JPH06504668A - 果実の成熟および植物の老化の制御 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 果実の成熟および植物の老化の制御 発明の分野 本発明は、一般的には植物分子生物学に関し、さらに詳しくは果実および野菜の 成熟の制御ならびに植物における老化の効果の制御、また所望の制御に影響可能 な組換えＤＮＡ分子に関する。

発明の背景 果実、野菜および切花の産業が直面している大きな問題の一つには、損傷により かなりの量の商品の損失があることである。果実および野菜生産物は、農場から 出荷されてから小売または加工販路に到達するまでに、その１２〜２０％が損傷 を受けると評価されている。切花工業においては、効果的に売りさばかれる前の 花の老化（凋萎または乾燥）が重要な問題である。果実、野菜および切花に認め られる傷みや老化過程が多くの望ましくなものは、商品の短い収穫期間と層積後 の商品の短い貯蔵寿命である。さらに、これらの損傷による損失は、最終的には 、消費者への商品価格の上昇にはねかえることになる。

果実および野菜の損傷の一次的原因は、果実または野菜の自然の成熟過程にある 。果実または野菜は熟するはと、柔らかくなり、また病気や他の損傷起因物質の 影響を受けやすくなる。植物中てのエチレンの生成が果実の成熟を刺激し、果実 や野菜の成熟におけるキー成分であることが知られている。生産物の保存寿命お よび／または収穫時期の延長を目指して、果実や野菜の成熟の制御が試みられて きた。これらの試みの多くは、果実や野菜自体への化学物質の局所適用である。

これらの化学的解決は、農場の植物への直接適用または果実もしくは野菜自体へ の収穫後適用であった。これらの方法のいくつかは、米国特許第４．９５７．７ ５７号または米国特許第４．８５１．０３５号に記載されている。環境へのこれ 以上の侵襲を低減することの重要性か増大していることから、化学的方法以外の 方法による成熟の制御が、この業界に対して有利かつ存益てあろうと考えられる 。

さらに最近になって、トマトの成熟の制御を目指して、植物のエチレン合成を遮 断する分子生物学的アプローチが用いられるようになった。このアプローチには 、トマトの苗木の、エチレンの合成を阻害するアンチセンス遺伝子による形質転 換が包含される。このアンチセンス遺伝子は、１−アミノシクロプロパン−１− カルボン酸（ＡＣＣ）のエチレン形成酵素ＡＣＣオキシダーゼによるエチレンへ の変換に関与するポリペプチドをコードする（＋）鎖ｍ　ＲＮ　Ａの定常状態レ ベルを低下させる（−）鎖ＲＮＡを生成する（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９９０） 　。この方法は、ある程度の有用性を示すものの、アンチセンス遺伝子は多分、 種もしくは遺伝子特異的であって、形質転換を所望する植物の種ごとに別のアン チセンス遺伝子を獲得する必要があることから、他の植物へのこの技術の応用は 容易でも効率的でもないと思われる。

したがって、果実、野菜および切花の産業には、広範囲の植物種にわたって容易 かつ効率的に利用できる、果実の成熟および植物の老化の制御のための非化学的 方法がめられている。

発明の要約 果実および野菜の成熟の制御ならびに切花における老化の効果の制御の方法が提 供される。一般的には、この方法は、所望の植物組織におけるＡＣＣ代謝酵素、 すなわち組織のＡＣＣレベルを低下させ、したがって所望の植物組織のエチレン のレベルを減少させる酵素の、発現に関する。さらに詳しくは、植物細胞内にお いてＲＮＡ配列の産生を惹起する機能をもつプロモーター、ＡＣＣデアミナーゼ 酵素をコードするＲＮＡ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配列および植物細胞内 においてＲＮＡ配列の３゛末端への一連のポリアデニル化ヌクレオチドの付加を 惹起する機能をもつ３゛非翻訳領域からなり、上記プロモーターは上記構造ＤＮ Ａ配列に関して異種である、キメラ遺伝子で植物細胞を形質転換し、ついてその 植物を成熟まで成長させることからなる。果実中におけるＡＣＣデアミナーゼの 発現は、成熟過程を遅延させ、それが収穫時期および生産品の貯蔵寿命を延長さ せることになる。同様に、切花産業における使用に適した植物種でのＡＣＣ代謝 酵素の発現は、花の老化を遅延させ、その結果、貯蔵寿命および花の市場性か延 長される。

本発明の他の態様においては、植物細胞内においてＲＮＡ配列の産生を惹起する 機能をもつプロモーター、ＡＣＣデアミナーゼ酵素をコードする構造ＤＮＡ配列 、およびＲＮＡ配列の３′末端への一連のポリアデニルヌクレオチドの付加を惹 起する機能をもつ３′非翻訳領域がらなり、プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関 して異種である、組換え二重鎖ＤＮＡ分子も提供する。これにより、成熟および 老化を制御するため、ＡＣＣデアミナーゼを発現できる植物を得ることができる 。植物細胞におけるＡＣＣデアミナーゼの発現は、植物におけるエチレンの産生 が減少することにより、生産品の収穫時期および貯蔵寿命を延長させる。

本発明の多くの目的の中で、主要な一つの目的は、多くの植物種に効果的に広く 適用可能な分子生物学的技術を利用して、植物の成熟および老化を制御する方法 を提供することにある。

本発明の他の目的は、植物中に発現するＡＣＣ代謝酵素、たとえばＡＣＣデアミ ナーゼまたはＡＣＣマロニルトランスフェラーゼを用いＡＣＣの定常状態レベル を低下させることによって、植物中てのエチレンの産生を制御し、果実、野菜お よび花の収穫時期および貯蔵寿命を延長させる方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、植物中で酵素ＡＣＣデアミナーセを発現させること によって、植物中でのエチレンの合成を低下させることにある。

本発明のさらに他の目的は、花に、酵素ＡＣＣデアミナーセを発現させることに よって、花でのエチレン合成による老化作用を低下させて、切花の市場寿命を延 長させることにある。

本発明のさらに他の目的は、果実をつるで成熟させる場合でもまた発生の未熟段 階て摘取してその後に成熟させる場合でも、果実の成熟を遅延させることができ るように、植物中で酵素ＡＣＣデアミナーゼを発現する形質転換植物を提供する ことにある。

本発明はまた、植物の果実で特異的にＡＣＣデアミナーゼを発現できる担果実植 物を提供することを、その主要な目的とするものである。

本発明の他の目的は、添付の図面を参照しなから以下の説明および特許請求の範 囲を読むことによって明確になろう。

図面の簡単な説明 図１はＡＣＣデアミナーゼのスクリーニングに使用された細菌コレクションの目 録を例示する。

図２はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏａｐｈｉｓ　（単離株６Ｇ５）か らのＡＣＣデアミナーセ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号ｌ）を示す。

図３はｐＭＯＮ９７７のプラスミド地図を例示する。

図４はｐ　Ｍ　ＯＮ　＋００２８のプラスミド地図を例示する。

図５はｐ　Ｍ　ＯＮ　１００３７のプラスミド地図を例示する。

図６はｐ　Ｍ　ＯＮ　１００５４のプラスミド地図を例示する。

図７はｐ　ＭＯＮ＋１０２７のプラスミド地図を例示する。

図８はｐＭＯＮ７２５８のプラスミド地図を例示する。

図９はｐＭＯＮＩＩ０１４のプラスミド地図を例示する。

図１０はｐＭＯＮ９８１のプラスミド地図を例示する。

図１１はｐ　Ｍ　ＯＮ　１１０１６のプラスミド地図を例示する。

図１２はｐ　ＭＯＮ１１０３２のプラスミド地図を例示する。

図１３はｐ　Ｍ　ＯＮ　＋００８６のプラスミド地図を例示する。

図１４は５’ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’　ＢｇｌｌＩ制限部位（下＃Ｉ）を有す る果実特異的プロモーターＥ８のヌクレオチド配列（配列番号１０）を例示する 。

図１５はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）デカルボキンラーセ遺伝子のヌク レオチド配列（配列番号９）を例示する。

図１６はＡＣＣシンターセ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）を例示する 。

図１７は単離株３Ｆ２から単離されたＡＣＣデアミナーゼ遺伝子のヌクレオチド 配列（配列番号１５）を例示する。

図１８は対照トマト果実とＡＣＣデアミナーセを発現するトランスジェニックト マト果実におけるエチレンレベル間の関係をグラフて示す。

図１９はｐ　Ｍ　ＯＮ　１１０３０のプラスミド地図を例示する。

図２０は葉緑体トランジットペプチドＣＴＰ２のＤＮＡ配列（配列番号１３）を 例示する。

図２１はＣＰ４合成５−エノールビルビル−３−シキミ酸ホスフェートシンター ゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１４）を例示する。

図２２はゴマノハグサモザイクウイルスからの完全長転写プロモーターのＤＮＡ 配列（配列番号１７）を例示する。

好ましい実施態様の詳細な説明 植物におけるエチレン産生の代謝経路は次の通りである。

植物組織でのエチレンの生合成を阻害するための一つの可能性のある方法は、■ −アミノシクロプロパンー１−カルボン酸（以下ＡＣＣ）を代謝させ、それを代 謝プールから除去することであろう。ＡＣＣ代謝酵素かエチレン生合成の阻害に 十分なまでＡＣＣのレベルを低下させることができるか否かは不明であったが、 このアプローチが検討された。多数の酵素がＡＣＣを代謝できる。ＡＣＣ代謝酵 素の例にはＡＣＣデアミナーゼおよびＡＣＣマロニルトランスフェラーゼがある 。ＡＣＣデアミナーセ酵素はＡＣＣをα−ケト酪酸とアンモニアに変換すること によって代謝する。すなわち、もし十分な速度論的能力をもつ酵素ＡＣＣデアミ ナーゼ、または他のＡＣＣ代謝酵素が植物中に十分なレベルで発現できれば、エ チレンの合成は、ＡＣＣ代謝酵素か発現する組織における代謝プールからのＡＣ Ｃの除去により、阻害されるはずである。本発明の重要な態様は、植物組織にお けるＡＣＣの定常状態レベルを低下させ、これによって植物組織におけるエチレ ンのレベルを低下させることにより、果実の成熟および植物の老化を遅延させる 機構を提供することである。植物中のエチレンまたはＡＣＣの定常状態濃度は、 非修飾栽培種の正常レベルから少なくとも約７０％程度低下させることか好まし い。好ましくは、エチレンまたはＡＣＣ濃度は正常レベルから少なくとも約９０ ％程度低下させる。植物または植物の果実中のＡＣＣまたはエチレンの定常状態 レベルの低下は、様々な方法で達成できると考えられるが、これらはすへて、本 発明の範囲内に包含されるものである。

果実の成熟の遅延に関しては、つるの上での成熟からは１〜３０日間遅延させる ことが好ましい。この遅延は、成熟の開始から、とくにトマトの場合には、果実 が成熟のブレーカ一段階に到達したときから起算する。同様に、果実は好ましく は、つるから摘取後１〜９０日、さらに好ましくは５〜３０日成熟を遅延させる 。トマトに関しては、この成熟の遅延は、果実が成熟グリーンまたは成熟のブレ ーカ一段階に採取された場合、果実のつるからの摘取の時点から起算する。つる から摘取後の成熟のこの遅延は、冷所保存や本技術分野で既知の他の方法にで報 告されている期間よりはるかに長く延長できるものであることを理解すべきであ る。

さらに実験を進めるために、酵素ＡＣＣデアミナーゼを選択した。ＡＣＣデアミ ナーゼか植物中で自然に産生または発現することは、本技術分野では知られてい ない。

したがって、ＡＣＣの分解によって植物中のエチレン合成を阻害する方法を追跡 するためには、ＡＣＣデアミナーゼをコードする遺伝子を同定し、ついで植物中 で発現可能にしなければならない。

ＡＣＣデアミナーセはある種の微生物で発現することか知られている（Ｈｏｎｍ ａ、Ｍ、　＆　Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ、Ｔ、ｌ９７８　）　ｏ　ＡＣＣデアミナー ゼ酵素を単離するためには、この酵素を発現する細菌を単離する細菌スクリーン を、このような細菌もしくは微生物の同定のために設計できる。ＡＣＣデアミナ ーゼ酵素を同定する他の方法、たとえば酵母またはかびの株のスクリーニングも 同様に適用可能で、これらは本技術分野の熟練者には定常的な手段になっている 。以下は、ＡＣＣデアミナーゼ酵素発現細菌を同定した細菌スクリーニングの説 明である。

細菌株コレクション（Ｄｒａｈｏｓ、　Ｄ、　、　１９８８）について、ＡＣＣ を分解できる生物体をスクリーニングした。この細菌コレクションは５９７の微 生物から構成されている。

大部分の生物体は、蛍光Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種てあり、残りは土壌中に通常 見出される微生物である。細菌コレクションの一覧は図１に示す。スクリーニン グは、単独の窒素源として３．０ｍＭのＡＣＣを含有する最小培地で生育する微 生物を選択できるように設計された。細菌コレクション中の各細菌のサンプルを 、９６−ウェルマイクロタイタープレート中で、個々に、３０°Ｃにおいて４日 間生育させた。各ウェルにはＡＣＣを補充したＤＦ培地０．２ｍｌを含有させた 。ＤＦ培地は、オートクレーブ処理した水１１中に、試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ各 １ｍｌおよびチアミン塩酸塩５ｍｇを混合して作成した。試薬Ａは、オートクレ ーブ処理した水１００ｍ１中、１ｍｇの８３　ＢＯ３、ｔｍｇのＭｎ　ＳＯ４・ ７Ｈ２０゜１２．５ｍｇのＺｎ　ＳＯ４・７Ｈ２０，８ｍｇのＣｏＳＯ４−５Ｈ ２０、ならびに１．７ｍｇのＮａ　Ｍｏ　Ｏｓ・３Ｈ２０からなる。試薬Ｂは、 オートクレーブ処理した水１００ｍ１中、０．１ｍｇのＦｅ　Ｓｏ、−７Ｈ２０ からなる。試薬Ｃは、オートクレーブ処理した水１００ｍ１中、２０ｇのＭｇ　 Ｓｏ４−７Ｈ２０を含有する。混合した溶液に、炭素源グルコース、グルコン酸 およびクエン酸を最終濃度各０．１％（Ｗ／Ｖ　）　、無機リン酸を最終濃度１ ．　０ｍＭ　（ｗ／ｖ　）　、および単独窒素源としてＡＣＣを最終濃度３．　 ０ｍＭ　（ｗ／ｖ　）添加する。最後に酵母エキｘ　（Ｄ　Ｉ　ＦＣＯ）を最終 濃度０．０１％（ｗ／ｖ）加える。

