JP2018527931A - 植物のオクロバクテリウム(ochrobactrum)媒介形質転換 - Google Patents
植物のオクロバクテリウム(ochrobactrum)媒介形質転換 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2015年8月28日に出願された米国仮特許出願第62/211267号の優先権を主張するものであり、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の正式な写しは、2016年8月24日に作成のファイル名20160826_6502WOPCT_SeqList.txtの、861KBのサイズを有するASCIIフォーマットの配列表として、EFS−Webを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このASCIIフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
組成物には、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)の株、トランスファーDNA、ならびにコンストラクトおよび/またはプラスミドが含まれる。これらの組成物には、1つ以上のビルレンス遺伝子、ボーダー領域および/または複製起点を含むプラスミドを有するオクロバクテリウム(Ochrobactrum)の株が含まれる。本方法で作製される目的ポリヌクレオチドを含む植物細胞、組織、植物および種子もまた提供される。
本開示の1つの態様は、単離されたオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1を特徴とし、前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)はNRRL B−67078として寄託されている。
を含む、作動可能に結合しているベクターを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1を提供する。ある態様では、第1の核酸および第2の核酸は、単一のポリヌクレオチド分子上に存在する。ある態様では、第1の核酸および第2の核酸は、別々のポリヌクレオチド分子上に存在する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)はさらに選択マーカー遺伝子を含む。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン/カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子、npt1遺伝子、npt2遺伝子、hpt遺伝子、SpcN遺伝子、aph遺伝子、またはaadA遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子である。ある態様では、aacC1遺伝子は、配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、aadA遺伝子である。ある態様では、aadA遺伝子は、配列番号39、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、npt1遺伝子である。ある態様では、npt1遺伝子は、配列番号40、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、npt2遺伝子である。ある態様では、npt2遺伝子は、配列番号41、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、hpt遺伝子である。ある態様では、hpt遺伝子は、配列番号67、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号77、またはその変異体およびフラグメントを有するSpcN遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号78、またはその変異体およびフラグメントを有するaph遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、tetAR遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。ある態様では、対抗選択マーカー遺伝子は、sacB遺伝子、rpsL(strA)遺伝子、pheS遺伝子、dhfr(folA)遺伝子、lacY遺伝子、Gata−1遺伝子、ccdB遺伝子、またはthyA遺伝子である。ある態様では、vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号4〜14、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virB1〜virB11:あるいは、それぞれ配列番号80〜90、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11を含み、ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11を含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号16〜17、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virC1〜C2:あるいは、それぞれ配列番号92〜93、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子r−virC1〜C2を含み、ビルレンス遺伝子r−virC1〜C2を含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号18〜19、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD1〜D2:あるいは、それぞれ配列番号94〜95、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子r−virD1〜D2を含み、ビルレンス遺伝子r−virD1〜D2を含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、vir遺伝子領域は、配列番号15、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virG:あるいは、配列番号91、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子r−virGを含み、ビルレンス遺伝子r−virGを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、vir遺伝子領域は、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virF、またはその変異体および誘導体の1つ以上を含み、ビルレンス遺伝子r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virFを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、配列番号26、または変異体および誘導体を有するr−virA、あるいは、配列番号79、またはその変異体および誘導体を有するr−virAビルレンス遺伝子であり、ビルレンス遺伝子r−virAを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD3〜D5は、それぞれ配列番号20〜22、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、r−virD3〜D5ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号96〜98、またはその変異体および誘導体を有し、ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5を含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virE1〜E3は、それぞれ配列番号23〜25、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、r−virE3ビルレンス遺伝子は、配列番号100、またはその変異体および誘導体を有し、ビルレンス遺伝子r−virE3を含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virH−H1は、それぞれ配列番号42〜43、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virKは、配列番号45、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virLは、配列番号46、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virMは、配列番号47、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virPは、配列番号48、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virQは、配列番号49、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD3〜D5およびvirE1〜E3、またはそれらの変異体およびフラグメント、あるいはr−virD3〜D5およびr−virE3、またはそれらの変異体および誘導体であり、ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5およびr−virE3を含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD3〜D5およびvirE1〜E3、またはそれらの変異体およびフラグメント、あるいはr−virD3〜D5およびr−virE3、またはそれらの変異体および誘導体であり、ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5およびr−virE3を含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、Col E1、pSC101、p15AまたはR6K複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、Col E1複製起点に由来する。ある態様では、Col E1複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、pSC101複製起点に由来する。ある態様では、pSC101複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号50、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、p15A複製起点に由来する。ある態様では、p15A複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号51、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、R6K複製起点に由来する。ある態様では、R6K複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号52、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、高コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、中コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、低コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa、またはpBBR1複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pRK2複製起点の変異体である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための
複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pVS1複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pSa複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号3、37、38、53、57、58、59、60もしくは112、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、repABC適合複製起点である。ある態様では、repABC適合複製起点は、配列番号57、58、59もしくは60、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点、ならびに、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、同じ複製起点である。ある態様では、複製起点は、pRK2複製起点、pSa複製起点、またはpRFS1010複製起点に由来する。ある態様では、複製起点は、pRK2複製起点に由来する。ある態様では、pRK2複製起点は、配列番号38、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、pSa複製起点に由来する。ある態様では、pSa複製起点は、配列番号53、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する。ある態様では、pRFS1010複製起点は、配列番号37、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、pRK2複製起点は、ミニもしくはミクロpRK2複製起点である。ある態様では、pRK2複製起点は、ミクロpRK2複製起点である。ある態様では、ミクロpRK2複製起点は、配列番号54、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、pRK2複製起点は、ミニpRK2複製起点である。ある態様では、ミニpRK2は、配列番号66、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、pRK2複製起点は、trfAおよびOriV配列を含む。ある態様では、pRK2複製起点は、配列番号64および65、またはそれらの変異体およびフラグメントを含む。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、par DEオペロン由来の配列をさらに含む。ある態様では、par DEオペロンは、配列番号55、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ベクターは、配列番号34、35、36、106、113もしくは114、またはその変異体および誘導体のいずれか1つを含む。他の態様では、本開示は、(a)vir遺伝子領域を含む第1の核酸であって、vir遺伝子領域は目的配列をコードする核酸をVirD2依存的様式で植物細胞に導入するように作用する第1の核酸;および(b)目的配列に作動可能に結合した1種以上のT−DNAボーダー配列を含む第2の核酸を含む、作動可能に結合しているベクターを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1を含むキットを提供する。
