly rostlinky 3 cm nebo vyšší, byly přeneseny do Sundae nádobek (Sweetheart Cup Company, Chicago, IL) obsahujících druhé regenerační medium jak bylo uvedeno výše pro další kultivaci a selekci.
Z některých rostlin byly v tomto stadiu odebrány vzorky listů pro histochemický test na GUS. Nicméně, rostlinky, které byly resistentní a nevykazovaly GUS aktivitu v tomto stadiu nebyly eliminovány. Během růstu v nádobkách většina s non-transformantů uhynula nebo vykazovala známky citlivosti na G418. Rostliny vysoce resistentní na G418 (mohutně rostoucí se silným kořenovým systémem) byly přeneseny do půdy před tím, než dosáhly vrcholu nádobek. Všechny rostliny pocházející ze stejného zárodku byly považovány za potomstvo ze stejného děje.
6. Potvrzení transgenního charakteru rostlin
Rostliny byly kultivovány v kultivační komůrce s kontrolovaným prostředím za stejných růstových podmínek, jaké jsou popsány výše. Vzhledem k tomu, že od inokulace do přenosu většiny rostlin do půdy uběhly pouze asi 3 měsíce, nebyly u těchto rostlin pozorovány žádné viditelné abnormality, které jsou obvykle asociovány s rostlinami dlouhodobě kultivovanými in vitro. Rostliny byly zcela fertilní. Každá rostlina byla vyšetřována alespoň jednou z následujících metod:
···· ···· ···· ···· ··· · · · · • ·· ·· · · · · · · · · · ···· · · · · · ·
1) Histochemický test na GUS (Jefferson, 1987) za použití různých částí rostlin.
2) Biologický test (test blednutí listů). Před hlavatěním byly vzorky listů (délky asi 5 až 7 mm) odebrány z nejmladších plně rozvinutých listů a byly umístěny do jamek 24-jamkové buněčné kultivační plotny (Costar Corporation, Cambridge, MA) · Každá jamka byla naplněna 0,5 ml vodného roztoku složeného z 300 mg/1 paromomycinu (Sigma) a 100 mg/1 Benlatu (fungicid vyráběný DuPont) nebo 100 mg/1 Benlatu samotného. Tři vzorky listů ze stejného listu každé rostliny byly umístěny ve dvou jamkách obsahujících paromomycin a Benlat a v jedné jamce obsahující Benlat samotný. Vzorky listů z netransformovaných rostlin Bobwhite byly použity jako negativní kontroly. Vzorky byly vakuově infiltrovány v sušící nádobě za použití vakuového systému po dobu 5 minut a potom byla plotna důkladně potažena ParafilmR před umístěním na světlo (140 μπιοί. m-2.s-1). Výsledky byly určeny o 60 hodin později. Vzorky listů, které byly vysoce resistentní na paromomycin zůstávaly na většině plochy zelené s výjimkou dvou okrajů (šířky <1 mm), což ukazuje, že rostliny měly funkční nptll gen. Vzorky listů od rostlin bez genu nebo s nefunkčním genem zcela vybledly působením paromomycinu stejně jako negativní kontroly, nebo měly pouze malé zelené plošky.
3) Analýza Southern hybridizací (Southern, 1975). Genomová DNA byla izolována ze tkáně listů rostlin podle metody, kterou popsal Shure a kol., (1983). 15 μg genomové DNA bylo tráveno restrikční endonukleasou BamHI a bylo • ·
frakcionováno na 0,8% agarosovém gelu. DNA byla přenesena do Hybond N membrán (Amersham, Arlington Heights, IL) podle standartních postupů (Sambrook a kol., 1989). Sonda pro detekci nptll genu byla připravena gelovým přečištěním 977 bp Ncol fragmentu z plasmidů pMON18365 (obrázek 1). Fragment byl značen 32P dCTP kitu pro náhodné značení primerů (Prime-It II od Stratagene , La Jolla, CA), na specifickou aktivitu
2,6 x 109 cpm/^g. Membrána byla hybridizována po dobu 14 hodin při 42 °C v roztoku obsahujícím 50% formamid, 5x SSC, 5x Denhart, 0,5% SDS, 100 p.g/ml tRNA. Podmínky pro konečné promytí byly 0,1% SSC a 0,1% SDS při 60 °C po dobu 15 minut.
7. Účinnost stabilní transformace
Počet transgenních dějů v každé studii byl určen po testování rostlin jak bylo popsáno výše. Účinnost transformace (počet dějů/počet nezralých zárodků) se lišila mezi jednotlivými studiemi a podle různých podmínek ošetření, které generovalo transgenní rostliny (tabulka 7). Nicméně, účinnost byla srovnatelná nebo vyšší, než jsou jakékoliv publikované účinnosti transformace pšenice (Vasil a kol., 1992, 1993; Weeks a kol., 1993; Nehra a kol., 1994; Becker a kol., 1994; Zhou a kol., 1995).
Tabulka 7
Účinosti stabilní transformace při produkci transgenní pšenice
Pokusošetření
Explantát
Počet IEs Počet Účinnost nebo kusů transgenních (B/A%) kalu (A) dějů (B)1
| AG2-05 | 21-d kalus, | intaktní | 73 | 2 | 2,7 |
| AG13 | 14-d kalus, | intaktní | 47 | 1 | 2,1 |
| AG22-05 | 10-d kalus, | asi 2 mm | 239 | 1 | 0,4 |
| AG22-06 | 25-d kalus, | asi 2 mm | 308 | 1 | 0,3 |
| AG22-11 | 10-d kalus, | asi 2 mm | 232 | 1 | 0,4 |
| AG25-24 | 6-d IEs | 40 | 1 | 2,5 | |
| AG27-15 | 1-d IEs | 23 | 1 | 4,3 | |
| AG29-04 | 5-d IEs | 97 | 1 | 1,0 | |
| AG30-02 | 3-d IEs | 98 | 1 | 1,0 | |
| AG30-05 | 3-d IEs | 104 | 2 | 1,9 | |
| AG30-08 | 3-d IEs | 36 | 1 | 2,8 | |
| 9528 | 0-d IEs | 160 | 1 | 0,6 | |
| 9531 | 17-d kalus, | intaktní | 50 | 1 | 2,0 |
| 9602 | 0-d IEs | 250 | 3 | 1,2 | |
| 9604 | 0-d IEs | 700 | 1 | 0,14 | |
| 9608 | 0-d IEs | 124 | 1 | 0,8 | |
| 9609 | 0-d IEs | 140 | 2 | 1,4 | |
| 9614 | 0-d IEs | 38 | 1 | 2,6 | |
| 9620 | 15-d kalus, | intaktní | 100 | 3 | 2,7 |
Každý transgenní děj proběhl u jedné nebo více rostlin • ·
8. Analýza potomstva transgenních rostlin
Nezralé obilky byly získány z primárních transgenních rostlin (Ro generace) s nptll i GUS aktivitou přibližně 20 dní po vývoji z květních orgánů. Nezralé zárodky byly izolovány a kultivovány na MMSOC mediu (tabulka 5) pro klíčení rostlin (asi jeden týden v Petriho miskách a další týden v Sundae nádobkách se stejným mediem). Každá z nezralých obilek s odstraněnými zárodky byla rozříznuta na dvě poloviny podélně a byla přenesena do 96-jamkových kultivačních ploten (Costar Corp. Cambridge, MA) pro histochemický test na GUS jak byl popsán výše. Obé poloviny obilek byly vyšetřovány pod mikroskopem pro určení GUS aktivity v různých oblastech. Část tkáně štítku byla také odebrána z každého klíčícího zárodku pro test na GUS. Po přenesení rostlin (R-^ generace) do půdy přibližně 2 týdny po klíčení byla GUS aktivita v rostlinách určována histochemickým testem na GUS za použití tkáně listů a květů.