このスクリーンに基づき、ＡＣＣ含有培地上で生育できるものとして、３つの微 生物が同定された。これらのＡＣＣ含有最小培地上での生育能は、同一培地の３ ００ｍ１液体培養液中で再生育させて確認した。ＡＣＣ上で最も良好な生育を示 した２つの単離体について、さらにその特性を調べた。これらの２つの単離体は ３Ｆ２および６Ｃ３命名された。これらの生物体はいずれも、さらに性質の調査 に選ばれなかった生物体と同じ（、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓであった。選択され た生物体はいずれも、以下に記載するインビトロアッセイにより、ＡＣＣデアミ ナーゼ活性についてスクリーニングした。６Ｇ５単離体が、さらに以後の実験の ために選ばれた。Ｇ６５細菌は、Ｍｉｌｌｅｒ　（１９８２）によって報告され た脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィー分析により、Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏａｐｈｉｓ株として同定された。上述のスクリーニング 結果から、さらに広範なスクリーニングを実施すれば、ＡＣＣを分解する他の細 菌株を同定できるであろうことは明白である。したがって、他のＡＣＣデアミナ ーゼ、およびスクリーニングによって同定されたかその後の実験には使用されな かったものも、木溌−昨の範囲に包含されるものと考えるへきである。

ＡＣＣを分解できる多数の生物体が同様に、様々な土壌サンプルから単離されて いる。これらの生物体はＡＣＣを単独の栄養源として含む最小培地上で生育が可 能であることに基づいて単離された。土壌サンプルは、Ｓｔ。

ＣＨａｒｌｅｓ　（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、［ＪＳＡ）　、Ｓａｒａｗａｋ　（Ｍａ ｌａｙｓｉａ）、Ｉｑｕｉｔｏｓ　（Ｐｅｒｕ）　、Ｓａｎ　Ｊｕａｎ　（Ｐｕ ｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ　）およびＭｕｊｉｎｄｉ　（Ｔａｎｚａｎｉａ）から採集 された。各土壌サンプル１ｇを９．９ｍｌの希釈緩衝液ボトル（Ｆｉｓｈｅｒ） 中に懸濁し、よく振盪し、土壌懸濁液を１・１００に希釈したのち平板培養する 。土壌サンプルの最終希釈度は１Ｏ−４であった。希釈サンプル＋００ｒｎｌを 、ペトリ皿（１００ｘ１５ｍｍ）中の単離培地上にホッケースティック型のガラ ス棒て広げた。単離培地には、Ｋ２ＨＰＯ４（１０ｇ　／　Ｉ　）　、Ｍｇ　Ｓ 　Ｏ＜　・７Ｈ２０（５ｇ／ｌ）　、および微量元素：　Ｆｅ　ＳＯ４（Ｉｍｇ ／Ｉ）　、Ｍｎ　Ｃ１Ｃ１２（１／ｌ）、Ｃｕ　Ｓｏ、（１ｍｇ／ｌ）　、Ｚｎ 　Ｓｏ＜　（１ｍｇ／ｌ）　、Ｃａ　Ｃ１ｘ　（１ｍｇ／Ｉ）の最小塩ベースを 含有する。ベースのｐＨをｌＮＨＣｌで７０に調製したのち、オートクレーブ処 理した。ＡＣＣ分解微生物の単離には、以下の３種の培地：　（１）ベース十グ ルコース（５ｇ／Ｉ）　＋ＡＣＣ（０，１〜１．Ｏｇ）；　（２）ベース十ＮＨ ，ＮＯｘ　（５ｇ／ｌ）＋ＡＣＣ（Ｉｇ／ｌ）：または（３）ペース＋ＡＣＣ（ Ｉｇ／ｌ）のいずれかを使用できる。ＡＣＣ、グルコース、ＮＨ４Ｎｏ３は蒸留 水に溶解し、滅菌濾過し、オートクレーブ処理したベース培地を５０℃に冷却し た中に添加した。平板は３０°Ｃで１週間インキュベートした。

Ｓｔ、　Ｃｈａｒｌｅｓから得られた土壌にＡＣＣを加えて、土壌中のＡＣＣ分 解細菌を増強させた。この実験では、２５０ｍ１のエルシンマイヤーフラスコ中 、０．５ｇのＳｔ。

Ｃｈａｒｌｅｓ土壌を含む希釈緩衝液５０ｍ１にＡＣＣ（２５０ｍｇ）を加えた 。フラスコをロータリーシェーカー上（２５０ｒｐｍ、３０’Ｃ）で３日間イン キュベートした。

ＡＣＣ強化サンプルはついで、非強化サンプルについて記載したと同様にして平 板培養した。平板上ＡＣＣの存在下に生育てきる細菌コロニーをついて純粋培養 液中に単離し、以下の培地：に２ＨＰＯ，（４ｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（６，５ ｇ／ｌ）　、Ｍｇ　ＳＯ４・７Ｈ２０（Ｉｇ／Ｉ）、微量元素（単離培地の場合 と同じ）、およびＡＣＣ（０，３ｇ／Ｉ）を５ｍｌ含む試験管（２０Ｘ　１５０ ）中で増殖させた。細菌の増殖を助けるためにグルコース（２ｇ／Ｉ）を加える こともてきる。最小塩ベース、単独炭素源および窒素源としてＡＣＣを用いて増 殖する細菌株を表１に掲げる。

細菌株　系統＃　起源 ３８８　Ｂ　２７４４４　Ｓｔ、Ｃｈａｒｌｅｓ（ＡＣＣ強化） ３９１　Ｂ　２７４４７　Ｍａｌａｙｓｉａ３９２　Ｂ　２７４４８　Ｐｅｒｕ ３９３　Ｂ　２７４４９　Ｓｔ、Ｃｈａｒｌｅｓ４０１　Ｂ　２７４５７　Ｓｔ 、Ｃｈａｒｌｅｓ（Ａｃｅ強化） Ｔ　４４　Ｂ　２７８１７　ＴａｎｚａｎｉａＰＲ−Ｉ　Ｂ　２７８１３　Ｐｕ ｅｒｔｏ　Ｒｉｃ。

これらの微生物はすべて、２つの基準でＡＣＣデアミナーゼを発現することを示 した。第一の基準は、すべての生物体からの抽出物がＡＣＣをα−ケト酪酸に変 換できること、第二は、すべてが６０５ＡＣＣデアミナーゼ蛋白に対して作成し た抗体と強力な交差反応を示す約３７．０００ダルトンの蛋白を含有することと した。さらに、これらの微生物の等優性を明らかにするため、単離ＡＣＣデアミ ナーセ酵素のそれぞれについて、カイネティックパラメーターを測定した。

各種土壌起源から単離されたＡＣＣデアミナーセのＫｍは粗製脱塩抽出物を用い て測定した。各細菌株は水ｌＩ中、４ｇのに２ＨＰＯ＜　、６．５ｇのＫＨ２Ｐ Ｏ４、ＩｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，２ｇのグルコース、１ｍｇのＦｅ　ＳＯ４ ，１ｍｇのＭｎＣｌ２．１ｍｇのＺｎＳ　Ｏ４、ｌ　ｍ　ｇのＣＬＩ　ＳＯ４， １ｍｇのＣａＣｌ２および３００ｍｇの八ＣＣを含む液体培地中で増殖させた。

細胞は３０°Ｃて３日間増殖させた。細胞を遠心分離してペレット化し、０．１ Ｍのリン酸塩、ｐＨ７，５、ＩｍＭのＥＤＴＡ、０．１％β−メルカプトエタノ ールを含有する抽出緩衝液中に再懸濁した。細胞をフレンチプレス、１０００ｐ ｓｉで破壊し、細胞屑を遠心分離してペレット化した。上清を、抽出緩衝液で予 め平衡化した５ｅｐｈｄｅｘ　Ｇ−２５カラム上て脱塩して、粗製の脱塩抽出物 を得た。抽出物にグリセロール（２０％Ｖ／Ｖ　）を加え、酵素溶液は一２０° Ｃて保存した。ＡＣＣデアミナーゼ酵素アッセイは、以下の実施例に記載のよう にして行った。

アッセイ混合物は、１００μｌの０．２Ｍ）リス緩衝液、ｐＨ８，０，３０μｍ の５００ｍＭＡＣＣ溶液、および酵素溶液を含有させ、最終容量２００μｍとし た。反応は３０℃で行った。１．８ｍｌの２ＮＨＣ１で反応を停止させた。３０ ０μｊの０．１％２．４−ジニトロフェニルヒドラジンを添加したのち、混合物 を３０’Ｃで１５分インキュベートした。ついて、２ｍｌの２ＮＮａＯＨをｊＪ ［＋えて溶液を塩基性にした。得られた赤褐色の溶液の光学ｍて測定した。

ＡＣＣデアミナーゼについての動力学的測定値、Ｋｍは、単離された各ＡＣＣデ アミナーゼ毎に酵素基質として、ＡＣＣに対して測定した。ＡＣＣデアミナーゼ 活性は、飽和レベルのＡＣＣ（５０ｍＭ）を用いると、酵素濃度に関して直線性 を示した。各抽出酵素につき、飽和上濃度のＡＣＣを用いて、概略のＫｍを測定 した。活性は、実際のＫｍの測定に用いた濃度でのＡＣＣ濃度に関して、常に直 線性を示した。次に、各抽出物について、推定Ｋｍの０，２×と２×の間のＡＣ Ｃａ度、または１〜１０ｍＭＡＣＣのＡＣＣ濃度を用いて、実際のＫｍを測定し た。Ｋｍ値は、ｙ軸に基質濃度の逆数、ｙ軸に速度（形成されたα−ケト酪酸） の逆数をプロットする、両逆数プロットから計算した。Ｘ切片（ｙ＝ｏ）が−１ ／　Ｋ　ｍになる。９種の異なる株から抽出されたＡＣＣデアミナーゼのＫｍ値 を測定したか、一般的に他の３倍以内（〜４から〜１２ｍＭ）の値を示した。こ のＫｍのデータは、本質的にすへてのＡＣＣデアミナーゼが機能的に均等であり 、本発明に使用できることを示している。

様々な単離体からのＡＣＣデアミナーゼのＫｍ値を表２に掲げる。

様々な細菌単離体の速度論的数値 細菌株　Ｋｍ［ｍＭＡＣＣ］ ＡＣＣを分解できる単離体が選択されたならば、ＡＣＣデアミナーゼをコードす る遺伝子を単離しなければならない。選択されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株６Ｇ ５からのＡＣＣデアミナーセ遺伝子の単離のための一般的戦略は次の通りである 。６Ｇ５単離体は、さらに詳細な実施態様のための例示的態様であって、他の単 離体も同様に有用と考えられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株６Ｇ５のコスミドバ ンクを構築し、クローン化し、大腸菌に導入する。ＡＣＣデアミナーセ遺伝子を もつクローンは、単独窒素源としてＡＣＣを含有する最小培地上での選択により 同定される。ついて、ＡＣＣデアミナーゼのコード領域を同定し、配列を決定す る。クローニングおよび遺伝子取扱い技術は、と（に指示のない限り、一般にＳ ａｍｂｒｏｏｋら（＋９８９）の記載の通りである。６Ｃ３株からのＡＣＣデア ミナーセ遺伝子を得るにはこの戦略を使用したか、他の戦略を使用しても同様の 成功か得られると考えられ、それらも本発明の範囲に包含されるものである。６ Ｃ３株からＡＣＣデアミナーセ遺伝子を単離する方法の詳細を以下に示す。

株６Ｇ５のＬ−ブロス（ＭＮＩｅｒ　１９７２　）後期対数期培養体からの細胞 ペレットを、染色体ＤＮＡを得るために、１０ｍ１の溶液Ｉ　（Ｂｉｒｎｂｏｉ ｍ　＆　Ｄｏｌｙ　１９７９）に再懸濁した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）を最終濃度１％になるように加え、各サイクルかドライアイスへ１５分間つい て７０°Ｃの水へ１０分間の浸漬からなる凍結−解凍サイクルに３回付す。次に 溶解物を等容量のフェノール・クロロホルム（１：　１　；ＴＥ緩衝液ｐＨ８， ０で飽和したフェノール）（ＴＥ＝ＩＯｍＭ）リス；ｌＯｍＭＥＤＴＡ）で４回 抽出し、遠心分離しく１５０００ｇ。

１０分間）、相を分離する。上清に２容量のエタノールを加えたのち短時間遠心 分離して（８０００ｇ、５分Ｍ）、エタノール沈殿物質をペレット化する。ベレ ットを５ｒｎｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、４°Ｃて２１のＴＥ緩衝液に対して１ ６時間透析する。この方法で、約５５２μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液溶液５肪ｌられ る。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　６　Ｇ　５　ＤＮＡの５０μｇ分画３つをついで、Ｅ ｃｏＲＩて部分消化して、２０Ｋｂより大きいフラグメントを生成させる。３つ の５０μｇ分画を、総容量各１．２５ｍ１中、１μｇＤＮＡあたりそれぞれ０． １２５．０．０６２および０．０３２単位のＥｃｏＲＩて消化し、３７℃で３０ 分間インキュベートする。分画をプールし、ＴＥ緩衝液ｐＨ７，６で飽和したフ ェノールクロロホルム等容量で１回抽出して、酵素を除去する。

２容量のエタノールでＤＮＡを沈殿させ、遠心分離（１２０００ｇ、５分子ｊ１ ）シてペレット化する。乾燥したＤＮＡペレットを５００μｍのＴＥ緩衝液に再 懸濁し、蔗糖勾配の頂部に載せる。１０〜４０％蔗糖勾配は、５０ｍＭｈリス９ Ｈ８，Ｏ１５ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＮａｃｌ中蔗糖を５％ずつ増量して用い 、７つの５．５ｍｍ層に調製する。勾配をＢｅｃｋｍａｎｎ　５Ｗ２８　ロータ ー中２６゜０００　ｒ　ｐｍで１８時間遠心分離する。チューブを底から穿刺し 、１ｍｌの分画を集める。各分画から、その一部２０μｍを、ラムダＤＮＡＨｉ ｎｄｎ［消化サイズ標準とともに、１％アガロースゲル上を流す。２０Ｋｂより 大きいＤＮＡフラグメントを含む分画を混合する。この場合は、７つの分画を混 合した。プールしたサンプルを脱塩し、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１ ０Ｒカラム上で濃縮する。