様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、Col E1、pSC101、p15AまたはR6K複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、Col E1複製起点に由来する。ある態様では、Col E1複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、pSC101複製起点に由来する。ある態様では、pSC101複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号50、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、p15A複製起点に由来する。ある態様では、p15A複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号51、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、R6K複製起点に由来する。ある態様では、R6K複製起点に由来する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号52、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、高コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、中コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、低コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa、またはpBBR1複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pRK2複製起点の変異体である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pVS1複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、pSa複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号3、37、38、53、57、58、59、60もしくは112、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、repABC適合複製起点である。ある態様では、repABC適合複製起点は、配列番号57、58、59もしくは60、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点、ならびに、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点は、同じ複製起点である。ある態様では、複製起点は、pRK2複製起点、pSa複製起点、またはpRFS1010複製起点に由来する。ある態様では、複製起点は、pRK2複製起点に由来する。ある態様では、pRK2複製起点は、配列番号38、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、pSa複製起点に由来する。ある態様では、pSa複製起点は、配列番号53、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する。ある態様では、pRFS1010複製起点は、配列番号37、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、pRK2複製起点は、ミニもしくはミクロpRK2複製起点である。ある態様では、pRK2複製起点は、ミクロpRK2複製起点である。ある態様では、ミクロpRK2複製起点は、配列番号54、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、pRK2複製起点は、ミニpRK2複製起点である。ある態様では、ミニpRK2は、配列番号66、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、pRK2複製起点は、trfAおよびOriV配列を含む。ある態様では、pRK2複製起点は、配列番号64および65、またはそれらの変異体およびフラグメントを含む。ある態様では、本方法は、par DEオペロン由来の配列をさらに含む。ある態様では、par DEオペロンは、配列番号55、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ベクターは、配列番号34、35、36、106、113もしくは114、またはその変異体および誘導体のいずれか1つを含む。
作動可能に結合している、(a)エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点(b)オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点、(c)選択マーカー遺伝子、ならびに(d)リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virB1〜B11もしくはr−virB1〜B11、virC1〜C2もしくはr−virC1〜C2、virD1〜D2もしくはr−virD1〜D2、およびvirGもしくはr−virG、またはその変異体および誘導体(ここで、ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11、r−virC1〜C2、r−virD1〜D2およびr−virGを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む)を含む第1のベクターと;作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2のベクターとを含むオクロバクテリウム(Ochrobactrum)と;(b)植物の形質転換に使用するための説明書とを含むキットを提供する。
は、本方法は、ゲノム中に目的配列を含む植物を再生させることをさらに含む。ある態様では、植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物由来である。ある態様では、植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ソルガム、オオムギ、カラスムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属(Brassica)、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)を、植物細胞と接触させる前に、アセトシリンゴン、またはvir遺伝子もしくはr−vir遺伝子の作用を誘導する他の化合物の存在下で培養する。ある態様では、植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎の外植体に含まれ、その外植体をオクロバクテリウム(Ochrobactrum)と接触させる。ある態様では、外植体は、萌芽期の分裂組織、体細胞の分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節を含むか、または葉、根もしくは茎の組織を含む。ある態様では、目的配列を含む植物細胞の同定を、選択剤の非存在下に行う。ある態様では、目的配列を含む植物細胞の同定は、選択剤の存在下に植物細胞を培養することを含む。ここで、目的配列は、選択剤に対する耐性を与えるか、または選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に送達される。ある態様では、選択剤は、クロルスルフロン、エタメツルフロン、イマザピル、グリホサート、カナマイシン、スペクチノマイシン、ビアラホス、2,4−Dまたはジカンバである。ある態様では、目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない。ある態様では、マーカー遺伝子および目的配列は、目的配列を含む植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、第2の目的配列を含む、作動可能に結合している第3のベクターをさらに含む。ある態様では、植物細胞からの植物の再生は、植物細胞を含む外植体から1つ以上のシュートの形成を誘導し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む。ある態様では、再生は器官形成により起こる。ある態様では、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1、オクロバクテリウム・サイティシ(Ochrobactrum cytisi)、オクロバクテリウム・デジョネンス(Ochrobactrum daejeonense)、オクロバクテリウム・ルピネ(Ochrobactrum lupine)、オクロバクテリウム・オリゼ(Ochrobactrum oryzae)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)、LBNL124−A−10、HTG3−C−07およびオクロバクテリウム・ペクトリス(Ochrobactrum pectoris)からなる群から選択される。ある態様では、ベクターは、配列番号34、35、36、106、113もしくは114、またはその変異体および誘導体のいずれか1つを含む。
プラスミドpVir8(PHP70365;配列番号106)はvir遺伝子、および標準の分子生物学手法を用いてエシェリキア・コリ(E.coli)中に構築されたT−DNAを有する38.8kbのベクターである。これは、広範囲の細菌中で安定な複製のために2つの複製起点(ColE1、pVS1)を有し、抗生物質ゲンタマイシン耐性をコードする。これは、高毒性pTiBo542 Tiプラスミドからの約27kbのvir遺伝子ならびに植物を対象とする選択bar(除草剤ビアラホス耐性遺伝子)マーカーおよび目視で赤色の蛍光タンパク質マーカーをコードするT−DNAを含有する。PCRを用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)AGL1株(Lazo et al.(1991)Biotechnology 10:963−967)に含まれるpTiBo542 Tiプラスミド(Genbankアクセッション番号DQ058764およびNC_010929)からVir遺伝子の複製物を単離した。Vir遺伝子には次のものが含まれた:virA、virJ、virB1−B11、virG、virC1−C2、virD1−D5およびvirE1−E3。安定性の向上とサイズの削減のために、virAおよびvirJ間の挿入配列IS66ならびにvirJおよびvirB1間の領域それぞれを削除した。
タバコBY−2細胞は、日本国文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを通して理化学研究所バイオリソースセンターから提供された。タバコBY−2懸濁培養のメンテナンス方法は、基本的には、Nagata et al.(Int Rev Cytol(1992)132:1−30)により報告されており、修正BY−2懸濁細胞法(Newman et al.(1993)Plant Cell 5:701−714)を用いてDsREDの一過性発現を行った。
各種の分析を行い、植物の形質転換に使用したオクロバクテリウム(Ochrobactrum)の種を決定した。最初に、MasterPure(登録商標)DNA Purification Kit(カタログ番号MCD85201、Epibio、Madison、WI、USA)を用いてゲノムDNAを調製した。24種の細菌から抽出したゲノムDNAを用い、PTC−100TM Programmable Thermal Controller(MJ Research、Inc.,San Francisco、CA、USA)を使用してPCRを行った。増幅に用いたプライマーは:
配列番号102 16S−F 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
配列番号103 16S−R 5’ ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3’であった。
EP1A09種を同定する試みで、以下の方法を用いた:(配列番号104)の詳細な16S rDNAの相同性検索、抽出した微生物脂肪酸エチルエステル(FAME)のガスクロマトグラフィー分析およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化法を使用する飛行時間型質量分析法(MALDI−TOF)。これらの分析はMIDI Labs(Newark、DE、USA)によって行われた。
IDが既知の数種のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)培養回収株と共に、新規のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)株のドラフトゲノムアセンブリを構築した(表6)。Illuminaが開発したライブラリー構築手順に従ってゲノムDNAを調整し、Illumina MiSeqを使用して配列を決定した。要約すれば、DNAをCovaris S220装置でせん断した後、得られたDNAフラグメントの末端修復を行い、A−塩基の付加のためにそれらの3’末端を処理した。Illumina特異的アダプターのライゲーションおよびゲルベースのサイズ選択の後、アダプター連結DNAフラグメントをIllumina特異的PCRプライマーと共に制限PCR増幅に供した。Illuminaの指示に従いIllumina MiSeqにより、増幅DNAフラグメントのクラスター形成およびペアエンドシーケンスを行った。シングルフローセルに菌株からのDNAフラグメントを供給した。Illuminaの画像解析およびベースコール用パイプラインソフトウェアにより、配列および品質スコアを生成させた。最初のベースコールおよび処理の後、Illuminaパイプラインにより生成した配列ファイルをFASTQフォーマットに変換し、追加のカスタム品質フィルタリングを行うことにより、リードが3’末端に品質スコア<15の、1つまたはそれより多くの塩基を有する場合、そのリードを除去した。既定のkmer値を使用して、ペアエンドIlluminaリード(2×150bp)をSPAdes 3.1.1(Bankevich et al.(2012)J Comp Biol 19:455−477)によりアセンブルした。さらに、SPAdesパイプライン・オプションにより、リードエラーの修正およびミスマッチ/ショートINDELの修正を行った。アセンブルした、500bpより小さいコンティグは最終出力から除去した。
Romano et al. 2009に記載されているスキームを用いて、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)株の多座配列解析(MLSA)を行った。以下は、MLSAスキームで使用した7つの遺伝子座である:
(1)>gi|256809827|gb|ACV31014.1|コリスミ酸シンターゼ、部分的[オクロバクテリウム・アントロピ(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188];
(2)>gi|256809699|gb|ACV30950.1|70kDa熱ショックタンパク質、部分的[オクロバクテリウム・アントロピ(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188];
(3)>gi|256809647|gb|ACV30924.1|グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、部分的[オクロバクテリウム・アントロピ(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188];
(4)>gi|256809455|gb|ACV30828.1|25kDa外膜タンパク質、部分的[オクロバクテリウム・アントロピ(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188];
(5)>gi|256809287|gb|ACV30744.1|リコンビナーゼA、部分的[オクロバクテリウム・アントロピ(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188];