Jak bylo očekáváno, mateřská tkáň, perikarp, každé nezralé obilky, vykazovala aktivitu GUS. Nicméně, aleuronová vrstva většiny obilek vykazovala GUS aktivitu, ostatní nikoliv. Poměr obilek s GUS pozitivní aleuronovou vrstvou k obilkám s GUS negativní aleuronovou vrstvou se signifikantně nelišil od 3:1 podle chi square testu (tabulka 8). Data GUS testu provedeného na oblíkách dobře odpovídala datům testu provedeného na tkáni štítku a dalším GUS testům provedeným na tkáních listu a květu, ačkoliv GUS aktivita v aleuronové vrstvě a štítku byla mnohem silnější než ve tkáních listu a květu.
Tabulka 8
Segregace GUS aktivity v R-j_ semenech a rostlinách
| Ro rostliny | Počet Rtestovaných semen (rostlin) | Počet GUS pozitivních | Počet GUS negativních | chi-square hodnota1 |
| 16612 | 31 | 22 | 9 | 0,27 |
| 16613 | 28 | 22 | 6 | 0,19 |
| 16614 | 124 | 96 | 28 | 0,387 |
| 16953 | 128 | 103 | 25 | 2,04 |
Ί
Tato hodnota byla vypočítána na základě předpokladu segregace 3:1. Kritická hodnota při a = 0,05 a df = 1 byla 3,84, vyšší než jakákoliv z chi-square hodnot v tabulce. Proto žádný ze segregačních poměrů nebyl signifikantně odlišný od hypoteticky předpovězeného poměru 3:1.
Příklad 2 - Transformace za použití zárodečného kalu
1. Příprava explantátů
Nezralé zárodky pšenice (Triticum aestivum L.) kultivar Bobwhite byly izolovány z nezralé obilky 14 dní po vývoji z květních orgánů a byly kultivovány v mediu indukujícím kalus CM4 nebo CM4C (tabulka 9) stranou štítku • ·
nahoru. Po 10 dnech nebo déle se nezralé zárodky vyvíjely do zárodečného kalu. Každý kalus byl velikosti přibližně 5 mm nebo větší. Kaly byly inokulovány Agrobacterium bez narušení (intaktní), nebo byly vybrány řezy pouze většiny zárodečných kalů a byly rozděleny na malé kousky (asi 2 mm) za použití jemných kleštiček pro inokulaci.
2. Inokulace a současná kultivace
Kousky kalu byly inokulovány buněčnou suspenzí Agrobacterium připravenou jak je popsáno výše, za použití jedné z následujících metod.
1) Ponoření kousků kalu do buněčné suspenze Agrobacterium na dobu 3 hodin.
2) Ponoření kousků kalu do buněčné suspenze Agrobacterium s vakuovou infiltrací po dobu 3 hodin.
3) Intaktní kousky kalu byly umístěny na kousek sterilního filtračního papíru nasycený kapalným inokulačním mediem. Kousky kalu byly inokulovány v intaktním stavu, nebo byly před inokulaci stlačeny za použití sterilní špachtle do koláčů. Každý kousek filtračního papíru nesoucí kousek kalu byl přenesen do 150-ml filtračního systému (Corning, lne., Corning, NY) spojeného s vakuovým systémem, nebo do Buchnerovy nálevky spojené s vakuovým systémem přes filtrační baňku. Ve vakuovém systému byla buněčná suspenze Agrobacterium pomalu nakapána na kousky kalu (>1 ml na 6 kousků kalu). Po nakapání buněčné suspenze Agrobacterium bylo po dobu dalších 10 minut aplikováno vakuum. Kousky kalu inokulované jakoukoliv z těchto metod byly přeneseny do Petriho misek (100 x 15 mm), které každá obsahovaly 6 kusů Whatmanova filtračního papíru (č. 1, 8,5 cm) nasyceného 8 ml media pro současnou kultivaci (CM4 nebo CM4C s 1/10 ředěním MS solí a doplněném 10 g/1 glukosy a 200 μΜ acetosyringonu). Plotny byly důkladně potaženy ParafilmemR. Po současné kultivaci s Agrobacterium po dobu 3 dnů byly kousky kalu promyty v kapalném zpožďovacím mediu (CM4 nebo CM4C doplněné 500 mg/1 karbencilinu) a byly naneseny na kousky sterilního filtračního papíru pro odstranění nadbytku kapaliny. Kousky kalu byly kultivovány v semisolidním zpožďovacím mediu po dobu 3 dnů před přenosem do selektivního kalus-indukujícího media.
3. Účinnost přenosu T-DNA
Po současné kultivaci s Agrobacterium nebo po stadiu zpoždění byly náhodně odebrány vzorky kalu pro histochemický test na GUS (Jefferson, 1987). Jak je ukázáno v tabulce 11, většina testovaných kousků kalu měla GUS pozitivní skvrny. V některých studiích (jako je pokus AG13) měly všechny testované kousky kalu GUS pozitivní skvrny. Počet GUS pozitivních skvrn v každém kousku kalu se lišil od několika do asi 100. V pokusu AG13 byl proveden další histochemický test na GUS dva týdny po inokulaci. Všech 16 testovaných kousků kalu mělo nějaké GUS pozitivní skvrny a z nich 7 kousků (44%) mělo rostoucí GUS pozitivní sektory, což naznačuje, že transformované buňky byly proliferující.
• ·
- 48 Tabulka 9
Účinnost přenosu T-DNA jako je ukázána histochemickým testem na GUS na kouscích kalu po současné kultivaci
Pokusošetření
Explantát
Počet IE t/
GS požit, skvrny (celkový počet z testovaných IEs)
Počet skvrn na každém GUS-pozit. IE
| AG2-5 | 21-d | kalus, | intaktní | 1/19 | 1-5 |
| AG13 | 14-d | kalus, | intaktní | 25/25 | několik - ~ 50 |
| AG22-5 | 10-d | kalus, | asi 2 mm | 6/15 | několik |
| AG22-6 | 25-d | kalus, | asi 2 mm | 7/10 | málo - ~ 100 |
| AG22-11 | 10-d | kalus, | asi 2 mm | 12/20 | málo - 12 |
4. Selekce a regenerace rostlin
Kousky kalu, které byly intaktní během inokulace, byly kultivovány na selektivním kalus indukujícím mediu (CM4C doplněné 25 mg/1 G418 a 250 mg/1 karbencilinu) v intaktním stavu, nebo byly rozděleny na několik malých kousků (« 2 mm) při přenosu do media. Inokulované malé kousky kalu zůstaly intaktiní a byly kultivovány v mediu. Po 2 až 3 týdnech byly kousky kalu přeneseny do regeneračního media. Postup regenerace byl stejný jak je popsán v příkladu 1.
5. Účinnost transformace
Regenerované rostliny nevykazovaly žádné viditelné abnormality a byly zcela fertilní. Všechny rostliny byly testovány v biologickém testu, histochemickém testu na GUS a/nebo v testu Southern hybridizace, jak jsou popsány v přikladu 1. Bylo generováno celkem 10 transgennich dějů ze 7 experimentálních ošetření za použití zárodečného kalu různého stáří (tabulka 9). Účinnost transformace (počet dějů/počet kousků kalu) byla v rozmezí od 0,3 do 2,7 %.
6. Analýza potomstva transgennich rostlin
R-L rostliny byly analyzovány stejně jako v příkladu 1.
Příklad 3 - Transformace buněčné suspenze
1. Příprava explantátu
Suspenze buněk pšenice v. Mustang byly kultivovány v kapalném MS1WSM (tabulka 9) při 28 °C ve tmě na rotační třepačce (frekvence otáčení 250 za minutu). Buňky sklízené po 3 dnech subkultivace byly použity pro inokulaci Agrobacteriem. Obecný protokol pro transformaci buněčné suspenze je uveden na obrázku 7.