０．５ｍｌの濃縮サンプルを２ｍｌのＴＥ緩衝液で洗浄し、再び０．５ｍｌに濃 縮する。ＤＮＡサンプルを１ｍ１のエタノールで沈殿させ、乾燥ベレットを５０ μＩのＴＥ緩衝液に再懸濁する。ＤＮＡの収率を評価するために、サンプル２μ Ｉを、標準としてＢｓｔＥＩＩで切断したラムダＤＮＡ０．８μｇとともに１％ アガロースゲル上を流す。このゲルから、濃度は、２０Ｋｂより大きいＰｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　６　Ｇ　５　Ｄ　Ｎ　Ａ部分ＥｃｏＲＩフラグメントで、３５ μｇ／μｍと評価される。

コスミドバンクはベクターｐＭＯＮＩ７０１６を用いて構築される。このベクタ ーはファージラムダＣＯＳプラスミドｐＨＣ７９の誘導体である（Ｈｏｈｎ　＆ 　Ｃｏ１１ｉｎｓ１９８０）。ｐＭＯＮ１７０１６は、ファージＴ７からの遺伝 子ｌＯプロモーター領域を含有するｐＴ７−７（Ｔａｂｏｒ　＆　Ｒｉｃｈａｒ ｄｓｏｎ　１９８５　）からのＨｉｎｄ　ｌｌｌ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、 Ｈｉｎｄ　ｍ−ＢａｍＨＩ切断ｐＨＣ７９に導入することによって構築する。ク ローンはｐＨＣ７９のテトラサイクリン抵抗性遺伝子を中断し不活性化するが、 アンピシリン抵抗性遺伝子は無傷のまま残す。導入されたＴ７プロモーターはコ スミトクローンの機能には必要てない。ｐＭＯＮ１７０１６ベクターをＥｃｏＲ Ｉで切断し、ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）で処理し、クローニングに 備える。ベクターと標的配列は次のようにしてリゲートする。ρＭＯＮ１７０１ ６ベクターＤＮＡ　（ＥｃｏＲＩ／ＣＡＰ）１．２５μｇ　（５０ｎｇ／μｍ、 ２５μｍ）を０．６３μｇ　（３５ｎｇ／μｌ、１８μｍ）のサイズ分画６Ｇ５ ＥｃｏＲＩフラグメントと混合し、２容量のエタノールて沈殿させる。サンプル を遠心分離し、乾燥ＤＮＡペレットを６μｍの水に再懸濁する。この溶液に、１ μｍのＩＯＸリゲーション緩衝液（２５０ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ８，０、Ｉ　Ｏ 、Ｏｍ　ＭＭｇＣＩ□、１００ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭスペルミジン） 、２μｍの１００ｍＭＡＴＰ（アデノシン５“−三リン酸）溶液、ならびに１μ ｍの４０単位／μＩＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ　）を加える。リゲーション混合物は室温（ＲＴ）で６時間インキュベート する。

ｌＯμｌのｐＭＯＮＩ　７０１６／６Ｇ５リゲー１−ＤＮＡサンプルから、３μ ｌをラムダファージ粒子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ：Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ ）に、製造業者の操作を用いてパッケージする。コスミドの力価を確立するため 、希釈系列を作成し、宿主細菌のインフエクトに使用する。

宿主ＭＭ　２９４　（Ｔａｌｍａｄｇｅ　＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ　１９８０　）大 腸菌は０．２％マルトース含有Ｌしブロス中３０°Ｃで生育させる。ＭＭ２９４ サンプル１００μｍを１００μｍのＳＭ緩衝液（ＳＭ＝５０ｍＭｌ・リスｐＨ７ ，５，１００ｍＭＮａ　Ｃ１，８ｍＭＭｇ　Ｓｏ、　、０．０１％ゼラチン）で 希釈し、パッケージコスミドの１０μｍ分画でインフエクトする。サンプルはＲ Ｔて１５分間インキュベートする。サンプルに１ｍｌのし一ブロスを加え、３７ °Ｃで３０分間インキュベートする。インフエクトした細菌をついで、遠心分離 （４０００ｒｐｍ、４分間）によって濃縮シ、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリ ンを含むＬ−ブロスアガー小プレート上で平板培養する。プレートは、３７°Ｃ て一夜インキユベートする。通常認められるコスミド力価は、３μｍのリゲート ｐ　ＭＯＮ１７０１６／６Ｇ５ＤＮＡから計約８．５Ｘ１０５クローン、または ２．８ＸＩＯ’　クローン／μｇ６Ｇ５ＥｃｏＲＩＤＮＡと評価される。

ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を含有するコスミドクローンの選択には、６Ｇ５ライ ブラリーをついて、単独窒素源としてＡＣＣを含有する培地上で平板培養する。

平板は窒素を含まないアガール１．５％、２ｍＭＭｇＳＯ４，０，２％グルコー ス、０、Ｉ　ｍＭ　Ｃａ　Ｃ＋２．１×Ｍ９塩（Ｍ９塩＝６ｇＮａ２ＨＰＯ４− Ｈ２Ｏ，３ｇＫＨ，ＰＯ４，１，５ｇＮａ　Ｃ１／ｌ）、ＩｍＭチアミン塩酸□ ・い　１００μｇ／ｍｌカルベニシリン、および３ｍＭ　ＡＣＣを含有する。Ｍ Ｍ２９４細胞を３５μｍ（約５．６Ｘ１０’　クローン）のパッケージコスミド と上述のようにインフェクトし、ｌＸＭ９塩で２回洗浄し、５つのプレート上で 平板培養する。生育は３７°Ｃ１３日間のインキュベーションで明らかであった 。６日間のインキュベーション後、約３０００コスミド（２００あたり１）が、 単独窒素源としてＡＣＣを含む最小培地プレート上に生育した。補給窒素源とし てＡＣＣを含まなかった対照プレート上には、６日後も生育の兆候はない。

ＡＣＣ含有最小培地上で生育した数種のコロニーを、ついてスクリーニングする 。この記述の場合は、すべてのサンプルがサイズの異なるコスミド挿入体を有し 、大部分はいくつかの共通ＥｃｏＲＩフラグメントを含んていた。３つの最も小 さいクローンを制限欠失および共通フラグメントのサブクローニングによってス クリーニングする。ＡＣＣデアミナーセ遺伝子の活性は、クローンを上述のよう にＡＣＣ含有最小培地上で平板培養してモニタリングする。スクリーニングによ り、活性を保持する約１０．６Ｋｂの挿入体を含有するクローンが同定された。

挿入体を次に、ｐＵｃＩＩ８プラスミド（Ｖｉｅｒａ　＆Ｍｅｓｓｉｎｇ　１９ ８７）中のＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌフラグメントにサブクローニングする。続いて ＨｌｎｄｍおよびＳ　ｍａ　Ｉ欠失により、ＡＣＣデアミナーゼ活性は、単独窒 素源としてＡＣＣを含む最小培地上でクローンを生育させる２、４Ｋｂまて短縮 された。この２．４Ｋｂ挿入体を含むｐＵＣ１１８プラスミドはＩ）ＭＯＮ１０ ０２７と命名する。

ｐ　ＭＯＮ　＋　００２７の２．４Ｋｂ挿入体の両紙をついで、ＵＳＢ　５ｅｑ ｕｅｎａｓｅ　ＲＤＮＡ配列決定キットを製造業者の指示に従って使用し、配列 決定した。ＡＣＣデアミナーセ遺伝子のコート配列として、１０１７塩基対（ｂ ｐ）のオープンリーディングフレームが同定された（図２）。

この配列は配列番号ｌとする。

異なる生物からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の同等性をさらに明らかにするため 、第二の遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。最初のスクリーニングにおいて、上述 のように、単独窒素源としてＡＣＣを含む最小培地上で生育てきる生物体として Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　３　Ｆ　２単離体が同定されていた。インヒドロての ＡＣＣのα−ケト酪酸への変換は（６Ｇ５生物体について述へたように）この生 物が同じ＜ＡＣＣデアミナーゼ酵素を含むことを示している。

３Ｆ２ＡＣＣデアミナーゼのクローン化にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を 使用した。既知の６０５配列に基づき、３Ｆ２ＤＮＡのプライムオフ用オリゴデ オキシヌクレオチドを設計した。５゛および３′オリゴヌクレオチドの配列は次 の通りである。

５′オリゴヌクレオチド： ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＧＴＴＴＴ（配列番号１１） ３゛オリゴヌクレオチド。

これらのオリゴヌクレオチドは、次のクローニングを容易にするためＰＣＲ生成 物へＢａｍＨＴ部位を導入する配列で始まる。いずれも、最初の１８　（５”） また最後の１８（３’）の下線を施したヌクレオチド配列は６Ｇ５の場合と同一 である。３　Ｆ　２　ＤＮＡは６Ｇ５について前述したのと同様にして調製した 。ＰＣＲ反応は、３Ｆ２と６０５の配列の間にある程度のミスマツチがあっても 、３　Ｆ　２　ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドのアニーリングが可能なような条 件下に実施した。ＰＣＲ反応は、それぞれの次のサイクルは１０秒延長して３０ サイクル行った。各サイクルは次の通りとした。

９４℃　１分 ＰＣＲ−増幅３　Ｆ　２　ＤＮＡは、オリゴヌクレオチド中に導入された単離６ Ｇ５のＡＣＣデアミナーセヌクレオチド配列の最初の１８（５’）および最後の １８（３’）のヌクレオチドを含み、したかって最初および最後の１８ヌクレオ チドの領域は実際の３Ｆ２遺伝子に相当しないかもしれない。すなわち３Ｆ　２ ＡＣＣデアミナーセの最初および最後の６個のアミノ酸の実体は、元の３Ｆ２生 物における酵素と同一ではないかもしれない。ＤＮＡ増幅が成功するためには、 ３　Ｆ　２　ＤＮＡとオリゴヌクレオチドブライマーとの間に高度のホモロジー が必須であるから、３Ｆ２と６０５の配列は極めて類似するものでなければなら ない。

ＰＣＲ増幅の生成物をＢａｍＨＩ切断ｐＢ　Ｓ　Ｓ　Ｋ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）にクローニングし、前述のように、ジデオキシＤＮＡ配列決定法に付した。

遺伝子の配列は、内部ＤＮＡ配列由来の一連のオリゴヌクレオチドブライマーを 用いて決定した。３Ｆ２遺伝子の配列およびそれから帰納されるＡＣＣデアミナ ーゼのアミノ酸配列を図１７に示す。ヌクレオチド配列は配列番号１５、アミノ 酸配列は配列番号１６とした。６Ｇ５と３Ｆ２酵素の推定アミノ酸配列を比較す ると、それらは、９６％が同一で、保存的アミノ酸置換を考慮すれば９９％が類 似という高いホモロジーを有する。これらの２つの酵素について認められたカイ ネティックデータを考え合わせると、この配列保存は、天然のＡＣＣデアミナー セの保存的性質を示すものである。

ＡＣＣデアミナーセが同定され、単離されたならば、それを植物での発現のため に操作する必要がある。ＡＣＣデアミナーセ遺伝子を植物に導入するためには、 適当なキメラ遺伝子およびトランスホーメーションベクターの構築か必要になる 。植物へのトランスホーメーションのための代表的キメラ遺伝子は、プロモータ ー領域、異種構造ＤＮＡコード配列および３゛非翻訳ポリアデニル化部位を包含 する。異種構造ＤＮＡコード配列とは、トランスホームされる植物にネイティブ ではない構造コード配列、またはその蛋白生成物の性質を改良するために操作さ れた構造コード配列を意味する。プロノーターに関して異種とは、コード配列か 、それと連結しようとするプロモーターと、天然には同−遺伝子内に存在しない ことを意味する。キメラは、異種遺伝子の部分からなる新規な天然には存在しな い遺伝子を意味する。トランスホーメーションベクターの調製に際しては、各種 のＤＮＡフラグメントを必要に応じて操作し、所望のベクターを調製することか できる。これには、必要に応じてリンカ−またはアダプターを使用して適当な制 限部位の形成もしくは望ましくない制限部位の除去、または本技術分野の熟練者 にはよく知られた他の同様の操作が包含される。

植物細胞中でＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の転写を起こすことが知られているかま たはそれが見出されたブロモ・　−ターが、本発明に使用できる。このようなプ ロモーターは、植物、植物病原性細菌または植物ウィルスから得ることができる 。必ずしもこれらに限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウィルス の３５３および１９Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５ＳおよびＣａＭＶ１９Ｓ）、 ゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ　）モザイクウィルスからの完全長転写プロモー ター（ＦＭＶ　３５　Ｓ）およびＥＰＳＰシンターゼ、５ｓＲＵＢＩｓｃｏ遺伝 子のような植物遺伝子から単離されるプロモーター、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ遺伝子たとえばツバリンおよ びマノピンシンターゼから得られるプロモーターを挙げることができる。選択さ れた特定のプロモーターは、エチレンの産生を実質的に阻害する有効量のＡＣＣ デアミナーゼの産生を生じる十分な発現を起こすことかできるものでなければな らない。本技術分野の熟練者であれば、エチレンの産生を阻害するのに必要なＡ ＣＣデアミナーゼの量が、関連する植物の種類および植物内の組織によって変動 することは自明であろう。

本発明における使用にとくに有用なプロモーターは、果実におけるエチレン産生 時に発現される果実特異的プロモーターおよびゴマノハグサモザイクウイルスか らの完全長転写プロモーター（ＦＭＶ３５Ｓ）である。ＦＭＶ３５Ｓプロモータ ーは、植物組織において均一かつ高レベルのＡＣＣ発現を生じるその能力から、 とくに有用である。ＦＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ配列は、図２２に示し、 配列番号１７とする。果実特異的プロモーターの例には、トマトからのＲ８、Ｒ ４、ＥＩ７およびＪ４９プロモーター（Ｌｉｎｃｏｌｎｊ、Ｅ、　＆　Ｆｉｓｃ ｈｅｒ、Ｒ，Ｌ、　１９８８）、ならびに米国特許第４．９４３．６７４号に記 載された２Ａｌｌプロモーターが包含される。

本発明のＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の発現に使用されるプロモーターは、それら の発現特性を変えることが望まれる場合には、さらに修飾することもてきる。た とえば、光の不存在下て５ｓＲＵＢＩｓｃｏの発現を抑制する５ｓＲＵＢＩｓｃ ｏ遺伝子の部分をＣａＭＶ３５Ｓにリゲートすると、葉では活性であるが根では 活性を示さないプロモーターを創製できる。得られたキメラプロモーターは、本 明細書に記載するようにして、使用できる。本明細書において用いられるｒＣａ ＭＶ３５ＳＪまたはｒＦＭＶ３５ＳＪの語には、これらのプロモーターの変異体 、たとえばオペレーター領域とのリゲーション、ランダムなまたは制御された突 然変異誘発、エンハンサ−配列の付加または二重化等により誘導されたプロモー ターか包含される。

