ES2624689T3 - Nuevas construcciones de expresión en plantas - Google Patents

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ES2624689T3 ES15169140.9T ES15169140T ES2624689T3 ES 2624689 T3 ES2624689 T3 ES 2624689T3 ES 15169140 T ES15169140 T ES 15169140T ES 2624689 T3 ES2624689 T3 ES 2624689T3
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Spain
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plant
gene
promoter
seq
dna
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ES15169140.9T
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Karen L. Fincher
Stanislaw Flasinski
Jack Q. Wilkinson
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Monsanto Technology LLC
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Abstract

Un procedimiento de producción de una planta que expresa una secuencia de gen estructural, comprendiendo el procedimiento: (1) proporcionar una construcción de ADN que comprende un promotor que es funcional en una célula vegetal, comprendiendo el promotor la SEQ ID NO:28; una secuencia de gen estructural; y una región 3' no traducida que actúa para provocar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de la secuencia de ARN; en la que la secuencia de gen estructural está unida operativamente al promotor y la región 3' no traducida, y el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia de gen estructural; (2) introducir la construcción de ADN en una célula vegetal; y (3) regenerar la célula vegetal para producir una planta, de forma que la secuencia de gen estructural pueda expresarse en la planta.

Description

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DESCRIPCION
Nuevas oonstrucoiones de expresion en plantas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al aislamiento y uso de moleoulas de aoido nuoleioo para control de expresion genica, espeoifioamente nuevos promotores de plantas.
Antecedentes de la invencion
Uno de los objetivos de la ingenieria genetioa de plantas es produoir plantas con caracteristicas o rasgos agronomicamente importantes. Recientes avanoes en la ingenieria genetioa han proporoionado las herramientas neoesarias para produoir plantas transgenicas que oontengan y expresen genes ajenos (Kahl y col., World J. of Microbiol. Biotech. 11:449-460, 1995). Los rasgos o oualidades partioularmente deseables de interes para ingenieria genetioa de plantas incluirian pero sin limitacion resistenoia a inseotos, enfermedades fungioas y otras plagas y agentes que provooan enfermedades, toleranoias a herbioidas, tiempo de conservacion o estabilidad potenoiados, rendimiento, toleranoias ambientales y potenoiaoiones nutrioionales. Los avanoes tecnologicos en transformacion y regeneracion de plantas han permitido a los investigadores tomar ADN exogeno, tal oomo un gen o genes de una fuente heterologa o nativa, e inoorporar el ADN exogeno en el genoma de la planta. En un enfoque, la expresion de un nuevo gen que no se expresa normalmente en una planta particular o tejido vegetal puede oonferir un efeoto fenotipico deseado. En otro enfoque, la transcripcion de un gen o parte de un gen en una orientacion antisentido puede produoir un efeoto deseable evitando o inhibiendo la expresion de un gen endogeno.
Para produoir una planta transgenica, una construccion que inoluye una seouenoia de gen heterologo que oonfiere un fenotipo deseado ouando se expresa en la planta se introduce en una celula vegetal. La construccion tambien inoluye un promotor vegetal que se une operativamente a la seouenoia del gen heterologo, con freouenoia un promotor no asooiado normalmente con el gen heterologo. La construccion se introduce despues en una celula vegetal para produoir una celula vegetal transformada, y la celula vegetal transformada se regenera en una planta transgenica. El promotor oontrola la expresion de la seouenoia de ADN introduoida a la que se une operativamente el promotor y, de este modo, afeota a la caracteristica deseada oonferida por la seouenoia de ADN. Por ejemplo, el dooumento W092/00377 desvela plantas que expresan seouenoias de ADN estruotural, en particular de la glifosato oxidorreduotasa, bajo el control de un promotor del FMV.
Seria ventajoso tener varios promotores para adaptar la expresion genica de modo que se transoriba un gen o genes eficazmente en el momento oorreoto durante el oreoimiento y desarrollo de la planta, en la localizacion optima de la planta, y en la oantidad neoesaria para produoir el efeoto deseado. Por ejemplo, la expresion oonstitutiva de un produoto genico puede ser benefioiosa en una localizacion de la planta pero menos benefioiosa en otra planta de la planta. En otros oasos, puede ser benefioioso tener un produoto genico produoido en un cierto estadio del desarrollo de la planta o en respuesta a ciertos estimulos ambientales o quimicos. El desarrollo oomeroial de germoplasma mejorado geneticamente tambien ha avanzado al estadio de introduoir multiples rasgos en plantas de oultivo, con freouenoia denominado enfoque de apilamiento genico. En este enfoque, pueden introduoirse multiples genes que oonfieren diferentes caracteristicas de interes a una planta. Es importante ouando se introduoen multiples genes en una planta que oada gen se module o oontrole para expresion optima y que los elementos reguladores sean diversos para reduoir el potenoial de silenoiamiento genico. A la luz de estas y otras oonsideraoiones, resulta evidente que el control optimo de la expresion genica y diversidad de elementos reguladores son importantes en la biotecnologia de plantas.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a un prooedimiento de produccion de una planta que expresa una seouenoia de ADN estruotural, oomprendiendo el prooedimiento:
(1) proporoionar una construccion de ADN que oomprende un promotor que es funoional en una celula vegetal, oomprendiendo el promotor la SEQ ID NO: 28; una seouenoia de ADN estruotural; y una region 3’ no traduoida que actua para provooar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida, y el promotor es heterologo con respeoto a la seouenoia de ADN estruotural;
(2) introduoir la construccion de ADN en una celula vegetal; y
(3) regenerar la celula vegetal para produoir la planta de forma que la seouenoia de ADN estruotural pueda expresarse en la planta.
La invencion adioionalmente proporoiona una planta de oultivo transgenica que oomprende una construccion de ADN que oomprende la seouenoia de ADN promotora quimerica de SEQ ID NO: 28 y una region 3’ no traduoida que actua en plantas para provooar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor quimerico y la region 3’ no traduoida, y la seouenoia de ADN promotora quimerica es heterologa con respeoto a la seouenoia de ADN estruotural. La planta de oultivo transgenica puede ser una espeoie de oultivo monocotiledonea o una dicotiledonea, por ejemplo alfalfa, brocoli, repollo, colza,
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coliflor, maiz, algodon, arandano, pepino, lechuga, guisante, alamo, pino, patata, cebolla, arroz, frambuesa, soja, cana de azucar, remolacha azucarera, girasol, tomate o trigo.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un mapa plasmidico de pCGN8086 La Figura 2 es un mapa plasmidico de pMON45325 La Figura 3 es un mapa plasmidico de pMON45331 La Figura 4 es un mapa plasmidico de pMON45332 La Figura 5 es un mapa plasmidico de pCGN9190 La Figura 6 es un mapa plasmidico de pCGN9153 La Figura 7 es un mapa plasmidico de pCGN8099 La Figura 8 es un mapa plasmidico de pCGN8088 La Figura 9 es un mapa plasmidico de pCGN8068 La Figura 10 es un mapa plasmidico de pCGN8096 La Figura 11 es un mapa plasmidico de pCGN9151 La Figura 12 es un mapa plasmidico de pMON10156 La Figura 13 es un mapa plasmidico de pMON52059 La Figura 14 es un mapa plasmidico de pMON54952 La Figura 15 es un mapa plasmidico de pMON54953 La Figura 16 es un mapa plasmidico de pMON54954 La Figura 17 es un mapa plasmidico de pMON54955 La Figura 18 es un mapa plasmidico de pMON54956
Breve descripcion de la lista de secuencias
SEQ ID NO: 1 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act2
SEQ ID NO: 2 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act2
SEQ ID NO: 3 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act8
SEQ ID NO: 4 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act8
SEQ ID NO: 5 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act11
SEQ ID NO: 6 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act11
SEQ ID NO: 7 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de EF1
SEQ ID NO: 8 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de EF1
SEQ ID NO: 9 es la secuencia del promotor de Act2 que incluye la secuencia intronica del gen Act2. Las
posiciones de bases 1 - 764 representan la secuencia promotora; las posiciones de base 765-1215 representan
el intron seguido de 5 bases de region 5’ no traducida (5’ UTR) antes de la ATG; el sitio de inicio de la
transcripcion se localiza en la posicion de base 597.
SEQ ID NO: 10 es la secuencia del promotor de Act8 que incluye el primer intron del gen Act8. Las posiciones de bases 1-797 representan la secuencia promotora; las posiciones de base 798-1259 representan el intron seguido de 10 bases de 5’ UTR antes de la ATG; el sitio de inicio de la transcripcion se localiza en la posicion de base 646.
SEQ ID NO: 11 es la secuencia del promotor Act11 que incluye el primer intron del gen Act11. Las posiciones de bases 1-1218 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1219-1381 representan el intron seguido de 10 bases de 5’ UTR antes de la ATG; el sitio de inicio de la transcripcion se localiza en la posicion de base 1062.
SEQ ID NO: 12 es la secuencia del promotor de EF1 que incluye el primer intron del gen EF1. Las posiciones de bases 1-536 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 537-1137 representan el intron seguido de 22 bases de 5’ UTR antes de la ATG; el sitio de inicio de la transcripcion se localiza en la posicion de bases 481.
SEQ ID NO: 13 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act1 a
SEQ ID NO: 14 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act1b
SEQ ID NO: 15 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act1 a y Act1 b
SEQ ID NO: 16 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act3
SEQ ID NO: 17 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act3
SEQ ID NO: 18 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act7
SEQ ID NO: 19 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act7
SEQ ID NO: 20 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act12
SEQ ID NO: 21 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act12
SEQ ID NO: 22 es la secuencia del promotor de Act1a que incluye el primer intron del gen Act1a. Las posiciones
de bases 1-1033 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1034-1578 representan el intron y
5’ UTR.
SEQ ID NO: 23 es la secuencia del promotor de Act1b que incluye el primer intron del gen Act1b. Las posiciones de bases 1-914 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 915-1468 representan la secuencia de intron y 5’ UTR.
SEQ ID NO: 24 es la secuencia del promotor de Act3 que incluye el primer intron del gen Act3. Las posiciones de bases 1-1023 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1024-1642 representan la secuencia
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35
40
45
50
55
de intron y 5’ UTR.
SEQ ID NO: 25 es la secuencia del promotor de Act7 que incluye el primer intron del gen Act7. Las posiciones de bases 1-600 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 601-1241 representan la secuencia de intron y 5’ UTR.
SEQ ID NO: 26 es la secuencia del promotor de Act12 que incluye el primer intron del gen Act12. Las posiciones de bases 1-1017 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1018-1313 representan la secuencia de intron y 5’ UTR.
SEQ ID NO: 27 es la secuencia del promotor de FMV-Act11 quimerico que incluye el primer intron del gen Act11. Las posiciones de bases 1-536 representan la secuencia promotora de FMV duplicada; las posiciones de bases 553-1946 representan el promotor de Actina 11 de Arabidopsis, secuencia de intron y 5’ UTR. SEQ ID NO: 28 es la secuencia del promotor de FMV-EF1 a quimerico que incluye el primer intron del gen EF1 a. Las posiciones de bases 1-536 presentan la secuencia promotora de FMV; las posiciones de bases 553-1695 representan el promotor de EF1 a, secuencia de intron y 5’ UTR.
SEQ ID NO: 29 es la secuencia del promotor de CaMV-Act8 que incluye el primer intron del gen Act8. Las posiciones de bases 1-523 representan la secuencia promotora de CaMV; las posiciones de bases 534-1800 representan el promotor de Act8, secuencia de intron y 5’ UTR.
SEQ ID NO: 30 es la secuencia del promotor de CaMV-Act2 que incluye el primer intron del gen Act2. Las posiciones de bases 1-523 representan la secuencia promotora de CaMV; las posiciones de bases 534-1742 representan el promotor de Act2, secuencia de intron y 5’ UTR.
Descripcion detallada de la invencion
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisoria de Patente N.2 60/171.173, presentada el 16/12/99. Se proporcionan las siguientes definiciones y procedimientos para definir mejor y para guiar a los expertos habituales en la tecnica en la practica de la presente invencion. A no ser que se indique de otro modo, los terminos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos habituales en la tecnica relevante. Se usa la nomenclatura para bases de ADN como se expone en 37 CFR § 1.822. Se usa la nomenclatura de una y tres letras convencional para restos de aminoacidos.
“(Secuencia) de acido nucleico” o “(secuencia) polinucleotidica” se refiere a ADN o ARN bicatenario o monocatenario de origen genomico o sintetico, es decir, un polimero de bases desoxirribonucleotidicas o ribonucleotidicas, respectivamente, leidas desde el extremo 5’ (cadena arriba) al extremo 3’ (cadena abajo). El acido nucleico puede representar la hebra sentido o complementaria (antisentido).
“Nativo” se refiere a una secuencia de acido nucleico de origen natural (“tipo silvestre”).
Secuencia “heterologa” se refiere a una secuencia que se origina de una fuente o especie ajena o, si es de la misma fuente, se modifica desde su forma original.
Una secuencia de acido nucleico “aislada” esta sustancialmente separada o purificada de otras secuencias de acidos nucleicos con las que normalmente se asocia el acido nucleico en la celula del organismo en la que aparece de forma natural el acido nucleico, es decir, otro ADN cromosomico o extracromosomico. El termino abarca acidos nucleicos que se purifican de forma bioquimica de modo que se retienen sustancialmente los acidos nucleicos contaminantes y otros componentes celulares. El termino tambien abarca acidos nucleicos recombinantes y acidos nucleicos sintetizados quimicamente.
La expresion “sustancialmente purificada”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula separada de otras moleculas normalmente asociadas con ella en su estado nativo. Mas preferentemente, una molecula sustancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparacion. Una molecula sustancialmente purificada puede ser mas del 60 % sin, preferentemente 75 % sin, mas preferentemente 90 % sin las otras moleculas (excluido el disolvente) presentes en la mezcla natural. La expresion “sustancialmente purificada” no pretende abarcar moleculas presentes en su estado nativo.
Una primera secuencia de acido nucleico presenta “identidad sustancial” con una secuencia de acido nucleico de referenda si, cuando se alinea de forma optima (con inserciones o deleciones de nucleotidos apropiadas que suman menos del 20 por ciento de la secuencia de referenda sobre la ventana de comparacion) con el otro acido nucleico (o su hebra complementaria), hay al menos aproximadamente 75 % de identidad de secuencia de nucleotidos, preferentemente al menos aproximadamente 80 % de identidad, mas preferentemente al menos 85 % de identidad, y mas preferentemente al menos aproximadamente 90 % de identidad sobre una ventana de comparacion de al menos 20 posiciones de nucleotidos, preferentemente al menos 50 posiciones de nucleotidos, mas preferentemente al menos 100 posiciones de nucleotidos, y mas preferentemente sobre la longitud completa del primer acido nucleico. Puede realizarse el alineamiento optimo de secuencias para alinear una ventana de comparacion por el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; por el algoritmo de alineamiento de homologia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; por el procedimiento de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; preferentemente por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA) en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics Version 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI. El acido nucleico de referenda
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puede ser una molecula de longitud oompleta o una parte de una molecula mas larga. Como alternativa, Ios acidos
nucleicos tienen identidad sustancial si uno hibrida con el otro en condiciones rigurosas, como se define
posteriormente.
Una primera secuencia de acido nucleico esta “unida operativamente” a una segunda secuencia de acido nucleico cuando las secuencias se disponen de tal modo que la primera secuencia de acido nucleico afecte a la funcion de la segunda secuencia de acido nucleico. Preferentemente, las dos secuencias son parte de una molecula de acido nucleico contigua sencilla y mas preferentemente estan adyacentes. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente a un gen si el promotor regula o media en la transcripcion del gen en una celula.
Un acido nucleico “recombinante” se prepara por una combinacion artificial de dos segmentos separados de otro modo de secuencia, por ejemplo, por sintesis quimica o por la manipulacion de segmentos aislados de acidos
nucleicos por tecnicas de ingenieria genetica. Se conocen bien tecnicas para manipulacion de acidos nucleicos
(vease por ejemplo Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga y col., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren y col., Genome Analysis: volumen 1, Analyzing DNA, (1997), volumen 2, Detecting Genes, (1998), volumen 3, Cloning Systems, (1999) volumen 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, Nueva York).
Se analizan procedimientos para sintesis quimica de acidos nucleicos, por ejemplo, en Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, 1981 y Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, 1981. Puede realizarse sintesis quimica de acidos nucleicos, por ejemplo, en sintetizadores de oligonucleotidos automaticos comerciales.
Una “secuencia de acido nucleico sintetica” puede disenarse y sintetizarse quimicamente para expresion potenciada en celulas huesped particulares y para los fines de clonacion en construcciones apropiadas. Las celulas huesped con frecuencia presentan un patron preferido de uso codonico (Murray y col., 1989). Los ADN sinteticos disenados para potenciar la expresion en un huesped particular deberian por lo tanto reflejar el patron de uso codonico en la celula huesped. Estan disponibles programas informaticos para estos fines incluyendo pero sin limitacion los programas "BestFit" o "Gap" del Paquete de Software de Analisis de Secuencia, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI 53711.
“Amplificacion” de acidos nucleicos o “reproduccion de acido nucleico” se refiere a la produccion de copias adicionales de una secuencia de acido nucleico y se lleva a cabo usando tecnologias de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Se conoce en la tecnica varios procedimientos de amplificacion y se describe, entre otros, en las Patentes de Estados Unidos N2: 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San Diego, 1990. En PCR, un cebador se refiere a un oligonucleotido corto de secuencia definida que se hibrida con un molde de ADN para iniciar la reaccion en cadena de la polimerasa.
“Transformado”, “transfectado” o “transgenico” se refiere a una celula, tejido, organo u organismo en el que se ha introducido un acido nucleico ajeno, tal como una construccion recombinante. Preferentemente, el acido nucleico introducido se integra en el ADN genomico de la celula, tejido, organo u organismo receptor de modo que el acido nucleico introducido se herede por la descendencia posterior. Una celula u organismo “transgenico” o “transformado” tambien incluye descendencia de la celula u organismo y descendencia producida a partir de un programa de reproduccion que emplee una planta “transgenica” tal como un parental en un cruce y que muestre un fenotipo alterado resultante de la presencia de una construccion o construccion recombinante.
El termino “gen” se refiere a ADN cromosomico, ADN plasmidico, ADNc, ADN sintetico u otro ADN que codifica un peptido, polipeptido, proteina o molecula de ARN, y regiones que flanquean la secuencia codificante implicada en la regulacion de la expresion. Algunos genes pueden transcribirse a ARNm y traducirse a polipeptidos (genes estructurales); otros genes pueden transcribirse a ARN (por ejemplo ARNr, ARNt); y otros tipos de genes actuan como reguladores de la expresion (genes reguladores).
“Expresion” de un gen se refiere a la transcripcion de un gen para producir el ARNm correspondiente y traduccion de este ARNm para producir el producto genico correspondiente, es decir, un peptido, polipeptido o proteina. La expresion genica se controla o modula por elementos reguladores que incluyen elementos reguladores 5’ tales como promotores.
“Componente genetico” se refiere a cualquier secuencia de acido nucleico o elemento genetico que tambien puede ser un componente o parte de una construccion de expresion. Los ejemplos de componentes geneticos incluyen, pero sin limitacion regiones promotoras, lideres no traducidos 5’, intrones, genes, regiones no traducidas 3’ y otras secuencias reguladoras o secuencias que afectan a la transcripcion o traduccion de una o mas secuencias de acido nucleico.
Las expresiones “construccion de ADN recombinante”, “construccion recombinante”, “construccion de expresion” o “casete de expresion” se refieren a cualquier agente tal como un plasmido, cosmido, virus, BAC (cromosoma artificial de bacteria), secuencia de replicacion autonoma, fago o secuencia de nucleotidos de ADN o ARN monocatenaria o bicatenaria lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de integracion genomica o replicacion autonoma, que comprende una molecula de ADN en la que se ha unido una o mas secuencias de ADN de una manera funcionalmente operativa usando tecnicas de ADN recombinante bien conocidas.
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“Complementario” se refiere a la asooiaoion natural de seouenolas de aoido nuoleloo por formaoion de pares de bases (pares A-G-T oon la seouenoia oomplementaria T-C-A). La oomplementariedad entre dos moleoulas monooatenarias puede ser paroial, si solamente algunos de los pares de aoidos nuoleioos son oomplementarios; o oompleta, si todos los pares de bases son oomplementarios. El grado de oomplementariedad afeota a la efioaoia y fuerza de hibridaoion y reaooiones de amplifioaoion.
“Homologia” se refiere al nivel de similitud entre seouenoias de aoido nuoleioo o aminoaoidos oon respeoto a poroentaje de nuoleotidos o identidad posioional de aminoaoidos, respeotivamente, es deoir, similitud o identidad de seouenoia. La homologia tambien se refiere al oonoepto de propiedades funoionales similares entre diferentes aoidos nuoleioos o proteinas.
“Promotor” se refiere a una seouenoia de aoido nuoleioo looalizada oadena arriba o 5’ de un oodon de inioio de la traduooion de una fase de abierta de leotura (o region oodifioante de proteinas) de un gen y que este implioada en el reoonooimiento y union de ARN polimerasa II y otras proteinas (faotores de transoripoion que aotuan en trans) para inioiar la transoripoion. Un “promotor vegetal” es un promotor nativo o no nativo que es funoional en oelulas vegetales. Los promotores oonstitutivos son funoionales en la mayoria o todos los tejidos de una planta durante el desarrollo de la planta. Se expresan promotores espeoifioos de tejido, organo o oelula solamente o predominantemente en un tejido, organo o tipo oelular partioular, respeotivamente. En lugar de expresarse “espeoifioamente” en un tejido, organo o tipo oelular dado, un promotor puede presentar expresion “potenoiada”, es deoir, un nivel de expresion mas alto en una parte (por ejemplo, tipo oelular, tejido u organo) de la planta en oomparaoion oon otras partes de la planta. Los promotores regulados temporalmente son funoionales solamente o predominantemente durante oiertos periodos del desarrollo de la planta o en oiertos momentos del dia, oomo suoede oon genes asooiados oon los ritmos oiroadianos, por ejemplo. Los promotores induoibles expresan seleotivamente una seouenoia de ADN unida operativamente en respuesta a la presenoia de un estimulo endogeno o exogeno, por ejemplo por oompuestos quimioos (induotores quimioos) o en respuesta a senales ambientales, hormonales, quimioas y/o de desarrollo. Los promotores induoibles o regulados inoluyen, por ejemplo, promotores regulados por luz, oalor, estres, inundaoion o sequia, fitohormonas, heridas o agentes quimioos tales oomo etanol, jasmonato, aoido salioilioo o proteotores.