2. Kultura Agrobacterium a přenos T-DNA
Metoda pro kultivaci Agrobacterium je v podstatě stejné, jako je metoda popsaná v příkladu 1. Hustota Agrobacterium buněk v inokulačním mediu (CM4 medium s 1/10 ředěním MS solí a 3,9 g/1 MES a doplněné 10 g/1 glukosy • ·
- 50 a 200 μΜ acetosyringonu) byla upravena na Οϋθ6θ 0,5 až 1. Kapalné medium bylo odstraněno ze suspenze kultury pšenice vakuem. Každý ml buněk pšenice byl smisen se 3 ml buněčné suspenze Agrobacterium v Petriho misce (100 x 25 mm). Inokulace byla prováděna při 23 až 25 °C po dobu 30 minut až 4 hodin. Po inokulaci byly Agrobacteriem infikované buňky pšenice umístěny na kousku sterilního Whatmanova filtračního papíru v Petriho misce (100 x 15 mm). Filtrační papír byl zvlhčen kapalným mediem jak bylo popsáno výše. Plotny pro současnou kultivaci byly umístěny ve tmě při 23 až 25 °C po dobu 2 až 3 dnů.
3. Získání transformovaných kolonií
Po současné kultivaci byly inokulované buňky přeneseny do kapalného MS2WCM (tabulka 9) s 500 mg/1 karbencilinu a byly kultivovány v nádobkách po dobu 1 dne za mírného třepání a potom byly umístěny na kousku filtračního papíru na solidním MS2WCM mediu doplněném bud’ 25 mg/1 G418, nebo 50 mg/1 paromomycinu a 250 mg/1 karbencilinu pro selekci. Resistentní kolonie mohly být získány po 40 až 60 dnech selekce. Transformace byla vysoce účinná podle počtu získaných transformovaných kolonií. Rutině bylo získáváno asi 200 nezávisle transformovaných kolonií z 1 ml inokulovaných buněk.
4. Faktory ovlivňující účinnost transformace
Bylo zjištěno, že tři faktory účastnící se procesů inokulace a současné kultivace, mají signifikantní vliv na účinnost transformace suspenze buněk. Těmito faktory byla • · • ·
teplota inokulace a současné kultivace, doba inokulace a současné kultivace a hustota buněk Agrobacterium pro inokulaci. Jak ukazuje tabulka 10, nej lepší teplota pro inokulaci a současnou kultivaci je 23 až 25 °C a účinnost transformace je signifikantně redukována při teplotě 19 °C nebo 28 °C. Nej lepší doba inokulace je 30 minut (tabulka 11) a nejvyšší účinnost transformace může být dosažena při 2nebo 3-denní současné kultivaci. Doba současné kultivace 1 den nebo kratší signifikantně redukuje účinnost transformace. Nej lepší hustota buněk Agrobacterium pro inokulaci je OD660 0,5 (tabulka 12). Hustota Agrobacterium vyšší nebo nižší než je tato hodnota redukuje účinnost transformace.
Tabulka 10
Účinek teploty v průběhu inokulace a současné kultivace na stabilní transformaci suspenze buněk
Teplota (°C)
Počet GUS-pozitivních kolonií/ml inokulovaných buněk
| 19 | 52,5 | + | 19,36 |
| 23 | 290 | + | 70,83 |
| 25 | 273 | + | 65,43 |
| 28 | 132,5 | + | 22,6 |
• ·
- 52 Tabulka 11
Účinek doby inokulace a současné kultivace na transformaci suspenze buněk
| Stadium | Doba (h) | Počet GUS-pozitivních kolonií/ml inokulovaných buněk | ||
| Inokulace | 0,5 | 351,25 | + | 29,23 |
| 1 | 178,5 | + | 23,1 | |
| 2 | 186,75 | + | 23,10 | |
| 3 | 202 | + | 51,37 | |
| 4 | 152,25 | + | 29,68 | |
| 14 | 4 | + | 0,82 | |
| Současná | 24 | 53 | 4,24 | |
| kultivace | 48 | 232,5 | + | 26,29 |
| 72 | 258,5 | + | 15,26 |
• · ·· · ·· · · · · • · · « ···· * · · · ···· · · · · · · · • · « ·· c · ·· ··· · · ···· ··· Λ · · ·« ·· ····· ·· · ·
- 53 Tabulka 12
Účinek hustoty buněk Agrobacterium na transformaci suspenze buněk
Hustota buněk Počet GUS-pozitivních kolonií/ml
Agrobacterium (OD660) inokulovaných buněk
| 0,10 | 79 | + | 4,97 |
| 0,25 | 174 | + | 53,67 |
| 0,50 | 260,25 | + | 45,33 |
| 1,00 | 172 | + | 51,04 |
| 2,00 | 159 | + | 70,06 |
5. Potvrzení transformovaných kolonií
Transformace byla potvrzena histochemickým testem na GUS jak byl popsán. Vzorky z 51 G418 resistentních kolonií byly testovány na aktivitu GUS. 49 z 51 kolonií vykazovalo GUS pozitivitu. Z těchto bylo 15 podrobeno Southern blot analýze. Všechny vzorky vykazovaly silný hybridizační signál s nptll sondou. Tyto výsledky naznačují, že frekvence společné exprese se blížila 100%.
Příklad 4 - Transformace suspenze buněk
1. Agrobacterium konstrukty • ·
Pro použití u pšenice byly konstruovány rostlinné transformační vektory podobné těm, které jsou odvozeny od Ti plasmidu Agrobacterium tumefaciens, například jsko jsou ty, které popsal Herrera - Estrella a kol·, (1983), Bevan a kol., (1983), Klee a kol., (1985) a EPO přihláška 120 516 (Schilperoort a kol. ). Agrobacterium binární vektor pro pšenici, pMON18364 (obrázek 2) byl konstruován odstraněním P-nos/nptII/nos 3' z pMON18342 (obrázek 3), trávením pMON18342 Notl a HindlII restrikčními enzymy pro tvorbu a izolaci fragmentu o 5,7 kb. Tento výsledný 5,7kb skeletový fragment vektoru obsahuje ori-322 zdroj replikace pro replikaci v E. coli a ori-V region pro replikaci v Agrobacterium, markéry bakteriální resistence pro spektinomycinovou a streptomycinovou selekci. P-e35S/hsp70 intron/kan/nos 3' chimérický fragment byl izolován z pMON19476 (obrázek 4) trávením Notl a HindlII restrikčními enzymy až do dokončení a izolací vzniklého 2,7kb insertu na gelu. Binární vektor pMON18364 byl konstruován ligací 2,7kb Notl, HindlII P-e35S/hsp70 intron/kan/nos 3' fragmentu a Notl, HindlII 5,7kb fragmentu vektorového skeletu za použití T4 DNA ligasy. Produkty ligace byly transformovány do Novablue buněk a byly selektovány na resistenci na spektinomycin. Transformované kolonie z tohoto nepřímého klonování byly kultivovány v kapalné kultuře a DNA byla analyzována na přítomnost P-e35S/kan/nos 3' chimérického genu restrikčním trávením HindlII a EcoRV. Pro reportérové genové konstrukty byl Agrobacterium binární vektor obsahující gen pro β-glukuronidasu (GUS) konstruován trávením pMON18361 (obrázek 5) HindlII a izolací 3,8kb fragmentu obsahujícího p-e35S/hsp70 intron/GUS/nos 3' chimérický fragment a ligací tohoto fragmentu do pMON18364 tráveného HindlII. Analýza
4 · · 4 ·· ·· · · «444 · · · 44*4 • « · · · · · 44 ····· • · 4 · · 4 4444
44 44444 44«4 výsledných transformovaných kolonií byla provedena HindlII a orientace byla potvrzena trávením BglII a Xbal. Výsledný konstrukt je pMON18365 (obrázek 6): RB > P/e35S/hsp70 intron/GUS:ST-LSl intron/nos 3'; P-e35S/HSP70 intron/nptll/nos > LB, kde LB a RB jsou levá a pravá hranice přenosu Ti plasmidu Agrobacteria, v příslušném pořadí.