(6)>gi|256809135|gb|ACV30668.1|DNA依存性RNAポリメラーゼのベータサブユニット、部分的[オクロバクテリウム・アントロピ(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188];および
(7)>gi|256808991|gb|ACV30596.1|アントラニル酸シンターゼ、部分的[オクロバクテリウム・アントロピ(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188]。
基本的にGalloisおよびMarinho(Methods Mol Biol(1995)49:39−48)に記載のようにしてタバコのリーフディスク形質転換を行った。タバコ植物(ニコチナ・タバクム(Nicotiana tabacum)栽培品種Petite Havana SR1、カタログ番号NT−02−20−01、Lehle Seeds、Round Rock、TX)を1.5%の蔗糖および0.3%のGelriteを含む1/2濃度ムラシゲスクーグ(MS)培地を含有する無菌ポリプロピレン容器(カタログ番号0701、International Container Corp、Severn、MD)中、24℃で16時間の光照射(80〜110μE/m2/sの冷白色蛍光ランプ)を行いながらインビトロにて無菌培養する。4〜6週ごとに、1つの節を有する茎を培養小植物体から切除し、その後、同一の環境条件下の新鮮な1/2濃度MSに移した。
基本的にPaz et al.((2006)Plant Cell Rep 25:206−213)および米国特許第7,473,822号明細書に記載のようにしてダイズの形質転換を行った。Di et al.((1996)Plant Cell Rep 15:746−750)の記載のように、12NのHCl3.5mLと100mLの市販漂白剤(5.25%次亜塩素酸ナトリウム)を混合して製造した塩素ガスを使用して、ダイズ株の成熟した種子の表面を16時間殺菌した。殺菌した種子を室温で16時間、無菌蒸留水に浸漬した(25×100mmのペトリ皿に100個の種子)。ダイズの半切種子の形質転換に使用した各種培地の組成および植物の再生を表10にまとめる。
PHP70365をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078で形質転換した、遺伝子導入小植物を、湿らせたJiffy−7ピートペレット(Jiffy Products Ltd、Shippagan、Canada)に移し、60〜100μE/m2/sで16時間の光周期、昼/夜温度を26℃/24℃とする条件のPercivalインキュベータ中で気候順応するまで、透明プラスチック製トレーボックスに収容した(図4J)。硬化小植物を湿らせたSunGro 702培養土(770 Silver Street、AGAWAM、MA 01001)を含有した2ガロンのポットに植え、温室内で成熟して収穫できるまでに栽培した。トランスジェニック植物のうち5本は携帯的に正常に見えたが、1本は恐らくはDsREDの過剰発現のために成長が阻止された。インビトロでまたは温室内で、DsRED過剰発現トランスジェニックダイズ植物のDsRED毒性もしくは再生能力低下の兆候または表現型の効果を、形質転換していない野生型植物と比較して観察した。温室におけるT0植物の葉の組織を採取し、qPCR分析を行い、PHP70365T−DNA(RB−ATUBQ10:DsRED:PINII Term−GMUBQ:BAR GMOT:UBQ14Term−LB)のコピー数を決定した。5種のT0系統のうち4種(系統番号277793891、279161306、279161388および278728430)は、PHP70365のT−DNAからのDsREDおよびBAR発現カセットの単一コピーを含有し(表12)、系統274749446はいくつかの導入配列について1コピーより多くを有した。
成熟乾燥種子を塩素ガスで消毒し、暗所において、5g/lの蔗糖および6g/lの寒天を含有する半固体培地上、室温で水を吸収させた。終夜のインキュベーション後、暗所でさらに3〜4時間、室温で種子を蒸留水に浸漬させた。完全な胚軸をメスの刃で子葉から分離した。実施例9に記載の手順により、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)媒介胚軸形質転換を行った。PHP70365をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078で形質転換した、胚軸の分裂組織部位の一過性のDsRED発現は、共培養してから3〜4日後に観察された。PHP70365をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078で形質転換してから2〜3週間後、分裂組織部位におけるDsRED陽性のシュート原基およびカルスが3mg/Lのビアラホスを含有する発芽培地上で観察された(図5B)。PHP70365をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078で形質転換してから6〜8週間後、安定に形質転換されたDsRED陽性シュートは1〜1.5cmの大きさに成長した(図5D)。
表14に示すように、16種のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)株はDSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Germany)から、2株はDr.Tamas Torok、Lawrence Berkeley National Laboratory(Berkeley、CA)から入手したものであり、これらの株は、供給者からの指示通りに培養した。16株全てが100mg/Lのゲンタマイシンに敏感であったが、8株(オクロバクテリウム・サイティシ(Ochrobactrum cytisi)、オクロバクテリウム・デジョネンス(O.daejeonense)、オクロバクテリウム・ルピネ(O.lupine)、オクロバクテリウム・オリゼ(O.oryzae)、オクロバクテリウム・ペコリス(O.pectoris)、オクロバクテリウム・トリティシ(O.tritici)、LBNL124−A−10およびHTG3−C−07)のみは、エレクトロポレーション後のゲンタマイシン選択によりPHP70365による形質転換が可能であった。これらの8株およびオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078について、タバコBY−2細胞(usingPYFP発現カセットを有するPHP72277を使用して)およびダイズ半切種子(usingDsREDカセットを有するPHP70365を使用して)を遺伝子学的に形質転換するそれらの能力を試験した。オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078、オクロバクテリウム・サイティシ(O.cytisi)およびオクロバクテリウム・ペコリス(O.pectoris)はBY−2細胞(表14)およびダイズ外植体(図6)を形質転換することができた。オクロバクテリウム・デジョネンス(O.daejeonense)、オクロバクテリウム・ルピネ(O.lupine)、オクロバクテリウム・オリゼ(O.oryzae)およびオクロバクテリウム・トリティシ(O.tritici)もまた、タバコBY−2細胞を形質転換することができたが、それらの形質転換の有効性はオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078、オクロバクテリウム・サイティシ(O.cytisi)およびオクロバクテリウム・ペコリス(O.pectoris)より有意に(10〜50倍)低かった。表14で、「X」は、プラスミドPHP70365で形質転換されたコロニーは得られなかったこと意味する。「O」はプラスミドPHP70365で形質転換されたコロニーが得られたこと意味する。「ND」は決定されていないことを意味する。+が多いほど一過性の蛍光タンパク質の発現がより強いことを示す。
実施例3に記載のようにして、プラスミドPHD4673をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078を、ゲンタマイシン100mg/Lを含有する50mLのLB液体培地に植菌し、28℃、250rpmで18〜24時間培養した。PHD4673をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078培養物を20℃、4,000rpmで15分間遠心分離し、ペレットを、新たに調製した、0.02%(体積/体積)のSilwet L−77界面活性剤(Helena Chemical Company225Schilling Blvd.Collierville、TN38017)を含む5%の蔗糖75mL中に再懸濁させた。修正フローラルディップ法(Clough & Bent(1998)Plant J16:735−743)を使用して、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)Col−0の形質転換を行った。PHD4673をさらに含有するオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078でフローラルディップした後、植物栽培室において、21℃、60〜100μE/m2/sでの16時間の光周期で植物を栽培し、鞘が茶色になった後、種子を収集した。層流フードの下、95%エタノールで1分間、20%漂白剤プラス1滴のTween−20で15分間、種子の表面を消毒し、無菌水で3回洗浄した。30mgの無菌の種子を、150×25mmのペトリ皿(カタログ番号351013、Falcon Large Petri Dishes、VWR)中、ビタミンを含む1×MS塩、1%蔗糖(pH5.7)、0.8%TC寒天、100mg/Lのチメンチンおよび50mg/Lのカナマイシンからなる寒天選択培地に蒔いた。層流下、プレートを乾燥させ、パラフィルムで封をし、発芽および成長のために、21℃、60〜100μE/m2/sでの16時間の光周期で培養した。カナマイシン50mg/L培地での選択から9日後、発芽し、緑色になった遺伝子が導入されたと推定される系統を数え、蛍光顕微鏡下でDsREDの発現を観察した。カナマイシン耐性およびDsRED陽性の発芽苗を示す形質転換効率は、0.53〜1%であり、平均の形質転換効率は0.77%であった(表15)。さらに成長させ、分析を行うために、カナマイシン耐性およびDsRED陽性発芽苗を土壌に移植した。
終夜培養したOオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1NRRL寄託B−67078プラスミド不含(ベクターを欠く)およびPHD4674をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1NRRL寄託B−67078を4,000rpm、20℃で20分間遠心分離し、ペレットを400μMアセトシリンゴンを含む10mMのMgSO4に再懸濁させ、細胞濃度をOD600で1.0近くにした。2色ソルガムのDuPont Pioneer TX430植物を栽培室中、375〜450μE/m2/sでの16時間の光周期、昼は26℃、夜は22℃で栽培した。Kapila et al.(Plant Sci(1997)122:101−108)およびSiehl et al.(Plant Physiol(2014)166:1162−76.)に記載のようにして、インフィルトレーションを行った。一過性DsRED発現のために、5週齢のソルガム植物の葉をオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078プラスミド不含、およびオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078(PHD4674)でインフィルトレーションし、インフィルトレーション後4日目(dpi)にLeica蛍光顕微鏡により一過性のDsRED発現を吟味した。PHD4674をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078でインフィルトレーションしたソルガムの葉にはDsREDの発現が見られたが、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078プラスミド不含からのものはそうでなかった。DsREDの発現に成功したことを蛍光顕微鏡で最初に確認したのはインフィルトレーション後4日目(dpi)であったが、定量化は遺伝子産物をさらに蓄積させるために7dpiまで遅らせた。処理した全試料についてGE Typhoon Trio(可変モードイメージャ)GE Healthcare Bio−Sciences、P.O.Box 643065 Pittsburgh、PA15264−3065によりDsREDを定量した。スキャンの前に、抽出物の細胞破片をろ過し、ブラッドフォード法により、測定試料ごとにCCLRバッファー100μL中150μgの可溶性トータルタンパク質に正規化し、その後、ImageQuantTL画像解析ソフトウェア(GE Healthcare Bio−Sciences、P.O.Box 643065 Pittsburgh、PA15264−3065)により最終スキャンを解析した。PHD4674をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078でインフィルトレーションした、ソルガム葉抽出物の相対蛍光単位の平均は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078プラスミド不含からのそれより3.5〜23倍高かった。この結果は、PHD4674をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1がソルガム細胞中にDNAを送達し、発現させることができることを明確に示すものである。
実施例10に記載のようにして、ダイズの形質転換を行った。PHP70365またはPHP81185を宿すオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078で形質転換した、胚軸の分裂組織部位の一過性のDsRED発現は、共培養してから7日後に観察された。両コンストラクトに感染した外植体は、同レベルのDsRed一過性発現を示した。PHP70365またはPHP81185をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078で形質転換してから6〜8週間後、安定に形質転換されたDsRED陽性シュートは1〜1.5cmの大きさに成長した。PHP70365またはPHP81185をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1 NRRL寄託B−67078による安定な形質転換の効率は、表17に示したものと類似であった。
表1Bおよび表18に掲げた、共組み込みベクターならびにヘルパーおよびバイナリーベクターの組み合わせをオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1に導入し、実施例2に記載のようにタバコBY−2懸濁細胞の修正法を使用して赤色蛍光タンパク質(RFP)の一過性発現を実施した。RFPの発現は感染から7日目にLeica蛍光実態顕微鏡下で観察された。タバコBY−2細胞でRFP発現を示すプラスミドを表18に要約する。
オクロバクテリウム(Ochrobactrum)による植物の形質転換は、植物の遺伝子の改良にも使用し得る。ランダムなオクロバクテリウム(Ochrobacturm)媒介形質転換は、ヘルパープラスミドを有する、または有しないT−DNAバイナリーベクター上に目的の遺伝子を含有する発現カセットの送達に使用し得る。これらのランダム形質転換に有用な植物物質は、ヒマワリ、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、ベニバナ、ダイズ、アルファルファ、キャノーラ、アブラナ属(Brassica)およびワタなどの双子葉植物、またはトウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、カラスムギ、ソルガム、キビおよびサトウキビなどの単子葉植物であり得る。