Cualquier promotor vegetal puede usarse oomo una seouenoia reguladora 5’ para modular la expresion de un gen o genes partioulares. Un promotor preferido seria un promotor de ARN polimerasa II vegetal. Los promotores de ARN polimerasa II vegetales, oomo los de otros euoariotas superiores, tienen estruoturas oomplejas y estan oomprendidos por varios elementos diferentes. Un elemento tal es la oaja TATA o oaja Goldberg-Hogness, que se requiere para la expresion oorreota de genes euoariotas in vitro e inioio de la transoripoion in vivo preoiso y efioaz. La oaja TATA se situa normalmente a aproximadamente -25 a -35, es deoir, a 25 a 35 pares de bases (pb) oadena arriba (5’) del sitio de inioio de la transoripoion, o sitio de reoubrimiento, que se define oomo posioion +1 (Breathnaoh y Chambon, Ann. Rev. Bioohem. 50: 349-383, 1981; Messing y ool., En: Genetio Engineering of Plants, Kosuge y ool., eds., pp. 211227, 1983). Otro elemento oomun, la oaja CCAAT, se looaliza entre -70 y -100 pb. En plantas, la oaja CCAAT puede tener una seouenoia oonsenso diferente que la seouenoia funoionalmente analoga de promotores de mamiferos (el analogo vegetal se ha denominado la “oaja AGGA” para diferenoiarla de su homologo animal; Messing y ool., en: Genetio Engineering of Plants, Kosuge y ool., eds., pp. 211-227, 1983). Ademas, praotioamente todos los promotores inoluyen seouenoias de aotivaoion oadena arriba adioionales o potenoiadores (Benoist y Chambon, Nature 290: 304310, 1981; Gruss y ool., Proo. Nat. Aoad. Soi. USA 78: 943-947, 1981 y Khoury y Gruss, Cell 27:313-314, 1983) que se extienden de aproximadamente -100 pb a -1000 pb o mas oadena arriba del sitio de inioio de la transoripoion.
Cuando se fusionan oon seouenoias de ADN heterologas, tales promotores normalmente provooan que la seouenoia fusionada se transoriba de una manera que es similar a la de la seouenoia genioa oon la que normalmente se asooia el promotor. Pueden anadirse fragmentos promotores que inoluyen seouenoias reguladoras (por ejemplo, fusionadas oon el extremo 5’, o insertadas dentro, de un promotor aotivo que tiene sus propias seouenoias reguladoras paroiales o oompletas (Fluhr y ool., Soienoe 232: 1106-1112, 1986; Ellis y ool., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proo. Nat. Aoad. Soi. USA 84: 8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai y ool., Plant Mol. Biol. 15: 373-381, 1991). Como alternativa, pueden anadirse seouenoias reguladoras heterologas a la region oadena arriba 5’ de un promotor inaotivo trunoado, por ejemplo, un promotor que inoluye solamente la TATA oentral y, en ooasiones, los elementos CCAAT (Fluhr y ool., Soienoe 232: 1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proo. Nat. Aoad. Soi. USA 84: 8986-8990, 1987; Aryan y ool., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71, 1991).
Los promotores normalmente oomprenden multiples “elementos reguladores transoripoionales que aotuan en ois” distintos, o simplemente “elementos en ois”, oada uno de los ouales oonfiere un aspeoto diferente del oontrol global de la expresion genioa (Strittmatter y Chua, Proo. Nat. Aoad. Soi. USA 84: 8986-8990, 1987; Ellis y ool., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Benfey y ool., EMBO J. 9: 1677-1684, 1990). Los "elementos en ois” se unen a faotores proteioos que aotuan en trans que regulan la transoripoion. Algunos elementos en cis se unen a mas de un faotor, y los faotores de transoripoion que aotuan en trans pueden interaooionar oon diferentes afinidades oon mas de un elemento en cis (Johnson y MoKnight, Ann. Rev. Bioohem. 58: 799-839, 1989). Se analizan faotores de transoripoion de plantas, elementos en cis oorrespondientes, y analisis de su interaooion, por ejemplo, en: Martin, Curr. Opinions Bioteoh. 7: 130-138, 1996; Murai, en: Methods in Plant Bioohemistry and Moleoular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422 y Methods in Plant Moleoular Biology, Maliga y ool., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300. Las seouenoias promotoras de la presente invenoion pueden oontener “elementos en cis" que oonfieren o modulan la
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expresion genica.
Los elementos en cis pueden identificarse por medio de varias tecnicas, incluyendo analisis de delecion, es decir, delecionar uno o mas nucleotidos del extremo 5’ o internos de un promotor; analisis de proteina de union a ADN usando huella de ADNasa I, interferencia de metilacion, ensayos de desplazamiento de movilidad en electroforesis, huella genomica in vivo por PCR mediada por ligacion y otros ensayos convencionales; o por similitud de secuencia con motivos de elementos en cis conocidos por procedimientos de comparacion de secuencia convencionales. Las estructura fina de un elemento en cis puede estudiarse ademas por mutagenesis (o sustitucion) de uno o mas nucleotidos del elemento o por otros procedimientos convencionales (vease por ejemplo, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422 y Methods in Plant Molecular Biology, Maliga y col., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300).
Los elementos en cis pueden obtenerse por sintesis quimica o por clonacion de promotores que incluyen tales elementos. Los elementos en cis tambien pueden sintetizarse con secuencias flanqueantes adicionales que contienen sitios de enzimas de restriccion utiles para facilitar manipulacion posterior. En una realizacion, los promotores estan comprendidos por multiples “elementos en cis” distintos. En una realizacion preferente se identifican regiones de secuencias que comprenden “elementos en cis" de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, utilizando programas de ordenador que incluyen, pero sin limitacion, MEME o SIGNALSCAN, que estan disenados de forma especifica para identificar elementos en cis, o dominios o motivos dentro de las secuencias.
La presente invencion incluye fragmentos o elementos en cis de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, u homologos de elementos en cis conocidos por efectuar regulacion genica que muestran homologia con las secuencias de acido nucleico de la presente invencion. Tales fragmentos de acido nucleico pueden incluir cualquier region de las secuencias desveladas. Las regiones promotoras o regiones promotoras parciales de la presente invencion como se muestran en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, pueden contener al menos un elemento regulador que incluye, pero sin limitacion, “elementos en cis" o dominios que tienen la capacidad de regular la expresion de secuencias de ADN unidas operativamente, tal como en tejidos reproductivos masculinos.
Los promotores vegetales tambien pueden incluir promotores producidos a traves de la manipulacion de promotores conocidos para producir promotores sinteticos, quimericos o hibridos. Tales promotores tambien pueden combinar elementos en cis de uno o mas promotores, por ejemplo, anadiendo una secuencia reguladora heterologa a un promotor activo con sus propias secuencias reguladoras parciales o completas (Ellis y col., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai y col., Plant. Mol. Biol. 15: 373-381, 1991). Tambien se han desarrollado promotores quimericos anadiendo una secuencia reguladora heterologa a la region cadena arriba 5’ de un promotor inactivo truncado, es decir un promotor que incluye solamente la TATA central y, opcionalmente, los elementos CCAAT (Fluhr y col., Science 232: 1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. uSa 84: 8986-8990, 1987; Aryan y col., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71, 1991).
Los promotores quimericos o hibridos de acuerdo con la presente invencion pueden incluir al menos un elemento en cis conocido tal como elementos que se regulan por numerosos factores ambientales tales como luz, calor o estres; elementos que se regulan o inducen por patogenos o agentes quimicos y similares. Tales elementos pueden regular de forma positiva o negativa la expresion genica, dependiendo de las condiciones. Los ejemplos de elementos en cis incluyen, pero sin limitacion, elementos sensibles a oxigeno (Cowen y col., J. Biol. Chem. 268(36): 26904, 1993), elementos reguladores de la luz (vease, por ejemplo Bruce y Quail, Plant Cell 2: 1081, 1990 y Bruce y col., EMBO J. 10: 3015, 1991), un elemento en cis sensible a tratamiento con metil jasmonato (Beaudoin y Rothstein, Plant Mol. Biol. 33: 835, 1997), elementos sensibles a acido salicilico (Strange y col., Plant J. 11: 1315, 1997), elementos de respuesta a choque termico (Pelham y col., Trends Genet. 1: 31, 1985), elementos sensibles a heridas y estres abiotico (Loace y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 9230, 1992; Mhiri y col., Plant Mol. Biol. 33: 257, 1997), elementos sensibles al frio (Baker y col., Plant Mol. Biol. 24: 701, 1994; Jiang y col., Plant Mol. Biol. 30: 679, 1996; Nordin y col., Plant Mol. Biol. 21: 641, 1993; Zhou y col., J. Biol. Chem. 267: 23515, 1992), y elementos sensibles a sequia (Yamaguchi y col., Plant Cell 6: 251-264, 1994; Wang y col., Plant Mol. Biol. 28: 605, 1995; Bray E. A. Trends in Plant Science 2: 48, 1997).
En otra realizacion, las secuencias de nucleotidos como se muestran en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, incluyen cualquier longitud de dichas secuencias de nucleotidos que tienen la capacidad de regular una secuencia de ADN unida operativamente. Por ejemplo, las secuencias como se desvelan en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID nO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, pueden estar truncadas o tener porciones delecionadas y aun tener la capacidad de regular la transcripcion de una secuencia de ADN unida operativamente. En una realizacion relacionada, un elemento en cis de las secuencias desveladas puede conferir una especificidad particular, de forma que confieren la expresion
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potenoiada de seouenoias de ADN unidas operativamente en determinados tejidos. Por oonsiguiente, pueden utilizarse oomo seouenoias reguladoras oualquiera de los fragmentos de seouenoia, poroiones o regiones de las seouenoias desveladas de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 , SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, inoluyendo, pero sin limitaoion, elementos en cis o motivos de las seouenoias desveladas. Por ejemplo, pueden deleoionarse una o mas pares de bases del extremo 5’ o 3’ de una seouenoia promotora para produoir un promotor “trunoado”. Tambien pueden insertarse, deleoionarse o sustituirse de forma interna a una seouenoia promotora uno o mas pares de bases. Los promotores pueden oonstruirse de forma que los fragmentos de promotor o elementos esten unidos operativamente, por ejemplo, oolooando tal fragmento oadena arriba de un promotor minimo. Un promotor minimo o basal es un trozo de ADN que tiene la oapaoidad de inoorporar o unir la maquinaria de transoripoion basal. Un ejemplo de maquinaria de transoripoion basal en oelulas euoariotas es el oomplejo de la ARN polimerasa II y sus proteinas aooesorias. Los oomponentes enzimatioos de la maquinaria de transoripoion basal tienen la oapaoidad de inioiar o elongar la transoripoion de un gen dado, utilizando un promotor minimo o basal. Es deoir, no hay seouenoias que aotuan en cis anadidas en la region promotora que tengan la oapaoidad de inoorporar o de unir faotores de transoripoion que modulan la transoripoion, por ejemplo, que potenoian, reprimen, haoen a la transoripoion dependiente de hormonas, eto. Para produoir una oonstruooion final pueden oombinarse sustituoiones, deleoiones, inseroiones o oualquier oombinaoion de las mismas.
Las seouenoias promotoras de la presente invenoion pueden modifioarse, por ejemplo para la expresion en otros sistemas vegetales. En otro enfoque, los promotores hibridos nuevos pueden disenarse o modifioarse por ingenieria genetioa mediante varios prooedimientos. Muohos promotores oontienen seouenoias oadena arriba que aotivan, potenoian o definen la fuerza y/o espeoifioidad del promotor (Atchison, Ann. Rev. Cell Biol. 4: 127, 1988). Los genes de ADN T, por ejemplo que oontienen oajas “TATA” que definen el sitio de inioio de la transoripoion y otros elementos oadena arriba looalizados oadena arriba del sitio de inioio de la transoripoion, modulan los niveles de transoripoion (Gelvin, en: Transgenio Plants (Kung, S.-D. y Us,R., eds, San Diego: Aoademio Press, pp.49-87, 1988). Otro promotor quimerioo oombino un trimero del aotivador de ootopina sintasa (ocs) oon el aotivador de manopina sintasa (mas) mas promotor y se ha indioado un aumento de la expresion de un gen indioador (Min Ni y ool., The Plant Journal 7: 661, 1995). Las seouenoias reguladoras oadena arriba de la presente invenoion pueden usarse para la oonstruooion de tales promotores quimerioos o hibridos. Los prooedimientos para oonstruooion de promotores variantes de la presente invenoion inoluyen pero sin limitaoion oombinar elementos de oontrol de diferentes promotores o duplioar partes o regiones de un promotor (vease por ejemplo Patente de Estados Unidos 5.110.732 y Patente de Estados Unidos 5.097.025). Los expertos en la materia estan familiarizados oon las oondioiones espeoifioas y prooedimientos para la oonstruooion, manipulaoion y aislamiento de maoromoleoulas (por ejemplo, moleoulas de ADN, plasmidos, eto.), generaoion de organismos reoombinantes y la exploraoion y aislamiento de genes (vease por ejemplo Sambrook y ool., Moleoular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga y ool., Methods in Plant Moleoular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren y ool., Genome Analysis: volumen 1, Analyzing DNA, (1997), volumen 2, Deteoting Genes, (1998), volumen 3, Cloning Systems, (1999) volumen 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, Nueva York).
El diseno, la oonstruooion y el uso de promotores quimerioos o hibridos que oomprenden uno o mas de los elementos en cis de la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, para modular o regular la expresion de seouenoias de aoido nuoleioo unidas operativamente, tambien estan abaroados por la presente invenoion.
Las seouenoias promotoras, fragmentos, regiones o elementos en cis de los mismos, de la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NOS:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, son oapaoes de transoribir seouenoias de ADN unidas operativamente en multiples tejidos y por lo tanto puede regular seleotivamente la expresion de genes en multiples tejidos.
Para varios rasgos agrioolas, la transoripoion de un gen o genes de interes es deseable en multiples tejidos para oonferir la oaraoteristioa o oaraoteristioas deseadas. La disponibilidad de promotores adeouados que regulen la transoripoion de genes unidos operativamente en tejidos diana seleooionados de interes es deseable, puesto que puede no ser deseable expresar un gen en oada tejido, sino solamente en oiertos tejidos. Por ejemplo, si se desea expresar seleotivamente un gen diana para expresion de gen para toleranoia a herbioidas, se puede desear expresion del gen de toleranoia a herbioidas en tejidos vegetativos y reproduotores. Las seouenoias promotoras de la presente invenoion son utiles para regular la expresion genioa en multiples tejidos inoluyendo, pero sin limitaoion, tejidos del meristemo de oreoimiento rapido, tejidos reproduotivos masoulinos (androoeo) tales oomo polen, anteras y filamentos, y tejidos reproduotivos femeninos (gineoeo) tales oomo el estigma, estilo y ovarios, hojas, sepalos y petalos. Los promotores de la presente invenoion tienen por lo tanto utilidad para expresion de genes de toleranoia a herbioida, por ejemplo, ouando se desea toleranoia en multiples tejidos y estadios del desarrollo vegetal. Las seouenoias promotoras de la presente invenoion tienen utilidad para regular la transoripoion de oualquier gen diana inoluyendo pero sin limitaoion genes para oontrol de la fertilidad, rendimiento, toleranoia a inseotos, toleranoia fungioa, toleranoia a herbioidas o oualquier rasgo deseable de interes. Los genes partioularmente preferidos inoluyen genes de toleranoia a herbioidas o genes de toleranoia a inseotos.
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En una realizacion, Ios promotores de la presente invencion tienen particular utllldad para regular la expresion de un gen de tolerancia a herbicidas cuando se desee expresion de un gen en multiples tejidos. Por ejemplo, el gen de tolerancia a herbicidas puede conferir tolerancia al herbicida glifosato. Los ejemplos de genes de tolerancia a glifosato adecuados incluyen, pero sin limitacion genes de la EPSP sintasa resistente a glifosato o productos genicos que degradan glifosato tales como una glifosato oxidorreductasa y fosfonato N-acetil transferasa. Es importante tener una amplia diversidad de elecciones de elementos reguladores 5’ para cualquier estrategia de biotecnologia vegetal para tener elementos reguladores adecuados que sean mas eficaces para el perfil de expresion deseado.
En otra realizacion, Ios promotores de la presente invencion tienen utilidad para determinar la funcion genica. La funcion de muchos genes es desconocida y Ios promotores de la presente invencion pueden usarse como elementos geneticos en una construccion para permitir una evaluacion fenotipica de uno o mas genes expresados en una orientacion sentido o antisentido. Los promotores de la presente invencion pueden ser componentes en una construccion de expresion en plantas desarrollada para un ensayo de alto rendimiento en el que se deseen altos niveles de expresion genica en tejidos constitutivos y reproductores.
Cualquier planta puede seleccionarse con respecto a la identificacion de genes y secuencias reguladoras. Ejemplos de dianas vegetales adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluirian pero sin limitacion alfalfa, manzana, albaricoque, Arabidopsis, alcachofa, rucula, esparrago, aguacate, banana, cebada, judias, remolacha, mora, arandano, brocoli, coles de Bruselas, col, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, citricos, clementinas, trebol, coco, cafe, maiz, algodon, arandano agrio, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higo, ajo, cucurbitaceas, uva, pomelo, melon verde, jicama, kiwi, lechuga, puerro, limon, lima, pino taeda, lino, mango, melon, champinon, nectarina, nuez, avena, palma aceitera, colza, ocra, oliva, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivia, guisante, melocoton, cacahuete, pera, pimiento, caqui, pino, pina, platano, ciruela, granada, alamo, patata, calabaza gigante, membrillo, pino insigne, achicoria roja, rabano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, boniato, liquidambar, tangerina, te, tabaco, tomate, triticale, cesped, nabo, vid, sandia, trigo, names y calabacin. Son plantas particularmente preferidas para la identificacion de secuencias reguladoras Arabidopsis, maiz, trigo, soja y algodon.
Las secuencias promotoras de la presente invencion se aislaron de ADN vegetal de Arabidopsis thaliana. En una realizacion preferida, una construccion incluye las secuencias promotoras de la presente invencion unidas operativamente con una secuencia transcribible junto con secuencias terminadoras y reguladoras adecuadas. Una construccion tal puede transformarse en una planta diana adecuada de interes. Cualquier planta puede usarse como un huesped adecuado para construcciones de acido nucleico que comprenden las secuencias promotoras de la presente invencion. Los ejemplos de plantas diana adecuadas de interes incluirian, pero sin limitacion, alfalfa, brocoli, col, colza, coliflor, maiz, algodon, arandano agrio, pepino, lechuga, guisante, alamo, pino, patata, cebolla, arroz, frambuesa, soja, cana de azucar, remolacha azucarera, girasol, tomate y trigo.
Procedimientos de Aislamiento y Modificacion de Promotores
Puede usarse cualquier variedad de procedimientos para aislar fragmentos de las secuencias promotoras desveladas en el presente documento. Puede usarse un enfoque basado en PCR para amplificar regiones flanqueantes de una biblioteca genomica de una planta usando informacion de secuencia disponible publicamente. Se conocen varios procedimientos por Ios expertos en la materia para amplificar secuencias de ADN desconocidas adyacentes a una region central de secuencia conocida. Los procedimientos incluyen pero sin limitacion PCR inversa (PCRI), PCR vectorette, PCR en forma de Y enfoques de walking de genoma. Para la presente invencion las moleculas de acido nucleico se aislaron de Arabidopsis disenando cebadores de PCR basados en informacion de secuencia disponible.
Tambien pueden obtenerse fragmentos de acido nucleico por otras tecnicas tales como sintetizando directamente el fragmento por medios quimicos, como se practica habitualmente usando un sintetizador de oligonucleotidos automatico. Tambien pueden obtenerse fragmentos por la aplicacion de tecnologia de reproduccion de acido nucleico, tal como la tecnologia de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) por tecnicas de ADN recombinante generalmente conocidas por Ios expertos en la materia de biologia molecular. Con respecto a la amplificacion de una secuencia de acido nucleico diana (por ejemplo por PCR) usando un par de cebadores de amplificacion particular, las “condiciones de PCR rigurosas” se refieren a condiciones que permiten que el par de cebadores hibriden solamente con la secuencia de acido nucleico diana con la que se uniria un cebador que tenga la secuencia de tipo silvestre correspondiente (o su complemento) y preferentemente para producir un producto de amplificacion unico.
Los expertos en la materia conocen procedimientos para preparacion de ADN genomico de plantas. En un enfoque, pueden prepararse bibliotecas de ADN genomico de una especie seleccionada por digestion parcial con una enzima de restriccion y seleccionando por tamano Ios fragmentos de ADN dentro de un intervalo de tamanos particular. El ADN genomico puede clonarse en una construccion adecuada que incluye pero sin limitacion un bacteriofago, y prepararse usando una construccion adecuada tal como un bacteriofago usando un kit de clonacion adecuado de cualquier variedad de distribuidores (vease por ejemplo Stratagene, La Jolla CA o Gibco BRL, Gaithersburg, MD).
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En otra realizacion, las seouenoias de nucleotidos de Ios promotores desvelados en el presente dooumento pueden modlflcarse. Los expertos en la materia pueden crear moleculas de ADN que tengan variaciones en la secuencia de nuoleotidos. Las secuencias de nucleotidos de la presente invencion, como se muestran en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, pueden modificarse o alterarse para potenciar sus caracteristicas de control. Por ejemplo, las secuencias pueden modificarse por insercion, delecion o reemplazo de secuencias molde en una estrategia de modificacion de ADN basada en PCR. Las moleculas de ADN “variante” son moleculas de ADN que contienen cambios en los que uno o mas nucleotidos de una secuencia nativa se delecionan, anaden y/o sustituyen, preferentemente mientras se mantiene de forma sustancial la funcion del promotor. En el caso de un fragmento de promotor, el ADN “variante” puede incluir cambios que afectan la transcripcion de un promotor minimo al cual esta unido operativamente. Las moleculas de ADN variante pueden producirse, por ejemplo, mediante tecnicas de mutagenesis de ADN convencionales o sintetizando de forma quimica la molecula de ADN variante o una porcion de la misma.