３゛非翻訳領域は、植物で、ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチ ドの付加を生じる機能を存するポリアデニル化シグナルを含有する。適当な３′ 領域の例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの腫瘍誘発（Ｔ１）プラスミド 遺伝子、たとえばツバリンシンターゼ遺伝子（ＮＯ３）、ならびに７８大豆保存 蛋白遺伝子お、よびＲｕＢＰカルボキシラーゼ遺伝子のＥ９サブユニット（ｓｓ ＲＵＢＩＳＣＯ参照）のような植物遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する ３′転写非翻訳領域かある。

本発明のＤＮＡ構築体によって生成されるＲＮＡはまた、５°非翻訳リーダー配 列を含有することが好ましい。

この配列は、その遺伝子を発現する選ばれたプロモーターから誘導できて、ｍＲ ＮＡの翻訳を増大するように特異的に修飾できる。５′非翻訳領域はまた、ウィ ルスＲＮＡから、適当な真核生物遺伝子から、または合成遺伝子配列から得るこ とができる。本発明は、以下の実施例に示すように、プロモーター配列に伴う５ ′非非翻訳列から非翻訳領域か誘導される場合、構築体に限定されるものではな い。むしろ、非翻訳リーダー配列は、異種コード配列についてのネイティブコー ド配列の非翻訳領域の５′末端の一部、プロモーター配列の一部とすることも、 または上述のように無関係なプロモーターもしくはコード配列から誘導すること もできる。

本発明のＤＮＡ構築体は任意の適当な方法で、植物のゲノムに挿入することがで きる。適当な植物トランスホーメーションベクターとしては、Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから誘導されるもの、たと えば、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　（１９８３）　、Ｂａｖａｎ　（１ ９８３）、Ｋｌｅｅ　（＋９８５）および米国特許第４．９８０．１１１３８号 によって開示されたものがある。ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｊＵＩｌｌのＴｉ　また は根誘導（Ｒ１）プラスミドから誘導される植物トランスホーメーションベクタ ーに加えて、別法として、本発明のＤＮＡ構築体を植物細胞に挿入することもて きる。このような方法には、たとえば、リポソーム、エレクトロポレーション、 遊離ＤＮＡの取り込みを増大させる化学剤、微粒子ガン技術、およびウィルス利 用トランスホーメーションか包含される。ベクターをトーモロコシまたは他の単 子葉植物細胞に導入する方法としては、それらに限定されるものではないが、Ｎ ｅｕｈａｕｓらのインジェクション法（１９８７）　、　ｄｅ　ｌａ　Ｐｅｎａ らのインジェクション法（＋９８７）またはＫｌｅｉｎら（１９８７）およびＭ ｃＣａｂｅら（１９８８）のマイクロプロジェクタイル法がある。

ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉＵｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ仲介送達によって植物ゲ ノムに挿入可能なベクターの構築は、本技術分野の通常の熟練者にはよく知られ ている。代表的な植物クローニングヘクターは、選択および評価可能なマーカー 遺伝子、Ｔ−ＤＮＡボーダー、クローニング部位、トランスコンジュゲートの同 定を容易にする適当な細菌遺伝子、広範囲の宿主での複製および可動機能、およ び所望される他の要素から構成される。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介送達か選ばれ、ベクターが無毒化Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ株に導入されたならば、所望の植物をトランスホームすることか できる。所望の植物に有効な任意のトランスホーメーション法か利用できる。

本発明における使用にとくに適した植物は、トマト、バナナ、キーライ、アホガ ド、メロン、マンゴ、パパイヤ、林檎、桃、および他のクリマクテリツク型担果 実植物である。本発明はまた、以下の非りリマクテリツク型種、すなわち、苺、 レタス、キャベツ、カリフラワー、玉葱、ブロッコリー、綿、カノラおよびアブ ラナに使用するのに適している。エチレン誘発成熟過程によって影響される他の 植物種、とくに植物の生育または植物の果実の成熟もしくは発生にエチレン産生 が重要な植物種には、本発明の教示は有益である。生花工業においてとくに望ま しい花種は、カーネーション、バラ等である。なお、以上の一覧は単なる例示で あって、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。

植物において、ＡＣＣ遺伝子の構造的発現を達成するには、遺伝子をトランスホ ーメーションヘクターｐＭＯＮ９７７にクローニングした。ここで調製したトラ ンスホーメーションベクターには、６Ｇ５単離体から単離されたＡＣＣデアミナ ーゼ遺伝子を使用した。ｐＭＯＮ９７７ブラスミド（図３）は以下の、性質が十 分明らかにされたＤＮＡセグメントを含有する。すなわち、第一に、細菌スペク チノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ　）をコードし、大 腸菌およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける選択決 定因子（Ｆｌｉｎｇら１９８５　）であるトランスホームＴｎ　７から単離され た０、９３Ｋｂフラグメントである。これはトランスホームされた組織の選択を 可能にするため、植物発現用に操作したキメラカナマイシン抵抗性遺伝子に連結 する。キメラ遺伝子は０．３５Ｋｂカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモ ーター（Ｐ　３５　Ｓ、　０ｄｅｌｌ　ら１９８５　）　、０．　８３Ｋｂ不オ マイシンホスホトランスフエラーセ■型遺伝子（ＮＰＴＩＩ）　、およびツバリ ンシンターゼ遺伝子の０゜２６Ｋｂ３’　非翻訳領域（ＮＯ３３’　）　（Ｐｒ ａｌｅｙら、＋９８３）から構成される。次のセグメントはＲＫ２プラスミドか らの０．７５Ｋｂ複製の起源（ｏｒｉ−Ｖ）（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８１）で ある。これは、ｐＢＲ３２２からの３．ＩＫｂ　５ａｌｌ−Ｐｖｕｌフラグメン トに連結する。これは、大腸菌（ｏｒｉ−３２２）中に維持するための複製の起 源およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞内への接合 移入のためのｂｏｍ部位を提供する。次はｐＴｉＴ３７ブラスミドからの０．３ ６Ｋｂ　Ｐｖｕｌ　Ｂｅ１ｌフラグメントである。

これはツバリン型Ｔ−ＤＮＡ右ホーダー領域を含存する（Ｆｒａｌｅ）Ｉら、＋ ９８５）。最後のセグメントは、プロモーター配列の二重化によって増強された ０、６５Ｋｂカリフラワーモザイクウイルス（Ｃａ　ＭＶ）３５Ｓプロモーター 　（Ｐ−Ｅ　３５　Ｓ）　（Ｋａｙら、＋９８７）　、いくつかのユニーククロ ーニング部位を有する合成マルチリンカ−１およびエントウｒｂｃｓ−Ｅ９遺伝 子の０．７Ｋｂ　３’　非翻訳領域（Ｅ　９３’　）　（Ｃｏｒｕｚｚｉ　ら、 １９８４およびＭｏｒｅｌｌｉら、１９８５）からなる発現カセットである。

いずれもｐ　ＭＯＮ　Ｉ　００２７からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を含有する ２つのサイズの異なるフラグメントをＥ３５Ｓプロモーターとｐ　ＭＯＮ９７７ のＥ９３゛末端の間に導入した。最初、ｐＭＯＮ１００２７からの１０７１ｂｐ ＥｃｏＲＶ−５ａｃｌフラグメントをＳ　ｔｕ　Ｉ　−３ａｃｌ切断ｐＭＯＮ９ ７７に導入し、ｐＭＯＮ１００２８ヘクター（図４）を生成させる。第二に、ｐ ＭＯＮ１００２７からの１１４５　ｂｐＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＶフラグメントを５ ｔｕｌｌ切断ｐＭＯＮ９７７に導入して、ｐＭＯＮ１００３７ベクター（図５） を生成させる。

果実に特異的にＡＣＣデアミナーゼの発現を指図することができるヘクターを構 築するためには、トマト果実特異的な転写プロモーターの単離を必要とした。選 択されたプロモーターは、エチレンの存在下に高レベルの発現を誘導することが 知られていて、また、トマト果実に限定されることか知られている（Ｉｊｎｃｏ ｌｎ、Ｊ、＆　Ｆｉｓｃｈｅｒ。

Ｒ，＋９８８　）　この遺伝子のだめのプロモーター、Ｅ８のＤＮＡ配列は報告 されている（Ｄｅｉｋｍａｎら、１９８８）　。Ｅ８プロモーターのＤＮＡ配列 は配列番号１０とし、図１４に示す。このプロモーターを選択した場合、他の果 実特異的プロモーターも有用であり、それらの同定および単離は本技術分野の通 常の熟練者にはルーチンな作業である。プロモーターフラグメントＥ８は、標準 的ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて単離された。Ｅ８に相補性のオリゴヌクレオ チドが合成された。５′および３゛オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は次の通り であった。

５′オリゴヌクレオチド： ＧＡＡＧＧＡ、ＡＧＣＴ　ＴＣＡＣＧＡＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＴＡＴＴ　Ｃ（配 列番号２） ３′オリゴヌクレオチド： ＧＧＧＧＣＴＴＴＡＧ　ＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴ　ＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡ　ＴＧ（ 配列番号３） ５′オリゴヌクレオチドは、転写の開始点に対し約１０４０ヌクレオチド５゛に ＨｉｎｄｌＩ［部位を導入する。

３゛オリゴヌクレオチドは転写開始点を越えて約２０ヌクレオチドにＢｇｌｌＩ 部位を導入する。ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄ　ＭＬ〜ＢｇｌＩ［フラグメントとし てクローン化できる約１０６０ヌクレオチドのフラグメントである。このプロモ ーターフラグメントは、任意のコード配列を適当な方向でそれに隣接させて配置 すると、組織特異的発現性を付与する。

ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐキット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ）の製造業者によって推薦された操作にほぼ従って実施した。反応混合物の組成 は次の通りである。

水　５８．５μ量 １０×緩衝液　１０μＩ ｄ　ＮＴＰ　ミックス　１６μＩ ５′　フライ７−　７５ｐＭ　（３，０μ　Ｉ　中）３°　プライマー　７５Ｐ Ｍ　（３，０μｍ　中）トマト　ＤＮＡ　１．２４　μｇ　（２μ　Ｉ　中）Ａ ｍｐｌｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ　０．５μ　＋ＰＣＲ反応は、以下の温度 ／時間の組合せで２８サイクル行った。

完了後、正しいサイズのＰＣＲ生成物が観察された。

フラグメントを、等容量の１：１フエノール／クロロホルムによる抽出、ついて エタノール沈殿で精製した。ＰＣＲフラグメントをついて、ｐ　ＭＯＮＩ　００ ３７ＤＮＡにリゲートてきるように、ＨｉｎｄＩ［ＩおよびＢｇｌＩＩて切断し た。ついて、ＰＣＲフラグメントを、同じ酵素で予め切断してＣａＭＶ３５Ｓプ ロモーター配列を除去したｐＭＯＮ　１００３７ＤＮＡにリゲートした。得られ たプラスミドは、ｐ　ＭＯＮＩ　Ｏ０３７ＤＮＡのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター と同じ位置にＥ８プロモーターを含存し、ｐＭＯＮ１００５４（図５）と命名さ れた。

ｐＭＯＮ　１００２８およびｐＭＯＮＩ００３７ベクターは、いずれも、ＡＢＩ 　Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ株に移入できる。

ＡＢＩ株は、無毒化ｐＴｉ５８プラスミドｐＭＰ９０ＲＫをもツＡ２０８　Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである（Ｋｏｎｃｚ　＆５ｃ ｈｅｌｌ　１９８６）　、　Ｔｉ　プラスミドはＴ−ＤＮＡフィトホルモン遺伝 子をもたず、したかってこの株はクラウンゴール病を生じない。９　ＭＯＮベク ターのＡＢＩへのメイティングは、ヘルパープラスミドｐ　ＲＫ２０１３（Ｄｊ ｔｔａら、１９８０）を用いる三親接合系によって行った。植物細胞をＡＢＩ・ ：ｐＭＯＮ接合体とインキュベートする場合には、ベクターは、無毒化ｐＭＰ９ ０ＲＫＴｉプラスミドによってコードされるｖｉｒ機能により植物細胞に移入す る。ベクターはＴ−ＤＮＡボーダー領域において開裂し、全ｐＭＯＮベクター配 列が宿主植物染色体に挿入される。Ｔｉプラスミドは植物細胞には移入されず、 ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉｌ１ｍ内に残る。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様のいくつかを、さらに示すものであ る。本技術分野の熟練者には、ここに述へる特定の実施態様に対し多くの均等な 態様を認識できるものと考えられる。このような均等な態様は本発明の範囲内に 包含される。

例Ｉ ＡＢ　Ｉ：：ｐ　ＭＯＮＩ　００２８およびＡＢＩ・・ｐ　ＭＯＮ１００３７ベ クターを用いて形質転換タバコ植物を生成させ、植物中におけるＡＣＣデアミナ ーゼの発現を示す。

タバコ細胞はタバコ葉ディスク法を用いてｌ・ランスホームシタ。タバコ葉ディ スクトランスホーメーションのプロトコールでは、約１月齢の健康な葉組織を使 用した。

１０％Ｃ１ｏｒｏｘおよび界面活性剤て表面を１５〜２０分間殺菌したのち、タ バコの葉を滅菌水て３回すすいだ、滅菌した紙パンチを用いて、葉のディスクを 打ち抜き、上面を下にしてＭＳ１０４培地（ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ ｌ、Ｂ５ビタミン５０　Ｏｘ２ｍ１／Ｌ　ＮＡＡＯ，１ｍｇ／ｍｌ、およびＢＡ ｌ、Ｏｍｇ／Ｉ）上に置き、１日前培養した。

ディスクについで、１１５に希釈した（すなわち、約０．６０Ｄ）目的のベクタ ーを含む無毒化Ａｂｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＡＢ［の−夜培養液を接種した 。接種は、培養体を入れた遠沈管中にディスクを置いて行った。３０〜６０秒後 に、液体をきり、ディスクを滅菌した濾紙の間に挟んで液を吸い取った。ディス クをついて上面を下にしてＭＳ　１０４フイーダープレート上に濾紙ディスクと ともに置き、共培養した。