Do pšenice mohou být vloženy další geny: například, obalový protein viru mozaiky pšenice (WSMV) a replikasa z Barley Yellow Dwarf Viru (BYVD) udělující resistenci na rostlinné viry. Vhodným rostlinným expresním vektorem je pMON18365 nebo deriváty podobných binárních vektorů. Gen kódující obalový protein (CP) z WSMV může být podobně insertován do pMON18364 nebo do pMON18365 za použití standartních technik. Rekombinantní vektor obsahující WSMV CP gen by měl po přenosu do pšenice metodou Agrobacteriem zprostředkované transformace způsobovat resistenci rostlin pšenice na infekci WSMV. Podobně, gen kódující kompletní replikasu BYVD může být vložen do stejných nebo do podobných Agrobacterium vektorových kazet. Rekombinantní vektor obsahující kompletní gen pro BYVD replikasu by měl po přenosu do pšenice metodou Agrobacteriem zprostředkované transformace způsobovat resistenci pšenice na infekci BYDV.
Geny kódující resistenci vůči houbám mohou být také vloženy do Agrobacterium binárních vektorů jako je pMON18364 a pMON32614 (obrázek 6). Geny pro antimykotické proteiny jako jsou ty, které kódují Alfalfa nebo Alyssum antimykotické proteiny insertované do pMON18364 nebo do pMON18365, jak byly popsány výše, umožní zapracování resistence na houby do pšenice transformací zprostředkovanou Agrobacteriem za • · · · 9 · * ··· · • · · · ···· · · · · • · · · · · · ···· v ·· · * · · · · ··· ·· ···· · · · · · · • 4 · · ··· · · · ·· · produkce transgenních rostlin. Vzniklé rostliny by měly být resistentní na Fusarium nebo na jiné houbové nebo bakteriální patogeny.
Geny, které ovlivňují kvalitu dějů ovlivňujících kvantitu a složení uhlohydrátů v zrnu jako je ADP glukosopyrofosforylasa (ADPGPP) exprivovaná pod kontrolou jaderného silného promotoru nebo silných promotorů jiných tkání mohou být insertovány do binárního vektoru jako je pMON18365 nebo jeho deriváty. Agrobacteriem zprostředkovaná transformace tohoto genu do rostlin pšenice by měla změnit množství nebo kvalitu uhlohydrátů v zrnu nebo v jiných tkáních za vzniku změn složení hmoty.
Je také možné vložit geny ovlivňující takové rysy pšenice, jako je tolerance na herbicidy pro vyvolání resistence na herbicidy, tolerance na sucho a vysokou salinitu a tolerance na chladový a tepelný stres. Geny zvyšující výnos pšenice, geny použité pro samčí sterilitu pro produkci hybridní pšenice a geny ovlivňující klíčení mohou být také vloženy do binárních rostlinných transformačních vektorů pro Agrobacteriem zprostředkovanou transformaci produkující rostliny pšenice vykazující rysy požadovaného fenotypu. Příklady plasmidů použitelných pro inserci genů zahrnují pMON25457 (obrázek 7), pMON30053 (obrázek 8), PMON30052 (obrázek 9) a pMON19450 (obrázek 10).
• · • ·
Literární odkazy
Literární odkazy vyjmenované dále a všechny odkazy zde citované jsou zde uvedeny jako odkaz v rozsahu, ve kterém doplňují, vysvětlují, objasňují podklady pro vynález nebo uvádějí metody, techniky a/nebo přípravky zde použité.
US patent č. 5 179 022.
Mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 91/02071.
Mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 92/06205.
Mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 93/18168.
Mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 94/0077.
Mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 94/00583.
Mezinárodní patentová přihláška publ. č. WO 95/06722.
Barcelo a kol., Plant J., 5, 583-592, 1994.
Becker a kol., Plant,!., 5, 299-307, 1994.
Bevan a kol., Nátuře, 303, 209, 1983.
Chán a kol., Plant Cell Physiol., 33(5), 577-583, 1992.
Chán a kol., Plant Mol. Biol., 22(3), 491-506, 1993.
Chán a kol., Plant Physiol., (Rockville) 108 (2 Suppl.) 115, Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Plant Physiol., Charlotte, NC, 1995.
Chen and Dále, Transgenic Res., 1(2), 93-100, 1992.
Chilton, Proč. Nati. Acad. Scí. USA, 90(8), 3119-3120, 1993.
Christou a kol., Plant Physiol., 87, 671-674, 1988.
Christou a kol., Bio/Technology, 9, 957-962, 1991.
Conger a kol., Plant Cell Rep., 6, 345-347, 1987.
Conner and Dommisse, Int. J. Plant Scí., 153. 550-555, 1992.
Creissen a kol., Plant Cell Rep., 8(11), 680-683, 1990. Datta a kol., Bio/Technology, 8, 736-740, 1990.
Davey a kol., J. Exp. Bot., 42, 1129-1169, 1991.
- 58 De la Pěna a kol., Nátuře, 325, 274-276, 1987.
Dekeyser a kol., Plant Physiol., 90, 217-223, 1989. Delbreil a kol., Plant Cell Rep., 12(3), 129-132, 1993. Della-Cioppa a kol., Bio/Technology, 5, 579-584, 1987. Deng a kol., Sci. China Ser B Chem. Life Sci. Earth Sci., 33(1) . 27-34, 1990.
| Du a kol., Genet. Manip. Plants, 5, | 8-12, | 1989. | |||
| Fromm | a | kol. , | Proč. Nati. Acad. Sci. | USA, | 82, 5824-5828 |
| 1985. | |||||
| Fromm | a | kol. , | Nátuře, 319, 791-793, | 1986. | |
| Fromm | a | kol., | Bio/Technology, 8, 833 | -839, | 1990. |
Godwin and Chikwamba, xiii-174, Plenům Press, New York, NY. Gordon-Kamm a kol., Plant Cell, 2, 603-618, 1990.
Gould a kol., Plant Physiol., 95(2), 426-434, 1991.
Graves and Goldman, Plant Mol Biol., 7(1), 43-50, 1986. Grimsley a kol., Nátuře, 325, 177-179, 1987.
Hayakawa a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 9865-9869, 1992.
Herrera-Estrella a kol., Nátuře, 303, 209, 1983.
Hess a kol., Plant Sci., 72(2), 233-244, 1990.
Hiei Y., Plant. J., 6(2), 271-282, 1994.
Hood a kol., Plant Physiol., 105(1 Suppl.), 114, 1994.
Ishida a kol., Plant Physiol., (Rockville) 108 (2 Suppl.) 114, Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Plant Physiol., Charlotte, NC, 1995.
Ishida Y., a kol., Nátuře Biotech., 745-750, 1996.
Jaehne a kol., Euphytica, £5, 1-3, 35-44, 1995.
Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep., 5, 387-405, 1987.
Jefferson a kól., EMBO J., 6, 3901-3907, 1987.
Kasha a kol., Gene Manip. Plant Improv. II, 213-239, 1990. Klee a kol., Bio/Technology, 2, 637, 1985.
• ·
Knutson a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 2624-2628, 1992.
Kornienko a kol., Pushchino, 20-22, noyabrya, Tezisy dokladov, 20., 21, 128-129, 1991.
Langridge a kol., Plant J., 2(4), 631-638, 1992.
Li a kol., Sci. China Ser B Chem. Life Sci. Earth Sci., 34(1) , 54-63, 1991.
Liu a kol., Plant Mol. Biol., 20(6), 1071-1087, 1992.
Luo a Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6, 165-174, 1988.
Mahalakshmi a Khurana, J. Plant Biochem. Biotech., 4(2), 55-59, 1995.
May a kol., Bio/Technology, 13, 486-452, 1995.