Ademas de su uso en la modulacion de la expresion genica, las secuencias promotoras de la presente invencion tambien tienen utilidad como sondas o cebadores en experimentos de hibridacion de acido nucleico. Las sondas y los cebadores de acido nucleico de la presente invencion pueden hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de ADN diana. La expresion “condiciones de hibridacion rigurosas” se define como condiciones en las que una sonda o cebador hibrida especificamente con una secuencia o secuencias diana y no con secuencias no diana, como se puede determinar de forma empirica. La expresion “condiciones rigurosas” se define funcionalmente con respecto a la hibridacion de una sonda de un acido nucleico un acido nucleico diana (es decir, con una secuencia de acido nucleico particular de interes) mediante el procedimiento de hibridacion especifico (vease por ejemplo Sambrook y col., 1989, en 9.52-9.55, Sambrook y col., 1989 en 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203-213, 1984; y Wetmur y Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370, 1968). Las condiciones de rigurosidad apropiada que promueven la hibridacion de ADN son, por ejemplo, cloruro sodico /citrato sodico (SSC) 6,0 x a aproximadamente 45 2C, seguido de un lavado de SSC 2,0 x a 50 2C, se conocen por los expertos en la materia o pueden encontrarse en manuales de laboratorio que incluyen pero sin limitacion, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentracion salina en la etapa de lavado puede seleccionarse de una baja rigurosidad de aproximadamente SSC 2,0 x a 50 2C hasta una ala rigurosidad de aproximadamente SSC 0,2 x a 50 2C. Ademas, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse de condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente a 22 2C, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 2C. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o la temperatura o la concentracion salina pueden mantenerse constantes mientras que la otra variable se cambia. Por ejemplo, la hibridacion usando sondas de ADN o ARN o cebadores puede realizarse a 65 2C en SSC 6x, SDS 0,5 %, Denhardt 5x, ADN no especifico 100 pg/ml (por ejemplo, ADN de esperma de salmon tratado con ultrasonido) con lavado a SSC 0,5x, SDS 0,5 % a 65 2C, para alta rigurosidad.
Se dice que una molecula de acido nucleico es el “complemento” de otra molecula de acido nucleico si muestran complementariedad completa. Como se usa en el presente dooumento, se dice que las moleculas muestran “complementariedad completa” cuando cada nucleotido de una de las moleculas es complementario de un nucleotido de la otra. Se dice que dos moleculas son minimamente complementarias si pueden hibridar entre si con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan hibridadas entre si en al menos condiciones de “baja rigurosidad” convencionales. De forma similar, se dice que las moleculas son “complementarias” si pueden hibridar entre si con suficiente estabilidad para permitir que se mantengan hibridadas entre si en condiciones de “alta rigurosidad” convencionales. Se contempla que pueden usarse condiciones de hibridacion de rigurosidad mas baja tales como temperaturas de lavado y/o hibridacion mas bajas para identificar secuencias relacionadas que tengan un grado mas bajo de similitud de secuencia si se conserva especificidad de union de la sonda o cebador con secuencia o secuencias diana. En consecuencia, las secuencias de nucleotidos de la presente invencion pueden usarse por su capacidad para formar selectivamente moleculas de doble cadena con tramos complementarios de fragmentos de ADN. Se conoce bien por los expertos en la materia la deteccion de segmentos de ADN mediante hibridacion, y por lo tanto, dependiendo de la aplicacion prevista, se deseara emplear diversas condiciones de hibridacion para conseguir diversos grados de selectividad de sonda hacia secuencia diana y el procedimiento de eleccion dependera de los resultados deseados. Se describen condiciones de rigurosidad convencionales en Sambrook, y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, y por Haymes y col., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985.
En una realizacion de la presente invencion, las secuencias de acido nucleico SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, o un fragmento, region, elemento en cis, u oligomero de estas secuencias, se usa en ensayos de hibridacion de otros tejidos vegetales para identificar genes homologos o cercanamente relacionados y secuencias reguladoras asociadas. Estos incluyen pero sin limitacion ensayos de hibridacion de Southern o northern en cualquier sustrato incluyendo pero sin limitacion un tejido vegetal preparado de forma apropiada, celulosa, nylon o filtro de combinacion, microplaca o portaobjetos de vidrio. Dichas metodologias se conocen bien en la tecnica y estan disponibles en un kit o preparacion que puede proporcionarse por proveedores comerciales.
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Un fragmento de un acido nuoleioo como se usa en el presente documento es una parte del acido nuoleloo que es menor de longitud completa. Por ejemplo, para la presente invencion cualquier longitud de secuencia de nucleotidos que sea menor que las secuencias de nucleotidos desveladas de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, se considera un fragmento. Un fragmento tambien puede comprender al menos una longitud minima capaz de hibridar especificamente con un acido nucleico nativo en condiciones de hibridacion rigurosas como se han definido anteriormente. La longitud de un fragmento minimo tal es preferentemente de al menos 8 nucleotidos, mas preferentemente 15 nucleotidos, incluso mas preferentemente al menos 20 nucleotidos, y mas preferentemente al menos 30 nucleotidos de una secuencia de acido nucleico nativa.
Una “sonda” es un acido nucleico aislado al que se une un marcador detectable convencional o molecula indiciadora, por ejemplo, un isotopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Los “cebadores” son acidos nucleicos aislados que hibridan con una cadena de ADN diana complementaria por hibridacion de acido nucleico para formar un hibrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, despues se extiende a lo largo de la cadena de ADN diana por una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Pueden usarse pares de cebadores para amplificacion de una secuencia de acido nucleico, por ejemplo, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificacion de acido nucleico convencionales.
Las sondas y los cebadores son generalmente de 11 nucleotidos o mas de longitud, preferentemente 18 nucleotidos o mas, mas preferentemente 25 nucleotidos y mas preferentemente 30 nucleotidos o mas. Tales sondas y cebadores hibridan especificamente con una secuencia de ADN o ARN diana en condiciones de hibridacion de alta rigurosidad e hibridan especificamente con una secuencia nativa diana de otra especie en condiciones de rigurosidad mas baja. Preferentemente, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invencion tienen similitud de secuencia completa con la secuencia nativa, aunque pueden disenarse sondas que difieran de la secuencia nativa y que conserven la capacidad para hibridar con las secuencias nativas diana por procedimientos convencionales. Se describen procedimientos para preparar y usar sondas y cebadores, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo en el presente documento "Sambrook y col., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y col., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periodicas) (en lo sucesivo en el presente documento, "Ausubel y col., 1992”); e Innis y col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pueden derivarse pares de cebadores de PCR de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas informaticos pretendidos para ese fin tales como Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Pueden usarse cebadores y sondas basados en las secuencias promotoras nativas desveladas en el presente documento para confirmar y, si es necesario, modificar las secuencias desveladas por procedimientos convencionales, por ejemplo, volviendo a clonar y volviendo a secuenciar.
Construcciones y Construcciones de Expresion
Pueden incorporarse acidos nucleicos nativos o sinteticos de acuerdo con la presente invencion en construcciones de acidos nucleicos recombinantes, normalmente construcciones de ADN, capaces de introduccion y replicacion en una celula huesped. En una realizacion preferida, las secuencias de nucleotidos de la presente invencion como se muestran en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NOS:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, o fragmentos, variantes o derivados de las mismas, se incorporan en un casete de expresion que incluye las regiones promotoras de la presente invencion unidas operativamente con un componente genetico tal como gen marcador seleccionable, explorable o puntuable.
En otra realizacion, las secuencias de acido nucleico desveladas de la presente invencion como se muestran en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NOS:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30 se unen operativamente con un componente genetico tal como un acido nucleico que confiere una caracteristica deseable asociada con morfologia, fisiologia, crecimiento y desarrollo de plantas, rendimiento, potenciacion nutricional, resistencia a enfermedad o plaga, o tolerancia ambiental o quimica. Estos componentes geneticos tales como genes marcadores o genes agronomos de interes pueden actuar en la identificacion de una celula vegetal o planta transformada o producir un producto de utilidad desde el punto de vista agronomico.
En otra realizacion, un componente genetico produce un producto que actua como un dispositivo de seleccion y actua en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que conferiria al tejido vegetal resistencia a un compuesto de otro modo toxico. Los genes de interes para su uso como un marcador seleccionable, explorable o puntuable incluirian pero sin limitacion GUS (secuencia codificante de beta-glucuronidasa), GFP (secuencia codifican de proteina verde fluorescente), LUX (gen codificante de luciferasa), genes marcadores de resistencia a antibioticos o genes de tolerancia a herbicidas. Los ejemplos de transposones y genes de resistencia a antibioticos asociados incluyen los transposones Tns (bla), Tn5 (nptII), Tn7 (dhfr), penicilinas, kanamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina.
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Se han perfilado oaraoterfstioas utiles para marcadores seleooionables en plantas en un informe sobre el uso de microrganismos (Comite Consultivo sobre Nuevos Alimentos y Prooedimientos, Julio de 1994). Estas inoluyen seleooion rigurosa oon numero minimo de teJidos no transformados, grandes numeros de aoonteoimientos de transformaoion independientes sin interferenoia signifioativa oon la regeneraoion, aplioaoion a un gran numero de espeoies y disponibilidad de un ensayo para puntuar los teJidos oon respeoto a presenoia del maroador.
Se oonooen en la teonioa varios genes maroadores seleooionables y varios maroadores de resistenoia a antibiotioos satisfaoen estos oriterios, inoluyendo los resistentes a kanamioina (nptll), higromioina B (aph IV) y gentamioina (aao3 y aaoC4). Los genes maroadores seleooionables dominantes utiles inoluyen genes que oodifioan genes de resistenoia a antibiotioos (por eJemplo, resistenoia a higromioina, kanamioina, bleomioina, G418, estreptomioina o espeotinomioina); y genes de resistenoia a herbioidas (por eJemplo, fosfinotrioin aoetiltransferasa). Una estrategia util para seleooion de transformantes para resistenoia a herbioida se desoribe, por eJemplo, en Vasil, Cell Culture and Somatio Cell Genetios of Plants, Vols. I-III, Laboratory Prooedures and Their Applioations Aoademio Press, Nueva York, 1984. Serian genes maroadores seleooionables partioularmente preferidos para su uso en la presente invenoion genes que oonfieran resistenoia a oompuestos tales oomo antibiotioos oomo kanamioina, y herbioidas oomo glifosato (Della-Cioppa y ool., Bio/Teohnology 5(6), 1987, Patente de Estados Unidos 5.463.175, Patente de Estados Unidos 5.633.435). Pueden implementarse tambien otros dispositivos de seleooion y aun quedarian dentro del ambito de la presente invenoion.
Para la praotioa de la presente invenoion, se emplean oomposioiones y prooedimientos oonvenoionales para preparar y usar oonstruooiones de ADN y oelulas hospedadoras, oomo se analiza, entre otros, en Sambrook y ool., 1989. En una realizaoion preferida, la oelula huesped es una oelula vegetal. Se han desorito varias oonstruooiones de ADN adeouadas para transfeooion estable de oelulas vegetales o para el estableoimiento de plantas transgenioas en, por eJemplo, Pouwels y ool., Cloning Veotors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987; Weissbaoh y Weissbaoh, Methods for Plant Moleoular Biology, Aoademio Press, 1989; Gelvin y ool., Plant Moleoular Biology Manual, Kluwer Aoademio Publishers, 1990 y R.R.D. Croy Plant Moleoular Biology LabFax, BIOS Soientifio Publishers, 1993. Las oonstruooiones de expresion en plantas pueden inoluir, por eJemplo, uno o mas genes vegetales olonados baJo el oontrol transoripoional de seouenoias reguladoras 5’ y 3’. Tambien pueden inoluir un maroador seleooionable oomo se desoribe para seleooionar oelulas huesped que oontienen la oonstruooion de expresion. Tales oonstruooiones de expresion en plantas tambien oontienen una region reguladora del promotor (por eJemplo, una region reguladora que oontrola expresion induoible o oonstitutiva, regulada ambientalmente o por desarrollo o espeoifioa de oelula o teJido), un sitio de inioio de la transoripoion, un sitio de union al ribosoma, una senal de prooesamiento de ARN, un sitio de terminaoion de la transoripoion y una senal de poliadenilaoion. Otras seouenoias de origen baoteriano tambien se inoluyen para permitir que la oonstruooion se olone en un huesped baoteriano. La oonstruooion normalmente tambien oontendra un origen de replioaoion prooariota de serie de huespedes amplia. En una realizaoion partioularmente preferida, la oelula huesped es una oelula vegetal y la oonstruooion de expresion en plantas oomprende una region promotora oomo se desvela en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ iD NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NOS:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; una seouenoia transoribible unida operativamente; y una seouenoia de terminaoion de la transoripoion. Otras seouenoias reguladoras previstas oomo oomponentes genetioos en una oonstruooion de expresion inoluyen pero sin limitaoion seouenoia lider no traduoida que puede aooplarse oon el promotor. En una realizaoion partioularmente preferida, la oelula huesped es una oelula vegetal y la oonstruooion de expresion en plantas oomprende una region promotora oomo se desvela en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID nO:1 1, SEQ ID NO:12, sEq ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NOS:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, una seouenoia transoribible unida operativamente y una seouenoia de terminaoion de la transoripoion. Las oonstruooiones de expresion en plantas tambien pueden oomprender seouenoias adioionales que inoluyen pero sin limitaoion seouenoias de poliligador que oontienen sitios de enzimas de restriooion que son utiles para fines de olonaoion.
Elementos Geneticos en Construcciones de Expresion en Plantas
Las oonstruooiones de expresion en plantas pueden inoluir mas de una seouenoia genioa expresable, oada una unida operativamente a un promotor diferente. Varios promotores tienen utilidad para expresion de genes en plantas para oualquier gen de interes inoluyendo pero sin limitaoion maroadores seleooionables, maroadores puntuables, genes para toleranoia a plagas, toleranoia a enfermedad, potenoiaoiones nutrioionales y oualquier otro gen de interes agronomo. Los eJemplos de promotores oonstitutivos utiles para expresion de genes en plantas inoluyen pero sin limitaoion, promotor P-35S del virus del mosaioo de la ooliflor (CaMV), que oonfiere expresion de alto nivel oonstitutiva en la mayoria de los teJidos vegetales (vease, por eJemplo, Odel y ool., Nature 313: 810, 1985), inoluyendo monoootiledoneas (vease, por eJemplo, Dekeyser y ool., Plant Cell 2: 591, 1990; Terada y Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220: 389, 1990); una version del promotor 35S de CaMV duplioada en tandem; el promotor 35S potenoiado (P-e35S) el promotor de nopalina sintasa (An y ool., Plant Physiol. 88: 547, 1988), el promotor de ootopina sintasa (Fromm y ool., Plant Cell 1: 977, 1989); y el promotor del virus del mosaioo de la esorofularia (P- FMV) oomo se desoribe en la Patente de Estados Unidos N2: 5.378.619 y una version potenoiada del promotor del FMV (P-eFMV) en donde la seouenoia promotora de P-FMV esta duplioada en tandem, el promotor 19S del virus del mosaioo de la ooliflor, un promotor del virus baoiliforme de la oana de azuoar; un promotor del virus de manohas amarillas de oommelina y otros promotores de virus de ADN de plantas que se sabe que se expresan en oelulas vegetales.
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Puede usarse varios promotores de genes vegetales que se regulan en respuesta a senales ambientales, hormonales, quimicas y/o de desarrollo para la expresion de un gen unido operativamente en celulas vegetales, incluyendo promotores regulados por (1) oalor (Callis y col., Plant Physiol. 88: 965, 1988), (2) luz (por ejemplo, promotor rboS-3A de guisante, Kuhlemeier y col., Plant Cell 1: 471, 1989; promotor rbcS del maiz, Sohaffner y Sheen, Plant Cell 3: 997, 1991; o promotor de la proteina de union a clorofila a/b, Simpson y col., EMBO J. 4: 2723, 1985), (3) hormonas, tales como acido abscisico (Marcotte y col., Plant Cell 1:969, 1989), (4) heridas (por ejemplo, wunl, Siebertz y col., Plant Cell 1: 961, 1989); o (5) compuestos quimicos tales como metil jasmonato, acido salicilico o protector. Tambien puede ser ventajoso emplear (6) promotores especificos de organos (por ejemplo, Roshal y col., EMBO J. 6: 1155, 1987; Schernthaner y col., EMBO J. 7: 1249, 1988; Bustos y col., Plant Cell 1: 839, 1989).
Los promotores de la presente invencion son promotores vegetales que son capaces de transcribir secuencias de ADN unidas operativamente en tejido del meristemo que crece rapidamente y tejidos reproductivos y pueden unirse operativamente a cualquier gen de interes en una construccion de expresion.
Las construcciones de expresion de plantas pueden incluir senales de procesamiento de ARN, por ejemplo, intrones, que pueden situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia codificante de polipeptidos en el transgen. Ademas, las construcciones de expresion pueden incluir secuencias reguladoras adicionales de la region no traducida 3’ de genes de plantas (Thornburg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 744 (1987); An y col., Plant Cell 1: 115 (1989), por ejemplo, una region terminadora 3’ para aumentar la estabilidad del ARNm, tal como la region terminadora Pl-ll de patata o las regiones terminadoras 3’ de octopina o nopalina sintasa. Las regiones no traducidas 5’ de un ARNm pueden desempenar un papel importante en el inicio de la traduccion y tambien pueden ser un componente genetico en una construccion de expresion en plantas. Por ejemplo, las secuencias lider 5’ no traducidas derivadas de genes de proteinas de choque termico han demostrado potenciar la expresion genica en plantas (vease, por ejemplo Patente de Estados Unidos 5.362.865). Estas secuencias reguladoras cadena arriba y cadena abajo adicionales pueden derivar de una fuente que es nativa o heterologa con respecto a los otros elementos presente en la construccion de expresion.
Las secuencias promotoras de la presente invencion se usan para controlar la expresion genica en celulas vegetales. Las secuencias promotoras desveladas son componentes geneticos que son parte de construcciones usadas en transformacion de plantas. Las secuencias promotoras de la presente invencion pueden usarse con cualquier plasmido o construccion de transformacion de plantas adecuado que contenga un marcador seleccionable o explorable y elementos reguladores asociados, como se describe, junto con uno o mas acidos nucleicos expresados de una manera suficiente para conferir un rasgo deseable particular. Los ejemplos de genes estructurales adecuados de interes agronomo previstos por la presente invencion incluirian pero sin limitacion uno o mas genes de tolerancia a insectos, tales como un gen de Bacillus thuringiensis (B.t.), tolerancia a plagas tales como genes para control de enfermedad fungica, tolerancia a herbicida tal como genes que confieren tolerancia a glifosato, y genes para mejoras de calidad tales como rendimiento, mejoras nutricionales, tolerancias ambientales o a estres, o cualquier cambio deseable en la fisiologia, crecimiento, desarrollo, morfologia vegetal o el producto o productos vegetales. Por ejemplo, los genes estructurales incluirian cualquier gen que confiera tolerancia a insectos incluyendo pero sin limitacion un gen de proteina de combate de insectos de Bacillus como se describe en el documento WO 9931248, Patente de Estados Unidos N2: 5.689.052, Patentes de Estados Unidos N2: 5.500.365 y 5.880.275. En otra realizacion, el gen estructural puede conferir tolerancia al herbicida glifosato como se confiere por genes que incluyen, pero sin limitacion gen de EPSPS resistente a glifosato de Agrobacterium cepa CP4 (aroA:CP4) como se describe en la Patente de Estados Unidos N2: 5.633.435, o gen de glifosato oxidorreductasa (GOX) como se describe en la Patente de Estados Unidos N2: 5.463.175.
Como alternativa, las secuencias codificantes de ADN pueden efectuar estos fenotipos codificando una molecula de ARN no traducible que provoca la inhibicion dirigida de expresion de un gen endogeno, por ejemplo mediante mecanismos mediados por antisentido o cosupresion (vease, por ejemplo, Bird y col., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9: 207,1991). El ARN tambien podria ser una molecula de ARN catalitica (es decir, una ribozima) modificada por ingenieria genetica para escindir un producto de ARNm endogeno deseado (vease por ejemplo, Gibson y Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125,1997). Por lo tanto, cualquier gen que produzca una proteina o ARNm que exprese un fenotipo o cambio de morfologia de interes es util para la practica de la presente invencion.
Ademas de elementos reguladores o secuencias localizadas cadena arriba (5’) o dentro de una secuencia de ADN, existen secuencias cadena abajo (3’) que afectan a la expresion genica. Por lo tanto, la expresion secuencia reguladora como se usa en el presente documento se refiere a cualquier secuencia de nucleotidos localizada cadena arriba, dentro, o cadena abajo de una secuencia de ADN que controla, media en o afecta a la expresion de un producto genico junto con el aparato sintetico proteico de la celula.
Los expertos en la materia conocen las construcciones adecuadas para la transformacion de plantas. Las secuencias promotoras de la presente invencion se incorporan preferentemente en una construccion de expresion usando marcadores explorables o puntuables como se ha descrito y se ensayan en analisis transitorios para proporcionar un indicio de la expresion genica en plantas transformadas. Se conocen procedimientos para ensayar la expresion genica en ensayos transitorios por los expertos en la materia. Se ha indicado expresion transitoria de genes marcadores usando varias plantas, tejidos y sistemas de suministro de ADN. Por ejemplo, los tipos de analisis transitorios pueden incluir pero sin limitacion dirigir el suministro genico mediante electroporacion o bombardeo de
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partfoulas de tejidos en cualquier ensayo de planta transitorio usando cualquier especie vegetal de interes. Tales slstemas transitorios incluirian pero sin limitacion protoplastos de oultivos en suspension en trigo (Zhou y col., Plant Cell Reports 12: 612. 1993), electroporacion de protoplastos de hoja de trigo (Sethi y col., J. Crop Sci. 52: 152, 1983); electroporacion de protoplasto preparado a partir de tejido de maiz (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991) o bombardeo de particulas de tejidos especificos de interes. La presente invencion abarca el uso de cualquier sistema de expresion transitorio para evaluar secuencias reguladoras unidas operativamente a genes indicadores seleccionados, genes marcadores o genes agronomos de interes. Los ejemplos de tejidos vegetales que se ha previsto ensayar en transitorios mediante un sistema de suministro apropiado incluirian pero sin limitacion tejidos de base de las hojas, callos, cotiledones, raices, endospermos, embriones, tejido floral, polen y tejido epidermico.
Puede usarse cualquier marcador puntuable o explorable en un ensayo transitorio. Los genes marcadores preferidos para analisis transitorios de los promotores de secuencias reguladoras 5’ de la presente invencion incluyen un gen de p-glucuronidasa (GUS) o un gen de proteina verde fluorescente (GFP). Las construcciones de expresion que contienen las secuencias reguladoras 5’ unidas operativamente a un gen marcador se suministran a los tejidos y los tejidos se analizan por el mecanismo apropiado, dependiendo del marcador. Los analisis cuantitativos o cualitativos se usan como una herramienta para evaluar el perfil de expresion potencial de las secuencias reguladoras 5’ cuando se unen operativamente a genes de interes agronomo en plantas estables. En ultima instancia, las secuencias reguladoras 5’ de la presente invencion se incorporan directamente en construcciones de expresion de transformacion de plantas adecuadas que comprenden las secuencias reguladoras 5’ unidas operativamente a una secuencia de ADN transcribible de interes, se transforman en plantas y las plantas transformadas de forma estable y descendencia de las mismas se analizan con respecto al perfil de expresion deseado conferido por las secuencias reguladoras 5’.