２〜３日間共培養したのち、ディスクの上面を下にしたままＭＳ１０４培地とと もに選択プレートに移した。

２〜３週後、カルスが形成した。各クランプを葉のディスクから分離した。芽が 葉柄から十分識別できる程度に大きくなったらば、芽をカルスから清潔に切り取 った。

芽を、ホルモンを含まない根培地（ＭＳＯ：ＭＳ塩４．３ｇ／］、蔗糖３０ｇ／ ｌおよびＢ５ビタミン５００　ｘ　２　ｍ　ｌ　／　１　）上に置き、選択した 。１〜２週で根か形成された。なお滅菌状態で、根が形成した芽について、好ま しくは、葉カルスアッセイを実施した。根をもった芽は土壌中に置き、高湿度環 境（すなわち、ブラチソク容器または袋）に保持した。芽は常湿度条件に徐々に 暴露して丈夫にした。

葉中のＡＣＣデアミナーゼのアッセイには、タバコ葉サンプルを集め、液体窒素 中で凍結させた。組織１ｇを液体窒素下に凍結したまま微粉末に粉砕した。抽出 緩衝液（１００ｍＪ）リスｐ　Ｈ７，１，１０ｍＭＥＤＴＡ。

３５ｍＭＫＣｌ　、２０％グリセロール、５　ｒｎ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ、５　ｍ　 Ｍ　Ｌ−アスコルビン酸、ＩｒｎＭベンザミジン、１ｍｇ／ｍＩ　ＢＳＡ）１ｍ 　ｌをサンプルに加え、４５秒間磨砕し、直ちに遠心分離（１２，０００ｇ、３ 分）して集屑を除去した。小分子を除去するため、２５０μｍの抽出液を、予め 上記抽出緩衝液（ＢＳＡ減量）で平衡化した１ｍｌの５ｅｐｈｄｅｘ−Ｇ５０ス ピンカラムを通した。抽出物を検定し、形質転換植物組織中のＡＣＣデアミナー セ活性の相対量を調へた。ＡＣＣデアミナーゼ酵素はＡＣＣ基質をα−ケト酪酸 とアンモニアに変換する。α−ケト酪酸を２．４−ジヒドロフェニルヒドラジン と反応させてヒドラゾン誘導体を形成させ、ＮａＯＨを添加したのちその光学密 度を５２０ｎｍて測゛定した。この光学密度は、植物抽出物中のＡＣＣデアミナ ーセの量の指標となる。

アッセイ反応混合物には、５０μｍのタバコ葉抽出物サンプル、１００ｍＭ）リ スｌ］Ｈ８，６、および５０ｍＭＡＣＣを最終容量１５０μｍ中に含有させた。

反応は３０°Ｃて１分間インキュベートして行い、５０μｍの０゜５６ＭＨＣｌ で終結させた。２ＮＨＣＩ中０．１％２．４−シヒドロフエニルヒドラジン０． ６ｍｌを添加した。サンプルを２分間煮沸し、室温に冷却し、０．２ｍｌの４０ ％ＮａＯＨを加えた。遠心分離して沈殿を除去した（＋２，０００ｇ、５分間） 。上清の光学密度を５２０ｎｍで測定した。この値は植物中で生成されたＡＣＣ デアミナーゼ酵素の相対量を示す。非形質転換タバコ植物を陰性対照として用い た。

数種のタバコ葉抽出物についてアッセイを行ったところ、ＡＣＣデアミナーゼ活 性は０．６〜７．５ｍｍｏｌｅ生成物（α−ケト酪酸）／ｍｇ総蛋白／分の範囲 であった。これらのアッセイ結果は、タバコ植物中でＡＣＣデアミナーセが発現 したことを実証するものである。

例２ ＡＢＴ：：ｐＭＯＮ１００２８およびＡＢＩ：・ｐ　ＭＯＮ１００３７ベクター を用いて形質転換トマト植物を生成させ、植物中におけるＡＣＣデアミナーゼの 発現を証明する。

トマト細胞は、上述のＡｂｇｒＯｂａＣｔｅｒｉｕｍ株を用い、はぼＭｃＣｏｒ ｍｉｃｋら（１９８６）の記載した方法に従って、トランスホームした。とくに 、７〜８日齢の若木からコチレドンを得た。種子を３０％Ｃ１ｏｒｏｘブリーチ 中て２０分間殺菌し、Ｐｌａｎｔｃｏｎｓボックス中、Ｄａｖｉｓ発芽培地上で 発芽させた。Ｄａｖｉｓの発芽培地の組成は、ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、蔗糖２０ｇ ／］、およびＮ１ｔｓｃｈビタミン１０ｍ１、ｐＨ５，８である。Ｎ１ｔｓｃｈ ビタミン溶液は、ミオイノシトール１００ｍｇ／ｍｌ、ニコチン酸５ｍｇ／Ｉ、 ピリドキシン塩酸塩０．５ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸塩０．　５ｍｇ／］、葉酸０ ．０５ｍｇ／］、ビオチン０．０５ｍｇ／Ｉ、グリシン２ｍｇ／］である。種子 は生育チャンバー中、２５°Ｃ１湿度４０％、強度８０アインシユタインｍ−２ ｓ−’の冷白色光下に７〜８日間発芽させた。光周期は明期１６時間、晴朗８時 間とした。

発芽が起こったならば、コレチドンを、＃１５のカミソリを使って、頂端分裂組 織および胚軸を切断して移植し、矩形の移植片を作成した。発芽しているコレチ ドンの短端でのこれらの切断は、インフェクションのための表面積を増大させた 。移植片は滅菌Ｄａｖｉｓ再生液に浸漬して乾燥を防止した。Ｄａｖｉｓ再生培 地の組成は、ｌ　ＸＭＳ塩、３％庶蔗糖１　ｘＮｉｔｓｃｈビタミン、２０ｍｇ ／ｍｌセアチン、ｐＨ５，８である。この溶液は０．８％貴アガールとともにオ ートクレーブ処理した。

コレチドンは、抗生物質を含まない培地からなる［フィーダープレート」上で前 培養した。この培地は、ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ庶糖３蔗糖／］、ミオイノシトール ０゜Ｉｇ／Ｉ、０．２ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ２，０，９ｒｎｇ／ｍ１チアミン塩酸 塩溶液１．４５ｍ１／１、キネチンの０．５ｒｎｇ／ｍｌ溶液０．２ｍｌ、およ び２，４Ｄの０゜２ｍｇ／ｍｌ溶液０，１ｍｌからなる。この溶液をＫＯＨによ りｐＨ６，０に調整した。これらのプレートを１．５〜２０ｍｌのトマト懸濁細 胞および２ＣＯ０５に培地に浸漬したＷｈｉｔｍａｎ濾紙て覆った。２ＣＯＯ５ に培地の組成は、Ｇ　ｉｂｃｏＭ　Ｓ塩混合物４．３ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン（１ ００ＯＸ保存液）１ｍＬ庶糖蔗糖ｇ／ｌ、２ｍｌのＰＣＰＡ（２ｍｇ／ｍｌの保 存液から）、およびキネチンの１０　ｕ　１／ｍ　１　（０，５ｍｇ／ｍ　ｌの 保存液から）である。コチレドンは生育チャンバー中、２５°Ｃ１強度４０〜５ ０アインシュタインｍ−２ｓ−’の冷白色光下、連続明期の光周期で、１日培養 した。

ついでコチレドンを、所望のトランスジェニック遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍの対数期溶液で接種した。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度は約５Ｘ　Ｉ　Ｏ’細胞／ｍｌとした。

コチレドンを細菌溶液に６分間浸漬させ、ついて滅菌ｗｈａｉｍａｎ　ｍ紙デイ スク上で吸取って過剰の溶液を除去し、次に、最初のフィ−ダープレートを置換 して、２日間共培養させた。２日後にロレチドンを、２ｍｇ／’１のゼアリンリ ボシド、５００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのカナマイ シンを加えたＤａｖｉｓ再生培地を含む選択プレートに移した。２・〜３週後、 カルスおよび／または若芽を形成したコチレドンを、カルベニシリンおよびカナ マイシンを同レベルで含有する新鮮なりａｖｉｓ再生プレートに移した。この時 点て、トランスホーマントについて、実験を評価した。カルス組織を規則的に３ 週間隔て慶大培養し、異常な構造かあれば摘み取った。若芽は３〜４月以内に発 生した。

若芽が発生したならば、カルス組織から清潔に切断し、発根選択プレート上に移 植した。これらのプレートには、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５００μ ｇ　／　ｍ　１のカルベニシリンを含む０．５ＸＭＳを含有させた。これらの若 芽には、選択培地上で２週間以内に根が形成された。２週間後にも発根か認めら れなかった場合は、若芽を摘み取り、選択培地に再移植した。若芽培養体は、パ ーシバル中２２°Ｃの温度でインキュベートした。根をもった若芽は、根の長さ か約２ｃｍになったときに、植木鉢に移した。この植物は生育チャンバー中２ピ Ｃにおいて、明期１８時間、晴朗６時間の光周期で２〜３週間生育させて丈夫に したのち、温室に移した。温室では、植物は、昼間２６°Ｃ１夜間２１″Ｃの温 度て生育させた。

光周期は明期１３時間、晴朗１１時間で、植物はそのまま成熟させた。

グリーンのトマト果実および葉サンプルを集め、液体窒素中で凍結させた。サン プルを抽出し、タバコについて記載した操作を用いたアッセイに付した。トマト 抽出緩衝液には、１００ｍ１）リスｐＨ７，１，１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセ ロール、５ｍＭＤＴＴ、５ｍＭＬ−アスコルビン酸、１ｍＭベンザミジン、１ｍ ｇ／ｒｎｌＢＳＡを含有させた。抽出物をアッセイしたところ、ＡＣＣデアミナ ーセ活性は、葉組織については１．６〜１１゜２ｍｍｏｌｅ生成物／ｍｇ総蛋白 ／反応時間（分）、果実組織については３．０〜２５．１ｍｍｏｌｅ生成物／ｍ ｇ総蛋白／反応時間（分）であった。これらのアッセイ結果は、ＡＣＣデアミナ ーゼがトマト植物中で構造的発現を示したことを実証するものである。

例３ ＡＣＣデアミナーゼをコードするキメラ遺伝子で形質転換されたトマト植物につ いては、トマト植物の果実の成熟に対するＡＣＣデアミナーゼの発現の効果を明 らかにするためのアッセイも行った。

プラスミドＩ）ＭＯＮＩ００２８およびｐＭＯＮ１００３７を、例２の記載と同 様にして、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　ｃｖ、 　Ｕ　Ｃ８２Ｂ　）に導入した。

この遺伝子を含む植物は最初、カナマイシン抵抗性によって同定した。カナマイ シン抵抗性植物はさらに、ＡＣＣデアミナーセ酵素アッセイ（上述）および精製 ＡＣＣデアミナーセ蛋白に対して作成した抗体を用いる定常的ウェスタンプロッ ト分析によって分析した。ＡＣＣデアミナーセ蛋白を発現する植物を選択し、さ らに分析を行った。

ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を発現すると同定されたトマト植物について、果実の 成熟の阻害を調へた。５６７３および５８５４と命名された２系統からの一部ト ランスホーマントのＲ１子孫、ならびに非形質転換ＵＣ８２Ｂ植物を、温室中、 同一条件で生育させた。トランスジェニック植物の子孫は、Ｔ−ＤＮＡの継承を 示すＮＰＴ■遺伝子の存在についてスクリーニングした。ＵＣ８２Ｂ対照も含め て、すへての植物か花をつけ、同時に果実の発生か開始された。各植物について 、ついで、それが成熟の開始を示すブレーカ−ステージ（果実が赤くなり始める ステージ）に入った日を評価した。両トランスジェニック系統からのＮＰＴＩＩ 陽性と評価された植物ては、成熟の開始に有意な遅延が認められた。成熟の開始 の遅延はほぼ１週であった。トランスジェニック植物ならびにＵＣ８２Ｂ対照か らの果実は、ブレーカ−ステージで植物から摘取した。果実は個々に、２００ｍ １のビーカー中に室温で保存し、そのまま成熟させた。トランスジェニック植物 からの果実は、それが完全な成熟状態に到達する時期に、２〜６週の遅延を示し た。すなわち、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を発現する植物は、成熟の開始ならび に成熟過程か開始したのちの成熟段階を通じてその進行に要する時間の両者で、 遅延を示した。

例４ 上述のようにｐ　ＭＯＮ　Ｉ　Ｏ０２８およびｐ　ＭＯＮ　＋　００７７によっ て形質転換したＮ１ｃｏｔｉｎａ　ｔａｂａｃｕｍ植物について、植物中てのＡ ＣＣデアミナーセの発現がタバコの花の寿命に与える効果についても検討するた め、アッセイを行った。ＡＣＣデアミナーゼを発現するタバコ植物は、トマト植 物について使用したのと同じ酵素アッセイを用いて同定した。酵素アッセイは、 タバコの葉および花について実施した。この遺伝子を発現する植物につ、いて、 花が維持される時間の長さを検定した。花には開花時に札をつけ、老化段階に達 するまでの時間を測定した。対照からの花は開花後２日で有意な凋萎を示したが 、ＡＣＣデアミナーゼを発現するトランスジェニック植物からの花では、凋萎が 丸１日遅延した。

例５ 本発明の方法はまた、果実の成熟を遅延させることが知られている他の方法と組 合せて使用することもできる。

このような組合せの一つに、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を、エチレン産生を阻害 するアンチセンス遺伝子と組合せる使用法がある。この目的で、ＡＣＣデアミナ ーゼをｐ　ＴＯＭｌ　３　ｃＤＮＡについてのアンチセンス遺伝子と組合せて含 有するプラスミドを調製した（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈら、１９８７）。ｐＴＯＭ １３と命名された遺伝子は、以前、植物中にアンチセンス方向に配置させると、 エチレンの産生を阻害することが示されている（　Ｈａｍｉ　Ｉ　ｔｏｎら、１ ９８０）。

この遺伝子はＡＣＣをエチレンに変換する酵素（多分、この酵素はＡＣＣオキシ ダーゼであろう）をコードし、アンチセンスＲＮＡによるこの酵素の合成の阻害 は植物組織中へのＡＣＣの蓄積を招来するものと考えられている。ｐＴＯＭ１３ 遺伝子に相当するｃ　ＤＮＡクローンが、公開されたｐＴＯＭ１３配列から調製 された合成オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズ能に基づいて、成熟中のトマ ト果実から作成されたｃ　ＤＮＡライブラリーから単離された。