本明細書で開示するオクロバクテリウム(Ochrobactrum)による形質転換は、リコンビナーゼ媒介部位特異的遺伝子ターゲッティングに使用し得る。オクロバクテリウム(Ochrobacturm)による形質転換は、標的遺伝子座を提供する、1つまたはそれより多くの非同一組み換え部位を含有する株の創出に使用し得る。そうすると、オクロバクテリウム(Ochrobacturm)による形質転換は、標的遺伝子座における部位特異的導入(SSI)を使用することができ、米国仮特許出願第62/296639号明細書(この全体を参照により本明細書に組込む)の記載のようにして、1つまたはそれより多くのコンストラクトを含有するトランスファーカセットの送達を可能にする。
本明細書で開示したオクロバクテリウム(Ochrobactrum)により媒介される形質転換は、CRISPR−Casヌクレアーゼ仲介によるゲノム修飾に使用し得る。CRISPR−Casヌクレアーゼ媒介ゲノム修飾を行う方法は、国際公開第2013/141680号パンフレット、米国特許出願公開第2014/0068797号明細書、および国際公開第2015/026883号パンフレットに記載があり、これらそれぞれの全体は参照により本明細書に組込まれる。
異なる起源のベクターを用いるオクロバクテリウム(Ochrobactrum)の形質転換はSSIおよびCRISPR−Cas9ゲノム編集の向上に使用し得る。CRISPR−Casヌクレアーゼ媒介ゲノム修飾を行う方法は、国際公開第2013/141680号パンフレット、米国特許出願公開第2014/0068797号明細書、および国際公開第2015/026883号パンフレットに記載があり、これらそれぞれの全体は参照により本明細書に組込まれる。異なる細菌Orisを含み、様々なプラスミドコピー数を与える、RepABC、pRi、pVS1、RK2などを含むトランスファーカセットは、SSIおよびCRISPR−Cas9ゲノム編集で使用する植物細胞に送達されるDNA分子の量を調節するために使用することができる。あるいは、異なるOrisを宿すトランスファーカセットは、さらに別の毒性遺伝子を有するヘルパープラスミドと組み合わせることができる。これらのヘルパープラスミドは、様々なプラスミドコピー数を有する、異なる細菌性の複製起源を有し得る(表1B)。
いくつかの態様では、細菌株は、アクセッション番号NRRL B−67078として2015年10月7日にAgricultural Research Service Culture Collection(NRRL)、1815 North University Street、Peoria、Illinois 61604、(nrrl.ncaur.usda.gov、ここには「www」の接頭語を付けてワールドワイドウェブ上でアクセスできる)へ寄託されたオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1株の生物学的に純粋な培養物である。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下で維持される予定である。これらの寄託は単に当業者の便宜のためになされたものであり、35U.S.C.112条で寄託が求められているからということではない。この申請の係属中は、Patents and Trademarksの長官および申請に対して長官がその権利を有すると認めた者がこの寄託物を入手できる。申請のいずれかのクレームが特許査定されたとき、出願人は37C.F.R.1.808条に従って、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)、1815 North University Street、Peoria、Illinois 61604に寄託したサンプルを公衆が利用できるようにするであろう。この寄託物は、30年間、または最新の請求から5年間、または特許の権利行使可能期間の、より長いいずれかの期間、公共の保管者であるNRRLの保管場所で維持され、その期間にそれが生きられなくなれば更新されるであろう。特許証が交付されれば、公衆は、取り消し不能の形でかつ無制限または無条件に寄託物を入手できるであろう。さらに、出願人は、寄託時に試料の生存率を提示することを含め、37C.F.R.1.801条〜1.809条の全ての要件を満足させている。出願人は、生物物質の移動またはその商業的な輸送に対して法が課す制限を撤回する権限を有しない。出願人は、この特許で与えられる権利の侵害を放置することはない。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の行為により与えられた特許権から逸脱して、主題の開示の実施を許諾するものではないことは理解されるべきである。
Claims (318)
- NRRL B−67078として寄託されている単離オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1。
- 作動可能に結合しているベクターを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1であって、
a.目的配列をコードする核酸を植物細胞にVirD2に依存した方法で導入するように作用するvir遺伝子領域を含む第1の核酸と;
b.目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2の核酸と
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1。 - 前記第1の核酸および前記第2の核酸は、単一のポリヌクレオチド分子上にある請求項2に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1の核酸および前記第2の核酸は、別個のポリヌクレオチド分子上にある請求項2に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 選択マーカー遺伝子をさらに含む請求項2〜4のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン/カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項5に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子、npt1遺伝子、npt2遺伝子、hpt遺伝子、SpcN遺伝子、aph遺伝子またはaadA遺伝子である請求項5または6に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子である請求項5〜7のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記aacC1遺伝子は、配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項5〜8のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aadA遺伝子である請求項5〜9のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記aadA遺伝子は、配列番号39、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項5〜10のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt1遺伝子である請求項5〜11のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記npt1遺伝子は、配列番号40、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項5〜12のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt2遺伝子である請求項5〜13のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記npt2遺伝子は、配列番号41、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項5〜14のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、hpt遺伝子である請求項5〜15のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記hpt遺伝子は、配列番号67、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項5〜16のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項5〜17のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、tetAR遺伝子ではない請求項5〜18のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項5〜19のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記対抗選択マーカー遺伝子は、sacB遺伝子、rpsL(strA)遺伝子、pheS遺伝子、dhfr(folA)遺伝子、lacY遺伝子、Gata−1遺伝子、ccdB遺伝子またはthyA遺伝子である請求項20に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号4〜14、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virB1〜virB11、あるいは、それぞれ配列番号80〜90、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項2〜21のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号16〜17、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virC1〜C2、あるいは、それぞれ配列番号92〜93、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子r−virC1〜C2を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virC1〜C2を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子を含む請求項2〜21のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号18〜19、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD1〜D2、あるいは、それぞれ配列番号94〜95、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子r−virD1〜D2を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virD1〜D2を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項2〜21のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記遺伝子vir遺伝子領域は、配列番号15、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virG、あるいは、配列番号91、またはその変異体および誘導体を有するr−virGビルレンス遺伝子を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virGを含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項2〜21のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記vir遺伝子領域は、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virF、またはその変異体および誘導体の1つ以上を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virFを含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項2〜21のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、配列番号26、または変異体および誘導体を有するvirA、あるいは、配列番号79、またはその変異体および誘導体を有するr−virAビルレンス遺伝子であり、前記ビルレンス遺伝子r−virAを含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD3〜D5は、それぞれ配列番号20〜22、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは前記r−virD3〜D5ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号96〜98、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virE1〜E3は、それぞれ配列番号23〜25、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは前記r−virE3ビルレンス遺伝子は、配列番号100、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子r−virE3を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virH〜H1は、それぞれ配列番号42〜43、またはその変異体および誘導体を有する請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virKは、配列番号45、またはその変異体および誘導体を有する請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virLは、配列番号46、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virMは、配列番号47、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virPは、配列番号48、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virQは、配列番号49、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD3〜D5およびvirE1〜E3、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、r−virD3〜D5およびr−virE3、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5およびr−virE3を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virA、virD3〜D5、およびvirE1−E3、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、r−virA、r−virD3〜D5およびr−virE3、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子r−virA、r−virD3〜D5およびr−virE3を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項26に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項2〜37のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1、pSC101、p15AまたはR6K複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する請求項38に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1複製起点に由来する請求項39に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- Col