Las construcciones de expresion adecuadas para introducir ADN exogeno en celulas vegetales incluirian pero sin limitacion plasmidos Ti desarmados para procedimientos mediados por Agrobacterium. Estas construcciones pueden contener un marcador de resistencia, limites de ADN T 1-2 y origenes de replicacion para E. coli y Agrobacterium junto con uno o mas genes de interes y regiones reguladoras asociadas. Los expertos en la materia saben que estan disponibles para enfoques mediados por Agrobacterium varias cepas y procedimientos. Tales cepas incluirian pero sin limitacion cepas de Agrobacterium C58, LBA4404, EHA101 y EHA105. Son cepas particularmente preferidas las cepas de Agrobacterium tumefaciens.
Acidos nucleicos a modo de ejemplo que pueden introducirse por los procedimientos abarcados por la presente invencion incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes de otras especies, o incluso genes o secuencias que se originan con o estan presentes en la misma especie, pero se incorporan en celulas receptoras por procedimientos de ingenieria genetica en vez de tecnicas de reproduccion o cultivo clasicas. Sin embargo, el termino “exogeno” tambien pretende referirse a genes que normalmente no estan presentes en la celula que se transforma, o quiza simplemente no estan presentes en la forma, estructura, etc., como se haya en el segmento de ADN transformante o gen o genes que normalmente estan presentes y que se desea expresar de una manera que difiere del patron de expresion natural, por ejemplo, sobreexpresar. Por lo tanto, el termino gen “exogeno” o ADN pretende referirse a cualquier gen o segmento de ADN que se introduce en una celula receptora, independientemente de si un gen similar ya esta presente en una celula tal. El tipo de ADN incluido en el ADN exogeno puede incluir ADN que ya esta presente en la celula vegetal, ADN de otra planta, ADN de un organismo diferente o un ADN generado de forma externa, tal como secuencia de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una version sintetica o modificada de un gen.
Las construcciones de transformacion de plantas que contienen las secuencias promotoras de la presente invencion pueden introducirse en plantas por cualquier procedimiento de transformacion de plantas. Estan disponibles varios procedimientos para introducir secuencias de ADN en celulas vegetales y se conocen bien en la tecnica. Los procedimientos adecuados incluyen pero sin limitacion infeccion bacteriana (por ejemplo, con Agrobacterium como se ha descrito anteriormente), construcciones de cromosoma artificial de bacterias binarios, suministro directo de ADN (por ejemplo, mediante transformacion mediada por PEG, captacion de ADN mediada por desecacion/inhibicion, electroporacion, agitacion con fibras de carburo de silicio), y aceleracion de particulas revestidas con ADN (revisado en Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42: 205, 1991).
Los procedimientos para transformar especificamente dicotiledoneas usan principalmente Agrobacterium tumefaciens. Por ejemplo, las plantas transgenicas indicadas incluyen pero sin limitacion algodon (Patente de Estados Unidos N2 5.004.863; Patente de Estados Unidos N2 5.159.135; Patente de Estados Unidos N2 5.518.908, documento WO 97/43430), soja (Patente de Estados Unidos N2 5.569.834; Patente de Estados Unidos N2 5.416.011; McCabe y col., Bio/Technology, 6:923, 1988; Christou y col., Plant Physiol., 87:671, 1988); Brassica (Patente de Estados Unidos N2 5.463.174), y cacahuete (Cheng y col., Plant Cell Rep., 15: 653, 1996).
Se han presentado procedimientos similares en la transformacion de monocotiledoneas. La retransformacion y regeneracion de plantas usando estos procedimientos se ha descrito para varios cultivos incluyendo pero sin limitacion esparragos (Asparagus officinalis; Bytebier y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 5345, 1987); cebada (Hordeum vulgarae; Wan y Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994); maiz (Zea mays; Rhodes, C.A., y col., Science, 240: 204, 1988; Gordon-Kamm, y col., Plant Cell, 2: 603, 1990; Fromm, y col., Bio/Technology, 8: 833, 1990; Koziel, y col., Bio/Technology, 11: 194, 1993); avena (Avena sativa; Somers, y col., Bio/Technology, 10: 1589, 1992);
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Dactylis (Dactylis glomerata; Horn, y coI., Plant Cell Rep., 7: 469, 1988); arroz (Oryza sativa, Incluyendo varledades indloa y japonloa, Torlyama, y col., Blo/Technology, 6: 10, 1988; Zhang, y col., Plant Cell Rep., 7: 379, 1988; Luo y Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Chrlstou, y col., Blo/Technology, 9: 957, 1991); sorgo (Sorghum bicolor, Casas, A.M., y col., Proo. Natl. Acad. ScI. U.S.A., 90: 11212, 1993); oana de azuoar (Saccharum spp. ; Bower y Birch, Plant J., 2: 409, 1992); festuoa alta (Festuca arundinacea; Wang, Z.Y. y col., Blo/Technology, 10: 691, 1992); oesped (Agrostis palustris; Zhong y col., Plant Cell Rep., 13: 1, 1993); trlgo (Triticum aestivum; Vasil y col., Blo/Technology, 10: 667, 1992; Weeks T., y col., Plant Physiol., 102: 1077, 1993; Becker, y col., Plant, J. 5: 299, 1994), y alfalfa (Masoud, S.A., y col., Transgen. Res., 5: 313, 1996). Resulta evldente para los expertos en la materia que pueden usarse varlas metodologias de transformaolon para producolon de plantas transgenloas estables de oualquler varledad de oultlvos dlana de Interes.
Procedimientos de analisis de plantas
Las plantas transformadas se analizan con respeoto a la presenola de los genes de Interes y el nlvel de expresion y/o perfll oonferldo por las seouenolas promotoras de la presente Invenolon. Los expertos en la materia oonooen numerosos procedimientos disponibles para analisis de plantas transformadas. Se usan varlos procedimientos para evaluar la expresion genloa y determlnar si el gen o los genes Introduoldos se Integran, aotuan de forma aproplada y se heredan oomo se esperaba. Para la presente Invenolon los promotores pueden evaluarse determlnando los niveles de expresion de genes con los que se unen operatlvamente los promotores. Una evaluaolon preliminar de la funolon promotora puede determlnarse por un prooedlmlento de ensayo transitorio usando genes Indloadores, pero una evaluaolon promotora mas definitiva puede determlnarse a partir del analisis de plantas estables. Los procedimientos para analisis de plantas Inoluyen pero sin llmltaolon transferenolas de Southern o transferenolas de Northern, enfoques basados en PCR, analisis bloquimloos, procedimientos de exploraolon fenotiploos, evaluaolones de oampo y ensayos Inmunodlagnostloos.
Los procedimientos de la presente Invenolon Inoluyen pero sin llmltaolon teonologias de PCR, aislamiento de ADN genomloo, oonstrucolon de una oonstrucolon de expresion, ensayos transitorios y se oonooen blen por los expertos en la materia procedimientos de transformaolon de plantas y se llevan a oabo usando teonloas oonvenolonales o modlfloaolones de las mismas.
Ensayos de pulverizacion de glifosato
En una reallzaolon se lleva a oabo una evaluaolon de Invernadero o de oampo con respeoto a la toleranola de glifosato. El termino “glifosato” se usa en el presente dooumento para referlrse ooleotlvamente al herblolda parental N-fosfonometllglloina (oonooldo de otro modo oomo aoldo de glifosato), a una sal o ester del mlsmo, o a un oompuesto que se oonvlerte a N-fosfonometllglloina en tejldos vegetales o que proporolona de otro modo N- fosfonometllgllolna en forma Ionloa (oonooldo de otro modo oomo Ion glifosato). De forma ilustrativa, se desvelan sales de glifosato solubles en agua utiles en el presente dooumento en las Patentes de Estados Unldos N2 3.799.758 y N2 4.405.531 de Franz. Las sales de glifosato que pueden usarse de aouerdo con la presente Invenolon Inoluyen pero sin restrloolon metales aloallnos, por ejemplo sodlo y potaslo, sales; sal de amonlo; sales de C1-16 alquilamonio, por ejemplo dimetilamonio e isopropilamonio; sal de C1-16 aloanolamonlo, por ejemplo monoetanolamonio; sales de C1-16 alquilsulfonio, por ejemplo trimetilsulfonio; mezolas de los mlsmos y similares. La moleoula de aoldo de glifosato tlene tres sitios aoldos que tlenen dlferentes valores de pKa; en oonseouenola pueden usarse sales mono, dl y trlbasloas o oualquler mezola de las mismas, o sales de oualquler nlvel intermedio de neutrallzaolon.
Las sales de glifosato son slgnlfloatlvas oomerolalmente en parte debldo a que son solubles en agua. Muchas sales de amonlo, alquilamonio, aloanolamonlo, alquilsulfonio y metales aloallnos son altamente solubles en agua, lo que permlte su formulaolon oomo soluolones aouosas altamente oonoentradas que pueden diluirse en agua en el punto de uso.
Dlohas soluolones aouosas oonoentradas pueden oontener de aproxlmadamente 50 a aproxlmadamente 500 g por litro de glifosato, expresado oomo equivalente de aoldo (g e.a./l). Se prefleren mayores oonoentraolones de glifosato, por ejemplo de aproxlmadamente 300 a aproxlmadamente 500 g e.a./l.
Las sales de glifosato se formulan de manera alternativa oomo oomposlolones solubles en agua o dispersables en agua, por ejemplo, en forma de polvos, granulos, granza o oomprlmldos. Tales oomposlolones se oonooen freouentemente oomo formulaolones en seoo, aunque el termino “seco” no debe entenderse en este oontexto que implique la ausenola oompleta de agua. Normalmente, las formulaolones en seoo oontlenen menos de aproxlmadamente el 5 % en peso de agua, por ejemplo de aproxlmadamente el 0,5 % a aproxlmadamente el 2 % en peso de agua. Tales formulaolones estan destlnadas para la dlsoluolon o dispersion en agua en el momento del uso.
Las formulaolones de glifosato en seoo oontempladas pueden oontener de aproxlmadamente el 5 % a aproxlmadamente el 80 % en peso de glifosato, expresado oomo equivalente de aoldo (poroentaje de e.a.). Se prefleren mayores oonoentraolones de glifosato dentro del intervalo anterior, por ejemplo de aproxlmadamente el 50 % a aproxlmadamente el 80 % e.a. Las sales de glifosato espeolalmente utiles para fabrloar formulaolones en seoo son las sales de sodlo y de amonlo.
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Las oomposioiones para el tratamiento de plantas y las oomposlolones de oonoentrado liquido y seco de la presente invenoion pueden oontener opoionalmente uno o mas prinoipios de exoipientes deseados. Los prinoipios exoipientes espeoialmente utiles para las oomposioiones de glifosato son tensioaotivos, que ayudan a retener las soluoiones de pulverizaoion aouosas en las superfioies relativamente hidrofobas de las hojas de las plantas, asi oomo ayudar al glifosato a penetrar en la oapa externa oerosa (outioula) de la hoja y por lo tanto ponerse en oontaoto oon los tejidos vivos dentro de la hoja. Los tensioaotivos tambien pueden realizar otras funoiones utiles.
No existe limitaoion en ouanto al tipo o olase quimioa de tensioaotivo que puede usarse en las oomposioiones de glifosato de la presente invenoion. En situaoiones partioulares, son del todo utiles los tipos no ionioos, anionioos, oationioos y anfoterioos, o oombinaoiones de mas de uno de estos tipos. Sin embargo, generalmente se prefiere que al menos uno de los tensioaotivos presente, si hubiese alguno, deba ser distinto de anionioo, es deoir, al menos uno de los tensioaotivos debe ser no ionioo, oationioo o anfoterioo.
Muohos tensioaotivos utiles en el presente dooumento tienen una estruotura quimioa que oomprende uno o mas restos oonsistiendo oada uno en una sola unidad de oxido de alquileno C2-4 o una oadena polimerizada o oopolimerizada de unidades de oxido de alquileno C2-4. Tales tensioaotivos se denominan tensioaotivos de polioxialquileno e inoluyen tipos anfoterioos no ionioos, anionioos y oationioos. Los tensioaotivos de polioxialquileno utiles en las oomposioiones oontempladas en la presente invenoion oontienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 unidades de oxido de alquileno C2-4. En los tensioaotivos de polioxialquileno preferidos las unidades de oxido de alquileno forman una o mas oadenas de oxido de etileno o de oxido de etileno y de oxido de propileno oopolimerizado, teniendo oada oadena de oxido de alquileno unidades que tienen un grupo hidrido terminal o una terminaoion oon proteooion alquilo C1-4 o aloanoilo C1-4.
Los restos hidrofobos de los tensioaotivos utiles en las oomposioiones de la presente invenoion pueden basarse esenoialmente en hidrooarbono, en ouyo oaso los restos hidrofobos son normalmente oadenas de alquilo, alquenilo, alquilarilo, aloanoilo o alquenoilo Ce-24, preferentemente C12-18. Estas oadenas pueden ser lineales o ramifioadas. Como alternativa, los restos hidrofobos pueden oontener atomos de silioio, por ejemplo en forma de grupos siloxano tales oomo grupos heptametiltrisiloxano, o atomos de fluor, por ejemplo, oomo oadenas de alquilo o perfluoroalquilo paroialmente fluoradas.
Entre los tensioaotivos no ionioos, las olases espeoialmente preferidas inoluyen eteres de polioxietileno de alquilo, alquenilo o alquilarilo, tales oomo alooholes primarios o seoundarios etoxilados o alquilfenoles, esteres de polioxietileno de alquilo o alquenilo, tales oomo aoidos grasos etoxilados, esteres de polioxietileno sorbitan alquilo sorbitan, esteres de glioeril alquilo, esteres de saoarosa, alquil poligluoosidos y similares. Los ejemplos espeoifioos representativos de tales tensioaotivos no ionioos inoluyen polioxietilen (9) nonilfenol, Neodol™ 25-7 de Shell (un aloohol primario lineal C12-15 de polioxietileno (7)), Tergitol™ 15-S-9 de Union Carbide (un aloohol seoundario C12-15 de polioxietileno (9)), Tween™ 20 de ICI (un monolaurato de polioxietileno de sorbitan (20)) y Agrimul™ PG-2069 de Henkel (un alquil poligluoosido C9-11).
Entre los tensioaotivos oationioos, las olases espeoialmente preferidas inoluyen alquilaminas o alquenilaminas teroiarias de polioxietileno, tales oomo aminas grasas etoxiladas, tensioaotivos de amonio ouaternario, alquileteraminas de polioxietileno, y similares. Los ejemplos espeoifioos representativos de tales tensioaotivos oationioos inoluyen polioxietilen (5) ooooamina, polioxietilen (15) seboamina, oloruro de diestearildimetilamonio, bromuro de oetiltrimetilamonio, oloruro de metil bis (2-hidroxietil)ooooamonio, oloruro de N-dodeoilpiridina y oloruro de polioxipropilen (8) etoxitrimetilamonio. Las polioxietilen alquileteraminas partioularmente preferidas son las desoritas en la Publioaoion PCT N(i) 2 WO 96/32839. En la teonioa se oonooen muohos tensioaotivos de amonio ouaternario oationioos de diversas estruoturas que son utiles en oombinaoion oon glifosato y que pueden usarse en las oomposioiones oontempladas en el presente dooumento; tales tensioaotivos de amonio ouaternario tienen la formula
(NRaRbRoRd)mAn
en la que A es un anion adeouado tal oomo oloro, bromo, iodo, aoetato, sulfato o fosfato, m y n son numeros enteros de tal manera que las oargas eleotrioas positivas sobre los oationes (NRaRbRoRd) equilibran las oargas eleotrioas negativas sobre los aniones A, y las opoiones para Ra, Rb, Ro y Rd inoluyen, sin limitaoion:
(i) Ra es benoilo o alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18 y Rb, Ro y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo;
(ii) Ra y Rb son independientemente alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18, y Ro y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo;
(iii) Ra es alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18, Rb es una oadena de polioxialquileno que tiene aproximadamente de 2 a aproximadamente 100 unidades de oxido de alquileno C2-4, preferentemente unidades de oxido de etileno, y Ro y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo;
(iv) Ra es alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18, Rb y Ro son oadenas de polioxialquileno que tiene en total de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 unidades de oxido de alquileno C2-4, preferentemente unidades de oxido de etileno, y Rd es alquilo C1-4, preferentemente metilo; o
(v) Ra es una oadena de polioxialquileno que tiene de aproximadamente de 2 a aproximadamente 100 unidades
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de oxido de alquileno C2-4, en la que predominan las unldades de oxido de alqulleno C3-4, preferentemente unldades de oxido de propileno y Rb, Rc y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo o etilo. Los tensioactivos de amonio cuaternario de este tipo particularmente preferidos son los desvelados en la Patente de Estados Unidos N2 5.464.807 de Claude y col.
En una realizacion, el anion A asociado con dicho tensioactivo de amonio cuaternario puede ser un anion de glifosato.
Entre los tensioactivos anfotericos, incluyendo como es habitual en la tecnica los tensioactivos mas debidamente descritos como zwitterionicos, clases especialmente preferidas incluye oxidos de polioxietilen alquilamina, alquilbetainas, aminoacidos sustituidos con alquilo y similares. Los ejemplos representativos de tales tensioactivos anfotericos incluyen oxido de dodecildimetilamina, oxido de polioxietilen (2) cocoamina y estearildimetilbetaina.
Las fuentes de referenda convencionales a partir de las cuales un experto en la materia puede seleccionar tensioactivos adecuados, sin limitacion con respecto a las clases mencionadas anteriormente, incluyen los documentos Handbook of Industrial Surfactants, Segunda Edicion (1997) publicado por Gower, McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents, North American and International Editions (1997) publicado por MC Publishing Company, e International Cosmetic Ingredient Dictionary, Sexta Edicion (1995) Volumenes 1 y 2, publicado por the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association.
Otros componentes opcionales de las composiciones de la presente invencion incluyen agentes para modificar caracteristicas de color, viscosidad, de gelificacion, punto de congelacion, higroscopia, comportamiento de apelmazamiento, velocidad de disolucion, dispersibilidad u otras caracteristicas de la formulacion.
Ejemplos de formulaciones de glifosato comerciales incluyen, sin limitacion, las comercializadas por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® y ACCORD®, todas ellas conteniendo glifosato como su sal de isopropilamonio; las comercializadas por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP® DRY y RIVAL®, que contienen glifosato como su sal de amonio; las comercializadas por Monsanto Company como ROUNDUP® GEOFORCE, que contienen glifosato como su sal de sodio y la que comercializa Zeneca Limited como herbicida TOUCHDOWN®, que contiene glifosato como su sal trimetilsulfonio.
La seleccion de las tasas de aplicacion para una formulacion de glifosato que sea biologicamente eficaz se encuentra dentro de la competencia de la tecnica agricola habitual. Un experto en la materia probablemente reconocera que condiciones individuales de la planta, condiciones climatologicas y condiciones de cultivo pueden influir en los resultados conseguidos en la realizacion practica del procedimiento de la presente invencion. Durante dos decadas del uso de glifosato y estudios publicados relacionados con dicho uso han proporcionado informacion abundante a partir de la cual un buen profesional del control de maleza puede seleccionar las tasas de aplicacion de glifosato que sean eficaces desde el punto de vista herbicida sobre especies particulares en fases de crecimiento particulares en condiciones de entorno particulares.
Un procedimiento de la presente invencion puede aplicarse a cualquiera y a todas las especies vegetales en las que el glifosato es biologicamente eficaz como un herbicida o como un regulador del crecimiento de las plantas. Esto incluye una variedad muy amplia de especies vegetales en todo el mundo. Del mismo modo, las composiciones de la invencion pueden aplicarse a cualquiera y a todas las especies vegetales en las que el glifosato es biologicamente eficaz.
En una realizacion, a la planta que comprende las construcciones de ADN de la presente invencion se le aplica un herbicida que contiene glifosato y las plantas se evaluan para determinar la tolerancia al herbicida de glifosato. Para someter a ensayo las plantas que comprenden las construcciones de ADN de la presente invencion puede usarse cualquier formulacion de glifosato. Por ejemplo, puede usarse una composicion de glifosato tal como Roundup Ultra™. Los parametros de ensayo para realizar una evaluacion de la planta de la tolerancia a glifosato variaran dependiendo de diversos factores. Los factores incluirian, pero sin limitacion, el tipo de formulacion de glifosato, la concentracion y la cantidad de glifosato usada en la formulacion, el tipo de planta, la fase de desarrollo de la planta durante el tiempo de la aplicacion, las condiciones ambientales, el procedimiento de aplicacion y del numero de veces en los que se aplica una formulacion particular. Por ejemplo, las plantas pueden someterse a ensayo en un entorno de invernadero usando un procedimiento de aplicacion mediante pulverizador. El intervalo de ensayo usando Roundup Ultra™ puede incluir, pero sin limitacion, de 0,56 a 17,93 kg/ha. El intervalo comercialmente eficaz preferido puede ser de 1,12 a 4.48 kg/Ha de Roundup Ultra™, dependiendo del cultivo y de la fase del desarrollo de la planta. Un cultivo puede pulverizarse al menos con una aplicacion de una formulacion de glifosato. Para ensayar en algodon, una aplicacion de 2,24 kg/ha en la fase de 3 hojas puede continuarse por aplicaciones adicionales en las ultimas fases en el desarrollo. Para el trigo puede usarse una aplicacion de 2,24 kg/Ha de Roundup Ultra™ en la fase de 3-5 hojas y puede continuarse con una aplicacion previa o posterior a la cosecha, dependiendo del tipo de trigo que vaya a ensayarse. Los parametros de ensayo pueden optimizarse para cada cultivo con objeto de encontrar la planta particular que comprenda las construcciones de la presente invencion que confiera el nivel de tolerancia a glifosato eficaz deseado desde el punto de vista comercial.