ｃ　ＤＮＡライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｃａｔ、＃９３６００４　 ）から購入した。このライブラリーは、バクテリオファージスクローニングベク ター、λ−ＺＡＰＩＩ中、成熟中のトマト果実から単離されたＲＮＡから作成さ れた。オリゴヌクレオチドプローブは、公開されたｐＴＯＭ１３配列のセグメン トから、次のように作成された。

オリゴヌクレオチド１： ５’　ＧＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧ　３’　（配列番号４ ）オリゴヌクレオチド２： ５°ＧＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＴＡＧＣ３′　（配列番号５）２ 万個のファージを、製造業者の推薦に従い、アガール含有プレート上で平板培養 した。製造業者によって供給された大腸菌株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅをファージの調製 に使用した。ファージプラークをニトロセルロース濾紙に移し、８０°Ｃのオー ブンで２時間ベーキングした。プレートは２５°Ｃて２時間、以下の溶液中でプ レハイブリダイズした。

６ＸＳＳＣ１５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ Ａ、２０ｍＭｔ−リス塩酸塩、ｐＨ７，０，０、１％ＳＤＳ、１．　０ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ５０　ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液＝水中各Ｆｉｃｏｌｌ　１．　０％、ポリ ビニルピロリドン、ウシ血清アルブミン（分画Ｖ。

Ｓｉｇｍａ　）、 ２０ＸＳＳＣ＝水１１あたり１７５ｇ食塩および８８゜２ｇクエン酸ナトリウム 、ＮａＯＨてｐＨを７．０に調整。

プレハイブリダイゼーション後、２２Ｐ−標識オリゴヌクレオチド（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、１９８９）を、ハイブリダイゼーション溶液中の各オリゴヌクレオチ ドの最終濃度が５００．０００ｃｐｍ／ｍｌになるように添加した。ハイブリダ イゼーションは５０°Ｃで４８時間行った。濾紙は６ｘｓｓｃ中、室温、１５分 で２回、５０°Ｃ，１５分で１回洗浄した。ついて乾燥し、Ｘ線フィルムに４８ 時間露出した。ハイブリダイズしたファージに相当するプラークを単離し、単一 のプラークが隣接するハイブリダイズしていないプラークから容易に分離できる ようなファージ密度において上述の操作を反復して精製した。ｐＴＯＭ１３ｃＤ ＮＡ挿入体は、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の記述に従い、プラスミドヘ クターｐ　Ｂ５５Ｋ−中に救出した。このプラスミドはｐＭＯＮ１１０２３と命 名された。

ついて、ｐ　ＴＯＭＩ　３　ｃＤＮＡ挿入体のアンチセンス方向での発現のため に設計されたベクターを調製した。

ｃ　ＤＮＡ挿入体を隣接のポリリンカーとともに、ｐＭ。

Ｎ１１０２３から制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＣｌａ　Ｉで切断す ることにより切り出した。プラスミドのｃ　ＤＮＡ含有部分をついで、Ｂｇｌｌ ＩおよびＣ１ａｌで切断しウシ腸アルカリホシファターセで処理したｐ　ＭＯＮ ９９９中にクローン化した。得られたプラスミド、ｐＭＯＮｌ］０２５は、Ｃａ ＭＶ３５Ｓプロモーターに関してアンチセンス方向のｃ　ＤＮＡ挿入体およびノ バリンソンターゼ３゛転写ターミネータ−／ポリアデニル化部位を含有する。こ の遺伝子カセットは単一の２．２ＫｂＮｏｔｌフラグメントとして切り出すこと ができる。このＮｏｔＩフラグメントをＩ］ＭＯＮ１１０２５から切断し、１１ Ｍ０Ｎ１００２８のユニークＮｏｔ１部位に配置してｐＭＯＮ１１０２７（図７ ）を創製した。すなわち、このプラスミドは、アンチセンスｐＴＯＭ１３遺伝子 およびＣａ　ＭＶ３５Ｓ／ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を含有する。

このプラスミドを、上述の三親交配を用いてＡｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ａ Ｂ［に導入し、トマト植物のトランスホーメーションに用いた。

得られた形質転換植物は、植物中でのエチレン産生を存意に阻害すると考えられ る。ＡＣＣデアミナーセ遺伝子とアンチセンスｐ　ＴＯＭＩ　３遺伝子の組合せ による作用は、実際にエチレンの合成を消失させ、果実の成熟をさらに遅延させ ることが期待される。ＡＣＣデアミナーゼとｐＴＯＭＩ３アンチセンス遺伝子の 組合せは、果実または植物におけるエチレンの形成の低下に相乗作用を発揮する ことが期待される。

例６ 植物組織におけるエチレン産生速度を低下させる他のアプローチには、Ｓ−アデ ノシルメチオニン（ＳＡＭ）デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現 かある。この酵素はＡＣＣの中間プレカーサーであるＳＡＭを分解する。脱カル ボキシル化されたＳＡＭはついて、一般的なポリアミンであるスペルミジンに変 換される。

ポリアミンはそれ自体、植物において抗老化作用を有することが報告されている ので、ＳＡＭデカルボキシラーゼは２つの方式で、すなわち（１）スペルミジン の産生、および（２）エチレンへのプレカーサーの分解により、成熟を防止でき ることが推測される。

図１５に示した（配列番号９）ＳＡＭデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は クローン化され、そのＤＮＡ配列が報告されている（Ｔａｂｏｒ　＆　Ｔａｂｏ ｒ　）。この遺伝子は、Ｅ８プロモーターの単離のためのプロトコール中に上述 したように、ＰＣＲを用いてクローニングした。大腸菌ＤＮＡは、Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ　６　Ｇ　５ゲノムＤＮＡの単離ついて上述したようにして精製した 。精製ＤＮＡは、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用い、上述のよ うにＰＣＲに付した。

５′オリゴヌクレオチド： ＧＧＡＧＡＡＧＡＴＡ　ＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡ　ＡＡＡＡＡＣＴＧＡＡ　ＡＣＴ ＧＣ（配列番号６） ３“オリゴヌクレオチド ＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡ　ＡＴＡＧＡＴＶＴＧＧ　ＣＧＧＡＧＣＣ（配列番号７） 使用された２つのプライマーにはそれぞれ、以後のクローニング工程を容易にす るため、増幅したＤＮＡ配列にＢｇｌＩＩ制限部位を導入した。増幅後、ＤＮＡ をＢｇｌＩＩて切断し、ＢｇＩＩＩ切断ｐＭＯＮ７２５８（図８）とリゲートし た。得られたプラスミドｐＭＯＮ１１０！４（図９）は、ＳＡＭデカルボキシラ ーゼ遺伝子を含有した。

この遺伝子を次に、構造的プロモーターたとえばＦＭＶからの完全長転写プロモ ーターまたは果実特異的プロモーターたとえば上述のＥ８プロモーターのいずれ かの制圓下にその遺伝子の発現を可能にする植物トランスホーメーションベクタ ー中にクローニングした。構造的発現ベクターは、Ｓ　Ａ　Ｍデカルボキシラー ゼを含有するｐＭＯＮＩＩ０１４ＢｇｌｌＩフラグメントを、ＢｇｌｌＩ切断ｐ ｒｖｒ○Ｎ９８１（図１０）にクローニングして構築した。得られたプラスミド 、Ｉ）ＭＯＮ１１０１６（図Ｉ＋）は、その遺伝子を、植物中ての発現のために 正しい方向て含有した。組織特異的発現ベクター、ｐ　ＭＯＮ　１１０３２（図 １２）は、ｐＭＯＮ１１０］、４かラノ同じＢｇｌｌＩ７ラグメントを、Ｂａｍ ＨＩ切断ｐＭＯＮＩ００８６（図１３）中に挿入して構築した。両トランスホー メーションベクターをついて、三親交配を使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ　ＡＢＩに導入した。ｐＭＯＮ１１０１６またはｐＭＯＮＩ１０３２のいずれ かを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株をついて、上述のようにトマト植物 のトランスホームに使用した。

ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をＳＡＭデカルボキシラーセ遺伝子とともに発現させ れば、植物中でのエチレンの産生が相乗的様式で阻害され、生成した植物の成熟 または老化過程は制御されて、その植物由来の商品の貯蔵寿命は増大することか 期待される。

例７ ＡＣＣ代謝酵素たとえばＡＣＣデアミナーゼはまた、アンチセンスＡＣＣソンタ ーゼ遺伝子と組合せて使用することもできる。ＡＣＣシンターゼのＤＮＡ配列は 既知であり（Ｖａｎ　Ｄｅｒ　５ｔｒａｅｔｅｎら、１９９０）　、図１６に示 す通りである（配列番号８）。通常の操作により、適当なＣＤＮＡライブラリー からＡＣＣシンターゼ遺伝子のｃＤＮＡを単離し、ＡＣＣシンターゼ遺伝子をア ンチセンス方向で含有するベクターを調製することができる。このベクターは、 アンチセンス方向でのＡＣＣシンターゼ遺伝子およびＡＣＣ代謝酵素たとえばＡ ＣＣデアミナーゼを、植物のトランスホーメーションを成功させるのに必要な他 のＤＮＡフラグメントとともに含有することになる。アンチセンスＡＣＣシンタ ーセおよびＡＣＣデアミナーゼの両者は、果実特異的プロモーターたとえばＥ８ の転写制御下にあることが好ましい。

得られた形質転換植物は、形質転換植物の果実におけるエチレンの産生を存意に 阻害するものと考えられる。

ＡＣＣ代謝酵素とＡＣＣシンターゼアンチセンス遺伝子の組合せは、実際にエチ レンの合成を消失させ、果実の成熟をさらに遅延させることが期待される。果実 は、所望の時点で、通常の濃度のエチレンに暴露させて成熟させることができる 。

例８ この実験は、植物中でＡＣＣデアミナーゼを高レベルに発現させた場合の、エチ レンレベルの低下作用を評価するために実施された。例３に記載した植物系統５ ６７３および５８５４について、植物中でのエチレンの発生、および植物中ての ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の発現の表現壓への影響を調べた。エチレン発生のア ッセイは、植物からの若い柔組織について、全部の葉または果実を密閉した容器 内に封入し、１時間後に気体サンプル１．Ｏｍｌを抜取って行った。エチレンは 、アルミニウムカラムおよび水素炎イオン化検出器を装置したガスクロマトグラ フィー（ＷＡｒｄら、１９７８）によって定量した。エチレン発生アッセイの結 果は以下の表３に示す。

エチレン合成（ｎｌ／ｇ／ｈ） 植物　葉　果実 υＣ８２Ｂ　５．１５±０．６９　１１．７３±０．８６ＬＩＣ８２Ｂ−２５， ５３±０．３７　ＮＤ５６７３　０．６０±０．０９　１．４３±０．３６５６ ７３−２　０．１８±０．２　ＮＤ５８５４　１．１４±０．２１　ＮＤ （ＮＤ＝測定せず） 植物系統５６７３のエチレンレベルは、若い葉を用いた一つの実験では９０％、 第二の実験では９７％もの低下を生じた。植物系統５８５４ては、約７８％の低 下を示した。これらのデータは、これらの植物系統における遺伝子発現データと 一致する。蛋白ゲルプロット分析で測定すると、系統５６７３はＡＣＣデアミナ ーゼとして可溶性蛋白約０．５％を含有し、一方、植物系統５８５４はＡＣＣデ アミナーゼとして可溶性蛋白約０．０５％を含有した。

蛋白ゲルプロット分析は、蛋白サンプルをゲル負荷緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸 塩、ｐＨ７，１００ｍＭジチオスレイトール、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール 、０．１％ブロモフェノールブルー）中３分間煮沸し、４〜２０％ポリアクリル アミドＭＩＮＩＰＲＯＴＥＩＮ　Ｉｆレディーゲル（ＢｒＯ−Ｉ？ＡＤ　）上に 流して行った。蛋白を、製造業者の指示に従いＭｉ　ｌｌ１Ｂ］ｏｔ−３ＤＥ電 気プロテイング装置を用いて、ニトロセルロース膜に移した。膜を、１％ＢＳＡ 。

ＴＢＳＴ　（ｌ　０ｍＭトリス、ｐＨ８，１５０ｍＭ　ＮａＣ１０，０５％Ｔｗ ｅｅｎ−２０）中４°Ｃで一夜インキユベートシた。インキュベーションは室温 で穏やかに撹拌して行い、膜をハイブリダイズさせた。膜を、ＴＢＳＴに１・１ ０００に希釈したヤギ血清中でインキュベートして、−次ＡＣＣデアミナーゼ抗 体を結合させた。ついて、ＴＢＳＴ中１０中間０分間を３回行った。膜を、ＴＢ ＳＴ２Ｏｍｌ中５μＣの１２５１−標識プロチインＧと３０分間インキュベート シて二次試薬を結合させた。膜を０゜１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００て１０分子 Ｉ！１４回洗浄し、フィルムに露出した。ＡＣＣデアミナーゼ蛋白に対する抗体 は、本技術分野の熟練者にはよく知られた標準技術により、ヤギに１．５ｍｇの 蛋白を注射し、ヤギから抗体を単離することにより得られた。

植物系統５６７３からのホモザイゴート植物について、表現型効果も調へた。ト ランスジェニック植物からの種子を通常のようにして発芽させたが、この植物は 表現型的に、対照と識別できなかった。この植物には、開花または成熟の開始に 遅延を認めなかった。しかしながら、成熟の進行には著しい差がみられた。トラ ンスジェニック植物の果実は対照果実と一致するエチレン合成のピークを示した か、そのレベルは対照のわずか１０％にすぎナカった。この結果を図１８に示し た。トランスジェニック植物によるエチレンの発生は−・−１対照植物（ＵＣ８ ２Ｂ）によるエチレンの発生は一■−で示されている。棒は特定の時点での平均 上標準誤差を示している。

果実はブレーカ一段階で摘取し、上述のようにしてエチレンの発生を毎日測定し た。ブレーカ一段階で摘取した果実の成熟の遅延も同様に有意であった。対照果 実は、ブレーカ一段階から７日を経過すると完全に赤色になり、わずか２週後に は著しい軟化を示した。トランスジェニックトマト果実は、２４日後に完全な赤 色の段階に到達し、ブレーカ一段階から長期間にわたり固いままであった。トラ ンスジェニック植物からの果実は４５日以上も固いままで離層しなかったが、一 方、対照果実は１４日後に離層した。これらのデータは表４に示す。