E1複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項40に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pSC101複製起点に由来する請求項39に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- pSC101複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号50、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項42に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、p15A複製起点に由来する請求項39に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- p15A複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号51、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項44に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、R6K複製起点に由来する請求項39に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- R6K複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号52、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項46に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項2〜47のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項48に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項48に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項48に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSaまたはpBBR1複製起点に由来する請求項48に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRK2複製起点の変異体である請求項52に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種は、前記pRFS1010複製起点に由来する請求項52に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記pVS1複製起点に由来する請求項52に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記pSa複製起点に由来する請求項52に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号3、37、38、53、57、58、59、60もしくは112、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項52に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、repABC適合複製起点である請求項48に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記repABC適合複製起点は、配列番号57、58、59もしくは60、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項58に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点、ならびに、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項38〜59のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、pRK2複製起点、pSa複製起点、またはpRFS1010複製起点に由来する請求項60に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、前記pRK2複製起点に由来する請求項60または61に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号38、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項62に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、前記pSa複製起点に由来する請求項60または61に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pSa複製起点は、配列番号53、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項64に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する請求項60または61に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRFS1010複製起点は、配列番号37、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項66に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、ミニもしくはミクロpRK2複製起点である請求項60〜62のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、ミクロpRK2複製起点である請求項60〜62および68のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記ミクロpRK2複製起点は、配列番号54、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項69に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、ミニpRK2複製起点である請求項60〜62および68のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記ミニpRK2は、配列番号66、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項71に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、前記trfAおよびOriV配列を含む請求項60〜62および68のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号64および65、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項73に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- par DEオペロン由来の配列をさらに含む請求項60〜74のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記par DEオペロンは、配列番号55、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項75に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 形質転換植物細胞の作製方法であって、
a.植物細胞を、作動可能に結合している、vir遺伝子領域を含む第1の核酸と、目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2の核酸とを含むオクロバクテリウム(Ochrobactrum)と接触させる工程と;
b.オクロバクテリウム(Ochrobactrum)が目的配列を前記植物細胞に形質転換させることができる条件下で、前記植物細胞を培養する工程と;
c.ゲノム中に前記目的配列を含む形質転換植物細胞を同定する工程と
を含む方法。 - ゲノム中に前記目的配列を含む植物を再生する工程をさらに含む請求項77に記載の方法。
- 前記植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物由来である請求項77または78に記載の方法。
- 前記植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイロナズナ属(Arabidopsis)、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、オートムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属(Brassica)、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である請求項77または78に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、前記植物細胞に接触させる前に、アセトシリンゴンまたはvirもしくはr−vir遺伝子機能を誘発する他の化合物の存在下で増殖させる請求項77〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎からの外植体に含まれており、前記外植体を前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)と接触させる請求項77〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外植体は、胚性分裂組織、体細胞分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節、または、葉、根もしくは茎の組織を含む請求項82に記載の方法。
- 目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の非存在下に行われる請求項77に記載の方法。
- 目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の存在下に前記植物細胞を培養することを含み、前記目的配列は、前記選択剤に対する耐性を与えるか、または前記選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に送達される請求項77に記載の方法。
- 前記選択剤は、クロルスルフロン、エタメツルフロン、イマザピル、グリホサート、カナマイシン、スペクチノマイシン、ビアラホス、2,4−Dまたはジカンバである請求項85に記載の方法。
- 前記目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない請求項85に記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子および前記目的配列は、前記目的配列を含む前記植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している請求項87に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、第2の目的配列を含む第3の核酸を含み、前記形質転換細胞は、そのゲノム中に前記第2の目的配列を含む
請求項77に記載の方法。 - 前記植物細胞からの植物の再生は、前記植物細胞を含む外植体から1つ以上のシュートの形成を誘導し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む請求項78に記載の方法。
- 再生は、組織形成によって起こる請求項90に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1、オクロバクテリウム・サイティシ(Ochrobactrum cytisi)、オクロバクテリウム・デジョネンス(Ochrobactrum daejeonense)、オクロバクテリウム・ルピネ(Ochrobactrum lupine)、オクロバクテリウム・オリゼ(Ochrobactrum oryzae)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)、LBNL124−A−10、HTG3−C−07およびオクロバクテリウム・ペクトリス(Ochrobactrum pectoris)からなる群から選択される請求項77〜91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、選択マーカーをさらに含む請求項77に記載の方法。
- 前記選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン/カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項93に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子、npt1遺伝子、npt2遺伝子、hpt遺伝子、SpcN遺伝子、aph遺伝子またはaadA遺伝子である請求項93または94に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子はaacC1遺伝子である請求項93〜95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記aacC1遺伝子は、配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項93〜96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aadA遺伝子である請求項93〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記aadA遺伝子は、配列番号39、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項93〜98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt1遺伝子である請求項93〜99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記npt1遺伝子は、配列番号40、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項93〜100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt2遺伝子である請求項93〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記npt2遺伝子は、配列番号41、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項93〜102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、hpt遺伝子である請求項93〜103のいずれか一項に記載の方法。.