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Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invencion. Los expertos en la materia deben apreciar que las tecnicas desveladas en los ejemplos que siguen representan tecnicas que los inventores descubrieron que actuan bien en la practica de la invencion. Sin embargo, los expertos en la materia deben, a la luz de la presente divulgacion, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones especificas que se desvelan y aun obtener un resultado semejante o similar, sin separarse del espiritu y el ambito de la invencion, por lo tanto, toda la materia expuesta o mostrada en los dibujos adjuntos debe interpretarse como ilustrativa y no en sentido limitativo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Las construcciones de plasmidos usadas son construcciones de clonacion de pUC o construcciones de transformacion de plantas de doble limite que contiene un origen de replicacion de E. coli tal como ori322, un origen de replicacion de amplio intervalo de hospedador tal como oriVo oriRi, y una region codificante para un marcador de seleccion tal como Spc/Str que codifica el aminoglucosido adeniltransferasa (aadA) de Tn7 que confiere resistencia a espectinomicina o a estreptomicina, o un marcador de seleccion de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformacion en plantas, la cepa bacteriana hospedadora fue Agrobacterium tumefaciens ABI o LBA4404.
Los elementos geneticos se describen de la siguiente manera: P-e35S es el ARN 35S del VMCa que contiene una duplicacion de la region -90-300 como se describe en la Patente de Estados Unidos N2 5.424.200 ; P-FMV es el promotor 34S del Virus del Mosaico de la Higuera, como se describe en la Patente de Estados Unidos N2 5.378.619; P-eFMV es un derivado del promotor del FMV que contiene una region potenciadora duplicada del promotor del FMV; CTP2 es la region del peptido de transito de la EPSP sintasa de Arabidopsis, como se describe en la Patente de Estados Unidos N2 5.633.435; aroA:CP4syn (aroA:CP4) es la region codificante de EPSP (secuencia sintetica) de CP4, como se describe en la Patente de Estados Unidos N2 5.633.435 o ademas modificada para la expresion en plantas a base del uso de codones de especies de plantas particulares; E9 3’ es el extremo 3’ de un aislado del gen RbcS del guisante que actua como una senal de poliadenilacion; nos es el extremo 3’ del gen de nopalina sintasa que actua como una senal de poliadenilacion; Hsp70 es la secuencia lider no traducida de Petunia hybrida como se describe en la Patente de Estados Unidos N2 5.362.865; GUS es la secuencia codificante de la beta-glucuronidasa de E. coli (Jefferson, R. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 83:8447-8451, 1987); el borde derecho (BD) y el borde izquierdo (BI) son del plasmido Ti de las cepas de octopina y nopalina de Agrobacterium tumefaciens. El P-AtAct2 es el promotor del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intron en la region 5’ no traducida (UTR, acronimo de untranslated region) del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct8 es el promotor del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intron en la UTR 5’ del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; P- AtAct11 es el promotor del gen actina 11 de Arabidopsis thaliana; AtAct11i es el intron en la UTR 5’ del gen de actina 11 de Arabidopsis thaliana; P-AtActla es el promotor del gen de actina1 a de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1 a es la secuencia lider no traducida e I-AtAct1a es el intron del ADN genomico del gen de actina 1a; P-AtActlb es el promotor del gen de actina 1b de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1b es la secuencia lider no traducida e I-AtAct1b es el intron del ADN genomico del gen de actina 1b; P-AtAct3 es el promotor del gen de actina 3 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct3 es la secuencia lider no traducida e I-AtAct3 es el intron del ADN genomico del gen de actina 3; P-AtAct7 es el promotor del gen de actina 7 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct7 es la secuencia lider no traducida e I-AtAct7 es el intron del ADN genomico del gen de actina 7; P-AtAct12 es el promotor del gen de actina 12 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct12 es la secuencia lider no traducida e I-AtAct12 es el intron del ADN genomico del gen de actina 12; P-AtEF1a (P-AtEF1 o EF1a) es el promotor del gen del factor de elongacion 1a de Arabidopsis thaliana, AtEF1 a-i (AtEF1 -i) es el intron de la UTR 5’ del gen del factor de elongacion 1 a de Arabidopsis thaliana.
Las Figuras 1-18 proporcionan ejemplos de construcciones de transformacion en plantas que contienen de uno a tres casetes de expresion de plantas. Los expertos en la tecnica de la biologia molecular vegetal pueden construir combinaciones multiples de casetes de expresion en plantas que comprendan el promotor y los elementos geneticos de la presente invencion y pueden realizar ensayos en plantas de cultivo sin demasiada experimentacion. Las construcciones ilustradas en las figuras no deben considerarse como las unicas construcciones que pueden ensamblarse, si no que unicamente sirven como ejemplos para los expertos en la tecnica. La Figura 1 (pCGN8086) proporciona un ejemplo de una construccion de transformacion en plantas que contiene un casete de expresion que comprende un promotor de la presente invencion (P-AtAct8) unido operativamente a un gen de interes (CTP2- aroA:CP4syn). La Figura 2 (pMON45325) proporciona un ejemplo de una construccion de transformacion en plantas que contiene dos casetes de expresion que comprenden al menos un promotor de la presente invencion (P-AtAct-11) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 3 (pMON45331) proporciona un ejemplo de una construccion de transformacion en plantas que contiene un casete de expresion que comprende un promotor de la presente invencion (P-AtEF1 mas intron) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 4 (pMON45332) proporciona un ejemplo de una construccion de transformacion en plantas que contiene dos casetes de expresion que comprenden al menos un promotor de la presente invencion (P-AtEF1 mas intron) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 5 (pMON9190) proporciona un ejemplo de una construccion de transformacion en plantas que contiene tres casetes de expresion en el que al menos dos promotores de la presente invencion (P-AtEF1 mas intron, AtEF1a-i; PAtAct2 mas intron, AtAct2i) estan unidos operativamente a al menos un gen de interes (CTP2- aroA:CP4syn) y el promotor P-eFMV esta unido operativamente a CTP2-aroA:CP4syn. Los casetes de expresion en
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plantas de la Figura 6 (pMON9153) son identioos a Ios ilustrados en la Flgura 4 (pMON45332), este mapa de plasmido se ilustra oon el fin de identifioar los oasetes de expresion para los datos mostrados sobre los fenotipos de plantas en las tablas de datos mostradas en la memoria desoriptiva. La Figura 7 (pCGN8099) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene dos oasetes de expresion que oomprenden promotores hibridos de la presente invenoion, P-eFMV-AtEF1a y P-e35S-AtAot8, que oonduoen la transoripoion del gen de interes (aroA;CP4syn). La Figura 8 (pCGN8088) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene dos oasetes de expresion que oomprenden un promotor de la presente invenoion, P-AtAot8 mas intron, AtAot8i, y el promotor P-eFMV que oonduoe la expresion de un gen de interes (aroA:CP4syn). La Figura 9 (pCGN8068) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene dos oasetes de expresion que oomprenden un promotor de la presente invenoion, P-AtAot2 mas intron, AtAot2i, y el promotor PeFMV que oonduoe la expresion de un gen de interes (aroA:CP4syn). La Figura 10 (pCGN8096) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene dos oasetes de expresion que oomprenden promotores hibridos de la presente invenoion, P-eFMV/-AtAot11 y P-e35S-AtAot2, que oonduoen la transoripoion del gen de interes (aroA;CP4syn). La Figura 11 (pCGN9151) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene dos oasetes de expresion que oomprenden promotores hibridos de la presente invenoion, P-eFMV-AtEF1a y P-e35S-AtAot2, que oonduoen la transoripoion del gen de interes (aroA;CP4syn). La Figura 12 (pMON10156) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene un oasete de expresion que oomprende el promotor P-eFMV que oonduoe la expresion del gen de interes aroA;CP4syn, este vector se usa oon fines oomparativos oon las seouenoias promotoras de la presente invenoion. La Figura 13 (pMON52059) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene un oasete de expresion que oomprende un promotor hibrido (P-eFMV-AtEF1a) que oonduoe la expresion del gen de interes (aroA;CP4syn). La Figura 14 (pMON54952) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene un oasete de expresion que oomprende un promotor de la presente invenoion (P-AtAotla mas intron AtAotla) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2- aroA;CP4syn). La Figura 15 (pMON54953) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene un oasete de expresion que oomprende un promotor de la presente invenoion (P-AtAot1b mas intron AtAot1b) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2-aroA;CP4syn). La Figura 16 (pMON54954) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene un oasete de expresion que oomprende un promotor de la presente invenoion (P-AtAot3 mas intron AtAot3) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2-aroA;CP4syn). La Figura 17 (pMON54955) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene un oasete de expresion que oomprende un promotor de la presente invenoion (P-AtAot7 mas intron AtAot7) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2- aroA;CP4syn). La Figura 18 (pMON54956) proporoiona un ejemplo de una oonstruooion de transformaoion en plantas que oontiene un oasete de expresion que oomprende un promotor de la presente invenoion (P-AtAot12 mas intron AtAot12) unido operativamente a al menos un gen de interes (CTP2-aroA;CP4syn).
Ejemplo 2
Las oonstruooiones de olonaoion y las oonstruooiones GUS se enumeran en la Tabla 1. El promotor y el intron de aotina 2 de Arabidopsis (numero de referenda de Genbank U41998 oomo se describe en An y col., Plant J. 10; 107121, 1996) se aislaron usando, oomo molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta (Rogers and Bendioh, Plant Mol. Biol. 5; 69, 1998) usando la SEQ ID NO 1 (oebador direoto) y la SEQ ID NO 2 (oebador inverso) en una reaooion de la siguiente manera; 0,5 pg de ADN molde, 25 pmol de oada oebador, taq polimerasa (BMB, Indianapolis, IN) usando perlas de oera para PCR “de inioio en oaliente” (hot start). Las oondioiones del termooiolador de la PCR fueron las siguientes; 94 sC durante un minuto; 30 oiolos de; 92 sC durante 40 segundos, 55 2C durante un minuto, 72 2C durante un minuto y 30 segundos; y una prolongaoion de oinoo minutos a 72 2C. La reaooion PCR se purifioo usando GeneClean II (Bio101 Ino., Vista, CA), la digestion se realizo oon Hind 111 y NooI y se ligo en la oonstruooion pMON26149 (Tabla 1) se realizo la digestion oon HindIII y NooI. Se verifioo la seouenoia del olon promotor y la oonstruooion resultante se denomino pMON26170 (Tabla 1).
Tabla 1. Construcciones de clonacion y construcciones GUS que contienen las secuencias promotoras de
Construooion
Actina y de EF1 de Arabidopsis Desoripoion Promotor*/Gen/3’
pMON26149
oonstruooion de olonaoion
pMON26170
oonstruooion de expresion en plantas Aot2/GUS/nos
pMON26171 pMON8677
oonstruooion de expresion en plantas oonstruooion de olonaoion Aot8/GUS/nos
pMON48407 pMON26152
oonstruooion de expresion en plantas oonstruooion de olonaoion Aot11/GUS/nos
pMON26177
oonstruooion de expresion en plantas EF1/GUS/nos
pMON11750
oonstruooion de expresion en plantas e35S/GUS/nos
pMON15737
oonstruooion de expresion en plantas VMH/GUS/nos
* las seouenoias promotoras de aotina y del faotor de elongaoion tambien oontienen la seouenoia intron de la UTR 5’ del gen oorrespondiente.
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Ejemplo 3
El promotor y el intron de aotina 8 de Arabidopsis (numero de referenda de Genbank U42007 como se describe en An y col., Plant. J. 10:107-121, 1996) se aislaron usando, como molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta en condiciones PCR y procedimientos de purificacion descritos en el Ejemplo 2 usando los cebadores de la SEQ ID NO: 3 (cebador directo) y SEQ ID NO: 4 (cebador inverso). El promotor se clono usando las enzimas de restriccion descritas en el Ejemplo 2, se verificaron las secuencias, y la construccion resultante se denomino pMON26171 (Tabla 1).
Ejemplo 4
El promotor e el intron de actina 11 de Arabidopsis (numero de referenda de Genbank U27981 como se describe en Huang y col., Plant Mol Biol., 33:125-139, 1997) se aislaron usando, como molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta a condiciones PCR y procedimientos de purificacion descritos en el Ejemplo 2 usando los cebadores de la SEQ ID NO: 5 (cebador directo) y SEQ ID NO: 6 (cebador inverso). El promotor se clono usando enzimas de restriccion EcoRV y Ncol y se ligaron en pMON8677 (Tabla 1), se verificaron las secuencias y la construccion resultante se denomino pMON48407 (Tabla 1).
Ejemplo 5
El promotor y el intron del factor de elongacion 1a de Arabidopsis (AtEF1a) (numero de referenda de Genbank X 16430 como se describe en Axelos y col., Mol. Gen. Genet. 219:106-112, 1989; Curie y col., NAR 19:1305-1310; Curie y col., Plant. Mol. Biol. 18:1083-1089, 1992; Curie y col., Mol. Gen. Genet. 238:428-436, 1993) se aislaron usando, como molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta en condiciones PCR y procedimientos de purificacion descritos en el Ejemplo 2 usando los cebadores de la SEQ ID NO: 7 (cebador directo) y SEQ ID NO: 8 (cebador inverso). El promotor se clono usando enzimas de restriccion HindIII y NcoI y se ligo en pMON26152 (Tabla 1) como se describe en el Ejemplo 2, se verificaron las secuencias, y la construccion resultante se denomino pMON26177 (Tabla 1).
Ejemplo 6
Las construcciones de transformacion en plantas descritas se acoplaron en Agrobacterium. La transformacion del algodon se realizo esencialmente como se describe en el documento WO/0036911. La transformacion de Arabidopsis se realizo como se describe en Ye y col., Plant. Journal 19:249-257, 1999. La transformacion del tomate se realizo como se describe en la Patente de Estados Unidos N2 5.565.347.
Ejemplo 7
Una construccion de ADN se transformo en un cultivo diana de interes mediante un sistema de administracion apropiado tal como un procedimiento de transformacion mediado por Agrobacterium (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N2 5.569.834, Patente de Estados Unidos N2 5.416.011, Patente de Estados Unidos N2 5.631.152, Patente de Estados Unidos N2 5.159.135, Patente de Estados Unidos N2 5.004.863 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N2 60/111795). Como alternativa, puede usarse un procedimiento de bombardeo con particulas (veanse, por ejemplo, las Solicitudes de Patente WO 92/15675, WO 97/48814 y la Solicitud de Patente Europea 586,355 y las Patentes de Estados Unidos N2 5.120.657, 5.503.998, 5.830.728 y 5.015.580).
Una gran cantidad de sistemas de transformacion y regeneracion y procedimientos se encuentra disponible y son bien conocidos por los expertos en la materia. Las plantas y la progenie, transformadas de manera estable, se analizan posteriormente para determinar la expresion de los genes en tejidos de interes mediante diversos procedimientos de evaluacion molecular, inmunodiagnostico, bioquimicos y/o de campo, conocidos por los expertos en la materia, que incluyen, pero sin limitacion, un ensayo de pulverizacion con una formulacion de glifosato a concentraciones eficaces desde el punto de vista comercial, realizado en una camara de cultivo o en un entorno de campo.
Ejemplo 8
Los ensayos GUS se realizaron por procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en las materia (vease por ejemplo, Jefferson y col., EMBO J. 6:3901, 1987). Para el algodon, se sometieron a ensayo plantas R0. El tejido se selecciono por tamano en diversas fases del desarrollo, se tomaron muestras y se agruparon para los analisis. El brote floral del algodon se recogio y se extrajeron muestras de tejido reproductor masculino (anteras y filamentos), muestras de tejido reproductor femenino (todo el estigma, estilo y ovario) y corola (sepalos y petalos). Para la seleccion por tamano, se seleccionaron tres brotes florales de cada fase que incluyeron diversos tamanos incluyendo pequeno (menos de 0,5 cm), mediano (de 0,5-0,7 cm) y grande (fase vela o flor abierta). Las muestras foliares se recogieron aproximadamente despues de 1-2 semanas de colocar las plantas de algodon en el invernadero y las otras muestras se recogieron aproximadamente de 1-2 meses mas tarde. Las primeras flores no se recogieron (las cinco primeras posiciones de fructificacion se dejaron intactas).
Para Arabidopsis, se analizaron plantas VI y solo se sometieron a ensayo segregantes homooigotos y heterooigotos, Se analizaron de ooho a diez suoesos por oonstruooion (oinoo plantas por suceso). Los resultados GUS para Arabidopsis representan muestras agrupadas de 8-10 suoesos. Los valores en las tablas desoritas (Tabla 2 y Tabla 3) representan la expresion GUS promedio para el tejido indioado (pmol/MU/min/mg).
5 Ejemplo 9
Las plantas se analizaron para la deteotar la expresion GUS en tejido foliar y en tejidos reproduotores inoluyendo brotes florales inmaduros y flores. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Las oonstruooiones sometidas a ensayo inoluyeron pMON48407 (P-AtAot11 + intron/GUS/nos), pMON26170 (P-AtAot2 + intron/GUS/nos), pMON26171 (P- AtAot8 + intron/GUS/nos), pMON11750 (e35S/GUS/nos), pMON26177 (P-EF1a + intron/GUS/nos), y pMON15737 10 (P-FMV/GUS/nos). Los promotores de aotina y del faotor de elongaoion oonfirieron altos niveles de expresion GUS en tejidos multiples inoluyendo tejidos reproduotores.
Tabla 2. Expresion GUS promedio en V1 de Arabidopsis
Construooion
Hoja Brote floral inmaduro Flor Gineoeo Androoeo
pMON48407
6944 7394 8359 nd nd
pMON26170
45238 74099 54502 73623 217292
pMON26171
29343 35884 37125 76311 207100
pMON11750
60844 14032 16263 35882 115049
pMON26177
47598 72871 96420 191066 507370
pMON15737
28314 57903 84457 44696 87876
Ejemplo 10
Las plantas de algodon R0 se sometieron a ensayo para determinar la expresion del gen indioador de GUS en 15 tejidos seleooionados de diversas fases de desarrollo. Los brotes florales se olasifioaron por tamano (pequeno, mediano y grande; grande = flor en vela y abierta). El androoeo representa los tejidos reproduotores masoulinos inoluyendo todo el reoeptaoulo (estigma, estilo y ovarios). La muestra de oorola estaba oompuesta de sepalos y petalos. El tejido se preparo y los ensayos GUS se realizaron oomo se desoribe en el EJEMPLO 8. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Las oonstruooiones sometidas a ensayo inoluyeron pMON48407 (P-EF1a + intron/gus/nos), 20 pMON26170 (P-AtAot2 + intron/gus/nos) y pMON48407 (P-AtAot11 + intron/gus/nos).
Se sometieron a ensayo seis plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON26177. Se sometieron a ensayo veinte plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON26170. Se sometieron a ensayo ooho plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON48407. Los resultados demuestran que los promotores de aotina y del faotor de elongaoion pueden usarse para la expresion efioaz de genes unidos operativamente, 25 partioularmente en tejidos reproduotores.
TABLA 3. Resultados de Ensayo GUS para Plantas de Algodon
Construooion Promotor/intron Tejido sometido a ensayo Resultados GUS
pMON26177
EF1a Hoja 11600
pMON26177
EF1a Corola pequena 396
pMON26177
EF1a Gineoeo pequeno 8670
pMON26177
EF1a Androoeo pequeno 13771
pMON26177
EF1a Corola mediana 362
pMON26177
EF1a Gineoeo mediano 3318
pMON26177
EF1a Androoeo mediano 8006
pMON26177
EF1a Corola grande 351
pMON26177
EF1a Gineoeo grande 500
pMON26177
EF1a Androoeo grande 15512
5
10
15
(oontinuaoion)
Construooion
Promotor/intron Tejido sometido a ensayo Resultados GUS
pMON26170
Aot2 Hoja 12718
pMON26170
Aot2 Corola pequena 1296
pMON26170
Aot2 Gineoeo pequeno 16684
pMON26170
Aot2 Androoeo pequeno 7570
pMON26170
Aot2 Corola mediana 742
pMON26170
Aot2 Gineoeo mediano 10041
pMON26170
Aot2 Androoeo mediano 7893
pMON26170
Aot2 Corola grande 289
pMON26170
Aot2 Gineoeo grande 3218
pMON26170
Aot2 Androoeo grande 42737
pMON48407
Aot11 Hoja 28289
pMON48407
Aot11 Corola pequena 10
pMON48407
Aot11 Gineoeo pequeno 40755
pMON48407
Aot11 Androoeo pequeno 47834
pMON48407
Aot11 Corola mediana 742
pMON48407
Aot11 Gineoeo mediano 52495
pMON48407
Aot11 Androoeo mediano 35573
pMON48407
Aot11 Corola grande 1072
pMON48407
Aot11 Gineoeo grande 4869
pMON48407
Aot11 Androoeo grande 42737
Ejemplo 11
Las plantas transformadas tambien se sometieron a ensayo en un ensayo de pulverizaoion en invernadero usando Roundup Ultra™, una formulaoion de glifosato, oon un dispositivo pulverizador Traok (Roundup Ultra es una maroa registrada de Monsanto Company). Las plantas estaban en la fase de oreoimiento de “dos” o mas hojas verdaderas y las hojas se seoaron antes de aplioar la pulverizaoion de Roundup ®. La formulaoion usada fue Roundup Ultra™ oomo una formulaoion de 359,52 gramos/litro e.a. (equivalente de aoido). El oalibre usado fue el siguiente;
Para un volumen de pulverizaoion de 187 litros/heotarea;
Velooidad de la boquilla; 9501 flujo uniforme Presion de pulverizaoion; 275,79 kPa
Altura de la pulverizaoion; 45,72 om entre la parte superior del dosel y la punta de la boquilla Velooidad de rastreo; 335 mm/seo., oorrespondiente a una leotura de 1950-1,0 voltios Formulaoion; Roundup Ultra™ (359,52 gramos e.a./litro)
Las oonoentraoiones de pulverizaoion variaran, dependiendo de los intervalos de ensayo deseados. Por ejemplo, para una tasa deseada de 0,56 kg/Ha se usa una soluoion de trabajo de 3,1 ml/l y para una tasa deseada de 4,48 kg/Ha se usa una soluoion de trabajo de 24,8 ml/l.
El periodo de evaluaoion variara dependiendo del oultivo, de la fase del desarrollo de la planta y del nivel de toleranoia deseado.