成熟段階 表４のデータは、摘取後、特定の成熟段階に到達するまでの日数を標準誤差とと もに示している。成熟段階は次のように定義された。

ブレーカ−色の変化の最初の兆候 ３　完全に橙色 ４　橙色〜赤色 ５　赤色部が５０％を越える ６　完全に赤色 例９ 本例は、花をもつ植物種におけるＡＣＣデアミナーゼ蛋白の発現を例示するもの である。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をペチュニア植物にトランスホームした。ペ チュニア植物は、トランスホームされた植物のグリフォゼート上での直接選択を 可能にするトランスホーメーションベクターでトランスホームした。ペチュニア の移植片は、一般的に、例１においてタバコ植物について記載したのと同様に、 前培養のために調製した。■月齢のペチュニア植物からの葉をｌＯ％Ｃ１ｏｒｏ ｘプラス界面活性剤の溶液中で１５分間表面殺菌したのち、蒸留水で３回洗浄し た。

移植片は０．５ｃｍ平方に切り取り、葉端、主脈、葉芽および葉柄端を除去し、 均一組織型とした。移植片をついて、上面を下にして単層に、２ｍｌの４ＣＯ５ に培地を含有するＭＳ１０４プレート上に置き、表面を湿潤させ１〜２日間前培 養した。移植片は、１．２ＸＩＯ’細菌／ｍ１４ｃＯ０５に培地の力価に調整し た植物トランスホーメーションベクター含有Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの一夜 培養液を用いて接種した。移植片は遠沈管中に置き、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ懸濁液を加え、細菌と移植片の混合物を、細菌の均一な侵入を保証するため、 最大セツティングで２５秒間「ポルテックス」した。細菌を流し出し、移植片は 乾燥滅菌濾紙の層の間にはさんで液を吸取り、過剰の細菌を除去した。水分を吸 取った移植片を、上面を下にしてＭＳ　Ｉ　０４プレート上に置き、これに４Ｃ Ｏ０５に培地と濾紙ディスクをアガールの頂部に加えて２〜３日共培養した。移 植片を、カルベニシリン１０００ｍｇ／ｌおよびセフォタキシムｔｏｏｍｇ／ｌ を含有するＭＳ１０４プレートに３日間移した。ついで移植片を、選択相として 、グリフォゼート０．０５ｍＭ、カルベニシリン１０００ｍｇ／ｌおよびセフオ タキシムｌ　ＯＯｍｇ／ｌを含有する新鮮なＭＳ　Ｉ　Ｏ４培地に移した。４〜 ６週時に、若芽をカルスから切断して、ＭＳＯとカルベニシリン５００ｍｇ／ｌ の発根培地に置いた。３〜５日で根か形成され、この時点て、発根プレートから 葉片を採取し、グリフォセート耐性とその材料が形質転換されていることを確認 した。

ペチュニア植物を植物のトランスホーメーションベクターｐＭＯＮ１１０３０て トランスホームした。ｐＭ。

Ｎ１１０３０の地図は図１９に示す。このプラスミドは本質的には、プラスミド の大腸菌における複製ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｊｕｍへの導入およびその 中での複製を可能にする上述の細菌レプリコン系からなるものである。図１９に 示すように、このプラスミドはさらに、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマ イシン選択可能マーカー遺伝子（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ　）を含有し、Ｔ−ＤＮＡ右ボ ーダーと左ボーダーの間には、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター−Ｅ９３°カセットに おけるＣＴＰ２−　ＣＰ４合成５−エノールビルビル−３−シキミ酸ホスフェー トシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子が配置されている。ＣＴＰ２−　ＣＰ４合成 遺伝子はグリフオゼートの存在下における生育能により、形質転換された細胞の 選択を可能にする。ＣＴＰ　２は葉緑素輸送ペプチドであり、そのＤＮＡ配列は 図２０（配列番号１３）に示す。グリフオゼートに対する抵抗性を付与できる遺 伝子、ＣＰ　４ＥＰＳＰＳのＤＮＡ配列は、図２１（配列番号１４）に示す。単 離体６Ｇ５からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子は、ＦＭＶプロモーターとツバリン シンターゼ３′領域の間に、ユニークなＮｏｔ１部位への２．０ＫｂＮｏｔｌフ ラグメントとして配置され、ｐＭＯＮ１１０３７を形成する。

トランスホームされたペチュニア組織におけるＡＣＣデアミナーセ蛋白の存在は 、例８に記載した葉ディスクのイムノプロット分析によって確認された。再生ペ チュニア植物６個中５個の葉組織にＡＣＣデアミナーセか検出された。

ｐＭＯＮ１１０３０でトランスホームされたトランスジェニックペチュニア植物 のエチレンレベルについても、ＡＣＣデアミナーゼ発現ペチュニア植物て測定し た。この植物におけるエチレンレベルは、トランスホームされていない対照植物 におけるエチレンレベルの約半分に減少していた。エチレン発生アッセイの結果 を以下の表５に示す。

エチレン合成（口１／ｇ／ｈ） 植物系統　葉組織 ３５８６１　０．５８ ３５８６０　０．５３ ３５８６２　０．６２ 対照　１．０９ これらのデータは、ＡＣＣデアミナーゼ蛋白を発現するトランスジェニック植物 では、葉組織のエチレンレベルが低下していることを例証するものである。この ような植物では、非トランスジェニック植物に比へて、花および葉の老化は減弱 することが期待される。

本明細書中で言及した報文および特許は、それらの報文および特許ごとにと（に その上述へていないが、すべて参考として本明細書に導入される。

以上の記述から、本発明は、前述の本発明の目的および対象のすべてを達成する ために十分適合するものであること、ならびに本発明の自明のまた本発明に固有 の利点が明白であろう。

ある種の特徴および組合せについてはとくに触れていないが、それらが有用であ り、容易に採用できるものてあることは明らかであろう。これらは、本発明のに よって予想されるものであり、本発明の範囲に包含される。

本発明は、その範囲から逸脱することなく多くの実施態様をとることが可能であ り、本明細書および図面に掲げだすへての記載は例示の目的であって、いかなる 意味においても本発明を限定するものではないことを理解すべきである。

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（１９８５１Ａ　５ｈｏｒｔ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｓ　 １ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｒ 　ａ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｒｄｉｎｇ　ｒｉｂｕｌｏｓｅ　１．５−ｂｉｓｐｈｏ ｓｐｈａｔｇｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｓｍａｌｌ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｏｒ　ｐ ｅａ−Ｎａｔｕｒｅ　３１５．２００−２０４゜Ｎｅｕｈａｕｓ、　Ｇ、　ｅｔ 　ａｌ、　（１９８７）　７５：３０゜０ｄｅｌｌ、　Ｊ、Ｔ、、　Ｎａｇｙ、 　Ｆ、、　ａｎｄ　Ｃｈｕａ、　Ｎ、Ｈ，（１９８５）、　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ　ｏｆＤＮＡ　６ｅｑｕｅｎｃａｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ａ ｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　ｍｏｓａｉｃｖｉｒ ｕｓ　３５８　ｐｒｏｍｏｔａｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．８１０−８１２゜ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｄ　Ｍａｎ ｉａｔｉｓ、　Ｔ、　（１９８９）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　−５ｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃ ｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

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Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ 　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａＬｉｏｎ　盾秩@ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓａ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｒ ｏｌｌｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒ　ｓｐｅｅｉｆｉ■ ｇｅｎｅｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２ ．１０７４−１０７８゜Ｔａｂｏｒ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｔａｂｏｒ　Ｈ，１９８’ Ａ　Ｔｈｅ　５ｐｅＥｓｐｅＤ　ｏｐｅｒｏｎ　ｏｒ　Ａ”、　ｃｏｌｉ、　Ｊ 。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２：１６０３７−１６０４０゜Ｔａｌｍａｄｇｅ、　 Ｌ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、、　℃ｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｒ　 ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈ　ｕｎｉｑｕｅ　ＰｓｔＩ　ｃｌｏｎ ｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｄ ｉｎｇｒｅｇｉｏｎ”　Ｇｅｎｅ、　（１２）　２３５−２４１　（１９８０） 。

Ｖａｎ　Ｄｅｒ　５ｔｒａｅｔｅｎ、Ｄ、、　Ｖａｎ　Ｗｉｅｍｅｅｒｓｃｈ、 　Ｌ、、　Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｈ，ａｎｄＶａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、　（ １９９０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７： ４８５９−４８６３゜Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、 　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｐｌａｓｍ ｉ■ ＤＮＡ、　Ｍｅｔｈｏｄ９．　Ｅｎｚ）ｒｍｏ＋、　１５３：　３　（１９８７ ）。

Ｗａｒｄ、　Ｔ、、　Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｍ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｊ、、　５ ｅｌｆ、　Ｒ，、ａｎｄ　０ｓｂｏｒｎｅ、　Ｄ、　（１９V８） Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ｒｎｏｄｉｆｙｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ、　３”（９）−０−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　 １３ｎｏ、１９．７０９５−７１０６゜Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ−、Ｒｏｇｅｒ ｓ、　Ｓ、Ｇ−、Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，Ｂ、、　５ａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、Ｒ，、 Ｆｌｉｃｋ。

Ｊ、Ｓ、、　Ａｄａｍｓ、　Ｓ、Ｐ、、　Ｂｉｔｔｎｅｒ、　Ｍ、Ｌ、、　Ｂｒ ａｎｄ、　Ｌ、Ａ、、　Ｆｉｎｋ、　Ｃ，Ｌ、、　Ｆｒｙ。

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Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏＣｔｈｅ　ＣａＭＶ　３５８　ｐｒｏｍｏｔ＋ｅｒ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｒｅｓｔ、ｅｓ　ａ　ｓｔｒｏｎｇｅｎｈａｎｃｅｒ　 ｆｏｒ　ｐｌａｎＬ＋、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．１２９９−１３０２゜Ｋｌ ｅｉｎ、　Ｔ、Ｍ、、　Ｗｏｌｄ、　Ｅ、Ｄ、、　Ｗｕ、　Ｒ−ａｎｄ　５ａｎ ｆｏｒｄ、　Ｊ、Ｃ，（１９８７）　Σ社ｕ１３２７：７０−７３゜ Ｋｏｎｃｚ、　Ｃ，、ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　（１９８６）、Ｔｈｅ　 ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｒ　ＴＬ−ＤＮＡ　ｇｅｎｅ　５ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｔｈ ｅ　ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒ　ｃｈｉｍ ｅｒｉｃ　ｇｅｎｅｓ　ｃａｒｒｉ■■ ｂｙ　ｎｏｖｅｌ　ｔｙｐｅ　ｏｒＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｎａｒｙ 　ｖｅｃｔｏｒ、　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２０４゜３８３−３９６゜ Ｌｉｎｃｏｌｎ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｆｉｓｃｈｅｒ、　Ｒ，（１９８８）、　Ｄ ｉｖｅｒｓｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　 ｏｆｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 、　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　ＧｅｎｅＬ２１２、７１−７５゜ ′　配列表 配列番号：１ 配列の長さ：１０７９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数−二本鎖 トボロジー：直鎖状 配列の種類・ＤＮＡ　（ゲノム） 配列： 配列番号＝２ 配列の長さ・３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 ）・ボロジー、直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列： Ｇｋ）＋ＧＧＡＡＧＣＴ　ＴＣＡＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＴＡＴＴ　Ｃ配列 番号＝８ 配列の長さ：１８００１８０ ０塩基対：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　ｃ　ＤＮＡ　−ｍ　ＲＮＡ配列。

ＧＴＣ（ｉＡＴ　へ＾丁　ττＴ　Ｃ？Ａ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　＾ＧｃＧＣＧ　＾ τＣ八ＧＧ　ＴＴＡ　にＧＴ　＾へ＾　八ＣＧ　ＣＡＣ１１P１２ ττＡＧｅＴＡＡＴ？　ｕ　１８００ 配列番号　９ 配列の長さ・９００塩基対 配列の型：核酸 鎖の数２二本鎖 トポロジー・直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列。