- 前記hpt遺伝子は、配列番号67、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項93〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項93〜105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、tetAR遺伝子ではない請求項93〜106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項93〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対抗選択マーカー遺伝子は、sacB遺伝子、rpsL(strA)遺伝子、pheS遺伝子、dhfr(folA)遺伝子、lacY遺伝子、Gata−1遺伝子、ccdB遺伝子またはthyA遺伝子である請求項108に記載の方法。
- 前記vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号4〜14、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virB1〜virB11、あるいは、それぞれ配列番号80〜90、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項77〜109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号16〜17、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virC1〜C2、あるいは、それぞれ配列番号92〜93、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子r−virC1〜C2を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virC1〜C2を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子を含む請求項77〜109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記vir遺伝子領域は、それぞれ配列番号18〜19、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD1〜D2、あるいは、それぞれ配列番号94〜95、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子r−virD1〜D2を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virD1〜D2を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項77〜109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記vir遺伝子領域は、配列番号15、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virG、あるいは、配列番号91、またはその変異体および誘導体を有するr−virGビルレンス遺伝子を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virGを含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項77〜109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記vir遺伝子領域は、リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virFまたはその変異体および誘導体の1種以上を含み、前記ビルレンス遺伝子r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virFを含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項77〜109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、配列番号26、または変異体および誘導体を有するvirA、あるいは、配列番号79、またはその変異体および誘導体を有するr−virAビルレンス遺伝子であり、前記ビルレンス遺伝子r−virAを含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD3〜D5は、それぞれ配列番号20〜22、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、前記ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5は、それぞれ配列番号96〜98、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virE1〜E3は、それぞれ配列番号23〜25、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは前記r−virE3ビルレンス遺伝子は、配列番号100、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子r−virE3を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virH〜H2は、それぞれ配列番号42〜43、またはその変異体および誘導体を有する請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、配列番号45、またはその変異体および誘導体を有する請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virLは、配列番号46、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virMは、配列番号47、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virPは、配列番号48、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virQは、配列番号49、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項114に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD3〜D5およびvirE1〜E3、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、r−virD3〜D5およびr−virE3、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子r−virD3〜D5およびr−virE3を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項114に記載の方法。
- 前記ビルレンス遺伝子virA、virD3〜D5、およびvirE1−E3、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、r−virA、r−virD3〜D5およびr−virE3、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子r−virA、r−virD3〜D5およびr−virE3を含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む請求項114に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項77〜125のいずれか一項に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1、pSC101、p15AまたはR6K複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する請求項126に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1複製起点に由来する請求項127に記載の方法。
- Col E1複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項128に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pSC101複製起点に由来する請求項127に記載の方法。
- pSC101複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号50、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項130に記載の方法。.
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、p15A複製起点に由来する請求項127に記載の方法。
- p15A複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号51、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項132に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、R6K複製起点に由来する請求項127に記載の方法。
- R6K複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号52、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項134に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項77〜135のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項136に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項136に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項136に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSaまたはpBBR1複製起点に由来する請求項136に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRK2複製起点の変異体である請求項140に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種は、前記pRFS1010複製起点に由来する請求項140に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記pVS1複製起点に由来する請求項140に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記pSa複製起点に由来する請求項140に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号3、37、38、53、57、58、59、60もしくは112、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項140に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、repABC適合複製起点である請求項136に記載の方法。
- 前記repABC適合複製起点は、配列番号57、58、59もしくは60、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項146に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点、ならびに、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項126〜147のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複製起点は、pRK2複製起点、pSa複製起点、またはpRFS1010複製起点に由来する請求項148に記載の方法。
- 前記複製起点は、前記pRK2複製起点に由来する請求項148または149に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号38、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項150に記載の方法。
- 前記複製起点は、前記pSa複製起点に由来する請求項148または149に記載の方法。
- 前記pSa複製起点は、配列番号53、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項152に記載の方法。
- 前記複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する請求項148または149に記載の方法。
- 前記pRFS1010複製起点は、配列番号37、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項154に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、ミニもしくはミクロpRK2複製起点である請求項149〜151のいずれか一項に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、ミクロpRK2複製起点である請求項149〜151および156のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミクロpRK2複製起点は、配列番号54、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項157に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、ミニpRK2複製起点である請求項149〜151および156のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミニpRK2は、配列番号66、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項159に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、前記trfAおよびOriV配列を含む請求項149〜151および156のいずれか一項に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号64および65、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項161に記載の方法。
- par DEオペロン由来の配列をさらに含む請求項136〜162のいずれか一項に記載の方法。
- 前記par DEオペロンは、配列番号55、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項163に記載の方法。
- 第1のベクターであって、作動可能に結合している、
a)エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点、
b)オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点、
c)選択マーカー遺伝子、ならびに
d)リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virB1〜B11もしくはr−virB1〜B11、virC1〜C2もしくはr−virC1〜C2、virD1〜D2もしくはr−virD1〜D2、およびvirGもしくはr−virG、またはその変異体および誘導体(ここで、ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11、r−virC1〜C2、r−virD1〜D2およびr−virGを含む前記ベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む)
を含むベクターと;
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1。 - 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号4〜14、またはその変異体および誘導体を有するvirB1〜virB11、あるいは、それぞれ配列番号80〜90、またはその変異体および誘導体を有するr−virB1〜B11である請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号16〜17、またはその変異体および誘導体を有するvirC1〜C2、あるいは、それぞれ配列番号92〜93、またはその変異体および誘導体を有するr−virC1〜C2である請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号18〜19、またはその変異体および誘導体を有するvirD1〜virD2、あるいは、それぞれ配列番号94〜95、またはその変異体および誘導体を有するr−virD1〜D2である請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子は、配列番号15、または変異体および誘導体を有するvirG、あるいは、配列番号91、またはその変異体および誘導体を有するr−virGである請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子、virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virF、またはその変異体および誘導体の1種以上をさらに含む請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1、pSC101、p15AまたはR6K複製起点、あるいはその変異体または誘導体に由来する請求項165〜170のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1複製起点に由来する請求項165〜171のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- Col