Ejemplo 12
Las oonstruooiones de expresion en plantas usadas para la transformaoion del tomate se indioan en la Tabla 4. Se exploraron plantas de tomate (TO) que oontenian oonstruooiones que oomprendian al menos un promotor de aotina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
o del factor de elongacion (con intron), unido operativamente a un gen de tolerancia a glifosato, aroA:CF4 en un ensayo de pulverizacion con glifosato en un invernadero con una formulacion de glifosato (Roundup Ultra™) para determinar la eficacia de conferir tolerancia a glifosato a plantas de tomate transgenicas. Opcionalmente, al menos una secuencia promotora de actina o del factor de elongacion unido operativamente a un gen aroA:CP4 y un promotor de colimovirus eFMV unido operativamente a un aroA:CP4 transformado en plantas de tomate se exploraron mediante aplicacion por pulverizacion con glifosato (Roundup Ultra™). Las plantas de tomate se pulverizaron con 3,36 kg/Ha, despues se evaluaron a las dos semanas tras la aplicacion para analisis de tolerancia vegetativa y hasta 60 dias despues de la aplicacion para analisis de tolerancia reproductora. Los resultados se muestran en la Tabla 4 y se clasifican de acuerdo con la eficacia de seleccion de lineas tolerantes reproductoras. El porcentaje de tolerancia vegetativa es el porcentaje de las lineas exploradas que demuestran tolerancia vegetativa suficiente a lesion por glifosato para considerarse para estudios posteriores de rasgos agronomicos en la preparacion de candidaturas desde el punto de vista comercial. El porcentaje de tolerancia reproductora es el porcentaje de las lineas tolerantes vegetativas que tambien demuestran tolerancia reproductora suficiente para considerarse para una evaluacion agronomica posterior. Todas las construcciones demostraron funcionalidad para proporcionar tolerancia vegetativa y reproductora a las plantas de tomate transgenicas. Diversas combinaciones de promotores son capaces de aumentar, la eficacia a la cual las lineas tolerantes vegetativas y reproductoras deben seleccionarse por exploracion en este experimento. Las construcciones que contienen el promotor EF1a de Arabidopsis se asocian mas especificamente con un elevado porcentaje de lineas tolerantes desde el punto de vista vegetativo. El promotor P-Act2 en combinacion con P-eFMV y P-AtEF1a (pCGN9190), explorados por este procedimiento, proporcionaron un aumento en el porcentaje de lineas tolerantes desde el punto de vista reproductor.
Tabla 4. Ensayos de Pulverizacion Track en Invernadero con una Tasa de Aplicacion de 3,36 kg/Ha *
Construccion Descripcion N2 de lineas sometidas a % de tolerancia % de tol.
_____________________________________ensayo________________vegetativa1_____reproduct.2
pCGN9190
eFMV/CP4 + EF1a/CP4 + Act2/CP4 930 83,2 52,4
pCGN9153
EF1a/CP4 + eFMV/CP4 391 73,9 38,9
pCGN8086
Act8/CP4 21 47,6 38,1
pCGN8099
EF1a/CP4 + Act8/CP4 71 84,5 36,6
pCGN8088
eFMV/CP4 + Act8/CP4 144 79,9 34,7
pMON45325
eFMV/CP4 + Act11/CP4 90 70,0 34,4
pCGN8096
Act11/CP4 + Act2/CP4 201 62,7 10,4
pCGN8067
Act2/CP4 205 67,3 8,8
* una aplicacion
1 resultados agrupados de 25 exploraciones. Puntuado 14 dias despues de la aplicacion
2 resultados agrupados de 25 exploraciones. Puntuado hasta 60 dias despues de la aplicacion____________
La produccion de semillas de tomate se usa como una medicion de la eficacia de las diversas secuencias promotoras y combinacion de casetes de expresion en la presente invencion para conferir tolerancia a glifosato a las plantas de tomate transgenicas. En la Tabla 5, se muestran los resultados de tres experimentos de campo en plantas de tomate transgenicas que contienen construcciones con los promotores de la presente invencion que conducen la expresion de la secuencia codificante aroA:CP4 para la tolerancia a glifosato. El experimento 1 es un ensayo de las plantas producidas a partir de las construcciones que contienen el promotor del virus del mosaico de la higuera (P-FMV) en la version natural y potenciada duplicada (P-eFMV) y elementos geneticos adicionales en las construcciones que tambien se encuentran en las construcciones usadas para someter a ensayo las secuencias promotoras de la presente invencion. Tambien se sometieron a ensayo otros elementos geneticos, tales como la fuente de la secuencia 5’ no traducida y el peptido transito de cloroplastos. La construccion pMON20998 comprende el P-eFMV, unido a la UTR 5’ Hsp70 de petunia, secuencia lider unida al peptido de transito de cloroplasto (CTP2), de EPESPS de Arabidopsis, unido a la region de terminacion 3’ E9. La construccion pMON20999 solo difiere de pMON20998 porque el promotor es P-FMV. La construccion pMON10156 solo difiere de pMON20998 porque el CTP es el peptido transito de cloroplasto de EPSPS de Petunia (CTP4). La construccion pMON45312 solo difiere de pMON20998 porque la secuencia lider es la secuencia lider natural del FMV.
Las plantas de tomate se transplantaron en el campo en surcos. Las plantas se trataron con pulverizador en el campo a una tasa de 3,36 kg/Ha con el herbicida Roundup. La semilla de tomate se recogio del fruto y se peso. Una linea de tomate no pulverizada sirvio como control con fines comparativos y la eficacia de cada construccion se expreso como un porcentaje del control. El resultado del experimento 1 (columna 1 de la Tabla 5) es que el promotor del FMV y el P-eFMV solo proporciona del 5-11 % de la produccion de semillas de un control sin pulverizar. El experimento 2 y 3 ensayan las construcciones de la presente invencion a diferentes localizaciones (columnas 2 y 3 de la Tabla 5). El experimento 2 se realizo en la misma localizacion que el experimento 1, las construcciones pCGN8099 (Figura 7), pCGN9151 (Figura 11) y pCGN9190 (Figura 5) se realizaron bien proporcionando 25-46 % de la semilla con respecto a un control no pulverizado. En una localizacion diferente que tenia una estacion de cultivo mas fria, el experimento 3 demostro que pCGN8068 (Figura 9), pCGN8088 (Figura 8), pCGN8099, pCGN9151, pCGN9153 (Figura 6) y pMON45325 (Figura 2) eran capaces de conferir suficiente tolerancia a glifosato para los tomates hasta ajustar el 34-77 % de semillas normales de ajuste con respecto a un control no tratado.
Tabla 5. Experimentos de produccion de semillas de tomate
Exp. 1 Peso en gramos de la semilla % de control Exp. 2 Peso en gramos de la semilla % de control Exp. 3 Peso en gramos de la semilla % de control
pMON20998
0,52 5,3
pMON20999
0,84 8,6
pMON10156
0,50 5,1
pMON45312
1,07 11,0
pCGN8068
0,48 8,4 7,06 77,8
pCGN8088
0,43 7,6 3,09 34,1
pCGN8096
0,40 7,0
pCGN8099
1,85 32,5 6,93 76,4
pCGN9151
1,46 25,7 6,11 67,4
pCGN9153
0,68 12,0 4,03 44,4
pCGN9190
2,64 46,4
pMON45325
0,31 5,4 3,37 37,2
pCGN8067
Control
9,73 100,0 5,69 100,0 9,07 100,0
Ejemplo 13
Las SEQ ID NO: 1-8 y las SEQ ID NO: 13-21 son cebadores de PCR dlsenados a partir de la Informaclon de secuencla dlsponlble publlcamente para genes de Arabidopsis thaliana Actl, Act2 (Genbank N2 U41998), Act3, Act7, 5 Act8 (Genbank N2 ATU42007), Act11 (Genbank N2 ATU27981), Act12 y Elf1 a (Genbank N2 X 16430). Estas secuenclas se usan para prolongar la secuencla de acido nucleico usando tecnlcas de amplificacion por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (vease por ejemplo, Mullis y col, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1986; Erlich, y col., Solicitud de Patente Europea; 50,424; Solicitud de Patente Europea 84,796, Solicitud de Patente Europea 258,017, Solicitud de Patente Europea 237,362; Mullis, Solicitud de Patente Europea 201,184; Mullis, y col, 10 Patente de Estados Unidos N2 4.683.202; Erlich, Patente de Estados Unidos N2 4.582.788; y Saiki, y col, Patente de Estados Unldos N2 4.683.194). Los expertos en la tecnica conocen dlversos procedimientos de amplificacion por PCR y se usan para identificar secuenclas de acido nucleico adyacentes a una secuencla conoclda. Por ejemplo, se han descrlto procedimientos de PCR Inversa (IPCR), que se usan para amplificar secuenclas de ADN desconocldas adyacentes a una region nucleo de secuenclas conocldas. Otros procedimientos tambien se encuentran disponibles 15 tales como PCR de captura (Lagerstrom M., y col., PCR Methods Applic. 1:111, 1991) y PCR andante (Parker y col., Nucleic Acids Res 19:3055, 1991). Dlversos fabrlcantes tambien han desarrollado kits basados en modificaciones de estos procedimientos con objeto de Identificar secuenclas de Interes. Los adelantos tecnicos que Incluyen mejoras en el diseno de cebador y adaptador, mejoras en la enzima polimerasa y capacldades de termociclador han facilitado procedimientos mas rapidos y eflcaces para aislar secuenclas de Interes.
20 Tabla 5. Secuencias de cebadores para el aislamiento de secuencias promotoras de actina y EF1a de
Arabidopsis
At. Actina 2 dlrecto: At. Actina 2 Inverso: At. Actina 8 dlrecto: At. Actina 8 Inverso: At. Actina 11 dlrecto: At. Actina 11 Inverso: At. EF1a dlrecto:
TTTTTTTTGATATCAAGCTTCAACTATTTTTATGTATGCATAAT TC GCCTCAGCCATGGTGAGTCTGCTGCAAACACACAAAAAGA GTTCAAT TTTTTTTTGATATCAAGCTTCCATTTTTCT TTTGCATAAT TC GCATCGGCCATGGTGAGTCTTCTGCAATCAAAAACATAAA GATCTGA TTTTTTTTTAAGCTTGATATCACAACCAAATGTCAAATGG CCATCTGCCATGGTCTATATCCTGTC TTTTTTTTTAAGCTTGATATCGGAAGTTTCTCTCTTG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
At. EF1a inverso:
At. Actina 1a directo: At. Actina 1b directo: At. Actina 1 inverso: At. Actina 3 directo: At. Actina 3 inverso: At. Actina 7 directo: At. Actina 7 inverso: At. Actina 12 directo:
(continuacion)
cttttcccatggtagatctctggtcaacaa atc
cccaagcttaaatgacatcagatacacgc
cataagcttagaggtccaaattca
ccatcagccatggtcttctacctttatgcaaa
ccaagcttaccacactcagatgcataaacaaacaca
catcagccatggtctactctctgcaaaaaca
gcaaagcttactagtcaacaattggcc
gatcggccatggttcactaaaaaaaaag
ggaagcttgcggccgctttctactctacatgtttct
Se homogeneizaron hojas de plantas jovenes de Arabidopsis thaliana (1 g) en 9 ml de tampon CTAB (Saghai Maroof y col. 1984, PNAS 81:8014-8018). El tampon CTAB contenia TrisHCl 100 mM, pH 7,8, NaCI 700 mM, EDTA 50 mM, CTAB (bromuro de alquiltrimetilamonio) al 1 % y 2-mercaptoetanoI 140 mM. Despues de 90 minutos de incubacion a 65 2C, se anadieron 4,5 ml de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y las muestras se mezclaron durante 10 minutos. La capa acuosa se separo por centrifugacion durante 10 minutos a 1500 g y se volvio a extraer con cloroformo: alcohol isoamilico. Despues de una segunda centrifugacion, la capa acuosa se transfirio a un tubo contenia 50 ml de ARNasa 10 mg/m (sin ADNasa) y se incubo a temperatura ambiente durante 30 minutos para retirar el ARN. El ADN se precipito con 6 ml de isopropanol y se volvio a suspender en 1 ml de tampon TrisHCl 10 mM, pH 8,5. La solucion de ADN se extrajo una vez con un volumen igual de fenol y una vez con un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamilico. Despues de la centrifugacion, se anadio un volumen de 1/10 de acetato de sodio (3 M, pH 5,2) a la capa acuosa, seguido por un volumen de 2,5 de etanol. El ADN se ensarto, se lavo en etanol al 70 % y despues se seco al aire y se volvio a suspender en 0,2 ml de tampon T risHCI 10 mM.
El ADN genomico de Arabidopsis (100 ng) se uso en reacciones PCR de 50 ml. Las reacciones contenian los cebadores mostrados en la Tabla 5 que contenian soluciones de cebador inverso y directo de 0,2 mM, los dNTP 200 nM y tampon de PCR con mezcla de magnesio y ADN polimerasa del sistema PCR Expand High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals). Despues de 2 minutos de desnaturalizacion iniciales a 94 2C las reacciones se ciclaron 35 veces durante 0,5 minutos a 94 2C, 0,5 minutos a 55 2C y 1,5 minutos a 72 2C. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Los fragmentos de ADN aislados en gel, que representaban secuencias de actina 1a, actina 1b, actina 7 y actina 12, se fosforilaron con ADN quinasa de T4 y se ligaron a una construccion de clonacion pUC19 de corte Sma I y desfosforilada. Las colonias blancas se exploraron para detectar la presencia de insertos apropiados y se secuenciaron con M13 para confirmar la presencia de promotores de actina. Los clones seleccionados se denominaron pMON54941 (P-AtAct1a), pMON54942 (P-AtActlb), pMON54943 (P-AtAct7) y pMON54944 (P-AtAct12). Posteriormente, los fragmentos de ADN promotores de actina se liberaron por digestion con Hind III y Ncol de las construcciones pUC19 que contenian las secuencias inserto, los fragmentos de ADN se aislaron en gel y se ligaron a pMON26165 que se habia digerido con las mismas enzimas de restriccion. Un producto PCR para el promotor de actina 3 (P-AtAct3) se digirio con Hind III y Nco I y se clono directamente en pMON26165 para formar pMON54951. pMON26165 contenia el segmento del gen terminador GUS/nos. El ligamiento con los segmentos promotores permite ensayar cada promotor para detectar la actividad funcional por la expresion de la enzima p-glucuronidasa en celulas vegetales. Las celulas vegetales pueden aislarse, por ejemplo, protoplastos foliares de tabaco o las celulas vegetales pueden incluirse en un tejido u organo vegetal, tal como, hoja, raiz, cotiledon, hipocotiledon, embrion, flor u organo de almacenamiento.
El nivel de expresion de GUS conducido por esos promotores se sometio a ensayo en hipocotiledones de soja en comparacion con GUS conducido por el promotor P-e35S (Tabla 6). Despues se bombardeo con particulas de oro/ADN de plasmido a hipocotiledones de soja tras 48 horas se sometio a ensayo la actividad GUS histoquimicamente. Todos los promotores actina sometidos a ensayo en este analisis mostraron actividad funcional en el tejido hipocotiledon demostrando su utilidad para la expresion de transgenes en especies de plantas de cultivo heterologas. Las construcciones que contenian EPSPS de aroA:CP4 conducidas por los promotores de Arabidopsis actina 1a, (pMON54952), actina 1b (pMON54953), actina 3 (pMON54954), actina 7 (pMON54955) y actina 12 (pMON54956) de la presente invencion se prepararon en construcciones de transformacion de plantas binarias de Agrobacterium para determinar la expresion estable del EPSPS resistente a glifosato en plantas de cultivo. Estas construcciones se transformaron en celulas de soja y de algodon, las celulas se seleccionaron y se regeneraron en plantas sobre glifosato que contenia medio de cultivo tisular y despues se sometieron a ensayo para determinar la expresion de la proteina aroA:CP4 y para determinar la tolerancia a la aplicacion de glifosato. Las plantas que demostraron tolerancia a glifosato comercialmente aceptables se desarrollaron posteriormente por procedimientos de cultivo convencionales para transferir el rasgo de tolerancia a glifosato en el plasma germinal adaptado para el cultivo.
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 6. Actividad de diferentes promotores de actina de Arabidopsis en un ensayo transitorio en
comparacion con P-e35S.
Construccion
Actividad GUS
Pe35S/GUS
+++
P-AtAct1 a/GUS
++
P-AtAct1 b/GUS
++
P-AtAct3/GUS
++
P-AtAct7/GUS
++
P-AtAct12/GUS
+
Ejemplo 14
La produccion de algodon se oorrelaoiona con el numero de cuadrados estableoidos durante las ouatro a olnoo prlmeras semanas de la cuadratura. La conservacion de estos cuadrados a bolas maduras y su contribucion para la cosecha del hilo de algodon es un componente clave de la produccion. Cuando se determina la eficacia de construcciones transgenicas para conferir tolerancia a herbicida en algodon, la cantidad de conservacion de bolas es una medicion de eficacia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodon transgenicas que contienen promotores de la presente invencion (Tabla 7) se sometieron a ensayo en condiciones de invernadero para la conservacion de bolas. Los promotores dirigen la expresion de la secuencia codificante aroA:CP4 para el fenotipo tolerante a glifosato. Las plantas se transformaron mediante un procedimiento mediado por Agrobacterium o mediante un procedimiento de bombardeo con particulas. Las construcciones de bombardeo de particulas contenian un GUS adicional que contenia un casete de expresion util para localizacion histoquimica de la actividad de la p- glucuronidasa a partir de los promotores de la presente invencion. Las plantas transgenicas se degeneraron en medio que contenia glifosato y las plantas se enraizaron en un medio de enraizamiento. Las plantulas enraizadas se sembraron en el suelo y se transfirieron a una camara de cultivo durante un periodo de endurecimiento. Las semillas de estas lineas de planta se recogieron y se plantaron. Quince plantas de cada linea se pulverizaron con glifosato a 3,36 kg/Ha en la fase de 4 hojas. Al menos 8 plantas supervivientes de cada linea se pulverizaron de nuevo en la fase de 8 hojas con glifosato a 3,36 kg/Ha. Al llegar a la madurez, se conto el numero de bolas de la primera posicion para las cinco primeras bolas. Estas lineas que tenian 3 o mas de las primeras posiciones de bolas conservadas despues de la pulverizacion con glifosato (mapa de planta > 3) se hicieron progresar para estudio posterior. La Tabla 7 ilustra los datos producidos a partir de este estudio. El numero de lineas mapeadas indica el numero de lineas que sobrevive a la primera aplicacion con pulverizacion de glifosato. El patron comercial es la linea 1445(pMON17136) que contiene el promotor P-FMV que dirige la expresion del gen CTP2-uaroA:CP4/E9 3’, esta linea conserva menos de 1 de las 5 primeras bolas. Las construcciones, pCGN8099, pCGN9153, pCGN8088, pCGN8068 proporcionan suficiente tolerancia a glifosato reproductora en el algodon de tal manera que el 14-35 % de las lineas sometidas a ensayo de estas construcciones se hicieron progresar para ensayos agronomicos posteriores.
Tabla 7. Estudio de conservacion de bolas de algodon en invernadero
Construccion
Promotores N° de lineas mapeadas Mapa de planta >3 mapeo %> 3
pCGN8099
eFMV:EF1a + e35S:Act8 104 36 34,6 %
pCGN9153
EF1a + FMV 36 12 33,3 %
pCGN9165
EF1a + 35S/GUS 3 1 33,3 %
pCGN9152
EF1a 7 0 0,0 %
pCGN8088
Act8 + FMV 43 6 14,0 %
pCGN8086
Act8 7 0 0,0 %
pCGN8068
Act2 + FMV 37 7 18,9 %
pCGN8067
Act2 37 0 0,0 %
pCGN8084
Act2 + FMV + 35S/GUS 5 0 0,0 %
pCGN8085
Act2 + FMV/GUS 1 0 0,0 %
pCGN9164
Act11 + 35S/GUS 21 1 4,8 %
pMON45325
Act11 + FMV 43 0 0,0 %
pCGN8096
eFMV:Act11 + e35S:Act2 14 0 0,0 %
pCGN9154
eFMV:Act11 + e35S:Act2 16 1 6,3 %
Linea 1445
FMV <1,0
Ejemplo 15
La produccion de algodon se oorrelaoiona con el numero de cuadrados estableoidos durante las primeras cuatro a cinco semanas de la cuadratura. La conservacion de estos cuadrados a bolas maduras y su contribucion para la cosecha de hilo de algodon es un componente de produccion clave. Cuando se determina la eficacia de construcciones transgenicas para conferir tolerancia herbicida en algodon, la cantidad de conservacion de bolas es una medida de eficacia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodon transgenicas que contienen promotores de
la presente invencion se sometieron a ensayo en oondioiones de campo en dos localizaciones para la conservacion de bolas. Las lineas de algodon transgenicas 502-254-2 (pCGN8068), 701-178-2 (pCGN8068), 53-2 (pCGN8088), 178-1 (pCGN9153) y 60-1 (pCGN9153) se compararon con 1445 (linea de tolerancia a glifosato) y se incluyo PM12i8bR (parental Paymaster 1218) que contenia la construccion pMON17136 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’), 5 una linea no transgenica de tipo silvestre, Coker 130. El diseno de campo es un diseno en bloque completo al azar que consiste en 2 hileras x 20-30 pies x 3 repeticiones. El glifosato se aplica como una formulacion de Roundup Ultra™ a tasas de producto de 1,38 kg ai/Ha = 1360,8 kg y producto 1,845 kg ai/Ha = 1814,4 kg en la fase de 8 hojas del desarrollo de la planta de algodon. Todas las parcelas de algodon se trataron de manera agresiva para el control de maleza y control de insectos, asi como otras entradas agronomicas tales como tiempo de siembra, fertilizacion, 10 irrigacion, uso PGR y desfoliacion. La conservacion de bola en porcentaje se determino mapeando la localizacion de
cada una de las bolas conservadas por seleccion al azar de diez plantas desde el centro de las dos hileras centrales (cinco de cada hilera) de cada parcela a mapear. El primer mapeo debe realizarse 4 semanas antes de la primera flor (mapa de media estacion), un segundo mapeo debe realizarse en la cosecha. Los datos recogidos incluyen el numero bollas de la primera posicion sobre los cinco nodos de floracion inferiores que se cuentan como una 15 indicacion de la tolerancia reproductora de las lineas de algodon transgenicas a glifosato. La Tabla 8 ilustra la
ventaja de que los promotores de la presente invencion han conferido a las plantas de algodon transgenicas para la conservacion de bolas. Esta tolerancia reproductora potenciada tiene como resultado una produccion de hilo aumentada (Tabla 9) y tambien una produccion de semilla aumentada (Tabla 10).