McElroy a kol., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991.
Miljus-Djukic a kol., Plant Cell Tissue Organ Culture, 29(2), 106-108, 1992.
Miller, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972.
Mooney a Doodwin, Plant Cell Tissue Organ Culture,
25, 209-218, 1991.
Mursahige a Skoog, Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962.
Nehra a kol., Plant J., 5, 285-297, 1994.
Paszkowski a kol., EMBO J., 3, 2717-2722, 1984.
Paszkowski a kol., Plant Mol. Biol., 6, 303-312, 1986.
Picard a kol., Vllth International Wheat Genetics Symposium, University of Cambridge, 779:781, 1988.
Piorer a kol., Science, 256, 520-523, 1992.
Potrykus I., Bio/Technology, 8, 535-543, 1990.
Raineri a kol., Bio/Technology, 8., 33, 1990.
Raineri a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90(8), 3549-3553, 1993 .
Report on the Use of Antibiotic Resistance Markers in
Genetically Modified Food Organisme, Advisory Committee on Novel Foods and Processes, červenec 1994.
Rhodes a kol., Science, 240, 204-207, 1988.
Ritchie a kol., Transgenic Res., 2(5), 252-265, 1993.
Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Sanford, Trends Biotechnology, 6, 299-302, 1988.
Sanford J. C., Physiologia Plantarium, 79, 206-209, 1990.
Sautter a kol., Bio/Technology, 9, 1080-1085, 1991.
Schlappi a Hohn, Plant Cell, 4(1), 7-16, 1992.
Schledzewski a Mendel, Transgenetic Research, 249-255, 1992.
Schrott M., v Gene Transfer in Plants, Springer, Verlay, New York, 1995, str. 325-331.
Seiichi a kol. , Plant Physiol., 100, 1503-1507, 1992.
Shen and Hohn, Plant. J., 2(1), 35-42, 1992.
Shen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90.(4), 1488-1492, 1993 .
Shen a kol., Meth. Mol. Biol., 44, Xiv-417, 1995.
Shillito a kol., Bio/Technology, 3.# 1099-1103, 1985.
Shimamoto a kol., Nátuře, 338, 274-276, 1989.
Shure a kol., Cell, 35, 225-233, 1983.
Smith a kol., v In Vitro Cell. Develop. Biol., 30A (3 Part 2), 1994.
Smith a Hood, Crop Sci., 35, 301-309, 1995.
Somers a kol., Bio/Technology, 10, 1589-1594, 1992.
Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517, 1975.
Topfer a kol., Plant Cell, 1, 133-139, 1989.
Vasil a kol., Bio/Technology, 10, 667-674, 1992.
Vasil a kol., Bio/Technology, 11, 1 153-1158, 1993.
Vijayachandra a kol., Plant Mol. Biol., 29(1), 125-133, 1995.
• ·
Wan a Lemaux, Plant Physiol., 104, 37-48, 1994.
Weeks a kol., Plant Physiol., 102, 1077-1084, 1993. Wilmink a kol., Plant Cell Rep., 11, 76-80, 1992. Xu a kol., Chin J. Bot., 2(2), 81-87, 1990.
Zaghmout and Trolinder, Nucl. Acids Res., 21(4), 1048, 1993. Zaghmout, Theoret. Appl. Genet. , 89.(5), 577-582, 1994.
Zhou a Konzak, Crop Sci., 29, 817-821, 1989.
Zhou a kol., Plant Cell Tissue Organ Culture, 30., 78-83, 1992.
Zhou a kol., Plant Cell Rep., 15, 159-163, 1995. Ziauddin a kol., Plant Cell Rep., 11, 489-493, 1992.
Všechny přípravky a způsoby zde popsané a nárokované mohou vyrobeny a prováděny bez zbytečného experimetování podle předkládaného vynálezu. Ačkoliv byly přípravky a způsoby podle tohoto vynálezu popsány ve smyslu jeho výhodných provedení, bude odborníkovi v oboru jasné, že mohou být použity variace přípravků, způsobů a a variace v krocích a sekvencích kroků způsobů zde popsaných bez odchýlení se od konceptu, duchu a rozsahu vynálezu. Přesněji, je jasné, že určitá činidla, která jsou chemicky nebo fyziologicky příbuzná, mohou nahradit činidla zde popsaná za dosažení stejných nebo podobných výsledků. Všechny takové podobné náhrady a modifikace, které jsou odborníkovi v oboru jasné, spadají do ducha, rozsahu a koncepce vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích.
Claims (20)
- Patentové nároky1. Rostlina fertilní, transgenní pšenice, jejíž genom byl pozměněn vložením předem vybrané genetické složky do genomu, kde uvedená složka obsahuje exogenní gen umístěný pod kontrolou jednoho nebo více předem vybraných genetických kontrolních elementů, kde tato rostlina je připravítelná způsobem zahrnujícím:(a) přípravu DNA přípravku in vitro, kde tento přípravek obsahuje genetickou složku, která má být vložena do genomu pšenice;(b) vložení uvedeného DNA přípravku do buněk pšenice transformací zprostředkovanou Agrobacteriem;(c) regeneraci rostlin pšenice z uvedených buněk, které dostaly uvedenou genetickou složku; a (d) identifikaci rostliny fertilní, transgenní pšenice, jejíž genom byl pozměněn stabilním vložením uvedené genetické složky.
- 2. Rostlina fertilní, transgenní pšenice podle nároku 1, kde genetická složka kroku (a) obsahuje selektovatelný nebo vyšetřitelný gen.
- 3. Rostlina fertilní, transgenní pšenice podle nároku1, kde uvedené buňky pšenice zahrnují nezralý zárodek, tkáň • · · • ·· ·· ·· · · ··· · · ···· ··· ··· • · ·· ····· ·· · · kalu nebo suspenzi buněk.
- 4. Rostlina fertilní, transgenní pšenice podle nároku3, kde uvedený zárodek je izolován z nezralé obilky nebo je izolován z nezralé obilky a potom pre-kultivován před inokulací.
- 5. Rostlina fertilní, transgenní pšenice podle nároku4, kde je uvedený nezralý zárodek izolován z uvedené nezralé obilky během asi 24 hodin až přibližně 10 nebo více dnů před inokulací.
- 6. Rostlina fertilní, transgenní pšenice podle nároku 3, kde je uvedená tkáň kalu izolována z nezralého zárodku nebo je vyvíjena ze zárodečných buněk.
- 7. Rostlina fertilní, transgenní pšenice podle nároku 3, kde uvedený nezralý zárodek zahrnuje zárodek 2 nebo více dní po vývoji z květních orgánů nebo uvedená nezralá obilka zahrnuje obilku 2 nebo více dnů po vývoji z květních orgánů.
- 8. Rostlina fertilní, transgenní pšenice, jejíž genetická výbava byla změněna přidáním DNA přípravku obsahujícího předem vybraný funkční genetický element, který obsahuje transgeny vybrané ze skupiny skládající se z nptll genu, bia genu, nptl genu, dhfr genu, aphIV genu, aacC3 genu, aacC4 genu a GUS genu, kde uvedený funkční genetický element způsobuje u uvedené rostliny pšenice fenotypový rys, který se nenachází na rodičích uvedené rostliny.
- 9. Rostlina fertilní, transgenní pšenice podle nároku • ·4 4·· · · · ·· • 4 4 4 4 ·· · · 4 4 4 4 • · · · 4 · · · ·4 4 · 4 4 · · ♦ · · ·- 64 1 nebo podle nároku 8, kde uvedený gen zahrnuje nptll gen.
- 10. Transgenní pšenice podle nároku 1 nebo 8, kde jsou alespoň dva exogenní geny umístěny na stejném DNA segmentu a kde jsou uvedené buňky transformovány uvedeným segmentem.
- 11. Potomstvo rostlin podle nároku 1 nebo 8.
- 12. Buňky získané z rostlin podle nároku 1 nebo 8.