E1複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項165〜172のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pSC101複製起点に由来する請求項165〜173のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- pSC101複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号50、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項165〜174のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、p15A複製起点に由来する請求項165〜175のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- p15A複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号51、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項165〜176のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、R6K複製起点に由来する請求項165〜177のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- R6K複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号52、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項165〜178のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項165〜179のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項165〜179のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項165〜179のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSaまたはpBBR1複製起点に由来する請求項165〜179のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRK2複製起点の変異体である請求項165〜179および183のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する請求項165〜179および183のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pVS1複製起点に由来する請求項165〜179および183のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pSa複製起点に由来する請求項165〜179および183のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号3、37、38、53、57、58、59、60もしくは112、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項165〜179および183のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、repABC適合複製起点である請求項165〜179のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記repABC適合複製起点は、配列番号57、58、59もしくは60、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項189に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項165〜170のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、pRK2複製起点、pSa複製起点、またはpRFS1010複製起点に由来する請求項191に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、前記pRK2複製起点に由来する請求項191または192に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号38、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項193に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、前記pSa複製起点に由来する請求項191または192に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pSa複製起点は、配列番号53、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項195に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する請求項191または192に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRFS1010複製起点は、配列番号37、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項197に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記複製起点は、前記pRK2複製起点に由来する請求項191または192に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、ミニもしくはミクロpRK2複製起点である請求項192〜194および199のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、ミニもしくはミクロpRK2複製起点である請求項192〜194および199〜200のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記ミクロpRK2複製起点は、配列番号54、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項201に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、ミニpRK2複製起点である請求項192〜194および199〜200のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記ミニpRK2は、配列番号66、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項203に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、前記trfAおよびOriV配列を含む請求項192〜194および199〜204のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号64および65、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項205に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- par DEオペロン由来の配列をさらに含む請求項180〜206のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記par DEオペロンは、配列番号55、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項207に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン/カナマイシン、ヒグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項165〜208のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子、npt1遺伝子、npt2遺伝子、hpt遺伝子、SpcN遺伝子、aph遺伝子またはaadA遺伝子である請求項209に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子である請求項210に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- aacC1遺伝子は、配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項211に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aadA遺伝子である請求項210に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記aadA遺伝子は、配列番号39、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項213に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt1遺伝子である請求項210に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記npt1遺伝子は、配列番号40、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項215に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt2遺伝子である請求項210に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記npt2遺伝子は、配列番号41、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項217に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、hpt遺伝子である請求項210に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記hpt遺伝子は、配列番号67、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項219に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項165〜208のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、tetAR遺伝子ではない請求項165〜208のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項165〜208のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記対抗選択マーカー遺伝子は、sacB遺伝子、rpsL(strA)遺伝子、pheS遺伝子、dhfr(folA)遺伝子、lacY遺伝子、Gata−1遺伝子、ccdB遺伝子またはthyA遺伝子である請求項223に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1のベクターは、配列番号61、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項165〜224のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1のベクターは、配列番号62、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項165〜225のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1のベクターは、traオペロン配列もしくはtrbオペロン配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項165〜226のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1のベクターは、配列番号63、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項227に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1のベクターは、配列番号34、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1のベクターは、配列番号35、またはその変異体およびフラグメントを含まない請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記第1のベクターは、配列番号36、またはその変異体およびフラグメントを含まない請求項165に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1であって、
作動可能に結合している、
a.配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖のための複製起点、
b.配列番号3、またはその変異体およびフラグメントを有するオクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖維持のための複製起点、
c.配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに
d.アグロバクテリウム(Agrobacterium)種のビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号4〜14を有するvirB1〜B11ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号80〜90を有するr−virB1〜B11ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号16〜17を有するvirC1〜C2ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号92〜93を有するr−virC1−C2ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号18〜19を有するvirD1〜D2ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号94〜95を有するr−virD1〜D2、および配列番号15を有するvirGビルレンス遺伝子、もしくは配列番号91を有するr−virGビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11、r−virC1〜C2、r−virD1〜D2、およびr−virGを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含むビルレンス遺伝子
を含む第1のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1。 - オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1であって、
作動可能に結合している、
a.配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖のための複製起点、
b.配列番号3、またはその変異体およびフラグメントを有するオクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖維持のための複製起点、
c.配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに
d.アグロバクテリウム(Agrobacterium)種のビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号4〜14を有するvirB1〜B11ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号80〜90を有するr−virB1〜B11ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号16〜17を有するvirC1〜C2ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号92〜93を有するr−virC1−C2ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号18〜22を有するvirD1〜D5ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号94〜98を有するr−virD1〜D5、およびそれぞれ配列番号23〜25を有するvirE1〜E3ビルレンス遺伝子、もしくは、配列番号100を有するr−virE3ビルレンス遺伝子、および配列番号15を有するvirGビルレンス遺伝子、もしくは配列番号91を有するr−virGビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11、r−virC1〜C2、r−virD1〜D5、r−virE3、およびr−virGを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む配列
を含む第1のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1。 - オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1であって、
作動可能に結合している、
a.配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖のための複製起点、
b.配列番号3、またはその変異体およびフラグメントを有するオクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖維持のための複製起点、
c.配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに
d.アグロバクテリウム(Agrobacterium)種のビルレンス遺伝子、配列番号26を有するvirAビルレンス遺伝子、もしくは配列番号79を有するr−virAビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号4〜14を有するvirB1〜B11ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号80〜90を有するr−virB1〜B11ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号16〜17を有するvirC1〜C2ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号92〜93を有するr−virC1−C2ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号18〜22を有するvirD1〜D5ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号94〜98を有するr−virD1〜D5、およびそれぞれ配列番号23〜25を有するvirE1〜E3ビルレンス遺伝子、もしくは、配列番号100を有するr−virE3ビルレンス遺伝子、および配列番号15を有するvirGビルレンス遺伝子、もしくは配列番号91を有するr−virGビルレンス遺伝子、および配列番号27を有するvirJビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子r−virA、r−virB1〜B11、r−virC1〜C2、r−virD1〜D5、r−virE3、およびr−virGを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む配列
を含む第1のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense)H1。 - 形質転換植物細胞の作製方法であって、
作動可能に結合している、
a)エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための複製起点、
b)オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための複製起点、
c)選択マーカー遺伝子;ならびに
d)リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号4〜14を有するvirB1〜B11ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号80〜90を有するr−virB1〜B11ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号16〜17を有するvirC1〜C2ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号92〜93を有するr−virC1−C2ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号18〜19を有するvirD1〜D2ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号94〜95を有するr−virD1〜D2、および配列番号15を有するvirGビルレンス遺伝子、もしくは配列番号91を有するr−virGビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体(ここで、ビルレンス遺伝子r−virB1〜B11、r−virC1〜C2、r−virD1〜D2、およびr−virGを含むベクターは、配列番号101、またはその変異体および誘導体を有するr−gallsビルレンス遺伝子をさらに含む)
を含む第1のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する1つ以上のT−DNAボーダー配列を含む第2のベクターと
を含むオクロバクテリウム(Ochrobactrum)と植物細胞を接触させる工程と;