Tabla 8. Conservacion de bola en un mapa de planta de estacion media de bolas inferiores de las 5 primeras 20 posiciones
Localizacion 1
Localizacion 2
Sin tratar 3,36 kg/Ha 4,48 kg/Ha Sin tratar 3,36 kg/Ha 4,48 kg/H;
(17136)1445
68 67 53 81 63 62
(8068) 502-254-2
87 72 64 77 80 69
(8068) 701-178-2
85 77 60 84 86 76
(8088)53-2
89 81 80 79 76 73
(9153) 178-1
77 83 73 85 71 79
(9153) 60-1
80 89 81 77 82 87
PM1218BR
92 56 63
Tabla 9. Produccion de hilo (kilogramos/hectarea) y porcentaje de produccion (Localizacion 1)
Variedad de cultivo Sin tratar 3,36 kg/Ha 3,36 kg/Ha % 4,48 kg/Ha 4,48 kg/Ha %
8068-502-254-2-4 1235,36 1075,2 87,0 % 960,96 77,8 %
8068-701-178-2-2 1485,12 1365,28 91,9 % 1318,24 88,8 %
9153-60-1-1 1318,24 1350,72 102,5 % 1311,52 99,5 %
9153-178-1-1 1245,44 861,28 69,2 % 840 67,4 %
8088-53-2-11 1436,96 1199,52 83,5 % 1228,64 85,5 %
1445 1140,16 630,56 55,3 % 548,8 48,1 %
C130 1344 0 0,0 % 0 0,0 %
PM 1218 BR 1223,04 925,12 75,6 % 798,56 65,3 %
Tabla 10. Produccion de semillas de algodon (kiloqramos/hectarea) y produccion en porcentaje
25
(Localizacion 1)
Variedad de cultivo
Sin tratar 3,36 kg/Ha 3,36 kg/Ha % 4,48 kg/Ha 4,48 kg/Ha %
8068-502-254-2-4
3759,84 3273,76 87,1 % 2963,52 78,8 %
8068-701-178-2-2
4166,4 3943,52 94,7 % 3727,36 89,5 %
9153-60-1-1
3689,28 3822,56 103,6 % 3314,88 100,7 %
9153-178-1-1
3884,16 2637,6 67,9 % 2484,16 64,0 %
8088-53-2-11
3812,48 3304 86,7 % 3324,16 87,2 %
1445
3175,2 1818,88 57,3 % 1536,64 48,4 %
C130
3664,64 0 0,0 % 0 0,0 %
PM 1218 B/RR
3400,32 2455,04 72,2 % 2111,2 62,1 %
Ejemplo 16
La eficacia del promotor hibrido P-eFMV-AtEF1 a que conduce la expresion de la secuencia codificante CTP2- aroA:CP4 (Figura 13, pMON52059) y P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’ (pMON15737) se comparo en Arabidopsis 30 thaliana transgenica. Las plantas de Arabidopsis thaliana transgenica se produjeron por infiltracion al vacio (Bechtold
5
10
15
20
25
30
35
40
y coI., C R Acad Paris Life Sci 316: 1194-1199) las semillas se sembraron en suelo en bandejas en una camara de oultivo ajustada a 24 sC, un ciclo de 16 horas de luz (120 pE m-2 s-1) para permitir el crecimiento normal y el desarrollo de las plantas. Se seleooionaron plantas de Arabidopsis transgenioas tolerantes a glifosato suoeso V1 pMON52059 por aplioaoion de pulverizaoion del herbioida glifosato a una tasa de 1,68 kg/Ha, las plantas supervivientes se trasplantaron en maoetas individuales. Ocho plantas pMON52059 V1 y ooho plantas homooigotas pMON15737 se pulverizaron una segunda vez oorrespondiente a la observaoion de la germinaoion antes de tiempo, aproximadamente 16 dias despues de una tasa de 1,68 kg/Ha. La segunda pulverizaoion determinara la efioaoia de las dos oonstruooiones para oonferir toleranoia reproduotora. Las plantas se observaron para deteotar efeotos vegetativos de la aplioaoion de glifosato. Todas las plantas tuvieron toleranoia vegetativa oompleta y no se observaron flores anomalas. Sin embargo, el aborto de siliouas produoido indioo que la semilla no se habia estableoido en las siliouas abortadas. La oantidad total de siliouas produoidas por oada planta y las siliouas que oontenian semillas (siliouas fertiles) se oontaron y se olasifioaron. Los resultados se muestran en la Tabla 9 e indican que la oonstruooion promotora hibrida pMON52059 demostro una mejora mayor de 10 veoes en siliouas fertiles, 89 % en oomparaoion con pMON15737 al 8 %. La oantidad de estruoturas fruotiferas fertiles se relaoiona con la oantidad de semillas que pueden produoirse, esto es espeoialmente importante en oultivos cuyo rendimiento esta asooiado con el numero de semillas. Los oultivos tales oomo algodon, soja, canola, trigo y maiz son oultivos en los que la toleranoia reproduotora a glifosato es esenoial para la buena producoion.
Tabla 11. Comparacion del promotor hi'brido P-eFMV-EF1a (pMON52059) y P-FMV (pMON15737) en conferir tolerancia reproductora a glifosato en plantas de Arabidopsis.
pMON52059
Numero de Planta
Siliouas Fertiles Siliouas Totales Poroentaje de Fertilidad
8819
39 50 78,0 %
8820
626 691 90,6 %
8821
507 561 90,4 %
8822
0 69 0,0 %
8823
512 534 95,9 %
8827
326 354 92,1 %
8833
432 461 93,7 %
8838
323 374 86,4 %
Total
2765 3094 89,4 %
pMON15737
Numero de Planta
Siliouas Fertiles Siliouas Totales Poroentaje de Fertilidad
1
74 540 13,7 %
2
23 600 3,8 %
3
1 470 0,2 %
4
20 646 3,1 %
5
43 717 6,0 %
6
22 651 3,4 %
7
178 868 20,5 %
8
40 520 7,7 %
Total
401 5012 8,0 %
Ejemplo 17
El girasol (Helianthus annuus L.) es un oultivo de importanoia agronomica para el aoeite y oomo alimento. Las oonstrucoiones pMON45325 (Figura 2), pMON45332 (Figura 4) y pMON45331 (Figura 3) de la presente invenoion se transformaron en girasol. La transformaoion mediada por Agrobacterium del girasol se ha indioado (Sohrammeijer y coI.., Plant Cell Reports, 9: 55-60, 1990; dooumento EP 0 486 234). Los prooedimientos conocidos por los expertos en la materia de la transformaoion de plantas con oonstrucoiones de expresion transgenioa pueden inoluir hipoootiledones, meristemos apioales, protoplasma y otros tejidos del girasol. Las lineas de girasol transgenioas SFB250-27 oontienen el oasete de expresion de pMON20999 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’); SFB288-01, SFB295- 09 oontiene pMON45325 (eP-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’::P-AtAot11 + intron/CTP2-aroA:CP4/E93’); SFB289-01 oontiene pMON45332 (P-AtEF1a + intron/CTP2-aroA:CP4/E93’::P-eFMV/CTP2-aroA:CP4/E93’); SFB303-08, SFB303-09, SFB303-11 y HA300B oontiene pMON45331 (P-AtEF1a + intron/CTP2-aroA:CP4/E9). Estas lineas se sometieron a ensayo para determinar la toleranoia a glifosato y se muestra en la Tabla 12.
La toleranoia reproduotora a glifosato en girasol puede medirse oomo una funoion del poroentaje de oabezas normales, poroentaje de tamano de oabeza normal y producoion de polen. Estas plantas se pulverizan con glifosato a en las etapas de hoja V-4 y V-8 a una tasa de 2,14 kg/Ha o 4,48 kg/Ha. Las plantas de girasol se evaluan para determinar la toleranoia vegetativa a glifosato. La toleranoia vegetativa se oonsigue a 2,24 y 4,48 kg/Ha niveles de pulverizaoion de glifosato tanto en las etapas V4 oomo V8 del desarrollo de la planta.
Las lineas de girasol transgenioas tolerantes a glifosato vegetativo se olasifioan para el numero de oabezas poroentaje de oabezas normal, poroentaje de tamano de oabeza normal y poroentaje de liberaoion de polen normal. Estos rasgos se puntuan en un ensayo de oampo en una looalizaoion. La tabulaoion de las puntuaoiones de oabeza y producoion de polen se muestran en la Tabla 12. Las lineas seleooionadas de las oonstrucoiones de la presente invenoion muestran un mayor poroentaje de oabezas normales, generalmente un poroentaje mayor de Io normal de tamano de oabeza y una mejor liberaoion de polen.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tabla 12. Puntuaciones de resistencia a glifosato en girasol
N2 de linea
N2 de % de cabezas normal % de tamano de cabeza % de liberacion
cabezas normal de polen
SFB250-27
28 29 75 36
SFB288-01
11 36 73 73
SFB295-09
28 57 64 68
SFB289-01
13 38 92 38
SFB303-08
25 68 92 64
SFB303-09
43 81 88 88
SFB305-11
45 71 84 100
HA300B
30 100 97 97
segregante no transgenico
0 0 0 0
Ejemplo 18
Los elementos reguladores de actuacion en cis necesarios para una regulacion del promotor oorreota pueden identificarse mediante diversos medios. En un procedimiento, se realiza analisis de delecion para eliminar regiones del promotor y los fragmentos de promotor resultantes se ensayan para detectar la actividad promotora. Los fragmentos de ADN se consideran necesarios para la regulacion del promotor si la actividad del promotor truncado se modifica en comparacion con el fragmento promotor original. Aunque este analisis de delecion, puede identificar pequenas regiones de ADN que seran necesarias para la regulacion positiva o negativa de la transcripcion. Los motivos de secuencia promotora tambien pueden identificarse y pueden modificarse por ingenieria genetica nuevos promotores para contener estos elementos cis para modular la expresion de secuencias que pueden transcribirse unidas operativamente. Vease por ejemplo la Patente de Estados Unidos N2 5.223.419, la Patente de Estados Unidos N2 4.990.607 y la Patente de Estados Unidos N2 5.097.025.
Una estrategia alternativa es buscar secuencias similares entre promotores con similares perfiles de expresion. Los promotores con modelos de actividad solapantes pueden tener mecanismos reguladores comunes. Pueden usarse diversos programas informaticos para identificar, conservar e identificar motivos entre promotores incluyendo pero sin limitacion MEME, SIGNAL SCAN o GENE SCAN. Estos motivos pueden representar sitios de union para factores de la transcripcion que actuan para regular los promotores. Una vez identificados los motivos de secuencia, su funcion puede someterse a ensayo. Por ejemplo, las secuencias motivo pueden delecionarse del promotor para determinar si el motivo es necesario para una funcion de promotor correcta. Como alternativa, el motivo puede anadirse a un promotor minimo para ensayar si es suficiente para activar la transcripcion. Los elementos reguladores negativos que se sospecha pueden someterse a ensayo para detectar la suficiencia anadiendo un promotor activo y ensayar para una reduccion en la actividad del promotor. Algunos elementos reguladores de actuacion en cis pueden requerir otros elementos para funcionar. Por lo tanto, pueden someterse a ensayo elementos multiples en diversas combinaciones mediante cualquiera de los procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
Una vez identificados los elementos promotores funcionales, los elementos promotores pueden modificarse a nivel de nucleotido para influir en la union de la proteina. Las modificaciones pueden producir afinidades de union mas elevadas o mas bajas que podrian influir en el nivel de la transcripcion de este promotor.
Los elementos promotores pueden actuar de manera aditiva o sinergica para influir en actividad promotora. En ese aspecto, los elementos promotores de diferentes regiones reguladoras 5’ pueden colocarse en tandem para obtener un promotor con un espectro diferente de actividad o diferentes perfiles de expresion. Por consiguiente, combinaciones de elementos promotores de fuentes heterologas o duplicacion de elementos similares o el mismo elemento puede conferir un mayor nivel de expresion de secuencias que pueden transcribirse unidas operativamente. Por ejemplo, un elemento promotor puede multimerizarse para aumentar los niveles de expresion especificamente en el modelo afectado por el elemento promotor.
Los procedimientos tecnicos necesarios para la construccion de construcciones de expresion que contienen los nuevos elementos reguladores 5’ modificados geneticamente los conocen los expertos en la materia. Los promotores modificados por ingenieria genetica se someten a ensayo en construcciones de expresion y se ensayan transitoriamente mediante union operativa de los nuevos promotores con respecto a un gen indicador adecuado tal como GUS y se someten a ensayo en un ensayo de planta transitoria. Los nuevos promotores se unen operativamente a uno o mas genes de interes y se incorporan en una construccion de transformacion de plantas junto con uno o mas elementos reguladores adicionales y se transforman en una planta diana de interes mediante un sistema de administracion de ADN adecuado. Las plantas transformadas de manera estable y posterior progenie se evaluan mediante cualquier medio molecular de inmunodiagnostico, bioquimico, fenotipico o de campo adecuado para evaluar la caracteristica (caracteristicas) deseada.
5
10
15
20
25
30
35
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45
50
Una oonstruooion de ADN que oomprende; un oasete de expresion que comprende una seouenoia de ADN promotora que oomprende al menos un elemento en cis obtenido de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO;10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO;12, SEQ ID NO;22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO;24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO;26; una seouenoia de ADN estruotural que oodifioa una proteina util desde el punto de vista agronomioo; y una region 3’ no traduoida que aotua en plantas para provooar la adioion de nuoleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida, y la seouenoia de ADN promotora es heterologa oon respeoto a la seouenoia de ADN estruotural.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia de ADN estruotural oodifioa un gen de toleranoia a herbioidas.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a herbioidas es un gen de toleranoia a glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen de la EPSP sintasa o un gen de la glifosato oxidorreduotasa.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen aroA;CP4.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 50 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 300 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a al menos una aplioaoion de glifosato a una tasa de 1,12 kg por heotarea.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia de ADN estruotural es un gen de oontrol de inseotos Bacillus thuringiensis.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia de ADN promotora oonsiste esenoialmente en una region 5’ reguladora obtenida de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26.
Una seouenoia de ADN promotora quimerioa que oomprende al menos un elemento en cis obtenido de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SeQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26; y dioho al menos un elemento en cis esta unido operativamente a una seouenoia promotora heterologa.
Una seouenoia de ADN promotora quimerioa oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia promotora heterologa es un promotor de virus de ADN de planta.
Una seouenoia de ADN promotora quimerioa oomo se define anteriormente, en la que el promotor de virus de ADN de planta se seleooiona del grupo que oonsiste en virus del mosaioo de la ooliflor y el virus del mosaioo de la esorofularia.
Una seouenoia de ADN promotora quimerioa oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia de ADN promotora quimerioa se seleooiona del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:27, sEq ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30.
Una oonstruooion de ADN que oomprende; un oasete de expresion que oomprende una seouenoia de ADN promotora quimerioa que oomprende al menos un elemento en cis obtenida de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26; y dioho al menos un elemento en cis esta unido operativamente a una seouenoia promotora heterologa; una seouenoia de ADN estruotural; y una region 3’ no traduoida que aotua en plantas para provooar la adioion de nuoleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida, y la seouenoia de ADN promotora es heterologa oon respeoto a la seouenoia de ADN estruotural.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia de ADN estruotural oodifioa un gen de toleranoia a herbioidas.
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Una oonstruooion de ADN como se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a herbioidas es un gen de tolerancia a glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen de la EPSP sintasa o un gen de la glifosato oxidorreduotasa.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen aroA:CP4.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 50 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 300 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a al menos una aplioaoion de glifosato a una tasa de 1,12 kg por heotarea.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia de ADN estruotural es un gen de oontrol de inseotos.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de oontrol de inseotos se obtiene de Bacillus thuringiensis.
Una oonstruooion de ADN que oomprende una seouenoia de ADN promotora quimerioa seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:27, SEQ lD NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; una seouenoia de ADN estruotural; y una region 3’ no traduoida que aotua en plantas para provooar la adioion de nuoleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor quimerioo y la region 3’ no traduoida, y la seouenoia de ADN promotora quimerioa es heterologa oon respeoto a la seouenoia de ADN estruotural.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que la seouenoia de ADN estruotural oodifioa un gen de toleranoia a herbioidas.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a herbioidas es un gen de toleranoia a glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen de la EPSP sintasa o un gen de la glifosato oxidorreduotasa.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen aroA:CP4.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 50 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 300 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
Una oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente, que, ouando se introduoe en una oelula vegetal, oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a al menos una aplioaoion de la formulaoion de glifosato a una tasa de 1,12 kg por heotarea.
Una planta de oultivo transgenioa que oomprende la oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente.
Una planta de oultivo transgenioa oomo se define anteriormente, en la que dioha planta de oultivo es una espeoie de oultivo monoootiledonea.
Una planta de oultivo transgenioa oomo se define anteriormente, en la que dioha planta de oultivo es una espeoie de oultivo diootiledonea. Una planta de oultivo transgenioa oomo se define anteriormente, en la que el gen de toleranoia a herbioidas es un gen de toleranoia a glifosato.
Una planta de oultivo transgenioa que oomprende la oonstruooion de ADN oomo se define anteriormente.
Una planta de oultivo transgenioa oomo se define anteriormente, en la que dioha planta de oultivo es una espeoie de oultivo monoootiledonea.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Una planta de oultivo transgenica como se define anteriormente, en la que dicha planta de oultivo es una especie de cultivo diootiledonea. Una planta de oultivo transgenioa que oomprende la construccion de ADN como se define anteriormente.
Una planta de oultivo transgenioa como se define anteriormente, en la que dicha planta de oultivo es una especie de oultivo monocotiledonea.
Una planta de oultivo transgenioa como se define anteriormente, en la que dicha planta de oultivo es una especie de oultivo diootiledonea. Una planta de oultivo transgenioa que oomprende la construccion de ADN como se define anteriormente.
Una planta de oultivo transgenioa como se define anteriormente, en la que dicha planta de oultivo es una especie de oultivo monocotiledonea.
Una planta de oultivo transgenioa como se define anteriormente, en la que dicha planta de oultivo es una especie de oultivo diootiledonea. Una construccion de ADN que oomprende un primer oasete de expresion y un segundo oasete de expresion, en la que dioho primer oasete de expresion oomprende una seouenoia de ADN promotora que oomprende al menos un elemento en cis obtenido de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26; una seouenoia de ADN estruotural que oodifioa una proteina util desde el punto vista agronomico; y una region 3’ no traduoida que actua en plantas para provooar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor y a la region 3’ no traduoida, y la seouenoia de ADN promotora es heterologa con respeoto a la seouenoia de ADN estruotural; y dioho segundo oasete de expresion oomprende una seouenoia de ADN promotora que oomprende al menos un elemento en cis obtenido de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26; una seouenoia de ADN estruotural que oodifioa una proteina util desde el punto de vista agronomico; y una region 3’ no traduoida que actua en plantas para provooar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida, y la seouenoia de ADN promotora es heterologa con respeoto a la seouenoia de ADN estruotural.
Un prooedimiento de expresion de una seouenoia de ADN estruotural en una planta, oomprendiendo el prooedimiento:
(1) proporoionar una construccion de ADN que oomprende un promotor que es funoional en una celula vegetal, oomprendiendo el promotor al menos un elemento en cis obtenido de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, y SEQ ID NO:12; , SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID nO:26; una seouenoia de ADN estruotural que oodifioa una proteina util desde el punto de vista agronomico; y una region 3’ no traduoida que actua para provooar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida, y el promotor es heterologo con respeoto a la seouenoia de ADN estruotural; (2) introduoir la construccion de ADN en una celula vegetal; y (3) regenerar la celula vegetal para produoir la planta de forma que la seouenoia de ADN estruotural pueda expresarse en la planta.
Un prooedimiento de expresion de una seouenoia de ADN estruotural en una planta, oomprendiendo el prooedimiento:
(1) proporoionar una construccion de ADN que oomprende un promotor que es funoional en una celula vegetal, oomprendiendo el promotor una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; una seouenoia de ADN estruotural; una region 3’ no traduoida que actua para provooar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen estruotural esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida, y el promotor es heterologo con respeoto a la seouenoia de ADN estruotural; (2) introduoir la construccion de ADN en una celula vegetal; y (3) regenerar la celula vegetal para produoir la planta de forma que la seouenoia de ADN estruotural pueda expresarse en la planta.
Un prooedimiento de control de malas hierbas, oomprendiendo el prooedimiento: (1) proporoionar una planta de oultivo transformada con una construccion de ADN que oomprende un promotor que es funoional en una celula vegetal, oomprendiendo el promotor al menos un elemento en cis obtenido de una seouenoia seleooionada del grupo que oonsiste en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SeQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26; un gen de toleranoia a glifosato; y una region 3’ no traduoida que actua para provooar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que el gen de toleranoia a glifosato esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida; y el promotor es heterologo con respeoto al gen de toleranoia a glifosato; y (2) aplioar a la planta de oultivo una oantidad sufioiente de glifosato como para oontrolar malas hierbas sin danar a la planta de oultivo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Un prooedimiento de control de malas hierbas, comprendiendo el prooedlmlento; (1) proporclonar una planta de cultlvo transformada con una construccion de ADN que oomprende un promotor que es funcional en una celula vegetal, comprendiendo el promotor una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO;29 y SEQ ID NO;30; un gen de tolerancia a glifosato; y una region 3’ no traducida que actua para provocar la adicion de nucleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la secuencia de ARN; en la que el gen de tolerancia a glifosato esta unido operativamente al promotor y la region 3’ no traducida; y el promotor es heterologo con respecto al gen de tolerancia a glifosato; y (2) aplicar a la planta de cultivo una cantidad suficiente de glifosato como para controlar malas hierbas sin danar a la planta de cultivo.
listado de secuencias
<110> Fincher, Karen L. Flasinski, Stanislaw Wilkinson, Jack Q.