- 13. Semena získaná z rostlin podle nároku 11.
- 14. Způsob pro produkci rostliny fertilní, transgenní pšenice, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:(a) ustanovení regenerovatelné kultury z rostliny pšenice, která má být transformována;(b) zavedení DNA přípravku obsahujícího genetickou složku, která má být vložena do genomu uvedené rostliny pšenice, transformací zprostředkovanou Agrobacteriem;(c) identifikaci a selekci transformované buněčné linie a (d) regeneraci rostliny fertilní transgenní pšenice z této linie, kde uvedená DNA je přenesena úplným pohlavním cyklem uvedené transgenní rostliny na její potomstvo, kde uvedené potomstvo obsahuje selektovatelný nebo vyšetřitelný markerový gen a kde je uvedený markerový gen chromosomálně integrován.
- 15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že alespoň dva exogenní geny jsou umístěny na stejném DNA segmentu a že uvedená regenerovatelné kultura je transformována uvedeným segmentem.
- 16. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že Agrobacterium je A. tumefaciens C58.
- 17. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedená kultura obsahuje nezralý zárodek, tkáň kalu nebo suspenzi buněk.
- 18. Způsob pro produkci transgenní pšenice vyznačující se tím, že obsahuje kroky:(a) ustanovení kultury z pšenice, která má být transformována ;(b) transformování uvedené kultury Agrobacteriem obsahujícím DNA přípravek obsahující genetickou složku, která má být vložena do genomu uvedené pšenice;(c) identifikaci nebo selekci transformované buněčné linie a (d) regeneraci rostliny fertilní transgenní pšenice z této linie.
- 19. Způsob podle nároku 14 nebo 18 vyznačuj í cí se tím, že uvedená DNA obsahuje nptll gen.
- 20. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že Agrobacterium je A. tumefaciens C58.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66718896A | 1996-06-21 | 1996-06-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ86798A3 true CZ86798A3 (cs) | 1999-03-17 |
Family
ID=24677185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ98867A CZ86798A3 (cs) | 1996-06-21 | 1997-06-20 | Fertilní transgenní rostlina pšenice, způsob její přípravy, buňky a semena této rostliny |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7026528B2 (cs) |
| EP (1) | EP0856060A2 (cs) |
| CN (1) | CN1208437A (cs) |
| AU (1) | AU738153C (cs) |
| CA (1) | CA2230216A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ86798A3 (cs) |
| EA (1) | EA199800212A1 (cs) |
| HU (1) | HUP9902123A3 (cs) |
| MX (1) | MX9801421A (cs) |
| TR (1) | TR199800294T1 (cs) |
| WO (1) | WO1997048814A2 (cs) |
Families Citing this family (111)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997048814A2 (en) | 1996-06-21 | 1997-12-24 | Monsanto Company | Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation and compositions derived therefrom |
| EP1121452A1 (en) * | 1998-10-15 | 2001-08-08 | Protein Research Trust | Transformation process |
| DE69932082T2 (de) * | 1998-12-11 | 2007-06-21 | Monsanto Technology Llc | Verfahren zur verbesserung der effizienz agrobakterium-vermittelter transformation von pflanzen |
| CA2352488A1 (en) * | 1998-12-23 | 2000-06-29 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Plant transformation process |
| EP1144664B1 (en) * | 1999-01-29 | 2011-04-13 | The New Zealand Institute for Plant and Food Research Limited | Transformation and regeneration of allium plants |
| CA2267014A1 (en) * | 1999-03-26 | 2000-09-26 | Brenda Rojas | Monocot transformation using acrobacterium |
| WO2000063398A1 (en) * | 1999-04-19 | 2000-10-26 | Rhobio | Plant transformation method |
| CN100425701C (zh) | 1999-12-16 | 2008-10-15 | 孟山都技术有限公司 | 新型植物表达构建物 |
| US7468475B2 (en) | 2000-06-16 | 2008-12-23 | Schmuelling Thomas | Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology |
| US8212109B2 (en) | 2001-07-19 | 2012-07-03 | Monsanto Technology Llc | Method for the production of transgenic plants |
| US7238862B2 (en) | 2001-08-22 | 2007-07-03 | Monsanto Technology Llc | Efficiency Agrobacterium-mediated wheat transformation method |
| GB0130199D0 (en) | 2001-12-17 | 2002-02-06 | Syngenta Mogen Bv | New nematode feeding assay |
| CN1515671B (zh) * | 2003-01-06 | 2011-04-27 | 云南省农业科学院生物技术研究所 | 一种农杆菌介导的植物无选择基因转化方法 |
| EP1616014A2 (en) | 2003-04-11 | 2006-01-18 | CropDesign N.V. | Method to increase stress tolerance in plants |
| US7525013B2 (en) * | 2003-06-30 | 2009-04-28 | United Soybean Board | Soybean selection system based on AEC-resistance |
| EP1502955A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-02 | Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Methods for the production of stably transformed, fertile gramineae employing agrobacterium-mediated transformation of isolated gramineae zygotes |
| US7560611B2 (en) | 2003-08-05 | 2009-07-14 | Monsanto Technology Llc | Method and apparatus for substantially isolating plant tissues |
| WO2006013072A2 (en) | 2004-08-02 | 2006-02-09 | Basf Plant Science Gmbh | Method for isolation of transcription termination sequences |
| UA90279C2 (ru) * | 2004-08-03 | 2010-04-26 | Грэйн Биотек Австралия Пти Лтд | Стресс-толерантное трансгенное растение пшеницы |
| JP4788002B2 (ja) * | 2004-10-01 | 2011-10-05 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 減圧処理／加圧処理の使用を含む、アグロバクテリウムを用いる細胞への核酸導入方法 |
| US8088971B2 (en) | 2005-03-08 | 2012-01-03 | Basf Plant Science Gmbh | Expression enhancing intron sequences |
| CA2626304C (en) | 2005-10-20 | 2015-07-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Cereals with altered dormancy |
| RU2301519C1 (ru) * | 2005-11-22 | 2007-06-27 | Институт Физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук | Способ получения трансгенных однодольных растений in vitro |
| EP1795611B1 (en) * | 2005-12-08 | 2012-05-02 | Entelechon Gmbh | Selection marker system and method for screening a choline tolerant plant cell |
| AU2007272314B2 (en) | 2006-07-12 | 2014-05-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Polynucleotides and methods for enhancing salinity tolerance in plants |
| WO2008021543A2 (en) | 2006-08-17 | 2008-02-21 | Monsanto Technology, Llc | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
| CN101528932B (zh) | 2006-08-31 | 2014-12-10 | 孟山都技术有限公司 | 植物无选择转化 |
| PL2121935T3 (pl) | 2006-09-25 | 2011-12-30 | Schmuelling Thomas | Transkrypcyjne represory szlaków sygnałowych cytokinin i ich zastosowanie |
| AU2008212127B2 (en) | 2007-02-05 | 2013-03-28 | National University Of Singapore | Putative cytokinin receptor and methods for use thereof |
| EP2840142B1 (en) | 2007-06-06 | 2018-12-26 | Monsanto Technology LLC | Genes and uses for plant enhancement |
| JP2010531640A (ja) | 2007-06-29 | 2010-09-30 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 毒性化合物の分解方法 |
| EP2175714A4 (en) | 2007-07-10 | 2011-01-26 | Monsanto Technology Llc | TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS |
| MX2010001734A (es) | 2007-08-13 | 2010-08-04 | Commw Scient Ind Res Org | Cebada con bajos niveles de hordeinas. |
| US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
| EP2537937A3 (en) | 2008-04-29 | 2013-04-10 | Monsanto Technology LLC | Genes and uses for plant enhancement |
| EP2924118A1 (en) | 2008-07-01 | 2015-09-30 | Monsanto Technology LLC | Recombinant DNA constructs and methods for modulating expression of a target gene |
| AU2009287411B2 (en) | 2008-08-25 | 2013-11-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Resistance genes |
| CN113957105B (zh) | 2008-11-18 | 2024-11-01 | 联邦科学技术研究组织 | 产生ω-3脂肪酸的酶和方法 |