ＧＸＡ　ＣＴＣＴＡ？　ＡＡ’ｒ　ＣＣＣ入ＡＣＣＧ’Ｔ　ＣＴＣＡｃｅ　にＡ Ａ　ＸτＣｃＴＣＴＣＡ　ＣＡＡ　ＡＣＣＴＧＴ　１９７ＧＴＣ０丁丁　ＧＣＣ ＣＡＴ　ＣＴ’ｒ　ＧＡＴ　Ａ入Ａ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＧＣＧ丁＾　 ＣＡＴ　Ａｃｅ　ｔ＾ｃ　ｃｃａ　コW９ ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＣＣ？　ＣＡＪＩ　ＧＧＣＧに丁　ＴＴＡ　ＴＣＴ　 Ａｃｅ　Ｔｒｃ　ＣＧＣＧＣＣＧＮＴ　ＡＴＴ　ＣＡＢ　４R７ （：、ＴＣＴＣＴ　ＡＣＣＴＧＣＧＣ，ＣＧＴＧ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　Ｃ ＴＣＡＡＧ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ｉＡＴ　ＴＡＣＣＴＧ　４１P５ ＾丁ｅ　ＣＡＣＣＡＣｅｒτ　ＣＡＣＴＣＱ　ＣＡＴ　＾ＴＣＧτＡ　＾ＣＣ＾ Ｔ丁　ＣＡＴ　丁＾丁ＣＧｅ　Ｇ↑ＣＣＧＣ５３〕！１＠　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｌ ａｕ　Ｃ１ｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌ＠　ＶａＬ　τｈｒ　ｌ１ｌｌ　Ａｍｐ　 −、：　λｒｇ　Ｖａｌ　＾ｒX ＧＯＴＴＴＴＡＣＣＣＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＧＣ？Ａ↑ＣＡＡＧＣ＾Ｃｍ＾Ｔ ＣＧＡｃＣＡＴＧＡＯ５８Ｌ丁＋１；ｌ１ｍ？ＡＡＧｃ　（：ＣＣＣＡＣＩＣＡ Ｃ９００配列番号・ＩＯ 配列の長さ：Ｉ］３８塩基対 配列の型　核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ＣＡＴＴｍＡＧＡＡＡ’ｆｆＡＴＴＣＴＡＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＧπＣ入入入Ａ Ｃ＾ＡＧＡ丁Ｃ丁八入ＡＧＣＣＣ？ＡＣＡＣ１１３８配列番へ人Ｉｆ 配列の長さ・２７へ人対 配列の型：核酸 鎖の数・一本鎮 トポロジー・直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列： 配列番号：１２ 配列の長さ＝２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数、−重鎖 トポロジー、直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 ＣＣＣＣ；ＧＡＴＣＣＧ　ＣＣＧＴＴＡＣＧＡＡ　ＡＣＡＧＧ＾Ａ配列番号：１ ３ 配列の長さ・３１８塩基対 配列の型・核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー　直鎖状 配列の種類　ＤＮＡ　（ゲノム） 配列： １０　ｉｓ　２０　２５ ＣＧＣＭＡ　丁ｃｒ　ｃｃｃ　ｔＴ＾　丁ＣＧ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ｋＡ Ｇ　λＣＸ；　（ＪＧ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＣＧＡ　Q０９ ｃｃ丁丁＾↑　ＣＣＣＡＴＴ　ＴＯ１＋　ＴＣＱ　ＴＣＱ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　Ｔ ＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣＡＣ１１＋@２５７ 配列番号・１４ 配列の長さ：１３７７塩基対 配列の型、核酸 鎖の数、−重鎖 トボロジー：直鎮状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （、ＴＧ　ＡＡＧ　ＴＣ７ＣＡＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　Ｃ ＣＡ　ＣＴＴ　ＡＣＣＴＴＧ　ＣＧＴ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　４V９ ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣＧ　ＣＣＡ　ＡＴＣＡＣＣ丁ＡＣＡＧＧ　ＧＴｋ 　ＣＣＴ　ＡＴＧにＣＴ　ＴＣＣＧＣｒ　ＣＡＡ　５２７＾ＣＴ　０丁丁　ＡＴ ＣＧＡＧ　ＣＣＡ　ＡＴＣＡＴＩＩ？　ＡＣＴ　ＣＣ；Ｔ　ＧＡＣＣＡＣ＾Ｃ？ Ｃ入八　八へＧ　ＡＴＧ　０７丁　６Qコ ＣＡＡＧＧＴ丁Ｔ？ＧＧＴＣｅＴＡＡＣ（ＴＴ＾ＣＣＣＴＴＣ＾ＧＡＣτＣ八Ｔ Ｇｅ？ＣλＣａＣ丁ＣＴＣへ７１ＣＣＴＡＣＣＡ丁ＣＣＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴ ＣＧ丁ＧＧＴ＾ＡにＣＴＣ＾ＣＣＧＧＴＣＡＡにＴＯＡＴＴ７１９Ｔ？Ｇ　ＣＴ Ｔ　ＧＴＴ　ＣｅＡ　ＣＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡ（：Ｃ＾？ＣＣＴＴ＾ＡＣＧ ＴＴ　ＴｉＧ　ＡＴｃ　Ｍｅ　１１１５ＣＣＡ　ＡＣＣｃｃＴ　ＡＣＴ　ＧＯＴ 　ＣＴＣＡＴＣＴＴＧ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＣＧＡＡ　為ＴＧ　ＧＧＴ　ＧＣ Ｃ（ｉＡｃ　８６３ＧＣＡ　ＴＴＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣＧ ＴＴ　ＡＴＯ＾＾ＣＣＣ丁ｍｃ＾＾　ＧＡＡ　ＣτＣＣＧテ　１０５５Ｃ：ＴＴ 　ＭＧ　ＣＡＡ　ＡＧＣＧＡＣｅＣＴ　Ｃ’ｔＴ　丁Ｃ？　ＧＣＴ　（ｉ？ｃＣ ｄ　）ＬＡＣＯＧＴ　ＩＹｃ　ＭＧ　ＣＴＣ！１０R ＡＡＣＧＧＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　丁ＧＣＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＯＴ　ＧＡＧ　ＡＣ Ｔ　ＴＣＴ　ＣＴＣＧＴＣＧＴＧ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　１１５P 配列番号＝１５ 配列の長さ：ｌ０２９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー、直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ＣＣＡ　ＣＴＧ　（＋ＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧ　ＴＴＣＧＡＴ　ＡＴＣＧＧＣＡ ＴＴ　ＣＧＧ　ＣＣＣＡＧＣＴｌｌ；Ｇ　ＧＡＧ　４コ２ＭＧ　ＧＣＣＡＴｃＩ ＣＡＣＣＡＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＧＧＴ　ｌ＆ｃ　ＡＡＩｆｆ 　Ｗ　ＴＴＣＣＣＧ　ＡＴＡ　４８０ｃｃｃ　ｃｃｃ　（、ＧＴ　ＴＣＴ　ＴＣ ＣＣＡＡ　ＣＡｅ　ＣＣＣＴＡＣＧＣＣにＧＣＣＴＴ　Ｃ＆　ＴＴＣＧ丁ＣＧＧ ０　５２８１ゴＧＣＣＧＡＧ　ＣＡＡ　Ｇπ国＾ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡ Ａ　Ｃ紡ＣＴＧαｔπＣ＾国ＴＴＣ５７６Ｐｈｅ＾Ｌｍ　Ｇｂ＋　Ｇｌｕ　Ｖａ ｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈ ｅ　Ｔｈｔ　ＰｈｅＣＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＴＣＴ　ＣＴＧ　Ａ ＣＣＧＧＣＡＣ’ｒ　ＡＣＣｃＡＧ　ＧＣＣＧＧＣＡＴＯ６２４ＣｉＴＣＣＴＣ ＣＧＴ　ＴＴＣＯＣＣＧＣＧ　ＧＡＣＧＧＣＣＧＴ　ＴＣ１ｌ＋　ＡＡＧ　＾＾ Ｃ０７丁　Ａｒｃ　（ｉｏｃ　ＡＴＴ　６７Q ＧＡＴＧＣＣ丁ＣＧＣＣＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡｃｅ入ＡＧＧＣ＾ＣＡＧ ＡＴＣＣＴＣＣ＋ｉ＾ＴＣ？２０にＣＣＣＯＧ　ＣＡＣＡＣＣＧＣｈ　ＧＡＧ　 ＴＴＧ　ＣＴＣにＧＡＡ　ＣＴＧ　ＧＣＣＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＡＣＣ（ｉＡ Ａ　７６８ＣＣＣ入＾ＣＧ入＾ＧＧＣＡＣ０ＣＴＧＧｊＩＡＧＣＣＡＴτＣクチ 丁テＧ丁ＧＣＧＧＧ八〇ＣＵＴＣＧ入八８６４ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣ ＣＩ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　丁ＡＣＧＡＧ　（：ＧＣＭＡ　ＴＣＣＡＴＧ　ＣＡＣＧ ＧＧ　ＡＴＣ９１２ＡＴＴ　ＣＡＡ　ＡＴＩ：；　（ＴＣＣＣＣＣＯＴ　ＧＣＣ ＧＡＧ　ＴｉＣＣＣＣＧＡＡ　ＧＧＣＴＣＣＡＡＡ　ＧＴＧ　ＣＴＣ９６０丁＾ 丁　ＧＣＧ　ＣＡＣＴＴＣＣ，ＧＴ　ＣＯＧ　ＣＣＣＣＣＴ　ＣＣＶ：　ＣＴＣ へ＾丁ＧＣＣＴＡＣ＾ＧＣＴ？ＣＣｒ１ｌ；　１００８ｍ　ＣにＴ　入＾Ｃ００ ＣＣＧＡＴＣｅｃにＣｉ０２９配列番号　１６ 配列の長さ、３３８アミノ酸 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 配列番号：１７ 配列の長さ＝５９７塩基対 配列の型、核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー二直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ＴＡＴ入ＡＧＡＡＧＧ　ＣＡＴＴＣＡＴＴＣＣＣＡｍＣＸ＾にＧ　ＡＴＣＡＴＣ ＡＧ＾τ　＾ＣＴ入＾ＣＣ入＾τ　Ａｆｆ丁ＣτＣ５９フ株　試験した単離体の 数 ＦｆＧ、７ （〕 Ｎ） ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、５ 右ボーダー ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、１３ ば） （う ムー ｏ　ｏ　ｏ　Ｏｏ　。

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罠蕎畦灯葺■」を韮■珪８引ｌ 葺芥畦珪÷訂扉隷射参韮肛■ Ｆ／６．１８ ＦＩＧ、　１９ Ｏ（ （り 一 ム− へ （う ムー 手続補正書（蛇） 特許庁長官殿　靭５４８”９−− １、事件の表示 果実の成熟および植物の老化の制御 ４、代理人 ６−ネ喝正により増力口する言青求項の数７−補正の対象 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文 ８−　補正の内容　別紙のとおり 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物細胞内においてＲＮＡ配列の産生を惹起する機能をもつプロモーター； １−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デアミナーゼ酵素をコードするＲＮ Ａ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配列；および植物細胞内においてＲＮＡ配列 の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を惹起する機能をもつ３′非 翻訳領域；から順次なり、上記プロモーターは上記構造ＤＮＡ配列に関して異種 である、組換え二重鎖ＤＮＡ分子。 ２．プロモーターは植物ＤＮＡウイルスプロモーターである請求項１記載のＤＮ Ａ分子。 ３．プロモーターはＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群 より選ばれる請求項２記載のＤＮＡ分子。 ４．プロモーターは果実特異的プロモーターである請求項１記載のＤＮＡ分子。 ５．プロモーターはトマトからのＥ８プロモーターである請求項１記載のＤＮＡ 分子。 ６．構造ＤＮＡ配列は配列番号１の配列である請求項１記載のＤＮＡ分子。 ７．構造ＤＮＡ配列は単独窒素源としてＡＣＣを含有する培地中で生育を保持で きる微生物からのものである請求項１記載のＤＮＡ分子。 ８．担果実植物の果実の成熟を制御する方法において、その担果実植物の細胞を 獲得し；その担果実植物の細胞を、植物細胞内においてＲＮＡ配列の産生を惹起 する機能をもつプロモーター、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デア ミナーゼ酵素をコードするＲＮＡ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配列および植 物細胞内においてＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加 を惹起する機能をもつ３′非翻訳領域からなり、上記プロモーターは上記構造Ｄ ＮＡ配列に関して異種であるキメラ遺伝子で形質転換して、そのキメラ遺伝子を 上記植物細胞のゲノム中に挿入し；その形質転換植物細胞から植物を再生し、形 質転換担果実植物を成長させて果実を生成させる各工程からなる方法。 ９．プロモーターは植物ＤＮＡウイルスプロモーターである請求項８記載のＤＮ Ａ分子。 １０．プロモーターはＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＦＭＶ３５Ｓプロモー ターからなる群より選ばれる請求項９記載のＤＮＡ分子。 １１．プロモーターは果実特異的プロモーターである請求項８記載のＤＮＡ分子 。 １２．プロモーターはトマトからのＥ８プロモーターである請求項８記載のＤＮ Ａ分子。 １３．構造ＤＮＡ配列は配列番号１の配列である請求項８記載のＤＮＡ分子。 １４．構造ＤＮＡ配列は単独窒素源としてＡＣＣを含有する培地中で生育を保持 できる微生物からのものである請求項８記載のＤＮＡ分子。 １５．植物の果実の成熟を遅延させる方法において、その植物中でのエチレンの 産生を低下させるのに十分なレベルの１−アミノシクロプロパン−１−カルボン 酸デアミナーゼをその植物内に発現させる方法。 １６．担果実植物からの果実の貯蔵寿命を延長する方法において、その担果実植 物の細胞を獲得し；その担果実植物の細胞を、植物細胞内においてＲＮＡ配列の 産生を惹起する機能をもつプロモーター、１−アミノシクロプロパン−１−カル ボン酸デアミナーゼ酵素をコードするＲＮＡ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配 列および植物細胞内においてＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオ チドの付加を惹起する機能をもつ３′非翻訳領域からなり、上記プロモーターは 上記構造ＤＮＡ配列に関して異種であるキメラ遺伝子で形質転換して、そのキメ ラ遺伝子を上記植物細胞のゲノム中に挿入し；その形質転換植物細胞から植物を 再生し、形質転換担果実植物を果実の産生が開始されるまで成長させ；その果実 が発生のブレーカーステージに到達した時点でその果実をその植物から除去する 各工程からなる方法。 １７．さらにその果実をエチレンに暴露してその果実の所望の成熟を達成する工 程からなる請求項１６記載の方法。 １８．植物細胞内においてＲＮＡ配列の産生を惹起する機能をもつプロモーター 、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デアミナーゼ酵素をコードするＲ ＮＡ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配列および植物細胞内においてＲＮＡ配列 の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を惹起する機能をもつ３′非 翻訳領域からなり、上記プロモーターは上記構造ＤＮＡ配列に関して異種である 形質転換植物。 １９．植物はトマト、バナナ、キーウィフルーツ、アボガド、メロン、苺、マン ゴ、パパイヤ、りんご、桃、キャベツ、カリフラワー、レタス、玉葱、ブロツコ リー、綿、カノラ、アブラナ、カーネーション、およびバラからなる群より選ば れる請求項１８記載の形質転換植物２０．植物はトマトである請求項１８記載の 形質転換植物。 ２１．構造ＤＮＡ配列は配列番号１の配列である請求項１８記載の形質転換植物 。 ２２．植物細胞内においてＲＮＡ配列の産生を惹起する機能をもつプロモーター ；１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デアミナーゼ酵素をコードするＲ ＮＡ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配列；および植物細胞内においてＲＮＡ配 列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を惹起する機能をもつ３′ 非翻訳領域からなり、上記プロモーターは上記構造ＤＮＡ配列に関して異種であ るトマト果実。 ２３．プロモーターはゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルスからの 完全長（３５Ｓ）プロモーターである請求項２２記載のトマト果実。 ２４．構造ＤＮＡ配列は配列番号１の配列である請求項２３記載のトマト果実。 ２５．植物中に産生するエチレンのレベルを低下させる方法において、その植物 中での１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸代謝酵素を、定常状態１−ア ミノシクロプロパン−１−カルボン酸濃度を少なくとも約７０％まで低下させる のに十分なレベルで発現させる方法。 ２６．１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸代謝酵素は１−アミノシクロ プロパン−１−カルボン酸デアミナーゼである請求項２５記載の方法。 ２７．定常状態１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸濃度は少なくとも約 ９０％まで低下させる請求項２５記載の方法。 ２８．植物中に産生するエチレンのレベルを低下させる方法において、その植物 中での１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸代謝酵素を、定常状態のエチ レン濃度を少なくとも約７０％まで低下させるのに十分なレベルで発現させる方 法。 ２９．１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸代謝酵素は１−アミノシクロ プロパン−１−カルボン酸デアミナーゼである請求項２８記載の方法。 ３０．定常状態のエチレン濃度は少なくとも約９０％まで低下させる請求項２８ 記載の方法。