<120> Nuevas construcciones de expresion en plantas
<130> P 97222
<140> US 60/171.173 <141 >
<160> 30
<170> PatentIn version 3.0
<210> 1 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400> 1
ttttttttga tatcaagctt caactatttt tatgtatgc 39
<210>2 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400>2
gcctcagcca tggtgagtct gctgcaaaca cacaaaaaga gttcaat 47
<210>3 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400>3
ttttttttga tatcaagctt ccatttttct tttgcataat tc 42
<210>4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 47 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400>4
gcatcggcca tggtgagtct tctgcaatca aaaacataaa gatctga 47
<210>5 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400> 5
ttttttttta agcttgatat cacaaccaaa tgtcaaatgg 40
<210>6 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400>6
ccatctgcca tggtctatat cctgtc 26
<210>7 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400>7
ttttttttta agcttgatat cggaagtttc tctcttg 37
<210>8 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico <400>8
cttttcccat ggtagatctc tggtcaacaa atc 33
<210>9 <211 > 1219 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana <400>9
5
caactatttt
tatgtatgca agagtcagca tatgtataat tgattcagaa tcgttttgac 60
gagttcggat
gtagtagtag ccattattta atgtacatac taatcgtgaa tagtgatatg 120
atgaaacatt
gtatcttatt gtataaatat ccataaacac atcatgaaag acactttctt 180
tcacggtctg
aattaattat gatacaattc taatagaaaa cgaattaaat tacgttgaat 240
tgtatgaaat
ctaattgaac aagccaacca cgacgacgac taacgttgcc tggattgact 300
cggtttaagt
taaccactaa aaaaacggag ctgtcatgta acacgcggat cgagcaggtc 360
acagtcatga
agccatcaaa gcaaaagaac taatccaagg gctgagatga ttaattagtt 420
taaaaattag
ttaacacgag ggaaaaggct gtctgacagc caggtcacgt tatctttacc 480
tgtggtcgaa
atgattcgtg tctgtcgatt ttaattattt ttttgaaagg ccgaaaataa 540
agttgtaaga
gataaacccg cctatataaa ttcatatatt ttcctctccg ctttgaattg 600
tctcgttgtc
ctcctcactt tcatcagccg ttttgaatct ccggcgactt gacagagaag 660
aacaaggaag
aagactaaga gagaaagtaa gagataatcc aggagattca ttctccgttt 720
tgaatcttcc
tcaatctcat cttcttccgc tctttctttc caaggtaata ggaactttct 780
ggatctactt
tatttgctgg atctcgatct tgttttctca atttccttga gatctggaat 840
tcgtttaatt
tggatctgtg aacctccact aaatcttttg gttttactag aatcgatcta 900
agttgaccga
tcagttagct cgattatagc taccagaatt tggcttgacc ttgatggaga 960
gatccatgtt
catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt gaattgaaat ctgaactgtt 1020
gaagttagat
tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga atctgaacac tgtttaagtt 1080
agatgaagtt
tgtgtataga ttcttcgaaa ctttaggatt tgtagtgtcg tacgttgaac 1140
agaaagctat
ttctgattca atcagggttt atttgactgt attgaactct ttttgtgtgt 1200
ttgcagcaga
ctcaccatg 1219
<210> 10 <211> 1271 <212> ADN
10 <213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221 > miso_feature <222> (535)..(536) 15 <223> y = o o t/u
<220>
<221 > miso_feature <222> (561 )..(561)
<223> y = c o t/u <400> 10
ccatttttct tttgcataat tcatgtttat ttttttattt ttttcatctt gcataattca 60
5
tgtttaaaag
gatatataca tgggtctact acattctcct gacattacgt tttatgtgtt 120
tgtcttctga
aaataatcat caaaatattt caggacttgt ttacgttttc aggagaaaaa 180
aaataactgt
acccttttca atatagaaat aacatttgta gaaatcgtgg attttcctta 240
ataaacaatc
caaaacacga ccaccgttgt ctcctcgact cggtaacacc cgatcgccga 300
cttgaaaatt
agaagaaaaa tgaaaagaat aataaaaaaa aaaaaggaat gatgattgaa 360
getgtcatat
atgtcgaccc tatcacagtc aatccaatag cctatattcg ccaactgata 420
tatccaacgg
ctcacaaatt ttcacaaact tttcaaaaaa gtataataaa agaggctgtc 480
tgacagccat
gtcacgttat actttttcog tatgategaa atgattegte tttgyygaat 540
ttaattattt
ccaaaattga ygactctaaa gaaaaaaaaa tagtttttoa gataaacccg 600
cctatataaa
tagttcaaca ctcggtttat ttcttctccc ctcaaagaat tgcctcgtcg 660
tettcagctt
catcggccgt tgcatttccc ggegataaga gagagaaaga ggagaaagag 720
tgagccagtt
cttcatcgtc gtggttcttg tttcttcctc gatetetega tettetgett 780
ttgcttttcc
gattaaggta attaaaacct cogatotact tgttcttgtg ttggatctcg 840
attaegattt
ctaagttacc ttcaaaagtt gtttccgatt tgattttgat tggaatttag 900
atcggtcaaa
ctattggaaa tttttgatcc tggcaccgat tagctcaacg attcatgttt 960
gaettgatet
tgcgttgtat ttgaaatcga tccggatcct ttegettett ctgtcaatag 1020
gaatctgaaa
tttgaaatgt tagttgaagt ttgacttcag attctgttga tttattgact 1080
gtaacatttt
gtcttccgat gagtatggat tcgttgaaat ctgctttcat tatgatteta 1140
ttgatagata
catcatacat tgaattgaat ctactcatga atgaaaagcc tggtttgatt 1200
aagaaagtgt
tttoggtttt ctcgatcaag attcagatct ttatgttttt gattgeagat 1260
cgtagaccat
g 1271
<210> 11 <211> 1393 <212> ADN
10 <213> Arabidopsis thaliana
<400> 11
acaaccaaat
gtcaaatgga atgcatcaga gaccaaacct gtaagagtcc acaaaacaat 60
tcaaagaaag
aatatcaaca attcagagat tcaatcctaa aacaaaaaga gaactgaaac 120
caaatcgtac
ctacacgacc agtgaagata ccaatagaga gctctgttgt agaatacaac 180
acattaagcg
caattagcag aaacagtctc ttcatctgcc gatttccact tgtcactact 240
ccaaaaacct
cccaaaccat ttccaaaaca gacacttttg ccatgtctac atctttccct 300
tccccgaaaa
acacatcatt tccatcaacg gagtaaatat ccggcggcat atcgatgctc 360
gagaccgtcc
tatcgagaaa aggcttagcc gcttccgtga ccgccggcgt tcgtggaccg 420
tgagattgct
gaaacgagcg agaataagca agcctccgat cattagcagc atatccgaca 480
tcgctgctcc
gatcatcagg gagctcgtta tcgcctcgag gattaaagga aatggatctc 540
tccattttct
tctttgatct taaagttcca acttcggcaa atactaaaat caacagtcag 600
tcgtacaaag
aaactctgct tatacagtaa agtcaatggg ccactgttct aagcccatat 660
ataattttag
aagcccatag aatacaaaag agtcaagaag cattgaccgc acaagaaaaa 720
aacaattgtt
aaaaagggtt ggttagtgtg tatgtatata tgaaatgcaa caaacattat 780
acagcccatt
aaatatggtt gttataggta gatgtcccca ttaaggaact ttatccagcc 840
cattaaatta
ctttacagag taaaagagag agagaagatt tacagttacg ttaccaaatt 900
ttcgaaatga
tttaattagt aataaataaa taattaaatg tcagttactc tctttagaaa 960
gctaaataag
acagctgttt ccaccaacaa cgtgactggt cgtggggtcc tccttcgttc 1020
aaagtgatat
tcagaaatca acggctgaga tcttctccat caatatttat tacgggccta 1080
ttccttcctt
ttttaaactt caattctccg gctcacattc tcttcttcat tcgctccgtt 1140
tctctctcaa
aaactacaca cccgtaccac accaccaccc tcctcgtttc ctcagagatc 1200
ccctctctaa
cttctaaggt aatcacattt ccataacgtt ccatcgtcat tgattcttca 1260
ttagtatgcg
tttatgaagc tttttcaatt taattctctt tggtagatct taagattcct 1320
ctgtttcttg
caaaataaag ggttcaatta tgctaatatt ttttatatca attttgacag 1380
gatatagacc
atg 1393
<210> 12 <211> 1160 5 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221 > miso_feature 10 <222> (565)..(565)
<223> y = o o t/u
<220>
<221> miso_feature <222> (571)..(571) <223> y = o o t/u 5
<220>
<221 > miso_feature <222> (638)..(638) <223> n = a o g o o o t/u
10
<220>
<221 > miso_feature <222> (656)..(656) <223> n = a o g o o o t/u 15
<400> 12
ggaagtttct ctcttgaggg aggttgctcg tggaatggga cacatatggt tgttataata 60
aaccatttcc
attgtcatga gattttgagg ttaatatata ctttacttgt tcattatttt 120
atttggtgtt
tgaataaatg atataaatgg ctcttgataa tctgcattca ttgagatatc 180
aaatatttaa
tctagagaag agtgtcatat agattgatgg tccacaatca atgaaatttt 240
tgggagacga
acatgtataa ccatttgctt gaataacctt aattaaaagg tgtgattaaa 300
tgatgtttgt
aacatgtagt actaaacatt cataaaacac aaccaaccca agaggtattg 360
agtatteaeg
gctaaacagg ggcataatgg taatttaaag aatgatatta ttttatgtta 420
aaccctaaca
ttggtttcgg attcaacgct ataaataaaa ccactctcgt tgctgattcc 480
atttatcgtt
cttattgacc ctagccgcta cacacttttc tgcgatatct ctgaggtaag 540
cgttaacgta
cccttaratc gttcyttttc yttttcgtct gctgatcgtt gctcatatta 600
tttcgatgat
tgttggattc gatgctcttt gttgattnat ogttctgaaa attctnatct 660
gttgtttaga
ttttatcgat tgttaatatc aacgtttcac tgcttctaaa cgataattta 720
ttcatgaaac
tattttccca ttctgatcga tcttgttttg agattttaat ttgttcgatt 780
gattgttggt
tggtggatct atatacgagt gaacttgttg atttgcgtat ttaagatgta 840
tgtcgatttg
aattgtgatt gggtaattct ggagtagcat aacaaatcca gtgttccctt 900
tttctaaggg
taattctcgg attgtttgct ttatatctct tgaaattgcc gatttgattg 960
aatttagctc
gcttagctca gatgatagag caccacaatt tttgtggtag aaatcggttt 1020
gactccgata
gcggcttttt actatgattg ttttgtgtta aagatgattt tcataatggt 1080
tatatatgtc
tactgttttt attgattcaa tatttgattg ttcttttttt tgcagatttg 1140
ttgaccagag
atctaccatg 1160
<210> 13 <211> 29 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotido sintetico
10
<400> 13
cccaagctta aatgacatca gatacacgc 29
<210> 14 15 <211 > 24
<212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220>
<223> Oligonuoleotido sintetioo <400> 14
oataagotta gaggtooaaa ttoa 24
<210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonuoleotido sintetioo <400> 15
ooatoagooa tggtottota ootttatgoa aa 32
<210> 16 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonuoleotido sintetioo <400> 16
ooaagottao oaoaotoaga tgoataaaoa aaoaoa 36
<210> 17 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonuoleotido sintetioo <400> 17
oatoagooat ggtotaotot otgoaaaaao a 31
<210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonuoleotido sintetioo <400> 18
goaaagotta otagtoaaoa attggoo 27
<210> 19 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
<223> Oligonuoleotido sintetioo <400> 19
gatoggooat ggttoaotaa aaaaaaag 28
<210> 20 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Oligonuoleotido sintetioo <400> 20
ggaagottgo ggoogottto taototaoat gtttot 36
<210> 21 <211> 31 <212> ADN
<213> Oligonuoleotido sintetioo <400> 21
gaotagoogo oatggttoaa tototagotg a 31
<210> 22 <211> 1578 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana <400> 22
taaatgacat
cagatacacg cttgtgaacc atctttaaag tattgatgga ctcttcacta 60
tgaaagctct
ctttaaaatt aattttcttt gtacatgtct ctaagcaatg tcaaattaat 120
tagaggtcca
aattcaaaaa aatgtcgtat tgaatcattc cattactaaa ttggttcaat 180
gtcagattta
aacagcctag ggataattta gtgagatatg agattctact ttcaacatat 240
actaatccta
aatctctagc aactttttat ataagctata aatatcatga aaatgtattt 300
taatcgtttc
ataatttatg cagtcacact aatggaaaaa aggccaatta ttattatttt 360
cttcagacta
taaatgaaaa cataaattaa aatgcagatt agtttaaaat tttaataagt 420
aagtaaaatg
cttatagcct tatacaaaat catatttgga agtttctaac attgttgcaa 480
tttgttatca
caaatcacag taatatttgt atactaatta gtaattacaa ctatacacaa 540
atttaaatgg
gtaatcatat atttgtgtcc agtggattga acaaatatgc tcggcccatg 600
cggaagtaat
gccaattttg ggtgagtaaa gcccatgcga aattttcaca taagaaatgc 660
atgctttttg
ttttcaacga catgagttgc atgcttttta tcattgctta tatagttgca 720
agtttgcaac
tccttgatat tttttttatg tagacactac taccaccaaa aacttttggt 780
ctgcttattc
ttgtttacta tgtaaaaaaa ataaatgaat tgtttattta ctccgatttg 840
atggagtctg
gtttatgagg ttttatagcc tttacagaaa attgatagtt acaaaaatat 900
ttttcaaaaa
taaaagggta aaaccgtcat ttcaagttgt tattgttttg ggggactgga 960
tttgaaatga
aatatagaac cggaaaacaa ggtgagccga agtcgaagcc tttggacccg 1020
tttttatatt
tactcctccc attcccttct ccttcaatcc ttccttcctc ctcctccctt 1080
cttcttcttc
ccctctttca ttttccagcc actacaaact tttctatctc tacttttttt 1140
cctctcgatt
tcaggtactt tttgagaccc tttgttgtga ttttcgaaca cacaccccaa 1200
ttacgtttga
tttttgatcc cgcatcgatt tcaattcatc cgtttctgag tttcttttgg 1260
atctgggtgt
cttgagctaa tcttttcgat ctgttgttta tcgattttac tcatgcgtat 1320
gttcattaca
ccatttgtta tttgtttaat caaccaaaag actcatgttt ttcaaatgtc 1380
tttaatataa
tttttctgat tgaattttat aatatttaca tgattctgga tccagaatat 1440
ccttcttctt
cttccatttt gtcctgtatt gatttgtctt tgaaaaagga ttgttctttg 1500
tatctgtatt
ggtgaaaaag gattgttatt tgttgataaa aatttgatct ttaaacaatg 1560
tttggttttg
cataaagg 1578
<210> 23 <211>1468 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 23
ttagaggtcc
aaattcaaaa aaatgtcgta ttgaatcatt ccattactaa attggttcaa 60
tgtcagattt
aaacagccta gggataattt agtgagatat gagattctac tttcaacata 120
tactaatcct
aaatctctag caacttttta tataagctat aaatatcatg aaaatgtatt 180
ttaatcgttt
cataatttat gcagtcacac taatggaaaa aaggccaatt attattattt 240
tcttcagact
ataaatgaaa acataaatta aaatgcagat tagtttaaaa ttttaataag 300
taagtaaaat
gcttatagcc ttatacaaaa tcatatttgg aagtttctaa cattgttgca 360
atttgttatc
acaaatcaca gtaatatttg tatactaatt agtaattaca actatacaca 420
aatttaaatg
ggtaatcata tatttgtgtc cagtggattg aacaaatatg ctcggcccat 480
gcggaagtaa
tgccaatttt gggtgagtaa agcccatgcg aaattttcac ataagaaatg 540
catgcttttt
gttttcaacg acatgagttg catgcttttt atcattgctt atatagttgc 600
aagtttgcaa
ctccttgata ttttttttat gtagacacta ctaccaccaa aaacttttgg 660
tctgcttatt
cttgtttact atgtaaaaaa aataaatgaa ttgtttattt actccgattt 720
gatggagtct
ggtttatgag gttttatagc ctttacagaa aattgatagt tacaaaaata 780
tttttcaaaa
ataaaagggt aaaaccgtca tttcaagttg ttattgtttt gggggactgg 840
atttgaaatg
aaatatagaa ccggaaaaca aggtgagccg aagtcgaagc ctttggaccc 900
gtttttatat
ttactcctcc cattcccttc tccttcaatc cttccttcct cctcctccct 960
tcttcttctt
cccctctttc attttccagc cactacaaac ttttctatct ctactttttt 1020
tcctctcgat
ttcaggtact ttttgagacc ctttgttgtg attttcgaac acacacccca 1080
attacgtttg
atttttgatc ccgcatcgat ttcaattcat ccgtttctga gtttcttttg 1140
gatctgggtg
tcttgagcta atcttttcga tctgttgttt atcgatttta ctcatgcgta 1200
tgttcattac
accatttgtt atttgtttaa tcaaccaaaa gactcatgtt tttcaaatgt 1260
ctttaatata
atttttctga ttgaatttta taatatttac atgattctgg atccagaata 1320
tccttcttct
tcttccattt tgtcctgtat tgatttgtct ttgaaaaagg attgttcttt 1380
gtatctgtat
tggtgaaaaa ggattgttat ttgttgataa aaatttgatc tttaaacaat 1440
gtttggtttt
gcataaaggt agaagacc 1468
<210> 24 5 <211> 1642
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana <400> 24

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un prooedimiento de produooion de una planta que expresa una seouenoia de gen estruotural, comprendiendo el prooedimiento:
    (1) proporoionar una oonstruooion de ADN que oomprende un promotor que es funoional en una oelula vegetal, oomprendiendo el promotor la SEQ ID NO:28; una seouenoia de gen estruotural; y una region 3’ no traduoida que aotua para provooar la adioion de nuoleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que la seouenoia de gen estruotural esta unida operativamente al promotor y la region 3’ no traduoida, y el promotor es heterologo oon respeoto a la seouenoia de gen estruotural;
    (2) introduoir la oonstruooion de ADN en una oelula vegetal; y
    (3) regenerar la oelula vegetal para produoir una planta, de forma que la seouenoia de gen estruotural pueda expresarse en la planta.
  2. 2. El prooedimiento de la reivindioaoion 1, en el que la seouenoia de gen estruotural es un gen de toleranoia a herbioidas.
  3. 3. El prooedimiento de la reivindioaoion 1 o 2, en el que el gen de toleranoia a herbioidas es un gen de toleranoia a glifosato.
  4. 4. El prooedimiento de una oualquiera de las reivindioaoiones 1 a 3, en el que el gen de toleranoia a glifosato es un gen de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa o un gen de la glifosato oxidorreduotasa.
  5. 5. El prooedimiento de una oualquiera de las reivindioaoiones 1 a 4, en el que el gen de toleranoia a glifosato es un gen aroA:CP4.
  6. 6. El prooedimiento de una oualquiera de las reivindioaoiones 1 a 5, en el que la oonstruooion de ADN oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 50 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
  7. 7. El prooedimiento de una oualquiera de las reivindioaoiones 1 a 6, en el que la oonstruooion de ADN oonfiere a la oelula vegetal toleranoia a una formulaoion de glifosato aouosa que oomprende al menos 300 gramos de equivalente de aoido por litro de glifosato.
  8. 8. El prooedimiento de una oualquiera de las reivindioaoiones 1 a 7, en el que la planta es alfalfa, broooli, repollo, oolza, ooliflor, maiz, algodon, arandano, pepino, leohuga, guisante, alamo, pino, patata, oebolla, arroz, frambuesa, soja, oana de azuoar, remolaoha azuoarera, girasol, tomate o trigo.
  9. 9. El prooedimiento de una oualquiera de las reivindioaoiones 1 a 8, en el que la planta es algodon, tomate, oolza, soja o girasol.
  10. 10. Una planta de oultivo transgenioa que oomprende una oonstruooion de ADN que oomprende la seouenoia de ADN promotora quimerioa de la SEQ ID NO:28 y una region 3’ no traduoida que aotua en plantas para provooar la adioion de nuoleotidos poliadenilados al extremo 3’ de la seouenoia de ARN; en la que una seouenoia de gen estruotural esta unida operativamente al promotor quimerioo y la region 3’ no traduoida, y la seouenoia de ADN promotora quimerioa es heterologa oon respeoto a la seouenoia de gen estruotural.
  11. 11. La planta de oultivo transgenioa de la reivindioaoion 10, en la que dioha planta de oultivo es una espeoie monoootiledonea o una diootiledonea.
  12. 12. La planta de oultivo transgenioa de la reivindioaoion 10 u 11, en la que la planta es alfalfa, broooli, repollo, oolza, ooliflor, maiz, algodon, arandano, pepino, leohuga, guisante, alamo, pino, patata, oebolla, arroz, frambuesa, soja, oana de azuoar, remolaoha azuoarera, girasol, tomate o trigo.
  13. 13. La planta de oultivo transgenioa de una oualquiera de las reivindioaoiones 10 a 12, en la que el gen estruotural es un gen de toleranoia a glifosato.
  14. 14. La planta de oultivo transgenioa de una oualquiera de las reivindioaoiones 10 a 13, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen de la EPSP sintasa o un gen de la glifosato oxidorreduotasa.
  15. 15. La planta de oultivo transgenioa de una oualquiera de las reivindioaoiones 10 a 14, en la que el gen de toleranoia a glifosato es un gen aroA:CP4.
    imagen1
    imagen2
    P-eFMV
    CTP2 \
    aroA:CP4syn
    Spc/Str
    pMON45325 12660 pb
    P-AtActl 1
    AtActHi
    aroA:CP4syn
    Notl 2071
    FIG. 2
    imagen3
    imagen4
    CTP2
    P-eFMV aroA:CP4syn
    aroA:CP4syn
    pMON45332 13777 pb
    P-At EF1 + intron
    RB Spc/Str
    FIG. 4
    Notl 4705
    Notl 8125
    imagen5
    P-eFMV
    L-HSP70 \^XX CTP2 >kXX aroA:CP4syn \p E9 3'
    P-AtEF1a A AtEF1a-i
    CTP2
    pCGN9190 aroA:CP4syn 22146 pb
    " oriColEI Gent
    P-AtAct2
    AtAct2i CTp2 ±
    aroA:CP4syn / E9 3' ><
    FIG
    5
    imagen6
    imagen7
    imagen8
    oriColEI
    P-eFMV
    L-Hsp70
    CTP2
    aroA:CP4syn
    pCGN8088 18722 pb
    P-AtAct8
    AtAct8i CTP2,
    aroA:CP4syn
    FIG. 8
    imagen9
    imagen10
    CTP2
    aroA:CP4syn E9 3
    /'AtAct2i
    P-AtAct2
    pCGN8096 aroA:CP4syn 13929 pb
    CTP2 * AtActHi
    P-AtAct11
    P-eFMV
    Spc/Str
    Notl 9900
    Notl 6205
    Notl 5608
    FIG. 10
    imagen11
    aroA:CP4syn
    AtAct2i
    P-AtAct2
    pCGN9151 13695 pb
    aroA:CP4syn
    aadA
    AtEF1-i P-eFMV \P-AtEF1 _
    Not! 9662
    Notl 5608
    FIG. 11
    imagen12
    imagen13
    P-eFMV
    P-AtEF1a
    pMON52059 11316 pb
    AtEF1a-i
    aroA:CP4syn
    FIG. 13
    imagen14
    aadA
    P-AtAct1a
    L-AtAct1a
    !-AtAct1a
    PMON54952 9052 pb
    FIG. 14
    imagen15
    imagen16
    imagen17
    imagen18
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