| WO2010075143A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Monsanto Technology Llc | Genes and uses for plant enhancement |
| US8404930B2 (en) * | 2009-01-26 | 2013-03-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for improving monocot transformation |
| US20120277117A1 (en) | 2009-02-27 | 2012-11-01 | Adel Zayed | Hydroponic apparatus and methods of use |
| US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
| NZ627060A (en) | 2010-03-08 | 2016-01-29 | Monsanto Technology Llc | Polynucleotide molecules for gene regulation in plants |
| US8816153B2 (en) | 2010-08-27 | 2014-08-26 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA constructs employing site-specific recombination |
| GB201020737D0 (en) | 2010-12-08 | 2011-01-19 | Univ Leuven Kath | Anti-oxidative stress agents |
| EP2734620A4 (en) | 2011-07-20 | 2014-12-24 | Commw Scient Ind Res Org | ENZYMES FOR REMOVING ORGANOPHOSPHATES |
| AU2012308694B2 (en) | 2011-09-13 | 2018-06-14 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| BR112014005958A2 (pt) | 2011-09-13 | 2020-10-13 | Monsanto Technology Llc | métodos e composições químicas agrícolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene accase em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene accase e composição herbicida |
| US9840715B1 (en) | 2011-09-13 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants |
| US10829828B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| CN109997852A (zh) | 2011-09-13 | 2019-07-12 | 孟山都技术公司 | 用于杂草控制的方法和组合物 |
| CN107739737A (zh) | 2011-09-13 | 2018-02-27 | 孟山都技术公司 | 用于杂草控制的方法和组合物 |
| US10806146B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-10-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10760086B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-09-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US9920326B1 (en) | 2011-09-14 | 2018-03-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for increasing invertase activity in plants |
| CN104271743B (zh) | 2011-12-27 | 2019-11-05 | 联邦科学技术研究组织 | 产生脂质的方法 |
| BR112014017196A2 (pt) | 2012-01-11 | 2017-06-13 | The Australian National University | métodos para a modulação ou inibição da modulação da arquitetura da raiz de uma planta, planta, planta transgênica, peptídeo regulador de arquitetura de raiz isolado (rar), polinucleotídeo isolado, vetor recombinante, célula hospedeira transgênica e promotor de planta isolado |
| CN104619843B (zh) | 2012-05-24 | 2020-03-06 | A.B.种子有限公司 | 用于使基因表达沉默的组合物和方法 |
| SG11201408362SA (en) | 2012-06-15 | 2015-01-29 | Commw Scient Ind Res Org | Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells |
| MX364070B (es) | 2012-10-18 | 2019-04-10 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para el control de plagas vegetales. |
| US20150307894A1 (en) | 2012-11-28 | 2015-10-29 | Monsanto Technology Llc | Transgenic Plants With Enhanced Traits |
| WO2014106837A2 (en) | 2013-01-01 | 2014-07-10 | A. B. Seeds Ltd. | ISOLATED dsRNA MOLECULES AND METHODS OF USING SAME FOR SILENCING TARGET MOLECULES OF INTEREST |
| US10683505B2 (en) | 2013-01-01 | 2020-06-16 | Monsanto Technology Llc | Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression |
| US10000767B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-06-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
| WO2014164761A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-09 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| CN105263329B (zh) | 2013-03-13 | 2020-09-18 | 孟山都技术公司 | 用于杂草控制的方法和组合物 |
| US20140283211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and Compositions for Plant Pest Control |
| US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| CN103278502B (zh) * | 2013-04-23 | 2015-12-23 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 启动子活性的检测方法 |
| EP2801619A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-12 | Fondazione Edmund Mach | Method of enhancing photosynthesis using Curvature thylakoid 1 (CURT1) polypeptide |
| NZ631602A (en) | 2013-06-13 | 2019-09-27 | Grains Res & Dev Corp | Barley with very low levels of hordeins |
| CN105980567B (zh) | 2013-07-19 | 2021-04-16 | 孟山都技术有限公司 | 用于控制叶甲属的组合物和方法 |
| US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
| WO2015024066A1 (en) | 2013-08-21 | 2015-02-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Rust resistance gene |
| WO2015054106A1 (en) | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants with enhanced traits |
| US10428336B2 (en) | 2013-10-16 | 2019-10-01 | The Australian National University | Method for modulating plant growth |
| CN105849266A (zh) | 2013-11-04 | 2016-08-10 | 孟山都技术公司 | 控制节肢动物寄生物和害虫侵染的组合物和方法 |
| UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
| NL2011980C2 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-18 | Univ Leiden | New effects of plant ahl proteins. |
| CN111154724B (zh) | 2013-12-18 | 2024-02-06 | 联邦科学技术研究组织 | 包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质 |
| MX368629B (es) | 2014-01-15 | 2019-10-08 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para el control de malezas utilizando polinucleotidos de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (epsps). |
| CN110506752B (zh) | 2014-04-01 | 2022-02-18 | 孟山都技术公司 | 用于控制虫害的组合物和方法 |
| AU2015280252A1 (en) | 2014-06-23 | 2017-01-12 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference |
| US11807857B2 (en) | 2014-06-25 | 2023-11-07 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression |
| CA2953008C (en) | 2014-06-27 | 2024-03-19 | Nuseed Pty Ltd | Lipid comprising docosapentaenoic acid |
| US10378012B2 (en) | 2014-07-29 | 2019-08-13 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
| EP3234156A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-10-25 | AgBiome, Inc. | Methods and compositions for providing resistance to glufosinate |
| MX395326B (es) | 2015-01-22 | 2025-03-25 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa. |
| WO2016196738A1 (en) | 2015-06-02 | 2016-12-08 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant |
| WO2016196782A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants |
| CN105039391A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-11-11 | 东北农业大学 | 一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法 |
| ES2892627T3 (es) | 2015-08-27 | 2022-02-04 | Monsanto Technology Llc | Proteínas inhibidoras de insectos novedosas |
| EP3337923B2 (en) | 2015-09-21 | 2023-01-04 | Modern Meadow, Inc. | Fiber reinforced tissue composites |
| KR20170096093A (ko) | 2016-02-15 | 2017-08-23 | 브렌던 패트릭 퍼셀 | 복합체 생제작된 물질 |
| CA3008850A1 (en) | 2017-06-29 | 2018-12-29 | Modern Meadow, Inc. | Yeast strains and methods for producing collagen |
| CN107860774B (zh) * | 2017-11-10 | 2020-01-07 | 青岛市农业科学研究院 | 一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法 |
| AU2018253595A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-30 | Modern Meadow, Inc. | Biofabricated leather articles having zonal properties |
| US10941428B2 (en) | 2018-09-12 | 2021-03-09 | Universidad Politécnica de Madrid | Reagents and methods for the expression of an active NifB protein and uses thereof |
| CN109321594B (zh) * | 2018-11-09 | 2023-11-03 | 湖南农业大学 | 一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法 |
| CA3121853A1 (en) | 2019-01-17 | 2020-07-23 | Modern Meadow, Inc. | Layered collagen materials and methods of making the same |
| KR20210149063A (ko) | 2019-03-08 | 2021-12-08 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 | 식물 세포에서 니트로게나제 폴리펩티드의 발현 |
| WO2021019394A1 (en) | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Oxford University Innovation Limited | Modified plants |