オクロバクテリウム(Ochrobactrum)が目的配列を前記植物細胞に形質転換させることができる条件下で、前記植物細胞を培養する工程と;
ゲノム中に前記目的配列を含む形質転換植物細胞を同定する工程と
を含む方法。 - 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virB1〜virB11は、それぞれ配列番号4〜14、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはr−virB1〜B11は、それぞれ配列番号80〜90、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項235に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virC1〜C2は、それぞれ配列番号16〜17、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはr−virC1〜C2は、それぞれ配列番号92〜93、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項235に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virD1〜virD2は、それぞれ配列番号18〜19、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはr−virD1〜D2は、それぞれ配列番号94〜95、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項235に記載の方法。
- 前記リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virGは、配列番号15、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはr−virGは、配列番号91、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項235に記載の方法。
- リゾビウム(Rhizobiaceae)ビルレンス遺伝子virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r−virA、r−virD3、r−virD4、r−virD5、r−virE3もしくはr−virF、またはその変異体および誘導体の1種以上をさらに含む請求項235に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1、pSC101、p15AまたはR6K複製起点、あるいはその変異体または誘導体に由来する請求項235〜240のいずれか一項に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Col E1複製起点に由来する請求項235〜241のいずれか一項に記載の方法。
- ColE1複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号2、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜242のいずれか一項に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pSC101複製起点に由来する請求項235〜243のいずれか一項に記載の方法。
- pSC101複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号50、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜244のいずれか一項に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、p15A複製起点に由来する請求項235〜245のいずれか一項に記載の方法。
- p15A複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号51、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜246のいずれか一項に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、R6K複製起点に由来する請求項235〜247のいずれか一項に記載の方法。
- R6K複製起点に由来するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号52、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜248のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項235〜249のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項235〜249のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項235〜249のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSaまたはpBBR1複製起点に由来する請求項235〜249のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRK2複製起点の変異体である請求項235〜249および253のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pRFS1010複製起点に由来する請求項235〜249および253のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pVS1複製起点に由来する請求項235〜249および253のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、pSa複製起点に由来する請求項235〜249および253のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号3、37、38、53、57、58、59、60もしくは112、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜249および253のいずれか一項に記載の方法。
- オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、repABC適合複製起点である請求項235〜249のいずれか一項に記載の方法。
- 前記repABC適合複製起点は、配列番号57、58、59もしくは60、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項259に記載の方法。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)における増殖および安定した維持のための前記複製起点、ならびに、オクロバクテリウム(Ochrobactrum)種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項235〜240のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複製起点は、pRK2複製起点、pSa複製起点、またはpRFS1010複製起点に由来する請求項261191に記載の方法。
- 前記複製起点は、前記pRK2複製起点に由来する請求項261または262に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号38、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項263に記載の方法。
- 前記複製起点は、前記pSa複製起点に由来する請求項261または262に記載の方法。
- 前記pSa複製起点は、配列番号53、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項265に記載の方法。
- 前記複製起点は、前記pRFA1010複製起点に由来する請求項261または262に記載の方法。
- 前記pRFS1010複製起点は、配列番号37、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項267に記載の方法。
- 前記複製起点は、前記pRK2複製起点に由来する請求項261または262に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、ミニもしくはミクロpRK2複製起点である請求項262〜264および269のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum)。
- 前記pRK2複製起点は、ミクロpRK2複製起点である請求項262〜264および269〜270のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミクロpRK2複製起点は、配列番号54、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項271に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、ミニpRK2複製起点である請求項262〜264および269〜270のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミニpRK2は、配列番号66、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項273に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、前記trfAおよびOriV配列を含む請求項262〜264および269〜274のいずれか一項に記載の方法。
- 前記pRK2複製起点は、配列番号64および65、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項275に記載の方法。
- par DEオペロン由来の配列をさらに含む請求項250〜276のいずれか一項に記載の方法。
- 前記par DEオペロンは、配列番号55、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項277に記載の方法。
- 前記選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン/カナマイシン、ヒグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項235〜278のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子、npt1遺伝子、npt2遺伝子、hpt遺伝子、SpcN遺伝子、aph遺伝子またはaadA遺伝子である請求項279に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aacC1遺伝子である請求項280に記載の方法。
- 前記aacC1遺伝子は、配列番号1、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項281に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、aadA遺伝子である請求項280に記載の方法。
- 前記aadA遺伝子は、配列番号39、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項283に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt1遺伝子である請求項280に記載の方法。
- 前記npt1遺伝子は、配列番号40、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項285に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、npt2遺伝子である請求項280に記載の方法。
- 前記npt2遺伝子は、配列番号41、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項287に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、hpt遺伝子である請求項280に記載の方法。
- 前記hpt遺伝子は、配列番号67、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項289に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項235〜278のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、tetAR遺伝子ではない請求項235〜278のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項235〜278のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対抗選択マーカー遺伝子は、sacB遺伝子、rpsL(strA)遺伝子、pheS遺伝子、dhfr(folA)遺伝子、lacY遺伝子、Gata−1遺伝子、ccdB遺伝子またはthyA遺伝子である請求項293に記載の方法。
- 前記第1のベクターは、配列番号61、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項235〜294のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターは、配列番号62、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項235〜295のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターは、traオペロン配列もしくはtrbオペロン配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項235〜296のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターは、配列番号63、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項235または297に記載の方法。
- 前記第1のベクターは、配列番号34、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜298のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターは、配列番号35、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜298のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターは、配列番号36、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項235〜298のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノム中に前記目的配列を含む植物を再生する工程をさらに含む請求項235に記載の方法。
- 前記植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物由来である請求項235または302に記載の方法。
- 前記植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイロナズナ属(Arabidopsis)、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、オートムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属(Brassica)、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である請求項235または302に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、前記植物細胞に接触させる前に、アセトシリンゴンまたはvirもしくはr−vir遺伝子機能を誘発する他の化合物の存在下で増殖させる請求項235〜304のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎からの外植体に含まれており、前記外植体を前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)と接触させる請求項235および303〜305のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外植体は、胚性分裂組織、体細胞分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節、または、葉、根もしくは茎の組織を含む請求項306に記載の方法。
- 前記目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の非存在下に行われる請求項235に記載の方法。
- 前記目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の存在下に前記植物細胞を培養することを含み、前記目的配列は、前記選択剤に対する耐性を与えるか、または前記選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に供給される請求項235に記載の方法。
- 前記選択剤は、クロルスルフロン、エタメツルフロン、イマザピル、グリホサート、カナマイシン、スペクチノマイシン、ビアラホス、2,4−Dまたはジカンバである請求項309に記載の方法。
- 前記目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない請求項235に記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子および前記目的配列は、前記目的配列を含む前記植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している請求項311に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、作動可能に結合している、第2の目的配列を含む第3のベクターをさらに含む請求項235に記載の方法。
- 前記植物細胞からの植物の再生は、前記植物細胞を含む外植体から1つ以上のシュートの形成を誘発し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む請求項302に記載の方法。
- 植物の再生は、組織形成によって起こる請求項314に記載の方法。
- 前記オクロバクテリウム(Ochrobactrum)は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ(Ochrobactrum haywardense H1)、オクロバクテリウム・サイティシ(Ochrobactrum cytisi)、オクロバクテリウム・デジョネンス(Ochrobactrum daejeonense)、オクロバクテリウム・ルピネ(Ochrobactrum lupine)、オクロバクテリウム・オリゼ(Ochrobactrum oryzae)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)、LBNL124−A−10、HTG3−C−07およびオクロバクテリウム・ペクトリス(Ochrobactrum pectoris)からなる群から選択される請求項235〜315のいずれか一項に記載の方法。
- (a)請求項2〜76および165〜234のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム(Ochrobactrum);および
(b)植物の形質転換に使用するための説明書
を含むキット。 - 配列番号34、35、36、106、113もしくは114、またはその変異体および誘導体のいずれか1つを含む請求項2、165、232、233、234および235のいずれか一項に記載のベクター。
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