| US12173293B2 (en) | 2020-11-20 | 2024-12-24 | AgBiome, Inc. | Compositions and methods for incorporation of DNA into the genome of an organism |
| MX2023007427A (es) | 2020-12-21 | 2023-07-03 | Monsanto Technology Llc | Proteinas inhibidoras de insectos novedosas. |
| UY39585A (es) | 2020-12-23 | 2022-07-29 | Monsanto Technology Llc | Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas |
| WO2022146874A1 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Monsanto Technology Llc | Novel insect inhibitory proteins |
| WO2023041983A2 (en) | 2021-09-17 | 2023-03-23 | University Of Freiburg | Proteins for regulation of symbiotic infection and associated regulatory elements |
| US20230143932A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-05-11 | University Of Freiburg | Pin6 proteins for the formation of nodule-like structures |
| WO2023223268A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Cambridge Enterprise Limited | Proteins for regulation of symbiotic nodule organ identity |
| US20250075226A1 (en) | 2023-08-29 | 2025-03-06 | University Of Freiburg | Proteins for regulation of symbiotic infection and associated regulatory elements |
| WO2025052334A1 (en) | 2023-09-08 | 2025-03-13 | Cambridge Enterprise Limited | Bundle sheath cell specific plant promoter |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341290C (en) | 1985-05-13 | 2001-09-11 | Thomas Hohn | Method of genetically modifying plants |
| US6037526A (en) * | 1986-05-05 | 2000-03-14 | Ciba-Geigy | Method of inserting viral DNA into plant material |
| US5187073A (en) * | 1986-06-30 | 1993-02-16 | The University Of Toledo | Process for transforming gramineae and the products thereof |
| EP0267159A3 (de) | 1986-11-07 | 1990-05-02 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen |
| US5218104A (en) * | 1986-12-19 | 1993-06-08 | Agricultural Genetics Company Limited | Bowman-Birk trypsin inhibitor isolated from Vigna unguiculata |
| EP0332581B1 (de) | 1988-03-08 | 1996-12-11 | Ciba-Geigy Ag | Regeneration von fertilen Gramineen-Pflanzen aus der Unterfamilie Pooideae ausgehend von Protoplasten |
| WO1989012102A1 (en) * | 1988-06-01 | 1989-12-14 | The Texas A&M University System | Method for transforming plants via the shoot apex |
| JPH05501352A (ja) | 1989-08-09 | 1993-03-18 | ディカルブ ジェネティクス コーポレイション | 安定な形質転換稔性単子葉植物およびそれらの細胞を製造するための方法および組成物 |
| US5550318A (en) * | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US5484956A (en) * | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
| HU220773B1 (hu) * | 1990-01-22 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corporation | Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására |
| US5225341A (en) * | 1990-07-19 | 1993-07-06 | The Regents Of The University Of California | Biologically safe plant transformation system using a ds transposon |
| NL9002116A (nl) | 1990-09-27 | 1992-04-16 | Clovis Matton N V | Werkwijze voor het genetisch manipuleren van plantecellen, recombinante plasmiden, recombinante bacterien, planten. |
| ES2299172T3 (es) | 1991-02-07 | 2008-05-16 | Bayer Bioscience N.V. | Promotores especificos de estambres de maiz. |
| AU2515592A (en) | 1991-08-23 | 1993-03-16 | University Of Florida | A novel method for the production of transgenic plants |
| US5610042A (en) | 1991-10-07 | 1997-03-11 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for stable transformation of wheat |
| IL101119A0 (en) | 1992-03-03 | 1992-11-15 | Univ Ramot | Transgenic wheat |
| WO1994000583A1 (en) | 1992-06-23 | 1994-01-06 | South Dakota State University | Transformation of plants by direct injection of dna |
| EP0604662B1 (en) | 1992-07-07 | 2008-06-18 | Japan Tobacco Inc. | Method of transforming monocotyledon |
| AU4469793A (en) | 1992-08-19 | 1994-02-24 | Monsanto Company | Method for transforming monocotyledonous plants |
| CA2148499C (en) | 1993-09-03 | 2006-07-11 | Hideaki Saito | Method for transforming monocotyledons using scutella of immature embryos |
| US5631152A (en) * | 1994-10-26 | 1997-05-20 | Monsanto Company | Rapid and efficient regeneration of transgenic plants |
| WO1997048814A2 (en) | 1996-06-21 | 1997-12-24 | Monsanto Company | Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation and compositions derived therefrom |
-
1997
- 1997-06-20 WO PCT/US1997/010621 patent/WO1997048814A2/en not_active Application Discontinuation
- 1997-06-20 AU AU34028/97A patent/AU738153C/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1997-06-20 CN CN97190983A patent/CN1208437A/zh active Pending
- 1997-06-20 TR TR1998/00294T patent/TR199800294T1/xx unknown
- 1997-06-20 CA CA002230216A patent/CA2230216A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-20 EA EA199800212A patent/EA199800212A1/ru unknown
- 1997-06-20 CZ CZ98867A patent/CZ86798A3/cs unknown
- 1997-06-20 HU HU9902123A patent/HUP9902123A3/hu unknown
- 1997-06-20 EP EP97930122A patent/EP0856060A2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-02-20 MX MX9801421A patent/MX9801421A/es unknown
-
2002
- 2002-07-31 US US10/210,370 patent/US7026528B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA199800212A1 (ru) | 1998-10-29 |
| HUP9902123A2 (hu) | 1999-10-28 |
| CA2230216A1 (en) | 1997-12-24 |
| AU738153C (en) | 2004-07-01 |
| CN1208437A (zh) | 1999-02-17 |
| US7026528B2 (en) | 2006-04-11 |
| US20030024014A1 (en) | 2003-01-30 |
| HUP9902123A3 (en) | 2002-01-28 |
| EP0856060A2 (en) | 1998-08-05 |
| MX9801421A (en) | 1999-01-01 |
| AU738153B2 (en) | 2001-09-13 |
| WO1997048814A2 (en) | 1997-12-24 |
| AU3402897A (en) | 1998-01-07 |
| WO1997048814A3 (en) | 1998-03-19 |
| TR199800294T1 (xx) | 1999-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU738153C (en) | Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation and compositions derived therefrom | |
| CN109153988B (zh) | 植物的基因组编辑方法 | |
| Tadesse et al. | Optimisation of transformation conditions and production of transgenic sorghum (Sorghum bicolor) via microparticle bombardment | |
| US20080229447A1 (en) | Transformation of immature soybean seeds through organogenesis | |
| CN116249780A (zh) | 单子叶植物叶外植体的快速转化 | |
| CA2464147C (en) | Promotion of somatic embryogenesis in plants by wuschel gene expression | |
| Tyagi et al. | Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of a popular indica rice variety, ADT39 | |
| US20090023212A1 (en) | Method for transforming soybean (Glycine max) | |
| AU2002342173A1 (en) | Promotion of somatic embryogenesis in plants by wuschel gene expression | |
| BG103883A (bg) | Селекционен маркер | |
| US20160138032A1 (en) | Poaceae plant whose flowering time is controllable | |
| Godwin et al. | Transgenic grain sorghum (Sorghum bicolor) plants via Agrobacterium | |
| AU7515500A (en) | Modified ubiquitin regulatory system | |
| El-Shemy et al. | Reproducible transformation in two grain legumes-soybean and azuki bean-using different systems | |
| WO2004016793A2 (en) | Method of plastid transformation in asteraceae, vector for use therein and plants thus obtained | |
| CN112867794A (zh) | 用于植物的基因组编辑的dna构建物 | |
| AU2007201633B2 (en) | Promotion of somatic embryogenesis in plants by wuschel gene expression | |
| US20090023213A1 (en) | Method to increase the rate of transgenic embryo formation after inoculation of immature cotyledons with agrobacterium | |
| KR100363122B1 (ko) | 유전자 조작을 통한 마늘 식물체의 형질전환 방법 및 형질전환 마늘 | |
| US6331663B1 (en) | Modified full length promoters | |
| EP4565055A1 (en) | Efficient genotype-independent in planta transformation of cereals | |
| DEEPAK | MASTER OF SCIENCE (Agriculture) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |